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For Peer Review - Les thèses en ligne de l`INP

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1. 97 Tableau 11 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de cellules h patiques HepG2 expos es pendant 24 h et 72 h aux m langes CIP TAM en dose inverse 100 Tableau 12 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de cellules mammaires MCF 7 expos es pendant 24 h et 72 h des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide 102 Tableau 13 Comparaison entre les valeurs additives du nombre d adduits attendus et ceux observ s avec des cellules mammaires MCF 7 expos es pendant 24 h des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide 113 Tableau 14 Comparaison entre les valeurs additives du nombre d adduits attendus et ceux observ s avec des cellules mammaires MCF 7 expos es pendant 24 h des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC sscccsssccesssesssecstscsssessees 115 Tableau 15 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de bioessais refl tant les effets aigus et Chroniques tn ir iinn aia itida ana std cs ded dent cael en dtd bade Cokes Sot ci ban tiens este 118 Tableau 16 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de biomarqueurs de g notoxicit refl tant le
2. C Albasi A Pfohl Leszkowicz Universit de Toulouse Institut National Polytechnique Laboratoire de G nie Chimique UMR CNRS INPT UPS 5503 France gt Ecole Nationale Sup rieure Agronomique ENSAT 1 avenue Agrobiop le BP 32607 31320 Auzeville Tolosane France Ecole National Sup rieure des Ing nieurs en Arts chimiques et Technologiques ENSIACET 4 all e Emile Monso 31030 Toulouse cedex 4 France 4 Universit de Toulouse Laboratoire GEODE UMR CNRS 5602 Centre Universitaire Jean Francois Champollion Place de Verdun 81012 Albi cedex 9 France Veolia Environnement Recherche et Innovation Centre de Recherche de Maisons Laffitte 78603 Maisons Laffitte France ARTICLE INFO ABSTRACT Article history Ciprofloxacin CIP tamoxifen TAM and cyclophosphamide CP which are often used in anticancer treatment are released in hospital effluent and into the environment Although the concentrations are low from ng L to ug L no data exist concerning their ecotoxicological impact In this study two biomarkers of early effect were performed on hepatic cells HepG2 cell viability and genotoxicity DNA breaks using cell proliferative assay and comet assay respectively These data were compared with two standardized ecotoxicological tests algaltoxkit Received 12 July 2013 Accepted 14 November 2013 Available online xxxx ae cn F and microtox Cells were exposed to an increasing amount of an indi
3. bon nombre de ces souvenirs Je n oublie pas non plus mes acolytes de tr s longue date avec qui j ai v cu mes premi res heures de science sur les bancs de la fac et qui j ai souvent pens Malgr la distance ils ont su m apporter leur mani re leur soutien Merci vous Yasminette amp Valochon Juls Tafou amp Laura et Nono l exploratrice Enfin je tiens remercier tout particuli rement mon amoureuse Ga lle A toi mon soutien number one merci pour ton coute ta patience et surtout pour l quilibre que tu m apportes tous les jours Tu as su me faire relativiser dans les moments de doute et c est pour cela que tu es la meilleure Of course merci aussi pour ton aide en anglais et pour tes muffins au chocolat si bons pour le moral Mes derniers remerciements vont a mes parents a qui je dois tout ou presque ces dix derni res ann es d j Que serais je devenu sans votre soutien et votre attention irr prochable mon gard Votre humanisme et votre philosophie de la vie ont t pour moi d une grande inspiration et m ont aid en arriver l aujourd hui Merci Je terminerai ces remerciements avec une pens e toute particuli re pour ces bact ries ces algues ces plantes et ces cellules qui ont donn leurs corps ma science Bien que vous ne soyez plus l je vous remercie pour tout et ne vous oublierai pas R I P Table des mati res vi Table des mati re
4. Synth se bibliographique maitriser concernent la lyse des membranes cellulaires et nucl aires afin d viter tout artefact exp rimental pouvant introduire des cassures de la chromatine Lemi re 2004 Durant l lectrophor se l ADN nucl aire pr sentant des cassures induites par le ou les x nobiotiques migre de mani re h t rog ne Cette migration est d autant plus importante que la fragmentation augmente Elle se traduit apr s marquage fluorescent par une image de type com te figure 12 qui se compose d une t te repr sentant le pool d ADN intact et d une queue repr sentant les fragments d ADN Noyau non Noyau endommag endommag t te queue Noyau l g rement Noyau fortement endommag endommag Figure 12 Description d une image de type com te et caract risation de noyaux endommag s et non endommag Le test des com tes peut d tecter chez toutes les populations de cellules eucaryotes pouvant tre cultiv es en suspension unicellulaire les cassures simples et doubles brins les sites labiles alcalins et potentiellement les pontages ou r ticulation ADN prot ines et ou ADN ADN Burlinson et al 2007 Dhawan et al 2009 Il rend galement compte des processus de r paration par excision et resynth se qui g n rent transitoirement des cassures Cependant cela ne peut pas tre consid r comme des dommages en soi mais comme un marqueur d exposition des fact
5. cotoxicologie la science qui tudie les impacts des agents polluants sur la structure et le fonctionnement des cosyst mes d veloppe des outils et des m thodologies qui permettent une caract risation la fois des dangers et des sources de pollutions pr vention sur le milieu mais aussi de l impact sur les milieux r cepteurs qualit des milieux compr hension du lien pression impact Les outils disponibles pour l valuation des risques cotoxicologiques sont de trois types les bioindicateurs les bioessais et les biomarqueurs La majorit des tudes men es se basent principalement sur des approches pr dictives qui reposent sur l exposition a des contaminants en conditions contr l es de mod les biologiques bioessais caract ris s par diff rentes chelles d organisation biologique depuis la cellule test in vitro a la communaut m socosme en passant par des organismes in toto tests mono et multi sp cifiques L valuation du risque se fonde la fois sur l valuation de l exposition des organismes aux substances mais galement sur l valuation du danger biologique Dans les deux cas elle repose sur des donn es issues de mod les qu il s agisse de mod les physicochimiques transports transformations transferts relation structure activit ou de mod les biologiques r cepteurs mol culaires cellules organismes qui conduisent au calcul d une concentration pr dite dans 41 Synth se b
6. des remaniements de g nes et ou de chromosomes a des translocations des recombinaisons des amplifications de g nes Des mutations d oncog nes et ou de g nes suppresseurs de tumeurs sont galement impliqu es dans cette tape de progression L invasion qui est le processus final de canc rogen se stade o les cellules de la tumeur maligne s infiltrent dans les tissus voisins Ces cellules peuvent galement migrer via la circulation sanguine ou lymphatique vers d autres tissus de l organisme se fixer puis d velopper des m tastases Boyer et al 1999 1 3 2 M canismes mol culaires de la canc rog n se La canc rogen se est multi s quentielle et est associ e une accumulation d alt rations g n tiques Les mutations critiques impliqu es dans la transformation ont lieu dans les g nes de contr le de la croissance les proto oncog nes les g nes suppresseurs de tumeur et ceux contr lant les g nes suppresseurs de tumeur Hussein amp Harris 1998 La plupart des g nes alt r s identifi s jusqu pr sent appartiennent deux familles les oncog nes et les g nes suppresseurs de tumeur Harris 1991 Les proto oncog nes ras fos jun etc sont des g nes qui jouent un r le majeur dans le contr le de la croissance et ou de la diff renciation cellulaire Ils codent notamment des l ments de transduction de signaux mitog nes Lorsqu ils sont activ s par des mutations ils deviennen
7. gt r control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 November December January Samples Figure 59 Inhibition de la croissance de l algue P subcapitata expos e 72 h a diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de station d puration STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes et sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement Quel que soit l chantillon test on constate une inhibition significative p lt 0 01 de la croissance algale lors de l exposition effluents hospitaliers N1 D1 J1 et aux effluents en entr e de STEP N2 D2 J2 Le taux d inhibition avoisine les 95 par comparaison avec la condition contr le Par contre il n y a pas de diff rence significative entre les lieux de pr l vement h pital entr e de STEP ni entre les p riodes d chantillonnage A l inverse l exposition aux chantillons issus des eaux en sortie de STEP entraine une augmentation de la croissance significative p lt 0 01 quelle que soit la p riode de pr l vement 10 40 sup rieure au contr le On note que l chantillon en sortie de STEP du mois de D cembre D3 induit une prolif ration significativement plus import
8. la fronti re avec la France Les points de pr l vements ont t d finis au niveau des effluents de l h pital Joseph Trueta de G rone qui compte environ 400 lits et de l entr e et la sortie de la station d puration STEP en aval du r seau communal d gouts figure 56 La station d puration r colte la globalit des eaux us es hospitali res ainsi que les eaux r siduelles urbaines pour une capacit de 100 000 quivalents habitants France NR be G rone H pital Joseph Trueta Station d puration aval 1km le Ter rivi re Figure 56 Situation g ographique de la zone d tude et des points de pr l vements Le choix de la saison de pr l vement a t d fini en relation avec l quipe espagnole de l ICRA en charge des analyses physico chimiques des chantillons et a pour but de suivre l volution et l abattement de la toxicit depuis les rejets au niveau de l h pital jusqu aux rejets dans l environnement apr s le traitement biologique conventionnel en STEP Les chantillons d eaux ont t collect s pendant trois mois cons cutifs de Novembre 2011 Janvier 2012 lors de l administration hebdomadaire des traitements chimioth rapeutiques Le choix s est fait en fonction de la p riode de No l au cours de laquelle on enregistre une forte diminution des activit s chimioth rapeutiques li aux f tes de fin d ann e Le niveau de contamination en m dicaments
9. 443 451 Darvari R Boroujerdi M 2004 Concentration dependency of modulatory effect of amlodipine on P glycoprotein efflux activity of doxorubicin a comparison with tamoxifen Journal of Pharmacy Pharmacology 56 985 91 Daughton C G Ternes T A 1999 Pharmaceuticals and personal care products in the environment Agents of subtle change Environmental Health Perspectives 107 Supplement 6 907 938 DCE 2000 Directive 2000 60 CE du Parlement Europ en et du Conseil du 23 octobre 2000 tablissant un cadre pour une politique communautaire dans le domaine de l eau JO L 327 du 22 d cembre 2000 1 80 Dearfield K L Bender E S Kravitz M Wentzel R Slimak M W Farland W H Gilmant P 2005 Ecological Risk assessment issues identified during the US Environmental Protection Agency s examination of risk assessment practices Integration of Environmental Assessment Management 1 73 76 Deblonde T Hartemann P 2013 Environmental impact of medical prescriptions assessing the risks and hazards of persistence bioaccumulation and toxicity of pharmaceuticals Public health 127 312 317 Degen G H 1993 SEMV cell cultures a model for studies of prostaglandin H synthase mediated metabolism and genotoxicity of xenobiotics Toxicology Letters 67 187 200 Degen G H Eling T E McLachlan J A 1982 Oxidative metabolism of diethylstilbestrol by prostaglandin synthetase Cancer Research 42 919 923
10. CP were dissolved in HCl methanol and water respectively for stock solution and stored at 20 C Prior to the treatments the compounds were diluted in the culture medium in order to give a final solvent concentration below 0 1 None of these solvents at this dose affected cell viability bacteria viability and algae growth Hepatic cells HepG2 algae and bacteria were exposed to increas ing concentrations of the respective drugs CIP TAM CP or to a binary mixture of CIP TAM or to a mixture of the 3 drugs CTC in the range of concentrations found in water as described in Table 1 Conditions 1 and 2 represent low doses close to environmental concentrations sur face water condition 3 close to WWTP concentrations with a 2 fold factor of CIP and conditions 4 and 5 represent hospital wastewater concentrations with a 10 fold factor of CIP In condition 0 cells received only medium This latter condition corresponds to control 2 4 MTS cell proliferation assay The assay was performed in accordance with the method by Barltrop et al 1991 In brief cell metabolic activity was determined by monitor ing the mitochondrial dependent reduction of 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 5 3 carboxymethoxypheny 2 4 sulfophenyl 2H tetrazolium inner salt MTS using a commercial assay CellTiter 96 AQueous Promega Subcultures for experiments were prepared the day preceding in 96 multiwell plates at a density of 5 5 x 10 cells well and 1
11. Ceci soul ve des questions concernant la capacit de compos s pharmaceutiques potentiellement g notoxiques induire des alt rations g n tiques ou mutag nes aux doses environnementales d tect es et notamment lorsqu elles sont en m lange Anway et al 2005 ll M tabolisation des x nobiotiques et canc rog n se 11 1 M tabolisation des x nobiotiques dans l organisme De par notre environnement nous sommes tous expos s quotidiennement directement ou indirectement des substances exog nes d origines diverses rassembl es sous le terme de x nobiotiques Ces compos s regroupent des produits naturels des m dicamentset des polluants de l environnement toxines v g tales et animales d riv s des combustibles domestiques et industriels solvants colorants additifs alimentaires pesticides herbicides etc Ils sont le plus souvent hydrophobes et ont pour tendance naturelle de s accumuler dans les phases lipidiques des membranes cellulaires Ils entra neraient ainsi une mort in luctable des organismes si ceux ci ne s taient dot s au cours de l volution de syst mes enzymatiques permettant leur limination L ensemble des tapes impliqu es dans la transformation et l limination de ces x nobiotiques est appel m tabolisation Le produit de m tabolisation form est un compos hydrophile dont l excr tion est favoris e au niveau r nal ou biliaire Stieger amp Meier 1998 figure 2 20
12. De Jonge M E Huitema A D R Rodenhuis S Geijnen J H 2005 Clinical Pharmacokinetics of Cyclophosphamide Clinical Pharmacokinet 44 11 1135 1164 Della Greca M Fiorentino A Isidori M Lavorgna M Previtera L Rubino M Temussi F 2004 Toxicity of prednisolone dexamethasone and their photochemical derivatives on aquatic organisms Chemosphere 54 629 637 Deloffre Bonnamour N 1995 Les rejets des tablissements de sant des effluents liquides auxd chets solides M moire de ma trise IUP G nie de l Environnement Ecod veloppement Universit Claude Bernard Lyon 1 Lyon 75p Desai P B Nallani S C Sane R S Moore L B Goodwin B J Buckley D J Buckley A R 2002 Induction of cytochrome P450 3A4 in primary human hepatocytes and activation of the human pregnane X receptor by tamoxifen and 4 hydroxytamoxifen Drug Metabolism Disposition 30 608 612 Desta Z Ward B A Soukhova N V Flockhart D A 2004 Comprehensive evaluation of tamoxifen sequential biotransformation by the human cytochrome P450 system in vitro prominent roles for CYP3A and CYP2D6 Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics 310 1062 1075 Devaux A Flammarion P Bernardon V Garric J Monod G 1998 Monitoring of the chemical pollution of the river Rh ne through measurement of DNA damage and cytochrome P4501a induction in chub Leuciscus cephalus Marine Environmental Research 46 1 5 25
13. JANVIER TESTS DE VIABILITE Microtox toxicit aigu Algaltox F toxicit chronique Viabilit cellulaire MTS toxicit aigu et chronique H patique HepG2 Mammaire MCF 7 30 Prolif ration Prolif ration Inhibition 72h Inhibition 24h 72h 24h 72h Prolif ration Prolif ration Inhibition Prolif ration Inhibition Prolif ration Prolif ration Prolif ration Inhibition Commentaires Le ph nom ne de prolif ration est r v l par l induction importante de la bioluminescence bact rienne Les taux d inhibition mesur s sont tous sup rieurs 90 Tableau 19 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de bioessais refl tant les effets aigus viabilit bact rienne et cellulaire humaine et chroniques inhibition de la croissance algale et lenticulaire 0 aucune toxicit n a t observ e DECEMBRE NOVEMBRE JANVIER BIOMARQUEURS DE GENOTOXICITE Test YES YAS Test des com tes Post marquage des adduits au 2P R cepteur hER a R cepteur hAR Cell H patique Cell Mammaire Cell H patique Cell Mammaire cestrog nique androg nique HepG2 MCF 7 HepG2 MCF 7 48h 24h 72h 24h 72h 24h 24h Agoniste Antagoniste 0 Antagoniste Agoniste Antagoniste Cassures a Cassures a l ADN l ADN 0 Antagonist
14. Synth se bibliographique Ce processus de m tabolisation se d roule selon trois phases regroupant diff rentes enzymes de biotransformation phases et Il et des transporteurs phase III e Les r actions de phase dites de fonctionnalisation permettent l introduction d une fonction chimique nouvelle OH NH2 COOH rendant la mol cule plus polaire Ces r actions sont g n ralement des r actions d oxydation mais elles comportent galement des r actions d hydrolyse de r duction et d halog nation Cette tape est catalys e par les mono oxyg nases cytochromes P450 essentiellement ainsi que par les peroxydases et par la quinone r ductase NQO e Les r actions de phase II dites de conjugaison permettent l ajout d un radical hydrophile et sont r alis es soit directement sur le x nobiotique inchang soit sur les m tabolites fonctionnalis s g n r s lors de la phase l Ces r actions de conjugaison augmentent l hydrophilie de la mol cule facilitent son transport et activent son limination par voies r nale et biliaire Les radicaux hydrophiles conjugu s sont des petites mol cules endog nes polaires telles que le glutathion l acide glucuronique le sulfate les groupements m thyle ac tyle glycocolle et autres acides amin s Ces r actions de conjugaison sont catalys es par diff rentes transf rases et notamment par les glutathion S transf rases GST les sulfurotransf rases et les UDP glucur
15. Table des mati res Partie 2 Application de la batterie de tests d cotoxicit pour la caract risation et le suivi d effluents hospitaliers et urbains L Evaluation de la bioluminescence de la bact rie V Fischeri Microtox 134 Il Evaluation de la croissance de l algue P subcapitata Algaltox F 135 lll Evaluation de la viabilit de cellules humaines test MTS ccccceeee 136 IV 1 Evaluation de la viabilit des cellules h patiques HepG2 ccseeseereees 136 IV 2 Evaluation de la viabilit des cellules mammaires MCF 7 137 IV Analyse du potentiel perturbateur endocrinien sur les r cepteurs cestrog niques hER a et androg niques hAR test YES YAS ccccs00 137 111 1 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs cestrog niques hER YES 137 111 2 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs androg niques hAR YAS 139 V Analyse des cassures l ADN sur cellules humaines test des com tes 140 V 1 Analyse des cassures a l ADN sur cellules h patiques HepG2 0 140 V 2 Analyse des cassures l ADN sur cellules mammaires MCF 7 0sss00 141 VI Analyse de la formation d adduits l ADN sur cellules humaines technique du postmarguage RE aai i a 142 VI 1 Analyse des adduits l ADN form s sur les cellules h patiques HepG2 142 VI 2 Analyse des adduits l A
16. aa 95 y 95 4 90 5 90 85 85 8 80 80 NP 75 75 control 0 01 0 1 1 10 100 C control 0 01 0 1 1 10 100 C 10 1 0 5 0 1 001 T 10 1 0 5 0 1 001 T 0 01 0 1 1 10 100 C 0 01 0 1 1 10 100 C 0 01 0 1 0 5 1 10 I 0 01 0 1 0 5 1 10 I Concentration ug L Concentration ug L Figure 39 Taux de survie des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes concentrations de m lange en doses inverses de ciprofloxacine tamoxif ne courbe noire Les r sultats sont exprim s en m dianes et compar s avec ceux des m langes en doses croissantes courbe rouge Les valeurs sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 diff rence significative P lt 0 01 entre les m langes Contrairement ce qui a pu tre mis en vidence pr c demment lors de l analyse de doses croissantes en m lange on constate ici l apparition d un effet de coalition des mol cules En effet on observe 24 h que les faibles doses de CIP 0 01 0 1 ug L additionn s aux fortes doses de TAM 1 10 ug L induisent une r ponse de toxicit importante Ce ph nom ne s amplifie 72h On constate clairement que le ph nom ne n est pas exclusivement li la seule concentration de TAM puisque pour une quantit quivalente de TAM 10 ug l l inhibition est significative et nettement plus importante lorsque les cellules sont expos es simultan ment aux plus faibles doses de CIP 0 01 ug l a
17. agarose Low Melting Poin LMP l agarose Normal Melting Poin NMP et le bromure d thidium BET proviennent de chez Sigma Saint Quentin France Le PBS sans Ca Mg est fourni par Life technologies Saint Aubin France 1 5 3 6 Principe Le test des com tes aussi appel Single Cell Gel Electrophoresis SCGE est une technique d lectrophor se sur microgel d agarose o des cellules ayant t expos es des x nobiotiques y sont incluses figure 19 Cet outil permet de mesurer directement les cassures induites par un agent g notoxique indirectement lors des processus enzymatiques de r paration des dommages ou encore lors de processus secondaires de fragmentation de l ADN apoptose 70 Mat riels amp M thodes 1 5 3 c Protocole Une vingtaine de lame de microscope sont pr par es pr alablement apr s les avoir tremp es dans un bain d agarose NMP 1 6 et laiss es s cher sous la hotte Les cellules sont distribu es sur microplaques 12 puits raison de 1 10 cellules pour un volume final de 2 mL Au terme du temps de traitement 24 h 72 h le milieu de culture est limin et 500 uL de trypsine sont ajout s par puits sous hotte sans lumi re Les cellules sont r cup r es dans 700 uL de milieu de culture complet ou 700 uL PBS sans Ca ni Mg puis distribu es dans des Eppendoris Les tubes sont centrifug s 5 min a 4000 rpm 4 C puis le surnageant est limin
18. puration de STEP En effet la g notoxicit est un indicateur sensible d exposition des facteurs de stress pouvant entrainer des modifications de la structure et du fonctionnement du g nome M me si le 156 Conclusions amp Perspectives dysfonctionnement cellulaire et tissulaire qui en r sulte peut tre l origine de perturbations physiologiques avec des r percussions au niveau populationnel d veloppement reproduction ou encore l origine d un processus de canc rog n se ces effets n affectent pas forc ment la viabilit des organismes et de ce fait ils ne sont pas d tect s par les tests standardis s comme nous avons pu le voir Par exemple le taux de viabilit cellulaire valu dans notre tude avec le test MTS n a pas r v l de toxicit sur les cellules humaines alors que la technique de post marquage a mis en vidence une forte g notoxicit Des processus de r paration ou de r cup ration peuvent expliquer ces r sultats et montrent que les analyses utilisant les outils standards actuellement recommand s peuvent tre biais es d o la pertinence d y associer des biomarqueurs de g notoxicit sensibles Perspectives Le d veloppement r cent des techniques de biologie mol culaires a permis d avancer dans la voie d une meilleure interpr tation des effets g notoxiques et de leurs cons quences La caract risation des s quences dont l expression est modifi e limite encore la port
19. 1973 Carcinogens are mutagens a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America 70 2281 2285 Anadon A Martinez Larragna M R Iturbe J Martinez M A Diaz M J Frejo M T Martinez M 2001 Pharmacokinetics and residues of ciprofloxacin and its metabolites in broiler chickens Research in Veterinary Science 71 2 101 109 Anandatheerthavarada H K Addya S Dwivedi R S Biswas G Mullick J and Avadhani N G 1997 Localization of multiple forms of inducible cytochromes P450 in rat liver mitochondria immunological characteristics and patterns of xenobiotic substrate metabolism Archives Of Biochemistry And Biophysics 339 136 150 Andreozzi R Caprio V Ciniglia C De Champdore M Lo Giudice R Marotta R Zuccato E 2004 Antibiotics in the environment Occurrence in Italian STPs fate and preliminary assessment on algal toxicity of amoxicillin Environmental Science and Technology 38 24 6832 6838 Anway M D Cupp A S Uzumcu M Skinner M K 2005 Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility Science 308 1466 1469 Aranha O Wood D P Sarkar F H 2000 Ciprofloxacin mediated cell growth inhibition S G2 M cell cycle arrest and apoptosis in a human transitional cell carcinoma of the bladder cell line Clinical Cancer Research 6
20. 2004 Comprehensive evaluation of tamoxifen sequential biotransformation by the human cytochrome P450 system in vitro prominent roles for CYP3A and CYP2D6 J Pharmacol Exp Ther 310 1062 1075 Dowers TS Qin ZH Tatcher GRJ Bolton JL 2006 Bioactivation of Selective Estrogen Receptor Modulators SERMs Chem ResToxicol 19 9 1125 1137 John Wiley amp Sons Inc OONOOARWND 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610 611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 626 Environmental and Molecular Mutagenesis Drusano GL Weir M Forrect A Plaisance K Emm T Standiford HC 1987 Pharmacokinetics of intravenously administered ciprofloxacin in patients with various degrees of renal function Antimicrobial Agents Chem 31 6 860 864 EFSA 2012 Minimum Criteria for the acceptance of in vivo alkaline Comet Assay Reports Efsa J 10 11 2977 2989 Eguchi K Nagase H Ozawa M Endoh YS Goto K Hirata K Miyamoto K Yoshimura H 2004 Evaluation of antimicrobial agents for veterinary use in the ecotoxicity test using microalgae Chemosphere 57 1733 1738 Emmanuel E Perrodin Y Keck G Blanchard JM Vermande P 2005 Ecotoxicological risk assessment of hospital wastewater a proposed framework for raw effluents discharging into urban sewer network J Hazardous Materials 117 1 11 Ferrando Climent L Rodriguez M
21. 2013 In vitro bioassays for risk assessment of oncologic treatments released in hospital waste water Application to hospital effluents International conference pharmaceutical products in environment Is there a problem June 2013 Nimes France Mater N Rodriguez Mozaz S Ferrando Climent L Barcel D Geret F Faucet Marquis V Pfohl Leszkowicz A 2012 In vitro bioassays for risk assessment induce by mixtures of anticancer drugs released in hospital waste water Application to hospital effluents 9 congr s international Gruttee Octobre 2012 Montpellier France Mater N Geret F Faucet Marquis V Albasi C Pfohl Leszkowicz A 2012 Optimization of in vitro bioassays for risk assessment of anticancer drugs mixtures released in hospital waste water 15 cytotreath workshop the effects of residues of cytostatics and other pharmaceuticals on non target organisms Oct 2012 Naples Italie Poster 1 Mater N Geret F Rodriguez Mozaz S Castillo L Barcel D Pfohl Leszkowicz A 2013 In vitro bioassays for risk assessment of oncologic treatments released in hospital wastewaters and surface waters 11 International Conference of Environmental Mutagens 11 ICEM Nov 2013 Brazil Mater N Faucet Marquis V Albasi C Lenoir S Castillo L Pfohl Leszkowicz A 2011 Evaluation of toxic effects of anticancer drugs mixture released in hospital waste water using in vitro bioassays International Toxicology of Mix
22. 891 900 163 Bibliographie Aoyama T Yamano S Guzelian P S Gelboin H V Gonzalez F J 1990 Five of 12 forms of vaccinia virus expressed human hepatic cytochrome P450 metabolically activate aflatoxin B1 National Academy Of Sciences Of The United States Of America 87 4790 4793 Ashton D Hilton M Thomas K V 2004 Investigating the environmental transport of human pharmaceuticals to streams in the United Kingdom Science of Total Environment 333 1 3 167 184 Attrassi B Saghi M Flatau G 1993 Multir sistance bact rienne aux antibiotiques en milieu marin c te atlantique Maroc Environmental Technology 14 1179 1186 Baquero F Martinez J L Cant n R 2008 Antibiotics and antibiotic resistance in water environments Current Opinion in Biotechnology 19 260 265 Bartsch H Rojas M Alexandrov K Risch A 1998 lmpact of adduct determination on the assessment of cancer susceptibility Recent Results in Cancer Research 154 86 96 Beaubien A Lapierre L Boucharde A Jolicoeur C 1986 A multispecies toxicity assessment rocedureu sing flow Microcalorimetry Comparison with other toxicity evaluation methods Toxicity Assessment An International Quaterly 2 187 200 Belpaeme K Cooreman K Kirsch Volders M 1998 Development and validation of the in vivo alkaline comet assay for detecting genomic damage in marine flatfish Mutation Research 425 167 184 Besse J P
23. CIP TAMat 0 61 0 88 10 53 4 83 0 48 CIP TAMobs 3 34 1 65 5 96 0 70 6 23 0 96 12 67 1 50 19 64 2 13 CTC att 0 61 0 88 10 53 4 83 0 48 CT Cots 0 0 1 65 1 92 2 47 0 83 6 15 3 10 Tableau 14 Comparaison entre les valeurs additives du nombre d adduits attendus et ceux observ s avec des cellules mammaires MCF 7 expos es pendant 24 h des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC 115 R sultats amp Discussion Partie 1 A partir des valeurs d additivit attendues compar es a celles mesur es tableau 14 on constate un ph nom ne de potentialisation pour les conditions 1 et 2 et encore plus prononc pour les conditions 4 et 5 lorsque la ciprofloxacine est pr sente en m lange A contrario les doses m lang es pour la condition 3 induisent un effet antagoniste avec un taux d adduits environ 2 fois moins important compar a une exposition au tamoxif ne seul Bien que la formation d adduits a l ADN soit elle aussi dose d pendante p lt 0 05 lorsque les trois mol cules sont pr sentes simultan ment en solution CTC les r sultats montrent clairement que la g notoxicit est significativement plus faible p lt 0 01 que celle induite par les m langes CIP TAM figure 53 La comparaison globale entre les types de m langes binaires et ternaires met en vidence l effet antagoniste du cyclophosphamide en m langes De plu
24. Halling Sorensen B 2000 Drugs in the environment Chemosphere 40 691 699 K Kaiser K L E Ribo J M 1988 Photobacterium phosphoreum toxicity bioassay Toxicity data compilation Toxicity Assessment International Journal 3 795 237 Kamat A M DeHavena J l Lamma D L 1999 Quinolone antibiotics a potential adjunct to intravesical chemotherapy for bladder cancer Urology 54 1 56 61 Kanuri M Minko I G Nechev L V Harris T M Harris C M Lloyd R S 2002 Error prone translesion synthesis past gamma hydroxypropano deoxyguanosine the primary acrolein derived adduct in mammalian cells Journal of Biological Chemistry 277 18257 18265 Kawanishi S Hiraku Y Murata M and Oikawa S 2002 The role of metals in sitespecific DNA damage with reference to carcinogenesis Free Radical Biology amp Medicine 32 822 832 Keher J P Biswal S S 2000 The molecular effects of acrolein Toxicological Sciences 57 1 6 15 Kerbusch T De Kraker J Keizer H J Van Putten J W Groen H J Jansen R L Schellens J H Beijnen J H 2001 Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of ifosfamide and its metabolites Clinical Pharmacokinet 40 41 62 Ketterer B Meyer D J Taylor J B Pemble S Coles B Fraser G 1990 GSTs and protection against oxidative stress In Glutathione S transferases and drug resistance Hayes J D Pickett C B and Mantle T J Eds Taylor and Francis London 9
25. HepG2 cells MutationResearch 468 213 225 V Vandenberg L N Colborn T Hayes T B Heindel J J Jacobs D R Jr Lee D H Shioda T Soto A M vom Saal F S Welshons W V Zoeller R T Myers J P 2012 Hormones and endocrine disrupting chemicals low dose effects and nonmonotonic dose responses Endocrine Reviews 33 378 455 Vannini C Domingo G Marsoni M De Mattia F Labra M Castiglioni S Bracale M 2011 Effects of a complex mixture of therapeutic drugs on unicellular algae Pseudokirchneriella subcapitata Aquatic Toxicology 101 459 465 Varadhachary G R Hoff P M 2005 Front line therapy for ad avanced colorectal cancer Emphasis on chemotherapy Seminar of Oncology 32 6 9 40 42 Vasseur P Cossu Leguille C 2003 Biomarkers and community indices as complementary tools for environmental safety Environment International 28 711 717 Verlicchi P Al Aukidy M Galletti A Petrovic M Barcelo D 2012 Hospital effluent investigation of the concentrations and distribution of pharmaceuticals and environmental risk assessment The Science of the Total Environment 430 109 118 Vindimian E 2006 Probl matique des substances a risque In Conf rence Eau et Sant Eaux pluviales etassainissement nouvelles pr occupations sanitaires GRAIE Grand Lyon et ASTEE 10 10 2006 Lyon Villeurbanne 55 73 Volatier L 2004 R ponse d une communaut p riphytique un effluent
26. Journal of Hazardous Materials 175 1 3 45 95 Schaeffer R C 1979 Failure of antivenin or corticosteroids to prevent lethal rattlesnake venom shock in the rat R C Schaeffer Jr R W Carlson and M H Weil Shock Research Unit University of Southern California Los Angeles USA Toxicon 17 163 Schaider L A Rudel R A Ackerman J M Dunagan S C Brody J G 2014 Pharmaceuticals perfluorosurfactants and other organic wastewater compounds in public drinking water wells in a shallow sand and gravel aquifer Science of the Total Environment 468 469 384 393 Schlosser M J Shurina R D Kalf G F Prostaglandin H synthase catalyzed oxidation of hydroquinone to a sulfhydryl binding and DNA damaging metabolite Chemical Research in Toxicology 3 333 339 Schulman L J Sargent E V Naumann B D Faria E C Dolan D G Wargo J P 2002 A Human Health Risk Assessment of Pharmaceuticals in the Aquatic Environment Human and Ecological Risk Assessment 8 657 680 Schwartz T Kohnen W Jansen B Obst U 2003 Detection of antibiotic resistant bacteria and their resistance genes in wastewater surface water and drinking water biofilms FEMS Microbiology Ecology 43 3 325 335 Scripture C D Sparreboom A Figg W D 2005 Modulation of cytochrome P450 activity implications for cancer therapy The Lancet Oncology 6 780 789 180 Bibliographie Seidegard J and Ekstrom G 1997 The role of hum
27. L o 2 60 a 40 o 2 ol ro f 9 20 amp z 40 xe 3 60 oa xx a m 80 xe a a a 100 control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 November December January Samples Figure 58 Inhibition de la bioluminescence de la bact rie Vibrio fischeri expos e 30 min diff rents chantillons d eaux 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s valeurs moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement Quel que soit l chantillon test on constate un impact sur la bioluminescence des bact ries Les chantillons pr lev s en Novembre N1 N2 N3 D cembre D1 D2 D3 ainsi que l chantillon en sortie de STEP pr lev en janvier J3 augmententsignificativement p gt 0 01 la bioluminescence des bact ries de 40 60 compar au contr le Cette augmentation de la bioluminescence li e une activationde la cha ne respiratoire des bact ries pourrait s expliquer par un ph nom ne de prolif ration cellulaire Au mois de novembre il n y a pas de diff rence significative entre les diff rentes zones de pr l vement En d cembre l augmentation de la bio
28. Nicotinamide ad nine dinucl otide phosphate forme r duite R paration par excision de nucl otides Non Observed Concentration Effect concentration sans effet observ Nucl ase P1 Normes de Qualit Environnementale Organisation du commerce et du d veloppement economique Organisation mondiale de la sant Olive Tail Moment Phosphate Buffer Saline ou Tampon phosphate salin PolyChloroBiph nyle Predictive Environmental Concentration concentration environnementale pr visible Poly thyl ne imine Prostaglandine H synth tase Peroxydation lipidique Poids mol culaire Predictive No Effect Concentration concentration sans effet pr visible sur l environnement R sonnance magn tique nucl aire Esp ces r actives de l oxyg ne Sodium dod cyl sulfate M lange de NaCl de TRIS et d EDTA Phosphodiest rase de rate Station d puration S rum de veaux f tal contenant des anticorps antitrypsine Tampon de trishydroxym thylaminom thane United States Environmental Protection Agency Ultra violet Yeast Estrogen Screen levure exprimant le r cepteur aux strog nes hERa Yeast Androgen Screen levure exprimant le r cepteur aux androg nes hAR xvii xviii xix Liste des figures Xxi Liste des figures Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 6 Figure 7 Figure 8 Figure 9 Figure 10 Figure 11 Figure 12 Figure 13 Figure 14 Figure 15 Figure
29. One Solution Cell Proliferation Assay R G3580 non radioactif achet chez Promega Allemagne contenant la solution MTS 1 5 2 6 Principe Tr s r pandu dans le monde scientifique pour sa simplicit et sa rapidit d analyse de la toxicit de compos s chimiques sur des cellules humaines le test MTS est une alternative plus sensible Cory etal 1991 du test MTT mis au point dans les ann es 80 pour valuer le nombre de cellules viables Mosmann 1983 De mani re g n rale l essai MTS est un test colorim trique de prolif ration cellulaire fond sur l activit m tabolique des cellules viables Il mesure l activit des enzymes mitochondriales les succinates d shydrog nases qui r duisent le MTS 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 5 3 carboxymethoxyphenyl 2 4 sulfophenyl 2H tetrazolium un t trazole de couleur jaune en formazan figure 17 Les cristaux de formazan form s sont ainsi d tectables par spectrophotom trie une longueur d onde de 570 nm 68 Mat riels amp M thodes Cet essai poss de deux avantages par rapport au test MTT le m lange MTS PMS est plus r actif que le MTT et le produit form est soluble dans l eau Ce nouvel essai est donc th oriquement plus sensible que le test MTT OCH COOH soz OCH COOH ar de U3 wes OL y AsO S Ne ile CHa N N HS CH3 X xx CH3 CH3 MTS 2 Formazan Figure 17 Structure du MTS t trazolium et son produit le formazan La mitoc
30. Perte du contrdle de la prolif ration R sistance l apoptose l Cancer Figure 4 Vue g n rale des diff rents modes d action des canc rog nes chimiques g notoxiques et pig n tiques d apr s Luch 2005 29 Synth se bibliographique 11 3 1 Les tapes de la canc rogen se Parmi les ph nom nes provoquant l apparition du cancer l intervention de substances chimiques tels que les compos s pharmaceutiques exog nes tient une place importante L apparition d un cancer au niveau individuel r sulte d une interaction complexe entre des facteurs exog nes de nature environnementale et des facteurs endog nes g n tiques ou acquis Le processus de la canc rogen se est caract ris par quatre phases successives figure 5 a put Procanc rog nes Milieu ext rieur g Organisme f Procanc rog nes Activation Pal N m tabolique g D toxification Canc rog ne ultime Canc rog ne non g notoxique g notoxique Elimination R paration ER Ak rations g n tiques lt lt H_ R plication de l ADN et fixation des l sions g n tiques mutations Activation des oncog nes Inactivation des g nes Cellule initi Suppresseurs de tumeur PROMOTION L sion pr canc reuse Ss PROGRESSION INVASION Tumeur maligne Cancer Figure 5 Les principales tapes de la canc rog n se chimique 30 Synth se bibliographique L initiation
