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OFFICE KIRKPA`I`RICK

1. ee H l i 10 15 20 25 30 34 mature et identifi par le proc d selon la revendication 1 3 Agent th rapeutique ou prophylactique pour le traitement de maladies caus es par une hormone prot ique mature qui est produite partir d une prohormone par clivage par une convertase ledit agent th rapeutique ou prophylactique ayant la propri t d inhiber ou de pr venir la production de ladite hormone mature par ladite convertase en entrant en comp tition avec ladite convertase pour la liaison ladite prohormone 4 Proc d d identification d agents prophylactiques ou th rapeutiques de la septic mie comprenant les tapes consistant a mettre en contact du TNF de poids mol culaire d environ 26 000 avec une quantit efficace de convertase du TNF ventuellement ledit TNF et ladite convertase du TNF tant dans une solution dont le pH est d environ 7 0 et ou ladite convertase du TNF tant obtenue partir de cellules HL60 b mesurer la conversion du TNF de poids mol culaire d environ 26 000 en une ou plusieurs esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire o ventuellement lesdites une ou plusieurs esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire ont des poids mol culaires choisis parmi ceux d environ 17 000 et 15 000 r p ter les tapes et b d crites ci dessus et en outre inclure une mol cule identifi
2. 519 VAL 13 gt PHE 13 5 TGC TAC GTC ACT CGG 3 CP 520 crible VAL 13 gt PHE 13 5 GGC 3 i 10 15 20 25 30 35 26 CP 521 VAL 1 gt HIS 1 57 TGA GGC AGG 3 CP 522 crible VAL 1 gt HIS 1 5 TGT GCC 3 523 VAL 13 HIS 13 5 CGG 3 524 crible VAL 13 gt HIS 13 5 GCA TGA GGC 3 525 VAL gt THR 1 57 TCG TGA TCT 3 526 crible VAL 1 gt 1 S GAT GCC 3 CP 527 VAL 13 gt THR 13 57 GGC GTC 3 528 crible VAL 13 gt THR 13 S TGG GGC T 3 529 1 VAL 1 GLN 1 HIS 1 5 TGA 3 530 crible ALA 1 VAL 1 gt GLN 1 HIS 1 5 CTG 3 531 PRO 12 VAL 13 gt GLN 12 HIS 5 TAC AAC GGC CTT CGG GGT 3 532 crible PRO 12 VAL 13 GLN 12 HIS 13 5 GGC ATG 3 533 PRO 12 VAL 13 gt SER 12 13 5 GGC AGT CTT
3. i i 10 15 20 25 30 35 br ches En assumant que le gel montre la pr sence d une troisi me bande c est dire que le duplex contenant des br ches s est form les oligonucl otides trait s la kinase peuvent tre appari s au duplex en m langeant 16 de m lange de r action du dupiex contenant des br ches avec 4 d oligonucl otides trait s la kinase et dilu s et le m lange est chauff 65 C pendant 3 minutes puis on laisse redescendre la temp rature la temp rature de la pi ce pendant 20 minutes L h t roduplex est compl t par les r actions d extension et de ligations appropri es en associant les r actifs suivant dans un volume total de 40 10 de duplex contenant des br ches et les amorces 44 de tampon PEL 10x 4 de dNTPs solution 0 25 mM faite partir de la solution m re 10 mM 3 d ATP 10 0 1 M 1490 d H 0 0 662 mM 175 d H 0 1 Klenow 51 2 et 1 de T4 ADN ligase 0 6 Weiss dilu ave du PEL 1x La r action se d roule 16 C pendant deux heures suivie par une transformation de 200 de cellules comp tentes d congel es HB2154 par 10 de m lange extension ligation Les cellules sont conserv es 0 C pendant 30 minutes et pass es 42 C pendant 1 5 minutes suivie par une mise en culture de diff rents volumes du m lange de transformation par exemple 50 102 etc avec 1002 de culture fra che de la
4. 45 51 74 11 Num ro de publication europ en 0491878 TRADUCTION DU BREVET EUROPEEN B1 Num ro de d p t de la demande de brevet europ en 90917939 2 Date de d p t de la demande de brevet europ en 8 juin 1990 Num ro et date du Bulletin Europ en o la mention de la d livrance t publi e 08 1997 du 19 f vrier 1997 Titre Compositions pour l inhibition de la formation d hormones prot iques et emploi de celles ci Titulaire du brevet CHIRON CORPORATION Int CI A61K 38 55 Mandataire OFFICE KIRKPATRICK S A Avenue Wolfers 32 B 1310 LA HULPE TITRE 90917939 2 Compositions pour l inhibition de la formation d hormones prot iques et emploi de celles ci 10 15 20 25 Cette invention se situe dans le domaine de l immunologie biochimie et concerne particuli rement le d veloppement de compositions et de proc d s pour l identification d inhibiteurs de la formation d hormone de nature prot ique et les utilisations prophylactiques et th rapeutiques de ces inhibiteurs pour le traitement de pathologies associ es des niveaux lev s d hormones Plus sp cifiquement l invention facilite l identification de compos s qui peuvent tre utiles pour traiter de nombreuses pathologies en particulier la septic mie le SIDA et des maladies auto immunes et offre donc aux m decins d autres possibilit s de traitement Uniquement aux tats Unis 194 000 patie
5. CGG GGT 3 CP 534 crible PRO 12 VAL 13 12 13 5 GCT 3 Les oligonucl otides sont trait s avec une kinase en utilisant les solutions de r action et les conditions suivantes 3 de tampon KB 10x 3 de 10 mM dilution 1 10 d une solution m re de 0 1 24 d oligonucl otide mutag ne 100 pmole 21 d H 0 et 1 de polynucl otide kinase 10 unit s La r action se d roule 37 C pendant 45 minutes et ensuite 65 68 pendant 5 minutes Ensuite 24 d oligonucl otide trait la kinase sont dilu s dans 56 d H O pour donner 2 pmoles Le duplex contenant des br ches est form comme d crit ci dessous suivi par un appariement des nucl otides Les r actifs suivants sont r unis dans un volume total de 40 8 de tampon GDB 5x 0 5 pmole d ADNSss et 0 1 pmoles d ADN RF de GAP lin aris par Hinc On pr l ve 10 pour un usage ult rieur et les 30 restant sont trait s de mani re s quentielle comme suit 3 minutes 100 C 5 minutes 65 C 30 minutes pour laisserla temp rature redescendre celle de la pi ce et finalement le m lange est plac sur la glace Ensuite 10 de duplex contenant des br ches et 10 de contr le sans br ches sont soumis une lectrophor se sur un gel d agarose pour contr ler la formation du duplex contenant des t 1 i
6. Enzymology 65 499 RS ne en i 10 15 20 25 30 35 1 5 Des souches h tes utilis es pour le clonage dans M13 sont des souches coli susceptibles d tre infect espar des phages par exemple des souches DG98 E coli K12 sont employ es La souche DG98 a t d pos e le 13 Juillet 1984 sous lenum ro d acc s 1965 En fonction de la cellule h te utilis e la transformation est r alis e en utilisant les techniques standards appropri es pour chacune des cellules Le traitement au calcium utilisant le chlorure de calcium tel que d crit par 5 Cohen 1972 Proc Acad Sci USA 68 2110 ou la m thode au d crite par Maniatis et coli 1984 Molecular cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press p 254 peut tre utilis e pour les procaryotes La transfection peut aussi tre r alis e en utilisant la technique de la pr cipitation au phosphate de calcium de Graham F L et coll 1973 Virology 52 456 ou Wigler et coll 1978 Cell 14 725 Des oligonucl otides synth tiques sont pr par s par la m thode triester de Matteucci et coil 1981 J Am Chem Soc 103 3185 ou en utilisant des synth tiseurs automatiques disponibles dans le commerce Le traitement par une kinase des simples brins avant l appariement ou pour les marquer est r alis en utilisant de la kinase en exc s par exemple approximativement 10 unit
7. CCC Pro GGT Gly TAT 7 GGG Gly AGC Ser GAG Glu GGC Gly TTC Phe CTG Leu GAG Glu GCC Ala GAC Asp GCT Ala AAT Asn AAC Asn ATC Ile CCC Pro CGC Arg CTC Leu 99714 Ile GAC Asp CTC Leu ATC Tle ACT Thr GAG Glu TCC Ser CTG Leu CTG Leu TCC Ser CAG Gln AAG Lys GAG Glu GCC Ala CAG Gln TAC Tyr TCC Ser ATC Ile TCT Ser GAG Glu TAT Tyr CGA Arg GAC Asp ATT Tle GAA AGC Glu Ser GCG CTC Ala Leu AGG CGG Arg Arg ATC GTG Ile Val CAC TTT His Phe CCC AGG Pro Arg Ala Val CCT GTA Pro Val GGG CAG Gly Gin CTC CTG Leu Leu CTG GTG Leu Val TCC CAG Thr His GCC Ala Val GCC ATC Ala ann nrm Luu LUL Gly Ala CTG GGA Leu Gly CTC AGC Leu Ser TTT GCC Phe Ala 157 GCC CTG Ala Leu 2 4 ATG Met CCC Pro TGC Cys GCA Ala GGA GAC Asp AGA Arg GCC Ala CTC Leu GCC Ala GTG Val GTC Val GTG Val TCC Ser AAG Lys nan GAU Glu GGG Gly GCT Ala GAG Glu ATC Ile AAG Lys TTG Leu GGC Gly GTG Val CTC Leu TCA Ser CAT His CAG Gln AAT Asn CCA Pro CTC Leu CTC Leu TAC Tyr AGC Ser GCC Ala GTC Val GAG Glu TCT Ser CGG GAC Arg Asp AAG ACA
8. PATENTS TRADE MARKS DESIGNS OFFICE KIRKPATRICK ESTADI 1852 ATTORNEYS Le 27 f vrier 1997 AVENUE WOLFERS 32 B 1310 LA HULPE BRUSSEL BELGIUM re Minist re des Affaires Economiques INFORMATIQUE office de la Propri t Industrielle Bruxelles 28 2 1997 J 9 N du mandataire 0196 Messieurs re Brevet europ en No 0491878 du 8 juin 1990 CHIRON CORFORATION La mention 1 d livrance de ce brevet europ en t publi e au Bulletin Europ en des Brevets du 19 f vrier 1997 Afin d assurer la protection en Belgique et conform ment l article 65 de la Convention de Munich je vous remets une traduction du 2 fascicule du brevet europ en J ai l honneur de vous signaler qu un pouvoir g n ral est d j en votre possession Je vous remercie de bien vouloir me confirmer la publication de cette traduction et vous prie d agr er Messieurs l expression de ma haute consid ration 2 Hans Guy PLUCKER GA PG v OFFICE KIRKPATRICK S A OPRI DIE 27 2 1997 RE io MEMBER BANKERS B L 310 0515119 66 TELEPHONE 32 2 682 1600 PRESIDENT PLUCKER BELGIAN ASS amp INT FED P A VAT BE 426 603 921 S G 210 0717845 01 TELEX 63198 OKIRK B ADMIN J F PLUCKER ITMA 76 793 C C P 000 0016732 48 TELEFAX 32 2652 1900 12 21 22
9. Lys Thr TTC CTC Phe Lue GCC ACC Ala Thr ATC GGC lie Gly TCT CTA Ser Leu TCT TCT Ser Ser GTT GTA Val Val TGG CTG Trp Leu GGC GTG Gly Val TCA GAG Ser Glu TTC AAG Phe Lys CTC ACC Leu Thr CAG ACC Gln Thr CCC TGC Pro Cys AAG Lys Pro TTC CAG Phe Gln ATC AAT Ile Asn GGG CAG Gly Gln GTG Val GGG Gly AGC Ser ACG Thr Ile CGA Arg GCA Ala AAC Asn GAG Glu GGC Gly GGC Gly CAC His AAG Lys CAG Gin TGG Trp CTG Leu CGG Arg GTC Val FIG 1C GAG Glu GGG Gly CTC Leu CTC Leu CAG Gin AGC Ser ACC Thr AAC Asn CGC Arg CTG Leu CTG Leu CAA Gln ACC Thr GTC Val AGG Arg TAT Tyr GAG Glu CCC Pro TAC CTG Leu CCC Pro TTC Phe TTC Phe AGG Arg CCT Pro CCG Pro CCT Pro CGG Arg AGA Arg TAC Tyr GGC Gly ATC Ile AAC Asn GAG Glu GAG Glu AAG Lys GAC Asp TTT Phea rne 3 4 g LL lt J FIG 3A FIG 3B
10. e s lectionnable par des drogues Nombreuses sont les lign es de my lomes qui sont connues dans le domaine la plupart d entre elle sont incapables de pousser dans milieu de culture cellulaire HAT suppl ment e Une lign e cellulaire de my lome typique est par exemple SP 2 OAg14 Les hybridomes sont donc form s en combinant les lymphocytes et les cellules de my lome dans un rapport 5 1 en g n ral a nano a Em 10 15 20 25 30 35 221 2 x 10 de cellules de my lome pour 1 x 107 lymphocytes Le m lange cellulaire est culott le milieu limin et la fusion effectu e par l ajout de 1 ml de solution de poly thyl ne glycol 1500 40 v v par addition au goutte goutte pendant 60 secondes la temp rature de la pi ce suivi par une incubation 60 secondes 37 C On ajoute la suspension cellulaire sous agitation douce 9 mi de milieu Eagles modifi de Dulbecco pendant 5 minutes Les agr gats cellulaires dans le m lange sont remis en suspension doucement les cellules sont lav s et d barrass es du PEG r siduel et tal es dans des plaques microtitration une densit d environ 2 x 10 cellules puits dans du DMEM suppl ment avec du s rum de veau foetal Apr s 24 heures on fournit comme nutriment aux cellules un milieu s lectif double contenant une solution d hypoxanthine et d azas rine Les milieux des puits o les cellules poussent test positif sont
