Home

ajout d`un contrôle d`inhibition dans des kits str multiplex

Contents

1. Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Figure 11 http www nfstc org pdi Subject06 images pdi_s06 jpg http www univ rouen fr ABISS L1 WEB empreinte dnamolecule html http planet terre ens lyon fr planetterre objets Images fossiles A DN pcr gif http www edu upmc fr sdv masselot 05001 polymorphisme microsatellites Html Coquoz Preuve par l ADN la g n tique au service de la justice p 83 AmpFISTR Yfiler et AmpFISTR Minifiler PCR Amplification Kit User s manual http www cstl nist gov div83 1 strbase kits PowerPlex16 htm http www cstl nist gov div83 1 strbase kits SGMPlus htm http www cstl nist gov div83 1 strbase kits MiniFiler htm http www cstl nist gov div83 1 strbase kits Y filer htm http www labgene direct com epages 206886 sf fr_FR ObjectPath Shops 206886 Products 22 1 1 20050 2072X 22 SubProducts 22 1 1 20050 20724 22 http www3 appliedbiosystems com cms groups mcb_marketing documents generaldocuments cms 041990 pdf Page 62 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 11 Lexique ADN codant c est la portion d ADN qui sera transcrite et ensuite traduite en prot ines et rassemble les g nes qui sont le support de l information g n tique essentielle a la vie de l individu ADN non codant repr sente la plus grande partie du g nome et on ne conna t pas aujourd hui sa foncti
2. 500 B_DYS456 B_DYS389I B_DYS390 B_DYS389II 100 200 300 400 500 6 3 4 4 Analyse des resultats Notre CI est bien pr sent et nous obtenons les profils d sir s des contr les positifs DNA 9947A ou DNA 007 pour chaque kit Donc il ne perturbe pas le bon fonctionnement des PCR Sauf peut tre pour le kit AmpFISTR YFiler Il semble que l amplification se soit moins bien d roul e pour les STR de faible poids mol culaire en pr sence du CI Toutefois le profil est plus homog ne les pics obtenus se situent tous a la m me hauteur Pour le kit AmpFISTR SGM Plus nous avons d cid d augmenter la quantit initiale d ADN de souris a 1000 copies pour augmenter les chances de d tecter une interf rence avec l amplification des marqueurs des kits N anmoins aucune interference n a t d tect e Par contre nous sommes toujours emb t s par la hauteur des pics suppl mentaires des colorants encadr s en rouge car ils se retrouvent sur les alleles des marqueurs D3S1358 et D21S11 pour le kit PovverPlex 16 System D3S1358 et vWA pour le kit AmpFISTR SGM Plus D13S317 pour le kit AmpFISTR MiniFiler et DYS456 et DYS390 pour le kit AmpFISTR Yfiler Ils peuvent soit masquer la pr sence de ces all les surtout si la quantit d ADN de l extrait de l chantillon est faible et la hauteur des pics suppl mentaires est grande soit tre confondus avec les all les Mais nous pouvons rien y faire
3. AJOUT D UN CONTR LE D INHIBITION DANS DES KITS STR MULTIPLEX A i a A i ar Laboratoire AURIGEN Lausanne Novembre 2008 A vril 2009 Travail r alis par Miriam Iglesias sous la supervision du Dr Rapha l Coquoz Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 1 Sommaire Il arrive qu apr s une Polymerase Chain Reaction PCR aucun profil ne soit obtenu sur l analyseur de fragment Comment savoir s il s agit d inhibition ou s il n y a simplement pas d ADN dans l extrait de l chantillon sans devoir au pr alable quantifier l ADN Pour r pondre cette question 1l suffit de mettre au point un contr le d inhibition partir d un ADN animal ou v g tal qui s amplifie en m me temps que l extrait Au sein du laboratoire Aurigen ce besoin d un contr le d inhibition CI est particuli rement ressenti pour des analyses de g n tique forensique Pour effectuer ces analyses nous utilisons les kits suivants PovverPlex 16 System de Promega AmpFISTR SGM Plus AmpFISTR MiniFiler et AmpFISTR Yfiler d Applied Biosystems Apr s r flexion nous avons opt pour ADN de souris Il est facile d acc s et il est d j utilis dans d autres techniques au laboratoire Apr s de nombreux tests les r sultats obtenus sont tr s satisfaisants Selon diff rents tests effectu s Le contr le d inhibition n interf re pas dans le fonctionnement des kits II n appara t pas sur le profil lorsq
4. 58 S Conclusion p SONO N pana a pseu dde eo a tente made 59 9 42 RI e ur 60 10 DO 10 01 30 E A in N 61 11 Po EE 63 12 AMEX az 65 Page 4 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 4 Introduction Les domaines d application du laboratoire dans lequel j effectue mon travail de diplome sont les suivants l histologie la cytologie la cytog n tique la g n tique m dicale et pour terminer la genetique forensique En g n tique m dicale et forensique la plupart des r sultats du diagnostic repose sur une technique bien connue actuellement la PCR De nombreuses applications de cette technique sont actuellement commercialis es sous la forme de kits Tout d abord nous expliguerons bri vement ADN Ensuite nous allons expliquer la PCR son fonctionnement et ses applications Et enfin nous terminerons par d finir les avantages et les d savantages de la PCR ce qui nous am nera au sujet de mon travail de diplome 4 1 L Acide D soxyriboNucl ique Tous les tres vivants ont pour support l Acide D soxyriboNucl ique ADN Pr sent au sein des ASN cellules l ADN se compose d une succession de e quatre elements differents appel s nucl otides Chaque nucl otide est form par l association d un e CR Wr dd sucre d un acide et d une base dont il existe quatre variantes l ad nine A la thymine T la a guanine G et la cytosine C L ordre dans lequel a se succedent c
5. Controls Ebo A A i JL 2 IB DYSS8T BDSM 1 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 3000 2000 1000 o om rele Inhabit 19 THI Bt CO NR 5 8 Z amp 2 Page 74 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 D Bu E EN E TAI mt i TAN La B_DY53891 B_DY5390 B_DYS3891I 100 200 300 400 500 3 E 3 E 3 E 13 D Thi 3 Am ED 100 200 300 HO 1 1 1 H E E E B S Page 75 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Po th hk EM B Desde LST sa APM Cantrole Enhibirion R R E PJ RSs ALE BL BLT Controle Inhibition 1 EX Hi an 500 D i a U U 1 H U a 10019 e I e MIL Gel D S Sol A n SA HE a B_DY5456 B_DY53891 B_DY5390 B_DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 1000 CU ee T e d e BW a z E E as B_DYS3891 B_DYS390 B_DYS38911 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 Page 76 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 B_DY5456 B_DYS3891 B_DY5390 B_DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 ci HN ne Inhibition 100 200 Si MW 300 Page 77 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 E S 3 38 2 Page 78 sur 79
6. Mais la fr quence de ces all les est de l ordre de 0 000 chez les Caucasiens chez les Africains et les Hispaniques Elle se situe entre 0 002 0 010 chez les Asiatiques Huckenbeck Nous remarquons aussi qu il y a malheureusement des pics suppl mentaires Ces pics suppl mentaires peuvent nous d ranger lors de la lecture des profils Avec les deux combinaisons nous obtenons deux pics se situant aux alentours de 118 pb et 207 pb Ces derniers sont plus intenses avec les amorces GALT F GALT R2 Pour les amorces GALT F GALT R2 il y a un troisi me pic suppl mentaire Il se situe vers 307 pb Ces pics suppl mentaires peuvent provenir des restes de colorants qui n ont pas t limin s lors de la purification des amorces Il aurait peut tre fallu demander une meilleure purification lors de leur achat ou diminuer la concentration des amorces GALT F2 GALT R et GALT F GALT R2 Page 30 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Dans l essai avec 1000 copies dADN de souris initiales nous notons la pr sence d un pic quidistant encadr en vert de 41 pb de moins que le pic principal que nous devons obtenir Ce pic est un art fact li a l exc s d ADN lors de la PCR Au bilan nous pensons que la quantit initiale optimale d ADN de souris est de 100 copies Cette quantit nous donne un pic bien visible compar a 10 copies d ADN et sans les exc s obtenus avec 1000 copies d ADN c est a dire les pics satur
7. Penta E D18551 D21S11 THO1 D3S1358 FGA TPOX D8S1179 Vwa am log nine Penta D CSF1PO D16S539 DIS8220 D13S317 et D5S818 Une des deux amorces pour les marqueurs Penta E D18551 D21S11 THOI et D3S1358 est marqu la fluoresc ine FL Y Pour les marqueurs FGA TPOX D8S1179 Vwa et l am log nine une des deux amorces est marqu e la carboxy tetramethylrhodamine TMR 4 Et pour les marqueurs suivants Penta D CSFIPO D168539 D7S8220 D13S317 et D5S818 l amorce fluorescente est marqu e par du 6 carboxy 4 5 dichloro 2 7 dimethoxyfluorescein 6 JOE Technical manuel PovverPlex System 16 p 2 Sch ma des tailles des alleles possibles PowerPlex 16 DO MM EE I ct CT io om 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp ILS 600 Figure 6 Composition Technical manuel PovverPlex System 16 p 4 Gold ST R 10x Buffer PowerPlex 16 10x Primer Pair Mix Control DNA 9947A 10 ng ul PowerPlex 16 Allelic Ladder Mix Internal Lane Standard ILS 600 PovverPlex Matrix Standards 310 PovverPlex Matrix Standards 3100 3130 Mineral Oil Nuclease free Water Page 14 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 MasterMix PCR Selon le manuel technique du kit PovverPlex System 16 p 8 le volume final de MasterMix est de 25 ul Nous avons juste diminu le volume de MasterMix a 12 5 ul tout en gardant les proportions des r actifs MasterMix MM PCR pour un ch
8. analyse des produits peuvent tre tr s rapidement r alis es par lectrophor se sur gel d agarose ou d acrylamide L ADN est r v l par une coloration au bromure d thidium Ainsi les produits sont visibles par transillumination aux ultraviolets 280 320 nm Ameziane p 159 Sur des syst mes automatis s on utilise aujourd hui un analyseur de fragment d ADN appareil d analyse g n tique ABI Genetic Analyse 3130 par exemple Cet appareil utilise le principe de l lectrophor se capillaire CE La d tection des fragments est r alis e par une diode laser Cela n est possible que si la PCR est r alis e avec des amorces coupl es des fluorochromes Page 8 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 4 2 2 Applications de la PCR Les applications de la PCR comme cit es pr c demment tant nombreuses je ne vais m attarder que sur la PCR appliqu e l identification La PCR est remarquablement efficace pour identifier des esp ces des vari t s ou des individus par profil ADN Cette application repose sur les connaissances acquises en mati re de structure du g nome Il s agit tout simplement d amplifier des s quences nucl otidiques qui soient sp cifiques l esp ce a la vari t ou l individu Chez les eucaryotes notamment ces s quences sont tr s nombreuses et offrent une vaste palette qui permet des identifications de mani re tr s pr cise et tr s s lective En
9. a part tenter d obtenir des amorces plus pures lors de la prochaine commande Page 38 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 5 Cinqui me essai inhibition de la Taq Polymerase dans les differents kits avec de I hemoglobine 6 3 5 1 But Nous voulons essayer d inhiber l AmpliTaq Gold DNA polymerase SU ul avec de l h moglobine chapitre 6 1 5 2 pour v rifier la r action du CI Et nous allons utiliser un ADN extrait d un chantillon de sang chapitre 6 1 5 2 dans les kits PowerPlex 16 System AmpFISTR SGM Plus AmpFISTR MiniFiler et AmpFISTR YFiler 6 3 5 2 Methode Amplification selon les protocoles de chaque kit avec 1 ul de CIMIX 10 ou CIMIX 12 5 par r action selon le volume r actionnel du kit 0 5 ng dADN d un patient et diff rentes concentrations d heme Page 39 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 3 5 3 R sultats kit PowerPlex 16 System Kit PovverPlex 16 System inhib avec 200 uM d h me F2_200uM PowerFlex_16_CI E D3 1358 Pena Controle 100 200 300 400 500 Kit PovverPlex 16 System inhib avec 40 uM d h me dtunt PowerPlex_16_CI Ei D3 1358 100 200 300 400 500 Kit PovverPlex 16 System sans inhibition tulit PoverPlex 16 CI E Controle 100 200 300 400 500 Page 40 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 5 4 Analyse des resultats L AmpliTag Gold DNA polymerase est t
