RealStar® Influenza S&T RT-PCR Kit 2.0
Contents
1. 2 0 10 Analyse des donn es Pour des informations basiques concernant l analyse des donn es sur des instru ment sp cifique de PCR en temps r el merci de se r f rer au manuel concern Pour des informations d taill es concernant l analyse des donn es avec le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 sur diff rents instruments de PCR en temps r el merci de contacter notre support technique 10 1 Validit des tests de diagnostic 10 1 1 Validit des tests de diagnostic qualitatif Pour un test de diagnostic valide qualitatif les valeurs suivantes des contr les doivent tre respect s Canal de d tection Canal de d tection Canal de d tection Nom du Contr l P ao FAM Cy5 JOE Contr le positif de d pistage de NEGATIF POSITIF POSITIF la grippe A B Contr le positif de typing POSITIF NEGATIF POSITIF H1N1nv Contr le n gatif NEGATIF NEGATIF POSITIF 10 1 2 Invalidit des tests de diagnostic qualitatif Un test de diagnostic qualitatif est invalide i si l essai n a pas t r alis com pl tement ou ii si l une des conditions de contr le pour l un des tests de validit du test de diagnostic n est pas respect En cas de test de diagnostic invalide r p ter le test en utilisant les acides nucl iques purifi s restants ou recommencer avec l chantillon de d part 20 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 10 2 Interpr tation des r sultats N de Canal de Canal de Canal2. 9 Programmation des instruments de PCR en temps r el 18 9 1 Ig u p r4 18 9 2 Tra eurs de fluorescents fluorophores 18 9 3 Profil de temp rature et aquisition des fluorophores 19 10 Analyse des donn es in enne ennt nnn nnn 20 10 1 Validit des tests de diagnostic 20 10 1 1 Validit des tests de diagnostic qualitatif 20 10 1 2 Invalidit des tests de diagnostic qualitatif 20 10 2 Interpr tation des r sultats ssssssm 21 4 11 11 1 11 1 1 11 2 1 11 2 2 11 2 2 11 3 12 14 15 16 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Evaluation des performances ns 23 Sensibilit analytique iue nennen tetti a iE 23 Analyse Problt siii ede EEA 23 Souches de grippe 4i rore Cede dee RE Ie e otre 24 5 aim liant 26 Substances interf rentes 1 eene cene 27 Sensibilit Clinique i iere ecce ceo eser Fee OEC cs cula dE eae 27 Limites et pr cautions is 28 Assistance technique eese nennen 29 Marques d pos es et responsabilit 29 Explications des symboles eene 30 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 RealStar Influenza S amp T RT P
3. Influenza A Brisbane 10 2007 Influenza A Brisbane 59 2007 Influenza A Chicken Germany R3294 2007 Influenza A Hamburg 2009 Influenza A Bayern 63 2009 Influenza A California 2009 25 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 11 2 2 R activit crois e La sp cificit analytique du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR a t valu e en testant un testant un panel d ARN l ADN g nomique extrait de diff rents patho g nes respiratoires principalement Table 4 Organismes test s afin de d montrer la sp cificit analytique du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 Influenza Influenza Contr le Organismes H1N inv interne Virus respiratoires Syncytial RSV A et RSV B Metapneumovirus humain Enteroviruses Adenoviruses Types 1 et 7 Chlamydia pneumonia Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR n a pr sent aucune r action crois e avec les organismes ci dessus 26 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 11 2 2 Substances interf rentes Table 5 R sultats des chantillons contenant diff rentes substances interf rentes possible Resultat 30 pfu ml Resultat 3 pfu ml Substances interf rentes possible 1 1 souche H1N1nv souche HH HH Mucine 10 96 bovine l ADN g nomique humain 2 ug PCR Milieu de transport viral 3 fabricants 11 3 Sensibilit clinique Aucune tude prospective pour la d termination de la sensibilit clinique n a encore t ef