31. Ryu JC Sasaki YF 2000 Single cell gel comet assay guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing Environ Mo Mutagen 35 206 221 Tjan Heijnen VC Postmus PE Ardizzoni A Manegold CH Burghouts J van Meerbeeck J Gans S Mollers M Buchholz E Biesma B Legrand C Debruyne C Giaccone G 2001 Reduction of chemotherapy induced febrile leucopenia by prophylactic use of ciprofloxacin and roxithromycin in small cell lung cancer patients an EORTC double blind placebo controlled phase III study Ann Oncol 12 1359 1368 Uhl M Helma C Knasmiller S 2000 Evaluation of the single cell gel electrophoresis assay with human hepatoma HepG2 cells Mutation Res 468 213 225 John Wiley amp Sons Inc Page 24 of 42 Page 25 of 42 J O O1 BR D 771 772 773 774 775 776 777 778 779 780 781 782 783 784 785 786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 796 797 798 799 800 801 802 803 Environmental and Molecular Mutagenesis Vandenberg LN Colborn T Hayes TB Heindel JJ Jacobs DR Lee D H Shioda T Soto AM vom Saal FS Welshons WV Zoeller RT Myers J P 2012 Hormones and endocrine disrupting chemicals low dose effects and nonmonotonic dose responses Endocr Rev 33 378 455 Verlicchi P Al Aukidy M Galletti A Petrovic M Barcel D 2012 Hospital effluent investigation of the concentrations and distribution of pharmaceuticals and environmental risk a
32. Voie de m tabolisation du tamoxif ne aboutissant la formation d adduits l ADN d apr s Shibutani et al 2003 Gamboa Da Costa et al 2001 2007 121 Sch ma possible d interaction entre les mol cules en m lange au niveau des diff rentes voies de m tabolisation propos partir des voies de m tabolisation du cyclophosphamide mis en vidence par Huang et al 2000 et celle du tamoxif ne par Desta et al 2004 nan ner ne een sees 123 Situation g ographique de la zone d tude et des points de pr l vements 00c00 131 Repr sentation sch matique de la zone d chantillonnage cccceccccesssseeessteeeeesseeeeees 132 Inhibition de la bioluminescence de la bact rie Vibrio fischeri expos e 30 min diff rents chantillons d eaux 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 134 Inhibition de la croissance de l algue P subcapitata expos e 72 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de station d puration STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 135 XXiV Liste des figures Figure 60 Figure 61 Figure 62 Figure 63 Figure 64 Figure 65 Figure 66 Figure 67 Figure 68 Figure 69 Taux de viabilit de cellule h patique HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rents chantillons 1
33. a t d velopp commercialement par la compagnie Microbics et mis sur le march en 1978 Bulich 1979 1986 Il est pr sent vendu et utilis partout dans le monde ce qui a donn une litt rature scientifique importante et une banque de donn es appr ciable sur les contaminants Kaiser amp Ribo 1988 L essai a connu un succ s rapide pour le suivi de la toxicit d effluents de stations d puration domestiques et industrielles du fait de sa commercialisation sous forme lyophilis e ne n cessitant pas d installation d levage Jean 1991 Santiago et al 2002 45 Synth se bibliographique Les qualit s du Microtox sont la simplicit la rapidit la reproductibilit la sensibilit et le d signent comme choix logique pour une pr valuation screening de la toxicit ou au sein d une batterie Ce test de surcro t ne requiert que de petits volumes d chantillons ce qui augmente son int r t On peut galement noter qu il ressort d une fa on g n rale que le Microtox est d une sensibilit comparable aux autres tests bas s sur les daphnies les poissons et les algues Qureshi et al 1982 Ribo amp Kaiser 1983 Beaubien et al 1986 et fournit une bonne corr lation lin aire avec ces esp ces Ribo amp Kaiser 1983 Blum amp Speece 1991 111 2 1 b Le test Algaltox F Le test Algaltox FTM est un test de toxicit simple et standardis AFNOR T 90 304 qui utilise une suspension d alg
34. actifs Ketterer et al 1990 Elles m tabolisent entre autres des canc rog nes des polluants environnementaux des m dicaments chimioth rapeutiques des produits provenant du stress oxydatif et des substances endog nes comme le leucotri ne A4 et la prostaglandine H2 Hayes amp Pulford 1995 Toutefois bien que la conjugaison au glutathion soit un processus d toxifiant dans certains cas elle peut accentuer la toxicit des x nobiotiques et activer des procarcinog nes Seidegard amp Ekstrom 1997 Monks et al 1990 Quatre m canismes sont l origine de cette toxification entra nant la formation de Quinones thiocyanates etnitrosoguanidine suite une d halog nation des alcanes ou alc nes halog n s lons pisulfonium lectrophiles partir d alcane dihalog n s D riv s n phrotoxiques suite l action de la B lyase dans le rein D riv s de quinones quinone imines ou isothiocyanates pouvant provenir de l action de la y glutamyltranspeptidase dans le rein 11 2 Interactionsentre les x nobiotiques dans l organisme Les x nobiotiques ne pr sentent pas tous le m me degr de toxicit qui peut tre faible ou fort et qui s explique par les diff rences entre les structures chimiques des substances Ces diff rences peuvent affecter leurs capacit s perturber le fonctionnement de l organisme A l heure actuelle l valuation du risque co toxicologique est centr e sur u
35. amp Discussion Partie 1 105 100 95 90 85 80 1 4 Evaluation de la viabilit de cellules humaines test MTS Nous avons expos deux types de lign es cellulaires humaines h patique HepG2 et mammaire MCF 7 a diff rentes concentrations de nos mol cules th rapeutiques seules ou en m langes L entr e en apoptose des cellules ou leur mort par n crose est refl t e par un ralentissement de l activit m tabolique Le test MTS permet de mesurer cette baisse d activit m tabolique 1 4 1 Evaluation de la viabilit des cellules h patiques HepG2 l 4 1 a Toxicit respective et en m langes de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide en doses croissantes La viabilit des cellules h patiques HepG2 a t mesur e apr s 24 h mimant une toxicit aigu et 72 h d exposition mimant une toxicit chronique des concentrations non th rapeutiques de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide seuls ou en m lange Les r sultats sont respectivement pr sent s dans les figures 31 et 32 et sont exprim s en moyenne des valeurs de 15 mesures triplicata de 5 points de mesure L exposition des cellules une doses de 10 ng L de ciprofloxacine ou de tamoxif ne r duit significativement la viabilit p lt 0 01 figure 31 A et l inhibition est temps d pendante figure 31 B A 72 h les doses de ciprofloxacine comprises entre 100 ng L et 100 pg L induisent une toxicit
36. antibiotique modulateur hormonal anticanc reux repr sentent un risque non n gligeable dans lapparition de processus de canc rog n se chez des individus expos s de mani re chronique de faibles doses 32 Synth se bibliographique 11 3 3 a Tableau de synth se g n rale Cyclophosphamide Tamoxif ne Ciprofloxacine D Endoxan D Kessar gt Ciproflox D Cytoxan gt Noltam D Ciloxan D Neosar gt Nolvadex D Ciprobay D Procytox gt Tamofen D Ciprobid Synonymes D Revimmune D Tamoxasta D Euciprin D N bis 2 chloroethyl 1 3 2 oxazaphosphinan 2 amine 2 D Tamoxifen citrate D Z Tamoxifen citrate D Cipro IV 1 cyclopropyl 6 fluoro 4 oxo 7 1 piperazinyl oxide gt Terimon 14 dihydro 3 D Zynoplex quinolinecarboxylique acid Formule chimique C7H15Cl2N202P Co6H29NO Ci7HigFN303 Num ro CAS 85721 33 1 54965 24 1 50 18 0 Aspect Poudre blanche Poudre blanche Poudre l g rement jaune Poids mol culaire 261 1 g mol 563 62g mol 331 38g mol Temps de vie 3 12 heures 5 7 jours 4 7 heures Point de fusion 65 66 C 97 C 255 257 C Biotransformation H patique H patique H patique de liaison prot ique gt 60 N A 20 40 e Soluble dans l eau 1 25 et l thanol e L g rement soluble dans Benz ne thyl ne glycol e 0 5mg L dans l eau 37 C e HCI 0 02N 0 2mg L e 1 1mg L dans l eau 37 C Solubilit g t trachloride de carbone e
37. cepteurs aux strog nes lign es T leukaemicJurkat et cellules canc reuses d ovaire A2780 ont montr que le tamoxif ne est capable d induire l apoptose des cellules par induction du stress oxydatif suivi d un dysfonctionnement mitochondrial et de l activation de capsases Zhou et al 2005 Enfin il agit galement comme un inhibiteur des P glycoprot ines La m tabolisation du tamoxif ne se fait principalement au niveau du foie Chez les patients trait s les principaux m tabolites circulant sont le N desmethyl tamoxif ne et le 4 hydroxytamoxif ne qui ont tous les deux des propri t s anti cestrog nes figure 8 Le N desmethyltamoxif ne principal m tabolite dans le s rum a une demi vie deux fois sup rieure a celle du tamoxif ne et a un mode d action similaire m me s il est un peu moins actif que la mol cule m re O Neill et al 2004 Il est form pr f rentiellement par l activit du CYP3A4 mais des tudes in vitro avec des CYPs recombinants humains ont galement indiqu une contribution des CYP2B6 2C9 2C19 et 3A Crewe et al 1997 Boocock et al 2002 Coller et al 2003 Les autres m tabolites sont form s par l activit des CYP3A4 2B6 et 2D6 principalement 35 Synth se bibliographique Tamoxifen CYP 3A4 CYP 3A4 5 CYP 2D6 CYP 3A5 2B6 2C9 2019 3A 2B6 2C9 2019 3A v M tabolites a hydroxy TAM N desmethyl TAM 4 hydroxy TAM PERS M ta
38. d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 136 Taux de viabilit de cellule mammaires MCF 7 expos es 24 h et 72 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 137 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs cestrog niques YES de levures S cerevisiae expos es diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs A Novembre B D cembre C Janvier 138 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs androg niques YAS de levures S cerevisiae expos es diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs A Novembre B D cembre C Janvier 139 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules h patique HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 140 Taux de cassures l ADN induites sur les cellules mammaires MCF 7 expos es 24 h et 72 h diff rents chantillons 1 d effluents hospital
39. e des r sultats lorsque le g nome des organismes tudi est peu connu La situation est moins critique actuellement pour les poissons que pour les invert br s aquatiques l exclusion de quelques esp ces mod les et d int r t conomique comme l hu tre Des modifications de l expression g n tique peuvent t moigner de l induction de m canismes de r sistance et d adaptation des populations expos es aux facteurs de stress environnementaux Il est donc certain que l cotoxicog nomique permettra sous peu de d velopper une approche bas e sur l tude de biomarqueurs g nomiques qui aideront a l tablissement des crit res de qualit de l environnement aquatique sur une base m canistique Nos travaux peuvent encore largement tre am lior s et des tudes compl mentaires devraient tre men es court terme via une approche de toxicog nomique sur nos mol cules mod les ainsi que sur des effluents bruts La d termination du niveau d expression de certains g nes CYP par exemple ou l valuation de la m thylation de l ADN par HPLC seraient des approches int ressantes Ces techniques sensibles et reproductibles pr sentent l avantage d tre rapide et peu contraignante dans la mise en place des exp riences Mais les principales tudes compl mentaires pr vues pour la suite de l tude concernent avant tout l valuation de la g notoxicit des mol cules mod les et des effluents sur le mod le v g tal Lemna
40. facteur 10 la condition 3 aux concentrations retrouv es en station d puration facteur 2 enfin les conditions 1 et 2 aux concentrations retrouv es dans l environnement Tous ces r sultats sont compar s la condition 0 repr sentant la condition contr le t moin non expos lll Outils d valuation en cotoxicologie 111 1 Typologie des strat gies de caract risation des effets en cotoxicologie D s le d but des ann es 70 se posait la question d un risque croissant pour la sant et l environnement li au d veloppement de l industrie chimique et qui au milieu du 20 me si cle apparaissait comme la cl de l am lioration des conditions de vie Forbes amp Forbes 1997 Il soulignait d ja les besoins de connaissances et de recherche sur le devenir et les effets des produits chimiques dans l environnement Bien que des am liorations soient encore apporter les concepts et la d marche en cotoxicologie sont maintenant largement int gr s dans les mesures visant a contr ler les apports de contaminants chimiques dans les milieux Ils fondent en partie la r glementation de mise sur les march s des substances chimiques des pesticides des substances pharmaceutiques a usage humain et v t rinaire ainsi que la gestion des milieux r cepteurs normes de rejets normes de qualit environnementale pour informations suppl mentaires voir Rapport 5 journ e de la ZABR 2009 th se de C Boillot 2008 L
41. l inactivation des m tabolites r actifs ou encore l inactivation intracellulaire d enzymes du m tabolisme Knasm ller et al 1998 1999 Uhl et al 2000 54 Synth se bibliographique 111 2 2 c 2 2 Les cellules mammaires humaines MCF 7 MCF 7 est l acronyme de Michigan Cancer Foundation 7 en r f rence l institut de Detroit o la lign e fut tablie en 1973 par Herbert Soule et son quipe Soule et al 1973 Etablie en culture in vitro partir d un panchement pleural pr lev chez une patiente de 69 ans atteinte d un cancer du sein m tastatique la lign e MCF 7 ATCC HTB 22 a t a l origine d une bonne partie des connaissances actuelles sur le cancer du sein Levenson 1997 Elles sont canc reuses non m tastatiques et conservent plusieurs caract ristiques de l pith lium mammaire diff renci y compris la capacit de traiter l stradiol par l interm diaire des r cepteurs cytoplasmiques cestrog niques ou encore la capacit de former des d mes qui contiennent l oncog ne Tx4 La plupart des carcinog nes mammaires humains potentiels n cessitent une multitude d tape de catalyse enzymatique avant d tre convertis en m tabolites r actifs de l ADN Ces tapes peuvent passer soit par une voie m tabolique primaire h patique suivie d une conjugaison secondaire avec un groupement chimique appropri soit par une activation m tabolique in situ au niveau du sein soit par une combinais
42. m tabolisation Lu amp Huang 1994 Ces cellules expriment notamment une grande vari t d enzymes de phase cytochromes P450 1A1 1A2 2B 2C 3A et 2E1 arylhydrocarbone hydrolase nitror ductase N d m thylase catalase peroxydase NAD P H cytochrome c reductase cytochrome P450 reductase et NAD P H quinone oxidor ductase et de phase Il poxyde hydrolase sulfotransf rase glutathione S transf rase glucuronosyl transf rase et N ac tyl transf rase Knasm ller et al 1998 En raison de leur expression endog ne d une grande vari t d enzymes m tabolisant les x nobiotiques et propri t s antioxydantes les cellules HepG2 sont des indicateurs valables des compos s ayant des propri t s g notoxiques ainsi que pour d tecter les effets combin s de m langes de mol cules Mersch Sundermann et al 2004 Zegura et al 2009 Les observations les plus int ressantes montrent notamment que les cellules sont particuli rement sensibles aux hydrocarbures aromatiques polycycliques et permettent de d tecter la g notoxicit d un nombre important de carcinog nes tels que les mycotoxines alors que les r sultats obtenus avec d autres bioessais taient n gatifs Des tudes soulignent aussi leur utilit dans les recherches d antimutag nicit o les cellules HepG2 peuvent permettre d identifier des m canismes non d tect s par des tests in vitro conventionnels tels que l induction d enzyme de d toxification
43. niques de taille variables de 2 a 138 isoformes De mani re g n rale on distingue plusieurs types de peroxydase sous divis s en plusieurs familles de prot ines Les peroxydases h me famille des cyclooxyg nases ex prostaglandines H synthases dont ela COX 1 ou PGHS 1 exprim e constitutivement dans la plupart des tissus o elle participe au maintien de l hom ostasie cellulaire Garavito amp DeWitt 1999 ela COX2 ou PGHS 2 exprim e constitutivement seulement dans quelques tissus tels que le cerveau la prostate la moelle pini re les reins et tissus pathologiques 25 Synth se bibliographique comme les cellules canc reuses du colon entre autres Simmons et al 1991 Harris et al 1994 Breder et al 1995 peroxydase 2 h mes ex cytochromes C famille des catalases famille des peroxydases DyP type tr s r pandues chez les bact ries et champignons peroxydases de classe ex ascorbate peroxydase cytochrome C peroxydase peroxydases de classe II ex lignine peroxydase Les peroxydases sans h me famille des alkylperoxydases D et assimil es haloperoxydases ex mangan se catalase glutathione peroxydase peroxyr doxines ex peroxyr doxines NAD P H oxydases ex NADPH oxydases d shydrog nase 1 1 2 6 Implication dans la m tabolisation des x nobiotiques La bioactivation de x nobiotiques par l activi
44. primant la voie de l apoptose conduisant la mort cellulaire soit en participant la croissance et la diff renciation cellulaire au travers de la production de prostaglandines pour un article g n ral voir Prescott amp Fitzpatrick 2000 26 Synth se bibliographique Il 1 3 Les glutathion S transf rases 11 1 3 a Localisation et fonction Les Glutathion S transf rases GSTs repr sentent une famille enzymatique de phase Il pr sentes chez les eucaryotes et les procaryotes dont la fonction est principalement d toxifiante lutte contre le stress oxydatif Chez l Homme il existe au moins 20 isoenzymes de GST cytosoliques class es en 5 familles GST de classe alpha mu pi sigma et theta Miller et al 1997 De plus il existe deux types de GST les unes membranaires les autres microsomales dont les leucotri nes C4 synthases LTC4S Otieno et al 1997 11 1 3 b Implications dans le m tabolisme des x nobiotiques Les GST poss dent principalement deux activit s Hayes amp Pulford 1995 Conjuguer des compos s lectrophiles endog nes exog nes par formation d un pont thioether avec le glutathion r duit Les produits peuvent tre excr t s dans la bile ou transport s dans le rein o ils sont m tabolis s en acide mercapturique puis excr t s dans l urine Prot ger la cellule par leur activit peroxydasique qui consiste r duire les peroxydes organiques en compos s moins r
45. se est une r ponse biphasique en fonction de la dose qui r sulte le plus souvent de l action d agoniste et d antagoniste partiels pour les r cepteurs mis en jeu C est le cas notamment du tamoxif ne qui est un perturbateur endocrinien et qui induit des effets agonistes et antagonistes au niveau des r cepteurs aux strog nes Coezy et al 1982 Vandenberg et al 2012 De faibles doses stimulant l apparition d une r ponse horm tique pourraient entrainer des effets ind sirables dans l environnement comme notamment la prolif ration de bact ries pathog nes Randall et al 1947 ou l activation de la prolif ration de cellules tumorales du certains m dicaments anticanc reux Calabrese et al 2005 2013 Dans le cas d agents chimioth rapeutiques tel que le 126 R sultats amp Discussion Partie 1 cyclophosphamide la stimulation par les faibles doses semble refl ter une adaptation du tissu tumoral Les r sultats pr sent s dans cette premi re partie obtenus a partir de l ensemble de ces bioessais et biomarqueurs confirment la fois l importance du choix du test lors d une analyse de la toxicit mais sugg rent aussi leur utilisation en batterie de test De plus au vu des diff rentes r ponses observ es l analyse individuelle de x nobiotiques l valuation de dose environnementale unique ou les mesures faites a un seul temps d exposition permettent difficilement de caract riser un effet pr cis
46. spontaneously breaks down into the reactive metabolites phosphoramide mustard and acrolein Kerbish et al 2001 Huang et al 2000 Phosphoramide mustard is an active bifunctional alkylating agent that has been shown to bind to the N 7 position of guanine to the phosphate backbone of DNA and to interact with the O6 position of guanine resulting in DNA cross links and cytotoxicity Bohnenstengel et al 1996 Being a bifunctional electrophile acrolein also reacts with DNA bases to form several exocyclic DNA adducts among which the y HOPdG 8 hydroxy 5 6 7 8 tetrahydropyrimidof 1 2 a purin 10 3H one 1 N2 y hydroxypropano deoxyguanosine Chung et al 1984 Pawlowicz et al 2006 The reason why no DNA adducts has been shown is due to the fact that the technique of DNA adduct used in this study enrichment by nuclease P1 did not allow the analysis of alkylation or ethenobase Separation of DNA adducts by HPLC permit to detect acrolein adduct data not shown Repair of alkylation or cross link induced abasic site and DNA breaks Nevertheless in our conditions of incubation we did not observe any DNA breaks when the cells were exposed to CP alone Mater et al 2014 This is in line of the studies of Uhl et al 2000 and Yusuf et al 2000 on hepatic cells and of Perry et al 1995 and Ohno et al 2008 on MCF7 who observed DNA breaks only after exposure to CP over 1mg L Thus the absence of DNA breaks and DNA adduct can also be due to the low doses o
47. t pr par es et distribu es suivant un profil d termin pour obtenir un duplicata de chaque concentration ou m lange test et du t moin Chaque erlen a re u 49 mL de solution d essai avec de l eau d ionis e 1 mL additionn de solution nutritive et d inoculum algal figure 14 L inoculum a t pr par partir d une culture d algue en phase exponentielle de croissance de 4 7 jours et les concentrations finales en nutriments sont donn es en annexes La sensibilit des algues est v rifi e par un essai avec du chlorure de dichromate de potassium comme t moin positif pour valider l inhibition des algues gt 95 Chacun des erlen est homog n is puis r partis dans deux cellules cuves d une contenance de 25 mL puis une mesure de la D O est effectu e to sur l ensemble des cellules pr par es La densit cellulaire initiale tait de 1 106 cellules mL Les cuves sont ensuite incub es a une temp rature 62 Mat riels amp M thodes constante de 24 2 C et sous un clairage continu de 10 000 lux durant 72 h puis la concentration d algues cellules mL est nouveau mesur e l aide d un spectrophotom tre L essai est statique et les mesures de D O sont faites tous les jours pendant 72 h afin de suivre le bon d roulement de l exp rience Figure 14 Dispositif exp rimental de l essai Algaltox FTM Calcul de l effet inhibiteur de chaque dilution Pour chaque chantillon t
48. valeurs moyennes de 4 points de mesures deux s ries r alis es en duplicata Compte tenu du grand nombre d chantillons analys s lors des travaux de th se et du fait de la manipulation de source radioactive au laboratoire nous avons focalis notre attention sur un nombre restreint de temps d exposition Une premi re approche a t faite avec l exposition des deux lign es cellulaires HepG2 et MCF 7 pendant 7 16 et 24 h a quelques concentrations de m dicaments seuls ou m langes Quelle que soit la condition test e aucun adduit n a t observ apr s 7 h et 16 h d exposition Nous avons donc choisi de poursuivre nos analyses uniquement a 24 h d exposition 11 3 1 Analyse de la formation d adduits a l ADN sur cellules h patiques HepG2 L exposition des cellules h patiques HepG2 a la ciprofloxacine et au cyclophosphamide n induit pas de formation d adduits l ADN et ce quelle que soit la concentration A l inverse le tamoxif ne induit la formation d adduits a l ADN Un exemple de profils types obtenus apr s l exposition des cellules est pr sent dans la figure 48 Suivant les conditions test es un trois adduits caract ristiques num rot s 1 3 sont form s lorsque le tamoxif ne est pr sent seul ou en m lange 111 R sultats amp Discussion Partie 1 figure 48 L exposition au tamoxif ne seul figure 48 B entraine la formation de deux adduits individuels 1 2 Quelle que so
49. 0 C a 13 000 rpm Sigma 1K15 puis le surnageant est limin et les acides nucl iques sont resuspendus dans de l thanol froid pur 20 C 1 5 4 c 2 Purification de l ADN L ARN est limin par l action de RNAses Dans un premier temps le m lange de RNAse A 20mg mL et de RNAse T1 10000 Ul mL est dissous dans de l eau ultra pure Le m lange est mis bouillir 100 C pendant 15 min pour d truire les DNAse On rajoute 10 uL du m lange de Rnases 75 Mat riels amp M thodes L ensemble est incub une heure suppl mentaire a 37 C Pour d truire les prot ines 25 uL de Prot inase K 20 mg mL dissous dans du SET sont ajout s au m lange qui est incub une heure 37 C La purification de l ADN se poursuit par ajout de 500 uL 1 Volume de Rotiph nol Roth Sichel ph nol satur en tris pH 8 Le m lange est agit m caniquement pendant 20 min Le m lange est centrifug 13 000 rpm pendant 15 min 15 C Sigma 1K15 Le surnageant est r cup r dans des microtubes Cinq cents uL de SEVAG 24v Chloroforme 1v Alcool isoamylique sont ajout s au surnageant On agite 20 secondes puis on centrifuge 5 min 13 000 rpm Sigma 1K15 Le surnageant qui doit tre limpide est r cup r Deux volumes d thanol froid pur 20 C et 50 uL d ac tate de sodium 3 M sont ajout s Les pelotes apparaissent imm diatement Les solutions d ADN sont laisser 1 nuit 20 C 1 5 4 c 3 Es
50. 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell Figure 7 Total DNA adducts level per 10 nucleotides in MCF 7 cells exposed to CIP TAM hatched or CTC stippling during 24h The results are expressed as median value SD corresponding to the median value of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically significant at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell significant difference at p lt 0 05 between exposure to three drugs CTC compared to CIP TAM The concentration exposure are described in table 1 section 2 3 Figure 8 DNA adduct pattern of DNA 4ug from HepG2 cells exposed to A ultrapure water negative control B hospital effluent C WWTP inflow D WWTP outflow Figure 9 DNA adduct pattern of DNA 4ug from MCF 7 cells exposed to A ultrapure water negative control B hospital effluent C WWTP inflow D WWTP outflow Figure 10 Total DNA adducts level per 10 nucleotides in HepG2 cells exposed during 24h to Hospital effluent black WWTP inflow effluent gray and WWTP outflow effluent light gray The results are expressed as median value SD corresponding to the median value of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically significant at p lt 0 01 compared to control cell a significant difference p lt 0 05 between exposure to hospital effluent compare to other conditions b significant difference p lt 0 05 between WWTP inflow compare to the o
51. 1 E Ca x 1 E Cb 1 E Cmix ou E Ca est l effet induit par le compos A seul E Cs l effet induit par le compose B seul et E Cmix est l effet observ lorsque les 2 compos s sont m lang s ensemble En d autre terme si le ratio valeur attendue E valeur observ e O 1 l interaction est strictement additive si le ratio est gt 1 l interaction est synergique et enfin si le ratio est lt 1 l interaction est antagoniste M langes de Condition mol cule 1 2 3 4 5 CIP TAM att 89 42 86 53 83 28 68 24 40 68 CIP TAMobs 83 44 1 23 94 62 6 91 91 1 8 44 84 44 1 21 40 3 2 71 E O 1 07 0 91 0 91 0 81 1 01 CTC att 83 46 78 09 74 97 58 75 32 58 CT Cobs 81 97 2 35 81 97 1 84 86 73 4 26 83 67 1 54 58 84 3 25 E O 1 02 0 95 0 86 0 7 0 55 Tableau 9 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de culture de Lemna minor expos es pendant 7 jours a des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC E O repr sente le ratio entre valeur attendue E et valeur observe O A partir de ces r sultats on constate tout d abord qu ind pendamment du type de m lange test les effets induits sont variables et dose d pendants En effet on observe que les ratios E O des m langes CIP TAM et CTC test s a la condition 1 induisent un effet synergique ratios E O gt 1 Outre le m lange CIP TAM condition 5
52. 10 jours aux conditions d exp rience Le milieu de dilution est le milieu normalis Steinberg modifi pH gt 4 6 d taill en annexes Lors de l exp rience une s rie de trois erlens contenant chacun 100 mL de milieu de culture est pr par e pour chaque chantillon tester ainsi que pour le t moin Les solutions tester sont additionn es au milieu puis 3 colonies de 2 ou 3 frondes sont introduites dans chaque erlen Cet essai statique est r alis pendant 7 jours dans un phytotron a 24 2 C sous clairage continu de 8 000 lux et pour une photop riode de 14 h de jour et 10 h de nuit figure 15 A la fin de l essai les frondes sont d nombr es pes es et le pH mesur pour valider l essai Figure 15 Dispositif exp rimental de l essai sur Lemna minor Calcul de l effet inhibiteur de chaque dilution Le calcul de l inhibition de la croissance de L minor est identique celui effectu dans le cadre de l essai d inhibition de croissance de la population de P subcapitata cf Mat amp Meth 1 2 2 Crit res de validit de l essai Le taux de croissance obtenu pour le lot t moin est d au moins 0 275 par jour La sensibilit de la souche est contr l e par un essai avec le chlorure de potassium dont la CEso nombre de frondes est comprise entre 5 5 et 10 0 g L 4 Evaluation du potentiel perturbateur endocrinien test YES YAS 1 4 1 Principe Le test in vitro YES YAS utilis est bas
53. 100 ug L CIP 10 ug L TAM condition 5 Concernant les m langes des trois mol cules on observe galement une dose r ponse en U mais avec un d calage dans les doses La r ponse de toxicit d croit mais reste significative p lt 0 05 par rapport au t moin lorsque les concentrations des mol cules dans les m langes augmentent L addition de cyclophosphamide aux m langes binaires CIP TAM entraine une r ponse antagoniste On constate notamment que l addition de 10 ng L CP au m lange de 10 ng L CIP 10 ng L TAM entraine 20 d inhibition de la bioluminescence p lt 0 01 alors qu en m lange binaire il n y avait aucun effet Le CP joue donc le r le de potentialisateur A l inverse l ajout de CP pour les conditions 2 3 et 4 att nue la toxicit en diminuant presque de moiti l inhibition de la bioluminescence Le m lange des trois m dicaments aux doses les plus fortes condition 5 entraine une toxicit significative p lt 0 05 89 R sultats amp Discussion Partie 1 Enfin il est important de souligner que l o un traitement de 100 ug L CIP seul entrainait une inhibition de la bioluminescence de 40 p lt 0 01 l addition de 10 ug L TAM ou l addition de 10 ug L TAM 10 ug L CP conditions 5 entraine dans les deux cas un effet antagoniste prononc 1 2 Evaluation de la croissance de l algue P subcapitata Algaltox F L essaiest fond sur l inhibition de la croissance d algues et con
54. 12 13 14 15 were formed figure 10 The adduct 1 was the major one and was already formed in HepG2 cells The adduct 6 already observed in HepG2 cells treated with WWTP outflow was also formed in MCF 7 cells Adducts 11 amp 12 were exclusively formed in MCF7 exposed to hospital waste water adduct 13 only when cells were exposed to WWTP inflow and adducts 14 amp 15 only when cells were exposed to WWTP outflow The total DNA adduct amounts in MCF7 ranging from 190 to 75 adducts 10 nucleotides were significantly lower compared to HePG2 cells A significant decrease p lt 0 01 of DNA damages were observed from hospital effluent to WWTP outflow DNA breaks formation on both human cell lines exposed to Hospital and waste water treatment plant WWTP effluents In the same way as for the analysis of DNA adduct formation the presence of DNA breaks were evaluated in HepG2 cells and MCF 7 cells exposed to different water samples during 24 h The results of HepG2 cells and MCF 7 cells are presented in Figure 12 and 13 respectively DNA breaks formation in hepatic cells HepG2 exposed to water effluents The exposure of hepatic cells HepG2 to hospital effluents induced significant DNA breaks p lt 0 01 compared to the negative control Figure 12 A slight increase of the genotoxic effect p lt 0 01 was observed when HepG2 cells were exposed to the WWTP inflow sample but the amount of DNA breaks did not exceed 10 Exposure to WWT
55. 16 Figure 17 Figure 18 Figure 19 Figure 20 Figure 21 Figure 22 Figure 23 Figure 24 Figure 25 Figure 26 Figure 27 Figure 28 Sources et voies possibles de la pr sence de r sidus de produits pharmaceutiques dans l environnement aquatique d apr s Heberer 2002 18 Sch ma g n ral de la biotransformation des x nobiotiques sources diverses 21 Implications physiologiques et physiopathologiques des cytochromes P450 Gueguen et al BOOM A EN nn AT A Descente aba E cee 24 Vue g n rale des diff rents modes d action des canc rog nes chimiques g notoxiques et pig n tiques d apr s Luch 2005 ire 29 Les principales tapes de la canc rog n se chimique csscccceceeseceeesecesesnnseetessnseeeeensees 30 Implication du g ne P53 dans la mise en place de la canc rog n se 32 Structure chimique de la ciprofloxacine et de ses principaux m tabolites connus 34 Structure chimiques du tamoxif ne et de ses principaux m tabolites connus 11 ceeee 36 Structure chimiques du cyclophosphamide 1 cccesececnceceeeeeceneeeseececeeeceeeceeeteneeeeeneetsensteas 37 Voie de m tabolisation du cyclophosphamide d apr s de Jonge et al 2005 38 Les diff rentes strat gies de caract risation des effets th se C Boillot 2008 42 Description d une image de type com te et caract risation de noya
56. 2009 The Comet assay has already been included in the strategy guidelines for the testing of chemical mutagenicity EFSA 2012 The Comet assay was chosen as an indicator test for its sensitivity to detect small amounts of DNA damage for being flexible and for requiring only small numbers of cells Tice et al 2000 Especially the alkaline Comet assay with sperm a relatively new technique may become important as it is very sensitive in assessing genotoxic damage Baumgartner et al 2007 The in vitro evaluation of DNA damage on cells will help establish feasible adequate and expedient biomarkers of exposure For this reason to be close to the real contamination levels found in waste water human hepatoma cell line HepG2 has been exposed to the drugs in a range of concentrations from 1 ng L to 100 ug L HepG2 cells have been chosen because they are extensively used for toxicity and genotoxicity evaluation of pure compounds and retained many of the properties of primary liver cells including the metabolic acti vation Lu and Huang 1994 Owing to their endogenous expression of a variety of xenobiotic metabolizing enzymes this cell lines are useful for detecting the combined effects of chemicals in a mixture Mersch Sundermann et al 2004 Zegura et al 2009 Furthermore it has been widely described that zearalenone a phytoestrogen and its metabolites competitively bind to estrogen receptors in different cell models including HepG2
57. 22 8 1307 1315 Garavito R M DeWitt D L 1999 The cyclooxygenase isoforms structural insights into the conversion of arachidonic acid to prostaglandins Biochimica et Biophysica Acta 1441 278 287 Garric J Ferrari B 2005 Les substances pharmaceutiques dans les milieux aquatiques Niveauxd exposition et effet biologique que savons nous Revue des sciences de l eau 18 3 307 330 Gartiser S Brinker L Erbe T kummerer K Willmund R 1996 Belastung von Krankenhausabwasser mit gefahrlichen Stoffen im Sinne 7a WHG Acta Hydrochimica et Hydrobiologica 24 2 90 97 Gilard V Martino R Malet Martino M C Kutscher B Mueller A Niemeyer U Pohl J Polymeropoulos E E 1994 Chemical and biological evaluation of hydrolysis products of cyclophosphamide Journal of Medicinal Chemistry 37 3986 3993 Glatt H Davis W Meinl W Hermesdorfer H Venitt S Phillips D 1998 Rat but not human sulfotransferase activates atamoxifen metabolite to produce DNA adducts and genemutations in bacteria and mammalian cells in culture Carcinogenesis 19 1709 1713 Glue P Clement R P 1999 Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism basic concepts and methods of assessment Cellular Molecular Neurobiology 19 309 323 Greene J C Bartels C L Warren Hicks W J Parkhurst B R Linder G L Peterson S A Miller W E 1989 Protocols for Short Term Toxicity Screening of Hazardous Waste
58. 292 Phillips DH Arlt VM 2007 The 32P postlabeling assay for DNA adducts Nature Protocols 2 2772 2781 Phillips DH 2013 On the origins and development of the 32P postlabelling assay for carcinogen DNA adducts Cancer Letters 334 5 9 Randall WA Price CW Welch H 1947 Demonstration of Hormesis Increase in Fatality Rate by Penicillin American J Public Health and the Nation Health 37 421 425 John Wiley amp Sons Inc OONODOARWND D 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747 748 749 750 751 752 753 754 755 756 757 758 759 760 761 762 763 764 765 766 767 768 769 770 Environmental and Molecular Mutagenesis Rether B Pfohl Leszkowicz A Guillemaut P Keith G 1990 Benzo a pyrene induces nuclear DNA adducts in plant cell suspension culture Detection by 32P postlabelling FEBS Lett 236 172 174 Roberts PH Thomas KV 2006 The occurrence of selected pharmaceuticals in wastewater effluent and surface waters of the lower Tyne catchment Sci Total Environ 356 143 153 Rowney NC Johnson AC Williams R J 2009 Cytotoxic drugs in drinking water a prediction and risk assessment exercise for the thames catchment in the United kingdom Environ Toxicol Chem 28 2733 2743 Sane RS Buckley DJ Buckley AR Nallani SC Desai PB 2008 Role of Human Pregnane X Receptor in Tamoxifen and 4 Hydroxytamoxifen Mediated CYP3A4 Induction in Primary Human Hepatocyte
59. 58 Materiels amp Methodes 60 Mat riels amp M thodes I Description des essais biologiques retenus pour l tude I 1 Le test Microtox 1 1 1 Principe Le fonctionnement du test est bas sur la capacit de la bact rie marine Vibrio fischeri a mettre de la lumi re comme sous produit de la respiration La bioluminescence bact rienne est attribuable au syst me lucif rine lucif rase cod par un groupe de g nes appel op ron Lux Chez cette bact rie 5 g nes LuxCDABE sont directement impliqu s dans l mission de lumi re visible une longueur d onde de 490 nm et deux autres LuxRI sont impliqu s dans la r gulation de l op ron Lux La mesure de la luminescence acc de au flot d lectrons de la cha ne respiratoire et l tat m tabolique de la cellule Hastings amp Nealson 1977 L agression toxique entra ne une diminution de la respiration et donc de la bioluminescence La lumi re est mesur e avec un protocole et un dispositif luminom trique sp cifiques figure 13 La r duction de lumi re 5 15 ou 30 minutes permet le calcul d un facteur d inhibition de la luminescence et donc d appr cier le potentiel toxique aig e d un compos ou d une solution ISO 11348 3 Il est toutefois noter que chez V fischeri la luminescence ne peut tre observ e qu partir d une certaine taille de population car la transcription des g nes impliqu s est induite par corum sensing Dun