11. sent aucun de ces inhibiteurs n a une efficacit reconnue dans le traitement de septic mie De la discussion pr c dente il apparait clairement qu il est n cessaire d identifier et de d velopper d autres inhibiteurs anti TNF la fois sur la base d anticorps et galement en employant d autres strat gies qui peuvent tre utilis s avec efficacit dans le traitement de la septic mie Dans sa forme la plus g n rale l invention d crite ici pr sente des m thodes et des compositions pour inhiber la production de la forme mature d une hormone prot ique de pr f rence d origine immunologique partir de son pr curseur la prohormone Ces compositions sont utiles pour pr venir ou traiter des maladies concernant des patients ayant des taux lev s d hormones matures circulantes Un deuxi me objet de l invention d crite ici concerne un proc d d identification de mol cules qui inhibent la production d une ou de plusieurs forme s mature s de TNF De tels inhibiteurs sont distincts la fois de Panticorps anti TNF qui neutralise le TNF et la fois de l anticorps anti LPS qui se et neutralise les effets des LPS Un troisi me objet de l invention est une description d un proc d qui peut tre utilis pour l identification d agents prophylactiques et ou th rapeutiques pour le traitement de la septic mie en partant du principe que ces m dicaments interf rent dans le clivage de la prohormone du TNF de
12. appropri e est celle dans laquelle l alanine et ou la valine est substitu e ou d l t e Les peptides d crits ci dessus peuvent tre r alis s en utilisant des techniques bien connues dans le m tier telies que par exemple la m thode en phase solide de Merrifield d crite dans Science 232 341 347 1985 La m thode permet d utiliser des synth tiseurs disponibles dans le commerce tels que le synth tiseur automatique de peptide Biosearch 9500 ou le clivage des acides amin s prot g s est r alis en utilisant le fluorure d hydrog ne et les peptides purifi s par HPLC pr parative utilisant un appareil Walters Delta Prep 3000 sur une colonne de 15 20 um Vydac Cd PrepPAK 10 15 20 35 13 Enfin il est important de savoir que lu sp cificit de la convertase est similaire celles des enzymes telles que l lastase c est dire que ces enzymes clivent de fa on pr lominante entre des acides amin s dont la charge est neutre tels que la valine la proline et l alanine Donc plus des peptides inhibiteurs mentionn es ci dessus de nombreux autres inhibiteurs connus pour inhiber l lastase vont de fa on g n rale inhiber l enzyme qui clive le TNF En utilisant le dosage d crit ci dessous on peut identifier les compos s qui inhibent la convertase De nombreux inhibiteurs de l lastase sont disponibles dans le commerce voir par exemple les catalogues de Boehringer Mannheim Biochemicels ou s
13. contenant la sonde Pour une plus forte stringence des temp ratures et des temps d incubation plus courts sont employ es Les conditions appropri es d hybridation consistent hybrider les sondes aux filtres dans du SSC 5x de la solution Denhardt NaPO 50 mM pH 7 0 EDTA 5 mM SDS 1 et 100 mg ml d ARN de levure 10 sous la de l oligonucl otide utilis pour faire le criblage Ensuite les filtres sont lav s deux fois 30 minutes pour chaque lavage la temp rature de la pi ce avec du SSC 2x SDS 0 1 et lav s encore une fois avec du SSC 2x SDS 1 5 sous la nt LS H l 10 15 20 30 28 Tu de l oligonucl o ide utilis pour cribler puis les filtres sont s ch s Enfin les filtres sont autoradiographi s 707 pendant 36 heures L autoradiographie met en vidence les plaques contenant le virus qui porte les mut ines d int r t En plus de produire des mut ines dans lesquelles la valine en position 2 et ou 13 ont t d l t e ou substitu e des mut ines poss dant de grandes d l tions peuvent tre produites d l tion qui englobent les deux sites de clivage pr dominant du TNF 26 kd Un mode de r alisation privil gi de mut ines est de cr er une d l tion des acides amin s de 9 14 comme cela est pr sent la Figure 1 Cette mut ine t construite en utilisant les mat ri
14. l anticorps d sir ADN qui peut tre isol et transf r dans des cellules par des techniques de g n tique connues pour produire un anticorps par g nie g n tique Un exemple illustrant ce dernier cas est la production d anticorps simple cha ne ayant le site de combinaison de l anticorps des hybridomes d crits ici L anticorps simple cha ne est d crit dans le brevet am ricain 4 704 692 Un deuxi me exemple d anticorps produit par g nie g n tique est un anticorps recombinant ou chim rique Des m thodes pour la production d anticorps recombinant sont d crites dans le brevet am ricain No 4 816 567 inventeur Cabilly et coll la demande de brevet japonais Num ro de s rie 84169370 d pos e le 15 Ao t 1984 la demande de brevet britanique 8422238 d pos e le 3 Septembre 1984 et la demande de brevet japonais No 85239543 d pos e le 28 Octobre 1985 La demande de brevet britanique No 867679 d pos e le 27 Mars 1986 d crit des m thodes pour produire un anticorps alt r dans lequel au moins des parties des r gions de d termination de la compl mentarit CDRS des domaines variables des cha nes l g res et lourdes ont t remplac es par des partie analogues des CDRs d un anticorps d une autre esp ce En utilisant les m thodes d crites il est possible de construire un anticorps recombinant ayant la r gion CDR d une esp ce greff e sur un anticorps d une deuxi me esp ce qui a une r gion CDR rem
15. ml inhibent la convertase N 1 10 15 20 25 30 35 19 montr galement que le 1 3 ac tyloxyl 7 m thoxy 8 0xy 8 0x0 5 thio 1 azabicyclo 4 2 0 oct 2 en 2 yl carbonyl morpholine S S dioxide 6R cis inhibe la convertase une concentration de 1 mM Ces r sultats sont pr sent s la Figure 3 B Test du monocyte plus de produire le TNF 26 kd par le test de transcription traduction in vitro d crit ci dessus des monocytes stimul s qui produisent du TNF 26 kd Kriegler et coll 1988 Cell 53 45 peuvent tre utilis s comme source de la mol cule Une m thode appropri e empioy e pour effectuer le test est de stimuler des monocytes et ensuite en pr sence de convertase de mesurer la disparition du TNF 26 kd et l apparition d esp ce de poids mol culaire plus faible de pr f rence du TNF 17 kd Bri vement des monocytes humains sont purifi s partir de sang humain par centrifugation la pr paration est ensuite enrichie en utilisant les propri t s d adh rence des monocytes aux fonds des boites de culture cellulaire La centrifugation consiste purifier les monocytes travers des plaques de Ficoll et percoll 49 2 disponible chez Pharmacia Les recommandations du fabricant sont suivies Le m lange de cellules obtenu apr s l tape de centrifugation un m lange de monocytes et de lymphocytes est tal dans des boites de culture de tissu contenant du
16. nuit de cellules HB2151 plus 3 02 d agar doux Les plaques obtenues sont cribl es en utilisant la m thode d hybridation sur plaque Bien que de nombreuses m thodes soient connues une description de la m thode appropri e est faite ci dessous Les plaques sont r pliqu es par copie sur des papiers filtres de nitrocellulose S amp S type 85 et l ADN fix sur le filtre par une succession de traitement pendant 5 minutes avec du NaOH 0 5 et du NaCl 1 5 NaCl et Tris HCI pH 7 4 0 5 et SSC 2x solution saline de citrate classique Les filtres sont s ch s et pass s au four 80 C pendant 2 heures sous vide Les filtres copie sont pr hybrid s 55 C pendant 2 heures avec 10 par filtre de tampon d hybridation D ADN SSC 5x pH 7 0 solution de Denhardt olyvinylpyrrolidone plus du ficol et de la BSA 1x 0 002 de chaque tampon phosphate de sodium 7 0 50 mM EDTA 0 5 mM SDS 1 et ARN de levure 100 ug ml Le tampon de pr hybridation est limin et les chantillons hybrid s avec 1 sonde trait e par une kinase appropri e c est dire les oligonucl otides trait s par une kinase cit s pr c demment dans des conditions qui d pendent de la stringence d sir e Environ 2 106 cpm mil total sont utilis s Les conditions typiques de stringence mod r e sont une temp rature de 42 C plus du formamide 50 pendant 24 36 heures en employant un volume de 1 5 ml filtre de tampon d hybridation d ADN
17. ou th rapeutique comprend un anticorps anti convertase ou comprend des mut ines non hydrolysables de TNF de poids mol culaire d environ 26 000 o ventuellement lesdites mut ines ont une substitution une d l tion sur 1 valine en position 2 et ou une substitution ou une d l tion sur la 1 en position 13 ou comprend un peptide ou une prot ine ayant une s quence en acides amin s en grande partie similaire 1 s quence en acides amin s pr sente sur ledit TNF de 26 kd laquelle ladite 4 H i 3 i 1 I i 10 15 20 25 30 a3 convertase se lie 8 Agent prophylactique ou th rapeutique selon la revendication 7 dans lequel lesdites mut ines comprennent une mut ine ayant une d l tion des acides amin s allant de 9 14 du TNF de 26 kd 9 Agent prophylactique ou th rapeutique selon la revendication 6 qui comprend un peptide qui entre en comp tition pour la liaison de 1 convertase du TNF avec ledit TNF de 26 kd et comprend la structure X Ala Val Y dans laquelle X et Y sont des acides amin s 10 Agent prophylactique ou th rapeutique selon la revendication 6 comprenant un peptide ou une prot ine ayant une s quence d acides amin s choisis parmi le groupe constitu de Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Se
18. outre enrichis en talant le m lange de cellules H 10 15 20 25 30 35 9 dans des boites de culture celiulaire et en incubant ces cellules pendant le temps n cessaire pour que les monocytes adh rent la surface du plat de culture Les lymphocytes sont alors limin s du plat par lavage laissant seulement les monocytes adh rant au fond du plat Ces cellules peuvent alors tre utilis es telles quelles ou peuvent tre stimul es pour produire des niveaux lev s de convertase en utilisant des activateurs connus de monocytes de pr f rence des lipopolysaccharides et du phorbol myristate ac tate Les cellules peuvent tre fractionn es et un extrait ou bien une fraction membranaire peut tre pr par partir de ces cellules et employ dans les dosages d crits ci dessous Des inhibiteurs de l activit convertase peuvent aussi pr senter une action prophylactique ou th rapeutique que l on peut utiliser dans le traitement de la septic mie ls peuvent tre identifi s en utilisant les tests suivants et en outre comprendre dans le m lange r actif du dosage des compos s dont on souhaite tester l activit inhibitrice Un test appropri consiste combiner du TNF 26 la convertase et l inhibiteur Les hommes du m tiers auront bien sur compris que les substances inbibitrices seront ajout es la convertase avant que la convertase ne soit ajout e TNF ou qu elle peut tre ajout e
19. pos s par puits dans une solution saline tamponn e au phosphate et laiss s 4 C toute la nuit Les puits sont prot g s apr s Pincubation de la nuit avec une solution saline tamponn e au phosphate contenant de l albumine s rique de boeuf pendant au moins une heure 47 et ensuite lav s avec la solution saline tamponn e au phosphate contenant la BSA Ensuite on ajoute 1 mi de PBS BSA contenant 107 lymphocytes dans chaque puits des plaques de six puits On laissent les lymphocytes en incubation pendant 70 minutes et la fin de cette p riode toutes les cellules non adh rentes sont limin es par aspiration Les celluies adh rentes sont incub es dans un milieu de culture cellulaire IMDM Sigma Chemical Co St Louis Missouri contenant du s rum veau foetal 10 Les cellules adh rentes sont soumises une transformation par le virus Epstein barr en ajoutant dans leur milieu de culture une quantit quivalente de milieu de culture dans lequel des cellules de la lign e cellulaire ouistiti infect es par le virus Epstein barr 95 8 ont pouss et donc contiennent le virus Les cellules sont cultiv es dans ce milieu 37 C pendant trois heures et de cette fa on les lymphocytes dans la population de cellules adh rentes sont soumis une infection par le virus Epstein barr Apr s cette p riode d infection les cellules sont lav es et ensemenc es dans des boites de microtitration 96 puits une densi