4. Souches de la grippe analys es avec le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 Souche Influenza A Anhui 07 290 Influenza A Anhui 1 105 Influenza A Bangkog 1 79 Influenza A Bangkog 80 517 Influenza A Brazil 11 78 Influenza A Brazil 83 550 Influenza A Brisbane 08 100 Influenza A Brisbane 10 2007 Influenza A Brisbane 59 2007 Influenza A England 427 88 Influenza A England 88 654 Influenza A Equine Kentucky 1 81 Influenza A Equine Kentucky 85 520 Influenza A Equine Miami 63 Influenza A Equine Miami 87 510 Influenza A Equine Newmarket 1 93 Influenza A Equine Newmarket 97 596 Influenza A Guizhou 54 89 Influenza A Guizhou 90 502 Influenza A Johannesburg 33 94 Influenza A Johannesburg 95 516 Influenza A Philipines 2 82 Influenza A Philipines 94 516 24 Soustype RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Table 3 suite Souche Soustype Influenza A Shangdong 78 516 Influenza A Shangdong 9 93 Influenza A Turkey 07 112 Influenza A Turkey 1 2005 Influenza A Uruguay 08 278 Influenza A Uruguay 7 16 2007 Influenza A Vietnam 05 204 Influenza A Vietnam 119 04 Influenza B Ann Arbor 1 86 Influenza B Ann Arbor 86 630 Influenza B Florida 08 140 Influenza B Florida 8 2006 Influenza B Harbin 7 94 Influenza B Harbin 97 748 Influenza B Hong Kong 79 568 Influenza B Hong Kong 79 568 Influenza B Malaysia 08 184 Influenza B Malaysia 2506 2004 Influenza B Norway 1 84 Influenza B Norway 84 542 Influenza B Brisbane 60 2008
5. chantillon de transport et de conservation afin d assurer les performances optimales du test dosage n est pas destin tre r alis directement sur l chantillon L extraction des acides nucl iques doit avoir t r alis e au pr alable La pr sence des inhibiteurs de RT PCR peut tre une cause de faux n gatifs ou de r sultats erron s De potentielles mutations dans les r gions du g nome de la grippe couvertes par les amorces et ou les sondes peuvent conduire de mauvais r sultats pour la d tection du virus Comme avec tous les tests de diagnostic les r sultats du kit RealStar Influ enza S amp T RT PCR 2 0 doivent tre interpr t s en prenant en consid ration tous les sympt mes cliniques 28 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 13 Contr le de qualit D apres le syst me de management de la qualit d altona Diagnostics GmbH selon ISO EN 13485 chaque lot du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 est test selon les sp cifications pr d finies afin d assurer la qualit constante du produit 14 Assistance technique Pour le support client merci de contacter notre support technique e mail support altona diagnostics com t l phone 49 0 40 5480676 0 15 Marques d pos es et responsabilit RealStar ExtraStar altona Diagnostics GmbH Mx 3005P Stratagene ABI Prism Applied Biosystems HighPure LightCycler Roche Rotor Gene QIAamp QIAGEN VE
6. groupe du virus de la grippe A d la conception des essais les chantillons positifs au H1N1nv donneront un signa positif dans le canal FAM mais pas dans le Cy5 Les chantillons positifs la grippe saisonni re A donneront un r sultat positif dans le canal Cy5 mais pas dans le canal FAM 22 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 11 Evaluation des performances 11 1 Sensibilit analytique Pour valuer la sensibilit analytique des dilutions en s rie ont t effectu es sur des plaques positives quantifi es la grippe A H1N1 A H3N2 et 1 1 Table 2 Taux de succ s des analyses pour les diff rentes souches Influenza A Influenza A Influenza A F PFU mi 1 1 H3N2 m Influenza B Focus forming units FFU au lieu de plaque forming units PFU 11 1 1 Analyse Probit Influenza A HK 1 68 H3N2 Limite de d tection 95 96 LoD 0 3 PFU ml 95 CI 0 2 0 7 PFU ml Influenza A HH 09 H1N1nv Limite de d tection 95 96 LoD 0 7 PFU ml 95 CI 0 5 1 8 PFU ml Influenza A Texas 91 H1N1 Limite de d tection 95 96 LoD 1 6 PFU 95 CI 1 1 3 8 PFU ml Influenza B Brisbane 60 2008 Limite de d tection 95 96 LoD 1 1 FFU 95 96 CI 0 5 1 8 FFU ml 23 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 11 2 Sp cificit analytique 11 2 1 Souches de grippe Table 3
7. CR Kit 2 0 2 Les r actifs doivent tre s par s en aliquotes et congel s si elles doits tre 1 Usage pr vu eat i utilis s de facon intermittente Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 est un test de diagnostic in vitro quali La conservation a 4 C ne doit pas exc der une dur e de 2 heures tatif bas sur la technologie RT PCR en temps r el pour la d tection des souches e Prot ger les Mastermix A et B de la lumi re saisonni res de grippe A et B ainsi que pour la pand mie actuelle de H1N1nv De plus il permet la diff renciation entre les grippes humaines saisonni res A et B et la souche H1N1nv responsable de la pand mie actuelle 4 Mat riels requis non fournis Instrument adapt la PCR en temps r el Chapitre 6 Description du produit 2 Composants du kit Syst me ou kit appropri l extraction des acides nucl iques e Centrifugeuse de bureau avec rotor adapt des tubes de 2 ml Couleur du e Centrifugeuse avec rotor pour plaques de microdosage si vous utilisez des Bleu Violet Blanc ios couvercle plaques de 96 puits de r action Type Screen Eau de e Vortex Master Contr le A BS Contr le positif Contr le positif qualit mix B interne T _ Influenza PCR Plaques de 96 puits de r action ou tubes de r action avec le mat riel corre spondant pour leur fermeture optique e Pipettes r glables Cones de pipettes avec filtres jetables Gants no
