GenoType Enterococcus
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1. Enterococcus 1 0 CE 03 2009 H A N LIFESCIENCE Enterococcus Test G n tique d Identification des Enterococci R sis tants la Vancomycine Principe Le test GenoType Enterococcus est bas sur la technologie DNAeSTRIP et permet l identification combin e des esp ces enterococcales faecalis faecium casseli flavus et gallinarum ainsi que des g nes de r sistance la vancomycine vanA vanB vanC1 et vanC2 C3 La proc dure compl te comporte trois phases extraction de l ADN partir de cultures bact ries fra chement cultiv es en milieu solide mat riel requis pour l extraction de l ADN non fourni une amplification multiplex l aide d amorces biotinyl es ADN polym rase thermostable non fournie et hybridation inverse Cette derni re phase comporte les tapes suivantes d naturation chimique de l ADN amplifi hybridation des amplicons simples brins biotinyl s aux sondes pr immo bilis es sur la membrane lavage stringent et enfin addition d un conjugu strepta vidine phosphatase alcaline suivie d une r v lation chromog nique Les signaux obtenus sont facilement et rapidement interpr t s l aide d une matrice fournie avec chaque kit Conservation et Pr cautions D s r ception conserver le M lange Amorces Nucl otides PNM 2 8 C et isol s de toute source d ADN potentiellement contaminante Si la dur e de conservation doit exc2. Contr le de Qualit Afin de contr ler le bon d roulement du test et le bon fonctionnement des r actifs chaque bandelette comporte 2 zones de contr le une zone de Contr le Conjugu pour contr ler la fixation du conjugu sur la bandelette et le bon d roulement de la r v lation chromog nique une zone de Contr le Universel qui d tecte au vue des connaissances actuelles toutes les esp ces bact riennes Extraction de l ADN Le mat riel de d part conseill pour l extraction de l ADN consiste en des bact ries fra chement cultiv es en milieu solide L espace de travail doit tre exempt de toute trace d ADN amplifi Toutes les proc dures d extraction de l ADN partir de bact ries et produisant de l ADN capable d tre amplifi peuvent tre employ es Le protocole d extraction rapide d crit ci apr s permet de pr parer l ADN en vue d une amplification 1 Pr lever jusqu 5 colonies l aide d une oeuse et resuspendre dans 150 ul d eau 2 Incuber la suspension bact rienne 95 C pendant 10 minutes 3 Incuber dans un bain ultrasons pendant 15 minutes 4 Centrifuger pendant 5 minutes vitesse maximale et utiliser directement 5 pl de surnageant pour la PCR Si l ADN doit tre conserv pendant une longue p riode transf rer le surnageant dans un nouveau tube Amplification Pr parer le m lange r actionnel 45 ul dans une pi ce exempte d ADN de l chantillon doit tre rajou
3. de Lavage Stringent incorrectement qui libr s ou homog n is s Contamination de l ADN extrait et ou des r actifs d amplification avec de l ADN pr c demment extrait ou amplifi Lorsque les r actifs d amplification sont contamin s un chantillon de contr le n gatif entra ne galement le d veloppe ment des lignes tests Contamination des puits voisins par des claboussures lors de l addition de la Solution d Hybridation 10 Dans certaines conditions du test une forte concentration d ADN amplifi peut entra ner une r action chromog nique tr s rapide En pareil cas afin de pr venir d veloppement de bandes dues des r actions d hybridation crois es arr ter la r action chromog nique d s que les premi res lignes color es deviennent visibles La culture de d part n est pas pure Mat riel Requis mais Non Fourni ADN polym rase thermostable avec tampon enzyme de type hot start recom mand e taux d extension 2 4 kb min 72 C demi vie 10 min 97 C 60 min 94 C rendement d amplification gt 105 Bain ultrasons Bain marie agitateur TwinCubator Chronom tre Eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire Embouts de pipettes st riles avec filtre Eprouvette gradu e Gants usage unique Microtubes pour thermocycleur exempt de contamination par DNase et RNase Papier absorbant Pincettes Pipettes r glables pour 10 20 200 et 1000 pl Plateau agitateur Twin