20. qu elle s applique la convertase du TNF signifie que la convertase sous cette forme est essentiellement insoluble comme cela est indiqu i 1 i H 10 15 20 30 35 6 par la pr sence de la plupart de l activit convertase dans un culot obtenu apr s centrifugation 300006 Un anticorps recombinant se r f re un anticorps dans lequel une portion de chacune des s quences en acides amin s des cha nes lourdes et l g res est homologue une s quence correspondante d un anticorps obtenu partir d une esp ce particuli re ou appartenant une classe particuli re tandis que le segment restant des cha nes est homologue une s quence correspondante d un autre anticorps La plupart du temps dans un anticorps recombinant la r gion variable des cha nes lourdes et l g res correspond des r gions variables d anticorps d riv es d une esp ce de mammif re tandis que les r gions constantes sont homologues aux s quences d un anticorps d une autre esp ce Dans sa forme la plus g n rale la pr sente invention concerne des proc d s et des compositions pour l identification d inhibiteurs de maladies associ es la production d hormones matures partir de leur forme prohormone Le mode de r alisation privil gi d une prohormone est le TNF 26 kd qui est coup en des mol cules de plus faible poids mol culaire en particulier en une mol cule ayant un poids mol c
21. traiter les patient qui sont infect s avec un virus l tat latent Les demandeurs ayant d crit de fa on g n rale leur propre vision de l invention les exemples qui sont pr sent s ci dessous sont des illustrations de la port e de l invention 11 est vident pour les hommes du m tier que ces exemples ne viennent pas limiter invention aux mat riel et m thodes pr sent s puisqu il existe de nombreuses substitutions possibles qui peuvent tre faites sans se d partir de la port e de l invention Exemple 1 Conversion du 26 kd Le vecteur pFVXM d pos l American Type Culture Collection sous le num ro d acc s No 67 103 est utilis pour produire un vecteur pFVXM TNF6 qui contient la s quence d ADN qui code pour l esp ce TNF 26 kd Pour produire ce dernier vecteur le plasmide B11 qui contient la s quence d ADNc qui code pour l esp ce TNF 26 kd a t trait Pst pour exciser la s quence codante Le fragment est purifi en utilisant des techniques classiques d lectrophor se Ensuite le vecteur pFVXM est trait avec Pst I et le fragment Pst de 11 contenant la s quence codante de 26 kd est ins r e dans une r gion site multiple d insertion du vecteur en utilisant des techniques classiques comme cela est d crit ci dessus pour produire le vecteur pFVX TNF6 Le vecteur pFVX TNF6 est utilis pour produire la lign e cellulaire TNF 6 8 comme d crit par Kriegler et coll 1988 voir plus haut
22. 26 kd par une enzyme que l on appelle la convertase qui clive la mol cule de 26 kd et par cons quent produit des mol cules de plus faible poids mol culaire induisant la septic mie Un quatri me objet de l invention est une description d un proc d d identification d inhibiteurs de la septic mie qui ont des applications significatives d ordre prophylactique et ou th rapeutique en partant du principe que ces inhibiteurs sont capables d interf rer avec la production du TNF mature de 17 kd partir du pr curseur de 26 kd en agissant sur la convertase qui limine la s quence peptide signal de 76 acides amin s de la mol cule de TNF de 26 kd pour proquire le TNF de 17 kd Un cinqui me objet de l invention est une pr sentation d une classe de compos s qui sont la fois des inhibiteurs de la convertase et sont galement efficaces dans la pr vention et ou le traitement de la septic mie Une liste partielle des compos s appartenant cette classe comprend lt 1 1 4 1 10 15 20 25 30 4 des anticorps anti convertase des mut ines de la prohormone et des prot ines ou peptides qui entrent en comp tition avec la forme de 26 kd du TNF pour la liaison la convertase Un sixi me objet de l invention est une pr sentation d agents prophylactiques ou th rapeutiques appropri s qui inhibent l activit de la convertase et qui sont efficaces
23. GG 3 502 crible VAL 1 gt ALA 1 5 GCT 3 503 VAL 13 ALA 13 57 TAC GGC ACT CGG 3 CP 504 crible VAL 13 gt ALA 13 5 TGG GCA GGC 3 505 VAL 1 gt GLY 1 57 TGA TGC GGC 3 506 crible VAL 1 gt GLY 5 3 507 VAL 13 gt GLY 13 57 TAC GGC ACT CGG 3 508 crible VAL 13 gt GLY 13 5 GCA CCA GGC 3 509 VAL 1 gt LEU 1 5 TGA AGG 3 510 crible VAL 1 gt 1 5 3 511 VAL 13 gt LEU 13 5 TAC ACT 3 512 crible VAL 13 gt LEU 13 5 TGG GCC 3 CP 513 VAL 1 gt 5 TCG TGA TCT TGC CTG AGG 3 514 crible VAL 1 gt 5 GAT GCC 3 515 VAL 13 gt 13 57 GGC CTT CGG 3 516 crible VAL 13 gt 13 5 GGC 3 517 VAL gt PHE 1 57 TGA AGG 3 518 crible VAL 1 gt PHE 1 5 GAT 3
24. Su comp tente pour la transformation d ADN et HB2151 Su utilis e comme cellules formant un tapis de surface lawn pendant la transformation M13 GAP le RF est utilis pour la formation du duplex contenant des br ches et le M13mp19amber l ADN cible du TNF 26 kd est clon dans ce vecteur et l ADN simple brin isol pour la formation du duplex contenant des br ches Les phages sont introduits dans la souche bact rienne appropri e multipli s et titr s comme suit Pour faire une grande quantit soit de phage pour l ADNss ou de cellules pour l ADNds ou RF on utilise le m me protocole d infection Un phage purifi sur plaque est produit en utilisant les techniques classiques Bri vement des plaques d agar sont griff es avec des surnageants de phages puis on d pose doucement une couche constitu e de 4 ml d agar doux et de 100 ml de culture fra che de la nuit de BMH 71 18 Ensuite des plaques isol es sont ensemenc es et incub es avec une dilution de 1 50 de culture fra che de la nuit de BMH71 18 dans du R26 ou R27 10 mm de et agit 37 C pendant 4 5 6 heures R17 milieu de culture N Z amine contient 10 g de N Z amine type 5 g de NaCl dans un volume final d un litre compl t avec de l eau alors que R26 contient 8 g de tryptone 5 g d extrait de levure 5 g de NaCl daus un volume final d un litre compl t avec de l eau milieu de La solution de phage est titr e et les bact
25. ation de l expression du virus de l immunod ficience humaine dans des cellules humaines porteuses du virus l tat latent Folks et coll 1989 Proc Sci USA 86 2365 Par cons quent pr venir ou inhiber la formation du TNF de 17 kd ou des formes de plus faible poids mol culaire pourrait tre un traitement prophylactique valable pour les patients atteints du SIDA en pr venant l expression du virus l tat laterit chez le patient Le TNF joue galement un r le dans de nombreuses maladies auto immunes et en particulier dans l arthrite Duff et coll 1987 International Conference on Tumor Necrosis Factor or 10 15 20 30 35 2355 and related cytotoxins 175 10 Des compos s ou des m thodes inhibant l action du TNF peuvent avoir des applications consid rables dans le traitement de nombreuses maladies d origine immunologique En plus de l anticorps a pens d autres mol cules ayant une activit inhibitrice sur le TNF Ces inhibiteurs du TNF qui ne sont pas des anticorps sont d crits par Seckinger et coll 1988 J of Exp Med 167 151 Seckinger et coll 1989 J Biol Chem 264 11966 et dans la demande de brevet europ en 88830365 8 inventeurs Wallach et coll Les inhibiteurs sont pr sents dans l urine de patients fi vreux et ont t purifi s leurs poids mol culaires s chelonnent entre environ 27 000 et 33 000 Jusqu pr
26. au TNF avant ou imm diatement apr s l addition de la convertase L ordre d addition peut faciliter l identification des inhibiteurs mais n est pas d terminante Si une substance a une activit inhibitrice on peut le mettre en vidence par une analyse en lectrophor se de la solution qui d montrera une r duction de la quantit de l esp ce 26 kd et simultan ment la pr sence de mol cules de TNF de plus faible poids mol culaire En plus d identifier des compos s ayant une activit anti convertase que l on ne soup onnait pas on d montrera que plusieurs compos s ont de fortes activit s anti convertase tels que des anticorps anti convertase polyclonaux ou monoclonaux ou des anticorps recombinants de pr f rence humanis s peut produire un anticorps monoclonal dirig contre la convertase en utilisant les m thodes g n rales d crites par Kohler G et Milstein C Kobler G et Milstein C 1975 Nature 256 495 qui ont t modifi es au cours des ann es comme le savent les hommes du m tier Ces tudes initiales impliquaient la fusion de lymphocytes murins avec des plastocytomes qu il est possible de s lectionner par des drogues pour produire des hybridomes Ensuite la technique a t appliqu e la production de lign es cellulaires hybrides capables de s cr ter des anticorps monoclonaux humains Ces derni res m thodes sont d crites de fa on g n rale dans l article de Abrams P 1986 Methods in Enz
27. c mie En 1988 Kriegler et coll Cell 53 45 ont avanc l hypoth se que le TNF peut exister la fois sous la forme d une prot ine li e la membrane de 26 kd et la fois sous une forme soluble correspondant l esp ce de 17 La forme de 26 kd est le pr curseur ou la prohormone de la mol cules mature de 17 kd En outre Kriegler et coll voir ci dessus l hypoth se qe deux formes de TNF peuvent avoir des effets biologiques diff rents Puisque le TNF joue un r le cl dans le d veloppement d une septic mie il apparait tout fait clair qu un besoin d identifier et de d velopper des agents prophylactiques et ou th rapeutiques anti TNF existe Comme mentionn ci dessus l anticorps anti TNF semble prometteur et on a montr son efficacit sur des babouins Cependant ces tudes impliquaient l utilisation de TNF non humain et d anticorps anti TNF non humain D un point de vue pratique les applications th rapeutiques de l anticorps anti TNF qui n est pas d origine humaine sont limit es en raison du rejet immunologique de cet anticorps par le syst me immunitaire du patient Par cons quent on privil gie l utilisation d un anticorps humain ou d un anticorps cr e par des techniques g rie g n tique consistant en une r gion constante humaine et une r gion variable de souris On montr r cemment que le TNF en plus du r le cl qu il joue dans la septic mie est impliqu dans l initi
28. dans le traitement de la septic mie et qui poss dent la s quence en acides amin s du TNF correspondant celle reconnue par la convertase Ces objets de l invention et d autres qui viendront s y ajouter apparaitront plus clairement en consid rant la description d taill e de l invention pr sent e ci dessous La Figure 1 en pr sente la carte de restriction de la s quence d ADN qui code pour le TNF 26 kd En est repr sent le profil d hydropathie du TNF 26 kd et les s quences d ADN et d acides amin s de la mol cule La Figure 2 montre la conversion du TNF 26 kd par la convertase du TNF Les pistes et C repr sentent des contr les diff rents lysat des cellules TNF 6 8 A contr les de la transcription traduction de la mol cule de 26 kd B et de l incubation Les pistes D E et F montrent la conversion du TNF 26 kd provenant de la transcription traduction en TNF 17 kd de mani re pr dominante par la convertase pr sente dans les fractions cytosoliques des cellules HL 60 5 1 non induites D et induites ou une fraction du culot C 1 obtenue partir de cellules induites G est le blanc La Figure 3 montre l effet des inhibiteurs sur la conversion du TNF 26 kd en ses formes de plus faible poids mol culaire telles que d termin es sur gel d lectrophor se En les pistes A et D repr sentent respectivement l immuno pr cipitation du lysat cellulaire provenant d une lign e ce