60. 6 Les d sinfectants Les d sinfectants sont des produits tr s largement utilis s en tant que tels ou comme composants de produits cosm tiques mousse raser par exemple dans les h pitaux l industrie et les foyers domestiques Ces compos s appartiennent diff rentes classes chimiques et poss dent des spectres d action vari s bact ricides bact riostatiques fongicides etc du fait des diff rentes sp cificit s des micro organismes qui leurs permettent de se prot ger des conditions ext rieures Besse amp Garric 2007 L utilisation des d sinfectants en milieu hospitalier est tr s diversifi e d sinfection des surfaces de l instrumentation de la peau antiseptiques des cuisines etc ce qui engendre deux grandes cat gories de substances les d sinfectants courants et les d sinfectants a utilisation restreinte Emmanuel 2004a Parmi les d sinfectants les plus couramment utilis s on peut citer Les produits chlor s eau de Javel et autres hypochlorites qui agissent en oxydant les acides amin s aromatiques des prot ines et peuvent induire l inhibition de certaines enzymes et ou une modification des prot ines structurelles Russell amp Hugo 2004 Ils contribuent galement la formation d AOX le plus souvent lipophiles r manents dans l environnement et potentiellement toxiques pour les organismes aquatiques Carey et al 1998 Les produits contenant des ald hydes et d riv
61. I 0 zi T h T h T T T EE T Control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 CONCENTRATION ug L Figure 52 Taux d adduits l ADN par 10 nucl otides form s chez des cellules mammaires MCF 7 expos es 24 h a diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP tamoxif ne TAM et cyclophosphamide CP Les r sultats sont exprim s en moyennes et consid r s statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 Quel que soit le type de m lange de mol cules binaire ou ternaire on observe la formation significative d adduits l ADN figure 53 Les m langes CIP TAM induisent une augmentation dose d pendante significative p lt 0 01 allant de 3 a 20 adduits 10 nucl otides On note que la r ponse de g notoxicit observ e ici est tr s diff rente de celle obtenue apr s une exposition au tamoxif ne seul 25 CIP TAM 8 CTC 20 Adducts 10 nucleotides CONDITIONS Figure 53 Taux d adduits l ADN par 10 nucl otides form s dans les cellules mammaires MCF 7 expos es 24 h diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM gris et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC blanc Les r sultats sont exprim s en moyennes et consid r s significatifs p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative p lt 0 05 entre les m langes CIP TAM et CTC M langes de Condition mol cules 1 2 3 4 5
62. Janvier J1 avec un taux d induction 5 fois plus important que la condition normale de r f rence figure 63 C 100 0 Sa didrotestosterone N1 N2 N3 Flutamide N1 N2 N3 i 80 0 Q w 60 0 gt gt Cc D ae B 400 v 20 0 i 0 0 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution Samole Dilution 100 0 Sa didrotestosterone DI D2 D3 Flutamide D1 D2 D3 Q w 2 3 v K 0 0 m i 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution Samole Dilution 100 0 5o didrotestosterone e J1 J2 J3 Flutamide J1 J2 J3 80 0 Q v ee a 600 c 2 400 2 7 20 0 i EEE S a 0 0 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution Samole Dilution Figure 63 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs androg niques YAS de levures S cerevisiae expos es diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs A Novembre B D cembre C Janvier Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes et sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p
63. La d termination de la pr sence d adduits l ADN sur les plantes permettrait de souligner le caract re polluant commun la faune et la flore des m dicaments dans l eau notamment en ce qui concerne la g notoxicit De plus ces plantes pourraient tre plac es comme organismes sentinnelles en sortie de STEP par exemple D autre part nous avons pr vu d tudier de nouveaux types de m langes l aide de cette batterie de tests qui tiendrait compte cette fois d un plus large ventail de mol cules en m lange Du fait de la pr sence r currente entre autre de mol cules dites marqueurs anthropiques de psychotropes de pesticide ou encore de drogues on pourrait imaginer int grer notre m lange initial de m dicaments d autre mol cules chimiques comme la caf ine marqueur anthropique oxazepam antid presseur le DDT pesticide organochlor ou encore si possible une drogue coca ne etc Bien qu un nombre 157 Conclusions amp Perspectives important de mol cule en m lange puisse compliquer l interpr tation des r sultats il permettrait au moins d valuer les interactions se produisant en m lange entre ces diff rentes familles de compos s chimiques Par la suite notre batterie de tests aura pour objectif d valuer plus finement la pertinence et l efficacit de rem diation de proc d s pr vus pour le pr traitement des effluents hospitaliers avant leur rejet dans le r seau urb
64. Novembre N1 N2 inhibent quasiment d un facteur 2 p lt 0 01 l activit des r cepteurs De plus on constate que l chantillon N1 et N2 conservent leurs effets antagonistes jusqu des facteurs de dilution de 10 p lt 0 05 et 3 10 p lt 0 05 respectivement Ces r sultats mettent en vidence un caract re toxique important de ces chantillons m me de tr s faibles concentrations Ind pendamment du lieu de pr l vement les chantillons du mois de Janvier induisent une inhibition significative de l activit des r cepteurs strog niques Les effluents hospitaliers J1 inhibent d un facteur 2 p lt 0 01 1 5 p lt 0 05 l activit des r cepteurs pour des dilutions allant respectivement jusqu 3 102 et 10 Concernant les effluents d entr e et de sortie de STEP les r sultats sont 138 Induction Ratio Induction Ratio Induction Ratio 40 0 30 0 20 0 10 0 0 0 R sultats amp Discussion Partie 2 quasiment identiques et se caract risent par un antagonisme d un facteur 2 1 5 p lt 0 01 pour des dilutions respective de 10 et 3 102 111 2 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs androg niques hAR YAS L effet perturbateur androg nique est pr sent figure 63 Un tiers des chantillons 3 9 ont un effet agoniste L exposition des levures aux effluents hospitaliers entraine un effet agoniste significatif seulement pour le mois de
65. On constate dans le tableau 15 que la majorit des r sultats ou il n y a pas de toxicit mesur e pas de r ponse concerne l analyse faite lors d exposition aux mol cules individuellement Dans certaines conditions de concentration et ou de temps d exposition des r sultats faux n gatifs pourraient donc entrainer des erreurs d interpr tation Par exemple si le temps d exposition est insuffisant pour l expression de g nes requis pour une r ponse adaptative de l organisme la mesure trop pr coce des effets biologiques pourrait r v ler un seuil ou une r ponse lin aire de toxicit plut t qu un ph nom ne d horm se par exemple Le r le pr pond rant du facteur temps a notamment t remarqu dans l amplification de la r ponse de toxicit des cellules h patiques HepG2 expos es aux diff rentes conditions test es A l inverse un temps d exposition trop long pourrait aussi conduire une absence de r ponse car les m canismes de r paration pourraient avoir d j acompli leur r le Ces r sultats soulignent plus particuli rement la pertinence d utiliser des biomarqueurs de g notoxicit en compl ment dans l valuation du risque environnemental global A cet effet la technique de post marquage des adduits l ADN repr sente un outil de premier choix L utilisation de ce panel d outils sur diff rents organismes d essais dont des lign es cellulaires humaines est d autant plus importante que l induction d un
66. Research Genetic Toxicology 368 1 49 57 Gupta R C 1993 32P postlabelling analysis of bulky aromatic adducts IARC Scientific Publications 11 23 Guo Y L L Lambert G H Hsu H C 1995 Growth Abnormalities in the Population Exposed in Utero and Early Postnatally to Polychlorinated Biphenyls and Dibenzofurans Environmental Health Perspectives 103 117 122 H Halling Sorensen B Nors Nielsen S Lankzy P F Ingerslev F Holten Lutzhoft H C Jorgensen S E 1998 Occurrence fate and effects of pharmaceutical substances in the environment a review Chemosphere 36 2 357 393 Harris C C 1991 Chemical and physical carcinogenesis advances and perspectives for the 1990s Cancer Research 51 5023 5044 Harris R C McKanna J A Akai Y Jacobson H R Dubois R N Breyer M D 1994 Cyclooxygenase 2 is associated with the macula densa of rat kidney and increases with salt restriction Journal of Clinical Investigation 94 2504 2510 Hartemann P 2006 Approche pour l valuation des effets mergents des r sidus de m dicaments dans les eaux Environnement Risques et Sant 5 307 310 Hartmann A Schumacher M Plappert Helbig U Lowe P Suter W Mueller L 2004 Use of the alkaline in vivo Comet assay for mechanistic genotoxicity investigations Mutagenesis 19 1 51 59 Hartmann A Golet E M Gartiser S Alder A C Koller T Widmer R M 1999 Primary DNA damage but not mutage
67. Rydberg et Johanson 1978 sur des cellules de mammif res lys es et incluses dans l agarose Les dommages double brin l ADN avaient alors t marqu s l acridine orange et mesur s l aide d un photom tre en rapportant la quantit d ADN double brin fluorescent en vert la quantit d ADN simple brin fluorescent en orange Ce n est que six ans plus tard que la m thode impliquant une lectrophor se sur microgel a t mise au point pour la d tection de cassures double brin pH lt 9 Ostling amp Johanson 1984 La technique a ensuite t largie la d tection de cassures simple brin en condition alcaline Singh et al 1988 puis optimis e Belpaeme et al 1998 et finalement standardis e Tice et al 2000 Les principaux atouts de cet outil sont l absence de sp cificit des cassures pour un compos g notoxique donn l application de nombreux types cellulaires ind pendamment de la phase du cycle cellulaire et de ne pas n cessiter d extraction d ADN l analyse des dommages de l ADN se fait directement sur les noyaux Shugart 1990 Nacci et al 1996 Devaux et al 1998 Livingstone et al 2000 Apr s incubation des cellules aux chantillons de x nobiotiques test s elles sont incluses dans de l agarose d pos sur des lames de microscope lys es dans une solution alcaline de forte force ionique puis soumis une lectrophor se en conditions alcalines Les tapes critiques 50
68. S cerevisiae des m langes binaires CIP TAM et lernaires CIC Mn transe net inerte ane nent end e te bes 108 xxiii Liste des figures Figure 44 Figure 45 Figure 46 Figure 47 Figure 48 Figure 49 Figure 50 Figure 51 Figure 52 Figure 53 Figure 54 Figure 55 Figure 56 Figure 57 Figure 58 Figure 59 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et Cyclophosphamide sisi brs oes oe nes ee iv nt ire uit ein to 109 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC 110 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et CyClophOoSphamide ss reset ee rare ann nn ni ii 110 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules humaines de glandes mammaires MCF7 expos es 24 h et 72 h diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide 111 Exemple de profils d adduits d ADN de cellules h patiques HepG2 expos s diff rentes conditions pendan
69. Synth se bibliographique Cytochrome P450 Fonctions m taboliques CYP 1 CYP 2 CYP 3 CYP 4 CYP 5 CYP 7 CYP 8 CYP 11 CYP 17 CYP 19 CYP 21 CYP 24 CYP 26 CYP 27 CYP 39 CYP 46 CYP 51 M tabolisme des x nobiotiques et des st ro des M tabolisme des x nobiotiques et des st ro des M tabolisme des x nobiotiques des st ro des et des m dicaments M tabolisme des acides gras eicosano des acide arachidonique et m dicaments Thromboxane A2 synthase Synth se des acides biliaires Synth se des acides biliaires Prostacycline synthase St ro dogen se St ro de 17 alpha hydroxylase Aromatase synth se des oestrog nes St ro dogen se st ro de 21 hydroxylase D gradation de la vitamine D vitamine D 24 hydroxylase Hydroxylation de l acide r tino que Synth se des acides biliaires hydroxylations de la vitamine D3 7a hydroxylation du 24S hydroxycholest rol Cholest rol 24S hydroxylase Lanost rol 14 alpha d m thylase biosynth se du cholest rol Tableau 3 Fonctions m taboliques des cytochromes P450 Il 1 2 Les peroxydases ll 1 2 a Localisation et fonctions Les peroxydases sont des enzymes h miniques capables de catalyser des r actions durant lesquelles l eau oxyg n e g n r e dans la cellule par un stress oxydatif est r duit et un substrat oxyd Ces prot ines sont pr sentes dans tous les r gnes et forment g n ralement des familles multig
70. Un ph nom ne d apoptose des cellules HepG2 expos es des doses sup rieures au microgramme par litre de tamoxif ne a t d crit par Brandt et al 2004 2005 Les r sultats ont d montr s que le tamoxif ne d r gulait l activit t lom rase des cellules entrainant l apoptose 124 R sultats amp Discussion Partie 1 L importance de la m tabolisation avait d ja t observ e avec le test de viabilit cellulaire ou les cellules mammaires n avaient pas r pondu contrairement aux cellules h patiques ou encore avec la diff rence de r ponse de toxicit entre mol cule seule et en m lange avec les bioessais Ainsi on observe dans le cas du Microtox qu il ne permet pas de d tecter la toxicit respective des mol cules sauf pour une dose de 100 ug L de ciprofloxacine alors que les m langes induisent une inhibition de la bioluminescence Bien que tr s peu de donn es soient disponibles concernant l impact de ces mol cules sur cette bact rie marine des tudes men es sur la ciprofloxacine par Martins et al 2008 2012 montrent une induction d effets aigus et subl taux dose th rapeutique chez plusieurs esp ces aquatiques Cependant aucune information n est disponible ni sur la toxicit de doses inf rieures au microgramme par litre ni sur des m canismes d action pr cis L impact de la ciprofloxacine sur les lentilles d eau observ dans notre tude et par d autres Migliore
71. V Turgeon J 2010 Assessment of Competitive and Mechanism Based Inhibition by Clarithromycin Use of Domperidone as a CYP3A Probe Drug Substrate and Various Enzymatic Sources Including a New Cell Based Assay with Freshly Isolated Human Hepatocytes Drug Metabolism Letters 4 2 69 76 Michel C 2011 Biomarqueurs de g notoxicit chez Dreissena polymorpha indicateur de la pression chimique urbaine et variabilit naturelle des l sions l ADN Th se Anthony Universit Pierre et Marie Curie GRN 218p Migliore L Cozzolino S Fiori M 2003 Phytotoxicity to and uptake of enrofloxacin in crop plants Chemosphere 52 1233 1244 Miller J A 1970 Carcinogenesis by chemicals an overview G H A Clowes memorial lecture Cancer Research 30 3 559 576 Miller E C Miller J A 1979 Milestones in chemical carcinogenesis Seminars in Oncology 6 4 445 460 Miller E C Miller J A 1981 Searches for ultimate chemical carcinogens and their reactions with cellular macromolecules Cancer 47 2327 2345 Miller M S McCarver D G Bell D A Eaton D L Goldstein J A 1997 Genetic polymorphisms in human drug metabolic enzymes Fundamental And Applied Toxicology Official Journal Of The Society Of Toxicology 40 1 14 Minckoitz G Kummel S Du Bois A 2008 Pegfilgrastim or ciprofloxacin for primary prophylaxis with TAC docetaxel doxorubicin cyclophosphamide chemotherapy for breast cancer Result
72. a t d valuer l impact de faibles doses de m dicaments couramment utilis es dans les protocoles de traitements anticanc reux La toxicit des mol cules mod les sur la viabilit de plusieurs organismes d tude a t valu e dans un premier temps l aide des bioessais et d un biomarqueur puis l analyse du potentiel perturbateur endocrinien et de la g notoxicit a t faite l aide de biomarqueurs Cette partie a pour but de valider la sensibilit des outils pour d tecter l induction d un effet toxique et comparer les r ponses obtenus afin de v rifier leur compl mentarit ou leur redondance et confirmer in fine la pertinence de leur utilisation dans l analyse du risque La deuxi me partie de la th se a eu pour but d appliquer cet ensemble d outils pour caract riser la toxicit globale ou sp cifique d effluents hospitaliers et leur volution spatio temporelle dans les r seaux urbains d go ts avant leur rejet dans l environnement La globalit de ce travail a pour vocation non pas de d terminer les CEso ou de suivre point par point les d marches cotoxicologiques recommand es mais au contraire d appliquer un ensemble d outils simples et rapides sur des chantillons bruts pour d celer un ph nom ne de pollution et valuer l efficacit des traitements actuellement utilis s en STEP biologique chimique etc pour d polluer les eaux us es 56 Synth se bibliographique 57
73. a deoxyguanosin N2 yl N oxid TAM Shibutani et al 2003 figure 14 The qualitative difference of DNA adduct formation induced by TAM in HepG2 cells and MCF7 cells can be explain by the differential metabolic capacity of these cells lines HepG2 cells of hepatic origin possess mainly CYP belonging to the family 1 4 whereas MCF7 express mainly aromatase quinone reductase peroxidases such cyclooxygenase and sulfatase Interestingly the dose response curve of DNA adduct formation in MCF7 exposed to TAM present a U shape explained by the endocrine disruptor ability of TAM Indeed TAM is an endocrine disruptor due to its agonist and antagonist effect on estrogen receptor Coezy et al 1982 Vandenberg et al 2012 and androgenic receptors as evidenced by the YES YAS test Mater 2014 The low doses stimulating hormetic responses could lead to enhancement of proliferation of tumors cells by antitumor drugs Calabrese 2005 2013 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D D 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 Environmental and Molecular Mutagenesis Absence of DNA adduct formation when cells were exposed to CP can be surprising as CP also should be biotransformed to be cytotoxic CP is activated in vivo to 4 hydroxycyclophosphamide via CYP 2B6 which
74. a l Unniversit de Savoie et au LSE de l ENTPE Vaulx en Velin et Chamb ry Universit de Savoie ENTPE 323p Cl ment B 2006 Apports des essais en microcosmes aquatiques lentiques de laboratoire al valuation cotoxicologique des polluants M moire d HDR INSA de Lyon et Universit Lyon1 Sp cialit Biologie et Biochimie Appliqu es au LSE de l ENTPE Vaulx en Velin 277p Cleuvers M 2003 Aquatic ecotoxicity of pharmaceuticals including the assessment of combination effects Toxicology Letter 142 3 185 194 Coesier C M Spinelli S Lin L Roig B Touraud E 2009 Discharge of pharmaceutical products PPs through a conventional biological sewage treatment plant MECs vs PECs Environment International 35 5 789 792 Coezy E Borgna J L Rochefort H 1982 Tamoxifen and Metabolites in MCF7 Cells Correlation between Binding to Estrogen Receptor and Inhibition of Cell Growth Cancer Research 42 317 323 Colborn T Saal F S V Soto A M 1993 Developmental Effects of Endocrine Disrupting Chemicals in Wildlife and Humans Environmental Health Perspectives 101 5 378 384 Coller J K 2003 Oxidative metabolism of tamoxifen to Z 4 hydroxytamoxifen by cytochrome P450 isoforms An appraisal of in vitro studies Clinical Experiment in Pharmacology Physiology 30 845 848 Coquery M Mi ge C Choubert J M Ribeiro L Eusebe M 2007 Occurence and removal efficency of pharmaceuticals and pers
75. amp Sons Inc hs lan 41 J O O1 B ND Environmental and Molecular Mutagenesis Page 42 of 42 Figure 15 CIPROFLOXACIN hs oe wn by ted a Soy we p a Ng A ye P ag a i 4 A INTERACTIONS lt ee es Inhibits CYP 2B6 Activate CYP 3A CYCLOPHOSPHAMIDE m TAMOXIFEN _ CYP 3M CYP 206 CYP 286 CYP 286 CPAS E 2B6 209 2019 JA CESAS RBE 208 219 M a O O N oe LEFT y He Bes Bes OOH S 4 OH CP Chloroacetaldehyde Acrolein a OH TAM N desmethyl TAM 4 OH TAM L F CYP3A CYP2D6 ws ie 1 l RIRN p NH OH Phosphoramide mustard John Wiley amp Sons The LS N didesmethyl Endoxifen 3 4 dihydroxy TAM smet TAB TAM R sum En Europe le nombre de cancers est en constante augmentation et explique l augmentation des traitements Les bases de ces traitements sont la chimioth rapie et la radioth rapie seules ou en association Les chimioth rapies sont effectu es l aide de m dicaments anticanc reux qui ont des propri t s toxiques pour les cellules Apr s administration des traitements aux patients les m dicaments sont excr t s et se concentrent dans les effluents hospitaliers et les r seaux d gouts Bien que beaucoup de ces compos s soient limin s dans les stations d puration certains sont difficilement biod gradables et sont directement rejet es dans le milieu naturel o ils repr sentent un risque toxique pour la flore la faune et Homme
76. and pharmacodynamics of ifosfamide and its metabolites Clin Pharmacokinet 40 41 62 Kisanga ER Mellgren G Lien EA 2005 Excretion of Hydroxylated Metabolites of Tamoxifen in Human Bile and Urine Anticancer Res 25 6 4487 4492 Kolpin DW Furlong ET Meyer MT Thurman EM Zaugg SD Barber LB Buxton HT 2002 Pharmaceuticals hormones and other organic wastewater contaminants in U S streams 1999 2000 a national reconnaissance Environ Sci Technol 36 1202 1211 Kuemmerer K Steger Hartmann T Meyer M 1997 Biodegradability of the anti tumour agent ifosfamide and its occurrence in hospital effluents and communal sewage Water Research 31 2705 2710 Lenz K Mahnik SN Weissenbacher N Mader RM Krenn P Hann S Koellensperger G Uhl M Knasm ller S Ferk F Bursch W Fuerhacker M 2007 Monitoring removal and risk assessment of cytostatic drugs in hospital wastewater Water Science amp Technology 56 141 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690 691 692 693 694 695 696 697 698 Environmental and Molecular Mutagenesis Lindberg R Jarnheimer P A Olsen B Johansson M Tysklind M 2004 Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography mass spectrometry and group analogue
77. ase P1 couper le phosphate en 3 des nucl otides normaux Il s agit d une activit de d phosphorylation s lective des d soxyribonucl otides normaux La configuration structurale de l adduit prot ge la liaison du phosphate en 3 qui sera ensuite conserv dans les adduits 74 Mat riels amp M thodes e On r alise alors un marquage enzymatique sp cifique des adduits Les 3 P nucl otides sont substrats de la polynucl otide kinase T4 qui a pour propri t de transf rer un phosphate radioactif en position y du 2P ATP sur la position 5 du nucl otide Les nucl osides normaux ne pouvant pas tre phosphoryl s ils n interf rent donc pas sur le marquage e Les nucl osides normaux et l exc s de phosphate inorganique sont s par s du ou des diff rents adduits par migration sur plaque de couche mince de poly thyl neimine cellulose dans des solvants aqueux salins ils permettent la migration des substances hydrophiles alors que les adduits hydrophobes restent au point d origine ou migrent l g rement selon leur degr d hydrophobicit e Les adduits sont alors s par s par chromatographie bidimensionnelle changeuse d anions sur plaque de couche mince de poly thyl ne iminecellulose dans un syst me de solvants bas s sur les propri t s chimiques des mol cules adduit es e Les adduits et leur emplacement sont visualis s par autoradiographie des plaques sur des crans amplificateu
78. aspartique L Thr onine et sulfate de Cuivre N Cultures YES Identifier 2 flasques YES et YAS Ajouter 5ml de m lange de culture Shi chaque flasque et y introduire la levure d di e Bien agiter et placer 32 C 100rpm 2 3 jours week end Jour 2 lundi matin pr paration des plaques de r action Inspecter les cultures fongiques V rifier que la DO gt 0 3 2 Reconstituer chaque substance de r f rence RS par 100uL de DMSO Pr parer les chantillons r aliser des solution stock 10M ou a d faut utiliser la concentration soluble la plus lev e D baller 5 plaques 96 puits et identifier 4 des plaques ainsi YES anti YES YAS et anti YAS Pr parer les milieux d essai dans 3 r servoirs Agonistes 20ml de m lange de culture 0 4ml CRPG Ajouter 100yl chaque puits des plaques YES et YAS YES antagonistes 10ml de m lange de culture 0 2ml CRPG 20yl de solution stock de E agoniste cestrog nique de r f rence Ajouter 100pl chaque puits de la plaque anti YES YAS antagonistes 10ml de m lange de culture 0 2ml CRPG Gui de solution stock DHT agoniste androg nique de r f rence Ajouter 100 chaque puits de la plaque anti YAS Pr parer la plaque de dilution des RS et chantillons o A a Le KA LC LA CREAN o OC Zs lt lt COOK Transf rer 2yul de chaque solution en duplicats dans les plaques aux emplacements respectifs Calculer les volumes de solutions fon
79. c dente Il s agit essentiellement d un lavage permettant d liminer la radioactivit non sp cifique et donc de r duire le bruit de fond Une bande de papier Whatman 16 cm x 4 cm est agraf e dans le sens de la largeur de la plaque La migration dure une nuit dans 70 mL de phosphate monosodique NaH2PO4 1 7 M pH 6 25 C Apr s avoir enlev le papier Whatman les plaques sont lav es deux fois 5 min l eau distill e puis s ch es et d coup es au format 9 5 cm x 14 5 cm partir de l origine du d p t Papier Wattman A D coupage et transfert sur une nouvelle 16 h 25 C plaque de cellulose 2 Point de d p t gt 4 h 25 E E 2 n 5 D p ts et migration D1 Migration D2 Na H2PO 2 3 M pH 5 7 Ur e 7 7 M formate de Lithium 4 8 M pH 3 5 Purification 5 S Rotation de 90 LH Ss a a Migration D3 NaH2PO 0 6M Ur e 7M pH 6 4 v Papier Whatman 4 eo OD Une nuit 25 C Ss Migration D4 Na H2PO 1 7 M pH 6 Figure 23 Chromatographies successives pour la purification et la s paration des adduits sur des plaques dePEl cellulose 1 5 4 c 6 Autoradiographie et quantification des adduits Les plaques obtenues en fin d exp rimentation sont autoradiographi es pendant une nuit 17 h l aide d crans photostimulables appel s cassettes Le nombre de mol cules radioactives peut tre d termin en mesurant la quantit de leur produit de d composition Le ra
80. cellules MCF 7 Ces r sultats soulignent des cibles et modes tr s diff rents pouvant donc bien tre la r sultante d interactions complexes entre les mol cules en m lange L ensemble de ses modifications au niveau de l ADN explique les effets observ s sur la formation de cassure ph nom ne de r paration et sur la viabilit cellulaire avec la mutation des g nes tels que le g ne p53 suppresseurs de tumeurs ou l induction de l apoptose Bien que la CIP soit utilis e principalement comme antibiotique pour son action inhibitrice des topoisom rases gyrases bact riennes de type Il les travaux men s par Herold et al 2002 ont montr que l exposition la ciprofloxacine pouvait affecter la viabilit de certaines lign es cellulaires eucaryotes Les causes peuvent entre autre tre dues une interaction directe de la mol cule avec la membrane mitochondriale et une inhibition non s lective de la synth se d ADN mitochondrial Lawrence et al 1993 Une baisse des mitochondries en entrainant une diminution de la concentration en ATP pourrait favoriser l apoptose cellulaire via l arr t du cycle cellulaire S G2 M en concomitance avec une diminution des cyclines B et E une d phosphorylation de cdk2 et une surexpression du facteur pro apoptotique Bax La capacit de la ciprofloxacine interf rer sur la voie de signalisation de Bax a t mise en vidence sur des cellules canc reuses humaines de vessie Aranha et al 2000
81. complexe tudes en bioessais et canaux artificiels Th se Sp cialit Sciences et Techniques du D chet au LSE del ENTPE Vaux en Velin INSA de Lyon 303p W Wang W 1990 Literature review on duckweed toxicity testing Environmental Research 52 1 7 22 Watkinson A J Murby E J Kolpin D W Costanzo S D 2009 The occurrence of antibiotics in an urban watershed from wastewater to drinking water Science of the Total Environment 407 2711 2723 Webb S Ternes T Gibert M Olejniczak K 2003 Indirect human exposure to pharmaceuticals via drinking water Toxicological Letters 142 157 167 Weigel S Kuhlmann J Huhnerfuss H 2002 Drugs and personal care products as ubiquitous pollutants occurrence and distribution of clofibric acid caffeine and DEET in the North Sea The Science of the Total Environment 295 131 141 Weinstein B 1988 The origins of human cancer molecular mechanisms of carcinogenesis and their implications for cancer prevention and treatment twenty seventh G H A Clowes memorial award lecture Cancer Research 48 4135 4143 Weisburger J H Williams G M 2000 The distinction between genotoxic and epigenetic carcinogens and implication for cancer risk Toxicological Sciences 57 4 5 WHO 2002 Global assessment of the state of the science of Endocrine diruptors T Damstra S Barlow A Bergman R Kavlock and G van Der Kraak geneva switzerland World Health Organization Inter
82. condition contr le est d crite par la courbe verte Concernant le potentiel antagoniste des m langes on note une inhibition de l activit des r cepteurs hAR seulement lorsque les levures sont expos es au m lange ternaire CTC dilu 10 10 mg L de chaque mol cule en m lange Le taux d induction diminue d un tiers p lt 0 05 compar l activit basale des r cepteurs Aucune autre perturbation n a t mesur e pour les autres concentrations de la gamme test e Il est important de noter que cet effet antagoniste est quivalent celui observ lors de l exposition au TAM seul Par contre en m lange binaire CIP TAM il n y a pas du tout d effet antagoniste confirmant que la CIP emp che totalement l effet androg ne du TAM 108 Tail DNA R sultats amp Discussion Partie 1 Il 2 Analyse des cassures l ADN sur cellules humaines h patiques HepG2 et mammaires MCF7 test des com tes La pr sence de cassures l ADN induites par les mol cules seules ou en m lange a t recherch e sur des lign es cellulaires humaines h patiques HepG2 et des glandes mammaires MCF7 expos es 24 48 h et 72 h aux m dicaments afin de rendre compte des effets g notoxiques aigus premi re g n ration de cellules et chroniques ni e g n ration de cellules Pour des raisons de simplification les r sultats ci apr s ne pr sentent que les effets observ s 24 h effet aigu et 72 h ef
83. cytochromes P450 Drug Metabolism Disposition 24 1254 Yusuf A T Vian L Sabatier R Cano J P 2000 In vitro detection of indirect acting g notoxines in the comet assay using HepG2 cells Mutation Research 468 227 34 184 Bibliographie Zamek Gliszczynski M J Hoffmaster K A Nezasa K Tallman M N Brouwer K L R 2006 Integration of hepatic drug transporters and phase II metabolizing enzymes Mechanisms of hepatic excretion of sulfate glucuronide and glutathione metabolites European Journal of Pharmaceutical Sciences 27 447 486 Zanger U M Schwab M 2013 Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism Regulation of gene expression enzyme activities and impact of genetic variation Pharmacology amp Therapeutics 138 103 141 Zeiler H J Pertersen U Gau W Ploschke H J 1987 Antibacterial activity of the metabolites of ciprofloxacin and its significance in the bioassay Arzneimittel forschung 37 2 131 134 Zegura B Heath E Cernosa A Filipic M 2009 Combination of in vitro bioassays for the determination of cytotoxic and genotoxic potential of wastewater surface water and drinking water samples Chemosphere 75 1453 1460 Zhang Q H Wu C F Duan L Yang J Y 2008 Protective effects of total saponins from stem and leaf of Panax ginseng against cyclophosphamide induced genotoxicity and apoptosis in mouse bone marrow cells and peripheral lymphocyte cells Food Chemical Toxico
84. de mol cules 1 3 Notion g n rale de canc rog n se Bien que suite des tudes pid miologiques des associations aient t observ es entre certains compos s chimiques et la canc rogen se humaine d s le 18 me si cle l tude des interactions de ces compos s avec les constituants cellulaires n a d marr qu en 1947 quand Miller amp Miller ont montr la liaison de ces agents aux prot ines Ils pr sumaient plus tard que tous les 28 Synth se bibliographique canc rog nes agissaient par des m canismes similaires op rant comme des lectrophiles Miller amp Miller 1979 pour produire des mutations Ames et al 1973 Cependant Weisburger amp Williams 1981 introduisent une distinction entre les canc rog nes g notoxiques et canc rog nes pig n tiques non g notoxiques figure 4 Les canc rog nes g notoxiques nitrosamines amines aromatiques HAP etc ont dans leur structure des groupes lectrophiles tr s r actifs qui peuventformer des adduits l ADN Miller 1970 Miller amp Miller 1981 Bien que ces canc rog nes aient une action directe sur l ADN des m canismes pig n tiques peuvent avoir lieu Une exposition chronique des faibles doses peut contribuer des alt rations non g notoxiques ayant un effet promoteur sur les clones cellulaires transform s in vivo Luch 2005 Les canc rog nes pig n tiques de part leur structure chimique ne forment pas direct
85. des personnes exceptionnelles s ach vent ici avec l criture de mes remerciements Je tiens remercier tout d abord ma directrice de th se le Pr Annie Leszkowicz pour m avoir accueilli dans son laboratoire Son aide sa disponibilit et ses conseils ont t d une grande importance dans la r alisation de mon travail de doctorat tout en me laissant une grande autonomie Je ne la remercierai jamais assez pour la confiance qu elle a su m accorder chaque instant ainsi que pour m avoir donn plusieurs reprises la chance de pr senter mes travaux lors de congr s scientifiques internationaux Bien que cela permette tout chacun de se grandir intellectuellement ce privil ge n est pas toujours laiss aux doctorants et je sais combien je lui suis redevable Je tiens ensuite remercier tous les membres du jury pour avoir accept d y participer Je remercie notamment le Dr Jeanne Garric et le Pr Benoit Roig d avoir accept de porter un int r t ce travail et d en tre les rapporteurs malgr leurs emplois du temps bien remplis Je remercie le Dr Michel Pierre De Meo de pr sider le jury lors de ma soutenance de th se Je remercie le Dr Florence Geret pour tre pr sente dans ce jury de th se pour sa collaboration dans l utilisation des bioessais son aide et sa gentillesse Je tiens remercier tout particuli rement le Dr Virginie Faucet Marquis pour sa pr sence mais surtout pour son aide et ses co
86. du tamoxif ne et du cyclophosphamide en doses croissantes 100 1 4 2 b Etude de la toxicit des m langes CIP TAM en doses inverses 103 Chapitre 2 Etude du potentiel perturbateur endocrinien et de la g notoxicit de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide cccccccceeeetttteeeees 105 11 1 Evaluation du potentiel perturbateur endocrinien sur les r cepteurs strog niques hERa et androg niques hAR humains test YES YAS 106 1 1 1 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs strog niques hERa test YES 106 1 1 2 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs androg niques hAR test YAS 107 11 2 Analyse des cassures l ADN sur cellules humaines h patiques HepG2 et mammaires MCF7 test des com tes nnnnsssnenennmnmmmmnses 109 1 2 1 Analyse des cassures l ADN induites sur cellules h patiques HepG2 109 1 2 2 Analyse des assures l ADN sur cellules mammaires MCF 7 n se 110 11 3 Analyse de la formation d adduits l ADN sur cellules humaine h patiques et mammaires technique du post marquage au P ssscsseeseesseeeseeeeseeeees 111 1 3 1 Analyse de la formation d adduits l ADN sur cellules h patiques HepG2 111 1 3 2 Analyse de la formation d adduits l ADN sur cellules mammaires MCF 7 114 SO sinistre 117
87. effect and give similar responses The two other endpoints DNA breaks and algaltoxkit F reflect a chronic effect and the adaptive response of organisms The results of the mixture experiments demonstrate that chemicals in real water samples act together in mixtures and how not only the Table 3 N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 absolute concentrations of the mixture components are important but also their contribution to the mixture effect Throughout this study we identified significant hormetic responses with the cell viability tests and algaltoxkit F test at low concentrations of drugs The hormesis phenomenon is characterized by low dose stimulation of the test species over the control and high dose enhancement of adverse effects These data pinpoint the difficulties of risk assessment to low concentra tion subnanograms exposure and confirm the data obtained by Hernando et al 2006 and Zegura et al 2009 Consequently while individually these drugs would not be expected to cause acute toxicity in environmental conditions this study revealed that chronic endpoints were a lot more sensitive than acute endpoints notably when the drugs occurred simultaneously and hence further research is needed to inves tigate chronic effects at environmentally relevant concentrations and in mixtures The synergism antagonism observed in the present study demonstrated the necessity to investigate the ecotoxicologi
88. entre les organes pour une m me esp ce Mugford amp Kedderis 1998 Chez les mammif res les propri t s connues des CYPs peuven t tre r sum es comme suit Ils sont form s d environ 500 acides amin s une cyst ine localis e pr s de la r gion carboxy terminale de la prot ine qui permet la liaison thiol ligand et une r gion N terminale riche en AA hydrophobes qui permet la fixation de la prot ine aux membranes Ils sont appel es mono oxyg nases car ils incorporent un atome d oxyg ne partir d oxyg ne mol culaire et transforment ainsi une grande vari t de compos s chimiques Ils sont plus concentr s dans les tissus tels que le foie l intestin et les glandes surr nales par rapport aux autres h moprot ines Ils ont habituellement une expression ubiquitaire bien que certains tissus n expriment de mani re constitutive que certaines isoformes Ils sont pour la plupart r gul s par des facteurs de transcription qui sont activ s par diff rents compos s chimiques La capacit d un compos servir d inducteur est g n ralement li e a une famille de CYP 11 1 1 b Structure Les mono oxyg nases cytochromes P450 CYP aussi appel es oxydases fonctions multiples MFO sont des complexes multi enzymatiques associ s la membrane externe du r ticulum endoplasmique et des mitochondries membrane interne externe ou matrice Leur site actif est orient du c t du cytoplasme Ana
89. et leur persistance dans l environnement c est la pr sence de substances pharmaceutiques qui pourraient expliquer l cotoxicit des effluents hospitaliers K mmerer et al 1997 Halling S rensen et al 1998 Cleuvers 2003 Ferrari et al 2003b Emmanuel 2004 M me si les rejets de ces compos s pharmaceutiques sont relativement faibles il s av re que ces mol cules peuvent induire des effets importants sur la faune aquatique Hartemann et al 2006 L autre hypoth se concerne l utilisation d agents de contraste iod s qui sont persistants dans l environnement et qui participent activement la formation d AOX dans les r seaux d assainissement K mmerer et al 1998 Fent et al 2006 Besse amp Garric 2007 12 Synth se bibliographique 1 3 2 a Les surfactants De mani re g n rale on d signe par d tergents les produits susceptibles de permettre un nettoyage quelconque Un des principes actifs des d tergents est le surfactant ou agent de surface ou tensioactif qui constitue l essentiel de la partie organique des d tergents Les surfactants sont des mol cules amphiphiles constitu es d une t te hydrophile et d une queue lipophile La t te polaire charg e ou non apporte la propri t cationique anionique amphot re ou non ionique au surfactant et favorise la dissolution de la mol cule dans les solvants eau glyc rol hydrazine etc La queue apolaire est quant a elle form e de chain