8. RSANT Siemens KingFisher Thermo Scientific Les noms d pos s les marques d pos es etc utilis es dans ce document m me si ils ne sont pas sp cifi es comme tels ne doivent pas tre consid r es comme non prot g es par la loi Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 est un test de diagnostic in vitro mar qu CE en accord avec la Directive europ enne 98 79 EC N est pas disponible dans tous les pays 2012 altona Diagnostics GmbH tous droits r serv s 29 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 16 Explications des symboles NOTES gt 49 5 VD Dispositif medical de diagnostic in vitro R f rence produit Num ro de lot Contient le nombre suffisant pour r aliser n tests rxns Limites de temp rature Version Utiliser avan Attention Se reporter au manuel d utilisation Fabricant 30 32 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 33
9. RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 11 2012 MAN 162010 FR 01 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 RealStar Influenza Screen amp Type RT PCR Kit 2 0 Pour utilisation avec m2000rt Abbott Diagnostics Mx 3005P TM System Stratagene VERSANT kPCR Molecular System AD Siemens ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS Applied Biosystems LightCycler 480 Instrument II Roche Rotor Gene 3000 6000 Corbett Research Rotor Gene Q5 6 plex Platform QIAGEN CFX96 V Dx Real Time System BIORAD M MA Usage de diagnostic in vitro R f rence 162013 96 tests Conserver 25 C 15 C Novembre 2012 E5 g altona Diagnostics GmbH M rkenstraRe 12 D 22767 Hamburg RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Content 1 Usage pr vu 6 2 Composants du Kit 6 3 Conservation esses eene nennen nnn nnn nnne tni n nnn nn inneren 6 4 Mat riels requis non fournis ss 7 5 Informations g n rales sn 8 6 Description du produit sisi 9 T Mises en garde et pr cautions ss 12 8 Mode d emploi 13 8 1 Pr traitement des chantillons sssee 13 8 2 Extraction de ARN niin Eee edo tied Ainsi 13 8 3 Pr paration du Mastermix 15 8 4 Pr paration d la r action iranien nde eec 17
10. certains cas plus s rieux la grippe peut causer des pneumo nies qui peuvent tre fatales en particulier chez les enfants et les personnes ag es En Avril 2009 une nouvelle souche de grippe volua combinant des g nes de Souches de grippe de l homme du cochon et des oiseaux Cette souche a merg au Mexique aux Etats Unis et dans d autres pays du monde entier Elle fut dans un premier temps nomm e la grippe porcine Aujourd hui ces souches sont nom m es H1N1nv Les kits d amorces sondes utilis es dans le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 pour la d tection des souches de grippe A et B sont bas es sur le g ne de la prot ine de matrice de la souche cible Les kits d amorces sondes utilis es pour la d tection de la souche de la grippe H1N1nv sont bas s sur un alignement multiple de souches connues de la grippe porcine combin es des s quences connues d isolats de la nouvelle H1N1 pand mique Le dosage a t concu pour r sister des mutations nouvelles ou venir N an moins dans le cas ou la souche en circulation voluerait et accumulerait des muta tions un kit mis jour pourrait tre requis Afin d tre capable de r agir vite aux mutations venir nous comptons fortement sur l acc s aux informations les plus r centes Cela inclut que l utilisateur du dosage reporte tous les r sultats inhabi tuels directement notre service de support technique e mail support altona diagnostics com t l p
