Téléchargez le poly de travaux pratiques 2010
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1. Les vecteurs utilis s au cours de cet atelier sont d riv s du MSCV Murine Embryonic Stem Cell Virus 6402 1 __ Khol 1420 ShRNA insert ECORI 1721 H1 et PGK s quences promotrices SM selection marker Ces vecteurs contiennent les s quences suivantes LTR Long Terminal Repeat V s quence d encapsidation du vecteur recombinant S quences promotrices promoteurs adapt s en amont du shRNA et du des g ne s de s lection SM antibiotiques ou et g nes rapporteurs type GFP AMP g ne de r sistance l ampicilline s lection des bact ries lors de l tape de clonage amplification du plasmide Au cours de cet atelier nous utiliserons les vecteurs suivants pMLS vecteur ayant un g ne rapporteur GFP pMLP vecteur ayant un g ne rapporteur GFP et une s lection la puromycine pMLS shmTrp53 vecteur ayant un g ne rapporteur GFP et un shRNA dirig contre Trp53 pMLP shmTrp53 vecteur ayant un g ne rapporteur GFP une s lection la puromycine et un shRNA dirig contre Trp53 Ecotropic helper vecteur non r troviral packaging genes gag pol env Ces vecteurs ont t transform s dans des bact ries E coli XL1 Ces bact ries transform es ont ensemenc es 500 ml de milieu de culture de type LB suppl ment avec de l ampicilline puis mises en culture 37 C pendant une nuit Le lendemain les cultures sont centrifug es 6000 g pendant 10 minutes puis les ADN plasmidiques2. Iani PARIS Master BMC UE MV442 2009 2010 GFP transfection indicator Pr sentation p dagogique de l UE MV442 Introduction th orique et exp rimentale l pig n tique a Objectifs de la partie Travaux Pratiques L extinction de g ne est un m canisme de r gulation de l expression g nique dont le r le anti viral a t d couvert chez les plantes il y a environ une dizaine d ann es Cette unit d enseignement exp rimentale porte sur l tude du m canisme de l extinction de g nes chez les plantes les invert br s et les mammif res La p dagogie utilis e lors de cet UE repose en grande partie sur la r alisation et l analyse d exp rimentations simples mais tr s spectaculaires et informatives sur le ph nom ne d extinction de g nes b Th mes abord s Exp riences historiques qui ont conduit la d couverte du m canisme de l extinction de g nes immunit anti virale Strat gies d extinction des g nes ARNi et siRNA sur cellules ou organisme entier Applications de l extinction de g nes diff rents mod les animal v g tal pour tudier la fonction des g nes en syst me homologue ou h t rologue Co responsables de l UE Evelyne T oul Evelyne Teoule versailles inra fr 01 30 83 33 06 S v rine Planchais severine planchais upmc fr 01 44 27 62 32 Equipe p dagogique Partie Travaux Pratiques S verine Planchais severine planchais upmc fr 01 44 27 62 32 Sylvie Collin sylvie c
3. ARN interf rence Nous diss querons des disques imaginaux d aile de larves L3 et comparerons le profil d expression de la GFP Exp rience d extinction de l expression de g nes sur des cellules de mammif res Les techniques d extinction de l expression de g nes ou silencing sont couramment utilis es pour tudier les fonctions de ces derniers Plusieurs approches sont disponibles pour effectuer un silencing de g ne dans les cellules de mammif res Les deux approches principales consistent i d une part en une approche bas e sur l ARN interf rent RNAi et ii d autre part en une approche bas e sur l ADN shRNA Le RNAi consiste transfecter transitoirement la lign e cellulaire d int r t par un duplex d ARN reconnaissant sp cifiquement le transcrit du g ne cible Cette m thode simple et efficace permet de diminuer significativement l expression du g ne cibl Le shRNA consiste transfecter transitoirement ou de fa on stable la lign e cellulaire d int r t par un vecteur contenant une s quence d ADN qui produira les petits ARN qui reconnaitront le transcrit du g ne cible Au cours de cet atelier nous utiliserons la technique de silencing par shRNA l aide de vecteurs r troviraux d sarm s Nous inactiverons le g ne Trp53 dans la lign e cellulaire murine NIH3T3 1 Pr paration des vecteurs r troviraux utilis s au cours de l atelier disponibles avant l atelier 1 1 Caract ristiques principales de