10. amplifier plus d un amplicon a la fois par l utilisation d au moins trois amorces par r action de PCR Les produits de PCR ne sont alors comp titifs que pour la polym rase les dNTP et ventuellement le marqueur d ADN Polymorphisme concerne n importe quelle diff rence entre les individus On peut l observer au niveau de l aspect g n ral des individus au niveau des prot ines Caract re ou g ne pour lequel il existe plusieurs variantes au sein d une population Profil d ADN ou profil g n tique est une portion d ADN sp cifique chaque individu Standard interne est un m lange de plusieurs fragments d ADN dont les tailles sont connues Stutter litt ralement en francais b gaiement Les stutters sont des produits secondaires qui apparaissent sur les profils ADN sous la forme d un pic de taille r duite correspondant a un all le ayant un l ment r p titif de moins que l all le dominant Ces stutters se forment pendant la phase d longation de la PCR C est comme si la Taq polym rase patine et omet parfois un l ment r p titif produisant donc un produit raccourci d un l ment Le ph nom ne des stutters est d autant plus prononc que l l ment r p titif est court Taq polym rase est une enzyme plus particuli rement une ADN polym rase qui agit dans une certaine gamme de temp rature Elle a t isol e partir de la bact rie thermophile Thermus aquaticus en 1965 Elle est d pourvue d act
11. concentrations 0 25 uM et 0 5 uM Nous avons d cid d abandonner les amorces GALT F GALT R2 car elles ne s amplifient pas comme souhait Premi rement notre but est de n obtenir qu un seul pic pour notre CI Avec ces amorces nous en obtenons deux sans que nous ayons pu trouver d explication a cet tat de fait Deuxi mement le pic obtenu pour notre CI peut nous d ranger dans la lecture des alleles pour le marqueur Penta E Mais encore la diff rence de hauteur obtenue entre la premi re exp rience et la deuxi me est flagrante ce qui laisse envisager des potentielles interf rences entre l amplification avec ces amorces et l amplification des marqueurs du kit Page 33 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 3 Troisi me essai utilisation dun melange pret a l emploi d ADN de souris et des amorces correspondantes et recherche de la concentration optimale 6 3 3 1 But Tout d abord nous avons dilu les amorces GALT F2 et GALT R pour en obtenir la concentration de 0 25 uM au lieu de 0 5 uM et ainsi r essayer de diminuer la hauteur des pics suppl mentaires Ensuite nous avons pr par un m lange d ADN de souris et d amorces CIMIX 12 5 pour ne plus avoir qu a rajouter un microlitre de ce m lange dans le MasterMix du kit utilis Ce m lange CIMIX contient en outre un stabilisateur le tRNA Nous avons effectu le test avec le kit AmpFISTR SGM Plus 6 3 3 2 M thode Amp
12. contr le d inhibition Cl La s quence du contr le d inhibition choisie se situe sur le g ne Galactose 1 phosphatase uridyl transf rase r f NT 166289 1 Annexe 1 depuis s quence nucleotides 10155302 10156200 du chromosome 4 de l ADN de souris MOUSE GENOMIC DNA G309A fournisseur Promega Cette s quence a t choisie pour des raisons de commodit L ADN de souris tant d j utilise dans d autres analyses de PCR nous avons d j une paire d amorces GALT F et GALT R amplifiant une s quence sur ce g ne A partir de ces amorces nous avons choisi deux autres amorces GALT F2 et GALT R2 qui nous permettent d amplifier un fragment de taille voulue Le couple d amorces GALT F et GALT R2 et la paire d amorces GALT F2 et GALT R vont donc amplifier deux r gions partiellement diff rentes Les deux amorces GALT F2 et GALT R2 ont t choisies pour satisfaire les crit res suivants a Selon le Dr R Coquoz plus le fragment est long plus la sensibilit de la PCR face a des substances inhibitrices augmente Suivant la concentration en inhibiteurs l action de la Taq polym rase peut tre inhib e totalement ou partiellement auquel cas les fragments de petites tailles seront malgre tout un peu amplifi s communication personnelle b L amplifiat obtenu ne doit pas interf rer avec les marqueurs des kits En d autres termes il ne doit pas donner un pic dans la gamme de taille des alleles des marqueurs car il peut t
13. de l inhibition S1 cette hypoth se est vraie notre prochain but est de vaincre cette inhibition Nous pouvons lever cette inhibition en effectuant une purification compl mentaire nouvelle extraction de l extrait par exemple Mais un des inconv nients de cette purification est que son rendement n est pas de cent pour cent Nous pourrions alors soit perdre de l ADN soit laisser encore des inhibiteurs dans notre extrait Alors comment conna tre le rendement d une extraction pour pouvoir v rifier si l inhibition a bien disparu Une possibilit pour valuer la performance de rendement de l extraction est d utiliser un deuxi me contr le de quantit connue qui nous indiquera la qualit de l extraction Ce contr le sera rajout lors de la purification Ensuite nous effectuons une PCR en temps r el avec une faible quantit d extrait purifi et nous calculons le rendement Si le rendement est bon nous effectuons une PCR Puis nous analysons les amplifiats obtenus sur l analyseur de fragment Si l inhibition est lev e comme nous le souhaitions nous devrions obtenir un pic plus grand que celui obtenu avec la premi re PCR Page 58 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 8 Conclusion personnelle Ce travail de dipl me m a permis de me familiariser avec de nombreuses techniques en biologie mol culaire ainsi que d approfondir mes connaissances th oriques dans le domaine de la g n tique f
14. es provenant pour Uessentiel de Gehring 1999 Figure 4 Page 12 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Ces kits ont t con us pour employer la capacit de d tection multicolor e de l appareil d analyse g n tique ABI Genetic Analyse 3130 par exemple Une des amorces de chaque marqueur amplifi par ces kits est coupl e a un fluorochrome Ces substances fluorescentes gui mettent diff rentes longueurs d onde sont d tect es sur I ABI dans le bleu le vert le jaune le rouge et dans l orange selon leur longueur d onde Ces diff rences de longueur d onde permettent ainsi la coamplification simultan e de differents marqueurs avec des gammes de taille se chevauchant dans un seul tube PCR et la d tection en une seule injection sur ABI ou sur un seul puit si c est sur gel Sch ma des diff rentes missions des cing fluorochromes pour AmpFISTR Yfiler et AmpFISTR Minifiler Emission Spectra of 5 dye Set E 100 S BOJ E god 40 2 20 J 500 550 600 650 700 Wavelength nm 6FAM dye S VJET dye NED dye Y dure LS T dye Figure 5 Page 13 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 1 1 2 Kit PowerPlex 16 System Principe Le kit PovverPlex 16 System permet la coamplification et la d tection de seize marqueurs quinze marqueurs STR et l am log nine d terminant le sexe Ce kit permet l amplification des marqueurs suivants
15. modifier le temps de migration Run time pour que le pic de notre contr le d inhibition CI soit visible sur le profil Le CI tant un fragment de grande taille explications p 25 le temps de migration a te rallonge a 2200 secondes pour tous les kits Les applications d un analyseur de fragments sont tr s nombreuses voici quelques exemples S quen age Analyse de mutation Identification d alleles Analyse de microsatellites STR Page 23 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Schema d un ABI Genetic Analyser 3130 Four Systeme d livrant le polymere Capillaires Fen tre de d tection D but du capillaire contenant la cathode Bouteille de polymere Support a chantillons R servoir contenant le tampon eau et poubelle tampon et l anode Figure 11 6 1 4 Autre materiel necessaire Pipettes Embouts avec filtre Vortex Centrifugeuse Gants sans poudre Kit d isolation d ADN ou ph nol chloroforme Tubes de 2 ml avec bouchon Microtubes pour PCR AmpliTag Gold DNA polymerase 5U ul par Applied Biosystem Tubes pour ABI Hi Di Formamide par Applied Biosystem POP 4 Polym re pour appareil ABI Genetic Analyse 3130 par Applied Biosystem Running Buffer 10x par Applied Biosystem GeneMapper ID Software v3 2 par Applied Biosystems Page 24 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 1 5 Materiel biologique 6 1 5 1 Le
16. n y a pas d ADN 6 Developpement 6 1 Mat riel 6 1 1 Les kits 6 1 1 1 Domaine d application et principe des kits A l exception du kit AmpFISTR Yfiler ces kits sont des multiplex qui permettent l amplification de plusieurs marqueurs STR situ s sur diff rents chromosomes Ils sont utiles dans les profils ADN dans les tests en paternit dans les analyses forensiques et dans l identification de souche de culture cellulaire Liste des principaux STR figurant dans la panoplie des laboratoires Nom usuel El ment Localisation Gamme d all les Pouvoir de R f rence du STR r p titif chromosomique connus discrimination GenBank THO1 TC11 A bp TCAT 11p15 5 3 13 3 92 D00269 VWA 4 bp TCTA 12p13 31 9 25 94 M25858 D21511 4 bp TCTA 21q21 1 24 38 95 AP000433 FGA FIBRA a bp CTT 4q31 3 13 51 2 96 M64982 D18551 4 bp AGAA 18q21 33 7 27 97 L18333 TPOX 4 bp GAAT 2p25 3 6 13 77 M68651 CSFIPO 4 bp TAGA 5q33 1 6 16 89 X14720 D16S539 4 bp GATA 16g24 1 5 15 91 607925 D7S820 4 bp GATA 7421 11 6 15 94 608616 D135317 4 bp TATC 13q31 1 5 15 91 609017 D55818 4 bp AGAT 5q23 2 7 16 88 G08446 D3S1358 4 bp TCTA 3q21 31 9 20 92 NT_005997 D8S1179 4 bp TCTA 8g24 13 5 19 94 G08710 D2S1338 4 bp TGCC 2q35 15 28 96 G08202 D195433 4 bp AAGG 19q12 9 17 2 94 G08036 ACTBP2 SE33 4 bp AAAG 6q15 4 2 37 98 V00481 penta E 5 bp AAAGA 15g26 2 5 24 97 AC027004 pentaD 5 bp AAAGA 21q22 3 2 2 17 94 AP001752 Donn
17. nous sommes initialement en pr sence de 8 cellules Et nous remarquons que nous sommes la limite de d tection car nous commen ons voir effet stochastique C est a dire les pics ne sont plus quilibr s Par cons quent nous sommes bien dans les conditions que nous voulions Nous pouvons voir que le CI r agit comme nous nous l attendions En pr sence d une faible concentration l amplification du CI est diminu e par rapport au test sans inhibition Le CI est donc bien la premi re cible affect e par un d but d inhibition m me avec des quantit s d ADN humain proches de la limite de d tection Page 48 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 7 Septieme essai reproductibilite du controle d inhibition 6 3 7 1 But Nous avons effectu en parall le cinq amplifications du CI avec le kit AmpFISTR SGM Plus Nous voulons savoir si celui ci s amplifie de mani re reproductible et par la m me occasion savoir a partir de quel seuil nous pouvons parler d un d but d inhibition Nous avons un cas de g n tique forensique dans lequel nous devons tudier les STR situ s sur le chromosome Y d une trentaine de personnes Cette recherche s effectue a double et par deux techniciennes C est pourquoi nous avons d cid d ins rer notre CI dans cette analyse et ainsi pouvoir mesurer la reproductibilit de notre CI Pour des raisons d anonymat nous avons enlev les noms des patients et n