11. de l chantillon d tection FAM d tection Cy5 d tection JOE Interpr tationir suttats ARN sp cifique de POSITIF NEGATIF d tecte ARN sp cifique du sp cifque du grippe saisonni re A et ou B d tect NEGATIF POSITIF POSITIF Pas d ARN sp cifique de la grippe A ou B ou du HiNinv d tect NEGATIF NEGATIF POSITIF L chantillon ne contient pas de quantit d tect able de ces ARN sp cifiques Inhibition de la RT PCR ou chec de le r actifs R p ter le test partir de l chantillon original ou bien pr lever et tester un nouvel chantillon NEGATIF NEGATIF NEGATIF La d tection du contr le interne dans le canal de d tection JOE n est pas requise pour les r sultats positifs dans le canal de d tection FAM ou dans le canal de d tection Cy5 De hautes charges en virus de la grippe dans l chantillon peuvent conduire des signaux du contr le interne r duits ou absents Ceci n a aucune influence sur le r sultat du test 1 La souche H1N1nv apparatient la famille des virus de la grippe A N anmoins cause de la conception du dosage les chantillons positifs H1N1nv g n rent un signal positif dans le canal du FAM mais pas dans le Cy5 Pour de plus amples d tails concernant l interpr tation des r sultats merci de contacter notre support technique 21 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 NOTE En d pit du fait que la souche H1N1nv appartienne au
12. e diff rent des sondes permet de les mettre en comp tition les unes avec les autres En cas de pr sence d ARN sp cifique la grippe A la sonde marqu e avec le Cy5 se liera alors que si c est la souche sp cfique au H1N nv qui est pr sente c est la sonde marqu e pour le FAM qui se liera Par cons quent et malgr le fait que la souche H1N1nv appartienne la famille des virus de la grippe A un chantillon positif au H1N1nv sera pr sent uniquement dans le canal de d tection FAM et pas dans celui du Cy5 Dans le cas d un chantil lon positif la grippe A il n y aura un signal que dans le canal Cy5 mais pas dans le FAM 11 12 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Mises en garde et pr cautions L utilisation de ce produit est limit e au personnel qualifi et form pour les techniques de PCR en temps r el et aux proc dures de diagnostic in vitro Les chantillons doivent tre manipul s comme s ils taient infectieux et ou dangereux en accord avec les proc dure de s curit en vigueur dans le laboratoire Porter des gants jetables non talqu s une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation des chantillons Eviter les contaminations microbiennes et nucl aires par ADN ARN de l chantillon et des composants du kit Toujours utiliser avec les a rosols des c nes de pipettes jetables non contamin s par l ADNase et l ARNase Toujours porter des gants de protection no
13. fectu e car il n existe aucun dosage approuv pour comparer En remplace ment un chantillon est d clar comme grippe positif si au moins un des chantil lons positifs en technique RT PCR en maison est galement disponible avec une preuve additionnelle de sa positivit s quen age test des antig nes ou culture virale Ces chantillons sont nomm s chantillons pr test s positifs et pr test s n gatifs respectivement Ces chantillons ont t test s nouveau avec le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 27 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Table 6 Resultats du diagnostic d valuation Positifs H1N1nv N gatifs 1 1 par RealStar Influenza par RealStar Influenza S amp T RT PCR S amp T RT PCR pr test s positifs pr test s n gatifs 12 Limites et pr cautions e L utilisation de ces produits est limit e au personnel comp tent et form aux techniques de PCR en temps r el et aux proc dures de diagnostic in vitro Lerespect des Bonnes Pratiques de Laboratoire est essentiel pour assurer la performance du dosage Une attention particuli re doit tre donn e la pr paration des chantillons afin de pr server la puret des composants du kit Tous les r actifs doivent tre minutieusement suivis afin d viter les impuret s et les contaminations Le moindre r actif douteux doit tre cart l est n cessaire de respecter les proc dures de pr l vement de l
14. ge chantillon tampon de lyse Le volume de CI ajouter d pend toujours et uniquement du volume d lution Il repr sente 10 du volume d lution Par exemple si l acide nu 15 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 cl ique va tre lu dans 60 yl de tampon d lution ou de tampon 6 ul de CI par chantillon doivent tre ajout s au m lange chantillon tampon de lyse NOTE Ne jamais ajouter le Contr le Interne directement avec l chantillon Sile CI a t ajout pendant la phase de pr paration de l chantillon le Mastermix doit tre pr par selon le sch ma de pipetage suivant Nombre de r actions Mastermix A 5 ul 60 ul Mastermix B 10 yl 120 ul 16 8 4 