4. d agarose purifier le fragment de 780 pb avec le kit QIAquick Gel Extraction Qiagen Mesure de la concentration de l ADN nanodrop clonage A T e 1T RNA pol Oligo 5peime 100 0 pBluKSP RNAiRolled Fragment PCR RNAI Rolled NN Otgo Ipnme 100 0 T7 RNA pol Clonage A T Mardi 1 Production de l ARN double brin partir de ce fragment d ADN en utilisant le kit Promega Ribomax large scale RNA Production System T7 A partir de ce moment pour pr server les ARN manipuler exclusivement avec des gants et des c nes filtre m langer 1ug d ADN 15uL de nucleotide triphosphate 25mM 10uL de tampon de r action 5X 1uL de Riboblock Fermentas 5uL d enzyme H20 qsp 40uL incuber 37 C 5h ajouter 1uL de Dnase RNase free incuber 37 C 15 minutes pr cipiter l ARN double brin ajouter 50uL d eau RNase free 10uL d ac tate de sodium 3M pH 5 2 250uL d thanol absolu et placer 20 C une nuit amp Mercredi 1 centrifuger 13000g 4 C 20 minutes jeter le surnageant rincer le culot avec 500uL d thanol 70 centrifuger 13000g 4 C 5 minutes s cher le culot puis le reprendre dans 100uL d eau RNase free resuspendre en vortexant pr lever 1uL chauffer l ARN restant 60 C pendant 30 minutes puis laisser revenir doucement temp rature ambiante faire migrer 1uL sur gel d agarose pour tester la qualit de la pr paration mesurer la concentration des ARN au Nanodrop ajuster 30ug 1O0uL avec de l eau RNase
5. effectu e et les bact ries transform es seront analys es pour la pr sence du plasmide Apr s extraction du plasmide celui ci sera s quenc afin de v rifier l int grit de l insert Les clones s lectionn s seront ensuite amplifi s comme d crit pr c demment et un stock d ADN plasmidique de concentration connue sera conserv 20 C jusqu utilisation La plupart des vecteurs r troviraux peuvent tre utilis s i directement pour transfecter des cellules de mammif res d sir es transfection transitoire ii ou pour transfecter des packaging cells qui vont produire les r trovirus dans le milieu de culture r trovirus utilis s pour infecter les cellules de mammif res de mani re stable Nous utiliserons cette seconde approche au cours de l atelier 2 Transfection et infection Il existe un grand nombre de lign es packaging cells Ces cellules sont optimis es pour produire de facon rapide des virus infectieux dans le milieu de culture L absence de particules r trovirales comp tentes pour la r plication est test e dans ces lign es cellulaires Nous utiliserons des packaging cells capables de produire des virus infectant les lign es cellulaires murines Ces cellules expriment les prot ines GAG group specific antigen POL polymerase et ENV envelop protein GAG est une polyprot ine impliqu e dans la formation de la matrice et de la capside ENV code pour des prot ines de la surface m
6. free Conserver les ARN 20 C De la m me facon des ARN double brin contr les dirig s contre la GFP ont d j t pr par s 2 Pr paration des cellules Jeudi 1 Ensemencer les cellules 2 106 cellules pour 2mL de milieu Schneider avec des antibiotiques sans serum dans des plaques 6 puits faire 2 puits 3 Traitement des cellules avec les ARN double brin JO Vendredi 1 D poser les ARN double brin la concentration finale de 40nM pour un fragment de 700pb 40nM correspond 15ug d ARN double brin dans 1mL de milieu puit 1 ARN contr le GFP 30ng puit 2 ARN ERK 30ng Bien m langer en balan ant doucement la plaque Remettre les cellules 25 C 4 Pr paration des extraits prot iques et lectrophor se 5 eudi2 Pr lever les cellules en partie en suspension en partie accroch es au plastique en pipettant up and down plusieurs fois et en rin ant bien le fond de chaque puit Transf rer dans un tube Eppendorf de 2 2mL Centrifuger a 2500g 20 C 8 minutes liminer le surnageant resuspendre le culot dans 500uL de PBS 1X R p ter le point pr c dent Resuspendre chaque culot dans 50uL de tampon RIPA Tris HCl 50 mM pH 7 4 NP 40 0 1 NaCl 150 mM EDTA 1 mM PMSF 1 mM 1 tablette d inhibiteurs de prot ases Roche pour 10mL en pipettant up and down plusieurs fois laisser 15 minutes sur la glace lyse Centrifuger 13000g 4 C 15 minutes Reprendre le surnageant Doser les prot
7. gt proc der la coloration ou au transfert 4 Solutions SDS Sample Buffer 2X Glyc rol 2mL 2296 Bleu BromoP 20 mg Tris 1 M pH 6 8 1 25 mL 140 mM SDS 20 w v 2 5 mL 5 6 EDTA 0 5 M 20 uL 1 mM H20 QSP 9 mL Extemporan ment ajouter 100 uL de 2 mercapto thanol 900 uL de tampon ou utiliser du DTT la concentration finale de 0 04M Conserver 20 C 25 Tampon de migration 5X conserver 4 C Tris Base 15 1g Glycine 72 0 g SDS 5 0 g H20 QSP 1 L Marqueur de poids mol culaire de prot ines BIO RAD Low Range 20 C 19 29 37 49 81 et 103 kDa D p t de 10 uL par puit JOUR4 suite Immunod tection sur membrane 1 Apr s s paration des prot ines sur gel SDS PAGE d monter l appareil lectrophor se A l aide d un espaceur liminer le gel de concentration gel sup rieur Placer le gel de l eau distill e puis dans la solution de transfert pendant 5 min au moins 2 Dans un bac propre d barrass de toute trace de prot ines placer successivement la membrane dans de l eau distill e 5 min dans la solution de transfert 10 min 3 Monter le sandwich entre les deux grilles p les rouge et noir indiqu s Tous les composants doivent tre humidifi s Les bulles doivent tre limin es l aide d une pipette chaque tape Montage du transfert lectrophor tique Cou rant Anode Cathode Tampon poreux 7 NO Tampon poreux Whatman 3MM S W