90. et al 2003 peut tre mis en parall le avec l impact sur les bact ries Ceci pourrait s expliquer par la conservation dans l volution des chloroplastes et mitochondries originellement issus de bact ries dont la ciprofloxacine pourrait bloquer la r plication Brain et al 2009 Pour le test Algaltox F on remarque principalement l apparition d une prolif ration avec le tamoxif ne et le cyclophosphamide tandis que les m langes induisent l encore une inhibition de la croissance Aucune toxicit chronique n est observ e avec des traitements de ciprofloxacine ce qui confirme les r sultats obtenus dans plusieurs tudes pr c dentes o seules des doses sup rieures 1 mg L induisaient une toxicit Lindeberg et al 2007 Liu et al 2011 Il est int ressant de noter qu l heure actuelle seules quelques tudes relatent une toxicit du cyclophosphamide mais pour des doses sup rieures au microgramme par litres Zounkova et al 2007 N anmoins ces approches ne refl tent pas les conditions environnementales o les organismes sont soumis des doses sub th rapeutiques D autre part bien que la valeur pr dite de concentration du cyclophosphamide n entrainant aucun effet PNEC ait t estim e 1 12 mg L pour P subcapitata Grung et al 2008 insistent sur le manque d information disponible concernant l cotoxicit de cette mol cule et ses m canismes d action sur cet organisme non cible Une tude
91. et les tubes mis goutter sur papier absorbant Pendant ce temps de l agarose NMP 0 8 85 uL est d pos e sur chaque lame recouvert d une lamelle et laiss reposer sur la glace 5 min La lamelle est retir e les cellules sont alors resuspendues dans 170 uL d agarose LMP 0 5 et 85 uL sont d pos s sur chacune des lames en duplicat puis recouverts d une nouvelle lamelle et laiss es repos es 5 min sur la glace Apr s avoir retir les lamelles une troisi me couche d agarose LMP 0 5 est finalement d pos e pour combler les trous Les lames sont ensuite plong e dans un bain de lyse contenant de la solution m re de lyse NaCl 2 5 M Na2EDTA 100 mM Tris 10 mM N Lauroyl sarcosinate pH 10 du triton X 100 et du DMSO et laiss es en contact pendant 1h30 a 4 C Le temps de contact doit rester le m me entre les s ries d exp rimentation afin de pouvoir comparer les r sultats f d naturation et distorsion de cellules emprisonn es l h lice d ADNdans tampon dans un gel d agarose lyse ee milieu d lectrophor se pH13 alcalin pH10 neutralisation pH7 et coloration l migration sous champ lectrique observation au microscope et mesure du taux de cassures PADN t te queue Figure 19 Etapes du test Com te en condition alcaline th se C Michel 2011 Au terme des 1h30 les lames sont retir es du bain de lyse et dispos es dans une cuve d
92. et ou g notoxiques Par contre la d tection des adduits encombrants par la technique de post marquage est beaucoup plus sensible Ainsi le test des com tes r alis sur les cellules mammaires MCF 7 ne permet pas de visualiser des cassures l ADN alors que des adduits sont form s Par ailleurs m me si les m canismes de g notoxicit d tect s sont intrins quement diff rents entre les tests YES YAS le test des com tes sur cellules h patiques ou encore la technique de post marquage sur les deux lign es cellulaires ils permettent de d tecter simultan ment la g notoxicit d un m me chantillon analys Dans certains cas seul le marquage des adduits permet de caract riser la toxicit de l effluent Le fait de ne pas trouver en parall le de cassures peut tre d au fait que le temps d exposition pour la d termination des cassures n est pas ad quate soit trop long pour visualiser les cassures provoqu es par un stress oxydatif soit trop court pour visualiser les effets de r paration des l sions Concernant plus particuli rement le test YES YAS on observe que l essai est plut t sensible de par les taux de toxicit enregistr et le nombre d chantillons r v l s g notoxiques Ind pendamment de la date ou du lieu de pr l vement les activit s agonistes ou antagonistes des r cepteurs aux strog nes hERa ou aux androg nes hAR sont d tect es jusqu des dilutions de 10 Cependant il est impo
93. et ou mesurables divers niveaux d organisation biologique mol culaire biochimique cellulaire physiologique ou comportementale qui r v lent l exposition pr sente ou pass e d un individu au moins une substance chimique caract re polluant Lagadic et al 1997 L id e n est pas nouvelle c est le principal diagnostique en m decine humaine fond e sur la d tection de sympt mes susceptibles de r v ler une maladie Lafaurie et al 1992 Le fondement historique de l approche biomarqueur est d ailleurs troitement li aux avanc es en m decine et biologie des invert br s National Reasearch Council NRC 1987 De mani re g n rale il est d usage de distinguer diff rents types de biomarqueurs pouvant r v ler la fois une toxicit aig e et chronique sur les organismes Ramade 2007 tableau 8 les biomarqueurs d exposition d tectent la pr sence de certains contaminants dans le milieu et indiquent que l organisme a bien t en contact avec ces substances Cependant la r ponse n implique pas obligatoirement d effets d l t res sur l organisme les biomarqueurs d effets indiquent un d passement des capacit s de r gulation de l organisme qui va se traduire par des effets biologiques Toutefois on notera que la mise en uvre des biomarqueurs mesur s au niveau sub individu des fins de surveillance de la qualit du milieu ou d un diagnostic de stress toxique pr sente d
94. fra chement isol es Enfin les lign es cellulaires sont soumises des ph nom nes de vieillissement et on peut voir leur ph notype voluer avec le nombre de passage Ceci entra ne des limites et des pr cautions d emploi Certains aspects importants sont difficiles tudier sur les lign es cellulaires Par exemple l tude de la r gulation de la r plication cellulaire est d licate sur ces lign es dont la transformation assure une prolif ration ind finie Par ailleurs certaines caract ristiques des contacts intercellulaires tels la pr sence de tight junctions peuvent manquer limitant les possibilit s d tude de la perm abilit cellulaire Les lign es cellulaires constituent n anmoins un outil pr cieux en biologie cellulaire et toxicologie sous r serve d une utilisation r fl chie pour l tude d un m canisme pr cis 111 2 2 c 2 Description des lign es utilis es Au cours de ce travail de th se nous avons utilis deux lign es cellulaires pour valuer la g notoxicit des m dicaments seuls ou en m lange et des chantillons bruts d eaux us es 111 2 2 c 2 1 Les cellules h patiques humaines HepG2 La lign e de cellules HepG2 ATCC HB 8065 a t tablie par Aden et al 1972 partir d un carcinome h patocellulaire provenant d un homme adulte Ces cellules sont de type pith lial non tumorig nes et conservent les propri t s de cellules h patiques primaires telles que leur activit de
95. h patiques humaine HepG2 expos es 24 het 72ha diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide ccceececesccenseceeeeeceneeessaeeseneeceeneecsnetseanesanassseneessnnseteanens 96 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour les cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide esse 97 Taux de survie des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de m lange en doses inverses de ciprofloxacine tamoxif ne 98 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour les cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h et 72 h aux m langes CIP TAM en O0Se INVerS S sun in Mn ee mn ns nn patie Gee 99 Taux de survie des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h et 72 h des concentrations croissantes de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide 100 Taux de survie des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide 0 22 ccccceececeeeceeneececececeeeesaaeeseneeceneeecsanetsasseesseceeneesseneesaes 101 Comparaison des ratios v
96. human breast cancer cells Annals of Surgical Oncology 2 238 245 Pfohl Leszkowicz A 1994a Detection of DNA adducts as biomarkers for exposure to environmental carcinogens Analusis 22 M12 M15 Pfohl Leszkowicz A 1994b Effet des canc rog nes sur la m thylation biologique de l ADN et d tection des adduits l ADN Regard sur la Biochimie 3 51 61 Pfohl Leszkowicz A 2008 Formation persistence amp significance of DNA adduct formation in relation to some pollutants from a board perspective Advance Toxicol 2 183 240 Pfohl Leszkowicz A Castegnaro M 2005 Further arguments in favour of direct covalent binding of Ochratoxin A OTA after metabolic biotransformation Food AddContam Suppl 1 75 87 Pfohl Leszkowicz A Chakor K Creppy EE Dirheimer G 1991 DNA adducts formation after treatment of mice with ochratoxine A IARC Scientific Public 115 Mycotoxins Endemic Nephropathy and Urinary Tracts Tumours 245 253 Pfohl Leszkowicz A Weber Lofti F Masfaraud JF Devaux A Laouedj A Guillemaut P Malaveille C Rether B Monod G Dirheimer G 1993 DNA adduct detection some applications to monitor exposure to environmental genotoxic chemicals IARC Scientific Public 124 Postlabelling methods for detection of DNA adducts 373 378 PhACT Database 2006 Pharmaceutical Research and Manufacturers of America PHRMA Phillips DH 2005 DNA adducts as markers of exposure and risk Mut Res Fundam Mol Mecha Mutagenesis 577 284
97. intercellular communication at low doses but inhibition at high doses etc for a review see Hoffman 2009 Hormesis is a biphasic dose response that often results from the actions of partial agonists and partial antagonists For example CIP which inhibited bacterial topoisomerase gyrases type Il decrease cell viability Herold et al 2002 which has been correlated to apoptotic Bax gene Aranha et al 2000 In the same way TAM inhibited telomerase leading to apoptosis in HePG2 cells Brandt et al 2004 2005 At least acrolein interfered with NFkB and transcriptor factor AP1 inducing apoptosis Keher amp Biswal 2000 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 Environmental and Molecular Mutagenesis Page 16 of 42 In the second part of this study we analyzed the genotoxicity of sewage and purified water using both comet assay DNA breaks formation and post labelling DNA adducts formation Cyclophosphamide tamoxifen and ciprofloxacin were detected in these hospital effluents and in the urban influents of the sewage treatment plant although most of them were totally eliminated after WWTP Only cyclophosphamide tamoxifen and ciprofloxacin were found in both WWTP effluent and in the receiving river at a concentration rang
98. lange A B 10 0 100 7 17R Estradiol CIP TAM CTC 4 Hydroxytamoxifen CIP TAM CTC 8 0 80 p o 6 0 Y 6 0 d 5 Le e 40 2 49 sis f O LT fi I a T 20 2 E bas i Re K x 0 0 0 0 1 0E 12 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Concentration g L Concentration g L Figure 41 Evaluation du potentiel agoniste A et antagoniste B sur les r cepteurs strog niques hERa YES apr s l exposition de levures S cerevisiae des m langes binaires CIP TAM courbe bleue et ternaires CTC courbe marron Les r sultats sont consid r s statistiquement significatives p lt 0 05 Les valeurs obtenues avec la condition contr le est d crite par la courbe verte Concernant le potentiel antagoniste des m langes on n observe une inhibition de l activit des r cepteurs hERa que lorsque les levures sont expos es au m lange ternaire CTC dilu a 10 10 mg L de chaque mol cule en m lange L activit antagoniste est 1 5 fois p lt 0 05 moins importante que l activit basale des r cepteurs Si on compare cette activit celle mesur e lorsque les levures n taient expos es qu au tamoxif ne on constate que pour le m lange ternaire elle est nettement moins lev e et que pour le m lange binaire il n y a plus d activit La ciprofloxacine inhibe totalement l effet antagonist
99. langes binaires et ternaires de mol cules se traduisent plus particuli rement par une dose r ponse non monotone refl t e par une courbe en U invers e Ce type de ph nom ne appel horm se est caract ristique des perturbateurs endocriniens notamment Il s agit d une r ponse de type biphasique II y a pour les faibles doses d exposition une amplification de la r ponse puis une rediminution 50 CIP TAM 1 CTE 40 4 30 20 10 5 Bioluminescence inhibition 10 CONDITIONS Figure 25 Inhibition de la bioluminescence chez Vibrio fischeri expos e 30 minutes a diff rentes concentrations de m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM gris fonc ou ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC gris clair Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 en comparaison aux cellules t moins non expos es diff rence significative P lt 0 05 entre les expositions aux m langes CIP TAM et CTC L exposition aux m langes des plus petites doses de CIP et TAM 10 ng L CIP 10 ng L TAM condition 1 n entraine aucune toxicit L augmentation des doses conditions 2 3 induit une inhibition significative de la bioluminescence comprise entre 15 et 20 p lt 0 01 Cette inhibition diminue pour la condition 4 pour ne plus tre observ e aux plus fortes concentrations
100. lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement 140 Tail DNA 20 0 R sultats amp Discussion Partie 2 Concernant la toxicit des effluents en entr e de STEP a 24 h les chantillons du mois de Novembre N2 et Janvier J2 induisent des cassures l ADN figure 64 A Le taux de cassures avoisine 10 et aucune diff rence significative n est mesur e entre les chantillons Le taux de cassures est significativement diff rent p lt 0 05 de ceux obtenus avec les effluents hospitaliers et ceux de sortie de STEP Pour ce qui est des pr l vements d eaux en sortie de STEP seul l chantillon du mois de Janvier induit significativement p lt 0 05 des cassures l ADN Le taux de cassure est significativement diff rent p lt 0 05 de celui des effluents en entr e de STEP mais il est quasiment identique compar aux effluents hospitaliers Apr s 72 h d exposition figure 64 B les effluents hospitaliers N1 et D1 induisent toujours significativement des cassures l ADN mais a des taux l g rement plus faibles que ceux observ s a 24 h L chantillon du mois de Janvier J1 induit une g notoxicit un peu plus importante a 72 h d exposition qu 24 h C est le cas galement de l chantillon N2 entr e de STEP Apr s 72h d exposition plus aucun des chantillons issus des eaux en sortie de STEP N3 D3 J3 n induit de cassure de l ADN su
101. linhibition Ces 2 tests r v lent des effets aquatiques d l t res chroniques sur les organismes photosynth tiques Effets chroniques plus prononc s et apparition de ph nom nes d horm se 30 72h 7j 24h 72h 24h 72h Inhibition Pe 7 Inhibition CIP 0 Inhibition Inhibition 0 0 100 ug L horm se A P Inhibition TAM 0 Croissance 0 Inhibition 0 0 horm se Fs Inhibition puis mind a an AEA Inhibition Inhibition Prolif ration DE CP 0 prolif ration Inhibition Inhibition h Sao N 10 ug L horm se 10 ug L orm se Ly Inhibition Inhibition roe Inhibition CIP TAM Inhibition A Inhibition 0 0 horm se A horm se horm se JIN Inhibition a Inhibition Inhibition aux fortes Inhibition CTC Inhibition 0 0 antagonisme antagonisme doses horm se N inhibition induite par CP pourrait tre d une modulation de l expression de prot ines pro et anti apoptotiques En dose invers e on note une inhibition horm se Tableau 15 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de bioessais refl tant les effets aigus viabilit bact rienne et cellulaire humaine et chroniques inhibition de la croissance algale et lenticulaire O aucune toxicit n a t observ e BIOMARQEURS DE GENOTOXICITE Test YES YAS Test des cometes Post marquage des adduits au P R cepteur hERa
102. matrice ou des polluants consid r s D autre part on peut souligner d autres limites concernant ces essais comme notamment l utilisation d un nombre restreint d esp ces et leur r alisme cologique limit tant donn qu ils sont r alis s dans des conditions d environnement conventionnelles souvent fort loign es des conditions environnementales naturelles De plus on peut noter que dans le cas de leur utilisation pour l valuation de l cotoxicit des effluents deux limites suppl mentaires apparaissent Il s agit d une part de la difficult de r aliser des essais de toxicit long terme compte tenu de l volution possible de l effluent au cours du temps et d autre part de l impossibilit de pr ciser la ou les substance s l origine de l ventuelle toxicit mise en vidence I11 2 1 a Le test Microtox Le test Microtox est un test de toxicit standardis AFNOR T 90 320 qui utilise une suspension de bact ries marines luminescentes Vibrio fischeri pour mesurer la toxicit aigu de solutions aqueuses Le ph nom ne de luminescence est produit au cours d un enchainement de processus m taboliques de la glycolyse et de la respiration cellulaire mettant en jeu l enzyme lucif rase et des coenzymes d oxydor duction Mayfield 1993 L inhibition d une seule de ces nombreuses enzymes par l interaction avec des polluants est r v l e par une perturbation de la luminescence Le Microtox
103. n ral mais souligne aussi et surtout l importance d y int grer des biomarqueurs de g notoxicit Ainsi la batterie de tests utilis e ici est pertinente puisqu elle nous a permis de caract riser globalement la toxicit des chantillons Toutefois il est n cessaire de rappeler que les analyses physico chimiques de ces effluents sont incompl tes et qu il est difficile de corr ler la toxicit observ e la seule pr sence de mol cules m dicamenteuses dans les eaux us es De plus l utilisation en parall le des tests a montr que le profil de toxicit d un chantillon n tait pas toujours le m me selon les organismes Les r sultats pr sent s ce stade ne permettent donc pas de conclure quant au risque environnemental li aux rejets de m dicaments anticanc reux dans les effluents On notera cependant que le test Algaltox FTM laisse supposer qu une prolif ration des algues en sortie de STEP pourrait conduire un ph nom ne d eutrophisation ou encore que la formation d adduit l ADN pourrait entrainer des mutations plus moins grave chez les organismes expos s Des recherches suppl mentaires seront n cessaires pour venir confirmer ces hypoth ses 150 R sultats amp Discussion Partie 2 151 152 Conclusions amp Perspectives 153 154 Conclusions amp Perspectives L mergence au XX si cle d une m decine technico scientifique a permis l homme d influer sur sa propre desti
104. non target organisms Until today ecotoxicological effects have been assessed by biomonitoring using standardized tests or by no specific in vitro assays principally on aquatic life Such tests however may not be suitable for anticancer drugs Zounkova et al 2010 Tools to characterize the efficacy of drug removal processes and to assess the impact of these pollutants on aquatic life and human health must be further developed and refined Currently the application of genotoxicity assay is an important approach for investigating the causal relationship between exposure to environmental pollutants and the human health effects Pellacani et al John Wiley amp Sons Inc Page 2 of 42 Page 3 of 42 OONOOARWND 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 Environmental and Molecular Mutagenesis 2006 Cavalcante et al 2008 Pfohl Leszkowicz 2008 Genotoxicity biomarkers are now considered to be an integral part of this approach because exposure to genotoxic agents may exert damage beyond that of individuals and may be detected through several generations Frenzilli et al 2009 Phillips 2005 The Comet assay has already been included in the strategy guidelines for the testing of chemicals mutagenicity EFSA 2012 A previous risk assessment of low doses of antineoplastic compounds using a
105. out using the same solution for 20 min at 26 V and 350 mA 0 8 V cm then the slides were gently washed three times for 5 min in a cold neutralizing buffer 400 mM Tris pH 7 4 Slides were dried in methanol and stored in low humidity environment until analysis Slide analysis Few minutes before analysis 50 uL of ethidium bromide 40ug mL were dropped onto the agarose and covered with a coverslip Fifty cells per slide were randomly scored at 250X magnification with an Olympus BX50 fluorescence microscope equipped with an excitation filter of 515 560 nm and a barrier filter 590 nm DNA damage was quantified by tail DNA and median values were calculated by Komet 5 5 image analysis system ANDOR Technology Belfast UK Positive control was run using ethyl methanesulfonate EMS John Wiley amp Sons Inc Page 9 of 42 J O O1 BR D 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 Environmental and Molecular Mutagenesis Statistical analysis All samples were tested in duplicate and experiments were independently performed three times under the same conditions Results were calculated in median values with standard deviation SD The measured values were compared with the standard condition using an analysis of variance ANOVA followed by Fisher s test Statistical sign
106. patiques HepG2 mais une inhibition stricte chez l algue et la lentille d eau Les m langes de CIP TAM d crivent galement cette tendance La r ponse peut tre encore plus complexe lorsque les cellules sont expos es des doses inverses Nous avons pu constater par exemple une diminution de la viabilit des cellules mammaires MCF 7 avec les m langes en doses invers es tandis que les m langes de doses croissantes n entrainent pas de toxicit Dans le cas des cellules humaines ces variations de la viabilit pourraient s expliquer par l interaction de la ciprofloxacine sur les CYP mais galement avec une d r gulation de l expression des prot ines p53 impliqu es dans le cycle cellulaire L incapacit des cellules s adapter un stress g notoxique pourrait entrainer des mutations ou la sous expression de ces prot ines et r sulterait au final un ph nom ne d apoptose C est d ailleurs le lien qui a pu tre observ entre la mortalit des cellules h patiques expos es aux m langes et l apparition de cassures l ADN sur ce m me mod le Ces ph nom nes d adaptation sont bien pr sents puisque nous avons pu voir avec l application des diff rents bioessais et biomarqueurs l apparition de ph nom nes d horm se Dans les gammes de concentrations test es 10 ng L 10 pg L la dose r ponse observ e avec les cellules h patiques expos es la ciprofloxacine au tamoxif ne et au cyclophosphamid
107. plus faible compar e un traitement de 10 ng L L exposition une concentration 10 fois plus importante 100 ug L r duit significativement p lt 0 01 la viabilit pour atteindre un taux de survie quasiment identique Les pourcentages de cellules viables expos es 100 ug L de ciprofloxacine sont respectivement de 90 et 80 apr s 24 h et 72 h Apr s 24 h d exposition la courbe semble dessiner un S cependant les carts types enregistr s ne permettent pas de conclure avec certitude de l apparition d un ph nom ne d horm se Par contre cet effet est clairement observ 72h A B 105 m Al 100 z j gt i i Sa 1x pt i 4 _ es ws i 5 fo i 4 z kk k Pe me kk a ak ETS 90 fase ae we d ek kk 85 T P de xx t k 7 r T r 80 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Concentration ug L Figure 31 Taux de survie des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B a diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne e et cyclophosphamide A Les r sultats sont exprim s en moyennes et les valeurs sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 95 Cell viability 105 100 95 90 85 80 R sultats amp Discussion Partie 1 Lorsque les cellules sont expos es au tamoxif ne la courbe d crit galement une dose
108. ponse de l exposition des algues simultan ment aux m langes CIP TAM CP est quasiment identique celle observ e lors de l exposition CIP TAM Ceci montre que l addition de cyclophosphamide au m lange n entraine aucun effet suppl mentaire sur la croissance algale 1 3 Evaluation de l inhibition de la croissance de lentilles d eau Lemna minor Des cultures de lentilles d eau 3 s ries en triplacata ont t expos es pendant 7 jours cons cutifs diff rentes doses de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide Au terme du temps d exposition le nombre de frondes a t mesur pour chaque condition et compar la condition contr le figure 28 L incubation des cultures est effectu e dans un syst me statique sans 91 R sultats amp Discussion Partie 1 renouvellement et dans des conditions de temp rature et de lumi re contr l es Les r ponses mesur es int grent les effets de toutes les composantes chimiques physiques et biologiques de l chantillon pouvant affecter le potentiel de croissance de l organisme v g tal aquatique Le tamoxif ne n entraine aucune toxicit significative vis a vis de la croissance des lentilles d eau expos es aux doses test es On observe que la ciprofloxacine induit une r ponse de toxicit chronique dose d pendante Une exposition des lentilles d eau 10 ng L CIP inhibe la croissance de 10 p lt 0 05 Cette inhibition peut atteindre 60
109. que les niveaux d activit strog nique mesur s dans les s diments pouvaient tre jusqu 700 fois plus lev s que ceux mesur s dans les eaux de surface du m me site Cela confirme la capacit d accumulation de ces mol cules dans les s diments Peck et al 2004 1 4 3 c G notoxicit Il y a eu un int r t grandissant ces derni res ann es pour la recherche des effets g notoxiques li s la l exposition a des g notoxines dans l environnement Pfohl Leszkowicz et al 1993 Pfohl Leszkowicz 1994 2008 La g notoxicit repr sente la capacit d une substance induire des dommages l ADN et aux chromosomes des cellules De par leurs caract ristiques chimiques intrins ques et leurs effets th rapeutiques de nombreuses substances pharmaceutiques sont g notoxiques C est le cas par exemple des mol cules cytostatiques utilis es dans le cadre de chimioth rapie pour une revue voir Sorsa et al 1985 ou encore des antibiotiques Ehlhardt et a 1988 Giuliani et al 1996 Du fait qu un cancer est suppos tre provog r n importe quel niveau d exposition un compos g notoxique le risque r side dans l absence d une dose seuil en dessous de laquelle aucun effet canc rog ne ne puisse pas se produire Webb et al 2003 De plus certaines tudes ont montr que la toxicit pouvait tre influenc e par des effets additifs et ou de synergie Daughton amp Ternes 1999 Pomati et al 2006 2007
110. qui consiste a transformer une cellule normale en cellule initi e a travers le d veloppement de d fauts g n tiques L initiation tumorale est une tape irr versible qui passe par une exposition a un agent initiateur chimique physique U V radiations ou viral appel canc rog ne Les alt rations du mat riel g n tique sont de diff rents types selon qu il s agit de mutations d aberrations chromosomiques ou de dommages primaires de l ADN Si cette alt ration est stabilis e apr s une ou deux r plications cellulaires les cellules sont alors dites initi es La promotion qui permet aux cellules initi es d acqu rir la facult de prolif rer de fa on autonome ce qui conduit la formation des l sions pr n oplasiques tumeurs b nignes La phase de promotion tumorale se distingue de la phase d initiation par plusieurs caract res dont la r versibilit le retrait de la substance promotrice peut entra ner la r gression des l sions pr canc reuses dans certains cas Bien que les m canismes impliqu s dans la promotion tumorale soit encore mal connus des perturbations dans les m canismes de signalisation cellulaire surexpression d oncog nes par exemple pourrait entre autre jouer un r le essentiel Weinstein 1988 La progression qui est caract ris e par le passage d une l sion pr n oplasique un n oplasme tumeur maligne Cette phase pr sente une grande instabilit g nomique faisant appel
111. r paration de l ADN La d tection des adduits encombrants par la technique de post marquage apparait clairement comme l outil le plus sensible de la batterie de test L utilisation de ce biomarqueur dans l analyse de la g notoxicit des effluents a permis de r v ler pour chaque chantillon la pr sence importante d adduits l ADN On note aussi que le nombre d adduits d tect s en valeur absolue est plus important pour les cellules h patiques compar aux cellules mammaires De mani re qualitative dix adduits sont d tect s dans les cellules h patiques alors que seulement cinq sont form s sur les cellules mammaires Parmi ces adduits trois d entre eux 1 2 et 6 sont retrouv s dans les deux types de lign es cellulaires Par ailleurs on peut observer que pour les cellules h patiques la g notoxicit induite par les chantillons en entr e de STEP N2 D2 et J2 est toujours la plus importante que tous les autres effluents L augmentation de la g notoxicit entre les effluents hospitaliers et les effluents en entr e de STEP pourrait s expliquer par un ph nom ne de conjugaison d conjugaison des mol cules chimiques dans les effluents en entr e de STEP mais galement par une concentration des contaminants via les rejets domestiques urbains On constate galement qu il y a un abattement de la toxicit en sortie de STEP ind pendamment de la p riode de pr l vement Pour les cellules mammaires c est au co
112. r ponse non monotone courbe en S quel que soit le temps d exposition Ce ph nom ne d horm se est plus prononc 72 h et l inhibition de la viabilit s amplifie de 5 pour les doses interm diaires 100 ng L 1 ug L et de 10 pour la plus faible 10 ng L et la plus forte 10 ug L dose test e Bien que les courbes du tamoxif ne et de la ciprofloxacine soient relativement semblables a 72 h la plus forte dose de tamoxif ne 10 ug L entraine une inhibition plus importante dela viabilit des cellules par rapport un traitement identique de ciprofloxacine Enfin quel que soit le temps d exposition des cellules h patiques au cyclophosphamide une faible diminution p lt 0 05 de la viabilit est observ e pour la plus forte dose test e 10 ug L figure 32 A B Une dose de 10 ng L entraine aussi une toxicit significative p lt 0 01 uniquement apr s 72 h figure 32 B et met en vidence l apparition d une courbe en U horm se A B 105 i 100 E PE ey kk Fe i l P iz 95 xe ee T i pan i x o __ LI 90 i z 85 gt Li a 7 80 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS CONDITIONS Figure 32 Taux de survie des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B a diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne m et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide X Les r sultats sont exprim s en moyennes et
113. r sultats obtenus en de cellules h patiques HepG2 expos es pendant 24 h A et 72 h B a des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC E O repr sente le ratio entre valeur attendue E et valeur observe O 97 R sultats amp Discussion Partie 1 Quelles que soient les concentrations relatives le type de m lange binaire ou ternaire test et le temps d exposition des cellules h patiques HepG2 on constate que les ratios E O observ s sont toujours strictement inf rieurs a 1 Ces r sultats indiquent qu un effet antagoniste intervient lorsque les mol cules tudi es sont pr sentes simultan ment m me aux plus faibles doses test es De plus l antagonisme est plus prononc en pr sence de cyclophosphamide compar aux m langes CIP TAM 1 4 1 6 Etude de la toxicit des m langes CIP TAM en doses croissantes inverses Nous avons vu pr c demment qu en m lange de tr s faible quantit de m dicaments taient capables d entrainer une toxicit alors que souvent seuls ils ne modulaient pas la viabilit cellulaire Dans le chapitre 4 1 a nous avons tudi l interaction des m langes constitu es de doses croissantes de mol cules Comme deux produits entrainent des ph nom nes d horm se nous nous sommes demand si seul le rapport de concentration entre les produits tait important ou si de faible concentration de l un pouv
114. se de doctorat des sciences de la vie Intitul toxicologie de l environnement Universit de Metz cole doctorale RP2E 200p 174 Bibliographie Levenson A S Jordan V C 1997 MCF 7 the first hormone responsive breast cancer cell line Cancer Research 57 3071 3078 Lewis D F 2004 57 varieties the human cytochromes P450 Pharmacogenomics 5 305 18 Li D Yu T Zhang Y Yang M Li Z Liu M Qi R 2010 Antibiotic resistancecharacteristics of environmental bacteria from an oxytetracycline productionwastewater treatment plant and the receiving river Applied Environmental Microbiology 76 3444 3451 Li J Al Azzawi F 2009 Mechanism of androgen receptor action Maturitas 63 2 142 148 Lin Z Du J Yin K 2004 Mechanism of concentration addition toxicity they are different for nonpolar narcotic chemicals and reactive chemicals Chemosphere 54 11 1691 1701 Lindberg R H Bj rklund K Rendahl P Johansson M I Tysklind M Andersson B A V 2007 Environmental risk assessment of antibiotics in the Swedish environment with emphasis on sewage treatment plants Water Research 41 613 619 Liu B Nie X Liu W Snoeijs P Guan C Tsui M T K 2011 Toxic effects of erythromycin ciprofloxacin and sulfamethoxazole on photosynthetic apparatus in Selenastrum capricornutum Ecotoxicology and Environmental Safety 74 1027 1035 Livingstone D R Chipman J K Lowe D M Mini
115. sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement 144 R sultats amp Discussion Partie 2 De mani re globale on observe une tendance identique pour chaque mois de pr l vement avec une diminution importante p lt 0 01 de la toxicit depuis l h pital jusqu la sortie des eaux de la station d puration On peut galement observer que le mois de Janvier induit la formation du plus grand nombre d adduits tandis que le mois de D cembre semble tre le moins g notoxique DISCUSSION Dans ce chapitre nous avons appliqu les tests retenus dans l tude de la toxicit de mol cules mod les Cette batterie de test a permis de mettre en vidence plusieurs r ponses de toxicit aigu et chronique La synth se des r sultats est pr sent e dans les tableaux 19 et 20 Au cours de cette analyse in situ nous avons constat que tous les tests l exception de la viabilit cellulaire et la formation des cassures l ADN sur cellules MCF 7 permettent de distinguer soit les p riodes de pr l vements soit les lieux de pr l vements L interpr tation peut sembler complexe car les r ponses ne sont pas identiques Il f
116. sur la lign e h patique Ce dernier point met en exergue l importance d utiliser les deux lign es cellulaires de mani re compl mentaire dans le cadre d une analyse par post marquage afin d affiner les profils de toxicit des effluents De plus cette lign e cellulaire est la cellule mod le pour tester les mol cules ayant des propri t s de perturbateur endocrinien L ensemble des r sultats pr sent s dans cette deuxi me partie nous a permis de mettre vidence l importance du choix des essais dans le cadre d une analyse de la toxicit des rejets hospitaliers La m tabolisation des contaminants dans l eau par les organismes expos s montrent clairement que les mol cules ont des cibles et des modes d action diff rents Comme les effets toxiques d pendent du temps d exposition et des doses de m dicaments dans les effluents certains tests peuvent s av rer n gatifs alors que des substances toxiques sont bien pr sentent cette constatation jusitifie l utilisation de plusieurs tests en parall le Bien que l on puisse admettre que l absence d effets r v l s par un bioessai ou un biomarqueur au cours d une analyse puisse tout simplement signifier que l chantillon n est pas toxique on constate ici que dans certains cas les r sultats peuvent apparaitre comme faux n gatifs Cela confirme l importance d utiliser des batteries de tests d co toxicit dans l valuation du risque environnementale des rejets en g
117. sur la souche de levure Saccharomyces cerevisiae qui a t g n tiquement modifi e pour identifier les compos s interagissant avec les r cepteurs humains aux strog nes test YES et aux androg nes test YAS Pour cela soit les s quences g nomiques 64 Mat riels amp M thodes des r cepteurs cestrog niques hERa soit celle des r cepteurs androg niques hAR ont t ins r es dans le chromosome principal des levures De plus les cellules contiennent galement un plasmide d expression portant le g ne rapporteur LacZ codant l enzyme B galactosidase Routledge amp Sumpter 1996 Sohoni amp Sumpter 1998 D s la liaison au ligand les hERa et hAR interagissent avec le domaine de liaison correspondant LBD sur le plasmide d expression et d clenchent la transcription du g ne rapporteur lacZ La f galactosidase secr t e dans le milieu convertit le substrat jaune chlorophenolred B D galactopyranoside CPRG en produit de d gradation rouge quantifiable par colorim trie La D O mesur e 570 nm est directement proportionnelle la quantit de B galactosidase secr t e et r v le ainsi l activit de la substance test e qui a interagit avec le r cepteur correspondant L essai mesure galement les effets cytotoxiques qui induisent l arr t de la croissance cellulaire ou la lyse des cellules par spectrophotom trie 690 nm 1 4 2 Protocole Des microplaques 96 puits sont ensemenc es avec des cult
118. sur plusieurs fonctions de l organisme L un des m canismes majeurs qui relaient ces alt rations implique la fixation des PE aux r cepteurs nucl aires et la modulation des r ponses g niques r gul es par ces r cepteurs Cette modulation peut tre de type agoniste activation ou antagoniste inhibition Parmi les r cepteurs connus on peut citer notamment les r cepteurs aux strog nes ER qui jouent un r le clef dans les processus de reproduction de d veloppement de comportement et de physiologie des organismes On peut galement citer les r cepteurs aux androg nes AR impliqu s dans la diff renciation sexuelle et le d veloppement des caract res sexuels secondaires chez les 49 Synth se bibliographique vert br s ou encore dans le m tabolisme et la r gulation du syst me immunitaire Li amp Al Azzawi 2009 L activation anormalement du ER conduit g n ralement une augmentation de la transcription de ses g nes cibles L augmentation de la synth se de vitellog nine Jobling et al 1998 une f minisation ou encore une intersexualit Nash et al 2004 Flammarion et al 2000 sont les effets les plus fr quemment rapport s En comparaison il existe moins d informations disponibles sur les ligands environnementaux du AR Les ligands identifi s chez l homme sont principalement des antagonistes et correspondent tr s fr quemment des agonistes du ER Depuis pr s de 30 ans des perturbati