4. der 4 semaines conserver 20 C Il est recommand d aliquoter le PNM afin d viter les cong lations d cong lations r p t es Conserver tous les autres compo sants du kit 2 8 C Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date de p remption Les chantillons pr lev s sur patient ou a partir de culture doivent toujours tre consid r s comme potentiellement infectieux Les chantillons et les cultures provenant de patients a risque doivent toujours tre tiquet s et manipul s dans des conditions de s curit adapt es Suivre les recommandations f d rale nationale locale d hygi ne de s curit et d environnement Se prot ger l aide de v tements ad quats et de gants Observer les pr cautions usuelles pour la pr paration de l amplification Il est es sentiel que le mat riel et les r actifs utilis s pour l extraction de l ADN et pour pr paration de l amplification soient exempts de DNases Lors de la manipulation du tenir compte des indications de s curit suivantes La Solution de D naturation DEN contient du NaOH lt 2 et est irritante pour la peau et les yeux R 36 38 et S 26 37 39 45 Le Substrat Concentr SUB C contient du Dimethyl Sulfoxide et est irritante R 36 37 38 S 23 26 36 Pour des informations suppl mentaires consulter les fiches de s curit qui peuvent galement tre t l charg es l adresse suivante www hain lifescience com products msds html
5. AIN LIFESCIENCE Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstrafie 1 72147 Nehren Germany http www hain lifescience de REF sss 2 88896 888 03 03 00
6. Cubator R actifs pour l extraction de l ADN ainsi que les appareils associ s Thermocycleur taux de chauffage 3 C sec taux de refroidissement 2 C sec pr cision 0 2 C Thermom tre calibr 11 Composition du Quantit Bandelettes sensibilis es avec les sondes sp cifiques STRIPS 12 96 M lange de Amorces Nucl otides contient amorces sp cifiques nucl otides colorant 0 5 4m Solution de D naturation DEN pr t l emploi contient lt 2 colorant 0 3 2 4 m Solution d Hybridation HYB pr t l emploi contient 8 10 de d tergent anionique colorant 20m 120 m Solution de Lavage Stringent STR pr t l emploi contient gt 25 d un sel d ammonium quaternaire lt 1 d tergent anionique colorant 20 120 m Solution de Rin age RIN pr t l emploi contient du tampon lt 1 NaCl lt 1 de d tergent anionique 50 360 Conjugu Concentr concentr contient de phosphatase alcaline conjugu streptavidine colorant 0 2m 1 2m Tampon Conjugu CON D contient du tampon 1 agent bloquant lt 1 NaCl 20m 120 m Substrat Concentr SUB C concentr contient du Dimethyl Sulfoxide solution substrat 0 2m 1 2m Tampon Substrat SUB D contient du tampon lt 1 9 lt 1 NaCl 20m 120 m bac feuille d valuation 1 de chaque 4 de chaque manuel d utilisation matrice 1 de chaque 1 de chaque 12 13 H
7. au Pr parer une solution m re de m lange r action nel contenant tous les r actifs l exception de l ADN et bien homog n iser ne pas vortexer Aliquoter 45 pl du m lange r actionnel dans les tubes de PCR Profil d amplification 15 min 95 C 1 cycle 30 sec 95 C 10 cycles 2min 58 C 25sec 95 C 40 sec 53 C 20 cycles 40 sec 70 C 8min 70 C 1 cycle 23 S applique Taq polym rase utilis e au cours de la validation En cas d utilisation d autres Taq polym rases de type lt hot start gt la dur e de la premi re tape devra peut tre tre raccourcie en cas d utilisation d ADN se r f rer au manuel de l enzymel Les produits de l amplification peuvent tre conserv s entre 4 et 20 C La r action d amplification peut tre contr l e par lectrophor se en gel en d posant directement 5 pl de chaque chantillon sans aucun tampon additionnel Les am plicons ont une taille de 63 pb fragment Contr le Universel 248 pb Enterococcus ssp 110 pb vanA 51 pb vanB vanC2 C3 et 76 pb vanC1 Hybridation Pr paration Pr chauffer le bain marie agitateur TwinCubator a 45 C d rivation maximum 1 C Pr chauffer les solutions HYB et STR 37 45 avant utilisation Les r ac est opaque Si besoin agiter Equilibrer les autres r actifs l exception des solutions CON C et SUB C temp rature ambiante Dans un tube appropri diluer le Conju gu Concentr CON C orange