8. ines par Bradford sur 5uL Ajouter 15uL de tampon de Laemmli 4X D poser l quivalent de 25ug de prot ines par puit sur gel d acrylamide SDS d poser galement un marqueur de poids mol culaire Plan du gel puit 1 Laemmli 1X Puit 2 MWM 10uL Puit 3 control Puit 4 RNAi ERK Puit 5 Laemmli 1X Analyse des prot ines par Western blot eudi2 Apr s la migration transf rer les prot ines sur un filtre de nitrocellulose membrane ECL GE Healthcare Incuber pendant 45 minutes dans du Blotto TBS 1X Tween 20 0 196 Lait cr m 5 Rincer 3 fois 5 minutes avec du TBS 1X Tween 20 0 1926 Couper le filtre en 2 au niveau du marqueur 55kDa Pr parer 5mL de TBS 1X BSA 396 pour chaque filtre Ajouter sur le filtre correspondant au haut du gel l anti D tubuline souris t moin de charge au 1 1000 0 5uL et sur le filtre correspondant au bas du gel l anti ERK C16 lapin au 1 1000 0 5uL Laisser sur la balancelle 4 C pendant la nuit 6 R v lation m me proc dure que pour les autres filtres pour l anti p tubuline utiliser le secondaire anti IgG de souris marqu la phosphatase alcaline et pour C16 utiliser le secondaire anti IgG de lapin marqu la phosphatase alcaline Inactivation par ARN interf rence d un transg ne exprimant la GFP chez Drosophila melanogaster d apr s Roignant et al 2003 Absence of transitive and systemic pathways allow cell specific and isoform specific RNAi in Dro
9. ont t purifi s en utilisant le kit Midi Prep Qiafilter selon les recommandations du fournisseur Qiagen 1 2 Obtention des vecteurs shRNA cette partie sera compl t e lors de la demi journ e de bioinformatique Design des inserts Pour induire sp cifiquement le silencing du g ne d sir ces vecteurs sont optimis s pour int grer une paire d oligonucl otides qui contiennent une s quence de 19 22 nucl otides d riv e du transcrit ARNm du g ne cible Ces s quences sont g n r es l aide de logiciels sp cifiques Apr s avoir g n r s les couples d oligonucl otides sp cifiques du g ne cible ces amorces sont command es A la r ception de vos amorces celles ci seront hybrid es selon un protocole standard Exemple de la transcription d un oligonucl otide de 60 pb en shRNA Bglll Target Sequence sense Hairpin Target Sequence antisense 4CCGACTCCAGTGGTAATC TAC GAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTA Z GGGGC TGAGGTCACCAT TAGATG AGUTTCTCTCATCTAATGGTGACC TCAG ATI Hindili Custom Oligos b I gU CA GACUCCAGUGGUAAUCUAC UUCUGAGGUCACCAUUAGAUGA G_G 4 Machinerie siRNA GACUCCAGUGGUAAUCUACUU UUCUGAGGUCACCAUUAGAUG au sein des cellules 10 En parallele votre vos vecteur s r troviraux auront t lin aris s par les enzymes de restriction appropri es pour cet exemple par BglII et HindIII Une tape de clonage ligation de vos amorces dans le vecteur de destination lin aris sera ensuite
10. 5 uL de TEMED la solution d acrylamide restant et couler les gels de s paration Recouvrir avec 500 uL d thanol et laisser polym riser Eliminer l thanol l eau distill e et goutter soigneusement 2 Pr parer le gel de concentration en m langeant par aspiration refoulement tube Falcon de 15 mL Acryl Bis 29 1 40 500 uL Tris 1 M pH 6 8 625 uL SDS 1096 50 uL H20 3 80 mL APS 10 60 uL Bleu bromoP 1 2 uL ou quelques grains Ajouter le TEMED 20 uL au dernier moment M langer rapidement par aspiration refoulement et couler le gel de concentration puis poser imm diatement les peignes 24 Une fois polym ris s les gels peuvent tre stock s dans du papier humidifi de tampon et emball s dans du papier aluminium jusqu au lendemain 4 C JOUR4 3 D p t des chantillons et migration Attendre la polym risation compl te sur gel Remplir l appareil lectrophor se de tampon de migration 1X puis enlever d licatement les peignes Rincer les puits avec le tampon pour liminer les traces d acrylamide seringue D poser les chantillons dont un marqueur de taille adapt et compl ter les puits vides avec 10 uL de SDS sample buffer 2X Mettre sous tension 25 mA pour 1 minigel 50 mA pour 2 minigels Lorsque le bleu de migration atteint le bas du gel arr ter et g n rateur et d brancher les fils lectriques Jeter le tampon et r cup rer soigneusement le gel