119. the environment a review Chemosphere 36 357 393 Hartmann A Alder AC Koller T Widmer R M 1998 Identification of fluoroquinolone antibiotics as the main source of umuC genotoxicity in native hospital wastewater Environ Toxicol Chem 17 377 382 Hemminki K Rajaniemi H Koskinen M Hansson J 1997 Tamoxifen induced DNA adducts in leucocytes of breast cancer patients Carcinogenesis 18 9 13 Hernando MD Heath E Petrovic M Barcel D 2006 Trace level determination of pharmaceutical residues by LC MS MS in natural and treated waters A pilot survey study Anal Bioanal Chem 385 985 991 John Wiley amp Sons Inc Page 20 of 42 Page 21 of 42 J O O1 BR D 627 628 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 640 641 642 643 644 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 Environmental and Molecular Mutagenesis Hoffmann GR 2009 A Perspective on the Scientific Philosophical and Policy Dimensions of Hormesis Dose Response 7 1 51 Huang Z Roy P Waxman DJ 2000 Role of human liver microsomal CYP3A4 and CYP2B6 in catalyzing dechloroethylation of cyclophosphamide and ifosfamide Biochem pharmacol 59 961 972 Jean J Perrodin Y Pivot C Trepo D Perraud M Droguet J Tissot Guerraz F Locher F 2012 Identification and prioritization of bioaccumulable pharmaceutical substances discharged in hospital effl
120. 0 4 0 2 0 0 0 _ Ne gt 1 0E 12 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution 100 gt 178 Estradiol J1 J2 J3 8 0 6 0 40 e 2 0 A 0 0 1 0 12 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution Induction Ratio Induction Ratio Induction Ratio ANTAGONISME 10 0 4Hyontamanton NI N2 gt N3 8 0 0 0 os ge 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution 10 0 murs es 4 Hycontamadten lt D1 D2 D3 8 0 6 0 4 0 2 0 0 0 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution 10 0 sHy orytamauten JI J2 J3 8 0 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution Figure 62 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs cestrog niques YES de levures S cerevisiae expos es diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs A Novembre B D cembre C Janvier Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes Les diff rences sont consid r es significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 En ce qui concerne l inhition de l activit des r cepteurs cestrog niques effet antagoniste aucun chantillon pr lev au mois de d cembre n entraine un effet Par contre les effluents hospitaliers ainsi que ceux d entr e de STEP du mois de
121. 0 1 1 1 Les mono oxyg nase cytochrome P450 oe ceecccccceeeteeeeeeeeeeeeseeeeeseaeeeesaeeteneeesaees 22 lay Localibaton eo esses aiara Ronei EEE Rare ai RIDAN 22 WG Be STUC RP PR aaee 22 Il 1 1 c Classification et nomenclature des cytochromes P450 23 Il 1 1 d Implication dans la m tabolisation des x nobiotiques eeeeeeeeeeeeeteeteneeeeeees 23 RSS crs ss ceca vce as eee acne A TANE ent T AE en 25 RS LOIS TSU IDMCNONS sirean rasei avian daar T AiR 25 11 1 2 b Implication dans la m tabolisation des x nobiotiques sessseeseeseeeeeereeereeeeen 26 Lia Les gutathion S transieras oS enua a 27 le LOIS ot TONI sraa aaa RAA 27 11 1 8 b Implications dans le m tabolisme des x nobiotiques eceeeeeeeeeeeeeeeeeteeeneees 27 vii Table des mati res 11 2 Interactionsentre les x nobiotiques dans l Organisme ccsesseeteeeeeeeeeees 27 11 3 Notion g n rale de canc rog n se nnnnmennnrs 28 3 1 Les tapes de la CaNCGrOO OOS encinar eaae ainn iiaiai 30 1 3 2 M canismes mol culaires de la canc rog n se 31 1 3 8 Mol cules pharmaceutiques retenues pour l tude cesceeeececeeeeeeeeeeeaeeeeneeenaees 32 IL Tableau de synthese gonr al Bsc clacenccientsicietavarseitedeaseeranisucossabeetneedtvennaubapadertencons 33 1 3 3 La ciproilo 0210 1 incre ENEN E 33 ee Letanio INS nann E
122. 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS Figure 27 Inhibition de la croissance des algues P subcapitata expos es 72 h a diff rentes concentrations de m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM gris fonc et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC gris clair Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes et sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 L exposition des algues pendant 72 h aux diff rents m langes de m dicaments entraine une inhibition dose d pendante de la croissance des algues refl tant une toxicit chronique figure 27 De plus on observe un effet de potentialisation aux petites doses puisque les mol cules n entrainaient pas d effet individuellement Pour les concentrations plus importantes auxquelles le TAM engendrait une prolif ration on note un effet antagoniste qui se caract rise par une inversion de la r ponse de toxicit On notera galement que la ciprofloxacine joue un r le potentialisateur dans l intensit de la r ponse puisque les valeurs absolues de toxicit sont chaque fois plus importantes avec les m langes CIP TAM par comparaison avec les traitments de TAM seul Les concentrations de l ordre du nanogramme par litre induisent une inhibition moyenne de 20 de la croissance p lt 0 05 tandis que les plus fortes concentrations de l ordre du microgramme par litre entrainent une inhibition sup rieure 40 p lt 0 01 La courbe de r
123. 00 uL of SDS 20 were added and incubated for 10 min at 65 C Then 800 uL of potassium acetate 6 M pH 5 were added and the reaction mixture was kept at 0 C for 30 min After centrifugation for 25 min at 0 C 10 000g the supernatant which contained nucleic acids was collected The nucleic acids were precipitated overnight at 20 C by adding two volumes of cold absolute ethanol DNA pellets were collected and washed once with 1 mL of 90 ethanol and dissolved in 500 uL of SET 15 min at 37 C The total extract was mixed with 10 uL of a mixture of RNase A 20 mg mL and RNase T1 10 John Wiley amp Sons Inc Page 6 of 42 Page 7 of 42 J O O1 BR D 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 Environmental and Molecular Mutagenesis 000 U mL and incubated for 1 h at 37 C this treatment was repeated twice Samples were then treated with 25 uL of proteinase K solution 20 mg mL SET for 1 h at 37 C After digestion 500 uL of Rotiphenol were added and the mixture was moderately shaken for 20 min at room temperature Samples were centrifuged for 15 min at 15 C 10 000g and the aqueous phase was collected Five hundred microliter of chloroform isoamyl alcohol 24 1 were added the aqueous phase was collected and supplemented with 50 uL of sodium
124. 08 H pital 0 008 Chine Liu et al 2010 lt LOQ 0 04 Italie Verlicchi et al 2012 0 143 0 74 UK Roberts amp Thomas 2005 146 France Zini et al 2008 Effluent STEP Len 0 053 0 101 France Coestier et al 2009 Tamoxifene 0 141 0 224 Chine Yang et al 2011 0 013 0 071 UK Thomas amp Hilton 2004 0 022 0 025 France Coestier et al 2009 Eaux de surface 0 120 0 0129 Chine Yang et al 2011 0 018 0 023 Espagne Lopez Serna et al 2012 Eaux de boissons ND E 0 02 4 5 Suisse Steger Hartmann et al 1996 ae 4 4 France Zini et al 2008 H pital 0 9 4 4 Catastini et al 2008 0 9 4 5 Italie Verlicchi et al 2012 7 0 017 0 143 Suisse Steger Hartmann et al 1997 Cyclophosphamide STEP 0 3 0 4 France Zini et al 2008 0 03 0 4 Catastini et al 2008 lt LOQ 0 064 Roumanie Moldovan 2006 Eaux de surface ND Canada Metcalfe et al 2003 Eaux de boissons ND 2 E ND non d tect LOQ limite de quantification Tableau 5 Concentrations en ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide mesur es dans diff rents types d effluents travers le monde 39 Synth se bibliographique De mani re g n rale la ciprofloxacine le tamoxif ne et le cyclophosphamide sont retrouv s de fa on sporadique dans les effluents hospitaliers dans les eaux us es municipales et a de moindres concentrations dans les eaux de surface Les niveaux de contamination rencontr s sont extr meme
125. 124 125 126 Environmental and Molecular Mutagenesis conclusion Collins et al 2008 Lovell 2009 Furthermore a limitation of the Comet assay is that aneugenic effects which may be a possible mechanism for carcinogenicity and epigenetic mechanisms indirect of DNA damage such as effects on cell cycle checkpoints are not detected COM 2000 In contrast bulky DNA adducts formations induced by carcinogens in early stage of exposure are generally considered as the first step inducing the apparition of mutation leading to development of cancer Gy rffy et al 2008 Pfohl Leszkowicz 1994a b 2008 Phillips 2013 The term bulky DNA adducts was derived from the early experiments using 32P postlabeling that were aimed at the detection of adducts of polycyclic aromatic hydrocarbons PAHs Beach amp Gupta 1992 The term has been extended to include all relatively large aromatic and nonpolar carcinogen adducts The P Postlabeling analysis is an ultrasensitive method for the detection and quantitation of DNA adducts and covalent modifications of the DNA Rether et al 1990 Pfohl Leszkowicz et al 1991 1993 Phillips et al 1999 The assay requires only a few micrograms of DNA and allow the detection of DNA adduct as low as one adduct in 10 10 normal nucleotides It is applicable to a wide range of investigations in human animal and in vitro studies including monitoring exposure to environmental or occupational carcinogens det
126. 19 and the wild type CYP2C9 ILE359 allele as low Km catalysts of cyclophosphamide and ifosfamide activation Pharmacogenetics 7 211 Chapman P M 2006 Emerging substances Emerging problems Environmental Toxicology Chemestry 25 6 1445 1447 Charles G D Gennings C Zacharewski T R Gollapudi B B Carney E W 2002 Assessment of interactions of diverse ternary mixtures in an estrogen receptor alpha reporter assay Toxicology Application Pharmacology 180 11 21 Chou T C 2006 Theoretical Basis Experimental design and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies Pharmacological Reviews 58 621 681 166 Bibliographie Chou T C 2011 The mass action law based algorithm for cost effective approach for cancer drug discovery and development American Journal of Cancer Research 1 925 Chow L W Loo W T 2003 The differential effects of cyclophosphamide epirubicin and 5 Fluorouracil on apoptotic Marker CPP 32 Pro Apoptotic Protein p21 WAF 1 and anti apoptotic protein bcl 2 in reast Cancer Cells Breast cancer research and treatment 80 239 244 Christensen F M 1998 Pharmaceuticals in the environment A Human risk Regulatory toxicology and pharmacology 28 212 221 Cl ment B 1994 La toxicit aigu des lixiviats de d charge Apports respectifs et compl mentarit des approches biologique et physico chimique Th se de Biologie et Biochimie Appliqu es
127. 1999 Stumpf et al 1999 Zuccato et al 2000 elles sont souvent persistantes De plus elles ont souvent un caract re lipophile leur permettant de se bioaccumuler et apparaissent suffisantes pour pouvoir engendrer des effets adverses globaux ou sp cifiques sur les cosyst mes aquatiques et la sant humaine via les eaux de boisson par exemple Daughton amp Ternes 1999 Jorgensen amp Halling Sorensen 2000 Johnson et al 2008 Rowney et al 2009 Zegura et al 2009 l 4 3 a R sistances aux antibiotiques Les antibiotiques sont des polluants particuliers dans l environnement qui ont un effet diff rent des x nobiotiques communs puisque les bact ries en sont les cibles directes L utilisation accrue des antibiotiques ces derni res d cennies a caus entre autre une s lection g n tique de bact ries plus nuisibles Jorgensen amp Halling Sorensen 2000 Amenu 2014 Bien qu il semble que le d veloppement de r sistance aux antibiotiques soit favoris par la pollution de mani re g n rale d tergeants d sinfectants etc les concentrations d antibiotiques dans les eaux ou les s diments peuvent galement en tre la cause Attrassi et al 1993 K mmerer amp Henninger 2003 da Silva et al 2005 Szczepanowski et al 2009 De ce fait il pourrait par exemple y avoir des cons quences n gatives importantes sur la capacit microbiologique des STEP a purer les effluents Toutefois la quantit d infor
128. 2 1 4 3 Ecotoxicit Le risque potentiel associ la pr sence de produits pharmaceutiques a des faibles concentrations dans des milieux aquatiques est actuellement au c ur des d bats Pomati ef al 2006 Dans le milieu aquatique aucune tude in situ capable d valuer objectivement leurs impacts sur des organismes ou des communaut s n est actuellement disponible sauf dans le cas des hormones st ro diennes tant donn que ces compos s sont habituellement m lang s d autres substances actives dans les eaux us es Par cons quent les tudes cotoxicologiques doivent faire 18 Synth se bibliographique face a un certain nombre de difficult s et le risque potentiel associ a la pr sence des m langes de produits pharmaceutiques dans les eaux de surface reste le plus souvent inconnu N anmoins il ne peut tre exclu que la pr sence continue de mol cules pharmaceutiques dans les cosyst mes aquatiques et terrestres soit source de danger a long terme Garric amp Ferrari 2005 Par opposition a beaucoup de mol cules mises sur le march les substances m dicamenteuses sont sp cifiquement con ues pour avoir des effets biologiques pharmacologiques Bien que ces substances soient retrouv es dans l environnement aquatiques a de tr s faibles concentrations et bien en dessous des doses th rapeutiques utilis es Heberer et al 1997 Halling Sorensen et al 1998 Ternes 1998 Hirsch et al
129. 24 90 7 Halling Sgrensen B Nors Nielsen S Lanzky PF Ingerslev F Holten L tzhoft HC Jorgensen SE Occurrence fate and effects of pharmaceutical substances in the environment a review Chemosphere 1998 36 357 93 Hartmann A Alder AC Koller T Widmer RM Identification of fluoroquinolone antibiotics as the main source of umuC genotoxicity in native hospital wastewater Environ Toxicol Chem 1998 17 377 82 Hernando MD Heath E Petrovic M Barcel D Trace level determination of pharmaceuti cal residues by LC MS MS in natural and treated waters A pilot survey study Anal Bioanal Chem 2006 385 985 91 Hoffmann GR A perspective on the scientific philosophical and policy dimensions of hormesis Dose response 2009 7 1 51 Huang Z Roy P Waxman DJ Role of human liver microsomal CYP3A4 and CYP2B6 in catalyzing N dechloroethylation of cyclophosphamide and ifosfamide Biochem Pharmacol 2000 59 961 72 Jean J Perrodin Y Pivot C Trepo D Perraud M Droguet J et al Identification and prioriti zation of bioaccumulable pharmaceutical substances discharged in hospital effluents J Environ Manage 2012 103 113 21 Johnson AC J rgens MD Williams RJ Kimmerer K Kortenkamp A Sumpter JP Do cytotoxic chemotherapy drugs discharged into rivers pose a risk to the environment and human health An overview and UK case study J Hydrol 2008 348 167 75 Jonker MJ Piskiewicz AM Castella NII Kammenga JE Toxicity of binary mixtures of cadmium co
130. 3 0 11 89 22 0 15 91 29 0 38 91 03 1 77 82 51 0 18 CIP TAMexp 67 34 78 92 82 51 83 19 69 24 E O 0 780 0 88 0 90 0 91 0 81 CTC 95 33 1 46 99 72 0 07 98 87 0 78 98 24 0 82 95 36 1 54 CTCexp 64 12 78 26 81 72 82 38 66 91 E O 0 67 0 78 0 83 0 84 0 70 196 Synergism 2 5 e Additive effect o __ oat DRE w ee Antagonism 0 5 1 2 3 4 5 CONDITIONS N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 Synergism Additive effect CONDITIONS Fig 4 Drug combination plot Ratio expected E observed O versus concentration CIP TAM CTC x at 24 h A and 72 h B water samples especially if synergistic antagonistic or potentiating effects between the components occur Our study focused on the cytotoxic and genotoxic effects of three drugs from different chemical classes ciprofloxacin CIP a fluoroquin olone antibiotic cyclophosphamide CP a neoplastic chlorinated compound tamoxifen TAM an estrogenic compound used as an anti cancer agent Considering that these drugs can co occur in water the toxic effects of mixtures CIP TAM and CTC where compared to their individual effects Toxicology has long been dominated by an emphasis on very high doses and the assessment of toxic responses In comparison with human health risk assessment ecological risk assessment is poorly un derstood In the environment it is important to know what happens w
131. 34 Zegura B Heath E Cernosa A Filipic M 2009 Combination of in vitro bioassays for the determination of cytotoxic and genotoxic potential of wastewater surface water and drinking water samples Chemosphere 75 1453 1460 Zorita S M rtensson L Mathiasson L 2009 Occurrence and removal of pharmaceuticals in a municipal sewage treatment system in the south of Sweden Sci Total Environ 407 2760 2770 Zounkova R Kovalova L Blaha L Dott W 2010 Ecotoxicity and genotoxicity assessment of cytotoxic antineoplastic drugs and their metabolites Chemosphere 81 253 260 Zuccato E Castiglioni S Fanelli R 2005 Identification of the pharmaceuticals for human use contaminating the Italian aquatic environment JI Hazardous Materials 122 205 209 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 804 805 806 807 808 809 810 811 812 813 814 815 816 817 818 819 820 821 822 823 824 825 826 827 828 829 830 831 832 833 834 835 836 837 838 839 840 841 842 843 844 845 846 847 848 849 850 851 852 853 854 855 856 Environmental and Molecular Mutagenesis Page 26 of 42 Captions Legends of figures Figure 1 Chemical structure of Ciprofloxacin CIP A Tamoxifen TAM B Cyclophosphamide CP C Figure 2 DNA adduct pattern of DNA 4ug from HepG2 cells exposed to different condition during 24 h A control B cells exposed to TAM C cells exposed
132. 50 E CIP mTAM mCP S 40 E 30 4 2 20 e S oO o all Lath fle Te chen 3 0 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Figure 24 Inhibition de la bioluminescence chez la bact rie Vibrio fischeri expos e 30 minutes a diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP blanc tamoxif ne TAM gris et cyclophosphamide CP noir Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes et sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 L analyse des r sultats pr sent s dans la figure 24 n a pas permis de mettre en vidence une toxicit aigu significative du tamoxif ne et de la cyclophosphamide sur V fischeri Seule la concentration la plus lev e de ciprofloxacine 100 ug L induit une inhibition de la bioluminescence p lt 0 01 Ce r sultat n est pas surprenant puisque la ciprofloxacine est un antibiotique Par contre l extinction de la bioluminescence mesur e chez la bact rie marine expos e 30 min a diff rents m langes de m dicaments r v le une toxicit aigu figure 25 mettant en vidence l apparition d une action coalitive des mol cules pour les conditions 1 4 Pour la condition 5 la 88 R sultats amp Discussion Partie 1 r ponse de toxicit des m langes tant bien inf rieur a celle mesur e avec 100 ug L de CIP les r sultats font apparaitre un effet antagoniste des mol cules Les effets induits par les m
133. 7 109 Khan K N Knapp D W Denicola D B Harris R K 2000 Expression of cyclooxygenase 2 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder in dogs American Journal of Veterinary Research 61 478 481 Kim Y Choi K Jung J Park S Kim P G Park J 2006 Aquatic toxicity of acetaminophen carbamazepine cimetidine diltiazem and six major sulfonamides and their potential ecological risks in Korea Environment International 33 3 370 375 Kisanga E R Mellgren G Lien E A 2005 Excretion of Hydroxylated Metabolites of Tamoxifen in Human Bile and Urine Anticancer Research 25 6 4487 4492 Knasmuller S Parzefall W Sanyal R Ecker S Schwab C Uhl M Mersch Sundermann V Williamson G Hietsch G and Langer T 1998 Use of metabolically competent human hepatoma cells for the detection of mutagens and antimutagens Mutation Research Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 402 185 202 173 Bibliographie Kodawara T Masuda S Yano Y Matsubara K Nakamura T Masada M 2014 Inhibitory effect of ciprofloxacin on B glucuronidase mediated deconjugation of mycophenolic acid glucuronide Biopharmaceutics amp Drug Disposition sous presse Kristiansson E Fick J Janzon A Grabic R Rutgersson C Weijdegard B Sd derstr m H Larsson D G J 2011 Pyrosequencing of antibioticcontaminatedriver sediments reveals high levels of resistance and genetransfe
134. 7 262 Devillers J 2000 Limites et perspectives des mod les en cotoxicologie Club CRINenvironnement et soci t MATE Mod lisation en cotoxicologie ECRIN ed Paris pp 181 197 De Waziers Cugnenc P H Yang C S Leroux J P and Beaune P H 1990 Cytochrome P 450 isoenzymes epoxide hydrolase and glutathione transferases in rat and human hepatic and extrahepatic tissues The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 253 387 394 Dhawan A Bajpayee M Parmar D 2009 Comet assay A reliable tool for the assessment of DNA damage in different models Cell Biology and Toxicology 25 1 5 32 Doll T E Frimmel F H 2003 Fate of pharmaceuticals photodegradation by simulated solar UV light Chemosphere 52 1757 1769 168 Bibliographie Dowers T S Qin Z H Tatcher G R J Bolton J L 2006 Bioactivation of Selective Estrogen Receptor Modulators SERMs Chemistry Research in Toxicology 19 9 1125 1137 Dremont C Hadjali R 1997 La gestion des effluents liquides en milieu hospitalier m moire deDESS Technologies M dicales Hospitali res Compi gne Universit de Technologie deCompi gne 30p Drusano G L Weir M Forrect A Plaisance K Emm T Standiford H C 1987 Pharmacokinetics of intravenously administered ciprofloxacin in patients with various degrees of renal function Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31 6 860 864 Dunlap P V 1999 Corum reg
135. 7B oestradiol agoniste des r cepteurs cestrog niques ii 4 OH tamoxif ne antagoniste des r cepteurs cestrog niques iii 5 dihydrotestost rone agoniste des r cepteurs androg niques iv flutamide antagoniste des r cepteurs androg niques 1 1 1 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs strog niques hERa test YES Pour r aliser l essai les solutions m res de chaque m dicament ont t dilu es de mani re semi logarithmique Les gammes de dilution vont de 1 10 10 mg L 1 109 1 ng L pour chaque m dicament On constate que quelle que soit la concentration test e ni la ciprofloxacine CIP ni le cyclophosphamide CP n entrainent d effet agoniste ou antagoniste sur les r cepteurs hERa figure 40 A B 7 10 0 17R Estradiol CIP TAM CP 4 Hydroxytamoxifen CIP TAM CP 8 0 id 2 U z X 6 0 5 40 i DT 204 T 0 0 0E 12 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Concentration g L Concentration g L Figure 40 Evaluation du potentiel agoniste A et antagoniste B sur les r cepteurs cestrog niques hERa YES apr s l exposition de levures S cerevisiae diff rentes concentrations de ciprofloxacine courbe jaune tamoxif ne courbe bleue et cyclophosphamide courbe rouge Les r sultats sont consid r s statistiquement s
136. 8 h after plating the medium was discarded and fresh medium containing drugs individually or in mixtures as described in Table 1 at different concentra tions was added Cells were exposed to drugs during 24 to 72 h then 20 LL of the MTS reagent was added to each well and incubated for 2 h at 37 C 5 CO The reduction of MTS was monitored by recording the change in absorbance A at 490 nm using the automated Dynex plate reader The amount of reduced MTS was calculated as a percentage of the absorbance determined by comparison with the standard condition Percent surviving cells Atest sample Acontrolsample x 100 Table 1 Nominal concentrations of drugs used for treatments Unit Code conditions 0 1 2 3 4 5 Drugs individually CIP ug L 0 0 01 0 1 1 10 100 TAM ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 cP ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 Drugs in mixture CIP ug L 0 0 01 0 1 1 10 100 TAM ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 CIP ug L 0 0 01 0 1 1 10 100 TAM ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 cP ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 2 5 Alkaline single cell gel electrophoresis SCGE assay 2 5 1 Treatment Subcultures for experiments were prepared the day preceeding the test HepG2 cells were plated onto 12 multiwell plates at a density of 1 x 10 cells well and allowed to attach overnight The medium was then discarded and replaced by 2 mL of test medium and treated cells and control cells were incubated for 24 h to 72 h 2 5 2 Slide preparation The comet assay was perform
137. 81 qui peut atteindre une sensibilit de 1 adduit par 10 nucl otides Reddy amp Randerath 1986 Elle comporte les tapes suivantes figure 21 73 Mat riels amp M thodes w Ej ADN purifi 7 ug Hydrolyse enzymatique de ADN Nucl ase de staphylocoque Phosphodiest rase de rate N p X p Z pty pt S lection des adduits Nucl ase P1 d phosphoryle en 3 les nucl otides normaux N on X p Z p yY p Marquage des additis SH T4 Polynucl otide Kinase ATP Py ATP Py N on gt pX 3 p pZ p pY p Rs Purification et s paration des adduits par chromatographie sur couche mince de PEl cellulose N d soxyribonucl otides A T G C X Y Z d soxyribonucl otides modifi s adduits Quantification au Phosphoimager p Xp p Y p p Zp d soxyribonucl otides modifi s marqu s en 5 Figure 21 Principe de la m thode du post marquage au P e Apr s extraction et purification de l ADN celui ci est hydrolys en d soxyribonucl osides 3 monophosphate par deux enzymes une endonucl ase nucl ase de Staphylocoque et une exonucl ase Phosphodiest rase de rate A cette tape le milieu r actionnel contient un m lange de nucl otides normaux et modifi s les adduits e S en suit une tape de s lection des adduits qui est classiquement appel e enrichissement a la nucl ase P1 Elle consiste par l activit 3 phosphatasique de la nucl
138. 87 95 535 Allemagne 25 733 27 668 France 24 520 25 630 Royaume Uni 14 985 15 666 Italie 14 496 14 942 Espagne 10 852 11 629 Japon 60 273 56 675 h pital compris Am rique Latine 16 277 18 747 Br sil 6 760 8 366 M xique 7 481 8 096 Argentine 2 037 2 285 Australie Nouvelle Z lande 5 688 5 803 Tableau 1 Evolution de la r partition des achats de m dicaments par les pharmacies dans le monde entre d cembre 2005 et 2006 d apr s IMS Health 2008 Synth se bibliographique Cependant ces derni re ann es ont t marqu es par des am liorations notables en France avec un taux d volution le plus bas d Europe sur la p riode 2000 2011 tandis que les autres pays eux augmentaient plus fortement leur consommation C est le cas par exemple de l Allemagne ou l Italie qui prennent d sormais mieux en charge certaines pathologies comme le diab te ou la d pression Si en 2000 la France tait en t te dans sept des huit classes th rapeutiques principalement utilis es antibiotiques anxiolytiques antid presseurs antiulc reux hypolip miants antihypertenseurs antidiab tiques et antiasthmatiques elle a r ussi freiner la tendance gr ce des campagnes de sensibilisation et des d remboursements Elle reste malgr tout le premier consommateur europ en d antibiotiques et d anxiolytiques consommation sept fois plus importante qu au Royaume Uni sans compter les usages v t rinaires tr s impo
139. 99 D apr s l AFSSAPS la consommation de ciprofloxacine en France s leverait 12 186 kg en 2004 Besse amp Garric 2007 Le spectre d action de la ciprofloxacine est large et elle agit habituellement sur un grand nombre de bact ries gram n gatives et gram positives Le mode d action de cette mol cule est fond sur sa capacit inhiber l activit des gyrases bact riennes des enzymes de la famille des topoisom rases impliqu es dans la r plication la transcription la r paration et la recombinaison de l ADN bact rien Son action est galement connue sur la topoisom rase Il chez les Mammif res quivalente de la gyrase bact rienne mais son affinit pour cette enzyme est 100 fois moins importante que chez la bact rie Cette nette diff rence d affinit fait de la ciprofloxacine un antibiotique de choix parmi les fluoroquinolones Wyckoff et al 1989 De plus la ciprofloxacine est connue pour inhiber fortement l activit des CYP P450 Janknet 1990 Son activit inhibitrice a notamment t mise en vidence chez le rat au niveau du CYP1A1 Ravi et al 2012 et du CYP2B Xie et al 2003 ou encore chez l homme au niveau du CYP1A2 Fuhr et al 1992 McLellan et al 1996 et du CYP3A Xie et al 2003 Elle inhibe aussi la B glucuronidase Kodawara et al 2014 QA 7 HN N w HN N N A o Des thylciprofloxacine Oxociprofloxacine F F OO Ciprofl i iprofloxacine di i at Sulf
140. A 90 90 Control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Concentration ug L Figure 36 Taux de survie des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B a des concentrations croissantes de ciprofloxacine tamoxif ne e et cyclophosphamide A Les r sultats sont exprim s en m dianes et les valeurs sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 100 Cell viability R sultats amp Discussion Partie 1 Quel que soit le temps d exposition des cellules mammaires MCF 7 les faibles doses de tamoxif ne n induisent pas d inhibition de la croissance cellulaire Pour ce qui est du cyclophosphamide on constate a 24 h l apparition d une prolif ration cellulaire p lt 0 05 pour la plus forte dose test e 10 ug L La m me gamme de concentrations de cyclophosphamide entraine une inhibition significative de la croissance a 72 h de l ordre de 5 p lt 0 01 La toxicit la plus importante est induite par la plus forte dose 10 ug L et atteint 7 d inhibition La comparaison 24 h et 72 h de la viabilit des cellules expos es a 100 ug L de cyclophosphamide montre une r ponse invers e avec dans un premier temps une stimulation de la croissance puis une cytotoxicit Ceci pourrait s expliquer par un ph nom ne d adaptation cellulaire avec la mise en uvre des enzymes impliqu e dans l apoptose Chow amp Loo 2003 on
141. ADN sur cellules humaines test des com tes Les cellules humaines h patiques HepG2 et de glandes mammaires MCF 7 ont t expos es pendant 24 h 72 h aux diff rents chantillons d effluents hospitaliers et d effluents d entr e et sortie de STEP Les valeurs sont exprim es en moyenne de 6 points de mesures 3 s ries en duplicata V 1 Analyse des cassures l ADN sur cellules h patiques HepG2 On constate que deux tiers des chntillons induisent apr s 24 h d exposition des cassures l ADN figure 64 Ind pendamment de la p riode de pr l vement tous les effluents hospitaliers N1 D1 et J1 induisent un taux significatif de cassures l ADN p lt 0 01 p lt 0 05 compris entre 5 et 12 Cependant il n y a pas de diff rence significative entre les diff rents mois de pr l vements 20 2 we D3 J1 J2 J3 control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 November December January November December January Samples Samples Figure 64 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules h patique HepG2 expos es 24 h et 72 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr
142. ADN sur les cellules mammaires MCF 7 et ce quel que soit le lieu de pr l vement figure 68 Les adduits 1 et 2 form s sur les cellules HepG2 sont form s majoritairement sur les cellules MCF 7 apr s exposition aux effluents hospitaliers ainsi qu aux effluents d entr e et de sortie de STEP L adduit 6 qui avait t observ suite l exposition des cellules HepG2 aux effluents d entr e et sortie de STEP est galement form dans les cellules MCF 7 expos es uniquement aux effluents en sortie de STEP N anmoins les profils d adduits sont qualitativement diff rents entre eux et pr sentent des adduits diff rents de ceux form s dans les cellules h patiques vs figure 66 On constate notamment la formation des adduits 11 et 12 lors d une exposition des cellules aux effluents hospitaliers de adduit 13 avec les effluents en entr e de STEP et des adduits 14 et 15 avec les effluents en sortie de STEP L analyse quantitative des r sultats met en vidence l apparition d une g notoxicit 24 h ind pendamment du lieu et de la p riode de pr l vement Chaque p riode est significativement diff rente p lt 0 01 des deux autres figure 69 En comparant les p riodes de pr l vement on constate notamment que les effluents hospitaliers des mois de Novembre N1 et D cembre D1 induisent la formation d un nombre total d adduits compris entre 150 et 200 adduits 10 nucl otides p lt 0 01 alors que l chant
143. Annie Pfohl Leszkowicz e mail leszkowicz ensat fr phone fax 33 534 323 947 Abstract DNA adduct detection using P postlabelling technique has been already used on aquatic organisms for biomonitoring genotoxicity of several pollutants whereas investigations in human cell lines exposed to similar environmental contaminants and emerging pollutants such drugs are sparse Ciprofloxacin CIP Tamoxifen TAM and Cyclophosphamide CP frequently used in anticancer treatments are partially released in hospital effluent and in the environment Even though the concentrations are low from ng L to ug L no data exists concerning their ecotoxicological impact The first objective of this study was to determine DNA adducts formation early genotoxic effects The second objective was to compare DNA adduct formation with DNA breaks comet assay Human hepatic cells HepG2 and mammary cells MCF 7 were exposed during 24h to increasing amount of drugs individually or in mixture Tamoxifen induced a dose dependent DNA adduct formation on hepatic cells and a non monotonic response on mammary cells Neither CIP nor CP induced any bulky DNA adducts A non monotonic dose response was observed when hepatic cells were exposed to both mixtures while a dose dependent increase of DNA adducts was observed on mammary cells The antagonist or synergistic effects observed when drugs are in mixture highlight the importance to investigate the ecotoxicological effects of chemi
144. Basin From waste to drinking water Science of the Total Environment 484 53 63 Catastini C Mullot J U Boukari S Mazellier P Levi Y Cervantes P Ormsby J N 2008 Assessment of antineoplasic drugs in effluents of two hospitals Water Quality 39 2 172 180 Cauzzi N 2007 valuation de l co compatibilit de s diments contamin s trait s et non trait s par un proc d physico chimique dans le cadre d un sc nario de d p t en gravi re Etude en microcosmes aquatiques Th se INSA de Lyon Sp cialit Sciences et Techniques du D chet au LSE de l ENTPE Villeurbanne INSA de Lyon 341p Cavali P Coignard F Leclerc S Maugendre P Rozet K 2003 Analyse des ventes de m dicaments aux officines et h pitaux en France 1991 2001 Afssaps Direction des Etudes M dico Economiques et de l Information Sientifique 3 me dition 94p Cavali P De Calan C Gourlay M L Comby V 2005 Analyse des ventes de m dicaments aux officines et h pitaux en France 1993 2003 Afssaps Direction des Etudes M dico Economiques et de l Information Sientifique 5 me dition Saint Denis 116p Chang T K Weber G F Crespi C L Waxman D J 1993 Differential activation of cyclophosphamide and ifosphamide by cytochromes P450 2B and 3A in human liver microsomes Cancer Research 53 5629 Chang T K Yu L Goldstein J A Waxman D J 1997 Identification of the polymorphically expressed CYP2C
145. Bien que les concentrations soient faibles ng L ug L tr s peu de donn es sont disponibles sur leurs impacts cotoxicologiques Leur pr sence dans l environnement est d autant plus pr occupante que les produits de m tabolisation sont souvent plus toxiques que la substance d origine L objectif de la th se a t d valuer le risque co toxicologique induit par de faibles doses de m dicaments rejet s seuls ou en m langes dans les effluents hospitaliers urbains et dans l environnement De par leur utilisation courante dans les traitements anticanc reux trois mol cules ont t s lectionn es pour notre tude la ciprofloxacine antibiotique le tamoxif ne perturbateur endocrinien et le cyclophosphamide anticanc reux Des gammes de concentrations repr sentatives des effluents hospitaliers station d puration et de l environnement ont t test es l aide de bioessais appliqu s des organismes aquatiques V fischeri P subcapitata L minor et de biomarqueurs appliqu s une levure S cerevisiae et des cellules humaines h patiques et mammaires La viabilit cellulaire test MTS et la g notoxicit cassures l ADN et adduit l ADN ont t compar s aux tests standardis s Microtox Algaltoxkit FIM ainsi que d inhibition de croissance de Lemna minor Le potentiel perturbateur endocrinien a t valu en parall le l aide du test YES Y AS Cette batterie de tests a ensui
146. C8 9 10 30 le CYP2D6 2 6 le CYP2C19 1 10 le CYP1A2 1 13 le CYP2E1 7 ainsi que les CYP2A6 et 4A Hasler 1999 Lewis 2004 Ces CYPs repr sentent a eux seuls plus de 90 des enzymes impliqu es dans le m tabolisme oxydatif des m dicaments Bien que la plupart des organismes vivants animal plante champignons poss dent ces syst mes de m tabolisation leurs vari t s ainsi que leur taux d expression diff rent selon les esp ces De mani re g n rale des interm diaires lectrophiles apparaissent suite la m tabolisation et peuvent former des adduits covalents aux bases de l ADN Un x nobiotique pr sente souvent la propri t d induire les enzymes qui permettent son m tabolisme La complexit des ph nom nes d induction des enzymes du m tabolisme fait qu il existe un quilibre entre l activation m tabolique et la d toxication du x nobiotique Cela d termine le degr de la r ponse toxique et notamment g notoxique Ainsi les CYP3A4 et 1A2 qui m tabolisent l Aflatoxine B1 en compos procarcinog ne chez l Homme Aoyama et al 1990 mais la canc rogen se h patique de l Aflatoxine B1 chez la truite arc en ciel peut tre inhib e par la B Naphtoflavone inducteur du CYP1A Takahashi et al 1996 Un autre exemple est la formation d adduits aux hydrocarbures polycycliques aromatiques qui diff rent entre le rat le poisson et les plantes Pfohl Leszkowicz et al 1996 24
147. DN sur les cellules mammaires MCF 7 000 143 WS CUSSION soa ER RENTE RE TR RER RER EEE 145 Conclusions amp Perspectives 153 Biphogra plie snis 161 Fosses 188 Pr paration du milieu de culture et d essai pour Lemna minor 189 Protocole simplifi du test YES YAS tir du manuel d utilisation fournit par la soci t OT mini nn 191 Article 1 In vitro tests aiding ecological risk assessment of ciprofloxacin tamoxifen ans cyclophosphamide in range of contentrations released in hospital and surface OS U2 Be ee See Une ECU REMI UE ee ee ORE ETRE Tre Senne ep TR eee ee 193 a Article 2 Genotoxicity assessment in human cell lines exposed to ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface WEIGN iicissciainsarcinisiaininissnrnintsiasiaiaiaainiaiauninisiarniarsiasniaieenene 205 xi xii Nomenclatures xiv Nomenclatures 32p AC MS ADN AFNOR AFSSAPS AOX APA ARN ATP B a P BET Bq CA CEs0 CIRC CLs0 CMC COX CPM CSE CYP DBO DCE DCO DL50 DMEM DMSO D O DPM DRASS DTT EDTA EPA GST HAP HPLC IARC IC95 IRSN Phosphore 32 Spectrom trie de masse a acc l rateur de particules Acide d soxyribonucl ique Agence Frangaise de Normalisation Agence Frangaise de S curit Sanitaire des Produits de Sant Compos s organohalog n s absorbables sur charbon actif Acide perac tique Acide ribonucl ique Ad nosin