18. retrouvons sur les tiquettes des all les en premier le nom de l all le et en dessous la hauteur des pics Le profil que nous devons obtenir pour le controle positif 9947A DNA avec le fluorochrome fluoresc ine FL est le suivant Promega p 50 D3S1358 14 15 THOI 8 9 3 D21S11 30 30 D18S51 15 19 Penta E 12 13 Tous les pics du controle positif 9947A DNA sont bien pr sents Cela signifie que le controle d inhibition CI n interf re pas avec la PCR du kit ce qui est une bonne chose Les pics de I ADN de souris se retrouvent bien l endroit ou ils devraient se trouver C est a dire a environ 480 pb pour les amorces GALT F2 GALT R et a environ 470 pb pour les amorces GALT F GALT R2 Nous retrouvons grosso modo l efficacit de l exp rience pr c dente Nous pouvons constater que les pics suppl mentaires encadr s en rouge ne sont plus pr sents avec autant d intensit dans le profil avec la concentration en amorces 0 1 uM Sauf peut tre le pic se situant environ 118 pb car il se trouve sous le stutter de l all le 14 Par contre nous pouvons constater une diff rence frappante entre la hauteur du pic CI obtenue avec la concentration en amorces de 0 1 uM et le r sultat obtenu avec la plus grande concentration Ceci s explique par la quantit initiale en amorces qui est plus faible pour le premier profil Par cons quent nous avons test de nouveau les amorces GALT F2 GALT R avec diff rentes
19. tique Ce polymorphisme est la cons quence d une accumulation de mutations au cours de l volution Ces s quences pr sentent ainsi un large choix de marqueurs g n tiques qui permettent d tablir des tests d identification redoutablement discriminants Parmi ces marqueurs nomm s selon leur taille on trouve notamment les minisatellites ou VNTR variable number of tandem repeats en fran ais nombre variable de r p titions en tandem et les microsatellites ou STR short tandem repeats en fran ais courtes r p titions en tandem Les VNTR et STR sont des polymorphismes de r p tition compos s de s quences qui se repetent en tandem Ces s quences r p t es mesurent de dix quarante paires de bases pour les VNTR de deux a dix paires de bases pour les STR D un individu l autre la s quence r p t e d un VNTR ou d un STR est identique mais le nombre de r p titions et donc la taille du VNTR ou du STR peuvent tre tres variables Ameziane p 12 et 42 Page 9 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 La mise en vidence du polymorphisme d un STR ou d un VNTR se fait par PCR l aide d amorces qui s hybrident aux s quences non polymorphes flanquantes Le ou les produits d amplification sont ensuite analys s soit sur gel d agarose soit a l aide d un analyseur de fragments d ADN Dubourg Sch ma d un microsatellite ce Chromosome TAAGCCCATGCATGCAGC TTATTA TTATTA TTATTATTATTA CCG
20. 6 Page 53 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 8 4 Analyse des r sultats Les tubes 4 et 6 contr les n gatifs donnent le r sultat attendu pr sence uniquement du pic CI Pour les tubes 1 et 3 le r sultat du CI indique que le profil partiel obtenu est bien caus par la pr sence d inhibiteurs car il est faiblement pr sent ou absent Pour les tubes 2 et 5 il n y a manifestement aucune inhibition car le CI est bien pr sent Donc le profil partiel obtenu est caus par de l ADN d grad En r sum gr ce a notre CI nous pouvons bel et bien d termin si nous sommes en pr sence d ADN d grad ou si le profil partiel obtenu est la cons quence de l inhibition Page 54 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 9 Neuvieme essai insertion du Cl dans l amplification d extraits de cas reels d analyse forensique 6 3 9 1 But Nous avons ins r notre CI dans des cas r els de g n tique dont nous soup onnons qu ils contiennent de l inhibition Nous avons utilis le kit AmpFISTR SGM Plus Par la suite pour les chantillons dont nous n obtenons aucun profil ou dont le pic CI est absent nous tentons une deuxi me amplification en utilisant une plus faible quantit d extrait dans l espoir d abaisser la concentration en inhibiteurs en dessous de la limite produisant encore un effet Nous avons toujours utilis le kit AmpFISTR SGM Plus 6 3 9 2 Methode Amplifi
21. 947A 1 ng ul pour les kits AmpFISTR SGM Plus et AmpFISTR MiniFiler et AmpFISTR Control DNA 007 0 10 ngjul pour le kit AmpFISTR Yfiler 6 3 4 2 Methode Amplification selon les protocoles de chaque kit avec 1 ul de CIMIX 10 par r action et 0 5 ng d ADN contr le positif Pour le kit AmpFISTR SGM Plus c est 1 ul de CIMIX 12 5 qui a t utilis et un suppl ment d ADN de souris a t ajout pour arriver a 1000 copies CIMIX 10 0 25 uM d amorces 10 ul ADN de souris 1000 copies ul 2 5 ul amorce GALT F2 100 uM 2 5 ul amorce GALT R 100 uM 85 ultRNA 100 ng ul Page 36 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 3 4 3 R sultats Profil Control DNA 9947A dans le kit AmpFISTR SGM Plus avec et sans CI Tube SEN Plus CI E D351358 Kei 7 100 200 300 400 500 Di SEM Plus CI EI D351358 Kei Diese ___ Controle Inhibition 100 200 300 400 500 Profil Control DNA 9947A dans le kit AmpFISTR MiniFiler avec et sans CI MINIFILER_F MiniFiler_G 500_CI A D75820 100 200 300 400 500 I 5 1208 5 6287 MINIFILER O Mikle esso C O R DDS Sen Controle Inhibition 100 200 300 400 500 Page 37 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Profil Control DNA 007 dans le kit AmpFISTR YFiler H avec et sans CI Yfler_CI B_DYS456 B_DYS389I B_DYS390 B_DYS399II 100 200 300 400 3000 2000 Y Yfiler_CI
22. ATAGCACGATAGCG ATTCGGGTACGTACGYCG AATAATAATAATAATAATAATAAT GGCTATCGTGCTATCGU s guence flanguante microsatellite TTA s quence flanquante unique gauche 2 unigue droite Figure 3 S quence Il est aujourd hui possible d amplifier simultan ment plusieurs STR ou VNTR en utilisant plusieurs couples d amorces La vari t des produits d amplification obtenus permet d aboutir a des profils qui sont sp cifiques des individus Page 10 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 4 2 3 Avantages et inconvenients de la PCR La PCR est une technique tres sensible qui permet rapidement d obtenir une grande quantite d ADN analysable a partir de quelques copies dADN matriciel contenues dans le pr l vement ou a partir d ADN d grad ce gui est fort utile pour la g n tique forensique Mais cette technique a ses limites qui sont souvent caus es par ses propres avantages Berthe Du fait de sa sensibilit les risques de contaminations sont lev s L origine de ces contaminations sont diverses elles peuvent provenir par exemple d un mauvais pr levement de l chantillon ou par les r actifs qui sont contamin s avec de l ADN Un autre inconvenient de la PCR est l inhibition de l ADN polym rase par des substances contenues dans l chantillon Certaines de ces substances sont connues par exemple l h me l h parine l acide humique les colorants et d autres ne le sont pas par exemple certaines substances contenues
23. aible lorsque nous sommes en pr sence d une faible quantit d h me Par contre les pics du patient sont bien visibles Par cons quent notre CI r agit mieux que ce que nous l esp rions Page 46 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 6 Sixieme essai amplification d une faible concentration d ADN avec une faible inhibition de la Taq Polym rase dans le kit PowerPlex 16 System 6 3 6 1 But Nous nous sommes demand comment r agit notre CI lorsque nous sommes en pr sence d une faible concentration d ADN et d une faible inhibition dans le kit PovverPlex 16 System Nous voulons nous assurer que le CI est bien la premi re cible tre affect e par la pr sence d inhibiteurs m me lorsque la quantit d ADN humain est la limite de d tection 6 3 6 2 Methode Amplification selon le protocole PovverPlex 16 System avec 1 ul de CIMIX 12 5 par r action 0 05 ng d ADN de patient et 0 ou 25 uM d h me chapitre 6 1 5 2 6 3 6 3 R sultats Kit PovverPlex 16 System inhib avec 20 uM d h me PP16_20uM PowerPlex_16_CI D351358 100 200 300 400 a dina Kit PovverPlex 16 System sans inhibition PP16_sans_Hb PowerPlex_16_CI E 100 200 300 400 7000 6000 5000 Page 47 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 6 4 Analyses des r sultats Il faut savoir que dans une cellule nous avons 6 pg d ADN Ici avec 0 05 ng d ADN par r action
24. ant le d tecteur overflow et l apparition de pics art facts a 430 pb 6 3 2 Deuxieme essai diminution des pics supplementaires et insertion du controle d inhibition dans un kit avec un ADN connu 6 3 2 1 But Nous voulons diluer les amorces GALT F2 et GALT R2 pour en diminuer la concentration a 0 1 uM au lieu de 0 5 uM et ainsi diminuer la hauteur des pics suppl mentaires En parall le nous voulons v rifier si le CI ne perturbe pas le bon fonctionnement du kit PovverPlex 16 System en pr sence d un ADN connu pr alablement dilu contr le positif 9947A DNA 10 ng ul du kit 6 3 2 2 Methode Amplification selon le protocole du kit PowerPlex System 16 avec 1 ng d ADN 9947A 100 copies d ADN de souris et une concentration des amorces GALT de 0 1 uM respectivement 0 5 uM Page 31 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 3 2 3 R sultats Amorces GALT F2 GALT R et GALT F GALT R2 0 1 uM F _0 1 C PowerPlex_16_CI A D351358 THI 71 Penta E Cantal 100 200 300 400 500 7000 6000 5000 3000 2000 1000 R2_01 C D351358 100 200 300 400 500 Amorces GALT F2 GALT R et GALT F GALT R2 40 5 uM F2_0 5 C PouerFlex 16 CI A D351358 THI Penta E Controle 100 200 300 400 500 R2_0 5 C PowerPlex_16_CI A D351358 Page 32 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 2 4 Analyse des r sultats Sur notre profil nous
25. antillon 1 30 ul Gold ST R 10x Buffer 1 30 ul PowerPlex 16 10x Primer Pair Mix 0 45 ul AmpliTaq Gold DNA polymerase SU ul Distribuer 5 ul de MM dans chaque tube PCR Ajouter X ul d ADN et 7 5 X ul d H20 Programme PCR Technical manuel PovverPlex System 16 p 10 Le programme utilis pour notre PCR est le suivant PovverPlex 16 System 32 cycles 95 C 11 96 C 1 10x 94 C 30 60 C 30 70 C 45 22x 90 C 30 60 C 30 70 C 45 609C 30 4 C pause Sur Panalyseur de fragments Protocole du laboratoire Pr parer un mix formamide standard interne Pour N chantillons pr parer N x 10 ul Hi Di formamide N x 0 3 ul ILS 600 size standard Ajouter 10 ul de mix formamide standard interne dans les microtubes pour ABI et 1 ul d amplifiat obtenu Page 15 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 1 1 3 Kit AmpFISTR SGM Plus Principe Le kit AmpFISTR SGM Plus permet la coamplification et la d tection de onze marqueurs dix marqueurs STR et l am log nine Ce kit permet l amplification des marqueurs suivants D3S1358 Vwa D165539 D251338 am log nine D8S1179 D21S11 D18551 D19S433 THO et FGA Pour les quatre premiers marqueurs une des deux amorces est coupl e au fluorochrome 5 carboxyfluorescein 5 FAM Pour les marqueurs suivants am log nine DSS1179 D21S11 DISS51 l amorce fluorescente est marqu e au fluor