11. Pr parer des tubes Eppendorf contenant 2 ou 4 mL surnageant de lyse ou 10 uL prot ine purifi e de solution prot ique Compl ter 800 uL avec de l eau distill e 27 c Dosage Ajouter 200 uL de solution de Bradford concentr e dans chaque tube Vortexer Attendre 5 min puis mesurer la densit optique 595 nm dans des cuves en plastique Tracer une courbe d talonnage OD595 f concentration BSA sur papier millim tr D terminer la concentration dans l chantillon 208 ANNEXE 3 DETERMINATION DU TITRE D UNE SUSPENSION A L AIDE D UNE CELLULE DE MALASSEZ Pour compter le nombre de cellules dans une suspension cellulaire on dispose d une lame sp ciale dite cellule de Malassez Cette lame paisse a la particularit de pr senter en son centre un creux de profondeur tr s pr cise 0 2 mm On dispose d une lamelle tr s plane qui repose sur les bords de ce creux ce qui d limite au centre une chambre de volume bien pr cis On introduit la suspension cellulaire dans cette chambre et le comptage se fait gr ce un quadrillage tr s fin grav sur la lame observ au microscope en m me temps que les cellules Ce quadrillage est form par un rectangle de 2 5 mm sur 2 mm subdivis en 100 carreaux dont certains sont subdivis s en 20 petits carr s 100 carreaux 1 grille 1 ul Pour obtenir le titre d une suspension compter un nombre suffisant de carreaux pour d nombrer en
12. ajout par boite de 10 cm les boites sont plac es 5 minutes dans l incubateur Au bout de 5 minutes 8 ml de milieu complet est ajout par boite et l ensemble du liquide contenant les cellules en suspension est plac dans un tube adapt qui va tre centrifug 1300 RPM pendant 5 minutes Le surnageant sera aspir les cellules seront re suspendues dans 2 ml de milieu complet et vous ensemencerez 4 boites contenant 8 ml de milieu complet avec 500 ul de la suspension cellulaire 14 Jour 2 transfection des packaging cells Plusieurs m thodes de transfection sont couramment utilis es dans les laboratoires de recherche i par le phosphate de calcium ii par des surfactants lipidiques iii par lectroporation iv par des polym res Nous utiliserons un polym re le polyethyleimine PET Polysciences qui aura t pr par pr alablement 1 mg ml aliquot et stock 20 C Nous pr parerons l ADN transfecter de la fa on suivante 10 20 ug du vecteur r troviral 5 10 ug d ecotropic helper augmente la production de virions ajouter 1 ml de DMEM sans FBS ni antibiotique ajouter 75 ul de PEI 1 mg ml Vortexer laisser reposer 10 30 minutes temp rature ambiante ajouter la solution pr par e aux packaging cells par goutte goutte homog n iser le milieu de culture placer les boites de culture dans l incubateur La moiti des bin mes transfectera pMLS pMLS shmTrp53 et l autr
13. e clonage de l ADNc Ci dessus Carte du plasmide pBin19 NPTII g ne de r sistance la kanamycine LB left border RB right border bordures gauches et droites qui permettent l insertion du T DNA au hasard dans le g nome nucl aire 22 ANNEXE 1 PROTOCOLES POUR LES WESTERNS BLOTS JOUR 3 Des westerns blots seront r alis s pour les manipulations sur cellules de drosophiles et cellules de mammif res SDS PAGE 1 Nettoyer soigneusement les plaques les entretoises et les peignes l eau savonneuse puis l alcool Eliminer toutes les asp rit s dues l acrylamide mais ne pas utiliser d ponge corrosive Monter le moule gel selon les instructions Marquer la limite du gel de s paration en fonction de la profondeur des puits et de l paisseur du gel de concentration Pr parer la solution de gel de s paration en m langeant par aspiration refoulement tube Falcon de 50 mL Sch matisation du montage du gel d lectrophor se Tampon de migration Tris Glycine pH 8 3 Cathode Gel de concentration Gel de s paration Anode spacer spacer 23 Quantit s pour 2 gels o o qms e que qme Acryl Bis 29 1 40 3 00 mL 3 75 mL 4 50 mL 5 60 mL 7 50 mL Tris 1 5M pH 8 8 3 75 mL 3 75 mL 3 75 mL 3 75 mL 3 75 mL SDS 1096 0 25 mL 0 25 mL 0 25 mL 0 25 mL 0 25 mL H20 8 00 mL 7 25 mL 6 50 mL 5 40 mL 3 50 mL APS 10 100 uL 100 uL 100 uL 100 pl 100 uL NB surtout ne pas autoclaver l APS Ajouter 2
14. e moiti pMLP pMLPshmTrp53 Deux boites de packaging seront donc transfect es pour chaque bin me Jour 3 v rification de la transfection ensemencer les NIH3T3 L efficacit de transfection des packaging cells sera estim e par visualisation au microscope pifluorescence du nombre de cellules pr sentant une fluorescence GFP Le milieu de culture sera remplac par 6 ml de milieu complet neuf Les NIH3T3 seront mises en suspension comme d crit pr c demment et un comptage sera effectu Un million de NIH3T3 seront mises en culture par boite dans 8 ml de milieu complet Jour 4 infection des NIH3T3 par les r trovirus Le surnageant 6 ml des packaging cells sera pr lev l aide de seringues Le milieu contenant les virions sera filtr via un filtre de 0 45 um 4 ug ml de polybr ne Sigma seront ajout s ces 6 ml filtr s Enfin apr s avoir t le milieu de culture des NIH3T3 les 6 ml seront ajout s aux cellules 15 Les packaging cells seront remises en culture avec 6 ml de milieu complet pendant 3 4 heures puis comme pr c demment le milieu sera utilis pour faire une seconde infection des NIH3T3 Les packaging cells transfect es seront ensuite jet es dans les poubelles autoclaver apr s avoir laiss agir de la javel pendant une dizaine de minutes Jour 5 traitement des cellules infect es Le milieu d infection 12 ml sera t et d contamin par un traitement l eau de javel et les ce