8. ce test en cas d utilisation d autres polym rases que ceux mentionn s ci dessus Les donn es sur les performances du test peuvent tre t l charg es sur le site internet www hain lifescience com Causes d Erreurs R sultats faibles ou absence de signal incluant la zone de Contr le Conjugu Temp rature ambiante trop basse ou r actifs mal quilibr s CON C et ou SUB C pas t ajout ou tait utilis trop dilu R sultats faibles ou absence de signal except dans zone de Contr le Conjugu La qualit et ou la quantit de l ADN extrait n ont pas permis une amplification correcte Analyser l ADN amplifi sur un gel Si aucun amplicon n est visible r p ter les tapes d extraction et d amplification Essayer ventuellement une autre m thode d extraction de l ADN noter que la r action d amplification peut tre inhib par un chantillon de d part trop concentr Temp rature d incubation trop lev e Coloration non homog ne Les bandelettes pas t suffisamment immerg es lors des diff rentes in cubations Le bac n a pas t correctement agit Bruit de fond important CON C et ou SUB C utilis s trop concentr s Les tapes de lavage n ont pas t correctement effectu es Les solutions de lavage taient trop froides lors de leur utilisation R sultat inattendu Temp rature d incubation trop basse Solution d Hybridation et ou Solution
9. contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute l aide de 1 ml de Solution de Rincage RIN Vider RIN R p ter ce rincage une nouvelle fois puis rincer une fois avec environ 1 ml d eau distill e l aide d une pissette Bien liminer toute trace d eau dans les puits apr s cette derni re tape 12 Ajouter 1 ml de Substrat dilu voir ci dessus dans chaque puits et incuber sans agitation l obscurit Le temps de r v lation peut varier en fonction des conditions de d roulement du test de 3 20 minutes notamment de la temp rature de pi ce Des temps de r v lation trop longs peuvent entra ner un bruit de fond qui peut g ner l inter pr tation des r sultats 13 Arr ter la r action en rincant bri vement deux fois l eau distill e 14 l aide de pincettes r cup rer Les bandelettes et Les s cher entre deux couches de papier absorbant Evaluation Interpr tation des R sultats Classer et ranger les bandelettes l abri de la lumi re Une feuille d valuation est fournie avec le kit La matrice fournie avec le kit permet d identifier chaque zone r actionnelle en alignant la bande CC de bandelette de matrice Chaque ban delette comprend 10 zones r actionnelles voir figure Contr le Conjugu Contr le Universel E faecalis E faecium E gallinarum E casseliflavus 1 vanC2 C3 marquage color Remarque Cet
10. et le Substrat Concentr SUB C jaune au 1 100 dans un volume ad quat du tampon correspondant CON C avec CON D SUB avec SUB D Bien homog n iser et quilibrer temp rature ambiante Pour chaque chantillon test ajouter 10 pl de concentr a 1 ml de tampon Diluer CON C avant chaque utilisation Une fois dilu SUB C reste stable pendant 4 semaines conserv temp rature ambiante et l obscurit 1 D poser 20 pl de Solution de D naturation DEN bleu une extr mit de chaque puits utilis 2 Ajouter 20 pl d chantillon amplifi et m langer les deux solutions par pipeta ges r p t s Incuber 5 minutes temp rature ambiante Pendant ce temps l aide d une pince sortir du tube le nombre appropri de bandelettes STRIPS et inscrire au crayon leur num ro d identification dans l espace situ sous le marquage color Toujours porter des gants pour manipu ler Les bandelettes 3 Ajouter dans chaque puits 1 ml de Tampon d Hybridation HYB vert pr chauff et homog n is Doucement agiter le bac jusqu a ce que le m lange devienne une coloration homog ne Eviter les claboussures vers les autres puits 4 D poser une bandelette dans chaque puits utilis Les bandelettes doivent tre enti rement recouvertes par le liquide avec la face sensibilis e identifiable par le marquage color tourn e vers le haut Les ban delettes mal orient es doivent tre remises en position l a
11. ide de pincettes propres Afin d viter toute contamination bien nettoyer les pincettes apr s chaque utilisation Cela vaut aussi pour toutes les tapes suivantes 5 Placer le bac dans bain marie agitateur TwinCubator et incuber 30 minutes 45 C Pour le bain marie agitateur s lectionner une fr quence d agitation suffisante pour assurer un bon brassage du tampon Ajuster le niveau de l eau dans le bain marie agitateur au moins a un tiers de la hauteur du bac de facon assurer un bon transfert de chaleur Cela vaut aussi pour toutes les tapes suivantes Aspirer le Tampon d Hybridation Utiliser par exemple une pipette pasteur reli e une pompe vide Ajouter chaque puits 1 ml de Solution de Lavage Stringent STR rouge et incuber 15 minutes a 45 C dans le bain marie agitateur TwinCubator partir de cette tape travailler temp rature ambiante Eliminer la Solution de Lavage Stringent Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container a d chets Eliminer tout le liquide r siduel en retournant le bac sur du papier absorbant effectuer de m me pour les autres tapes de lavage Laver chaque puits avec 1 ml de Solution de Rincage RIN et incuber pendant 1 minute sous agitation TwinCubator plateau agitateur Vider la Solution de Rincage 10 Ajouter a chaque puits 1 ml de Conjugu dilu voir ci dessus et incuber 30 mi nutes sous agitation TwinCubator plateau agitateur Vider le