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Pr paration de la r action Pipeter 15 ul de Mastermix dans chacun des puits n cessaires de la plaque 96 puit ou d un tube essai permettant les r actions optiques Ajouter 10 ul de l chantillon lu partir de l extraction d acide nucl ique ou 5 ul des contr les contr le positif ou n gatif Assurez vous qu il y a au moins un contr le positif et un n gatif par essai Homog n iser avec soin les chantillons et les contr les avec le Mastermix en pipetant Couvrir la plaque de 96 puits avec un film adh sif opaque appropri et les tubes essai avec un couvercle appropri Centrifuger les plaque de 96 puits avec un rotor microplaque pendant 30 secondes en
15. hone 49 0 40 5480676 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 NOTE Etant donn l volution mol culaire des virus de la grippe il y a un risque inh rent pour tous les syst mes bas s sur la PCR en temps r el en cas d accumulation de mutations au cours du temps qui pourraient conduire de faux n gatifs 6 Description du produit Le Kit Realstar Influenza S amp T RT PCR 2 0 est un test de diagnostic in vitro quali tatif bas sur la technologie RT PCR en temps r el pour la d tection des souches saisonni res de grippe A et B ainsi que pour la pand mie actuelle de HINTnv De plus il permet la diff renciation entre les grippes humaines saisonni res A et B et la souche H1N 1nv responsable de la pand mie actuelle Le dosage inclue un sys t me d amplification h t rologue Contr le Interne qui permet d identifier une ventuelle inhibition de la RT PCR et de confirmer l int grit des r actifs du kit Le test est bas sur une technologie RT PCR en temps r el utilisant la transcrip tase inverse RT pour convertir l ARN en ADN compl mentaire ADNC la r action en chaine par polym rase PCR pour l amplification de s quences de cibles sp ci fiques et les sondes cibles sp cifiques pour la d tection de l ADN amplifi Les sondes sont marqu es avec un marqueur fluorescent et un quencher dyes Les sondes sp cifiques aux souches saisonni res de la grippe humaine A et B sont marqu es avec un flu
16. ides nucl iques utilis est compatible avec la technologie de RT PCR en temps r el 13 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Les syst mes d extraction nucl iques et les kits suivants sont recommand s KingFisher Flex Thermo Scientific avec ExtraStar Purification altona Diagnostics e VERSANT Molecular System SP Siemens e HighPure Viral Nucleic Acid Kit Roche QlAamp Viral RNA Mini Kit QIAGEN Si pour la pr paration des chantillons vous utilisez une colonne comportant des tampons de lavage avec de l thanol une tape de centrifugation suppl mentaire de 10 minutes environ 17000 x g 13000 rpm en utilisant un nouveau tube essai est recommand avant l lution des acides nucl iques Pour une grande sensibilit l ARN doit tre lu en 30 ul de tampon d lution pr chauff environ 70 C NOTE L utilisation porteur est crucial pour l efficacit de l extraction et la stabilit de l acide nucl ique extrait L thanol est un fort inhibiteur de la PCR en temps r el Si votre syst me de pr paration de l chantillon utilise des tampons de lavage contenant de l thanol assurez vous d liminer toutes les traces d thanol avant de proc der l lution de l acide nucl ique Pour de plus amples informations ou un support technique concernant le pr traitement et la pr paration des chantillons merci de contacter notre support technique e mail s
17. l hydrochloride de Guanidinium ou hydrochloride ou du thyocianate de Guanidini um L efficacit et la sensibilit de cette m thode est significativement plus haute par rapport aux m thodes qui n cessitent le rincage de l couvillon avec des agents non d naturants comme le NaCl ou le PBS De plus l chantillon n est plus infectieux apr s l incubation de l couvillon dans le tampon de lyse Bow et al Virus Inactivation by Nucleic Acid Extraction Reagents In Journal of Virological Methods 119 2004 195 198 Il est bien connu que le genre d couvillon utilis pour pr lever l chantillon a un impact important sur les r sultats de diagnostic Les couvillons en alginate de calcium ou ceux avec du bois ou des parties en aluminium et ou les coton tiges sont de potentiels inhibiteurs Ils peuvent porter atteinte la PCR et dans certains cas plus graves conduire des faux n gatifs Par cons quent nous recomman dons fortement l utilisation d couvillons en plastiques et les embouts en mati res synth tiques comme le Rayon ou le Dacron L utilisation d couvillons bact ri ologique contenant un gel d agarose noir ou transparent n est pas adapt 8 2 Extraction de l ARN L ARN extrait est le mat riel de d part pour le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 La qualit de l ARN extrait a un impact important sur la performance de l int gralit du test Il est important de s assurer que le syst me d extraction des ac