15. embranaire qui sont responsables de l attachement du virion la membrane des cellules h tes POL code pour la reverse transcriptase qui poss de des fonctions d int grase et de RNase H 11 Visualisation 3D de la structure d un r trovirus env Surface Glycoprotein SU gp 120 to env Transmembrane ee _____ Glycoprotein TM s Membrane Associated Matrix Protein MA pi7 gag Capsid CA Core Shell p24 RNA 2 molecules pol Protease PR p9 Polymersase RT amp RNAse H RNH p66 Integrase IN p32 tir du laboratoire de Nolan Stanford Les g nes gag pol et env sont clon s dans des plasmides permettant une s lection sp cifique et sont transfect s dans des cellules h tes qui apr s s lection pour l int gration du des insert s exprimant ces g nes et les g nes de s lection seront test es pour leur capacit de production de particules r trovirales d sarm es 12 Obtention de packaging cells W packaging signal pr Producer Cell matrix and coro gag Membrane onrvolopo Target Cell X embrane Receptor Reverse Transcription and Integration t Les packaging cells et les cellules infecter utilis es sont mises en culture en milieu Dulbecco s Modified Eagle Medium DMEM Gibco suppl ment avec 10 de Fetal Bovine Serum FBS Sigma et 1 d antiobiotique antimycotique Gibco ce milieu sera nomm milieu complet en boites de 10 cm Falcon et
16. hatman 3MM Nitrocellulose 0 45uM 26 ANNEXE 2 Dosage des prot ines par la m thode de Bradford Principe La technique de Bradford repose sur la fixation d un colorant Coomassie Brilliant Blue G 250 sur les prot ines pr sentes en solution Cette fixation entraine un d placement du pic maximal d absorbance du colorant de 465nm vers 595nm Le coefficient d extinction du complexe prot ine colorant tant constant sur une large gamme de dilution il est possible d appliquer la loi de Beer Lambert pour calculer la concentration en prot ine Celle ci est d termin e par comparaison avec les valeurs d absorbance obtenues pour une gamme de r f rence D autres m thodes telles que la mesure de l absorbance 280nm cycles aromatiques Trp Tyr et dans une moindre mesure Phe ou 205nm liaison peptidique sont utilisables Pour chaque technique les valeurs d pendront de la prot ine de r f rence choisie en g n ral l albumine s rique bovine BSA R f rences Current Protocols in Molecular Biology Current Protocols Ed Wiley Biorad Protein Assay Biorad Manuel d utilisation I M thode classique a Gamme talon Pr parer des tubes Eppendorf contenant 0 2 tubes 1 4 7 14 28 42 et 56 ug de BSA partir d une solution stock 0 2 mg mL Ajouter 10 uL du tampon dans lequel se trouvent les prot ines doser Compl ter 800 uL avec de l eau distill e b Pr paration des chantillons
17. incub es dans un incubateur 37 C 5 de CO Attention la majorit des manipulations doit tre r alis e en conditions st riles sous hotte flux laminaire avec une blouse et des gants 13 2 1 Protocole de transfection des packaging cells et d infection des cellules h tes NIH3T3 Jour 1 ensemencement des packaging cells Les packaging cells mises en culture pr alablement seront ensemenc es en vue des transfections Pour ce faire les milieux de culture seront aspir s les cellules seront rinc es d licatement ces cellules sont faiblement adh rentes avec du PBS 1X 137 mM NaCl 2 7 mM KCl 10 mM sodium phosphate dibasic 2 mM potassium phosphate monobasic pH of 7 4 Apr s aspiration du PBS les cellules sont d coll es par ajout de 5 ml de milieu complet et par flux reflux la pipette Les 5 ml sont r cup r s dans un tube adapt puis un aliquot est pr lev pour comptage du nombre de cellules par ml l aide d une cellule de Malassez voir annexe 0 5 1 x 107 de packaging cells par boite de 10 cm sont mises en culture dans 8 ml de milieu complet puis plac es dans l incubateur Les cellules infecter sont des cellules murines NIH3T3 Ce sont des cultures de fibroblastes couramment utilis s en laboratoire Nous passerons les NIH3T3 au cours du premier jour Pour cela les milieux de culture seront aspir s les cellules seront rinc es avec du PBS 1X le PBS est aspir et 1 ml de Trypsine EDTA est