148. E Cb 1 E Cmix where E Ca is the effect induced by the compound a alone E Cb the effect in duced by the compound b alone and E C mix is the effect observed when the compounds are mixed In other word if the ratio expected value E observed value O 1 the interaction is strictly additive if ratio gt 1 the interaction is synergistic and when the ratio lt 1 the interac tion is antagonistic 105 amp 100 4 z z T A Le a KE RE o r a 7 gt ra ax 1 pe pe ik i 85 O 80 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 CONCENTRATION ug L 3 Results 3 1 HepG2 cell viability Viability of HepG2 cells after exposure to drugs alone or mixed was detected by the MTS cell proliferation assay The data Figs 2 and 3 are expressed as percentage of viable cells compared to non exposed cells Each value corresponds to the median value of 15 measurements 3 experiments five replicates Whatever the exposure time of hepatic cells to CP a slight but significant p lt 0 05 decrease of cell viability was only observed with the highest dose tested 10 pg L Fig 2A and B Exposure of cells to the lowest concentration 10 ng L of CIP or TAM significantly p lt 0 01 reduced cell viability Fig 2A and the inhi bition was time dependent Fig 2B With higher doses of CIP 100 ng L 10 ug L the cytotoxicity is lower than with 10 ng L and was not dose dependent Exposure to a ten fold higher concentration of CI
149. Garric J 2007 M dicaments usage humain risque d exposition sur les milieux r cepteurs Proposition d une liste de m dicaments a usage humain a surveiller dans les eaux de surface continentales CEMAGREF Agence de l Eau RMC Lyon 241p Besse J P Garric J 2008 Human pharmaceuticals in surface waters Implementation of a prioritization methodology and application to the French situation Toxicology Letter 176 2 104 123 Besse J P Latour J F Garric J 2012 Anticancer drugs in surface waters what can we say about the occurrence and environmental significance of cytotoxic cytostatic and endocrine therapy drugs Environment international 39 1 73 86 Black J J Baumann P C 1991 Carcinogens and cancers in freshwater fishes Environmental health perspectives 90 27 Blackman G Robertson Cuninghame R 1955 Inter relationships between light intensity temperature and thephysiological effects of 2 4 dichlorophenoxyacetic acid onthe growth of Lemna minor Journal of Experimental Botany 6 156 176 Blaise C Couture P 1984 D tection a l aide d un bio essai Selenastrumcapricornutum des r percussions d un rejet minier sur l environnement aquatique toxicit ou enrichissement en substance essentielle Hydrobiologia 114 39 50 Bliefert C Perraud R 2001 Chimie de l Environnement Air Eau Sols D chets Editions De Boeck Universit 1 496 Blum D J W Speece R E 1991 A database o
150. Gillam E M J Hollenberg P F 2002 Effect of tamoxifen on the enzymatic activity of human cytochrome CYP2B6 Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics 301 945 952 Stabb E V Butler M S Adin D M 2004 Correlation between osmolarity and luminescence of symbiotic Vibrio fischeri strain ES114 Journal of Bacteriology 186 2906 2908 Steger Hartmann T K mmerer K Hartmann A 1997 Biological degradation of CP and its occurrence in sewage Water Ecotoxicology and Environmental Safety 36 174 179 Stein J E Reichert W L Varanasi U 1994 Molecular epizootiology assessment of exposure to genotoxic compounds in teleosts Environmental Health Perspectives 102 19 181 Bibliographie Stieger B Meier P J 1998 Bile acid and xenobiotic transporters in liver CurrentOpinion In Cell Biology 10 462 467 Stumpf M Ternes T A Wilken R D Rodriguez S V Baumann W 1999 Polar drug residues in sewage and natural waters in the state of Rio de Janeiro Brazil The Science of the Total Environment 225 135 141 Summerhayes M Daniels S 2003 Practical Chemotherapy A Multidisciplinary Guide Oxford Radcliffe Medical Press Sumpter J P 2005 Endocrine disrupters in the aquatic environment An overview Acta Hydrochimica et Hydrobiologica 33 1 9 16 T Takahashi N Harttig U Williams D E and Bailey G S 1996 The model Ah receptor agonist beta naphthoflavone inhibits a
151. H ttner E 2002 Assessment of genotoxic damage in nurses occupationally exposed to antineoplastics by the analysis of chromosomal aberrations Hum Exp Toxicol 21 129 135 Cachot J Cherel Y Larcher T Pfohl Leszkowicz A Laroche J Quiniou L Morin J Schmitz J Burgot T Pottier D 2013 Histopathological lesions and DNA adducts in the liver of European Flounder Platichthys flesus collected in the Seine estuary versus two estuarine system on the French Atlantic coast Environ Sci Pollution Res 20 723 737 Calabrese EJ 2005 Cancer biology and hormesis human tumor cell lines commonly display hormetic biphasic dose responses Crit Rev Toxicol 35 463 582 Calabrese EJ 2013 Hormesis once marginalized Evidence Now Supports Hormesis as the Most Fundamental Dose Response M P Mattson E J Calabrese Hormesis DOI 10 1007 978 1 60761 495 1_2 Springer science Buissness media Cavalcante DGSM Martinez CBR Sofia SH 2008 Genotoxic effects of Roundup on the fish Prochilodus lineatus Mut Res Genetic ToxicolEnviron Mutagenesis 655 41 46 Carabineiro SAC Thavorn Amornsri T Pereira MFR Figueiredo JL 2011 Adsorption of ciprofloxacin on surface modified carbon materials Water Res 45 4583 4591 Catastini C Mullot J U Boukari Mazellier P Levi Y Cervantes P Ormsby J N 2010 Identification de mol cules anticanc reuses dans les effluents hospitaliers European Jwater quality 39 171 180 John Wiley amp S
152. IN TH SE de Toulouse En vue de l obtention du DOCTORAT DE L UNIVERSIT DE TOULOUSE D livr par Institut National Polytechnique de Toulouse INP Toulouse Discipline ou sp cialit Pathologie Toxicologie G n tique et Nutrition Pr sent e et soutenue par M NICOLAS MATER le vendredi 20 juin 2014 Titre EVALUATION DE L IMPACT ECO TOXICOLOGIQUE DE RESIDUS MEDICAMENTEUX PRESENTS DANS LES EFFLUENTS HOSPITALIERS URBAINS ET DANS L ENVIRONNEMENT A L AIDE D UNE BATTERIE DE BIOESSAIS ET DE BIOMARQUEURS Ecole doctorale Sciences Ecologiques V t rinaires Agronomiques et Bioing nieries SEVAB Unit de recherche Laboratoire de G nie Chimique L G C Directeur s de Th se MME ANNIE LESZKOWICZ Rapporteurs M BENOIT ROIG UNIVERSITE DE NIMES Mme JEANNE GARRIC IRSTEA Membre s du jury M MICHEL DE MEO UNIVERSITE AIX MARSEILLE 2 Pr sident Mme ANNIE LESZKOWICZ INP TOULOUSE Membre Mme FLORENCE GERET UNIVERSITE TOULOUSE 2 Membre Mme VIRGINIE FAUCET MARQUIS INP TOULOUSE Membre Va donc savoir quand tu sais pas Coluche Remerciements Bien que le travail de th se repr sente certes dans la vie de chaque aspirant docteur une tape longue et fastidieuse souvent parsem e de doutes cela reste et restera pour moi un enrichissement personnel et professionnel exceptionnel Ces trois ann es et demie de recherches o j ai eu la chance de rencontrer et de travailler avec
153. N Oo Lo O O N qm _ SOpHO8 onu g OL SJONPPY SE BS SP ORNS NO John Wiley amp Sons Inc J O O1 ND Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 5 RER John Wiley amp Sons Inc Page 32 of 42 Page 33 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 6 J O O1 BR D 11 25 OCIP BTAM mCP 20 15 10 Adducts 10 nucleotides _ 31 Control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 33 CONCENTRATION ug L 40 John Wiley amp Sons Inc Page 34 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis sl ae ae i e 5 eign o 6 E z lt a 2 2 5 SOP JOSJONU 5 OL SIONPPY Figure 7 ON ORDDOT NMHNORDDHOT NM NOR DmHOT NC TNMSODOR DO mm NNNNNON NON QU QU CO GO M CO M M OO YTS Page 35 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 8 A OONDOARWND 40 John Wiley amp Sons Inc J O O1 ND Figure 9 A Environmental and Molecular Mutagenesis John Wiley amp Sons Inc Page 36 of 42 Page 37 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 10 J O O1 BR D 11 400 300 200 100 Adducts 10 nucleotides 25 0 26 Control Hospital WWTP inflow WWTP outflow 29 SAMPLES 40 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D Environmental and Molec
154. N4 Ac tyl Sulfamethoxazole Sulfamethoxazole Roxithromycine Sulfamethazine Antid pressifs Mianserin Tranquilisants Diazepam Anti pileptiques Carbamazepine Anti inflammatoires Analg siques Acide Ac tylsalicylique Aspirin Diclofenac Ibuprof ne Acetaminoph ne Metamizol Cod ine Indom thacine Naproxen Ph nazone Fenoprofen Parac tamol Agents de contraste Diatrizoate lohexol lomeprol lopanidol lopromide Acide iothalamine Acide ioxithalamine Estrog nes et Hormones 17 b cestradiol 17 a ethinyloestradiol Diethylstilbestrol strone Di thylstilbestrol ac tate Tamoxif ne Beta bloquants Metoprolol Propanolol Nadolol Atenolol Sotalol Betaxolol Anticanc reux Cyclophosphamide lfosfamide Diur tiques Furosemide R gulateurs lipidiques Benzofibrate acide Clofibrique Fenofibrate Gemfibrozil Tableau 2 Compos s pharmaceutiques les plus fr quents dans l environnement d apr s Halling Sorensen et al 1998 Daughton amp Ternes 1999 Hirsch et al 1999 Hernando et al 2006 17 Synth se bibliographique De mani re g n rale deux cat gories de sources d mission peuvent tre identifi es e Les sources d missions diffuses rejets de substances m dicamenteuses et de leurs d riv s dans les urines et les f ces de la population humaine et des animaux de compagnie et d levage ou dans les
155. ONDITIONS Fig 8 Comparison of microalgae growth inhibition induced by exposure to CIP TAM hatched or CTC stippling during 72 h The data are expressed as median value SD The numbers 1 to 5 refer to the mixture conditions explained in the M amp M part Table 1 oO co 50 40 30 4 20 control 0 01 10 o Bioluminescence inhibition ann 100 CONCENTRATION ug L Fig 9 Bioluminescence inhibition of bacteria exposed to ciprofloxacin CIP white ta moxifen TAM gray and cyclophosphamide CP black Results are expressed as median value SD of the percentage of inhibition compared to control condition Statistically significant at p lt 0 05 compared to control algae without any treatment F 50 amp 404 S E 30 kk g 207 5 ES 10 7 i F 35 10 rea 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS Fig 10 Comparison of bioluminescence inhibition induced by exposure to CIP TAM hatched or CTC stippling The numbers 1 to 5 refer to the mixture conditions explained in the M amp M part Table 1 Results are expressed as median value SD of the percentage of viable bacteria compared to control condition 0 Statistically significant at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control significant difference between exposure to three drugs CTC compared to CIP TAM endpoints cell viability and microtox reflect the acute toxic
156. P 100 pg L significantly p lt 0 01 decreases the cell viability The percentages of viable cells exposed to 100 ug L of CIP were 90 and 80 respectively after 24 and 72 h of exposure When cells are exposed to TAM whatever the time of exposure a U shaped dose response curve was observed Fig 3 shows the combined effects of CIP TAM or of the three drugs CTC on HepG2 cell viability The concentrations of exposure are de scribed in Table 1 cf Section 2 3 Whatever the length of cell exposure to CIP TAM a U shaped dose response curve was observed The inhibition of cell growth is lower than expected if a strictly additive effect will occur Table 2 When CP was added in the mixture the antagonistic effect was higher compared to a binary mixture with almost no more impact on cell viability Whatever the relative concen trations the type of mixture binary or ternary mixture and the time of exposure the E O ratio was always lt 1 indicating that an antagonistic effect occurs when the drug are present together even at very low doses Table 2 The antagonism is higher in the presence of CP compared to CIP TAM Fig 4 3 2 DNA damage on HepG2 cells The genotoxic effect of the three drugs on HepG2 was tested by analysis of DNA single strand break formation using the comet assay In the range of concentrations tested 10 ng L 10 ug L exposure of cells to individual compounds did not induce any DNA damage whatev er the expos
157. P Te OH fN f E MAN 0 Phosphoramide RN po Mustard R R Cytotoxic a 5 Aldophosphamide CYP286 4 OH CPA A CYP2C oe active CYP3A JIL 90 ALDH HY Acrolein it 9 Cytotoxic M GOH R of RTN O CYP3A4 R Yh R 2 10 R CPA Carboxyphosphamide Inactive H Inactive B O P H a N H N O R CI Dechloroethyt CPA Chioroacetaldehyde Inactive Cytotoxic Figure 10 Voie de m tabolisation du cyclophosphamide d apr s de Jonge et al 2005 La deuxi me voie de m tabolisation du cyclophosphamide implique une N d chloro thylation qui r sulte de la production quimolaire de d chloro thyl cyclophosphamide et de chloroac tald hyde Huang et al 2000 Ces deux produits n ont aucune propri t antitumorale mais le chloroac tald hyde un canc rog ne connu est responsable de diff rents effets toxiques dont une neurotoxicit et une toxicit au niveau des voies urinaires Springate et al 1997 Les cytochromes CYP responsables de l activation du cyclophosphamide ont t identifi s chez le Rat et chez l Homme Chez l Homme le CYP2B6 Roy et al 1999 joue un r le majeur dans la 4 hydroxylation du cyclophosphamide Chang et al 1993 et jusqu 95 de la N d chloro thylation est catalys e par le CYP3A4 Huang et al 2000 Yu amp Waxman 1996 Toutefois on peut noter que de fortes variations dans la cin tique et le m tabolisme du cyclophosphamide ont t o
158. P outflow induced a significant DNA breaks formation p lt 0 01 compared to the control but significantly less p lt 0 01 compared to the two other samples DNA adduct formation in mammary cells MCF7 exposed to water effluents John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D D 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 Environmental and Molecular Mutagenesis Concerning the mammary cells MCF 7 exposed to different water samples no significant DNA damages were detected after 24 h exposure Although the amounts of DNA breaks detected were low a similar trend than the DNA adducts analysis can be observed Globally a decrease of the genotoxicity was observed from the hospital effluents to the WWTP outflow effluents Discussion After drug administration in the hospital cytostatic drugs and human metabolites are directly discharged into communal sewage system without any specific control Household discharge by out patients represents another pathway of cytostatics in the environment Bound and Voulvoulis 2005 Due to their highly potent mechanism of action cytotoxicity genotoxicity mutagenicity and teratogenicity cytostatic drugs could induce adverse effects on any growing eukaryotic organism and bacteria Besse et al 2012 Johnson et al 2008 Since th
159. Page 22 of 42 Page 23 of 42 J O O1 BR D 699 700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718 719 720 721 722 723 724 725 726 727 728 729 730 731 732 733 734 735 Environmental and Molecular Mutagenesis Nishiyama T Ogura K Nakano H Ohnuma T Kaku T Hiratsuka A Muro K Watabe T 2002 Reverse geometrical selectivity in glucuronidation and sulfation of cis and trans 4 hydroxytamoxifens by human liver UDP glucuronosyltransferases and sulfotransferases Biochem Pharmacol 63 10 1817 1830 Ohno K Ishihata K Tanaka Azuma Y Yamada T 2008 A genotoxicity test system based on p53R2 gene expression in human cells Assessment of its reactivity to various classes of genotoxic chemicals Mut Res Genetic Toxicol Environ Mutagenesis 656 27 35 Orias F Perrodin Y 2013 Characterisation of the ecotoxicity of hospital effluents A review Sci Total Environ 454 455 250 276 Pawlowicz A Munter T Zhao Y Kronberg L 2006 Formation of Acrolein Adducts with 2 Deoxyadenosine in Calf Thymus DNA Chem Res Toxicol 19 4 571 576 Pellacani C Buschini A Furlini M Poli P Rossi C 2006 A battery of in vivo and in vitro tests useful for genotoxic pollutant detection in surface waters Aquatic Toxicol 77 1 10 Perry R Kang Y Greaves B 1995 Effects of tamoxifen on growth and apoptosis estrogen dependent and independent
160. Quantal responses to mixtures of poisons Journal of Royal Statistical Society B 14 141 163 178 Bibliographie Pomati F Cotsapas C J Castiglioni S Zuccato E Calamari D 2007a Gene expression profiles in zebrafish Danio rerio liver cells exposed to a mixture of pharmaceuticals at environmentally relevant concentrations Chemosphere 70 65 73 Pomati F Orlandi C Clerici M Luciani F Zuccato E 2007b Effects and Interactions in an Environmentally Relevant Mixture of Pharmaceuticals Toxicological Sciences 102 129 137 Pomati F Castiglioni S Zuccato E Fanelli R Vigetti D Rossetti C Calamari D 2006 Effets of a complexe mixture of therapeutic drugs at environmental levels on human embryonic cells Environmental Science and Technology 40 7 2442 2447 Prein A E Thie G M Alink G M Koeman J H Poels C L M 1978 Cytogeneticchanges in fish exposed to water of the river Rhine Science of the Total Environment 9 3 287 291 Prescott S M Fitzpatrick F A 2000 Cyclooxygenase 2 and carcinogenesis Biochimica et Biophysica Acta 1470 69 78 Pruijn F B DeWitte R S 2004 A practical approach to improving drug transport in tumors Current Drug Discovery 29 32 Q Qureshi A A Flood K V Thompson S R Janhurst J M Inniss C S Rokosh D A 1932 Comparison of a luminescent bacterial test with other bioassays for determining toxicity of pure compounds and compl
161. R cepteur hAR Cell H patique Cell Mammaire Cell H patique Cell Mammaire cestrog nique androg nique HepG2 MCF 7 HepG2 MCF 7 48h 24h 72h 24h 72h 24h 24h CIP 0 0 0 0 0 0 0 0 Agonisme Formation d adduits dose Dose r ponse non monotone TAM Antagonisme 0 0 0 0 Antagonisme d pendante horm se A CP 0 0 0 0 0 0 0 0 Cassuresdose 3 Cassuresdose Dose r ponse non monotone Formation d adduits dose CIP TAM 0 0 d pendantes 0 0 d pendantes ou horm se d pendante att nuation AS Plateau de i Plateau de g ee Formation d adduits dose Formation d adduits dose CTC Antagonisme Antagonisme 7 a g notoxicit 0 0 j g notoxicit 7 d pendante d pendante att nuation c ai Seule la forte dose des gammes Aucune cassures l ADN induite par les mol cules respectives Apparition d effets synergiques et antagonistes selon la pr sence ommentaires test es est l origine de la toxicit ind pendamment du temps et de la lign e cellulaire de CIP et ou CP en m lange Tableau 16 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de biomarqueurs de g notoxicit refl tant les effets aigus et chroniques 0 aucune toxicit n a t observ e R sultats amp Discussion Partie 1 On constate que quelque soit le test utilis ils r pondent tous au moins un m dicament dans les gammes de concentration test es La ciprofloxacine affecte la viabilit des ba
162. SAISON Point de DECEMBRE JANVIER pr l vement 2011 2012 1 N 1 D 1 J 1 2 N 2 D 2 J 2 3 N 3 D 3 J 3 Tableau 17 Nomenclature des chantillons d effluents 132 R sultats amp Discussion Partie 2 NOVEMBRE DECEMBRE JANVIER Mol cules 2011 2011 2012 ng L H pital STEP STEP H pital STEP STEP H pital STEP STEP entr e sortie entr e sortie entr e sortie Azathioprine 90 3 20 1 ng lq ng ng 20 2 19 2 nd Ciprofloxacin 7973 210 1172 74 78 11 3089 307 1472 97 36 3 14826 2260 1558 164 147413 Cyclophosphamide 36 4 26 2 2543 iq 8402 7403 43 4 1444 1543 Docetaxel 79 25 175 39 ng ng 61 4 219 57 ng Etoposide 714 37 lq ng Iq 367 68 nd ng ifosfamide ng ng ng ng nd nd n d Methotrexate 6 1 1142 6 01 nd 19 5 Iq nd Paclitaxel 59 7 nd ng Iq 100 14 ng nd Tamoxifen 95 2 5141 42 3 3641 1543 1120 2 170 0 2 5845 33 0 4 Vincristine nd ng ng Iq ng ng ng nd nd n d non d tect Iq inf rieur la limite de quantification STEP station d puration Tableau 18 Concentration des principaux m dicaments recherch s dans les effluents hospitalier et les effluents en entr e et sortie de STEP de la ville de G rone Espagne pendant les trois mois cons cutifs d apr s Ferrando et al 2013 Les chantillons issus des effluents hospitaliers point 1 ont t r alis s le matin entre 10 h et 11 h correspondant aux premi res urine
163. SP NH O Figure 9 Structure chimiques du cyclophosphamide Il peut galement induire un stress oxydatif cellulaire Zhang et al 2008 l origine de perturbations au niveau de la synth se de l ADN et de la division cellulaire Hengstler et al 1997 Bien que cette action ne d pend pas du stade de cycle cellulaire sa cytotoxicit est maximale dans les tissus fortement prolif rateurs Le m canisme de liaison l ADN de mort cellulaire et la pharmacologie exact de ce compos ne sont pas encore enti rement lucid s Boddy amp Yule 2000 L activation du cyclophosphamide requiert l intervention des cytochromes CYP h patiques P450 pour d velopper son activit cytotoxique Moore 1991 figure 10 La mol cule m re est relativement stable en solution aqueuse et n a qu une faible activit compar a ses m tabolites actifs Moore 1991 Fleming 1997 Sa m tabolisation conduit au produit actif le 4 hydroxycyclophosphamide en quilibre dynamique avec un autre d riv aldophosphamide Cet aldophosphamide est principalement d grad en moutarde phosphor e et acrol ine dont l limination r nale est responsable en grande partie de la toxicit v sicale observ e avec de fortes doses de cyclophosphamide Il peut galement aboutir la formation en faible proportion d un compos non toxique le carboxyphosphamide Sladek 1999 37 Synth se bibliographique Hi RRAN P NH NT NH A O p y O
164. ST mati res en suspension totales 60 200 mg L et COT carbone organique total 50 300 mg L tant donn l utilisation et les rejets de volumes importants d eau dans les tablissements hospitaliers les polluants identifi s m taux radio isotopes et autres substances chimiques sont dilu s et se retrouvent des concentrations souvent voisines de celles des effluents domestiques Plusieurs tudes men es ces derni res ann es ont montr que les effluents hospitaliers pr sentaient des caract ristiques physico chimiques globales tout fait semblables la moyenne de celles d eaux r siduaires urbaines l exception des d tergents significativement plus concentr s et que le niveau de pollution pouvait tre plus faible que les effluents domestiques mais avec la pr sence syst matique de germes ayant acquis des caract res de r sistance aux antibiotiques Mansotte et al 2000 Leprat et al 1999 Mais ces r sultats sont trompeurs car ils ne tiennent compte en r alit ni du volume rejet ni de la composante toxique des effluents Un tablissement de 1000 lits polluerait ainsi autant qu une ville de 10 000 habitants Hartemann et al 2006 sans compter l utilisation quasi industrielle de nombreux produits chimiques Il convient donc de s int resser aux types de mol cules limin es et non pas des param tres physico chimiques globaux 1 3 1 Caract ristiques Les effluents hospitaliers sont des efflu
165. Sites U S Environmental Protection Agency EPA 6WI3 88 029 Gros M Petrovic M Barcelo D 2006 Multi residue analytical methods using LC tandem MS for the determination of pharmaceuticals in environmental and wastewater samples a review Analytical and Bioanalytical Chemistry 386 4 941 952 170 Bibliographie Grue C E Gardner S C Gilbert P L 2002 On the significance of pollutant induced alterations in the behavior of fish and wildlife DellOmo G Behavioural Ecotoxicology Jon Wiley amp Sons Ltd Chichester West Sussex 1 90 Gruenert D C Basbaum C B Widdicombe J H 1990 Long term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum free conditions In Vitro Cellular amp developmental Biology Journal Of The Tissue Culture Association 26 411 418 Grung M Kallqvist T Sakshaug S Skurtveit S Thomas K V 2008 Environmental assessment of Norwegian priority pharmaceuticals based on the EMEA guideline Ecotoxicology and Environmental Safety 71 328 340 Gu guen Y Mouzat K Ferrari L Tissandie E Lobaccaro J M Batt A M Paquet F Voisin P Aigueperse J Gourmelon P Souidi M 2006 Cytochromes P450 xenobiotic metabolism regulation and clinical importance Annales de biologie Clinique 64 6 535 548 Guiliani F Koller T W rgler F E Widmer R M 1996 Detection of genotoxic activity in native hospital waste water by the umuC test Mutation
166. T Dunnbier U 2002 Identification and significance of phenazone drugs and their metabolites in ground and drinking water Chemosphere 49 539 544 Reddy M V Randerath K 1986 Nuclease P1 mediated enhancement of sensitivity of 32P postlabeling test for structurally diverse DNA adducts Carcinogenesis 7 1543 1551 Ribo J M Kaiser K L E 1983 Effects of selected chemicals to photoluminescent bacteria and their correlations with acute and sublethal effects on other organisms Chemosphere 12 11 12 1421 1442 179 Bibliographie Rihn B H Hdou T Le Faou A 2001 Virus produits antiseptiques et d sinfectants La norme et seslimites Dossier m dico technique DMT 86 143 149 Rivi re J L 1998 valuation du risque cologique des sols pollu s Tec amp Doc Lavoisier Paris 228p Rodier J Bazin C Broutin J P Chambon P Champsaur H Rodi L 1996 L analyse de l eau eauxnaturelles eaux r siduaires eau de mer DUNOD 8 me ed Paris 1384p Routledge E J Sumpter J P 2009 Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen Environmental Toxicology and Chemistry 15 3 241 248 Roy P Yu L J Crespi C L Waxman D J 1999 Development of a substrate activity based approach to identify the major human liver P 450 catalysts of cyclophosphamide and ifosfamide activation based on cDNA expressed activities and liver micr
167. TAM belongs to compounds put on the pri oritization list due to the potential of this substance to bioaccumulate in the human body and probably in aquatic organisms Jean et al 2012 In fish dose dependent effects have been reported on the rate of vitellogenin synthesized in males and on sex ratio disturbance of the population also dose dependent whose parents were exposed to concentrations of tamoxifen higher than 5 ug L Liwei et al 2007 Ciprofloxacin CIP which belongs to the fluoroquinolone class is an antibiotic that inhibits the enzyme activity necessary for replication transcription repair and recombination of bacterial DNA McLellan et al 1996 This drug is often used against the side effects of treatment protocols particularly in fever prevention and infections arising after chemotherapy of breast cancer cancer of the ovaries or the small cell lung cancer SCLC Tjan Heijnen et al 2001 The three drugs can be found in wastewater in the range of 10 ng L to 10 ug L for TAM and CP and 10 ng L to 100 ug L for CIP Lindberg et al 2004 2005 Roberts and Thomas 2006 Thomas and Hilton 2004 Zorita et al 2009 Zuccato et al 2005 As CIP is widely used for therapeutic treatments it is 10 fold more concentrated in hospital effluents and 2 fold more concentrated in municipal WWTP effluents than TAM and CP Among the fluoroquinolones ciprofloxacin CIP was the most fre quently detected in wastewater and surface water
168. Tjan Heijnen et al 2001 The three drugs can be found in wastewater in range of 10 ng L to 10 ug L for TAM and CP and 10 ng L to 100 ug L for CIP Tomas amp Hilton 2004 Lindberg et al 2004 Zorita et al 2009 Zuccato et al 2005 Roberts amp Tomas 2006 As CIP is widely used for therapeutic treatments it is 10 fold more concentrated in hospital effluents and a 2 fold more concentrated in municipal WWTP effluents than TAM and CP Among the fluoroquinolones ciprofloxacin CIP was the most frequently detected in wastewater and surface waters with concentrations of several hundred ng L Kolpin et al 2002 Miao et al 2004 Karthikeyan and Meyer 2006 Higher concentrations up to150 ug L were even reported in the effluents from hospitals Martins et al 2008 Although the comet assay was chosen in the first study Mater et al 2014 for its sensitivity to detect small amounts of DNA damage the good repeatability of the assay depends on several parameters and some experimental design is critical to the final statistical power of the conclusions As part of controversies the use of the statistics to assess the results of studies often relate to the use of probability values to draw a John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123
169. UMR CNRS INPT UPS 5503 Department of Bioprocess amp Microbial engineering Rodriguez Mozaz Sarah Catalan Institute for Water Research Castillo Luis Veolia Barcelo Damia Chemical and Environmental Research Institute of Barcelona Albsai Claire INP ENSAT UMR CNRS INPT UPS 5503 Department of Bioprocess amp Microbial engineering Pfohl Leszkowicz Annie University Toulouse Bioprocess amp microbila system genotoxicity DNA adduct ciprofloxacin tamoxifen cyclophosphamide SCHOLARONE Manuscripts John Wiley amp Sons Inc Page 1 of 42 J O O1 BR D D 4 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 31 Environmental and Molecular Mutagenesis Genotoxicity assessment in human cell lines exposed to ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface water N Mater S Rodriguez Mozaz L Castillo C Albasi Barceld D A Pfohl Leszkowicz 1 Ecole Nationale Sup rieure Agronomique ENSAT 1 avenue Agrobiop le BP 32607 31320 Auzeville Tolosane France Catalan Institute for Water Research ICRA H20 Building Scientific and Technological Park of the University of Girona Emili Grahit 101 17003 Girona Spain 3 Veolia Environnement Recherche et Innovation Centre de Recherche de Maisons Laffitte 78603 Maisons Laffitte France Corresponding author
170. VC Postmus PE Ardizzoni A Manegold CH Burghouts J van Meerbeeck J et al Reduction of chemotherapy induced febrile leucopenia by prophylactic use of ciprofloxacin and roxithromycin in small cell lung cancer patients an EORTC double blind placebo controlled phase III study Ann Oncol 2001 12 1359 68 200 N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 Vandenberg LN Colborn T Hayes TB Heindel JJ Jacobs Jr DR Lee D H et al Hormones and endocrine disrupting chemicals low dose effects and nonmonotonic dose re sponses Endocr Rev 2012 33 378 455 Verlicchi P Al Aukidy M Galletti A Petrovic M Barcel D Hospital effluent investigation of the concentrations and distribution of pharmaceuticals and environmental risk as sessment Sci Total Environ 2012 430 109 18 Wenzel SDA Sch fers C Vollmer G Michna H Diel P K ln DS et al Research efforts to wards the development and validation of a test method for the identification of endo crine disrupting chemicals Contract 2001 6 000015 Xie H J Griskevicius L Broberg U Lundgren S Carlens S Meurling L et al Alteration of pharmacokinetics of cyclophosphamide and suppression of the cytochrome P450 genes by ciprofloxacin Bone Marrow Transplant 2003 31 197 203 Yusuf AT Vian L Sabatier R Cano JP In vitro detection of indirect acting genotoxins in the comet assay using HeP G2 cells Mutat Res 2000 468 227 34 Zegura B Heath E Cernosa A Filipic M Combination
171. a France 1 5 1 6 Conditions de culture des cellules 1 5 1 b 1 Maintien des constantes physico chimiques Les cellules sont cultiv es dans des flasques de 75 cm2 contenant 15 mL de milieu de culture suppl ment en s rum de veau foetal SVF et antibiotiques a 37 C dans une atmosph re humide et satur e 5 CO dans une tuve st rile Le syst me tampon utilis est le bicarbonate HCOs en quilibre avec le CO de l tuve permettant de maintenir un pH de 7 4 1 5 1 b 2 Mise en culture d une lign e cellulaire Les souches cellulaires sont conserv es dans de l azote liquide dans 1 mL d une solution de cong lation contenant 10 de DMSO et 40 de s rum de veau foetal Sorti de l azote liquide le tube reste 1 min temp rature ambiante avant d tre port 37 C 1 min dans un bain marie Dix mL de milieu de culture complet 10 de s rum de veau foetal 1 de p nicilline streptomycine pr alablement chauff 37 C sont vers s dans une flasque de 75 cm avec 1 mL de la culture de cellule d congel e Une nuit 37 C permet l adh sion des cellules au support Au bout de trois jours les cellules ne pouvant plus se d velopper correctement due l puisement du milieu de culture il est n cessaire d effectuer un passage ou repiquage pour maintenir la viabilit des cellules et l tat de culture Cette op ration permet l amplification de la culture cellulaire 1 5 1 6 3 Amplification d une lign
172. a probabilit pour la comparaison de l chantillon avec le t moin n gatif tait inf rieure la valeur 0 05 et tr s significatif lorsqu inf rieure la valeur 0 01 Enfin dans le cas d une analyse multiple de la toxicit le test post hoc de Kruskal Wallis a t appliqu pour d terminer les diff rences entre chantillons Les r sultats sont consid r s significatifs lorsque la probabilit pour la comparaison de l chantillon avec le t moin n gatif tait inf rieure la valeur 0 05 et tr s significatif lorsqu inf rieure la valeur 0 01 80 Mat riels amp M thodes 81 82 Resultats amp Discussions 84 Partie 1 Etude de la toxicit des mol cules mod les ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide l aide d une batterie de bioessais et de biomarqueurs 85 86 R sultats amp Discussion Partie 1 Chapitre 1 Impact de la ciprofloxacine du tamoxifene et du cyclophosphamide sur la viabilit d organismes procaryotes et eucaryotes Depuis plus d une trentaine d ann es des mol cules pharmaceutiques sont d tect es dans les effluents et les milieux aquatiques Avec la manifestation d v nements r cents comme la modification du sex ratio chez certaines esp ces aquatiques Sonneschein amp Soto 1998 Tyler et al 1998 Hinfray et al 2010 pour une revue voir Cardoso et al 2014 ou l apparition d antibior sistance chez certaines bact ries K m
173. acetate 3 M pH 6 The DNA was precipitated by the addition of two volumes of cold ethanol overnight at 20 C and the precipitate was collected by centrifugation at 10 000g for 30 min The DNA pellet was washed four times with 90 ethanol The purity of the DNA was checked by recording UV spectra between 220 and 320 nm DNA P postlabelling DNA 4 ug was digested at 37 C for 4 h with 10 uL of the mix containing 1 uL of micrococcal nuclease 2 mg mL corresponding to 500 mU spleen phosphodiesterase 80 mU sample or 20 mU ug DNA 1 uL of sodium succinate 200 mM and 1 uL of calcium chloride 100 mM pH 6 The digested DNA was then treated with 5 uL of the mix containing nuclease P1 NP1 4 mg mL ZnCl 1 mM and sodium acetate 0 5 M pH 5 at 37 C for 45 min The reaction was stopped by adding 3 uL of Tris base 500 mM The DNA adducts were labeled as follows To the NP1 digest 5 uL of the reaction mixture containing 2 uL of bicine buffer 800 uM pH 9 8 9 6 U of polynucleotide kinase T4 and 100 uCi of P ATP specific activity 5000 Ci mmol was added and incubated at 37 C for 45 min Normal nucleotides pyrophosphate and excess ATP were removed by chromatography on PEl cellulose TLC plates in NaH2PO buffer 2 3 M pH 5 7 overnight D1 The origin areas containing labeled adducted nucleotides were cut out and transferred to another PEl cellulose TLC plate which was run in 4 8M lithium formate and 7 7 M urea pH 3 5 for 2 h D2 A
174. ain d gouts A ce titre un bior acteur membrane est d j plac sur le site de l h pital de Rangueil et des campagnes de pr l vements sont en cours projet ANR Panacee Un tel proc d a pour but d abattre la concentration des compos s pharmaceutiques dans les effluents hospitaliers afin de limiter les flux de contaminants pouvant alt rer l efficacit d puration de la STEP et contaminer l environnement Faute de temps ils n ont pas encore t analys s 158 Conclusions amp Perspectives 159 160 Bibliographie 162 Bibliographie A Adam C Debayle C Carel D Cavali I 2006 Les produits radiopharmaceutiques dans les effluents hospitaliers et domestiques Environnement Risques et Sante 5 4 pp 254 260 Aden D P Reed N D and Jutila J W 1972 Reconstitution of the in vitro immune response of congenitally thymusless nude mice Proceedings Of The Society For Experimental Biology And Medicine Society For Experimental Biology And Medicine New York N Y 140 548 552 Afsharian P Mdllgard Z H Xie H Kimby E Hassan M 2005 The effect of ciprofloxacin on cyclophosphamide pharmakocinetics in patients with non Hodgkin lymphoma European Journal of Haematology 75 3 206 211 Aga D S 2008 Fate of pharmaceuticals in the environmentand in water treatment systems CRC Press Boca Raton FL Akcha F Vincent Hubert F Pfohl Leszkowicz A 2003 Potential
175. ait influer sur de forte concentration de l autre Pour cela nous avons d termin l impact de m lange de CIP TAM en dose inverse de gammes de concentrations doses croissantes de CIP associ es des doses d croissantes de TAM sur la viabilit cellulaire 24 h toxicit aigu et 72 h toxicit chronique Les r sultats sont pr sent s dans la figure 34 et sont exprim s en valeurs m dianes de 15 mesures triplicata de 5 points de mesure A B 105 105 100 e 7 100 r x Z 95 LHe i 95 ee 1 8 i gt 90 FL i 90 i ro O Li 85 85 Y rs 80 80 control 0 01 0 1 1 10 100 C control 0 01 0 1 1 10 100 C 10 1 0 5 0 1 001 T 10 1 0 5 0 1 001 T 0 01 0 1 1 10 100 0 01 0 1 1 10 100 0 01 0 1 0 5 1 10 I 0 01 0 1 0 5 1 10 I Concentration ug L Concentration ug L Figure 34 Taux de survie des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes concentrations de m lange en doses inverses de ciprofloxacine tamoxif ne courbe noire Les r sultats sont exprim s en moyennes et compar s avec ceux des m langes en doses croissantes courbe rouge Les valeurs sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 diff rence significative P lt 0 05 entre les m langes Quel que soit le temps d exposition des cellules h patiques on observe une courbe en U avec une inhibitionde la viabilit cellulaire dose d
176. ait d tre r flechie et pertinente pour une bonne valuation co toxicologique Ceci met en exergue l importance du choix des essais d tude du temps d exposition et dans le cas des tudes in situ l importance de la saison et du lieu de pr l vement d chantillons bruts Ces r sultats nous ont permis de constater que l utilisation de biomarqueurs de g notoxicit tel que les adduits l ADN repr sente des outils tr s pertinents et tr s sensibles en compl mentarit des essais standardis s normalement utilis s Bien qu on oppose souvent les approches fond es sur l valuation du risque au niveau individuel consid r es comme 155 Conclusions amp Perspectives moins valables que les approches au niveau supra individuel Dearfield et al 2005 notre tude montre au contraire que les bioessais et les biomarqueurs devraient tre utilis de pair Les tests standards ont permis de fixer des seuils concentrations consid r s comme protecteur pour les milieux mais pourtant dans certains cas des effets d l t res peuvent tre observ s a des doses bien inf rieures De ce fait il serait important de d velopper cette d marche de d finition de seuils mais pour ceux des biomarqueurs qui paraissent plus fortement li la sant des individus notamment l homme voire des populations Une fois valid un indice de ce type serait particuli rement ad quat pour tre inclus dans une d marche normative fo
177. aitement de chimioth rapie augmente d environ 10 par an dans les pays industrialis s DOH 2004 Health Canada 2004 Summerhayes 2003 L augmentation de la consommation des m dicaments cytotoxiques est due notamment au large ventail de m dicaments disponibles et leur combinaison possible dans les traitements de chimioth rapie Allwood et al 2002 BMA 2006 En effet la chimioth rapie combin e par administration simultan e de plusieurs agents de chimioth rapie est devenue la norme Hartmann et al 1999 Varadhachary amp Hoff 2005 D un point de vue m dical ces m dicaments doivent exercer leurs effets rapidement puis tre limin s le plus vite possible la majorit des m dicaments cytostatiques tant tr s soluble Pruijn amp DeWitte 2004 leur pr sence dans l environnement repr sente donc un risque 10 Synth se bibliographique 1 3 Les effluents hospitaliers Encore trop peu d tudes s int ressent la caract risation des effluents hospitaliers qui sont le plus souvent consid r s comme similaires aux effluents domestiques L agence environnementale Am ricaine EPA 1989 pr cise par exemple que les eaux us es provenant des h pitaux sont essentiellement domestiques et peuvent tre caract ris es par la mesure des param tres globaux dans les limites suivantes DBO5 demande biologique en oxyg ne pendant 5 jours 50 400 mg L DCO demande chimique en oxyg ne 150 800 mg L ME