29. de 26 kd clivables Les mut ines TNF 26 kd qui sont d crites entrent en comp tition avec la liaison la convertase et donc inhibent ou r duisent son activit Les mut ines dont le mode de r alisation est privil gi sont celles ayant une valine en position 1 et ou 13 ou une alanine en position 1 et ou une proline en position 12 substitu e ou d l t e Les mut ines sont construites en utilisant une modification de la m thode de mutag n se de site dirig e sur duplex contenant des br ches gapped duplex Les tampons solutions suivants sont utilis s pour r aliser les protocoles d sir s Tampon du duplex contenant des br ches 5 GDB contenant du KC1 0 938 M et du Tris 7 5 0 063 PEL 10x contenant du KCI 1 M Tris 0 3 M MgCi 0 15 M DTT 0 02 M pH 7 5 10x contenant du Tris 0 5 M 0 1 M DTT 0 05 EDTA 0 001 M 8 0 une solution fra che contenant 0 25 mM de dCTP dATP dGTP dTTP faite partir de solution m re 10 mM une solution d ATP de concentration 0 1 M d ATP faite dissolvant 60 mg 4 dans 0 8 mi et en ajustant le 7 0 avec du NAOH 0 1 M et le volume final 1 0 ml avec de l eau 20 2 5M 3 0 et du TE satur ph nol De nombreuse souches bact riennes et phages sont employ s pour produire les mut ines d sir es et ce sont 71 18 JM103 souches pour multiplier des phages HB2154 MutL
30. e de my lome s lectionnable et les cellules hybrides ainsi cr es sont isol es et caract ris es par leur production d anticorps Plus sp cifiquement des cellules mononucl aires sont s par es sur plaque de Ficoll Ficoll hypaque Pharmacia et des monocytes isol s du m lange en fonction de leur propri t d adh rence au plastique Des m thodes classiques sont utilis es pour effectuer ce protocole Ensuite les cellules non adh rentes sont enrichies en producteur d anticorps par un lavage avec un antig ne sp cifique panning Ce lavage est une technique connue dans le domaine et implique l incubation de la population de cellules s cr trices d anticorps avec l antig ne appropri fix sur une surface de plastique Les cellules qui expriment un anticorps leur surface lient l antig ne a EE ns i t 10 15 20 25 30 35 22 par cons quent adh rent la surface de plastique alors que les cellules qui n expriment pas d anticorps la surface n adh rent pas et sont donc limin es au lavage On enrichie donc la pr paration en cellules s cr trices d anticorps sp cifiques par cette technique Plus sp cifiquement des boites 6 puits Costar sont recouvertes avec une fraction membranaire contenant la convertase pr par e partir de cellules HL 60 soit induites soit non induites comme d crit plus haut 150 ug de fraction membranaire sont d
31. e en principe comme un agent prophylactique ou th rapeutique des septic mies et d mesurer l inhibition de ladite conversion dudit TNF de poids mol culaire d environ 26 000 une ou plusieurs ne ne ant db ct din 10 15 20 25 30 32 esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire 5 Proc d selon la revendication 4 dans lequel mesurer l inhibition de ladite convertase comprend les tapes consistant a marquer ledit TNF de poids mol culaire d environ 26 000 avec un marqueur ad quat o ventuellement ledit marqueur est choisi parmi un groupe constitu de radionuci ides fluors o d enzy b traiter ledit TNF de 26 kd marqu avec ladite convertase afin de convertir ledit TNF de 26 kd en ledit TNF de poids mol culaire d environ 17 000 c s parer ventuellement par lectrophor se ledit TNF de poids mol culaire d environ 26 000 dudit TNF de poids mol culaire 17 000 et d mesurer ledit marqueur pr sent dans ledit TNF de poids mol culaire 17 000 ou mesurer la r duction dudit marqueur dans les esp ces de 26 kd 6 Agent prophylactique ou th rapeutique de la septic mie qui inhibe convertase du TNF la caract ristique de ladite convertase tant de convertir le TNF de 26 kd en une ou plusieurs esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire 7 Agent prophylactique ou th rapeutique selon la revendication 6 o ledit agent prophylactique
32. e phosphate en 5 et de pr venir la religation du vecteur Les digestions par la BAP sont conduites pH 8 dans du Tris environ 150 mM en pr sence de Na et de Mg en utilisant environ 1 unit de par ug de vecteur 60 pendant environ heure Les fragment d acide nucl ique sont r cup r s par l extraction de la pr paration au ph nol chloroforme suivi d une pr cipitation l thanol On peut galement pr venir la religation dans les vecteurs en les soumettant une double digestion par une digestion suppl mentaire des fragments non d sir s Dans les constructions expos es ci dessous on v rifie que les ligations sont correctes en transformant dans un premier temps la souche appropri e d E coli avec le m lange de ligation Les transformants sont s lectionn s par le test de la r sistance l ampicilline la t tracycline ou d autres antibiotiques ou en utilisant d autres marqueurs en fonction du mode de construction du plasmide tel que cela est connu dans le domaine Des minipr parations d ADN peuvent tre pr par es partir des transformants par la m thode de Ish Howowiez D et coll 1981 Nucleic Acids Res 9 2989 et l ADN analys par restriction et ou s quen age par la m thode did soxy de Sanger et coll 1977 Proc Natl Acad Sci USA 74 5463 comme cela est d crit en outre par Messing et coll 1981 Nucleic Acids Res 9 309 o par la m thode de Maxam et coll 1980 Methods
33. el et m thodes d crits plus haut et l oligonucl otide 75 qui la s quence suivante 5 GTTTGCTACAACATGGAGGTCCCTGGGGGA 3 Inhibiteurs prot ine peptide Les peptides ayant les s quences suivantes en acides amin s sont synth tis es en utilisant la m thode en phase solide d crite en d tail par Merrifiels R B 1985 dans Science 232 341 347 Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro On utilise un appareil de synth se automatique de peptide Biosearch 9500 en clivant avec du fluorure d hydrog ne et une purification pr parative par HPLC en utilisant l appareil Waters Delta Prep 3000 avec une colonne de 15 20 um Vydac C4 PrepPAK On montre que ces peptides inhibent l activit convertase en r alisant je test d crit plus haut en pr sence de quantit s diff rentes de chaque peptide L lectrophor se sur gel et le Western Blot du m lange de r action montrent une inhibition de la conversion du TNF 26 kd en TNF 17 kd Exemple 4 Effet protecteur des inhibiteurs de convertase dans le traitement des septic mes On montr comme suit que des compos s qui sont des inhibiteurs fonctionnels de l activit de la convertase sont capables de pr venir la s
34. eptic mie sur un mod le animal ie babouin Un anticorps anticonvertase humain murin ou recombinant une concentration de 5 mg kg est administr par une simple I V 60 minutes avant que l animal ait re u une dose letale d E coli et 2 mg ml simultan ment avec la charge d E coli L anticorps est administr dans une 19 15 29 solution saline physiologique et environ 4 X 1019 bact ries E coli sont utilis s La dose coli est administr e par perfusion sur une p riode de 2 heures Les animaux qui ont re u l anticorps sont prot g s pour au moins 7 jours tandis que les animaux qui ont re u seulement la solution saline meurent dans les 16 32 heures Une protection similaire est attribuable aux inhibiteurs de convertase de type mut ine du TNF comme cela est montr dans l Exemple 3 Les mut ines sont administr es une concentration de 5 mg kg par une simple 1 60 minutes avant que l animal ait re u une dose de 4 x 10 de bact ries E coli Les babouins re oivent aussi 2 mg kg de mut ines simultan ment avec la charge bact rienne Enfin les peptides pr sent s dans l Exemple 3 savoir Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser et Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala ont t test comme cela est d crit ci dessus et produisent des effets protecteurs similaires La pr sente invention a t d crite en faisant r f rence des modes de r alisations sp cifique
35. estriction appropri es dans des conditions qui sont g n ralement bien connus dans le domaine et les particularit s de chacune sont sp cifi s par fabriquant de ces enzymes disponibles dans le commerce voir par exemple le catalogue de produits de New England Biolabs En g n ral environ 1 ug de plasmide ou d ADN est cliv par une unit d enzyme dans environ 20 wi de solution tampon Dans les exempies d crits ici typiquement on utilise l enzyme de restriction exc s pour assurer a digestion compl te du substrat ADN Des temps d incubation d environ une heure deux heures 37 C sont appropri s bien que des variations peuvent tre tol r es Apr s chaque incubation les prot ines sont limin es par extraction au ph nol chloroforme et peut tre suivie d une extraction l ther et l acide nucl ique est r cup r dans les fractions aqueuses par pr cipitation l thanol suivie par une chromatographie sur colonne S rhadex G 50 Si d sir la s paration en fonction de la taille des fragments de clivage peut tre r alis e par lectrophor se sur gel de polyacrylamide ou d agarose en utilisant les techniques classiques Une description 10 15 20 30 35 14 g n rale des s parations selon la taille est donn es dans Methods in Enzymology 1980 65 499 560 Les extr mit s des fragments cliv s par enzyme de restriction peuvent tre modifi es pour devenir des extr
36. ilisation dans la mutag n se du TNF 26 kd Les oligonucl otides suivants sont utilis pour changer la valine en position 2et ou 13 l alanine en position L et la proline en position 12 Les oligonucl otides et leurs mut ines correspondantes sont pr sent es dans le Tableau 1 ableau L Mut ines a D l tions AVAL 1 AVAL 13 AVAL 1 APRO 12 AVAL 1 AVAL 13 b Substitutions VAL 1 gt ALA 1 VAL 13 gt ALA 13 VAL 1 gt GLY 1 VAL 13 gt GLY 13 VAL 1 LEU 1 VAL 13 gt LEU 13 VAL 1 gt 1 VAL 13 gt 13 VAL 1 gt 1 VAL 13 gt 13 VAL 1 gt HIS 1 VAL 13 gt HIS 13 VAL 1 THR 1 VAL 13 gt 13 ALA 1 VAL 1 gt 1 HIS 1 PRO 12 VAL 13 gt GLN 12 HIS 13 ALA 1 VAL 1 gt GLN 1 HIS 1 PRO 12 VAE 13 gt SER 12 13 2 Oligonucl otides CP 495 AVAL 1 5 TCG TGA TGC GGC 3 496 crible AVAL 1 5 3 497 APRO 12 5 GGC CGG 3 CP 498 crible APRO 12 5 3 10 15 20 25 30 35 40 25 CP 499 AVAL 13 5 TGC TAC GGC ACT CGG 3 CP 500 crible AVAL 13 5 ATG GGC AGG CTT 3 CP 501 VAL 1 gt ALA 1 57 TGA TCT GGC A
37. ines qui d rivent est d crit dans le brevet europ en 168 214 publi le 15 Janvier 1986 Genentech et le brevet am ricain US 85 01921 d pos le 3 Octobre 1985 Cetus Corporation Le dernier PCT 85 01921 correspond au WO 86 02381 De plus les brevets am ricains No 4 677 063 et 4 677 064 pr sentent des s quences d ADNe qui codent pour les formes de 26 000 et de 17 000 du TNF et galement pour des mut ines de ces mol cules La s quence d ADNc qui code pour des esp ces de TNF 26 kd est de pr f rence obtenue partir du plasmide pB11 d crit dans WO 86 02381 et les brevets am ricains Nos 4 677 063 et 4 677 064 Le plasmide 11 contient le promoteur de SV40 reli de mani re fonctionnelle s quence codante du TNF et donc est utile pour l expression des esp ces de 26 kd dans des cellules h tes eucaryotes De plus un secoud plasmide qui contient la s quence compl te qui code pour le TNF 26 kd est d crite dans la demande de brevet et les brevets am ricains qui pr c dent 10 15 20 25 35 8 H est d sign par 4 Le plasmide pEd est d pos l American Type Culture Collection sous le num ro d adh sion 39894 La s quence d ADNc qui code pour le TNF 26 kd dans le plasmide pB11 est un fragment Pstl De ce fait elle est facilement excis e et ins r e dans chacun des nombreux syst mes d expression appropri s De pr f rence le syst