18. l analyse de l extinction de l expression du g ne Les m thodes compl mentaires sont g n ralement une analyse par PCR en temps r el des western blots analyses de ph notype Analyse des prot ines par western blot Cette partie sera effectu e en m me temps que pour la partie drosophile Les cellules infect es par les diff rents r trovirus seront aliquot es Chaque bin me fera une extraction de prot ines lyse des cellules dans 50 ul de tampon RIPA recette partie drosophile centrifugation 13000g pendant 15 minutes 4 C pr lever le surnageant dans un tube neuf dosage des prot ines par Bradford pr l ver 30 50 ug de prot ines ajouter x ul du tampon Laemmli 4X pour obtenir 1X placer 100 C 5 minutes d poser sur gel SDS PAGE Apr s migration et transfert des prot ines sur membrane de nitrocellulose coloration au rouge ponceau couper la membrane en deux au niveau de la bande 70 kDa annoter les membranes incuber les membranes environ 30 minutes dans du TBS 1X Lait 596 tween20 0 196 puis rincer 3 fois avec TBS 1X tween20 0 1 pendant 5 minutes ajouter les anticorps anti Trp53 et anti actinin t moin de charge dilu s au 1 1000 dans du TBS1X BSA 3 sur les membranes correspondantes incuber une nuit sous agitation 4 C R v lation incuber avec les anticorps secondaires appropri s dilu s au 1 1000 dans du TBS1X BSA 396 puis rincer 3 fois avec TBS 1X
19. la culture de la veille ou de deux jours 35S GFP kanamycine 50ug ml rifampicine 50ug ml pBIN19 kanamycine 50ug ml rifampicine 50ug ml pBIN19 35S Pro kanamycine 50ug ml t tracycline 5ug ml Culture une nuit 28 C avec agitation 3 R colte des agrobact ries Lecture de la DO 600nm sur 1mL de la culture de nuit il faut que la DO soit sup rieure ou gale 1 Blanc milieuLB antibios Pr lever 20mL sur les 40mL R server le reste 4 C Centrifuger les 20mL d agrobact ries dans un falcon de 50ml 5000g 20 min temp rature ambiante Enlever le surnageant et reprendre le culot dans 10mL de mileu MMA Ajuster la DO 1 en diluant avec du tampon MMA Blanc tampon MMA 4 Si on veut agro infiltrer avec un m lange de 2 agrobact ries il faut faire un m lange qui volume des 2 souches d agrobact ries 5 Laisser au repos au moins Zh sur la paillasse 19 Planning des agroinfiltrations 35S GFP pBIN19 pBIN 19 35S Pro pBIN19 35S Pro ET 35S GFP A m langer au moment du point 4 tampon MMA seul Infiltrer directement avec une seringue en plastique de 2mL sans l aiguille sur la face inf rieure de la feuille 2 feuilles par plante 2 infiltrations par feuilles de part et d autre de la nervure principale Mettre des gants pour l infiltration et changer chaque fois qu on change de souche d agrobact ries Mettre des tiquettes sur le p tiole de chaque feuille pour rep rer quelles constructions so
20. llules seront mises en culture dans du milieu complet neuf jour 6 le milieu contenant les virus est limin et les NIH3T3 sont mises en pr sence de milieu complet neuf Jour 8 afin de connaitre le pourcentage de cellules infect es les cellules sont mises en suspension et un aliquote est analys par cytom trie de flux pour d tecter la pr sence de GFP Si les vecteurs utilis s portent tous une s lection GFP vous pouvez estimer votre pourcentage d infection pour chacune de vos constructions si non en utilisant le contr le positif GFP vecteur vide vous pourrez faire une approximation du pourcentage d infection pour les vecteurs d pourvus de GFP et ayant t utilis s en parall le de ce contr le Le pourcentage d infection d pend de plusieurs param tres dont nous discuterons au cours de l atelier cellules vecteurs tats des cellules milieux les g nes infecter Pour les cellules NIH3T3 une infection de 60 7096 est un minimum La plupart des vecteurs r troviraux ayant un g ne de s lection un antibiotique les cellules infect es peuvent tre mises en culture dans un milieu de s lection jusqu l apparition d une population stable en parall le vous avez une culture NIH3T3 non r sistante votre antibiotique Selon le pourcentage d infection nous ensemencerons les cellules en milieu s lectif ou non 16 2 2 Analyse de l extinction de l expression du des g nes Vous pouvez ensuite proc der
21. nt utilis es Observer l obscurit avec une lampe UV J3 et J4 Mettre des masques pour se prot ger des UV SOLUTIONS MERES Tampon MES 100mM peser 1 95g de MES 195 2g mol pour faire 100mL de tampon 100mM Diluer dans H20 Pas besoin de prendre le pH Filtrer sur 0 45um Aliquoter par 20mL dans des falcons et congeler des aliquots 20 C MgCI2 0 2M Acetosyringone 100mM dans DMSO stocker 20 C en aliquots de 500pl Lors de la manip ou le jour pr c dent pr paration du tampon MMA ne sera pas autoclav Pour 200mL de tampon MMA 20mL de MES 100mM 10mL de MgCI20 2M 300 ul d acetosyringone 100mM 150pyM final qsp H20mQ 200mL final Ajuster le pH 5 8 MAT RIEL V G TAL Plantes transg niques 16C de 3 semaines qui surexpriment la GFP gr ce un promoteur constitutif 35S CaMV 20 Ci dessus Carte du transg ne ins r dans les plantes 16C 35S GFP Plante surexprimant la GFP examin e sous les UV En rouge le point d Agroinfiltration 21 CARTES DES PLASMIDES pBIN19 plasmide de d part r sistance kanamycine et rifampicine pBIN19 35 Pro plasmide qui permet de surexprimer la prot ine virale PRO dans les cellules v g tales r sistance kanamycine et t tracycline 35S GFP plasmide qui permet de surexprimer la GFP dans les cellules v g tales r sistance kanamycine et rifampicine pBin19 backbone and T DNA ns NPTII LB RB Smal A Site d