26. anual AmpFISTR SGM Plus ch 5 2 Le programme utilis pour notre POR est le suivant AmpFISTR SGM Plus 28 cycles 95 C 11 28x 94 C 1 599C 1 72 C 1 609C 45 25 C pause Sur l analyseur de fragments Protocole du laboratoire Pr parer un mix formamide standard interne Pour N chantillons pr parer N x 10 ul Hi Di formamide N x 0 125 ul GeneScan 500 ROX Size Standard Ajouter 10 ul de mix formamide standard interne dans les microtubes pour ABI et 1 ul d amplifiat obtenu Page 17 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 1 1 4 Kit AmpFISTR MiniFiler Principe Le kit AmpFISTR MiniFiler est un kit optimis pour l amplification d chantillons d ADN d grad s et ou inhib s Huit marqueurs autosomaux STR et le marqueur am logenine d terminant le sexe sont amplifi s dans une seule r action PCR Ce kit permet l amplification des marqueurs suivants DI3S317 D7S820 am log nine D251338 D21S11 D16S539 D18S51 CSFIPO et FGA Pour les deux premiers marqueurs une des deux amorces est coupl e au fluorochrome 6 carboxyfluorescein 6 FAM Pour les marqueurs suivants am log nine D2S1338 D21S11 l amorce fluorescente est marqu e au fluorochrome VIC Et pour les marqueurs DI6S539 D18S51 une des deux amorces est coupl e au fluorochrome 2 chloro 5 fluoro 7 8 fused phenyl 1 4 dichloro 6 carboxyfluorescein NED Et pour les deux d
27. ara t Ce qui parfaitement d montr par l extrait FO009 01 P9 dans le premier test nous avons de l addition A incomplete signe d inhibition Dans le deuxi me test nous n avons plus d addition A incomplete donc l inhibition est lev e et le CI est pr sent Il n y a qu un petit d tail qui nous emb te nous trouvons que notre CI est peut tre un peu trop sensible En effet nous craignons que le CI donne des signes d inhibition alors que les marqueurs du kit ne sont eux pas inhib s exemple ci dessus extrait FO0003 04 VA ce qui pourrait nous amener a r aliser des op rations inutiles de purification compl mentaire Page 57 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 7 Conclusion generale Apr s tous ces tests effectu s nous pouvons conclure que notre CI joue parfaitement le role pour lequel il a t cr C est dire il n interf re pas dans le bon fonctionnement des kits il ne r agit pas avec les r actifs des kits Il est facilement g n par des substances inhibitrices ce qui fait de ce controle un bon indicateur d inhibition En effet ceci est bien d montr par la neuvi me exp rience lorsque nous effectuons le premier test avec 4 ul d extrait d chantillon nous n obtenons aucun pic CI Par contre lors de la deuxi me amplification avec une quantit d extrait plus faible nous obtenons un meilleur profil et le pic du CI est pr sent Donc nous supposons qu il y a bel et bien
28. ase html Jaunin P 2004 Cours de biologie mol culaire Polycopi Lausanne ESSant Le Beillan L Clevers S 01 02 2007 Les empreintes g n tiques en m decine l gale Page Web Acc s http Www univ rouen fr ABISS L1 WEB empreinte dnamolecule html National Center for Biotechnology Information 04 02 2009 Mus musculus chromosome 4 genomic contig strain C57BL OJ Page Web Acces http www ncbi nlm nih gov nuccore 1492523 16 report fasta amp log seqview Promega 2007 Technical manual PowerPlex System 16 Page Web Acc s http www promega com tbs TMD012 tmd012 pdf Rozen S Skaletsky H J 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers In Krawetz S Misener S eds Bioinformatics Methods and Protocols Methods in Molecular Biology Humana Press Totowa NJ pp 365 386 Acc s au logiciel http frodo wi mit edu Page 61 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Saiki R Scharf S Faloona F Mullis K B Horn G T et Erlich HA Arnheim N 1985 Enzymatic amplification of beta globin genomic sequencesand restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia y Science 230 4732 1350 4 Wautier M Pas de date Acide d soxyribonucl ique ADN Page Web Acc s http w3 umh ac be chimie docs studs03 04 MWautier page2 htm R f rence des images Figure titre Figure 1 Figure 2
29. ats 1000 copies ADN de souris avec les amorces GALT F2 GALT R et GALT F GALT R2 F2_1000copie PowerPlex_16_CI x E DXS981 D218127T0 DH KGAA DB _ R2_1000copies PewerFlex 16 CI Ki S E DXS981 DI3S631 Pj D21 11 J pasion Gan DI3S634 et 100 200 300 400 500 100 copies ADN de souris avec les amorces GALT F2 GALT R et GALT F GALT R2 F2 100copie PowerPlex_16_CI x E DXS981 Pse Pj pish D21S1270 Mf X GATA DI35634 By 100 200 300 400 500 116 181 206 78 480 25 R2_100copies PowerPlex_16_CI x E DXS981 D135631_ P pish D21S1270 y X CATA DI35634 B _ Page 29 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 10 copies ADN de souris avec les amorces GALT F2 GALT R et GALT F GALT R2 F2_l0copie PowerPlex_16_CI x DXS7424 DX5981 D2181270_ X GATA DI35634 BY 100 200 300 400 500 118 03 206 93 480 32 R2_l0copies PowerPlex_16_CI x DXS7424 DXS981 D138631 P pin p21S81270 D ATA DI35634 B 100 200 300 400 500 3000 2000 1000 118 14 207 19 6 3 1 4 Analyse des resultats Nous obtenons bien des amplifiats pour les amorces GALT F2 GALT R et les amorces GALT F GALT R2 Mais pour les amorces GALT F GALT R2 nous obtenons deux pics alors que nous n attendions qu un seul pic Le premier se situe a 472 pb et le deuxieme a environ 478 pb Le pic a 472 pb peut nous g ner dans la lecture des alleles 23 et 24 du marqueur Penta E dans le kit PovverPlex 16 System
30. biteurs Avec une concentration d h me de 0 5 uM nous n obtenons aucun profil Puis progressivement en diminuant la concentration en h me le profil appara t ainsi que notre CI Nous n obtenons pas la fin du pic du CI pour le test sans inhibition car le tampon de migration devenait trop vieux Du coup la migration devient plus lente et le CI tant de grande taille n est pas compl tement pass devant la fen tre optique Page 42 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 3 5 7 R sultats kit AMpFISTR MiniFiler Kit AmpFISTR MiniFiler inhib avec 200 uM d h me MFI hmiFiler_G 500_CI D D135317 D75820 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 Kit AmpFISTR MiniFiler H inhib avec 80 uM d h me D135317 D75820 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 Kit AmpFISTR MiniFiler sans inhibition ME MniFlle G 500 CI IX EI Centola bes 100 200 300 400 500 4000 3000 2000 1000 Page 43 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 5 8 Analyse des r sultats Dans le manuel d utilisation user guide AmpFISTR MiniFiler ch 5 34 5 36 le kit AmpFISTR MiniFiler a t compar avec les kits suivants AmpFISTR Identifiler et AmpFISTR SGM Plus d Applied Biosystems Les r sultats ressemblent ceux que nous avons obtenus c est dire que le kit AmpFISTR MiniFiler r sist
31. cation selon le protocole du kit AmpFISTR SGM Plus avec 1 ul de CIMIX 12 5 par r action 6 3 9 3 R sultats Premier essai FO911 02_14 SGM Plus CI Ei D3 1358 100 200 300 400 500 600 500 400 300 Deuxi me essai FO911 02_14 SEM Plus CI Ei D351358 100 200 300 400 300 Page 55 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Premier essai F00003 04_VA SCH Plus CI E D351358 WA 7 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 4000 2000 1000 Deuxi me essai F00003 04_VA SEM Plus CI eal I D351358 pra Cid Controle Inhibition 100 200 300 400 500 4000 2000 105 1974 1717 72 Premier essai F00009 01_P9 SEM Plus CI mi D351358 Kei Controle Inhibition 100 200 300 400 500 Page 56 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Deuxi me essai F00009 01_P9 SCH Plus CI Ei D351358 WA Controle Inhibition 100 200 300 400 500 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 Premier essai F00305 03_AM SEM Plus CI a Gil Etgen 100 200 300 400 50C 16 17 19 252 182 130 79 768 Le pic du CI tant pr sent il n a pas t n cessaire de faire une deuxi me amplification utilisant moins d extrait 6 3 9 4 Analyse des r sultats Nous pouvons dire que notre CI fonctionne comme pr vu Lorsqu il y a de l inhibition le CI est absent et lorsque nous diminuons la concentration des inhibiteurs il app
32. d agectcecag age cacctgE alactgtccgg tcccgadcag gggatctcag ageCcogccact Catleaagcccer ECACECECCO cgaqotacac acca EUgacatca dqtatagacte cotacggace EGUGCCUGEO aggttactia tStglaates cocattaceg taaltcctbcag EE EE EN daccactage aagttccoacgg atcadgacte tagtcrttgas Sc ce OC CE cotcagtarct EgattgoLLC Lattgagce ataaaactgc Etacatteccg Ltgaaaadtt al CeCaCcatc JceagJaccta LOCCECCCCa agtatetgac acatgraa agg tetgctcast qttcactace attLaggagg ctgtttaaaa Rp GALT R2 Pinsiad GALT F2 Page 65 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Annexe 2 SCH Plus CI es ontrole Inhibition 100 200 300 400 500 1000 300 300 700 600 500 300 200 100 CI ze Pas CI L RSA Controle Inhibition 100 200 300 400 500 1000 300 800 700 600 500 300 200 100 CI SEN Plus CI i D351358 BWA DI65539 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 1000 300 300 700 600 500 CI SGM_Phus_C1 i Controle Inhibition 100 200 300 400 500 300 800 700 600 500 CI 4000 300 800 700 600 500 400 300 200 100 0 FA Page 66 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Annexe 3 Premiere technicienne RVers A SHA Leas ee 100 Aa 300 400 EA i i E ES Es Fi MAA KA EK laa 100 un xm am am E FA A a S CAR O Gna I BO E U Page 67 sur 79 Travail de diplome No
33. dans l urine ou dans le liquide c phalorachidien Ameziane p 239 Il existe diff rentes techniques pour diminuer voir faire dispara tre l inhibition Il est possible de diluer l chantillon avec de l eau st rile Cela permettra de diminuer la concentration des substances inhibitrices et donc augmenter les chances qu il y ait moins d inactivation de l ADN polym rase Une autre technique consister effectuer une purification compl mentaire de l extrait d ADN car 1l peut tre contamin par des prot ines ou des substances restantes lors de l extraction par exemple l alcool Une autre possibilit serait de changer d ADN polym rase car certaines polym rases sont plus r sistantes aux inhibiteurs que d autres C est le cas pour la Tth ADN polym rase et la Tfl ADN polym rase Une autre m thode consiste rajouter un leurre sur lequel les substances inhibitrices se fixeront par exemple l albumine du s rum bovin BSA _ Et la derni re m thode est d augmenter la quantit de l ADN polym rase Les techniques cit es ci dessus sont utiles lorsque nous suspectons que l absence de r sultat soit due l inhibition Mais elles ne servent rien si l absence de r sultat est due l absence d ADN dans l extrait Une des m thodes pour savoir s il y a de l ADN dans l extrait c est de le quantifier soit en utilisant la spectrom trie 260 nm soit en faisant une PCR en temps r el soit en utilisan
34. des TESUIALS dd 38 6 3 5 Cinqui me essai inhibition de la Tag Polym rase dans les diff rents kits AVEC de NET 39 e E MM gt E 39 0 52 MENGE ne 1 39 6 3 5 3 R sultats kit PowerPlex 16 System 40 639 Analyse des 1CSullaiS iio liinda 4 6 3 5 5 R sultats kit AMpFISTR SGM Plus III LI IH dje 03300 Amalyse des EE 42 6 3 5 7 R sultats kit AmpFISTR Minier de AE SAA o A A 44 6 3 5 9 R sultats kit AMpFISTR YFiler Me 45 6 10 Analyse TE 46 6 3 6 Sixieme essai amplification d une faible concentration d ADN avec une faible inhibition de la Taq Polym rase dans le kit PowerPlex 16 System 47 OO BU SR A en in nn 47 OZ deiere De session ee 47 A SIS EE 47 65 04 Analyses des T SUI AS ae eee oe eee 48 6 3 7 Septi me essai reproductibilit du contr le d inhibition sese eee 49 i YN NN 49 AE e ee 49 O 7 5 M SUA ni 49 0 4 Analyse des TESIS on 51 6 3 8 Huiti me essai utilisation du CI dans l amplification d extraits de MATT INC dd 52 Oro H gt 1 D a ee 52 63 82 Methode internat dec ttes eee ete O ee eee rene 52 e e de dei OU 52 6 8 4 Analyse EE 54 6 3 9 Neuvi me essai insertion du CI dans l amplification d extraits de cas reed analyse FORCES I GUC ER rr nn 55 Gl BUS ds 55 Ce COS EE 55 G59 A de die dem 55 GAO 4 Anahe CS TSU AUG ne 57 T SC ONCIMISIONZC E M AAA US en RL DDO RA E O DD RD a