178. aleur attendue E valeur observ e O calcul s pour les cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide ss 102 Taux de survie des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h et 72 h diff rentes concentrations de m lange en doses inverses de ciprofloxacine tamoxif ne NE I EE REP EE deen D EI ON OR PIE PP PTE TE INR PE ade EI 103 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs strog niques hERa YES apr s l exposition de levures S cerevisiae a diff rentes concentrations de ciprofloxacine courbe jaune tamoxif ne et cyclophosphamide 106 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs cestrog niques hERa YES apr s l exposition de levures S cerevisiae des m langes binaires CIP TAM et l fnalres GIG unie enr iidaenirele lire etre E tee lutte es ni table ses 107 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs androg niques hAR YAS apr s l exposition de levures S cerevisiae diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide 2 2 cccccceecceeeeceeneeceneeeseeeseeeeenenecsnetenes 108 Evaluation du potentiel agoniste et antagoniste sur les r cepteurs androg niques hAR YAS apr s l exposition de levures
179. alling Sorensen et al 1998 sugg rent trois devenirs possibles de ces compos s et de leurs m tabolites dans les STEP 1 Min ralisation compl te avec la production de CO et d eau comme produits finaux de transformation 2 R tention des m dicaments par la phase solide boues bio solides si les compos s ou les produits de transformation sont lipophiles 3 D charge de ces compos s dans les eaux r ceptrices sous forme inchang e ou sous forme de produit de d gradation m tabolite De plus l efficacit d puration en STEP est tr s variable et d pendant du type de traitement Dans le cas des STEP biologiques par exemple les taux d abattement peuvent atteindre des valeurs sup rieures 90 pour la plupart des anti inflammatoires et des analg siques Besse amp Garric 2007 2008 tandis que le b tabloquant at nolol n est pas pur Coquery et al 2007 Concernant les mol cules cytostatiques les taux d abattement sont aussi tr s variables entre les mol cules avec des valeurs proches de 75 pour le m thotrexate mais seulement 25 pour le cyclophosphamide Catastini et al 2008 La d gradation des sous produits est galement un sujet de pr occupation puisqu ils peuvent avoir une toxicit similaire voire sup rieure celle des compos s parents Andreozzi et al 2004 Doll amp Frimmel 2003 C est le cas par exemple de certaines tudes de d gradation photochimiques en lumi re naturell
180. ame way TAM and its metabolites N desmethyltamoxifen and 4 hydroxytamoxifen inhibit metabolism mediated by CYP 2B6 2C9 and 2D6 Sridar et al 2002 but increased CYP3A4 Desai et al 2002 Sane et al 2008 and have the po tential to cause drug interactions Scripture et al 2005 Altogether mod ifications of the metabolic pathway lead in the enhancement of the formation of genotoxic metabolites of CP such acrolein The dG acrolein adduct has been reported to be considerably more mutagenic in mamma lian cells than in Escherichia coli Mammalian polymerase has been report ed to bypass the dG acrolein lesion in the presence of proliferating cell nuclear antigen Kanuri et al 2002 To confirm the link between DNA adduct formations and DNA breaks comet assay experiments are underway in our laboratory DNA breaks can reflect two different events either a direct attack of DNA or the reparation of DNA damaged by a bulky adduct In general after repair cells will proliferate whereas after DNA damage and inaccu rate repair cells can die 5 Conclusion Only a battery based approach including in one hand biomarkers and on other hand an acute and chronic aquatic toxic test on whole organisms investigating the causal relationship between exposures and environmental pollutants will aid to assess water quality Two 100 x 80 e 2 kk 5 60 ra e 40 kk kk 20 Oo 04 peli K2Cr207 0 1 2 3 4 5 C
181. an glutathione transferases and epoxide hydrolases in the metabolism of xenobiotics Environmental Health Perspectives105 791 799 SFHH 1993 Bilan et recommandations sur les conditions de rejets des effluents liquides des tablissements de sant Rapport aux Minist res de la sant et de l environnement Soci t Frangaise d Hygi ne Hospitali re Paris 32p Shaw J P Large A T Chipman J K Livingstone D R Peters L D 2000 Seasonal variation in mussel Mytilus edulis digestive gland cytochrome P4501A and 2Eimmunoidentified protein levels and DNA strand breaks Comet assay Marine Environmental Research 50 1 5 405 409 Shibutani S Shaw P M Suzuki N Dasaraghi L Duffel M W Terashima l 1998 Sulfation of alpha hydroxytamoxifen catalyzed by human hydroxysteroid sulfotransferase results in tamoxifen DNA adducts Carcinogenesis 19 11 2007 2011 Shibutani S Suzuki N Laxmi YRS Schild LJ Divi RL Grollman AP Poirier MC 2003 Identification of Tamoxifen DNA Adducts in Monkeys Treated with Tamoxifen Cancer Research 63 4402 4406 Shugart L R 2000 DNA damage as a biomarker of exposure Ecotoxicology 9 329 340 Shugart L R Theodorakis C 1994 Environmental genotoxicity probing the underlying mechanisms Environmental Health Perspectives 102 13 Shugart L R 1990 Biomarkers of environmental contamination Biological monitoring testing for genotoxicity 205 216 Silverman J A 1999 M
182. ans le cas des m langes permettant des actions pr ventives contrairement aux bioessais qui ne permettent qu un diagnostic a posteriori Si l analyse doit tre restreinte au strict minimum il est primordial de d finir clairement les hypoth ses de l tude et si possible de caract riser succinctement en amont les effets toxiques potentiels afin de choisir la lign e cellulaire capacit de m tabolisation pr sence de r cepteurs hormonaux etc Outre l aspect cologique cette tude in situ a permis de valider la pertinence de certains tests pour caract riser et suivre la toxicit globale d un chantillons en fonction du lieu et de la p riode de pr l vement Il faut souligner que l utilisation de tels outils par des gestionnaires pourrait permettre de suivre l abattement de la toxicit apr s retraitements des eaux en STEP et valider ainsi leur capacit puratoire En tenant compte des aspects p cuniers et d applicabilit dans le cadre d analyses de routine le nombre des essais devra se limiter aux plus pertinents Nos r sultats sugg rent l utilisation en batterie des tests Microtox Algaltox F et l analyse des adduits l ADN par la m thode du post marquage sur lign es cellulaires humaines en tant que biomarqueur de g notoxicit Cette technique repr sente notamment un indicateur qualitatif et quantitatif de choix la fois dans l valuation du risque et mais aussi dans l valuation des capacit s d
183. ante p lt 0 01 que les pr l vements aux m me endroits les deux autres mois La station d puration limine les substances responsables de la mort des algues 135 Cell viability 120 110 R sultats amp Discussion Partie 2 lll Evaluation de la viabilit de cellules humaines test MTS Des cellules humaines h patiques HepG2 et mammaires MCF 7 ont t expos es pendant 24 h 72 h diff rents chantillons d effluents hospitaliers et d effluents d entr e et sortie de STEP Les r sultats sont exprim s en m diane de 18 points de mesures 3 s ries ind pendantes de 8 points de mesure IV 1 Evaluation de la viabilit des cellules h patiques HepG2 Suite a une exposition des cellules h patiques pendant 24 h aux diff rents chantillons d eau figure 60 A on observe que seul l chantillon d effluents en entr e de STEP pr lev s au mois de Janvier J2 entraine une prolif ration cellulaire significative avoisinant environ 5 On peut souligner une tendance a une prolif ration suite a l exposition aux chantillons d entr e de STEP N2 D2 m me si les valeurs ne sont pas significatives figure 60 A B 120 a e 110 LE I R 1 T H i 100 T Li 90 80 control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 November December January November December January Samples Samples Figure 60 Taux de viabilit de cellule h pa
184. antit s importantes et rejet s continuellement dans les effluents hospitaliers puis les r seaux d gouts o ils se concentrent Bien que ces rejets d pendent de la quantit de m dicaments administr e de l efficacit d excr tion du compos parent et des m tabolites par les patients ou encore de la propension du m dicament s adsorber aux l ments solides les effluents hospitaliers repr sentent une des principales sources de rejets m dicamenteux dans l environnement apr s les rejets domestiques Cette probl matique est d autant plus pr occupante du fait que ces tablissements g n rent des volumes importants d effluents liquides contenant des substances sp cifiques m dicaments d sinfectants d tergents r v lateurs et fixateurs radiographiques r actifs chimiques etc et qu ils sont susceptibles de diss miner des germes pathog nes De plus ces effluents sont g n ralement vacu s dans les r seauxurbains sans traitement pr alable au m me titre que des eaux us es domestiques classiques Introduction g n rale De mani re g n rale en France la majorit des eaux us es domestiques hospitali res et industrielles sont collect es puis pur es dans des stations d puration STEP avant d tre rejet es dans le milieu naturel rivi res lacs mers Les STEP sont con ues pour purer les eaux us es et limiter ainsi l apport en exc s demati res organiques et de polluants min raux dans l
185. ants cationiques amines ol iques thoxyl es diamines ol iques thoxyl es amides ol iques thoxyl es ammoniums quaternaires ol iques thoxyl s ammoniums quaternaires ol iques d riv s ol iques de l imidazoline dont les plus courants sont les ammoniums quaternaires R NH3 X Ils sont principalement utilis s pour leurs propri t s fongicides et bact ricides que leur conf re leur caract re nitr Cox 1994 De ce fait leur utilisation se limite en g n ral au nettoyage acide Lavou et al 2002 Les surfactants non ioniques alcools alcoyl s alcyls polyglucosides alcanolamides non sulfat s acides gras thoxyl s poss dent une partie hydrophile permettant la formation de liaison hydrog ne avec l eau en milieu neutre ou alcalin Ces tensioactifs se caract risent par une faible sensibilit la duret de l eau au pH ainsi que de faibles CMC qui permettent une efficacit satisfaisante basse temp rature et en milieu neutre ou faiblement alcalin Lavou et al 2002 Les surfactants amphot res alkylb ta nes d riv s de l imidazolinium qui poss dent une partie hydrophile s ionisant diff remment selon le pH du milieu Thoumelin 1995 En raison de leur co t lev cette classe de surfactant reste marginale mais est parfois utilis e en association d autres surfactants pour am liorer leurs performances Lavou et al 2002 13 Synth se bibliographique 1 3 2
186. arnheimer P A Olsen B Johansson M Tysklind M Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography mass spectrometry and group analogue internal standards Chemosphere 2004 57 1479 88 Lindberg RH Wennberg P Johansson MI Tysklind M Andersson BAV Screening of human antibiotic substances and determination of weekly mass flows in five sewage treatment plants in Sweden Environ Sci Technol 2005 39 3421 9 Liwei S Jinmiao Z Philip AS Zijian W Tamoxifen effects on the early life stages and repro duction of Japanese medaka Oryzias latipes Environ Toxicol Pharmacol 2007 24 23 9 Lu SC Huang HY Comparison of sulfur amino acid utilization for GSH synthesis between HepG2 cells and cultured rat hepatocytes Biochem Pharmacol 1994 47 859 69 Ma J Lu N Qin W Xu R Wang Y Chen X Differential responses of eight cyanobacterial and green algal species to carbamate insecticides Ecotoxicol Environ Saf 2006 63 268 74 Martins AF Vasconcelos TG Henriques DM da S Frank C K nig A K mmerer K Concen tration of ciprofloxacin in Brazilian hospital effluent and preliminary risk assessment a case study CLEAN Soil Air Water 2008 36 264 9 McLellan RA Drobitch RK Monshouwer M Renton KW Fluoroquinolone antibiotics in hibit cytochrome P450 mediated microsomal drug metabolism in rat and human Drug Metab Dispos 1996 24 1134 8 Mersch Sundermann V Knasm ller S Wu X J D
187. arroudi F Kassie F Use of a human derived liver cell line for the detection of cytoprotective antigenotoxic and cogenotoxic agents Toxicology 2004 198 329 40 Miao X S Bishay F Chen M Metcalfe CD Occurrence of antimicrobials in the final efflu ents of wastewater treatment plants in Canada Environ Sci Technol 2004 38 3533 41 Negreira N Lopez de Alda M Barcel D On line solid phase extraction liquid chromatog raphy tandem mass spectrometry for the determination of 17 cytostatics and metab olites in waste surface and ground water samples J Chromatogr A 2013a 1280 64 74 Negreira N Mastroianni N L pez de Alda M Barcel D Multianalyte determination of 24 cytostatics and metabolites by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry and study of their stability and optimum storage conditions in aqueous solution Talanta 2013b 116 290 9 Orias F Perrodin Y Characterisation of the ecotoxicity of hospital effluents a review Sci Total Environ 2013 454 455 250 76 PhACT Database Pharmaceutical Research and Manufacturers of America PhRMA 2006 Randall WA Price CW Welch H Demonstration of hormesis increase in fatality rate by penicillin Am J Public Health Nations Health 1947 37 421 5 Roberts PH Thomas KV The occurrence of selected pharmaceuticals in wastewater efflu ent and surface waters of the lower Tyne catchment Sci Total Environ 2006 356 143 53 Rowney NC Johnson AC Williams RJ Cytotoxic dru
188. atic cells HepG2 to TAM lead to a dose dependent increase of total DNA adducts whereas the same treatment exhibited a U shape curve with mammary cells MCF 7 More important the types of DNA adducts formed by TAM are not the same in the both cell lines This can be explained by the biotransformation of TAM TAM must be metabolized notably by cytochromes P450 CYP into anti estrogenic metabolites N desmethyltamoxifen via CYP3A 4 hydroxytamoxifen and endoxifen via CYP2D6 to exert its effects Coezy et al 1982 Desta et al 2004 Some of these metabolites are then taken in charge by the hydroxysteroid sulfotransferase Shibutani et al 1998 Nishiyama et al 2002 and can cross react with DNA Gamboa Da Costa et al 2001 2007 and formed two DNA adducts E a deoxyguanosin N2 yl tamoxifen and E a deoxyguanosin N2 yl N desmethyl tamoxifen Figure 14 A third adduct E a deoxyguanosin N2 yl 4 hydroxytamoxifen can be formed after additional biotransformation of 4 OH TAM via a two electron oxidation mechanism into quinone methid Another adduct can also be formed after transformation of 4 OH TAM into catechol and finally into O quinone Dowers et al 2006 using the same pathways aromatase and quinone reductase as estrogens notably in mammary glands Wong amp Chen 2012 TAM can also be biotransformed by flavin monooxygenase into TAM N oxide which will be taken in charge by hydroxysteroid sulfotransferase and give an additional DNA adduct E
189. aut n anmoins garder en t te que les diff rents tests ne donnent pas les m mes informations On notera cependant que m me si tous les effluents induisent des effets toxiques significatifs voire tr s significatifs selon les essais il n a pas toujours t possible de d celer des diff rences entre les p riodes de pr l vement ou encore de valider un abattement de la toxicit apr s le retraitement en STEP Le profil d inhibition de la croissance algale Algaltox F est identique quelle que soit la p riode de pr l vement Par contre la toxicit disparait apr s la STEP avec une inversion de la toxicit puisqu on observe une prolif ration cellulaire Avec les autres tests on constate une diff rence significative entre les diff rentes p riodes Dans le test d inhibition de la croissance bact rienne Microtox l tude de la viabilit cellulaire h patique et la formation des adduits l ADN dans les cellules des glandes mammaires MCF 7 l effet toxique tait plus important au mois de janvier compar aux autres mois de pr l vements Pour d autres tests comme les cassures l ADN des cellules h patiques et les tests YES YAS on note une diff rence significative entre le mois de d cembre et les deux autres mois de pr levement Il est important de noter que quel que soit le test il y a toujours un abattement de la toxicit dans les chantillons pr lev s apr s la STEP 145 DECEMBRE NOVEMBRE
190. ay preceding the test HepG2 cells were plated onto 12 multiwell plates at density of 1x10 cells well allowing the attachment overnight The medium was then discarded and replaced by 2 mL of test medium Cells were incubated for 24h to 72h Slide preparation The comet assay was performed according to Singh et al 1988 with minor modifications All the procedures were conducted in the dark and on ice to minimize spurious sources that might cause DNA damage Conventional microscope slides were dipped in agarose 1 6 and allowed to dry on a flat surface at room temperature before experiment A first layer of 0 8 normal melting point NMP in PBS phosphate saline buffer containing NaCl 137 mM KCI 2 7 mM NaHPO 4 3 mM KH2PQ 1 47 mM pH 7 4 kept at 37 C was added onto frosted slides and gently covered with cover slide The cell pellet obtain by centrifugation 5min at 4 C 4000 rpm was suspended in 150 uL to a final cell agarose solution containing approximately 5x1 0 cells in 0 5 low melting point LMP agarose in PBS and 75 uL were added as second layer onto duplicate slides A third layer of 75 uL 0 5 LMP agarose were added and the slides were placed in fresh lysis solution 2 5M NaCl 100 mM EDTA Na 10 mM Tris pH 10 1 Triton X 100 10 DMSO pH 10 at 4 C for 1 h The slides were transferred on horizontal electrophoresis tray and submerged in denaturation buffer 1 mM EDTA 300 mM NaOH pH 13 for 20 min Electrophoresis was carried
191. battery based approach has been performed Mater et al 2014 In this later paper three drugs were selected for their frequent use in cancer treatment They are found at low doses in hospital wastewater municipal wastewater treatment plant WWTP and surface water Hartmann et al 1998 Zuccato et al 2005 Thomas amp Hilton 2004 Cyclophosphamide CP is primarily used as anticancer chemotherapeutic but is also used as an immunosuppressive agent in several treatments of arthritis interstitial pneumonia etc or during organ transplantation Tamoxifen TAM is a selective estrogen receptor modulator used in breast cancer treatment which acts as an antagonist competitor in the a ER1 estrogen receptor mammary tissues and like an agonist competitor in cholesterol metabolism Coezy et al 1982 Jordan amp Korner 1972 Tamoxifen belongs to compounds put on the prioritization list due to the potential of this substance to bioaccumulate in human body and probably in aquatic organisms Jean et al 2012 Ciprofloxacin CIP which belongs to the fluoroquinolone class is an antibiotic that inhibits the enzyme activity necessary for replication transcription repair and recombination of bacterial DNA McLellan et al 1996 This drug is often used against the side effects of treatment protocols particularly for fevers prevention and infections arising after chemotherapy of the breast cancer cancer of ovaries or the small cell lung cancer SCLC
192. bleau 11 Les 2 mod les de r f rence d addition des concentrations CA et de l action ind pendante IA ont t utilis s pour tirer les mod les des effets conjugu s en m lange figure 35 A B Synergism Synergism p Additive effect Additive effect 1 1 O mm n o gi aaa A WwW g 6 r Sy Antagonism Antagonism 0 5 0 5 0 01 0 1 1 10 100 0 01 0 1 1 10 100 G 10 1 0 5 0 1 0 01 T 10 1 0 5 0 1 0 01 T Concentration ug L Concentration ug L Figure 35 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour les cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B aux m langes CIP TAM en dose inverses CIP TAM A M langes de 0 01 0 1 1 10 100 mol cule 10 1 0 5 0 1 0 01 CIP TAM at 86 42 89 33 90 35 89 88 82 74 CIP TAMobs 86 75 3 68 92 3 04 93 87 1 85 96 52 3 08 97 24 2 61 E O 1 00 0 97 0 96 0 93 0 85 99 R sultats amp Discussion Partie 1 B M langes de 0 01 0 1 1 10 100 CIP mol cule 10 1 0 5 0 1 0 01 TAM CIP TAM at 68 59 83 04 82 51 79 06 67 98 CIP TAMots 82 29 0 70 89 99 3 97 92 97 4 52 95 56 3 97 96 65 2 60 E O 0 83 0 92 0 89 0 83 0 70 Cell viability Tableau 11 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de cellules h patiques HepG2 expos es pendant 24 h A et 72 h B aux m langes CIP TAM en dose inverse E O repr sente le ratio
193. bolites secondaires CYP CYP 3A CYP 3A CYP 2B6 CYP 3A CYP 3A a hydroxy N didesmethyl TAM Endoxifen 3 4 dihydroxy TAM N desmethyl TAM Figure 8 Structure chimiques du tamoxif ne et de ses principaux m tabolites connus Le 4 hydroxytamoxif ne a une tr s grande affinit pour le r cepteur aux strog nes quivalente celle du 17 stradiol Allain 2000 Fent et al 2006 Cette affinit exceptionnelle est la raison principale pour laquelle le 4 hydroxytamoxif ne est souvent utilis dans les tudes sur le tamoxif ne utilisant des cultures cellulaires Il est form par le CYP2D6 De mani re g n rale certains de ces cytochromes sont polymorphiques ce qui explique la forte variation entre individus pour ce qui est de l activit des enzymes le m tabolisant Coller et al 2004 11 3 3 d Le cyclophosphamide Le cyclophosphamide est un antin oplasique de la classe des agents alkylants de la famille des moutardes azot es oxazaphosphorine figure 9 Introduit comme m dicament anticanc reux en 1958 Gilard et al 1994 il est couramment utilis pour traiter une grande vari t de cancer en particulier les lymphomes et les leuc mies ainsi que certains troubles auto immunitaires Ce compos est une prodrogue qui n agit qu apr s transformation dans l organisme notamment au niveau des microsomes h patiques Il peut tre administr par voie orale ou par intraveineuse et on le retrouve dans les urines des patie
194. bserv es que ce soit chez lenfant ou chez ladulte Ces r sultats s expliquent par les diff rences du niveau d expression des enzymes CYP et le polymorphisme g n tique de certaines de ces enzymes Chang et al 1997 11 3 3 e Pr sence dans l environnement De nombreuses tudes se sont int ress quantifier les contaminants organiques travers des analyses cibl es et bas es sur des m thodes de d tection de plus en plus sensibles Le tableau 5 pr sente un inventaire non exhaustif des niveaux de contamination rencontr s ces derni res ann es en Europe dans les milieux aquatiques pour diff rentes classes de polluants On notera que les m tabolites des trois m dicaments tudi s n apparaissent pas car ils n ont pas t recherch s 38 Synth se bibliographique Type A ey Mol cule 7 Yp 3 Concentration Pays R f rence d chantillon g L 101 UK Lindberg et al 2004 25 8 Vietnam Hong Anh Duong et al 2008 H pital 2 5 15 Australie Watkinson et al 2009 1 4 26 Italie Verlicchi et al 20122 0 03 125 Italie Verlicchi et al 2012 7 T 1 USA Brown et al 2006 Ciprofloxacine 0 6 1 1 Australie Watkinson et al 2009 Effluent STEP 0 03 9 3 Su de Zorita et al 2009 0 3 3 7 Italie Verlicchi et al 20122 0 02 0 03 USA Kolpin et al 2002 Eaux de surface 0 015 0 026 Italie Zuccato et al 2005 Eaux de boissons ND z 143 France Zini et al 20
195. cal contaminations in water at low doses High amount of DNA adducts and DNA breaks are formed in both cell lines exposed to hospital waste water and influent waste water A significant decrease was observed with outflow water coming from the waste water treatment plant John Wiley amp Sons Inc OONDOOARWND 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Environmental and Molecular Mutagenesis Key words Ciprofloxacin Tamoxifen Cyclophosphamide Genotoxicity DNA adduct Wastewater Hormesis Introduction In the last decade the constantly growing use of pharmaceutical and personal care products PPCPs in particular cytostatic agents has become a new environmental problem Actually different sources like emissions from production sites or direct disposal of pharmaceuticals in households contribute to the potential pollution of the environment but the main source of cytostatic compounds in wastewater and in the environment are excretions urine and feces of patients under medical treatment Some of these treatments are chemotherapy or radiotherapy and require drugs mixture having toxic properties for cells These drugs are classified in three categories by International Agency for Research on Cancer IARC carcinogenic for humans class 1 likely carcinogenic class 2A potentially carcinogen
196. cal effects of contaminants at low concentration mixtures and at different time exposures Cell culture can offer several advantages over whole animal or organism studies e g reduced labor sample volume variability and at least reduced cost Acknowledgment This paper was prepared with financial support by the French National Research Agency in the framework of the 2010 CD21 call program within the project PANACEE and by the French company The authors thank G M for English proofreading The authors declare that there are no conflicts of interests References Altenburger R Nendza M Sch rmann G Mixture toxicity and its modeling by quantita tive structure activity relationships Environ Toxicol Chem 2003 22 1900 15 Barltrop JA Owen TC Cory AH Cory JG 5 3 Carboxymethoxyphenyl 2 4 5 dimethylthiazolyl 3 4 sulfophenyl tetrazolium inner salt MTS and related analogs of 3 4 5 dimethylthiazolyl 2 5 diphenyltetrazolium bromide MTT reducing to purple water soluble formazans As cell viability indicators Bioorg Med Chem Lett 1991 1 611 4 Baumgartner A Cemeli E Anderson D The comet assay in male reproductive toxicology Cell Biol Toxicol 2007 25 81 98 Besse J P Latour J F Garric J Anticancer drugs in surface waters what can we say about the occurrence and environmental significance of cytotoxic cytostatic and endocrine therapy drugs Environ Int 2012 39 73 86 Bound JP Voulvoulis N Predicted an
197. ce algale li e la pr sence d azote et de phosphore I11 2 1 c Le test d inhibition de la croissance sur Lemna minor Le test d inhibition de la croissance de population de Lemna minor est un test de toxicit simple et standardis qui mesure comme le test Algaltox F la toxicit chronique de solutions aqueuses en mesurant l inhibition de la croissance Cette esp ce cosmopolite qui est un macrophyte sert dans les essais de d tection de la phytotoxicit depuis les ann es 30 Elle a notamment servi a d terminer les effets des premiers herbicides d riv s de l acide ph noxyac tique Blackman amp Robertson Cuninghame 1955 Cette plante est a la fois repr sentative de limpact de pollutions environnementales de par son appartenance aux cosyst mes aquatiques mais aussi utile a l valuation au moyen d essais phytotoxicologiques de l innocuit de nombreux polluants des effluents color s turbides ou encore charg s en MES Wang 1990 Cl ment 1994 A l heure actuelle ce bioessai qui pr sente de nombreuses qualit s propices aux essais toxicologiques petite taille structure relativement simple croissance rapide etc est devenu un outil 46 Synth se bibliographique standardis incontournable en cotoxicologie Les m thodes d essais normalis es utilisant Lemna comprennent notamment celles de l United States Environmental Protection Agency USEPA 1996 de l Association fran aise de normalisa
198. cells Breithofer et al 1998 Both viability and genotoxicity revealed by comet assay were evaluated on cells and a comparison was made with two standard tests microtox and algaltoxkit F 2 Materials and methods 2 1 Chemicals Ciprofloxacin CIP tamoxifen citrate TAM cyclophosphamide CP and agarose were obtained from Sigma Aldrich France Cell cul ture reagents including fetal calf serum and material were obtained from Fisher Scientific France The 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 5 3 carboxymethoxyphenyl 2 4 sulfophenyl 2H tetrazolium inner salt C ge ON Pe O NH CrHisC12N202P MM 261 085 g mol Fig 1 Chemical structure of ciprofloxacin CIP A tamoxifen TAM B and cyclophosphamide CP C N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 193 MTS was obtained from Promega France All solutions were pre pared using ultrapure water 2 2 Cell culture The HepG2 cell line American Type Culture Collection HB 8065 was cultured in 75 cm polystyrene flasks with minimum essential medium supplemented with 10 heat inactive fetal bovine serum 10 L glutamine 200 mM 1 penicillin 100 U mL 1 streptomycin 100 mg mL and 1 mM sodium pyruvate under an atmosphere of 5 CO at 37 C Viable cell count was assessed by Trypan Blue exclusion before toxic evaluation 2 3 Cell algae and bacteria treatments Ciprofloxacin CIP tamoxifen citrate TAM and cyclophosphamide
199. cellulose de 18 cm x 13 cm et de faire migrer les adduits dans le sens vertical de la plaque Les points de d p t sont d coup s de la plaque de D1 et le transfert sur la plaque D2 se fait par contact cellulose a cellulose les deux parties de cellulose sont maintenues par des aimants La migration est amorc e dans de l eau distill e et les plaques sont ensuite plac es dans des cuves avec 70 mL de solvant Ur e 7 7 M formate de Li 4 8M pH 8 5 La migration dure environ 4 h 25 C Les plaques sont ensuite lav es deux fois l eau distill e pendant 5 minutes s ch es puis d coup es la dimension 16 cm x 13 cm C Migration Dimension 3 La migration D3 s effectue dans le sens perpendiculaire la migration D2 1 4 dans les sens inverse des aiguilles d une montre et permet de d placer les adduits dans le sens de la largeur de la plaque Une bande de papier Whatman 16 cm x 2 5 cm est agraf e dans le sens de la longueur de la plaque sur le bord de la plaque La migration est amorc e dans un solvant D3 NaH2PO4 0 7 M Les plaques sont plac es dans des cuves contenant 70 mL de solvant de migration NaH2PO4 0 6 M Ur e 7 M pH 6 4 25 C La migration dure 3 h Apr s avoir limin le papier Whatman les plaques sont lav es deux fois l eau distill e pendant 5 min puis s ch es 78 Mat riels amp M thodes D Migration Dimension 4 La migration D4 est dans le m me sens que la migration pr
200. cence Juste avant l addition de la solution tester l mission de lumi re a t mesur e quantitativement par un dispositif photom trique Microbics Model 500 Analyser figure 14 pour chaque chantillon o et pour les t moins ho La diminution de lumi re a t d termin e apr s 30 minutes d exposition avec la solution tester 30 et kso et exprim e enpourcentage moyen d inhibition d mission de lumi re par rapport au t moin par la formule suivante Izo X Ito I 1 x 100 Io X Igo Lors de chaque test Microtox un triplicata est r alis pour tous les chantillons De plus des solutions de contr le Zn 4 mg L et CrVI 50mg L dont le facteur d inhibition est connu 60 pour l ion Zn et 80 pour le CrVI apr s 30 minutes de contact avec V fischeri sont galement analys es afin de garantir la fiabilit des manipulations ISO 11348 3 1 2 Le test Algaltox F 1 2 1 Principe Le test se base sur l valuation de l inhibition de la croissance d une population d algues vertes unicellulaires Pseudokirchneriella subcapitata apr s un contact de 72 h avec un chantillon liquide Cet essai chronique est r alis d apr s la norme NF EN ISO 8662 T90 304 2005 et il est recommand par l agence environnementale am ricaine US EPA Greene et al 1989 et par le minist re canadien de l environnement Environment Canada 1992 1 2 2 Protocole Les solutions d essai ont
201. chanisms of action Toxicological Letters 133 1 16 Hussein S P Harris C C 1998 Molecular epidemiology of human cancer contribution of mutation spectra studies of tumor suppressor genes Cancer Research 15 4023 4037 172 Bibliographie Janknegt R 1990 Drug interactions with quinolones Journal of Antimicrobial Chemotherapy 26 7 29 Jean G 1991 Evaluation de la toxicit aig e de solutions synth tiques et d effluents partir d un apartir d un muti test macroinvert br s le MTM Comparaison des r ponses desmacroinvert br s avec celles de Photobacterium phosphoreum Daphnia magna et Brachydanio rerio Th se Villeurbanne INSA de Lyon LAEPSI 213p Jobling S Nolan M Tyler C R Brighty G Sumpter J P 1998 Widespread sexual disruption in wild fish Environmental Science amp Technology 32 17 2498 2506 Jolibois B Guerbet M Vassal S 2003 Detection of hospital wastewater genotoxicity with the SOSchromotest and Ames fluctuation test Chemosphere 52 539 543 Johnson A C Jurgens M D Williams R J K mmerer K Kortenkamp A Sumpter J P 2008 Do cytotoxic chemotherapy drugs discharged into rivers pose a risk to the environment and human health An overview and UK case study Journal of Hydrology 348 167 175 Jordan V C Koerner S 1975 Tamoxifen ICI 46 474 and the human carcinoma 8S oestrogen receptor European Journal of Cancer 11 205 206 Jorgensen S E
202. chemicals are even more toxic than the original substance The aim of the thesis is to develop a battery based approach to evaluate the risks induct by low doses of drugs released independently or in mixture in hospital waste water Because of their common use in anticancer treatment procedures three molecules have been chosen for our study ciprofloxacin antibiotic tamoxifen endocrine disruptor cyclophosphamide anticancer Concentrations were range from hospital sewers and WWTP to the environment have been tested with a battery base approach using standardized bioassays applied on aquatic organisms V fischeri S subcapitata L minor and biomarker applied on yeast S cerevisia hepatic and mammary human cell lines Cell viability test MTS and genotoxicity DNA breaks DNA adducts were compared with the standardized bioassays Microtox Algaltoxkit F and Lemna minor growth inhibition In parallel the endocrine disruptor activity was estimated the YES YAS assay The battery assay was then applied to evaluate the geno toxicity of raw effluents hospital wastewater treatment plant Samples from the hospital of Girona Spain were taken got out of it from the hospital in entrance and got out of it from water treatment plant during three consecutive months Several toxic effects have been observed during this work on aquatic organisms and both human cell lines Results show especially hormetic effect on viability of hepatic cell line e
203. cl ase de staphylocoque dans 10 uL de m lange r actionnel suivant 76 Mat riels amp M thodes 0 47 uL de phosphodiest rase de rate 2 mg mL 1 uL de nucl ase de Staphylocoque 3 2 mU pg d ADN 2 uL de tampon succinate 200 mM CaCle 100 mM pH 6 6 53 uL H20 ultra pure 1 5 4 c 4 2 Enrichissement la nucl ase P1 L ADN hydrolys est incub 45 min 37 C apr s avoir rajout 5 uL du milieu r actionnel suivant 1 5 pL de nucl ase P1 4 mg mL 1 6 uL de ZnCle 1 mM 1 6 pL Ac tate de Na 0 5 M pH 5 0 3 pL H20 ultra pure La r action est stopp e par l ajout de 3 uL de Tris base 500 mM 1 5 4 c 4 8 Marquage des adduits au P en position 5 Apr s enrichissement la nucl ase P1 les chantillons sont incub s 45 min en salle chaude salle radioactive 37 C en ajoutant 5 uL de m lange r actionnel suivant 100 pCi de y 2P ATP pr alablement s ch s 2 pL de tampon bicine 0 32 uL de polynucl otides kinase T4 10 UI uL 2 68 uL d H20 ultra pure tampon bicine 500 uL de bicine 800 uM 500 uL de dithiothr itol DTT 400 mM 500 uL de MgClz 400 mM 55 uL de spermidine 400 mM 445 uL d eau distill e pH 9 8 ajust avec de la soude 1 5 4 c 4 4 Test d efficacit de I hydrolyse De l ADN hydrolys e est pr lev s 2 ug et dilu s x 1200 dans de l eau ultra pure Cinq uL de cette solution est incub 1 h 37 C avec 8 uL d eau ultra
204. concentrations sauf pour le m lange aux plus fortes concentrations Le CP a un effet antagoniste En effet l inhibition dans la condition 2 faible concentrations est significativement plus importante en pr sence de cyclophosphamide compar au m lange binaire 15 versus 0 respectivement Dans la condition 5 forte concentration l inhibition de croissance est nettement moins lev e compar au m lange binaire 40 versus 60 respectivement Les valeurs attendues de toxicit ont t calcul es partir de la toxicit respective des mol cules affectant la viabilit des lentilles d eau De par les caract ristiques chimiques intrins ques des mol cules de l tude les 2 mod les de r f rence d addition des concentrations CA et de l action ind pendante IA ont t utilis s pour tirer les mod les des effets conjugu s en m lange et compar ainsi les interactions figure30 tableau 9 Chou 2006 2011 tS Synergism Q p 1 me O Additive effect D Antagonism 0 5 T T 1 2 3 4 5 CONDITIONS Figure 30 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour des cultures de Lemna minor expos es 7 jours diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne m et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide X 93 R sultats amp Discussion Partie 1 Si l interaction entre les mol cules est strictement additive alors
205. ct ries des plantes aquatiques et des cellules h patiques par contre elle n est pas g notoxique cassures adduits encombrants Le tamoxif ne affecte d une part part le m tabolisme des cellules h patiques qui se traduit par une inhibition de la viabilit mais galement celui des algues qui se traduit par un ph nom ne de prolif ration Le tamoxif ne connu pour son effet perturbateur endocrinien est le seul r pondre dans le test YES YAS agoniste antagoniste des r cepteurs hERa et hAR Il est galement g notoxique par la formation d adduits encombrants dans les deux types cellulaires mais de nature diff rente selon la cellule Quant au cyclophosphamide il affecte la viabilit des algues des plantes aquatiques et des cellules h patiques et mammaires Par contre aucune r ponse pour les tests de g notoxicit n est observ e aux doses utilis es L absence de formation de cassure l ADN lorsque les cellules sont expos es aux mol cules isol ment est en accord avec les tudes de Uhl et al 2000 et Yusuf et al 2000 sur cellules h patiques et Perry et al 1995 et Ohno et al 2008 sur cellules MCF 7 qui ont rapport avec le m me test l apparition d effets g notoxiques du tamoxif ne et du cyclophosphamide seulement pour des doses proches du milligramme par litre Les diff rences de r ponse de nos m dicaments observ es avec l ensemble des tests indiquent que la m tabolisation des mol cule
206. ct du polluant avec la mol cule d ADN ii un impact indirect li un stress oxydatif ou une alt ration des prot ines impliqu es dans la synth se de l ADN La mesure des adduits l ADN signe un effet g notoxique direct La mesure des cassures de l ADN est le reflet soit d un effet du stress oxydatif soit du ph nom ne de r paration des adduits 105 Induction Ratio R sultats amp Discussion Partie 1 100 T 8 0 0 0 1 Il 1 Evaluation du potentiel perturbateur endocrinien sur les r cepteurs cestrog niques hERa et androg niques hAR humains test YES YAS Les ph nom nes de perturbations endocriniennes sont d pendantes des r cepteurs aux cestrog nes et aux androg nes L activit cestrog nique est mesur e par le test YES et l activit androg nique par le test YAS Pour chacun des r cepteurs l activit agoniste interaction directe avec le r cepteur et l activit antagoniste modification de l activit du r cepteur ont t test es Les r cepteurs humains ont t clon s dans une levure Saccharomyces Cerevisiae Les levures ont t expos es pendant 18 h diff rentes dilution d une solution m re 1 g L de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide seul ou en m lange Les valeurs sont exprim es en moyenne de 4 points de mesure 2 s ries en duplicata Ces valeurs sont compar es celle obtenues avec les substrats respectifs des r cepteurs i 1