18. n talqu s jetables 3 Conservation NOTE Lekit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 est exp di sous carboglace Les composants du kit doivent arriver congel s Si un ou plusieurs composants Merci de vous assurer que les instruments ont t install s ne sont pas congel s au moment de la r ception ou si l un des tubes a t calibr s v rifi s et entretenus selon les instructions et les recom abim lors de la livraison contacter altona Diagnostics GmbH pour demander inandattons du fabricant conseil Tous les composants doivent tre conserv s 20 C d s la livraison e Des cycles r p t s de d cong lation et de cong lation des r actifs plus de deux doivent tre vit s car ils peuvent affecter les performances du dosage RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 5 Informations g n rales L Influenza commun ment appel e la grippe est une maladie infectieuse caus e par un virus ARN de la famille des Orthomyxoviridae virus de la grippe Les virus de la grippe sont caract ris s par le continuel changement de leur agent principal de surface les antig nes hemaglutinines H et les neuraminidases N d rive antig nique Ils infectent les oiseaux ainsi que les mammif res par les a rosols Les virus de la grippe humaine de type A et B causent de s rieuses infections sur tout dans les voies respiratoires avec de la fi vre de la toux comme sympt mes pr dominants Dans
19. n talqu s lors de la manipulation des composants des kits Utiliser des aires de travail s par es les unes des autres pour i la pr para tion des chantillons ii la pr paration de la r action et iii l amplification et la d tection de l activit Le flux de travail dans le laboratoire doit tre unidi rectionnel Porter des gants dans chaque aire de travail et les changer avant d entrer dans une aire diff rente Consacrer les fournitures et le mat riel aux diff rentes aires de travail et ne pas les d placer d une aire une autre Conserver le mat riel positif oubien potentielle positif s par des autres com posants du kit Ne pas ouvrir les tubes plaques de r action apr s l amplification afin d viter les contaminations avec les amplicons Des contr les additionnels doivent tre faits en accord avec les lignes direc trices aux exigences locales ou gouvernementales ou des organismes d accr ditation Ne pas utiliser des composants au del de leur date d expiration Eliminer les chantillons et les d chets d essai selon la r glementation de s curit s locales RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 8 Mode d emploi 8 1 Pr traitement des chantillons Si l chantillon ne doit pas tre utilis pour une culture virale des tests d antig nes et ou de pathologies l couvillon doit tre rinc pendant au moins 10 minutes dans un tampon de lyse contenant au moins 4M d un agent chaotropique comme
20. ompos de Deux r actifs Mastermix A et Mastermix B Le mod le de Contr le interne Cl Deux contr les positifs Contr le positif de d pistage Grippe A B Contr le positif de typing H1N1nv Eau de qualit PCR 10 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 Les r actifs du Mastermix A et du Mastermix B contiennent tous les composants tampon enzymes amorces sondes afin de r aliser la transcription inverse la PCR par amplification et la d tection de la cible grippe humaine A grippe humaine B H1N1nv Contr le interne dans une seule mise en place de r action Les amorces et les sondes sp cifiques utilis es pour les grippes humaines A et B et pour H1N1nv dans le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 ont t con ues par le Prof Dr Christian Drosten Institute of Virology University of Bonn Germany Les s quences de ces amorces et sondes sont list es dans le tableau suivant Table 1 Amorces et sondes utilis es pour l amplification sp cifique et la d tection des souch es des grippes humaines A et B et de H1N1nv Sequence 5 3 Matrice AGAGACTTGAAGATGTATTTGCTGGGAAGAT Sonde 1 Matrice TCCTGCAAAGACACTTTCCAGT Sonde 2 Matrice CAGGCCCCCTCAAAGC Amorce 1 Matrice CGTCAGGCCTCCTCAAAGC Amorce 2 Matrice ATTCCATGAGAGCCTCAAGATC Amorce 3 Les amorces et les sondent recherchent les m mes r gions l int rieur de la ma trice du g ne des souches des grippes A et B et H1N 1nv Cependant le marquag