35. e remarquablement bien la pr sence d inhibiteurs Avec le kit AmpFISTR MiniFiler malgr la diminution de la hauteur des pics en fonction de la concentration en heme nous obtenons un bon profil pour notre patient Par contre notre CI joue correctement son role Il est totalement absent avec une concentration de 200 uM et de 80 uM Il est facile de remarquer que ce kit est difficilement inhib Nous aurions pu augmenter la concentration en heme en faisant une dilution du sang du patient plus faible mais cela ne nous int resse pas car nous savons d ores et d ja que ce kit poss de une meilleure r sistance aux inhibiteurs Page 44 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 3 5 9 R sultats kit AmpFISTR YFiler Kit AmpFISTR YFiler inhib avec 80 uM d h me Y Filer_60uM Yfie I li IN B DYS456 B DYS389I B DYS390 B DYS389II Controle Inhibition 100 200 300 400 300 8000 7000 6000 3000 4000 3000 2000 1000 Kit AmpFISTR YFiler inhib avec 0 5 uM d h me Y Yfiler_CI a Controle Inhibition 100 200 300 400 500 Kit AmpFISTR YFiler sans inhibition Y Yfiler_CI A Controle Inhibition 100 200 300 400 500 Page 45 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 5 10 Analyse des r sultats Tout comme le kit AmpFISTR SGM Plus le kit AmpFISTR YFiler est tr s sensible aux substances inhibitrices Nous remarquons que le pic du CI est tr s f
36. e un allele ici all le 13 alors que cela n en est pas un Certes pour une personne ayant de l exp rience nous pouvons ais ment diff rencier un pic d un all le et un pic art fact grace la forme de celui ci La pointe du pic art fact a une forme plus arrondie par contre le vrai pic se termine en pointe plus fine Malgr une concentration plus faible en amorces dans la premi re fen tre nous n avons constat qu une faible diminution de la hauteur des pics suppl mentaires Cependant amplification du CI est quasiment identique avec les deux concentrations Par cons quent nous avons d cid de garder la concentration des amorces a 0 25 uM Page 35 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 4 Quatri me essai Essai du melange pr t a Femploi CIMIX avec diff rents kits 6 3 4 1 But Premi rement nous avons pr par un m lange d ADN de souris et d amorces CIMIX 10 similaire au m lange CIMIX 12 5 utilis au chapitre 6 3 3 mais adapt pour les kits travaillant avec un volume r actionnel de 10 ul c est dire les kits AmpFISTR MiniFiler AmpFISTR Yfiler Ensuite nous avons ins r le m lange CIMIX 12 5 ou CIMIX 10 selon le volume final de la PCR dans les kits suivants AmpFISTR SGM Plus AmpFISTR MiniFiler 4 AmpFISTR Yfiler pour v rifier si notre CI n alt re pas la qualit des r sultats de ces kits avec deux controles positifs Control DNA 9
37. effet les g nomes d organismes eucaryotes comportent la diff rence des procaryotes des s quences codantes et des s quences non codantes Les s quences codantes correspondent aux g nes et sont donc traduites en prot ines Les s quences non codantes qui ne sont donc pas traduites repr sentent une large proportion de l ADN g nomique des eucaryotes Jaunin p 46 Les seguences codantes 10 1590 du g nome sont tr s homologues chez les individus d une m me esp ce Le Beillan De la mol cule l empreinte g n tique En effet l esp ce est caract ris e par des caract res communs qui sont garantis par ses g nes Les differences ph notypiques entre les individus qui la composent reposent sur les variations all liques et les differents alleles d un m me g ne montrent des differences de s quence qui sont infimes D une esp ce a l autre en fonction de la distance phylog n tique qui les s pare les s quences des g nes qui codent pour la m me fonction pr sentent des homologies tr s fortes d autant plus fortes que la fonction du g ne est essentielle l embryog n se ou au m tabolisme Par cons quence les s quences codantes pr sentent peu d int r t en mati re d identification Ameziane p 12 et 42 Par contre les s quences non codantes 85 90 du g nome sont tr s polymorphes entre esp ces comme entre individus d une m me esp ce Le Beillan De la mol cule l empreinte g n
38. erniers marqueurs l amorce marqu e est coupl e au fluorochrome PET user guide AmpFISTR MiniFiler ch 1 2 1 4 Sch ma des tailles des alleles possibles AmpF STR MiniFiler 6 gs 77177 17Vv1709T1T7277T7 F 7 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp GS500 internal lane standard Figure 8 Composition user guide AmpFISTR MiniFiler ch 1 9 AmpFISTR MiniFiler Primer Set AmpFISTR MiniFiler Master Mix AmpFISTR MiniFiler Y Allelic Ladder AmpFISTR Control DNA 007 0 10 ng ul Mat riels indispensables mais non fournis par le kit GeneScan 500 LIZ Size Standard Kit DS 33 Matrix Standard Kit Dye Set G5 Page 18 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 MasterMix POR Selon l user guide du kit AmpFISTR MiniFiler ch 2 7 le volume final de MasterMix est de 15 ul Nous avons juste diminu le volume de MasterMix 6 ul tout en gardant les proportions des r actifs MasterMix MM PCR pour un chantillon 4 ul AmpFISTR MiniFiler Master Mix 2 ul AmpFISTR MiniFiler Primer Set Distribuer 6 ul de MM dans chaque tube PCR Ajouter X ul d A DN et 4 X ul d H20 Programme PCR user guide AmpFISTR MiniFiler ch 2 9 Le programme PCR utilis pour notre PCR est le suivant AmpFISTR MiniFiler 25 ou 30 cycles 95 C 11 25x ou 30x 94 C 20 59 C 2 72 C 1 609C 45 4 C pause Sur Panalyseur de f
39. es kits JetQuick Blood Spin Kit de Genomed ou DNA IQ System de Promega cat DC6700 ou par la m thode ph nol chloroforme Ensuite nous utilisons les kits PowerPlex 16 System AmpFISTR SGM Plus AmpFISTR MiniFiler ou AmpFISTR Yfiler pour amplifier les marqueurs qui nous int ressent Lorsque le MasterMix est pr t nous rajoutons lul du CIMIX 10 ou du CIMIX 12 5 selon le volume final de la PCR Le CIMIX 10 et le CIMIX 12 5 sont des m langes pr ts a l emploi contenant ADN de souris et la paire d amorces permettant d amplifier la s quence servant de contr le d inhibition pour un volume final PCR de 10 ul et de 12 5 ul Sch ma de la m thode finale EXTRACTION DE L ECHANTILLON PREPARATION DU MASTERMIX SELON LES KITS AJOUT DU CIMIX 10 OU 12 5 AJOUT DE LA QUANTIT AD QUATE D EXTRAIT AMPLIFICATION PAR PCR MIGRATION PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE ain EX DE PROFIL SANS LAMPLIFIAT CI EX DE PROFIL AVEC LAMPLIFIAT CI Hauteur Hauteur des pics des pics Marqueur Marqueur Cc Taille en Marqueur 1 pb Marqueur Marqueur Marqueur E Taille en 1 2 3 pb RESULTAT INHIBITION RESULTAT PAS D INHIBITION Utiliser des techniques ad quates pour bloauer les inhibiteurs ou s en d barrasser OK on peut rendre le r sultat 1l n y a pas d A DN exploitable dans extrait Page 27 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 Essais r al
40. es quatre bases tout au long de la e mol cule d ADN constitue l information mmm g n tique propre a chaque tre vivant Wautier m AS La structure de 1 ADN en un double brin h lico dal est caus e par l appariement des bases S AT deux ponts hydrog ne et CG trois ponts sa Se hydrog ne Il est important de signaler que les deux brins d ADN sont toujours li s entre eux Figure 1 Structure de l ADN dans une position antiparall le Jaunin p 5 Page 5 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 4 2 La Polymerase Chain Reaction PCR La PCR fut d crite pour la premiere fois par Kary Mullis en 1985 Saiki Son principe repose sur l utilisation de ADN polym rase par exemple la Taq polym rase Il s agit en fait d une r plication in vitro de s quences sp cifiques d ADN Cette m thode permet de produire une tr s grande quantit d ADN cible partir d un extrait d ADN ADN matriciel L ADN extrait partir d un organisme ou un chantillon contenant des ADN d origines diverses n est pas directement analysable En effet si nous nous int ressons une s quence cible pr cise celle ci n est pas visible au milieu des milliers d autres s quences ADN de l extrait lorsque nous utilisons une technique simple comme une lectrophor se partir d une telle masse la PCR peut s lectionner gr ce des amorces une ou plusieurs s quences d termin es qu il s a
41. gisse de la s quence d un g ne ou de s quences non codantes et les amplifier par r plication des dizaines de milliards de copies La r action termin e la quantit extr mement faible d ADN matriciel contenue dans l chantillon PCR n aura pas vari En revanche la quantit de la ou des s quences amplifi es ADN cible sera tr s grande Jaunin p 73 Les applications de la PCR sont multiples C est une technique d sormais incontournable en biologie cellulaire et mol culaire Elle est largement utilis e des fins de diagnostic pour d tecter la pr sence d une s quence d ADN sp cifique de tel ou tel organisme dans un fluide biologique ou pour d tecter des mutations g nomiques ou chromosomiques comme la mucoviscidose ou une trisomie lors d un d pistage pr natal par exemple Elle est aussi employ e pour r aliser des profils g n tiques qu il s agisse de l identification g n tique d une personne dans le cadre d une enqu te judiciaire de paternit ou de l identification de vari t s animales v g tales ou microbiennes destin e des tests de qualit alimentaire de diagnostic ou de s lection vari tale La PCR est encore indispensable la r alisation d un s quen age Enfin 1l existe des variantes de la PCR real time PCR PCR comp titive RT PCR Dubourg Page 6 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 4 2 1 But et principe de la PCR La PCR permet donc d obteni
42. ion cause d un exc s d ADN initial ou par inhibition nous obtenons aussi un fragment plus petit d une paire de base Le r sultat obtenu sur le graphique de l analyseur de fragments est la pr sence Page 7 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 de deux pics s par s par une seule paire de base Ce ph nom ne porte le nom d addition A incomplete Voici un sch ma expliquant les diff rentes tapes de la PCR i Quantt infime d ADN d un chantillon de sang a S quence cible a amplifier BEE EES EE EE ED PS 3 j 2 d naturation de l ADN 4 94 C i 3 pr paration de deux sondes nucl otidiques compl mentaires des extr mit s de la s quence cibl d 4 ajout des sondes en exces 50 60 C hybridation 5 synth se des brins partir e mmm mm mm mm mmn 6 I sondes hybrid ss servant d amorces primers 60 70 C extension AAA 6 d naturation des duplex dNTP n oform s 95 C puis retour 60 C Taq polym rase Reprise de la pohim risation du fat de l exc s d amorces Repetition de cycles de synthesedenaturation r alize une augmentation exponentielle de la quantt initiale d ADN a chaque cycle le nombre d exemplaires de la s quence encod e par les deux amomes double M Figure 2 4 2 1 4 La d tection Le produit d une PCR est constitu d un ou de plusieurs fragments d ADN la ou les s quences d int r t La d tection et l
43. ion est assur e par une mesure en UV ou bien par fluorescence apres excitation par laser ou par lampe halogene Ameziane p 167 Il faut prendre en compte que l analyse des STR en multiplex ne peut se faire gu avec l aide de l informatique En effet les fluorochromes utilis s pour la multiplex ne sont pas diff renciables a l il nu et leur spectre d mission se chevauchent figure 4 Seuls des logiciels adapt s sont capables de r colter les donn es distinguer les couleurs reconnaitre les pics d terminer la taille des amplifiats et identifier les alleles pour ainsi obtenir un r sultat final sous la forme d une s rie de graphiques de pics d tect s p ex GeneMapper Coquoz p 100 102 Page 22 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 A vril 2009 Conditions d analyse d lectrophor se pour chaque kit Protocole du laboratoire Module Manager PowerPlex AmpFISTR AmpFISTR AmpFISTR pour kit System 16 SGM Plus MiniFiler YFiler HIDIFragmentAn HIDIFragmentAn HIDIFragmentAn HIDIFragmentAn alysis36 POP4 alysis36 POP4 alysis36 POP4 alysis36 POP4 Ee Poly Fill Vol Fill Vol 4840 4840 ago 4840 ae Injection Time Time 12 Voltage Numbers 40 40 40 40 of Steps Voltage Step 15 15 15 15 Interval Time 1750 1500 1320 1500 Template Il est noter que chaque kit poss de ses propres param tres d crits ci dessus d lectrophor se capillaire sur l appareil Il est n cessaire de