38. l on sait que les LPS jouent un r le cl dans la septic mie de nombreuses approches ont t mises en oeuvre pour neutraliser son activit Actuellement il d importants es 10 15 20 25 30 35 52 travaux qui sugg rent qu un anticorps anti LPS sera tr s bient t un additif cliniquement valable l antibioth rapie classique Le LPS initie une cascade d v nements biochimiques qui ventuellement conduit au d c s du patient il est g n ralement admis que le deuxi me v nement la suite de l introduction du LPS est la production du facteur de n crose des tumeurs TNF comme r sultat de la stimulation par le LPS des macrophages Des efforts consid rables ont donc t engag s pour produire des anticorps neutralisantsanti TNF ou d autres mol cules capables d inhiber ses effets septiques Il est probable qu un anticorps anti TNF aura des applications cliniques int ressantes Tracey et coll 1987 Nature 330 662 Le TNF existe sous deux formes une forme li e la membrane et une forme soluble s cr t e Decker et coll 1987 J of Immunol 138 957 et Kriegler et coll 1988 Cell 53 45 Le TNF humain a t clon et on a montr qu il s agit d un polypeptide de 17 kd auquel s ajoute une s quence peptide signal inhabituellement longue de 76 acides amin s La mol cule de 17 kd joue un r le cl dans l initiation de la cascade biochimique responsable de la septi
39. le brin est pr par partir du phage selon les techniques classiques Ensuite l ADN double brin r pliqu provenant de M13 GAP un d riv M13 manipul g n tiquement qui il manque les codon ambres est cliv avec 2 de restriction Hinc II La s quence de base de est similaire celle de 18 qui il manque la fois les codons ambre et la s quence entre les paires de bases 6172 et 6323 Cette d l tion jouxte les sites de clonage multiple des s ries M13mp et g n re un site de clivage unique Hinc II L ADN duplex contenant des br ches est form en utilisant des techniques drhybridation ADN ADN standards constitu d un ADN simple brin ayant les codons ambre et d un second brin d ADN provenant de la digestion Hinc I du M13 GAP qui il manque la fois les codons ambre et les s quences codantes du TNF Donc la seule portion du duplex contenant des br ches qui est expos e est la s quence cible du 26 Le nucl otide d sir est appari l ADN duplex contenant des br ches et tous les trous sont combl s avec polym rase et les ruptures jointes avec l ADN ligase pour produire un h t roduplexe Ce dernier est transfect de pr f rence dans un h te d ficient en syst me de r paration des m sappariements et un m lange de phages est produit partir de cette population h t rog ne de phages un phage porteur de l ADN mut du TNF 26 kd qui pos
40. llulaire TNF 6 8 transfect e pFVXM TNF6 Kriegler et coll 1988 Cell 53 45 l immunopr cipitation du TNF 26 kd transcrit traduit in vitro l effet du 1 3 ac tyloxyl 7 m thoxy 8 oxy 8 oxo 5 thio l azabicyclo 4 2 0 oct 2 en 2 ylcarbonyl morpholine S S dioxide 6R cis sur la conversion du TNF 26 kd et la conversion du TNF 26 kd en absence de 1 3 ac tyloxyl 7 m thoxy 8 oxy 8 oxo 5 thio 1 azabicyclo 4 2 0 oct 2 en 2 ylcarbonyl morpholine S S dioxide 6R cis En les pistes et montrent respectivement l immuno pr cipitation du lysat cellulaire provenant d une lign e cellulaire TNF 6 8 transfect e par PFVXM TNF6 Kriegier et coll 1988 53 45 l immunopr cipitation du TNF 26 kd transcrit traduit in vitro Les pistes et D montrent respectivement la conversion du TNF 26 kd en pr sence et en absence de 3 4 lt dichloro isocoumarine Les pistes et F montrent respectivement Ja conversion du TNF 26 kd en pr sence et en absence d lastinal Pour faciliter la compr hension de la nature et de la port e de l invention du demandeur plusieurs d finitions concernant diff rents aspects de l invention sont pr sent es ci dessous 10 15 20 25 30 35 25 2 Cependant il faut bien noter que ces d finitions sont de nature g n rale et englobent les d finitions qui sont bien connues des hommes du m tier Les termes prohormone et horm
41. lument n cessaire comme partie d un peptide ou d une prot ine inhibiteur ces derniers pouvant avoir d autres acides amin s qui favorisent ou sont parfois requis pour la liaison de la s quence dipeptidique la convertase et l inhibition de son activit enzymatique Un autre mode de r alisation de l inhibiteur de convertase peptide prot ine est un peptide ou une prot ine qui une s quence en acides amin s qui une fonction similaire Gin Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala Ce peptide r unit ensemble les sites de clivage de la convertase et va donc pr venir la formation de la forme 17 kd du TNF et des formes de plus faible poids mol culaire Le premier le site de clivage dominant se trouve entre l alanine et la valine aux positions 1 et 1 et le deuxi me site se trouve entre la proline et la valine aux positions 12 et 13 Ces positions correspondent la s quence en acides amin s pr sent e en Figure 1 Une deuxi me classe d inhibiteurs comp titifs est constitu e de compos s ayant la s quence montr e ci dessus qui est Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser ou Gin Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala mais dans laquelle des acides amin s ont 616 mut s ou d l t s pour donner un substrat non clivable Un mode de r alisation privil gi de ce peptide est une mut ine du TNF de 26 kd non clivable produite par des techniques de mutag n se de site sp cifique La mut ine la plus
42. me d expression est le plasmide PFVXM qui est d pos l American Type Culture Collection sous le num ro d acc s 67 103 Le plasmide PFVXM est un vecteur r toviral qui est d riv du plasmide pE VX d crit par d pissage donneur de 3 ver Kriegier et 1984 dans Celi 48 483 longue r p tition terminale d riv Moloney r pr c demment que cette s quence d pissage donneur entra ne une diminution de la quantit de matrices piss es traduites partir des constructions r trovirales Donc le plasmide PEVX t manipul pour liminer la s quence d pissage donneur et ins rer la place un fragment analogue Smal du g nome viral du sarcome de la souris Harvey qui ne contient pas la s quence d pissage donneur du virus des leuc mies de la souris Le vecteur qui en r sulte PFVXM ne contient pas la s quence d pissage donneur du virus des leuc mies de la souris Moloney et est porteur d une s quence codant pour les prot ines de l enveloppe du virus Le plasmide PFVXM a un site Pst appropri au niveau duquel les s quences d ADN qui codent pour l esp ce TNF 26 kd peuvent tre ins r es Des sources d activit convertase sont disponibles chez de nombreux et divers mat riaux biologiques Ceux ci comprennent des tissus des cellules ou des extraits ou des fluides associ s ces derniers de pr f rence mais pas n cessairement d
43. milieu RPMI suppl ment avec 20 de s rum de veau foetal Les boites sont mises en incubateur 37 C pendant 30 minutes apr s avoir t rinc es abondamment avec le m me milieu Ce traitement limine les lymphocytes non coll s et laisse en place seulement les monocytes coll s dans le fond de 1 boite Le TNF 26 kd des monocytes est marqu comme suit Les monocytes sont incub s pendant trois heures 37 C dans du milieu RPMI suppl ment avec 20 de s rum de veau foetal 100 ng ml de lypopolysaccharide et 10 ug ml de phorbol myristate ac tate pendant 30 minutes 37 Ces deux derniers compos s induisent l expression du TNF Le milieu RPMI est carenc en cyst ine et le s rum de veau foetal est pr sent la concentration finale de 5 Le s rum est dialys avant usage pour liminer toute trace de cyst ine Apr s une p riode de 30 minutes d incubation on ajoute 109 de S cyst ine et les cellules sont cultiv es en pr sence du radiomarqueur pendant 3 jours 37 C apr s quoi elles sont 1 et utilis es pour tester l activit convertase Les tapes pour mener bien ce test et galement pour identifier les inhibiteurs de convertase sont similaires ceux d crits ci dessus Exemple 3 Mut ine TNF Anticorps Peptide inhibiteur de l activit de la convertase Les compos s suivants ont une activit inhibitrice sur la convertase et peuvent tre pr par s comme suit et test pour le
44. mit s franches par traitement avec le grand fragment de l ADN polym rase d E coli c est dire le fragment Klenow en pr sence des quatres d soxynucl otides triphosphates dNTPs en utilisant des temps d incubation d environ 15 25 minutes 20 25 dans du Tris 7 6 50 mM NaCl 50 mM MgCl 6 mM DTT 6 mM et dNTPs 10 mM Apr s le traitement avec l enzyme de Klenow on fait une extraction ph nol chloroforme et une pr cipitation l thanol du m lange Un traitement dans les conditions appropri es par la nucl ase 5 pour r sultat d hydrolyser les portions d ADN simple brin Les ligations sont r alis es dans des volumes de 15 30 dans les conditions standards et de temp rature suivantes Tris Cl pH 7 5 20 mM MgCl 10 mM DDT 10 mM BSA 33 ug ml NaCi 10 50 mM 1 mM et 0 3 0 6 Weiss unit s d ADN 4 ligase 4 C pour les ligations des extr mit s collantes ou pour les ligations des extr mit s bout franc Les ligations intermol culaires des extr mit s collantes sont en g n ral r alis es en utilisant une concentration d ADN total de 33 100 ug ml Pour les ligations des extr mit s bout franc on utilise une concentration totale d ADN des extr mit s d environ 1 M Dans la construction des vecteurs employant des fragments de vecteur le fragment de vecteur est habituellement trait avec la phosphatase alcaline bact rienne alkaline phosphatase BAP afin d liminer l
45. nine et la valine puisqu on sait que l acide amin N terminal de mol cule de poids mol culaire 17 000 est la valine Plusieurs autres esp ces de TNF sont produites par la convertase et donc ce sont des produits de site de clivage secondaire Ind pendamment du fait que la mol cule de 26 000 soit cliv e un ou plusieurs sites et puisque l on cherche identifier des inhibiteurs de la septic mie ce point particulier est de peu d int r t puisque le dosage pr sent peut permettre de suivre aussi bien la conversion des esp ces de TNF 26 kd que l apparition de formes de plus faible poids mol culaire Le TNF sous des formes de 26 kd ou de 17 kd a t clon et exprim dans de nombreux syst mes Par exemple le clonage du de lapin est d crit dans les brevets europ ens 146 026 publi le 26 Juin 1985 Dainippon Pharmaceutical Co Ltd et EP 148 311 publi le 17 Juillet 1985 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Le clonage du TNF humain ayant 151 et 155 acides amin s 2 et 6 de moins que la forme native est d crit dans le brevet europ en EP 155 549 publi le 25 Septembre 1985 Dainippon Pharmaceutical Co Ltd et le TNF humain de 155 acides amin s est d crit dans le brevet europ en 158 286 publi le 16 Octobre 1985 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha et correspondant au GB 1 158 829 publi le 20 Novembre 1985 Le cionage de la forme mature du TNF 157 acides amin s et de nombreuses formes modifi es mut