21. orophore qui montrent les m mes caract ristiques que le Cy5 tandis que les sondes sp cifiques aux la pand mie actuelle du H1N nv sont marqu es avec le fluorophore FAM La sonde sp cifiques au Contr le Interne est marqu e avec le fluorophore JOE L utilisation de sondes li es des fluorophores diff rents permet la d tection en parall le de l ADN des souches saisonni res de grippe A et B de l actuelle pand RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 mie du H1N1nv et du contr le interne dans les canaux de d tecteur correspondant de l instrument PCR en temps r el Le test consiste de trois proc dures r alis es dans un m me tube essai transcription inverse de l ARN cible pour g n rer des ADNC e amplification par PCR du Contr le interne et de la cible d ADNc La d tection simultan e des amplicons par un colorant fluorescent des sondes marqu es Le Kit Realstar Influenza S amp T RT PCR 2 0 a t d velopp et valid pour tre utilis avec les instruments de PCR en temps r el suivants e m2000rt Abbott Diagnostics Mx 3005P M System Stratagene e VERSANT kPCR Molecular System AD Siemens ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS Applied Biosystems LightCycler 480 Instrument II Roche Rotor Gene 3000 6000 Corbett Research Rotor Gene 5 6 plex Platform QIAGEN e CFX96 V Dx Real Time System BIORAD Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 est c
22. upport altona diagnostics com t l phone 49 0 40 5480676 0 14 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 8 3 Pr paration du Mastermix Tous les r actifs doivent tre compl tement d congel s homog n is s la pi pette ou vortex s doucement et bri vement centrifug s avant leur utilisation Le kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 contient un Contr le interne h t ro logue peut tre utilis aussi bien comme un contr le d inhibition de la RT PCR ou comme un contr le lors de la pr paration de l chantillon extraction de l acide nucl ique et aussi comme un contr le de l inhibition de la RT PCR Sile contr le interne est utilis comme un contr le d inhibition de la RT PCR mais pas comme un contr le lors de la proc dure de pr paration de l chantillon alors le Mastermix doit tre pr par comme d crit par le sch ma de pipetage ci dessous Nombre de r actions Mastermix A Mastermix B Contr le interne e Si le contr le interne est utilis comme un contr le lors de la proc dure de pr paration de l chantillon et comme un contr le d inhibition de la RT PCR le contr le interne doit tre ajout au moment de la proc d ure d extraction de l acide nucl ique Peu importe la m thode ou le syst me utilis pour l extraction de l acide nucl ique le contr le interne ne doit pas tre ajout directement l chantillon Le CI doit toujours tre ajout au m lan
23. viron 1000 x g 3000 rpm Pr paration de la r action Mastermix Echantillon ou contr le 17 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit 2 0 9 Programmation des instruments de PCR en temps r el 9 3 Profil de temp rature et aquisition des fluorophores Pour des informations basiques concernant l installation et la programmation des D finir le profil de temp rature et l aquisition des fluorophores diff rents instruments de PCR en temps r el merci de vous r f rer au manuel d utilisation des diff rents instruments Pour des instructions de programmation d taill es concernant l utilisation du kit RealStar Influenza S amp T RT PCR 2 0 sur un Nombre cycles Aquisition Temperature instrument de PCR en temps r el sp cifique merci de contacter notre support technique Transcription 50 10 00 9 1 Param tres D naturation 2 00 min D finir les param tres suivants Param tres X Amplification Cyclique 0 45 min Volume de r action 25 yl 0 15 min Taux de rampe par d faut R f rence passive aucune 9 2 Tra eurs de fluorescents fluorophores D finir les traceurs fluorescents fluorophores D tection Nom de traceur Reporteur Quencher l ARN sp cifique Influenza A B Inf A Inf B l ARN sp cifique 1 1 grippe porcine Contr le interne CI 18 19 RealStar Influenza S amp T RT PCR Kit
Download Pdf Manuals
Related Search