44. is s 6 3 1 Premier essai amplification et choix de la concentration optimale de l ADN de souris 6 3 1 1 But Pour commencer nous voulons tester les amorces pour v rifier si nous obtenons un amplifiat en choisissant un programme PCR qui va donner le plus de chance aux amorces de s amplifier programme ayant la temp rature d hybridation la plus basse En parall le nous testons diff rentes concentrations d ADN de souris pour obtenir la concentration optimale Cette concentration doit nous permettre de voir un pic d une taille entre 500 et 5000 rfu 6 3 1 2 M thode Calcul du PCR mix pour v rifier la qualit de l amplification des amorces Condition Amorces seules volume final vs 25 ul Gold ST R 10x Buffer Buffer lx gt 25ul Kit PovverPlex System 16 MgCl 25mM MgCl 1 5mM gt 1 5 UU dNTP 25 mM dNTP 0 2mM O2ul Amorces 100 uM Amorces 0 5 uM 0 125 ul AmpliTaq Gold 5U ul _ AmpliTag 2U gt O04ul 4 725 ul de Mix Nous allons faire plusieurs PCR avec diff rentes quantit s d ADN pour trouver la quantit optimale a tube n 1 1 ul d ADN 10 copies ul 10 copies initiales b tube n 2 1 ul d ADN 100copies ul 100 copies initiales c tube n 3 10 ul d ADN 1000copies ul 1000 copies initiales Choix pour tester le controle inhibition seul Programme MiniFiler 30 cycles Page 28 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 3 1 3 R sult
45. it raisonnablement bonne de l amplification du CI Imaginons une s rie similaire d amplification de divers extraits Si l un de ces amplifiats fournissait un pic de hauteur 100 pour le CI ce serait un bon indice d une l g re inhibition Si le profil ADN obtenu tait un profil partiel cela justifierait des tentatives d optimalisation du profil Il ne faut pas oublier que pour le test b nous sommes en pr sence de vrais patients Par cons quent il est possible qu il y ait de l inhibition dans certains chantillons et donc une mauvaise amplification correspondante du CI C est une des possibilit s qui peut nous faire obtenir une si grande diff rence entre les CI des patients Il est a noter que la hauteur des pics des CI est relativement basse pour le test b car le nombre de cycles PCR effectu s est de 26 au lieu de 30 Nous effectuons moins de cycles avec un extrait obtenu avec la technique d extraction DNA IQ System car le rendement est meilleur avec cette extraction Malgr ce d tail nous observons n anmoins l aussi une reproductibilit raisonnablement bonne de l amplification du CI Page 51 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 8 Huiti me essai utilisation du Cl dans Pamplification d extraits de materiel fixe 6 3 8 1 But Nous avons cherch des chantillons dont le mat riel a t fix au formol car souvent nous obtenons un profil partiel Nous pensons qu en rajoutant no
46. itation Ce sont des substances compos es de plusieurs noyaux aromatiques conjugu s ou encore des mol cules planes et cycliques qui poss dent une ou plusieurs liaisons pi G nome est compos de g ne d fini comme un enchainement de nucl otides c est a dire une portion d ADN destin tre transcrite en ARNm et ensuite tre traduite en prot ine permettant ainsi de remplir les fonctions n cessaires la vie de l organisme et d une autre portion d ADN qui ne code pour rien Locus est une position sur l ADN d un chromosome Mini satellites ou VNTR Variable Numbers of Tandem Repeats correspondent a des s quences r p t es en tandem appel es cores de 10 a 40 paires de bases Le nombre de ces r p titions est variable d un individu l autre constituant une s rie d all les Ces all les se transmettent selon le mode mend lien l enfant re oit un allele de son p re et un all le de sa m re Page 63 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Micro satellites ou STR Short Tandem Repeats unit s r p titives dont le core est tr s court 4 paires de bases en moyenne et r p t de deux a dix fois au plus Des centaines de micro satellites ont t tudi s mais pour la pratique des empreintes g n tiques on ne retient que ceux qui sont ais ment amplifiables avec une expression simple des alleles et pr sentant un fort taux d h t rozygotie Multiplex est une PCR destin e
47. ivit exonucl asique ce qui rend donc impossible la correction d erreur lors de copie Page 64 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 12 Annexes Annexe 1 Nucl otides 10155061 10155121 10155181 10155241 10155301 10155361 10155421 10155481 10155541 10155601 10155661 10155721 10155781 10155841 10155901 10155961 10156021 10156081 10156141 10156201 10156261 10156321 aactgtecad cgcatgggtg atetdactacot deatacclgag ggttagctta ggggaggggc tCELCEECLE gJLcaggJgJgJoLt dgctccacgc Gi trtgactatrga caEgoLEJOc aca ce gg ee hehehe cetgaadade ctcataaaaa ecctaoargac tecagotata tcctgaggece agaecgocLc EXCOUCCCCELE atadgecaca aacg Bacc Gacagacccrg gteotcacatt Ertadccatrgt dgagtttgggt daaggctaag tggtgcaaga OOG attagcaget acatradgat geetetgaaa ecgadgccatr ggacactgag gcaggaggat ctggLacaae ggacctgLga SCCEOCOLUS Ggocctcact GLCECOC I O OE ECLCACOLL ctgggactga SCTCCCT e Lett tagactgaag ecccacgagat eccccactte Seqgcccagc egttcacecte eee deal ctgaactaat ggLacaatrtte gQaaagattaa gcagecat eg ggacctggag Ectetaaceas EGUgacetcca ccaagcoaga ET OT Ae ser getaGalete tgcaaattca aataggtcag atagagaaga gtgatatgga gagaagagag gQaaaatacct gctgacaaag taaagJacLgg LJcgeEcogoc GI GTO Cac E EE GOT SOS C O CLL OOO CC Caggtgaccc JOC egctetce GETO TELO E OT TET GT cagaggagta aecacc ct capgatggbg agJgccagLgu atgttacagg aggct ag tggtagagtg aaa Ceca tagcatgcta atttgatgac ggagctota
48. lification selon le protocole du kit AmpFISTR SGM Plus avec 1 ul de CIMIX 12 5 par r action Ceci fournit 100 copies d ADN de souris et une concentration des amorces de 0 25 uM respectivement 0 5 uM suivant le CIMIX utilis CIMIX 12 5 0 25 uM d amorces CIMIX 12 5 0 5 uM d amorces 2 6 ul tRNA 100 ng ul 12 4 ul tRNA 100 ng ul 3 2 ul amorce GALT F2 1 uM 1 ul amorce GALT F2 10 uM 3 2 ul amorce GALT R 1 uM I ul amorce GALT R 10 uM 1 ul ADN souris 1000 copies ul 1 6 ul ADN souris 1000 copies ul Page 34 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 3 3 Resultats Amorces GALT F2 GALT R a 0 25 uM Tubal SEM Plus CI a D351358 WA 5_ 100 200 300 400 500 Amorces GALT F2 GALT R a 0 5 uM Tube SCH Plus CI Wi D351358 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 6 3 3 4 Analyse des resultats L amplification s est correctement d roul e pour les deux tests Certes la hauteur de notre CI est plus petite que sur le premier essai Mais il faut tenir compte que dans le premier essai nous avons effectu une PCR de 32 cycles tandis que pour le kit AmpFISTR SGM Plus nous effectuons une PCR de 28 cycles Par cons quent nous avons 2 c est a dire 16 fois moins d ADN en supposant bien s r que l amplification s est d roul e de mani re exponentielle Sur la deuxi me fen tre nous obtenons justement ce que nous voulons viter C est dire que le pic suppl mentaire soit nomm comm
49. ngs brins d ADN matriciel Plus la temp rature d hybridation est lev e plus l hybridation est s lective et plus elle est sp cifique 4 2 1 3 L elongation ou l extension La troisi me tape s effectue une temp rature de 72 C dite temp rature d elongation C est a 72 C que se situe l optimum d efficacite de la Taq polymerase laquelle catalyse la r plication en utilisant les dNTPs pr sents dans le m lange r actionnel Les r gions de I ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi s lectivement synth tis es Au cycle suivant les fragments synth tis s au cycle pr c dent servent a leur tour de matrice et au bout de quelques cycles l esp ce pr dominante correspond a la s quence d ADN comprise entre les r gions ou les amorces s hybrident Il faut compter 20 a 40 cycles pour synth tiser une quantit analysable dADN environ 0 1 microgramme Chaque cycle voit th oriquement doubler la quantit d ADN pr sente au cours du cycle pr c dent A la fin des cycles il est recommand de rajouter un cycle final d longation a 60 C Ce cycle est utile pour que l ADN polymerase puisse terminer son longation Il faut savoir que la Taq polym rase tend ajouter un nucl otide Adenosine a l extr mit 3 de la s quence amplifi e malgr l absence de nucl otide en vis vis sur le brin mod le Lorsque l ADN polym rase ne r ussit pas rajouter ce nucl otide sur tous les brins en construct
50. ochrome 6 carboxy 4 5 dichloro 2 7 dimethoxyfluorescein 6 JOE Et pour les trois derniers marqueurs une des deux amorces est coupl e au fluorochrome 2 chloro 5 fluoro 7 8 fused phenyl 1 4 dichloro 6 carboxyfluorescein NED user s manual AmpFISTR SGM Plus ch 1 5 1 9 Sch ma des tailles des alleles possibles AmpF STR SGM Plus 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp G 500 internal lane standard Figure 7 Composition user s manual AmpFISTR SGM Plus ch 1 10 AmpFISTR PCR Reaction Mix AmpFISTR SGM Plus Primer Set AmpFISTR Control DNA 007 0 10ng ul AmpFISTR SGM Plus Allelic Ladder Mat riels indispensables mais non fournis par le kit GeneScan 500 ROX Size Standard Kit Matrix Standard Set DS 32 5 FAMTM JOE NEDTM ROX dyes for use with 3100 and 3100 Avant systems Page 16 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 MasterMix PCR Selon le manuel d utilisation du kit AmpFISTR SGM Plus Ich 5 3 le volume final de MasterMix est de 30 ul Nous avons juste diminu le volume de MasterMix 12 5 ul tout en gardant les proportions des r actifs MasterMix MM PCR pour un chantillon 5 25 ul AmpFISTR PCR Reaction Mix 2 75 ul AmpFISTR SGM Plus Primer Set 0 125 ul AmpliTaq Gold DNA polymerase SU ul Distribuer 7 5 ul de MM dans chaque tube PCR Ajouter X ul d ADN et 5 X ul d H20 Programme POR user s m
51. on pr cise All les sont les diff rentes versions d un m me g ne Chaque all le se diff rencie par une ou plusieurs diff rences de la s quence de nucl otides Ces diff rences apparaissent par mutation au cours de l histoire de l esp ce ou par recombinaison g n tique Tous les all les d un g ne occupent le m me locus emplacement sur un m me chromosome Amorces sont des courtes s quences monocat naires d ADN compl mentaires de r gions qui flanguent I ADN amplifier Amplifiat est le m lange r actionnel de la PCR une fois que le processus d amplification est termin Klectrophor se est utilis e en biochimie ou biologie mol culaire pour la s paration des prot ines ou celle des acides nucl iques Dans un milieu donn la s paration des particules se fait en fonction de leur charge Q et pour des Q identiques en fonction de leur taille La technique de l lectrophor se est fond e sur le d placement d ions mol cules ayant perdu leur neutralit lectrique sous l effet d un champ lectrique Du fait de leurs caract ristiques propres et en fonction des conditions de l lectrophor se ces ions auront des vitesses de migration diff rentes 1ls vont donc se s parer les uns des autres Les mol cules anioniques migrent vers l anode et les mol cules cationiques se d placent vers la cathode Fluorochrome est une substance chimique capable d mettre de la lumi re de fluorescence apr s exc