46. nt On assume bien entendu que des contr les appropri s ont t r alis s afin de s assurer que l antis ra provenant d animaux non immunis s n a pas d activit inhibitrice Les anticorps poiyclonaux peuvent tre purifi s comme cela est d crit ci dessous i Anticorps murins Pour l immunisation in vivo des souris on peut suivre la m thode de Kohler et Milstein d crite dans Nature 256 495 1975 ou les m thodes modifi es telles que celles d crites par Fendly et coll 1987 Hybridoma 6 359 et Buck et coil 1988 In vitro 18 377 Les techniques in vitro sont d crites de fa on g n rale par Luben R et Mohler M 1980 Molecular Immunology 17 635 Reading Methods in Enzymology 121 premi re partie 18 ou Voss 1986 Methods in Enzymology 121 27 Les souris sont immunis es avec une fraction membranaire des cellules HL 60 une concentration de 1 mg ml a montr auparavant que ces fractions sont positives pour l activit convertase L immunisation est r alis e avec un adjuvant de Freund complet Deux immunisations suppl mentaires ou rappels sont r alis es intervalles mensuels sans adjuvant et un mois apr s le dernier rappel on fait aux souris un rappel 1 avec 10 pg de mat riel membranaire Trois jours apr s le rappel I V les souris sont sacrifi es et leur rate pr lev e et les lymphocytes isol s et fusionn es avec un partenaire une lign e cellulaire de my lome immortalis
47. nt de noter et il convient d insister sur le fait que pratiquement toute m thode qui permet de mesurer la conversion des esp ces de TNF 26 kd peut tre utilis e pour identifier des inhibiteurs de TNF Par cons quent bien que les syst mes recombinants d crits ci apr s permettent d obtenir d normes quantit s de mol cules 26 kd et donc facilitent les tests des inhibiteurs de TNF il est clair que des syst mes non recombinants peuvent tre galement utilis s Par exemple on a montr qu il est possible d identifier la mol cule de 26 kd dans des monocytes stimul s comme cela est d crit par Kriegler et coll 1988 Cell 53 45 Une m thode de dosage 10 15 20 25 30 35 7 appropri e consiste donc stimuler des monocytes pour produire de la mol cule de 26 kd et ensuite en pr sence de convertase mesurer la disparition de la mol cule en des esp ces de plus faible poids mol culaire de pr f rence des esp ces de poids mol culaire 17000 En ce qui concerne la conversion de la mol cule de 26000 la convertase comme cela appara tra ci apr s coupe la mol cule au niveau d un site interne ou peut tre de plusieurs Le site de coupure principal se trouve dans la s quence de jonction qui s pare la forme s cr t e du TNF c est dire l esp ce de poids mol culaire 17000 du peptide signal La s quence cette jonction est Gin Ala Val Arg Ser Ser La coupure principale se r alise entre i ala
48. nt on dispose d une source permanente des anticorps d sir s Les techniques d immunisation in vivo sont bien connues dans le domaine tandis que les techniques vitro sont d crites de fa on g n ral par Luben R et Molher M 1980 Molecular Immunology 17 635 Reading C Methods in Enzymology 121 partie 1 18 ou Voss B 1986 Methods in Enzymology 121 27 De nombreux syst mes d immunisation in vitro sont efficaces pour sensibiliser des cellules humaines Reading C 1982 J of Immun Methods 53 261 est vident maintenant pour les hommes du m tier qu au lieu d immuniser des individus directement avec la convertase des lymphocytes peuvent isol s partir d individus sont soumis ou ont t soumis une infection bact rienne Une fraction de ces lymphocytes est sensibilis e la convertase et peut tre utilis e pour produire des lign es de cellule hybrides s cr tant des anticorps de fa on permanente Par exemple des patients humains immunod ficients sont de fa on g n rale sensibles aux infections bact riennes et en particuliers ceux souffrant d affections malignes de brul res tendues etc et des lymphocytes isol s partir de ces patients peuvent tre une source de cellules s cr tant des anticorps Des lymphocytes sensibilis s peuvent tre immortalis s par transformation virale La technique de transformation virale appropri e pour des lymphocytes humains implique l utilisation du virus E
49. nts sont touch s par l infection bact rienne nocosomiale et parmi eux on compte environ 75 000 d c s Maki D G 1981 Nocosomial Infect Dikson R E Ed page 183 Yrke Medical Books U S A La plupart de ces d c s sont attribuables six principaux bacilles gram n gatif et ce sont Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Proteus Klebsiella Enterobacter et Serratia Le traitement utilis lors d une infection bact rienne est l administration d antibiotiques qui malheureusement ont une efficacit limit e La pathologie pr cise de l infection bact rienne n est pas compl tement comprise n anmoins on sait que des endotoxines bact riennes des lipopolysaccharides LPS en sont la cause primaire Les LPS sont constitu s d au moins trois r gions antig niques importantes le lipide le coeur du polysaccharide et le O sp cifique polysaccharide Ce dernier est galement appel cha ne O sp cifique ou simplement O antig ne La r gion cha ne O sp cifique est une longue cha ne polysaccharidique construite d unit s polysaccharidiques qui se r p tent Le nombre d unit s polysaccharidiques diff re parmi les diff rentes esp ces de bact ries et peuvent varier d une autant que six ou sept unit s polysaccharidiques Bien que la cha ne O sp cifique varie entre les diff rentes bact ries gram n gatif le lipide A et le coeur polysaccharidique sont similaires lorsqu ils ne sont pas identiques Depuis que
50. nues dans le domaine sont les esp ces actives primaires Tel qu utilis ici le TNF ayant un poids mol culaire d environ 26 000 kd se r f re au TNF sous sa forme prohormone On sait que la longueur de la partie peptidique N terminale de la prohormone varie en fonction de l esp ce dont elle est issue bien que le segment propeptidique de ia mol cule soit une s quence hautement conserv e En effet chez la souris environ 86 des 79 acides amin s constituant la s quence signal commune de la pro hormone sont identiques aux 76 acides amin s que comprend la pros quence du TNF humain Donc les hommes de l art pourront facilement discerner qu en faisant r f rence par la suite un TNF de poids mol culaire d environ 26 000 ceci n indique pas que cette mol cule d rive d une esp ce particuli re et que beaucoup d entre elles ont une s quence signal l g rement modifi e par rapport la s quence humaine qui est connue dans le domaine Le terme convertase ou convertase du TNF s applique une enzyme normalement pr sente dans le corps qui est responsable du clivage du TNF 26 kd en une ou plusieurs esp ces de plus faibie poids mol culaire La convertase est essentiellement associ e la membrane si bien que la majeure partie de son activit se situe dans le cytosole Une autre propri t de la convertase pst association primaire des cellules qui produisent du TNF L expression associ e la membrane telle
51. o comme d crit dans la demande de brevet am ricain Anticorps bloquant un site de clivage dirig contre des prot ines prohormones et utilisations qui d rivent d pos e le m me jour que la pr sente demande de brevet Cette demande est Cetus Case No 2534 inventeurs Kriegler et Perez La lign e cellulaire TNF 6 8 exprime ia fois le TNF 26 kd et le TNF 17 kd La Figure 2 montre la conversion du TNF 26 kd par l activit de la convertase pr sent dans les cellules HL 60 La production du TNF 26 kd marqu par une transcription traduction in vivo et l analyse par gel d lectrophor se est d crite ci dessous dans l exemple 2 Noter que les fractions cytosoliques 5 1 ou les culots provoquent un conversion presque compl te du TNF 26 kd TNF 17 kd La Figure montre galement pour des raisons de comparaison le TNF 26 kd et le 17 kd dans un lysat des cellules TNF 6 8 Le vecteur pFVXM et le plasmide 11 sont tous les deux amplifi s dans une souche d E 101 La ligation des fragments est conduite selon les techniques classiques Le plasmide d ADN est isol apr s ligation et la bonne orientation des s quences codant pour le TNF est contr l e par une analyse de restriction 1 t f 1 10 15 20 30 35 18 Le plasmide d ADN est pr par selon la m thode de Birnboim et Doly comme cela est d crit dans Nucleic Acid Research 7 1513 1979 Le plasmide d ADN es
52. one mature ont les sens suivants Le terme prohormone s applique aux prot ines de pr f rence d origine immunologique qui poss dent une s quence peptidique qui est limin e au cours de la production in vivo de la prot ine La forme mature de l hormone est obtenue quand le peptide est limin Le mode de r alisation privil gi de l invention fait appel la prohormone TNF 26 kd comme cela est discut en d tail ci dessous prot ine qui est cliv e de fa on primaire pour donner la forme mature de 17 kd Cependant d autres produits de clivage sont galement obtenus partir de la prohormone et la notion d hormone mature s tend ces autres produits Finalement il est important de noter que ces prohormones en plus du TNF sont inclues dans la port e de l invention et sont consid r es comme faisant partie de l invention Les CSFs et l IL 1 sont des exemples de prohormones septic mie est d finie ici comme une maladie r sultant d infections bact riennes Gram positif ou n gatif la derni re ayant pour cause primaire une endotoxine bact rienne un lipopolysaccharide LPS Elle peut tre induite par au moins six principaux bacilles Gram n gatif et ce sont Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Proteus Klebsiella Enterobacter et Serratia Le TNF est un facteur que l on peut d tecter dans la phase pr coce de la maladie et qui contribue sa progression La mol cule de 17 kd ou des mut ines plus courtes con
53. ont connus dans ie domaine Doherty et coii 1986 Nature 322 192 les brevets am ricains Nos 4 711 886 4 797 396 4 717 722 et 4 699 904 Les inhibiteurs appropri s de l lastase sont des antibiotiques modifi s de type c phalosporine tels que ceux montr s par Doherty et coll voir ci dessus Le plus appropri est le 1 3 lt ac tyloxyt 7 m thoxy 8 oxy 8 0x0 5 thio 1 azabicyclo 4 2 0Joct 2 en 2 yl carbonyl morpholine S S dioxide 6R cis Stetier et coll 1986 Nucleic_Acid_ Research 14 7883 d crivent galement un clone d ADNc qui code pour un inhibiteur de l lastase neutropile La plupart des techniques recombinantes qui sont d crites ici peuvent tre utilis es pour transformer des cellules fabriquer des vecteurs extraire des ARN messagers et similaires et sont utilis es en biotechnologie et la plupart des exp rimentateurs sont familiers des mat riaux et des techniques employ s Cependant par convenance le paragraphe suivant rappelle les grandes lignes de ces techniques La construction de vecteurs appropri s contenant 1 s quence d sir e codant pour le TNF fait appel des techniques classiques de ligation et de restriction qui sont bien ma tris es dans le domaine Les vecteurs isol s les s quences d ADN ou les oligonucl otides sont cliv s manipul s et r ins r s et li s sous la forme d sir e Le clivage de l ADN un site sp cifique est r alis en traitant l ADN avec des enzymes de r
54. origine immunologique De plus des lign es cellulaires tablies peuvent galement tre utilis es Des sources appropri es comprendront des cellules mononucl aires telles que des leucocytes ou des lign es cellulaires d origine leucocytaire de pr f rence la lign e cellulaire HL60 En raison de la facilit manipuler les lign es cellulaires tablies la source pr f r e de convertase est la lign e HL60 La conversion de l esp ce TNF 26 kd en esp ce 17 kd est donc effectu e en combinant l esp ce 26 kd avec soit les cellules HL60 intactes soit des extraits qui en d rivent ou un milieu dans lequel des cellules HL60 ont t cultiv es et dans lesquels existe une activit convertase Pour certains types de cellules l activit convertase est pr sente dans le milieu de culture apr s une stimulation appropri e qui est discut e en d tail ci apr s En outre il est possible d obtenir une fraction membranaire que l on peut utiliser car l activit convertase est partiellement associ e la membrane La proc dure pour isoler des monocytes est bien connue dans le domaine tout comme les autres m thodes de culture de cellules telles que les HL60 Bri vement des monocytes peuvent tre pr par s partir du sang p riph rique par ceatrifugation travers du Ficoll et du percoll 49 2 en utilisant les techniques classiques Ceci fournit une population enrichie en monocytes et lymphocytes et les monocytes peuvent tre en