22. ollin upmc fr 01 44 27 59 13 Marco Da Costa mdacosta snv jussieu fr 01 44 27 37 35 Fr d rique P ronnet frederique peronnet upmc fr 01 44 27 27 39 Rapha lle Grifone raphaelle grifone snv jussieu fr 01 44 27 28 04 Secr tariat Carine Joseph carine joseph snv jussieu fr 01 44 27 35 35 D roulement de l UE Cours B timent K 1er tage salle 120 Partie Pratique Ateliers de biotechnologie Atrium 3 me tage 8h 8h 30 9h 9h 30 10h 10h30 11h ilh 30 12h 12h 30 13h 13h 30 14h 14h 30 15h 15h 30 16h 16h 30 17h 17h 30 18h 8h30 9h 9h30 10h30 11h30 12h 13h 13h30 15h 15h15 16h 16h30 18h SEMAINE 1 LUNDI MARDI MERCREDI JEUDI VENDREDI Introduction SB Cours ARN 1 LT Cellules Digestion ADN FP 1h Cellules Ensemencement MDC RG 2h Gel d agarose V rification FP 1h Agrobact ries Q D O min Cours ARNs fin 1h LT H t rochromatine 2h ET Ensemencement MDC 2h Cellules ARNds FP Observation plantes SC SP Cours M thylation ex plantes ET Lavage agrobact ries SC SP 1h Transcription in vitro FP 1h Transfection de cellules MDC 2 h Infiltration des plantes SC SP 1h DNAse Pr cipitation FP 1h TD empreinte parentale 3h EMV Conf rence sur l inactivation de l X Edith Heard Observation plantes TD Bioinformatiq
23. s vecteurs r troviraux Les vecteurs r troviraux sont actuellement les seuls permettre une expression stable puisqu ils s int grent dans le g nome de la cellule infect e L expression des g nes transf r s est relativement longue les g nes transf r s tant ainsi transmis aux cellules filles au cours des divisions Cependant leur emploi reste limit au transfert de g nes dans des cellules en division car ils n cessitent une rupture de la membrane nucl aire pour que le transg ne ait acc s l ADN nucl aire C est gr ce l utilisation de ce type de vecteur que des enfants atteints de syndrome immunitaire combin s v re li l X enfants bulles ont pu tre trait s par l quipe d Alain Fischer et Marina Cavazzana Calvo l h pital Necker L emploi de ces vecteurs r troviraux est galement limit des cellules facilement pr levables pour une modification ex vivo En effet ils sont tr s rapidement inactiv s par le syst me du compl ment lorsqu ils sont inject s par voix syst mique Des tudes sont actuellement en cours afin de permettre cette utilisation syst mique et d largir ainsi leurs indications th rapeutiques D autres vecteurs r troviraux pourraient tre utilis s de facon plus large car ils permettent une infection des cellules au repos Il s agit des vecteurs issus de la famille des lentivirus Ces vecteurs sont encore l tude car il faut 8 notamment s assurer de leur innocuit
24. sophila RNA 9 299 308 Cycle de vie de Drosophila melanogaster female male 10 after fertilization c embryo pupa 4 5j after fertilization A 1st instar larva 24h after fertilization Pc a Li ta NO age m HF 2nd instar larva prepupa ER RES id VEUT 3rd instar larva Sch ma d une larve de 3 e stade L3 et d un adulte de Drosophila melanogaster d apr s V Hartenstein Atlas of Drosophila development les disques imaginaux des larves de 3 me stade pr figurent les appendices de l adulte L3 gute eg Tran RO x por pAdW mme P j pAdCIy Be Cp pAdAbd EN ge pAdHI FA psc 2 Ga pAdL pAdLb ji HE 5 j m EL on a aud id aout dll zi pA ng dd wg A ADU LT wmg guess UP IN prothoracic disc clypeo labral bud vil vill XS wing disc MM eye antenna disc IV MU haltere disc Wl labial disc ex IN leg disc arri iz abdominal histoblast x F F MX genital disc PPS not DA og zen mmm Expression de la GFP dans un disque imaginal d aile de larve L3 sous le contr le d un pilote patched ptc expression la fronti re des compartiments ant rieur et post rieur gauche contraste de phase droite fluorescence g notype ptc Gal4 UAS GFP 7 b Transg ne permettant de produire un ARN double brin GFP UAS RNAiGFP sous le contr le d un pilote Gal4 et qui induira l inactivation de la GFP par