52. orensique Il est vrai que la pratique tait tr s int ressante bien qu elle pr sentait un aspect relativement r p titif Le probl me majeur rencontr dans ce travail de dipl me a t de retrouver des chantillons pr sentant de l inhibition En effet le laboratoire ayant d m nag et ayant r cemment ouvert il a t difficile d obtenir beaucoup d chantillons Cependant je garde un excellent souvenir de ce travail dipl me cette exp rience m a permise de me faire comprendre que nous ne pouvons pas tout savoir d s le d part mais que les id es se rajoutent au fur et mesure que nous avancons dans le travail Et que nous ne pouvons pas effectuer le travail tout seul mais qu il faut un dialogue entre les diff rents membres de l quipe pour am liorer les id es et pouvoir ainsi avancer Page 59 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 9 Remerciements Un grand merci tout le personnel d Aurigen et plus particuli rement l quipe de g n tique m dicale et de cytog n tique pour m avoir aussi bien accueillie et soutenue tout au long de mon stage Je tiens a remercier tout particulitrement le Dr Rapha l Coquoz pour sa patience et pour son soutien th orique tout au long de ce travail de diplome Sans oublier Nathalie Roussy qui a fait preuve de gentillesse et de disponibilit et qui m a beaucoup aid e Page 60 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 10 Bibliog
53. otalement inhib e avec une concentration de 200 uM d h me Il n y a aucun profil pour le patient ni aucun pic pour notre CI Par contre les pics de colorants sont toujours pr sents encadr s en rouge Malgr la pr sence de beaux pics pour l extrait d ADN du patient avec une concentration de 40 uM nous constatons que notre CI est absent Ceci nous d montre que notre CI est particuli rement sensible a l inhibition et que pour l instant notre CI r agit comme nous le souhaitions Maintenant il nous reste a savoir s il en va de m me pour les kits restants 6 3 5 5 R sultats kit AmpFISTR SGM Plus Kit AmpFISTR SGM Plus inhib avec 0 5 uM d h me 0 Sunt SCH Plus CI bi D351358 RASAT Controle Inhibition 100 200 300 400 3000 2000 1000 Kit AmpFISTR SGM Plus inhib avec 0 4 uM d h me DA SCH Plus CI a D351358 Controle Inhibition 100 200 300 400 Page 41 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 Kit AmpFISTR SGM Plus inhib avec 0 3 uM d h me SEN Plus CI E D351358 Kei I 100 200 300 400 500 Kit AmpFISTR SGM Plus sans inhibition SEM SEM Plus CI E D351358 A 100 200 300 400 500 6 3 5 6 Analyse des r sultats Avec cet essai nous avons fait une concentration progressive en Hb Car il a t difficile de d terminer la concentration qui nous permet d avoir un profil partiel Nous constatons que ce kit est extr mement sensible aux inhi
54. other techniques in the laboratory After numerous tests results are very satisfactory According to various performed tests The control of inhibition does not interfere with the performance of the kits It does not appear on the profile when there is an inhibitory substance in the PCR Even when the DNA targeted by the kit is at the lower limit of detection the control of inhibition is the first target to be affected by the weakest quantity of inhibitor still having an effect It 1s reproducible It helps to differentiate between a partial profile caused by DNA degradation and a partial profile caused by PCR inhibition At the end the control of inhibition was tested in real cases and it reacts as expected The keywords are underlined Page 2 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 3 Table des matieres Nee e E te erento OT de 1 2 A A GYN YD FO 2 2 gt Ke En EE 3 A _ A SN A Ra 5 4 1 LAcid DESOXYTIDONUCICIQUEG A a 5 4 2 La Polymerase Chaim Reaction PER EEN 6 4 2 1 Bubet pnneipeuc Ia POR is 7 AZOT atlssradsbaasudedubgicaesteteastet 7 2 12 GN ee anion EE 7 A23 E loncaHonou I eXtension nn Fd naine 7 A E e FFRI HN ANT 8 A 2 2 Applicanons d la PER Ga en 9 4 2 3 Avantages et inconv nients de la PCR rn ll Oe Ul apie io aah Y GY A O OO 12 6 Developpe MEN EE 12 6 1 As EE 12 6 1 1 K I ead Gada aa alesse ee De 12 6 1 1 1 Domaine d application et principe des Kit
55. ous les avons remplac s par des lettres 6 3 7 2 M thode Pour la partie a nous avons effectu une amplification selon le protocole AmpFISTR SGM Plus avec seulement 1 ul de CIMIX 12 5 par r action Pour la partie b nous avons effectu une amplification selon le protocole AmpFISTR vier H 26 cycles partir d un extrait effectu selon la technique d extraction DNA IO System de Promega avec lul de CIMIX 10 par r action 6 3 7 3 Resultats a Nous pouvons voir les profils en annexe 2 Hauteur des pios TOR a pos Moyemne 626 Ecart type 126 Coefficient de variation 20 Page 49 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 b Nous pouvons voir les profils en annexe 3 Tubes technicienne 1 Hauteur des pics Tubes technicienne 2 Hauteur des pics 260 BL YB O BL 106 DI DL ss EL 0133 EL 122 DL 169 Hl 190 LI 2901 LL dl 183 LL 172 ML 153 NL 109 D 28 E PL 2881 LP a pp te a Ro AC PR 203 208 Moyemne 149 Moyemne 141 Ecart type 49 Ecart type 41 Coefficient de Coefficient de variation 32 variation 29 Remarque les chiffres marqu s en rouge ne sont pas pris en consid ration car ils ont t analys s sur le capillaire n 3 de notre analyseur de fragments et nous avons eu un petit souci avec ce capillaire Page 50 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 3 7 4 Analyse des r sultats L essai a indique une reproductibil
56. r par r plication in vitro de multiples copies d un fragment d ADN partir d un extrait La PCR est une r action de polymerisation en chaine r alis e dans un melange r actionnel qui comprend l extrait d ADN ADN matriciel la Taq polymerase les amorces et les quatre d soxyriboNucl osides TriPhosphates dNTP en exces dans une solution tampon Les tubes contenant le m lange r actionnel sont soumis des cycles de temp rature r it r s plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d un thermocycleur Cet appareil permet la programmation de la dur e et de la succession des cycles de paliers de temp rature Chaque cycle comprend les trois tapes suivantes allant de quelques dizaines de secondes a quelques minutes Ameziane p 232 235 4 2 1 1 La denaturation La premi re tape s effectue une temp rature de 94 C dite temp rature de d naturation A cette temperature I ADN matriciel gui sert de matrice au cours de la r plication est denature les ADN double brin se s parent en ADN simple brin ADN monocat naires 4 2 1 2 L hybridation La deuxi me tape s effectue a une temp rature g n ralement comprise entre 50 et 65 C dite temp rature d hybridation des amorces La diminution de la temp rature permet aux liaisons hydrog ne de se reformer et donc aux brins complementaires de s hybrider Les amorces tant de courtes s quences compl mentaires s hybrident plus facilement que les lo
57. ragments Protocole du laboratoire Pr parer un mix formamide standard interne Pour N chantillons pr parer N x 10 ul Hi Di formamide Nx 0 15 ul GeneScan M 500 LIZ Size Standard Ajouter 10 ul de mix formamidej standard interne dans les microtubes pour ABI et 1 ul d amplifiat obtenu Page 19 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 6 1 1 5 Kit AmpFISTR Yfiler Principe Le kit AmpFISTR Yfiler permet la coamplification et la d tection de dix sept marqueurs STR se trouvant sur le chromosome Y Ce kit permet l amplification des marqueurs suivants DYS456 DYS3891 DYS390 DYS389II DYS458 DYS19 DYS385 a b DYS393 DYS391 DYS439 DYS635 DYS392 Y GATA H4 DYS437 DYS438 DYS448 Pour les cinq premiers marqueurs une des deux amorces est coupl e au fluorochrome 6 carboxyfluorescein 6 FAM Pour les marqueurs suivants DYS458 DYS19 DYS385 a b l amorce fluorescente est marqu e au fluorochrome VIC Et pour les cinq marqueurs suivants une des deux amorces est coupl e au fluorochrome 2 chloro 5 fluoro 7 8 fused phenyl 1 4 dichloro 6 carboxyfluorescein NED Et pour les quatre derniers les amorces marqu es sont coupl es au fluorochrome PET user s manual AmpFISTR YFiler ch 1 2 a 1 31 Sch ma des tailles des all les possibles AmpF STR Yfiler IS a CRE Yr rrr y 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp GS500 nternal lane standard Figure 9 Composition
58. raphie Ameziane N Bogard M Lamoril J 2005 Principe de biologie mol culaire en biologie clinique y Livre Paris Elsevier Masson Applied Biosystems 2007 a AmpFISTR MiniFiler PCR Amplification Kit user guide Page Web Acc s http www3 appliedbiosystems com cms groups applied_markets_support documents general documentsicms 042748 pdf Applied Biosystems 2006 AmpFISTR SGM Plus PCR Amplification Kit user s manual Page Web Acc s http www3 appliedbiosystems com cms groups applied markets _support documents general documents cms 041049 pdf Applied Biosystems 2006 AmpFISTR YFiler PCR Amplification Kit user s manual Page Web Acc s http www3 appliedbiosystems com cms groups applied markets _support documents general documents cms 041477 pdf Berthe T 30 12 2004 Avantages et limites de la PCR Page Web Acc s http www lda22 com dossiers dossiers php id_dossier 149 amp idparent 148 Coquoz R Taroni F 2006 Preuve par l ADN la g n tique au service de la justice Livre Lausanne presses polytechniques et universitaires romandes Dubourg C 2007 Polymerase Chain Reaction PCR Page Web Acc s http Www med univ rennesl fr wkf stock RENNES20071031101610vdavidPCR 2007 pdf Huckenbeck W Scheil H G The distribution of the human DNA PCR polymorphisms Page Web Acc s www uni duesseldorf de W WW MedFak Serology datab
59. re confondu avec un all le et nous ne saurons pas si nous sommes face au CI ou face a un vrai allele Selon les figures 5 a 8 et les manuels d utilisation des kits le plus grand marqueur de tous les kits se trouve dans le kit PovverPlex 16 System Promega p 49 Il se nomme Penta E et il fournit des alleles s talant entre 379 474 paires de bases pb Donc la sequence amplifi e de notre CI doit tre sup rieure ou gale a 480 pb Mais elle ne doit pas non plus tre trop grande car il faudrait trop augmenter le temps de migration ce qui ne serait gu re interessant A partir de la s quence de l ADN de souris des amorces GALT F et GALT R et grace au logiciel de conception d amorces Primer3 Rozen nous trouvons les deux autres amorces Ces paires d amorces amplifient chacune un fragment de 480 pb Annexe 1 Il ne reste plus qu choisir le fluorochrome qui sera fix sur les amorces GALT F2 et GALT R2 choisies Page 25 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Selon les figures 5 8 et les manuels d utilisation des kits tous les kits poss dent en commun le fluorochrome fluoresc ine FAM Donc nous avons d cid de marquer les amorces avec ce fluorochrome Il sera fix sur l extr mit 5 pour viter de perturber la Taq lors de la phase d longation Amorces d ja disponible au laboratoire Aurigen fournisseur Microsynth GALT F a 100 uM 5 TGG CGC AGA AAG ACA AGG A 3 GALT R a 100
60. ril 2009 CN ER E Su Val FR Hu 0 sn D U U U U H 1 a E EJ E 9 Page 71 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 e pu lt A a IN a l e A D emt ETE HP speck GRR R LEE CT E DYER B 100 E 300 U U U U H r T S TI LEFI Controle mihin 100 St i EA 40 500 Page 72 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 technicienne Lis Ls AAA Caoba 110 mil ED don NRI 4000 I Ai a B_DY5456 B_DY53891 B_DY5390 B_DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 5000 4000 3000 2000 1000 1050 Pili if Sei ci PO Dei mi Eid CN RK Si E BOYS ss Canale b ige E WU BA 300 an 500 BEN i t U i i t t i i li M M 2 Le Li 2 as B_DYS45 B_DYS3891 B_DY5390 B_DYS53891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 IB_DYS456 B_DY53891 B_DY5390 B_DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 Page 73 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 IB_DYS456 B_DYS3891 B_DYS390 B_DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 2000 Tor Y DY FER Cents Imhibilien 100 HM 200 AM 500 am 5000 ly 1000 9 Li H H ci 1u Tan ns UJ JES B_DY5456 B_DYS3891 B DYS390 B DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000