55. plac e Le mode de r alisation privil gi dans cet exemple est une r gion CDR d un anticorps anti convertase murin qui remplace la r gion CDR d un anticorps humain En plus des anticorps il existe des compos s qui entrent en comp tition avec le TNF 26 kd pour la liaison la convertase qui inhibent ou r duisent la conversion du TNF 26 kd en sa enm betten ARRETE 4 i i i 10 15 20 30 35 12 forme de 17 kd et donc peuvent tre utiles en tant que m dicaments pour traiter la septic mie Une telle classe de r actifs comprend des peptides ou des prot ines ou d autres compos s synth tiques ou d origine naturelle qui ont une activit de liaison la convertase similaire la forme de 26 kd du TNF Des peptides ou prot ines appropri s de cette classe sont ceux qui poss dent une s quence en acides amin s similaires celle trouv e la jonction entre le TNF 26 kd et l esp ce de 17 Cette s quence est Gin Ala Val Arg Ser Ser Ser ou l alanine est le r sidu pr sent dans la portion du TNF qui reste dans la membrane apr s le clivage et la valine est l acide amin N terminal du TNF 17 kd Bien que la s quence pr sent e soit de sept acides amin s il est important de noter que la s quence minimale est un dipeptide reconnu par la convertase dont la s quence est Ala Val C est pourquoi la s quence dipeptidique est abso
56. pstein barr Le virus est capable de transformer des cellules humaines et a t utilis pour g n rer des anticorps monoclonaux humains Crawford D et coll 1983 J of General Virology 64 697 Kozbor V et Roder J 1983 J Immun Today 4 72 Une autre m thode o des lymphocytes sensibilis s peuvent tre immortalis s consiste combiner les deux techniques cit es plus haut qui sont la transformation virale et la fusion cellulaire La combinaison appropri e consiste transformer des cellules s cr tant des anticorps avec le virus Epstein barr et ensuite fusionner les cellules transform es un partenaire de fusion appropri Le partenaire de fusion peut tre une lign e cellulaire de my lome de souris une lign e cellulaire d h t romy lome ou une lign e cellulaire de my lome humain ou d autres lign es cellulaires immortalis es Demande de brevet PCT No 81 00957 Schlom et coll 1980 PNAS USA 77 6841 Croce et coll 1980 Nature 288 488 Le partenaire de fusion appropri est un h t ro hybride souris humain et mieux encore la lign e cellulaire F3B6 Cette lign e cellulaire est d pos e l American Type Culture Collection sous le num ro d adh sion 8785 d pos e ie 18 en RE 1 10 15 20 30 25 avril 1985 Les m thodes pour obtenir F3B6 sont d crites dans la demande de brevet europ en num ro de publication 174 204 Des techniq
57. r Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala et Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro 11 Anticorps anti convertase du TNF ventuellement anticorps recombinant o ledit anticorps est capable de se lier ladite convertase et galement de neutraliser l activit enzymatique de ladite convertase ou de pr venir la liaison de ladite convertase au TNF ladite convertase tant caract ris e par sa capacit convertir du TNF de poids mol culaire d environ 26 kd une ou plusieurs esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire ventuellement lesdites esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire ayant un poids mol culaire d environ 17 000 12 Anticorps selon la revendication 11 o l anticorps est un anticorps murin ou humain 3 i 10 15 20 25 34 13 Utilisation d un inhibiteur de la convertase du TNF ladite convertase tant caract ris e par sa capacit convertir du TNF de poids mol culaire d environ 26 kd en une ou plusieurs esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire ventuellement lesdites esp ces de TNF de plus faible poids mol culaire ayant un poids mol culaire d environ 17 000 dans la production d un m dicament pour la prophylaxie ou la th rapie de la septic mie 14 Utilisation selon la revendication 13 o ledit inhibiteur comprend un anticorps anti convertase o
58. r ches un duplex d ADN partiel est construit et a seulement la r gion cible expos e l instar des m thodes conventionnelles o la r gior cible et le reste de l ADN simple brin sont expos s Comme dans les m thodes conventionnelles un petit oligonuci otide est appari la r gion cible et allong s et li s pour former un h t roduplex Cependant en raison de la petite portion unique d ADN simple brin disponible pour l hybridation dans la m thode du duplex contenant des H f 10 15 20 25 30 35 16 br ches l oligonucl otide ne se lie pas sur des sites non d sir s appartenant au g nome M13 En outre cette m thode a l avantage suppi mentaire d introduire tr s peu d erreur pendant la formation de l h t roduplex puisque seulement une tr s petite zone d ADN de chaque cot de la r gion cibie doit tre compl t e Plus sp cifiquement la m thode du duplex contenant des br ches implique de cloner la s quence cible d ADN dans un phage M13 appropri qui porte des marqueurs de s lection tels que la mutation ambre du codon stop Ce dernier permet une s lection n gative dans une celluie h te qui ne peut pas supprimer les effets de la mutation De pr f rence le phage est M13mp9 qui contient deux codons ambre dans des g nes critiques du phage Donc la s quence qui code pour le TNF 26 kd est clon e dans M13mp9 ambre et l ADN simp
59. ries infect es par les phages une multiplicit d infection MOI de 10 Apr s incubation de la cuiture 37 C sous agitation pendant 4 heures la suspension cellulaire est centrifug e et le sumageant r cup r pour isoler l ADNss et 10 25 30 35 40 24 les cellules pour isoler l ADN RF L ADN RF est isol en utilisant les technique classiques d isolation de l ADN plasmidique alors que l ADNSss est isol comme suit Le surnageant de phage 250 ml est secou fortement en tournant puis 200 ml du surnageant est d cant puis on ajoute 50 mi de PEG 20 1 2 5 M ei le m lange est incub toute la nuit 4 C ou sur la glace pendant 30 minutes Le m lange est secou fortement en tournant et le surnageant d cant La bouteille est centrifug e pour obtenir un d p t de phages pr cipit sur les parois de la bouteille et le liquide restant est aspir la pipette Le culot est remis en suspension dans 5 0 ml du TE 1 et conserv 4 apr s quoi 0 5 mi est soumis une double extraction avec 0 5 de TE satur au ph nol On ajoute la phase aqueuse 0 05 ml de NaOAc 0 0 M et 1 ml d thanol 95 Le m lange est plac dans un bain de giace s che pendant 10 minutes et centrifug pendant 10 minutes dans une microcentifugeuse 4 C Le culot est s ch remis en suspension dans 200 al de TE 1 Ce mat riel est conserv en aliquote de 0 05 ml 20 C jusqu son ut
60. s Cependant cette demande couvre galement les changements et substitutions qui peuvent tre faites par des hommes du m tier sans se d partir de l esprit et de la port e des revendications suivantes H 1 3 i y 10 15 20 25 30 REVENDICATIONS 1 Proc d d identification d agents une hormone prot ique mature ou par une ou plusieurs esp ces de plus faible poids mol culaire de ladite hormone prot ique mature qui sont produits partir d une prohormone par clivage par une convertase de ladite prohormone comprenant les tapes consistant a mettre en contact la dite prohormone avec une quantit efficace de ladite convertase b mesurer la conversion de ladite prohormone en ladite hormone mature ou en une ou plusieurs esp ce de plus faible poids mol culaire de ladite hormone mature c r p ter les tapes et b d crites ci dessus et en outre inclure une mol cule identifi e en principe comme un agent prophylactique ou th rapeutique des maladies caus es par ladite hormone mature d mesurer la conversion de ladite prohormone en ladite hormone mature ou en des esp ces de plus faible poids mol culaire de ladite hormone mature et e comparer la quantit de conversion de ladite prohormone dans des tapes b et d 2 Agent th rapeutique ou prophylactique pour le traitement de maladies caus es par une hormone prot ique
61. s de aussi les mutations ambre peut tre s lectionn en infectant des cellules h tes incapables de r parer la mutation ambre par la population h t rog ne de phages Les clones sont ensuite cribl s pour d tecter les phages porteurs de la mutation d sir du TNF Des compos s identifi s comme ayant une activit inhibitrice de la convertase auront des applications prophylactiques ou th rapeutiques dans le traitement de la septic mie Parce que la phase initiale de la septic mie est associ e avec une augmentation du TNF circulant ces inhibiteurs peuvent tre utilis s de mani re prophylactique dans les cas ou il y a un risque d infection bact rienne en particulier dans la pr paration pr op ratoire De fa on similaire dans les cas ou un diagnostic pr coce de septic mie est pos les inhibiteurs auront un effet b n fique en r duisant consid rablement la quantit de TNF produit Une deuxi me application m dicale des inhibiteurs de convertase concerne le traitement du SIDA On a montr que le TNF provoque l activation de virus de l immnod ficience humain 4 10 15 30 35 217 latent Folks et coll Proc Natl Acad Sci USA 86 p 2365 1989 Pr venir ou inhiber la formation des formes de TNF de 17 kd ou de plus faible poids mol culaire par inhibition de la convertase serait donc un traitement prophylactique valable du SIDA et serait de pr f rence utile pour
62. s de polynucl otide kinase pour 0 1 nmoles de substrat en pr sence de Tris pH 7 6 50 mM MgCl 10 mM DDT 5 mM ATP 1 2 mM 1 7 pmoles de gamma 3p ATP 2 9 mCi mmole spermidine 0 1 mM et EDTA 0 1 mM La mutag n se peut tre conduite en utilisant chacune des nombreuses m thodes connues dans le domaine Ces techniques sont d crites par Smith 1985 Annual Review Genetics 19 423 et des modifications de ces techniques sont d crites dans Methods in Enzymology 154 partie E eds Wu et Grossman 1987 chapitre 17 18 19 et 20 La m thode appropri e est une modification de la m thode de mutag n se dirig e dite du duplex contenant des br ches gapped duplex La proc dure g n rale est d crite par Kramer et coll dans le chapitre 17 du Methods in Enzymology cit ci dessus Les m thodes classiques de mutag n se M13 impliquent l appariement d une petit oligonucl otide synth tique un ADN simple brin ayant une s quence codante de la cible clon e o l on souhaite cr er une mutation L oligonucl otide est presque mais pas enti rement compl mentaire de la s quence cible et a au moins un nucl otide m sappari Apr s la r action d appariement la portion qui reste sous forme d un simple brin d ADN doit tre compl t e pour former un h t roduplex qui peut tre transfect dans une cellules h te appropri e qui permet l expression de la mutation Dans la m thode du duplex contenant des b