25. tween 0 196 pendant 5 minutes et poursuivre avec la r v lation l ECL et exposition du film autoradiographique 17 Inactivation d un transg ne dans des plantes de tabac et effet d une prot ine virale PRO sur l extinction de g nes Carte d identit des Potyvirus Le genre potyvirus est le genre le plus tudi dans la famille des Potyviridae Le nom de ce genre vient du plus connu de ses membres le virus Y de la pomme de terre Potato virus Y PVY Les particules sont en filaments flexueux non envelopp es de 720 850 nm de long et de 12 15 nm de diam tre Ils forment des corps d inclusion dans les cellules v g tales et leur g nome monopartite code une polyprot ine Ils sont transmis par les insectes G nome Monopartite lin aire ARN simple brin de polarit positive d environ 10 000 nucl otides de long L extr mit 3 terminale a une queue poly A et l extr mit 5 terminale a une prot ine VPg cod e par le g nome viral Viral Protein g NIa P1 HC Pro P3 6K1 CI 6K2 VPg Pro NID CP T tot P ttt Carte du g nome de Potyvirus Le g nome du Potyvirus est traduit en une seule polyprot ine puis la polyprot ine est cliv e en 10 prot ines la prot ine de capside CP tant situ e en N terminal P1 protein 32 4kDa unknown function HC Pro 51 9kDa Helper Component insect transmission P3 protein 41 5 kDa unknown function 6K1 6 0 kDa unknown function CI 71 4kDa Cylindrical inclusion protein possibl
26. ue l UTES MdC et RG Outils ARNi 2h V rification des ARNs sur gel FP 1h Microscopie Efficacit Transfection Ensemencement MDC 1h 2h Observation des plantes Dissection larves Observations drosophiles FP 3h Conf rence Louisa Dandolo empreinte mammif res Cours vernalisation 2h ET MDC 30 min Observation plantes Observation plantes p SC SP Cours prions CF 2h Cours 3h histones chromatine Trithorax PcG FP SB Infection des cellules MDC 30 min TD1 prions CF 2h TD2 la reine des abeilles SB 1h SEMAINE 2 cunor MARDI MERCREDI JEUDI VENDREDI Extraction de prot ines Lavages Anticorps secondaires Dosage de prot ines Besson FP MdC RG Observation plantes 15min Mouvement SC SP Analyse des r sultats D p t Migration des gels Transfert sur membrane Blocage Inactivation par ARN interf rence du g ne codant la MAP kinase ERK dans les cellules S2 de drosophile d apr s RNAi in cultured Drosophila cells Kao and Megraw 2004 Methods Mol Biol 247 443 457 et Use of double stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways Clemens et al 2000 PNAS 97 6499 6503 1 Pr paration de l ARN double brin Lundi 1 Pr paration de l ADN pour la transcription dig rer 10ug du plasmide pBluKSP RNAiRolled par EcoRI et HindIII Apr s migration sur gel
27. viron 100 cellules puis multiplier par 100 000 le nombre de cellules par carreaux Exemple on a compt 120 cellules pour 40 carreaux donc le nombre de cellules par carreaux est de 120 40 3 et le titre de la suspension est de 3 X 100 000 cellules ml NNNSONONNSNSN HH SNNNNNNNNNNN S OS Re rrc r NONO OON ATR Hr FEE XR Fa a et tt CR CS MT ES E EJ so Tarta eee LE rs RER oe bd Car mECH M E narm e SEHE EE 2 ME LS SARA RSR RE C SNR FT OMIT 29 4 j DI LE LI a i Hd ni EE mu mea co ni NE 28 i L le E A E ANNEXE 4 LIENS INTERNET UTILES Le site du Laboratoire de David Baulcombe Cambridge Royaume Uni http www plantsci cam ac uk research baulcombe Description of plant viruses http www dpvweb net CONFERENCES EN LIGNE Andrew Fire s Nobel Prize http nobelprize org nobel prizes medicine laureates 2006 fire lecture html Henry Stewart Talks 30
28. y involved in cell to cell movement 6K2 5 5 kDa unknown function VPg 21 7kDa Genome linked protein NIa pro 27 7 kDa Nuclear Inclusion proteinase NIb 59 8 kDa Nuclear Inclusion polymerase CP 29 8 kDa coat protein 18 Inactivation de l expression d un transg ne dans des plantes de tabac et effet d une prot ine virale PRO sur l extinction de g nes d apr s Ruiz et al 1998 Plant Cell 10 6 937 946 Il est possible d induire dans une plante l inactivation de l expression d un transg ne par l expression transitoire de s quences homologues Nous allons utiliser une lign e transg nique de Nicotiana benthamiana exprimant la GFP de mani re constitutive lign e 16C Cette lign e a t cr e dans le laboratoire de David Baulcombe John Innes Centre Royaume Uni Sous les UV la plante est verte Quand on infiltre les feuilles avec une souche d agrobact rie portant une construction permettant de surexprimer le g ne GFP la zone de la feuille infiltr e devient rouge sous les UV on visualise alors seulement la fluorescence de la chlorophylle On peut donc induire l inactivation de l expression du transgene GFP et suivre le mouvement de cette inactivation dans la plante enti re partir de la zone infiltr e mouvement syst mique Protocole d infiltration sur tabac 1 Pr culture d agrobact ries 2mL de milieu LB antibios 28 C une nuit ou deux jours 2 Ensemencer dans un erlen 40mL de milieu LB antibios avec 50ul de
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