61. rotubes pour ABI et 1 ul d amplifiat obtenu Page 21 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 1 2 Thermocycleur T3000 ou autre Cet appareil concu par la firme Biometra est utilis dans le cadre de l amplification des acides nucl igues Il est constitu de trois blocs chauffants permettant ainsi la programmation de la dur e et de la succession des cycles des paliers de temp rature pour trois PCR diff rentes Figure 10 6 1 3 ABI Genetic Analyser 3130 Domaine d application et principe Cet appareil permet la s paration des acides nucl iques obtenus en PCR selon leur taille Les s parations se font dans un capillaire d environ 50 um de diam tre permettant ainsi de r guler facilement la temp rature et d utiliser des tensions lectriques beaucoup plus lev es Coquoz p 41 La longueur de ce capillaire peut varier de 20 a 50 cm Il est rev tu a l int rieur de silice fondue et est rempli d un gel Ce gel est compos d une solution visqueuse de polydimethylacrylamide 4 ur e 8M 2 pyrrolidione 5 La s paration est effectu e sous l application d un champ lectrique de voltage lev Sous l effet de ce champ lectrique et du tampon les amplifiats charg s n gativement rentrent dans le capillaire et migrent en direction de l anode La migration est tr s rapide de 45 mn une heure Ensuite les amplifiats passent devant une fen tre optique o la d tection s effectue La d tect
62. s e 12 6 1 1 2 Kit PowerPlex 16 Systeme lid 6 1 1 3 Kit AmpFISTR SGM Pius 16 6 1 1 4 Kit AmpFISTR Minier 18 6 1 1 5 Kit AmpFISTR GJ 20 6 1 2 Thermocycleur T3000 0u AU een initier 22 6 1 3 AB Genene Analyser 3130 Tona di eg he 22 6 1 4 Autre MA IS INEC SSQIT 6 ge i ed CT nu hi 24 6 1 5 ENT ee LEE 25 e D H B 671 Ne L C1 151 631 Ee 25 A EE EE pje e ets 26 6 2 Schema g n ral de la strat gie choisie 27 6 3 Essais EE 28 6 3 1 Premier essai amplification et choix de la concentration optimale de ADN GC SONI U cadra 28 Ose Bu eae ae ee Y RD eee 28 GPM Neger 28 Ol RS A UC GR A GO cel 29 63 14 oAmalysedes1esulla e eL do 30 6 3 2 Deuxi me essai diminution des pics suppl mentaires et insertion du contr le d inhibition dans un kit avec un ADN connu 31 AN EE 31 Ge MENO atest acs A ote 31 G32 O eee 32 0324 AmalySe des EE 33 6 3 3 Troisi me essai utilisation d un m lange pr t l emploi dADN de souris et des amorces correspondantes et recherche de la concentration ODA E ven 34 62l gt i eee 34 0922 a aa laine 34 AE ES A A A DE A 35 Page 3 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 AE ANMALYVSS CES E 35 6 3 4 Quatri me essai Essai du m lange pr t l emploi CIMIX avec WE YN Te E EN ie FN 36 o BU O dU tastes ee 36 ON 2 NOT en 36 ERS A et ee eee ee OD 37 6 3 4 Analyse
63. t des kits par exemple le Quantifiler kit d Applied Biosystems user guide AmpFISTR MiniFiler ch 1 6 Il faut tenir compte que l absence de r sultat lorsque nous sommes en pr sence d une inhibition est provoqu e par une forte concentration en inhibiteurs Si nous en diminuons la concentration il est possible d obtenir un profil partiel Ceci est expliqu par le fait que la Taq polymerase a une affinit chimique pour ces substances inhibitrices Donc plus y en a plus plus la Tag est inhib e et vice versa Coquoz p 190 En r sum l activit de la Taq polymerase d pend de la concentration en substances inhibitrices Elle peut donc tre totalement inhib e ou diminu e Si l activit est diminu e 1l n y a que les fragments de petites tailles qui sont assez amplifies pour pouvoir tre d tect s obtention d un profil partiel Page 11 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 5 But Notre but est d viter d avoir a effectuer une analyse pr alable pour certifier la pr sence d ADN dans l extrait mais de rajouter un ADN animal ou v g tal directement dans notre tube PCR L ADN choisi va tre amplifi en m me temps que notre extrait permettant ainsi de dire si l absence de profil est provoqu par de l inhibition ou par l absence d ADN dans notre chantillon Cette information suppl mentaire nous vite ainsi de faire des manipulations suppl mentaires pour lever l inhibition alors qu il
64. tre CI il nous permet de savoir si le profil partiel est caus par de l ADN d grad ou par de l inhibition Nous avons utilis le kit PovverPlex 16 System 6 3 8 2 M thode Amplification selon le protocole PovverPlex 16 System avec lul de CIMIX 12 5 par r action A noter que la PCR s est d roul e sur 25 cycles seulement pour les tubes 1 a 4 en corollaire ce sont 1000 copies suppl mentaires d ADN de souris qui ont t ajout es au MasterMix Les tubes 4 et 6 sont des contr les n gatifs sans ADN IT faut savoir que les extraits des chantillons utilis s sont de qualit connue les tubes 1 et 3 contiennent des extraits ayant des inhibiteurs et les tubes 2 et 5 de l ADN d grad 6 3 8 3 Resultats O Tube n 1 608 151 PouerPlex 16 CI ni O Tube n 2 G08 300 PouerPlex 16 CI Ei 100 200 300 400 500 3000 1000 Page 52 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Tube n 3 08 823 PowerPlex_16_CI Ka D3 1358 Controle 400 200 300 400 500 2000 Tube n 4 _25cy PowerPlex_16_CI a 351358 Penta E Controle 100 200 300 400 500 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 2563 Tube n 5 G08 870 PoverPlex 16 CI x NM D3 1358 Penia E Controle 100 200 300 400 500 Tube n 6 _32cy PoverFlex 16 CI d IR Penta E Controle 100 200 300 400 500 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 740
65. u il y a une substance inhibitrice dans la PCR M me lorsque l ADN cibl par le kit est la limite de d tection le contr le d inhibition est la premi re cible a tre affect e par la quantit d inhibiteur la plus faible ayant encore un effet I est reproductible Il permet de d terminer si nous sommes en pr sence d ADN d grad ou s il y a de l inhibition Pour terminer le contr le d inhibition a t teste dans des cas r els et il r agit comme nous le souhaitons Les mots cl s sont soulign s Page sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 2 Abstract It happens that after a Polymerase Chain Reaction PCR no profile is obtained on the fragment analyzer How can we know if it is the result of PCR inhibitors or if there is simply no DNA in the extract of the sample without having to quantify the DNA beforehand To answer this question it is enough to work out a control of inhibition from an animal or plant DNA which gets amplified in the same tube as the target sequences from extract Within the laboratory Aurigen this need of a control of inhibition CI 1s particularly felt for analyses of forensic genetics To make these analyses we use the following kits PovverPlex 16 System from Promega AmpFISTR SGM Plus AmpFISTR MiniFilerT and AmpFISTR Yfiler from Applied Biosystems After reflection we opted for the mouse s DNA It is easy of access and it is already used in
66. uM 5 CAA AGA TTC AAG GCC CTG ATG 3 Amorces choisies fournisseur Microsynth GALT R2 a 100 uM 5 FAM CAG TCT CAC CAA GCT ACC CTG A 3 GALT F2 a 100 uM 5 FAM GCT CCA CGC CCA CTA CTA CC 3 6 1 5 2 Extraits divers a Nous avons exploit d anciens extraits utiles pour observer l action de notre CI Certains extraits contenaient des substances inhibitrices et d autres donnaient un profil partiel b Nous avons utilis un extrait d ADN d un patient comme contr le et une solution en h me obtenus partir du sang de ce patient Estimation de la concentration en h me Masse mol culaire de l h moglobine 65 600g mol communication personnelle Concentration de l h moglobine dans le sang env 120 g l communication personnelle 99600 16400 g mol 120g 7 3x10 M d h me dans le sang 4 h mes 16400 g mol 3 73x10 nM na 10 ul de sang 63 ul d H2O pour une 1000 uM concentration en heme de 1000 uM A partir de cette solution m re nous effectuons diff rentes dilutions Extraction avec le kit JetQuick Blood Spin Kit de Genomed cat 440250 La concentration en ADN de l extrait a t obtenue en admettant une concentration en ADN de 30 ng ul de sang et un rendement d extraction de 100 Page 26 sur 79 Travail de dipl me Novembre 2008 A vril 2009 6 2 Schema general de la strategie choisie Tout d abord ADN de l chantillon doit tre extrait L extraction peut se faire grace d
67. user s manual AmpFISTR YFiler ch 1 7 AmpFISTR Yfiler Primer Set AmpFISTR Yfiler PCR Reaction Mix AmpFISTR Yfiler Allelic Ladder AmpliTag Gold DNA Polymerase AmpFISTR Control DNA 9947A 10 ng ul AmpFISTR Control DNA 007 0 10 ng ul Mat riels indispensables mais non fournis par le kit GeneScan 500 LIZ Size Standard Kit DS 33 Matrix Standard Kit Dye Set G5 Page 20 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 MasterMix PCR Selon le manuel d utilisation du kit AmpFISTR YFiler ch 3 6 le volume final de MasterMix est de 15 ul Nous avons juste diminu le volume de MasterMix 10 ul tout en gardant les proportions des r actifs MasterMix MM PCR pour un chantillon 3 7 ul AmpFISTR Yfiler PCR Reaction Mix 2 ul AmpFISTR Yfiler Primer Set 0 3 ul AmpliTaq Gold DNA Polymerase SU ul Distribuer 6 ul de MM dans chaque tube PCR Ajouter X ul d A DN et 4 X ul d H20 Programme POR user s manual AmpFISTR YFiler M ch 3 8 Le programme utilis pour notre PCR est le suivant AmpFISTR Yfiler 30 cycles 95 C 11 30x 94 C 1 61 C 1 72 C 1 60 C 80 4 C pause Sur l analyseur de fragments Protocole du laboratoire Pr parer un mix formamide standard interne Pour N chantillons pr parer N x 10 ul Hi Di formamide Nx 0 15 ul GeneScan M 500 LIZ Size Standard Ajouter 10 ul de mix formamide standard interne dans les mic
68. vembre 2008 Avril 2009 199 B_DYS456 B_DYS3891 B_DYS3891 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 B_DYS456 B_DYS3891 B_DYS3891 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 4000 2000 1000 B_DYS456 B_DYS3891 R DYS38911 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 2000 1000 B_DYS3891 B_DYS39891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 2000 1000 D 13 1 110 1672 y uras el SA Page 68 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 Spaas B_DYSHH_ Sam 1 B DYSH 1 Controls Inhibition 100 XR 00 an am 13 CI 2146 173 B_DYS456 B_DYS3891 B_DY5390 B_DYS3891I Controle Inhibition 100 200 300 400 500 TJ ii E ci YM 104 Controle Imhibilien 1H 291 T du Mu NU NE 1000 tl la Ca AA J A a a e A 13 B_DY 456 IB DYS3891 B_DY5390 B_DYS3391 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 5000 4000 3000 2000 1000 Page 69 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Avril 2009 B_DYS456 B_DY53891 B_DY5390 B_DY538911 Controle Inhibition 100 200 300 400 500 E Controle Inhibition H 15 3 cl Ha HL 119 ip MESES J A OSHA 1 TR a 1 JR TY naan Canale Inhibition CCE PART Car role Inhibition VI on RI don WE 14 CR wl FA nt QEN ETFI T B Driss LOVERA ARA AIM Controle Inhibition Page 70 sur 79 Travail de diplome Novembre 2008 Av

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

MIXER VERTICAL SÉRIES 1100 ET 5100  DELL 7700HD    DISHWASHER WD-7 Installation and user manual  Guía de operación 5142 - Support  MANUAL DO USUÁRIO  Opción L34, parametrizar interruptor automático en el  

Copyright © All rights reserved. Failed to retrieve file