12. outes les lignes d une m me bandelette peuvent ne pas pr senter m me intensit Limitations En vue de l amplification l ADN doit tre extrait partir de culture de bact ries l aide d une m thode appropri e cible doit avoir t amplifi e efficacement pendant r action d amplification Le test fonctionne dans les limites de r gion du g nome choisie pour les amorces et les sondes Un s quencage potentiel doit tre r alis s s par ment La pr sence de diff rentes esp ces bact riennes dans un m me chantillon peut entrav e l interpr tation du test Comme dans tout syst me de d tection bas sur l hybridation il existe possibilit que des variations situ es dans la s quence d ADN g nomique cible partir de la quelle les amorces et les sondes ont t choisies et pour lesquelles le test pas t concu entra nent un r sultat erron En raison de l extr me variabilit des g no mes bact riens il est possible que certains sous types puissent pas tre d tect s Le test refl te l tat actuel des connaissances de la soci t Hain Lifescience L utilisation de ce kit est r serv e un personnel qualifi d j form et rod aux techniques de biologie mol culaire L valuation des performances du test t r alis e l aide de la Taq polym rase HotStarTaq fournie par la soci t Qiagen Hilden Allemagne Il reste a la charge de l utilisateur de valider
13. t dans une pi ce s par e Pr parer Le m lange suivant par tube 35 pl de PNM fournie avec le kit 5 pl de tampon d incubation de la polym rase 10x non fourni x pl MgCl non fourni 1 2 unit s d ADN polym rase thermostable se r f rer au manuel non fourni ul d eau qsp 45 pl hors volume de non fourni Ajouter 5 ul de solution d ADN fra chement extrait 20 100 ng d ADN pour atteindre un volume final de 50 pl hors volume de l enzymel Selon le syst me tampon enzyme utilis la concentration optimale de MgCl peut varier de 1 5 2 5 mM A noter que certains tampons contiennent d j le MgCl L valuation des performances du test GenoType Enterococcus a t r alis e avec la HotStarTaq DNA Polymerase Qiagen Lors de l utilisation de cette enzyme les volu mes r action sont les suivants 35 ul de PNM fournie avec le kit 5 pl de tampon de PCR 10x pour HotStarTaq contient 15 mM non fourni 2 1125 mM MgCl non fourni 0 2 pl 1 U HotStarTaq non fourni 3 pl d eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire non fourni 5 ul de solution d ADN ajout dans une pi ce s par e La concentration finale du mix r actionnel en MgCl est 2 5 mM D terminer le nombre d chantillons amplifier nombre d chantillons analyser contr les Pour un contr le de contamination par exemple la solution d ADN am plifier est remplac e par 5 pl d e
14. te bandelette n est pas repr sent e dans sa taille originale Contr le Conjugu CC Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone Cette ligne t moigne de la bonne fixation du conjugu et du bon d roulement de la r v lation Contr le Universel UC Cette zone comprend une sonde s hybridant au niveau d une r gion d ADN hautement conserv e au sein de toutes les esp ces bact riennes test es ce jour Le d velop pement d une ligne color e dans cette zone indique pr sence d ADN bact rien dans l chantillon test ainsi qu une extraction et une amplification de l ADN correctes Puisque l chantillon de d part tant une culture bact rienne cette zone devrait d velopper un signal positif Lamplification du contr le peut n anmoins tre att nuer par l amplification du des sp cifique s noter que le Contr le Universel n est pas un contr le de PCR puisqu un chantillon de contr le de contamination entra nera un signal n gatif dans cette zone Autres bandes Sondes sp cifiques utiliser la figure ou la matrice pour l valuation des r sultats Lorsqu aucune autre bande ne d veloppe de signaux positifs les zones de contr le doivent d velopper un signal positif Si cela n est pas le cas il s agit d une r action faussement n gative et Le test doit tre r p t noter que flavescens peut galement r agir au niveau de zone casseliflavus T
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