63. t d environ 1 10 celluies puits dans du milieu IMDM plus 10 de s rum de veau foetal et 30 de milieu conditionn Ce dernier est d riv d une lign e cellulaire lymphoblasto de de pr f rence JW5 Le milieu contient aussi du 2 mercapto thanol 5 10 M du sulfate de gentamycine Sigma 50 ug ml et de la cyclosporine 600 ng ml Sandimmun Sandoz Basel Switzerland Apr s environ 14 21 jours d incubation les surnageants de culture cellulaire sont r unis et cribl s pour tester une activit neutralisante de la convertase comme d crit ci dessus Les hybridomes sont alors cultiv s faible densit retest s pour un anticorps neutralisant et cultiv s nouveau et fusionn s avec la lign e cellulaire F3B6 en utilisant du poly thyl ne glycol et la technique de fusion sur plaque techniques bien connues dans le domaine Cette derni re technique est d crite par Larrick J W 1985 dans Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies Englerman 5 Foung J W Larrick et Raubitschek Editeurs Plenum Press New York page 446 F3B6 est une lign e cellulaire d un h t romy lome qui peut tre s lectionn dans yn milieu contenant de l hypoxanthine 100 uM de l azas rine 5 pg ml et de l ouaba ne 5 uM Enfin les hybrides obtenus sont cribl s pour s assurer qu ils produisent un anticorps neutralisant anti convertase 10 15 20 25 30 35 2234 Mut ines
64. t pass deux fois sur chlorure de c sium et ia bande r cup r e est dialys e contre un tampon TE contenant du Tris 10 mM pH 8 0 et EDTA 1 mM Exemple 2 Test de la convertase Test de la transcription traduction vitro La m thode de test appropri consiste faire une transcription traduction in vitro de la mol cule de 26 kd suivie par un traitement avec la convertase en pr sence et en absence des compos s que l on veut tester pour leur activit inhibitrice sur la convertase La m thode n cessite la transcription traduction in vitro de la mol cule de 26 kd dont la s quence est pr sente dans le plasmide 11 Cette s quence est dont excis e de 11 par digestion la Pst et ins r e au site Pst de pGEM 3 obtenu chez Promega Biotec Le plasmide obtenu appel 14 est amplifi dans coli selon des techniques bien tablies et le plasmide d ADN est pr par selon les techniques de Bimboim et Doly d crites plus haut La plasmide d ADN est transcrit in vitro il est lin aris Hind et les matrices de plasmides lin aris s sont modifi es par la 7 polym rase pour en faire des transcrits poss dant une coiffe et le kit de transcription in vitro de chez Promega Biotec est utilis La transcription est r alis e en utilisant les techniques classiques telles que sugg r es dans le manuel d utilisation du fabricant L ARNm est traduit in vivo en pr sence de S cyst ine po
65. test s pour d tecter la pr sence d un anticorps monoclonal anti convertase Le test appropri est le test de la convertase d crit dans l exemple 2 plus haut dans lequel ie milieu tester pour la pr sence d anticorps est pr sent dans le test Le meilleur protocole est de combiner des sumageants de 3 8 puits de la plaque et de tester le m lange Si le m lange est positif alors le milieu de chaque puits est test ind pendamment pour identifier l hybridome s cr teur De nombreux tests sont connus dans le domaine et sont capables de d tecter des antig nes solubies ou non solubles comme cela est d crit par Langone J et Van Vinakis H Methods in Enzymology 92 Partie E 1983 Quelque soit la nature de l anticorps monoclonal ou polyclonal il est souhaitable de purifier par des techniques classiques qui sont connues dans le domaine ou d crites par Springer 1980 Monoclonal Antibodies 194 Eds Kennett McKeam et K Bechtol Plenum Press New York Habituellement on utilise au moins une pr cipitation de l anticorps au sulfate d ammonium utilisant une solution de sulfate d ammonium 50 On peut galement utiliser des colonnes d affinit ii Anticorps monoclonal humain Des lymphocytes du sang p riph rique sont isol s partir de patient atteints de septic mie et ensuite infect s avec le virus d Epstein barr et les lymphocytes immortalis s par fusion avec une lign e cellulair
66. u des mut ines de TNF non hydrolysables ventuellement des mut ines pr sent es dans le Tableau I 15 Utilisation selon la revendication 14 o ledit inhibiteur comprend des mut ines ayant une substitution ou une d l tion sur la valine en position 2 et ou une substitution ou une d l tion sur la valine en position 13 ou comprend une mut ine ayant une d l tion des acides amin s 9 jusqu 14 Gu TNF de 26 16 Utilisation selon la revendication 13 o ledit inhibiteur comprend un peptide ou une prot ine qui entre en comp tition avec le TNF de 26 kd pour la liaison la convertase 17 Utilisation d un inhibiteur de la convertase du TNF dans la fabrication d un m dicament pour traiter des pateints atteints du SIDA ou pour traiter des patients atteints d une maladie autoimmune ventuellement l arthrite nn gerer pag rem 1 4 QY ZL Teusis fo e eg r i gt d l 0 6 dq 1 eprqded KH MA 461 L 9 1154 023 E D gt I Z l 2 lt lt lt rs Hy rophobie o u 913 Ts 76 ATG Met GCC Ala CAG TCC Ser TGC Cys GAA Glu CTG Leu AGT Ser CAA Gln GCC Ala GAT Asp CTC Leu TGC Cys AGC CTC Leu Thr
67. ues applicables l utilisation de la transformation par le virus Epstein barr et la production de lign es cellulaires immortelles s cr tant des anticorps sont pr sent es par Roder J et coll 1986 Methods in Enzymology 121 140 La proc dure consiste isoler le virus Epstein barr partir d une source appropri e g n ralement une lign e cellulaire infect e et exposer les cellules cibles s cr tant l anticorps aux surnageants contenant le virus Les cellules sont lav es et cultiv es dans le milieu de culture appropri Ensuite les cellules transform es par le virus pr sentes dans la culture cellulaire sont identifi es par la pr sence d antig ne nucl aire du virus Epstein barr et les cellules transform es s cr tant les anticorps peuvent tre identifi es en utilisant les m thodes standards connues dans le domaine Il est maintenant vident pour les hommes du m tier que bien que le mode de r alisation privil gi de la pr sente invention est un anticorps monoclonal neutralisant anti convertase seul ou en combinaison ces anticorps peuvent tre alt r s mais conservent toujours une activit biologique Les anticorps modifi s par r duction des fragments de diff rentes tailles tels que F ab Fab ou similaires sont donc compris dans la port e de l invention Les lign es cellulaires hybrides qui produisent l anticorps peuvent tre aussi consid r es comme une source d ADN qui code pour
68. ulaire d environ 17 000 qui est fortement impliqu e dans le d veloppement de la septic mie Il est donc clair que des inhibiteurs capables d agir sur la conversion de la forme de 26 kd du TNF sont utiles pour la pr vention et le traitement de la septic mie Les dosages d crits ici permettent de mesurer la conversion de ia prohormone sa forme hormone mature le mode de r alisation privil gi tant la conversion enzymatique de la forme mol culaire de 26 du en de pr f rence une forme de poids mol culaire 17 000 L enzyme responsable de la conversion est appel convertase L invention se pr sente donc ais ment en trois parties La premi re partie d crit les mat riel et m thodes pour la r alisation de la forme mol culaire de 26 kd du TNF La deuxi me partie d crit des dosages pour la d tection et l identification de diff rents inhibiteurs de la convertase Enfin la troisi me partie de l invention pr sente une description des mani res d utiliser les inhibiteurs pour traiter des patients atteints de septic mie Ci apr s chacune de ces parties sera trait e de mani re ind pendante est fait r f rence plusieurs brevets demandes de brevets et articles scientifiques ci apr s La pr sente invention s appuie en partie sur des mat riel et m thodes pr sent s dans ces r f rences et donc il est pr vu que toutes ces r f rences dans leur totalit sont incorpor es par r f rence est importa
69. ur activit inhibitrice comme cela est d crit ci dessus 1 10 15 20 30 35 20 A Anticorps anti convertase Un anticorps qu il soit polyclonal ou monoclonal est pr par de fa on neutraliser l activit enzymatique de la convertase ou se lier la convertase et par cons quent provoquer un encombrement st rique qui emp che la convertase de se lier au TNF 26 kd La m thode consiste imrouniser un animal h te appropri avec une fraction membranaire de cellules HL 60 produisant de la convertase Une quantit suffisante de mat riel doit tre utilis pour initier une r ponse immnunitaire et habituellement on utilise une quantit comprise entre 10 ug et 10 mg par kilogramme de poids corporel L immunisation peut tre effectu e l aide d un adjuvant dans un tampon biologiquement acceptable tampons qui sont connus dans le domaine La meilleure voie d immunisation est d termin e exp rimentalement et l immunisation primaire peut tre suivie par une ou plusieurs immunisation secondaire en fonction de l importance de la r ponse immunitaire lors de l immunisation initiale La pr sence de l anticorps neutralisant anti convertase dans le sera est d tect e en utilisant ie test de la convertase d crit plus haut dans lequel un antis ra est pr sent dans le m lange du test L inhibition de la conversion du TNF 26 kd en esp ces de plus faible poids mol culaire indique la pr sence d anticorps neutralisa
70. ur produire du TNF 26 kd marqu la S cyst ine La m thode consiste utiliser le kit de traduction lysat de r ticulocyte de lapin de chez Promega Biotec en suivant les recommandations du fabricant Le TNF 26 kd marqu la S cyst ine est utilis pour tester les inhibiteurs de la convertase comme suit On m lange 25 ul de mat riel traduit vitro avec 250 de 60 non induite pour l activit convertase plus des compos s dont on souhaite tester l activit inhibitrice La convertase est produite en r coltant des cellules HL 60 une densit de 2 x 10 dont les fractions S 1 18 ml et P 30 6 ml sont isol es On utilise 250 g de la fraction P 30 mais peut galement utiliser la fraction S 1 Le dosage est effectu 30 C pendant une heure essentiellement comme cela est d crit plus haut Ensuite le m lange est immunopr cipit avec un antisera polyclonal anti TNF et de la prot ine s pharose culott et lav La fraction de prot ine li e est lu e et pass e sur lectrophor se Le gel est s ch et expos un film radiographique et ensuite d velopp Les profiles d lectrophor se du TNF 26 kd trait avec des dilutions diff rentes de convertase HL60 mettent en vidence les compos s qui poss dent une activit inhibitrice En utilisant le test d crit ci dessus on a pu d montr que le 3 4 dichloro isocoumarine et l lastinal respectivement des concentrations de 100 g ml et 5 mg
71. ymology 121 107 mais d autres modifications sont connues par les hommes du m tier En ce qui concerne la production d anticorps murin ou humain les cellules s cr tant les anticorps sont associ es avec un partenaire de fusion et la cellule fusionn e avec un agent de fusion appropri de pr f rence le poly thyl ne glycol et mieux encore avec du poly thyl ne glycol 1000 Ce dernier est ajout au culot de cellules contenant les cellules s cr tant les anticorps et le partenaire de fusion en petites quantit s sur une courte p riode de temps en agitant doucement Apr s l addition de l agent de fusion le m lange cellulaire est lav pour liminer l agent de fusion et tous les d bris cellulaires et le 10 15 20 30 35 10 m lange cellulaire contenant des cellules fusionn es et des cellules fusionn es est dans des chambres de culture cellulaire appropri es contenant un milieu de croissance s lectif Apr s plusieurs semaines on voit appara tre des cellules hybrides qui peuvent tre identifi es par leur production d anticorps et sous clon es pour assurer la stabilit de la lign e cellulaire hybride L anticorps pr f r est anticorps monoclonal d origine humaine qui peut tre pr par partir de lymphocytes sensibilis s avec de la convertase soit in vivo soit in vitro par immortalisation des lign es cellulaires hybrides productrices d anticorps par cons que

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