207. d chets des usagers ordures m nag res e Les sources d missions ponctuelles li es aux rejets de l industrie chimique fine de l industrie pharmaceutique des tablissements de soins des levages industriels animaux et piscicoles ou aux pandages des boues de stations d puration On peut noter que les rejets des tablissements de soins repr sentent une situation particuli re en raison du nombre de malades trait s de la quantit et de la diversit des m dicaments utilis s notamment des anticanc reux des anesth siques des antibiotiques des produits de diagnostic de contraste ou des produits radioactifs La figure 1 pr sente les voies possibles de la pr sence de ces r sidus pharmaceutiques dans l environnement aquatique susceptible de contaminer terme les eaux de boisson Heberer 2002 M decine V t rinaire Aquaculture B tail Volaille I M decine Humaine Excr tion Elimination Excr tion Eaux d gout Eaux d gout Ordures M nag res l i i Hospitali re Domestique M dicaments non utilis s l Fuites pes e i ee lane E i Sol Exploitation agricole Eaux de surface Eaux souterraines Chaine Alimentaire Usines de production de produits Eaux du robinet pharmaceutiques Figure 1 Sources et voies possibles de la pr sence de r sidus de produits pharmaceutiques dans l environnement aquatique d apr s Heberer 200
208. d Alterations in Testicular Structure Preliminary Results of Estrogenic Effects in Chub Leuciscus cephalus Ecotoxicology 9 127 135 Fleming R A 1997 An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology Pharmacotherapy 17 146 271 276 Forbes V E Forbes T L 1997 Ecotoxicologie Th orie et applications INRA Editions Paris 256 Forbes V E Palmqvist A Bach L 2006 The use and misuse of biomarkers in ecotoxicology Environmental Toxicology Chemistry 25 272 280 Fremery L Rigaud S 2001 Que deviennent les effluents radioactifs hospitaliers Sciences et Technologie de l Eau Montpellier 9p Frenzili G Nigro M Lyons B 2009 The comet assay for the evaluation of genotoxic impact in aquatic environment Mutation Research 681 80 92 Fuhr U Anders E M Mahr G S rgel F Staib A H 1992 Inhibitory potency of quinolone antibacterial agents against cytochrome P450 1A2 activity in vivo and in vitro Antimicrobial Agents Chemotherapy 36 942 948 G Gamboa da Costa G Marques Fu X Churchwell M I Wang Y P Doerge R Beland F A 2007 Effect of N N didesmethyltamoxifen upon DNA adduct formation by tamoxifen and a hydroxytamoxifen Cancer Letters 257 2 191 198 Gamboa da Costa G McDaniel Hamilton P Heflich R H Marques M M Beland F A 2001 DNA adduct formation and mutant induction in Sprague Dawley rats treated with tamoxifen and its derivatives Carcinogenesis
209. d be explained by its antibiotic activity Comparison between the two mixtures condition shows an antagonist effect Reflect acute aquatic effect CIP ciprofloxacine TAM tamoxifen CP cyclophosphamid CTC mixture of CIP TAM CP N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 199 Buerge IJ Buser H R Poiger T Miiller MD Occurrence and fate of the cytostatic drugs cyclophosphamide and ifosfamide in wastewater and surface waters Environ Sci Technol 2006 40 7242 50 Burgaz S Karahalil B Bayrak P Ta kin L Yavuzaslan F B kesoy I et al Urinary cyclophos phamide excretion and micronuclei frequencies in peripheral lymphocytes and in exfoliated buccal epithelial cells of nurses handling antineoplastics Mutat Res 1999 439 97 104 Burgaz S Karahalil B Canhi Z Terzioglu F An el G Anzion RBM et al Assessment of genotoxic damage in nurses occupationally exposed to antineoplastics by the analysis of chromosomal aberrations Hum Exp Toxicol 2002 21 129 35 Calabrese EJ Cancer biology and hormesis human tumor cell lines commonly display hormetic biphasic dose responses Crit Rev Toxicol 2005 35 463 582 Calabrese EJ Hormesis once marginalized evidence now supports hormesis as the most fundamental dose response In Mattson MP Calabrese EJ editors Hormesis Springer science Business Media 2013 http dx doi org 10 1007 978 1 60761 495 1_2 Carabineiro SAC Thavorn Amornsri T Pereira MFR Figueir
210. d measured concentrations for selected pharmaceu ticals in UK rivers implications for risk assessment Water Res 2006 40 2885 92 Bouraoui S Brahem A Tabka F Mrizek N Saad A Elghezal H Assessment of chromosomal aberrations micronuclei and proliferation rate index in peripheral lymphocytes from Tunisian nurses handling cytotoxic drugs Environ Toxicol Pharmacol 2011 31 250 7 Breithofer A Graumann K Scicchitano MS Karathanasis SK Butt TR Jungbauer A Regula tion of human estrogen receptor by phytoestrogens in yeast and human cells J Steroid Biochem Mol Biol 1998 67 421 9 Comparison of the four bioassays reflecting acute effect cell or bacteria viability or chronic effect DNA damages or algae growth inhibition Bioassay Cell viability MTS DNA break COMET Algae growth inhibition Bacteria activity microtox algaltoxkit F CIP alone Hormesis inhibition except inhibition wih high dose TAM alone Hormesis inhibition proliferation CP alone Inhibition high dose Hormesis inhibition followed by proliferation CIP TAM Hormesis antagonism synergy inhibition Hormesis synergy CTC Hormesis antagonism synergy inhibition Hormesis antagonism almost return to basal level Comment Effects more pronounced Effects less pronounced Reflect chronic aquatic effect Inhibition of bacteria luminescence by CIP after 72 h exposure after 72 h exposure Reflect repair system and chronic effect coul
211. d roxithromycin in small cell lung cancer SCLC patients an EORTC phase III study Proc American Society of Clinical Oncology 18 469 Tice R R Agurell E Anderson D Burlinson B Hartmann A Kobayashi H Miyamae Y Rojas E Ryu J C Sasaki Y F 2000 Single cell gel comet assay guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing Environmental Molecular Mutagenesis 35 206 221 Thomas K V Hilton M J 2004 The occurrence of selected human pharmaceutical compounds in UK estuaries Marine Pollution Bulletin 49 436 444 Tr daniel J Zaleman G Douriez E 1995 G nes et enzymes impliqu s dans lem tabolisme des carcinog nes Bulletin cancer 82 77 84 Truhaut R 1975 Ecotoxicology a new branch of toxicology a general surve of its aims methods and prospect Ecological Toxicology Research New York plenum 3 24 Truhaut R 1977 Ecotoxicology objectives principles and perspectevies Ecotoxicology Environment Safetey 1 151 173 Tsuchiya Y Nakajima M Yokoi T 2005 Cytochrome P450 mediated metabolism of estrogens and its regulation in human Cancer Letters 227 115 124 Tyler C R Jobling S Sumpter J P 1998 Endocrine Disruption in Wildlife A Critical Review of the Evidence Critical Review in Toxicology 28 4 319 361 182 Bibliographie U Uhl M Helma C Knasmiller S 2000 Evaluation of the single cell gel electrophoresis assay with human hepatoma
212. dans deux bains d eau distill e puis s ch es temp rature ambiante Les plaques sont d coup es aux dimensions 18 cm x 13 cm et sont stock es 20 C jusqu utilisation Le papier Whatman n 1 provient de Whatman international Ltd Maidstone England Pour les autoradiographies on utilise des films de radiographie Kodak de 20 cm x 40 cm le r v lateur Kodak LX24 et le fixateur Kodak AL4 a 20 hexamed France Les microtubes 1 5 et 2 mL proviennent d Eppendorf Hamburg Allemagne Ils sont lav s au m thanol puis rinc s deux fois l eau distill e avant utilisation 1 5 4 a 4 Les adduits standards Un contr le n gatif est r alis lors de chaque post marquage a partir d ADN d pourvu d adduits Pour cela on utilise une solution d ADN de sperme de saumon purifi Deux uL de cette solution soit 7 ug d ADN sont marqu s lors de chaque analyse Un contr le positif est galement utilis partir d adduits de BaP sur cellules de poisson marqu radioactivement dans les m mes conditions que nos chantillons L utilisation de ces contr les est primordiale pour valider le marquage 1 5 4 6 Principe La d tection directe des adduits l ADN par la m thode du post marquage au 3P est une m thode fine et extr mement sensible qui permet de mettre en vidence le caract re g notoxique d une substance Au laboratoire nous utilisons une version modifi e de la m thode initiale Randerath et al 19
213. dependent increase of effects In general these effects are more pronounced after a 72 h exposure compared to lower expo sure time confirming a chronic effect and an adaptive mechanism B 25 204 0 01 0 1 0 5 1 CONCENTRATION ug L control or CP black during 24 h A to 72 h B The data are expressed as median value SD N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 197 25 25 20 20 g LL J 154 Ca SH 154 e e 9 2 k ae ae 2 L a 10 gt ns 10 srl eft i Ei i ae i i 0 r T T 0 T r 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS CONDITIONS Fig 6 Comparison of DNA breaks induced on HepG2 exposed to CIP TAM hatched or CTC stippling during 24 h A to 72 h B The data are expressed as median value SD The numbers 1 to 5 refer to the mixture conditions explained in the M amp M part Table 1 Statistically significant at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell significant difference between exposure to three drugs CTC compared to CIP TAM This is in line of the data obtained by Yusuf et al 2000 even though the doses used in their study were much higher The evidence suggests that if one measures biological effects too early the response may appear to fit a threshold or linear model rather than hormesis because insufficient time has elapsed for the requisite gene expression for an adap
214. dio isotope 2P met en se 79 Mat riels amp M thodes d sint grant des particules B ayant des forts niveaux d nergie qui peuvent tre facilement mesur es Les m thodes de mesure de ces particules se basent sur le nombre r el de d sint grations d sint grations par minute ou DPM Pour connaitre le taux de radioactivit de nos chantillons et faire le comptage de nos adduits une r gle de radioactivit de 10 50 100 250 et 500 dpm est r alis e partir de la solution d ATP radioactive sachant que 1 Ci 2 22 1012 dpm et que 1 uL d ATP 152 pCi x facteur de d croissance Cette r gle de radioactivit ou gamme de dilution est d pos e sur une plaque de PEl cellulose et mis expos e dans les cassettes avec les chantillons Au terme du temps d exposition les crans sont analys s l aide d un phosphoimager ou typhoon mis notre disposition par l quipe Inserm Interactions et profils d Expression des Prot ines du CHU Rangueil a Toulouse Cet appareil permet de d tecter un signal fluorescent chimio luminescent ou radioactif de diff rents isotopes 2P 383P 12351 35S 14C SH avec crans sp ciaux et il est dot du logiciel d analyse IMAGE Quant TL pour l analyse des images Le nombre d adduits est calcul en fonction de la radioactivit mesur e de l activit sp cifique et du facteur de d croissance de lATP radioactif utilis ainsi que d
215. ds In Pharmacological Sciences 24 524 529 Manderville R amp Pfohl Leszkowicz A 2008 Bioactivation and DNA Adduction as a Rationale for Ochratoxin A Carcinogenesis World Mycotoxin Journal 1 3 357 367Manickum T John W 2014 Occurrence fate and environmental risk assessment of endocrine disrupting compounds at the wastewater treatment works in Pietermaritzburg South Africa Science of the Total Environment 468 469 584 597 Mansotte F 2000 Les rejets des tablissements de sant DDAS Seine Maritime Synth se r alis et compl t sur la base du travail de F Lebrun Charg d tudes Environnement Cetrehospitalier du havre CLIN Club Environnement 68p Mansotte F Jestin E 2000 Les rejets liquides des tablissements de sant Caract risation a lasource et impact sur l environnement marin c tier Direction d partementale des affairessanitaires et sociales de la SeineMaritime Agence de l eau de la SeineNormandie Nanterre 2000 175 Bibliographie Marine Pollution Bulletin 2007 Implementation of the water framework directive in European marine waters Marine Pollution Bulletin special issue 55 1 298 Marquis V 2005 L ochratoxine A contaminant alimentaire est elle un canc rog ne g notoxique ou pig n tique Recherche des effets g notoxiques par la technique de post marquage de l ADN au 32P en relation avec la m tabolisation de l ochratoxine A Th se Toulouse INP de Toulou
216. du t trazolium MTS par les cellules m taboliquement actives Les cellules vivantes poss dent des d shydrog nases mitochondriales qui r duisent le compos MTS de couleur 48 Synth se bibliographique jaune aussi nomm 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 5 3 carboxymethoxyphenyl 2 4 sulfophenyl 2H tetrazolium en formazan de couleur pourpre soluble dans le milieu de culture Ce test est donc essentiellement une mesure de l activit mitochondriale 111 2 2 b Biomarqueurs de g notoxicit L tude des dommages l ADN a t propos e comme tant un outil adapt l valuation des propri t s g notoxiques des polluants environnementaux et leur d tection dans le milieu naturel Pfohl Leszkowicz et al 1993 Hebert amp Luiker 1996 Nunn et al 1996 Shugart 2000 Les biomarqueurs de g notoxicit sont aujourd hui consid r s comme une part int grale de l approche cotoxicologique Frenzili et al 2009 Ils pr sentent un fort int r t pour les tudes d impact sur des esp ces sentinelles aquatiques Parry et al 1976 Prein et al 1978 Parmi les nombreux travaux r alis s en milieu naturel on peut citer les analyses des cassures simples et double brin de ADN pour le biomonitoring environnemental On peut galement citer les analyses de la formation d adduits l ADN en tant que biomarqueur d exposition des compos s g notoxiques mutag nes et canc rog nes pr sents dans les cosyst m
217. duction d activit des r cepteurs sont d taill es en annexes 1 5 Biomarqueurs de toxicit sur lign es cellulaires humaines 1 5 1 Culture des cellules 1 5 1 a Produits utilis s en culture cellulaire Les lign es cellulaires proviennent de chez ATCC American Type Culture Collection Manassas Virginia USA Les milieux de croissance utilis s pour les cultures cellulaires sont les suivants HepG2 minimum Eagle s medium MEM 65 Mat riels amp M thodes MCF 7 Eagle s minimum essential medium D MEM avec 1 g L de D glucose et suppl ment par 2 uM de glutamine Ces milieux ainsi que le tampon phosphate salin PBS et la trypsine ont t obtenus chez Invitrogen Life Technologies Cergy Pontoise France Le tampon PBS est constitu de KCI 0 2 g L KH2PO4 0 2 g L NaCl 8 g L NaHPO4 1 15 g L pH 7 4 La solution de trypsine est constitu e de Trypsine 0 05 EDTA 0 53 mM Le milieu nutritif est suppl ment par 10 de s rum de veau foetal SVF apportant des facteurs mitog nes n cessaires a la division cellulaire 1 d antibiotiques streptomycine et p nicilline et 1 de L glutamine de fournis par Life Technologies Cergy Pontoise France Pour les cellules MCF 7 15 uL 1 d insuline bovine facteur de croissance sont ajout s dans une flasque contenant 15 mL de milieu Les consommables proviennent du laboratoire Becton Dickinson Le dim thyle sulfoxide DMSO provient de chez Sigm
218. dus sont pr sent es dans le tableau 12 101 R sultats amp Discussion Partie 1 A B Synergism Synergism P Additive effect Additive effect o 1 F E 1 LE Ww Antagonism Antagonism 0 5 4 0 5 1 3 5 1 3 4 5 CONDITIONS CONDITIONS Figure 38 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour les cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne m et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide X A M langes de Condition mol cule 1 2 3 4 5 CIP TAM at 97 90 98 62 95 45 99 61 98 27 CIP TAMobs 99 35 1 44 98 88 0 97 99 06 0 89 100 31 0 24 100 08 0 67 E O 0 99 1 00 0 99 0 99 0 98 CTC att 98 03 99 95 100 55 100 97 101 22 CTC obs 99 87 1 56 99 56 2 41 99 43 1 66 100 02 0 67 99 90 0 33 E O 0 98 1 00 1 01 1 01 1 01 B M langes de Condition mol cules 1 2 3 4 5 CIP TAM at 99 89 98 76 99 17 100 48 98 50 CIP TAMobs 100 93 1 42 100 88 1 22 100 14 0 98 100 26 0 37 99 29 2 34 E O 0 99 0 98 0 99 1 00 0 99 CTC att 93 45 93 28 93 10 94 67 90 60 CTC obs 102 16 1 14 101 43 1 45 100 62 1 86 101 29 1 69 100 53 0 72 E O 0 92 0 92 0 93 0 93 0 90 Tableau 12 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de cellules mammaires MCF 7 expos es pendant 24 h A et 72 h B a d
219. e Cassures a Cassures a l ADN l ADN Antagoniste 0 0 Agoniste Antagoniste Agoniste Antagoniste Antagoniste Cassures a ADN Cassures l ADN 0 Adduits l ADN Adduits l ADN Adduits l ADN Adduits l ADN Adduits l ADN Adduits l ADN Fun Le nombre d adduits form s est globalement plus important sur les Bien que des cassures l ADN soient d tect es sur les oo aa a Ne cellules h patiques sauf cas particulier des effluents hospitalier du Commentaires cellules h patiques les taux restent faibles et compris mois de Janvier J1 qui induisent 2 fois plus d adduits sur cellules entre 5 et 12 MCF 7 que les cellules HepG2 Tableau 20 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de biomarqueurs de g notoxicit refl tant les effets aigus com tes post marquage et chroniques comet YES YAS 0 aucune toxicit n a t observ e R sultats amp Discussion Partie 2 De mani re g n rale il est int ressant de souligner que la toxicit globale des effluents h pital entr e et sortie de STEP du mois de d cembre est au moins gale ou tr s l g rement inf rieure celle du mois de novembre et janvier On aurait pu penser qu au cours de cette p riode o il y une baisse des traitements chimioth rapeutiques la toxicit serait plus faible L tude men e par Ferra
220. e Only the two intermediate concentrations induced significant DNA adducts p lt 0 01 After exposure to 0 5 ug L of TAM two folds more DNA adducts p lt 0 01 were formed compared to 1 ug L exposure Whatever the drug mixture tested a dose dependent DNA adducts formation was observed Figure 7 CIP TAM induced a significant dose dependent increase of DNA adducts p lt 0 01 DNA adducts are four folds p lt 0 01 and 2 5 folds p lt 0 01 higher when cells are exposed to condition 5 and 4 respectively compared to control cells CIP stimulated the formation of TAM DNA adduct Although the increase of DNA damage was also dose dependent p lt 0 05 when the three drugs are present simultaneously the result showed clearly that ternary mixture induced a lowest genotoxicity compared to binary mixture Comparison between binary and ternary exposure showed that CP has an antagonist effect DNA adducts formation on both human cell lines exposed to Hospital and waste water treatment plant WWTP effluents DNA adduct formation in hepatic cells HepG2 exposed to water effluents HepG2 cells were exposed during 24 h to hospital waste water waste water treatment plant WWTP inflow and WWTP outflow to evaluate the genotoxic effects Example of DNA adduct patterns in HepG2 is presented in figure 8 In HepG2 cells five to ten individual DNA adducts numbered 1 10 depending of the conditions are formed DNA adducts having the same number are of the
221. e accumulation of mutations in critical genes typically underpins these harmful capabilities modern toxicology devotes much effort to identifying chemicals that cause mutations Particular attention focusses on the mechanisms whereby bioactivation dependent carcinogens form DNA reactive metabolites that generate abnormal bases within the genome Such DNA adducts are central to chemical carcinogenesis since they can generate mutations during processing by DNA polymerases trigger apoptosis or undergo enzymatic repair DNA adducts are also useful biomarkers of carcinogen exposure in humans and animals for a review see Pfohl Leszkowicz 2008 This study focused on the genotoxicity reflected by DNA adducts formation of three drugs belonging to different chemical classes ciprofloxacin CIP a fluoroquinolone antibiotic cyclophosphamide CP a neoplastic chlorinated compound tamoxifen TAM an estrogenic compound used as anticancer agent A preliminary study investigating the risk assessment of these three drugs tested alone or in mixture was performed using a battery based approach Mater et al 2014 including the comet assay detecting DNA breaks reflecting genotoxicity None of the three drugs individually induced any DNA breaks but in binary or ternary mixture a dose dependent formation of DNA breaks were observed Mater et al 2004 To refine the genotoxic in vitro approach the 2p postlabeling technique was chosen as tool to detect DNA dama
222. e between nd 20 ng L 25 38 ng L and 7 103 ng L respectively Ferrando Climent et al 2014 In both cells DNA adducts were detected whereas DNA breaks are only observed in HePG2 Qualitatively ten individual DNA adducts were formed in HePG2 whereas only five were formed in MCF7 Some DNA adducts are formed in both cell lines adducts 1 2 6 but some others were specific from the cells Whatever the cell lines a significant decrease of DNA adducts and DNA breaks were observed between inflow sewage and outflow water Increasing formation of DNA adducts and DNA breaks in inflow sewage compared to hospital effluent in HePG2 cells can be explained by the fact that other contaminants than that released by hospital induced the genotoxicity On the contrary a constant decrease of DNA adduct and DNA breaks from hospital to outflow water in MCF7 cells indicated that the agents responsible of the genotoxic effect in this cell line are related to endocrine disruptors used in hospital Again the metabolic capacity of cell lines plays a crucial role in the genotoxicity Altogether these data pinpoints the interest to applied several tests to be able to qualify a water and also follow the water treatment plant efficacy More works are needed to put in parallel the contaminants released in the sewage and the ecotoxic effects observed In conclusion our results show that cell lines are an excellent tool for genotoxicity assessment of pharmaceuticals Both t
223. e cellulaire Cette tape consiste a r duire le nombre de cellules des flasques afin de leur permettre de poursuivre leur d veloppement correctement Le repiquage des cellules est effectu a 80 de confluence Le milieu de culture est aspir et la flasque est rinc e a deux reprises avec du PBS Ceci a pour but d liminer les traces de SVF inhibiteur de la trypsine Trois mL de trypsine 1 X pour les cellules HepG2 et 3 mL de trypsine 0 5 X pour les cellules MCF 7 pr alablement chauff e 37 C sont ajout s dans chaque flasque afin de d coller le tapis cellulaire La flasque est ensuite plac e a 37 C pour favoriser l activit enzymatique de la trypsine Quand la dissociation du tapis cellulaire est visible l il nu la trypsination est stopp e par addition de 5 mL de milieu de culture complet dans la 66 Mat riels amp M thodes flasque Le surnageant contenant les cellules est r cup r et centrifug 10 min 2000 rpm Sigma 3k10 4 C Les cellules sont remises en suspension dans 3 mL de milieu et r parties dans diff rents flacons raison de 1 mL par boite auxquels sont ajout s 14 mL de milieu de culture figure 16 Maintien de culture Milieu nutritif Etuve 37 C pH 7 4 5 CO D collement des cellules Trypsine 1 mL 5 min 37 C 5 CO Le Flasque Ajout du milieu de culture Centrifugation Elimination du milieu Amplification de la culture cellulaire pour om trai
224. e d crit une courbe en U qui s amplifie 72 h Le m me type de courbe est observ lorsque les microalgues sont expos es au cyclophosphamide lorsque que des Lemna sont expos es des m langes CIP TAM ou encore lorsque que les bact ries marines sont expos es a des m langes binaires ou ternaires de mol cules Cette relation dose r ponse non lin aire a t d finie comme un ph nom ne d horm se et a d j t d crite dans un large ventail d organismes des bact ries aux vert br s expos s plus de 1000 compos s chimiques et stresseurs environnementaux L horm se est corr l e l acclimatation ainsi qu la plasticit ph notypiques des organismes et peut jouer un r le essentiel dans l adaptation a des changements dans l environnement Costantini et al 2010 La d viation de la lin arit dans la r ponse de toxicit est favoris e par la pr sence de multiples v nements concomitants Les m canismes impliqu s dans le ph nom ne d horm se faibles doses incluent notamment la surcompensation apr s une perturbation hom ostasique les r ponses adaptatives li es l induction des processus de r paration les interactions entre prolif ration cellulaire retard du cycle cellulaire apoptose et dommages l ADN une activation de la voie de signalisation intercellulaire jonction GAP faible dose mais une inhibition forte doses etc pour une revue voir Hoffman 2009 L horm
225. e dose r ponse de formation des adduits lors de l exposition des cellules h patiques aux m langes binaires est non monotone courbe en U invers figure 50 Apr s une formation importante d adduit lors de l exposition simultan e aux faibles concentrations de CIP et TAM le nombre d adduit a l ADN diminue graduellement lorsque les doses augmentent La nature des adduits form s tant diff rentes les expositions au TAM seul ou CIP TAM nous avons a faire un ph nom ne de potentialisation plus que de synergie Ce ph nom ne est particuli rement marqu lorsque l on compare les valeurs additives de toxicit attendues de la condition 1 et 2 avec celles observ es tableau 13 Le nombre d adduits au total est respectivement multipli par un facteur 4 et 1 5 Il est vraisemblable que l adduit ne soit pas form par le m me m tabolite que pr c demment 20 CIP TAM CTC 15 Adducts 10 nucleotides CONDITIONS Figure 50 Nombre d adduits l ADN par 109 nucl otides form s dans les cellules h patiques HepG2 expos es 24 h diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM gris et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC blanc Les r sultats sont exprim s en moyennes et les valeurs consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative p lt 0 05 ent
226. e du tamoxif ne 1 1 2 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs androg niques hAR test YAS L effet des mol cules seules sur le r cepteur androg nique est pr sent figure 42 On constate que quelle que soit la concentration test e ni la ciprofloxacine CIP ni la cyclophosphamide CP n entraine d effet agoniste ou antagoniste sur les r cepteur hAR Le tamoxif ne n a pas d effet agoniste significatif vis vis du r cepteur aux androg nes hAR m me si une tendance l induction est observ e la plus forte concentration Par contre cette dose de 10 mg l dilution 10 2 on note un effet antagoniste significatif p lt 0 05 107 Induction Ratio Induction Ratio R sultats amp Discussion Partie 1 50 0 40 0 30 0 20 0 10 0 0 0 1 50 0 40 0 30 0 20 0 10 0 0 0 1 A B es 7 50 0 5a dihydrotestosterone CIP TAM CP a Flutamide CIP TAM CP 40 0 2 ptit fe 300 d ae g 20 0 Le 100 a a ees 0 0 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Concentration g L Concentration g L Figure 42 Evaluation du potentiel agoniste A et antagoniste B sur les r cepteurs androg niques hAR YAS apr s l exposition de levures S cerevisiae diff rentes concentrations de ciprofloxacine courbe jaune tamoxif ne courbe bleue et cyclo
227. e la quantit d ADN marqu pour plus d informations sur les calculs voir th se V Marquis 2005 1 6 Traitement statistique des donn es L ensemble des r sultats pr sent s dans ce m moire de th se ont t d termin s partir de n essais ind pendants Pour chaque essai la toxicit des diff rents chantillons test s a t mesur e en triple tout comme pour la condition contr le Les r sultats sont exprim s en moyenne de valeurs et donn es avec leurs carts types Concernant plus particuli rement les essais standardis s le traitement statistique des donn es a t fait selon les recommandations et proc dures relatifs chaque test Dans le but de v rifier l homog n it a 0 05 des diff rentes donn es obtenues les valeurs des chantillons et du t moin ont t compar es par une analyse de la variance un facteur l aide d un logiciel disponible au laboratoire Le test post hoc de Fisher de comparaison avec la condition contr le a ensuite t appliqu e pour d terminer les valeurs significatives Ainsi les r sultats sont consid r s significatifs lorsque la probabilit pour la comparaison de l chantillon avec le t moin n gatif tait inf rieure la valeur 0 05 Pour ce qui est de l analyse des r sultats obtenus a partir des lign es cellulaires humaines le test post hoc de Dunnetts a t utilis pour les m mes raisons Les r sultats sont consid r s significatifs lorsque l
228. e m tabolite le plus actif de la CIP est la sulfociprofloxacine Le TAM peut tre aussi conjugu l acide glucuronique Une diminution de la potentialit du TAM tre sulfoconjugu car les enzymes sont utilis s pour la sulfoconjugaison de la CIP va favoriser la voie de glucuronation du TAM D autre part le 4 OH TAM form au niveau des tissus extrah patiques va tre transform en cat chol puis en O quinone Dans les cellules des glandes mammaires o ces enzymes sont principalement exprim s nous n avons observ la formation que d un seul adduit de nature diff rente aux pr c dents Lors des expositions aux m langes des trois mol cules ensemble les interactions s expliquent aussi par des interf rences sur les enzymes de biotransformation Par exemple une inhibition du CYP3A4 par la ciprofloxacine favorisera la formation pr f rentielle de 4 OH TAM ayant les propri t s endocriniennes d une part et l acrol ine et le 4 OH CP d autre part figure 55 l origine de cassures de l ADN L adduit dG acrol ine a d j t d crit comme tant consid rablement plus mutag ne pour les cellules de mammif res que chez la bact rie E coli mais 123 R sultats amp Discussion Partie 1 les polym rases mammaliennes ont t d crites comme tant capable de palier les l sions dG acrol ines en pr sence d antig ne lors de la prolif ration cellulaire Kanuri et a 2002 Le TAM quant a lui en i
229. e milieu naturel Cependant bien que de nombreux micropolluants soient limin s par adsorption ou biod gradation dans les STEP certaines mol cules difficilement biod gradables traversent les stations d puration sans perdre n cessairement leur caract re g no toxique et sont directement rejet es dans le milieu naturel Parmi les principaux contaminants pr sents dans l environnement on distingue notamment les compos sorganiques hydrocarbures polychlorobiph nyles pesticides et les m taux Depuis peu lapr sence de polluants mergeants regroupant les produitspharmaceutiques et les alkylph nols ex nonylph nol a t mise en vidence Dans un premier temps les m dicaments taient rarement consid r s comme des polluants environnementaux potentiels du fait de leur utilisation b n fique pour l homme N anmoins plusieurs tudes ont montr la pr sence r currente de ces substances pharmaceutiques actives dans l environnement Halling Sorensen et al 1998 Daughton amp Sternes 1999 Leprat 1999 Emmanuel 2004b Hartemann et al 2006 Zounkova et al 2006 o elles constituent un risque toxique pour la flore la faune et l Homme via l eau de boisson r sistance crois e aux traitements allergie cancer etc Mais ces tudes portent rarement sur unecaract risation physico chimique et cotoxicologique approfondie des effluents et les probl mes relatifs la gestion de ces substances ri
230. e qui ont montr l apparition de d riv s photochimiques plus toxiques que les compos s parents DellaGreca et al 2004 1 4 2 Pr sence dans l environnement Les produits pharmaceutiques en tant que contaminants dans l environnement n ont pas re u une attention imm diate de la part de la communaut scientifique et des autorit s Il aura fallu attendre qu un lien ait pu tre tabli entre la pr sence d thinyloestradiol et la pr sence d effets d l t res chez des populations de poissons Jobling 2004 Kim et al 2007 projet Europ en KNAPPE 2006 2008 pour que la probl matique des rejets de compos s pharmaceutiques soit prise en consid ration En parall le les progr s des techniques analytiques physico chimiques a permis la d tection de traces de substances m dicamenteuses et de leurs d riv s ou m tabolites l chelle mondiale Leurs pr sence a t mise en vidence depuis les STEP ou les boues utilis es en pandage agricole jusqu aux eaux de surface Ternes 1998 Ashton et al 2004 Wiegel et al 2004 les eaux souterraines Zuccato et al 2000 K mmerer 2001 Heberer 2002 Carlsson et al 2006 Gros et 16 Synth se bibliographique al 2006 les mers et oc ans Buser et al 1998 Weigel et al 2002 Palaniyappan et al 2013 ou encore les eaux de boissons Heberer 1997 2002 Reddersen et al 2002 A l heure actuelle plus de 300 produits pharmaceutiques de diff rentes cla
231. e r ponse g no toxique est d pendante la fois des concentrations et la nature des mol cules pr sentes en m lange mais galement du temps d exposition choisi pour l analyse Dans le chapitre suivant nous avons poursuivi notre tude par l application de cette batterie de tests afin d valuer la toxicit d effluents hospitaliers et urbains Seul le test d inhibition de la croissance de L minor n a pas pu tre r alis du fait du temps d exp rience assez long pour une valuation rapide du risque en routine L utilisation des autres essais in situ pour la caract risation de la toxicit des effluents est d terminante pour confirmer sa sensibilit et sa pertinence dans l valuation du risque des mol cules pharmaceutiques dans les milieux aquatiques 127 128 Partie 2 Application de la batterie de tests d cotoxicit pour la caract risation et le suivi d effluents hospitaliers et urbains 129 130 R sultats amp Discussion Partie 2 La batterie de bioessais et de biomarqueurs retenus lors de l analyse de la toxicit de mol cules mod les ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide a t appliqu e a des chantillons bruts d eaux us es Ces chantillons proviennent d une collaboration avec une quipe espagnole de l ICRA Catalan Institute for Water Research Girona Spain dans le cadre du projet MBrMed La zone g ographique de l tude se situe a G rone ville catalane
232. e tri phosphate Benzo a pyr ne Bromure d ethidium Becquerel Concentration d addition Concentration efficace 50 Centre international de recherche contre le cancer IARC Concentration l tale 50 Concentration micellaire critique Cyclooxyg nase Coups par minute Concentration sans effet Cytochrome P450 Demande biologique en oxyg ne Directive cadre europ enne sur l eau Demande chimique en oxyg ne Dose l thale 50 Dulbecco s Modified Eagle Medium Dim thyl sulfoxide Densit optique D sint grations par minute Direction r gionale des affaires aanitaires et aociales DL Dithiolhr itol Acide thyl ne diamine t tra ac tique Environmental Protection Agency Glutathion S transf rase Hydrocarbures polycycliques aromatiques Chromatographie liquide de haute performance Action Ind pendante International Agency for Research on Cancer CIRC Intervalle de Confiance 95 Institut de Radioprotection et de S ret Nucl aire xvi Nomenclatures ISO LIPOX LOD LOEC LOQ MES MN MS NADPH NER NOEC NP1 NQE OCDE OMS OTM PBS PCB PEC PEI PGHS PL PM PNEC RMN ROS SDS SET SPD STEP SVF TRIS US EPA UV YES YAS Organisation internationale de normalisation Lipoxyg nase Limite de d tection Lowest Observed Concentration Effect plus petite concentration effective Limite de quantification Mati re en suspension Nucl ase de staphylocoque Spectrom trie de masse
233. e types de m langes L inhibition de la croissance des lentilles d eau expos es aux m langes CIP TAM se traduit par une courbe de dose r ponse non monotone horm se courbe en S Pour l exposition aux faibles concentrations on observe tout d abord une inhibition significative d environ 17 alors qu on n observe pas de toxicit dans la condition 2 puis on note une inhibition dose d pendante aux concentrations plus importantes conditions 3 4 5 92 R sultats amp Discussion Partie 1 70 CIP TAM A CTC G 60 4 7 S 50 ra a T 40 4 g 3 ces 30 xx 20 s g Shy I T o f ule a all 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS Figure 29 Inhibition de la croissance de cultures de Lemna minor expos es 7 jours diff rentes concentrations de m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM gris fonc et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC gris clair Les r sultats sont exprim s en moyenness et les valeurs consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 05 entre les expositions aux m langes CIP TAM et CTC Lorsque le cyclophosphamide est ajout au m lange l allure de la courbe dose r ponse est diff rente de celle observ e lors de l exposition aux m langes binaires Il y a peu de diff rence de toxicit en fonction des
234. ed according to Singh et al 1988 with minor modifications All the procedures were conducted in the dark and on ice to minimize spurious sources that might cause DNA damage Conventional microscope slides were dipped in 1 6 agarose and allowed to dry on a flat surface at room temperature before the experiment The first layer with a 0 8 normal melting point NMP in PBS phosphate saline buffer containing NaCl 137 mM KCI 2 7 mM NazHPO 4 3 mM KH2PO 1 47 mM pH 7 4 kept at 37 C was added onto frosted slides and gently covered with a cover slide The cell pellet obtained by centrifugation for 5 min at 4 C 4000 rpm was resuspend ed in 150 ul to a final cell agarose solution containing approximately 5 x 10 cells in 0 5 low melting point LMP agarose in PBS and 75 uL was added as the second layer onto duplicate slides The third layer 75 uL 0 5 LMP agarose was added and the slides were placed in fresh lysis solution 2 5 M NaCl 100 mM EDTA Na2 10 mM Tris pH 10 1 Triton X 100 10 DMSO pH 10 at 4 C for 1 h The slides were transferred on a horizontal electrophoresis tray and submerged in denaturation buffer 1 mM EDTA 300 mM NaOH pH 13 for 20 min Electrophoresis was carried out using the same solution for 20 min at 26 V and 350 mA 0 8 V cm then the slides were gently washed three times for 5 min in a cold neutralizing buffer 400 mM Tris pH 7 4 Slides were dried in methanol and stored in a low humid ity environment unt
235. edo JL Adsorption of ciproflox acin on surface modified carbon materials Water Res 2011 45 4583 91 Catastini C Mullot J U Boukari S Mazellier P Levi Y Cervantes P et al Identification de mol cules anticanc reuses dans les effluents hospitaliers Eur J Water Qual 2010 39 171 80 Chou T C Theoretical basis experimental design and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies Pharmacol Rev 2006 58 621 81 Chou T C The mass action law based algorithm for cost effective approach for cancer drug discovery and development Am J Cancer Res 2011 1 925 Coe TS Hamilton PB Hodgson D Paull GC Stevens JR Sumner K et al An environmental estrogen alters reproductive hierarchies disrupting sexual selection in group spawning fish Environ Sci Technol 2008 42 5020 5 Coezy E Borgna J L Rochefort H Tamoxifen and metabolites in MCF7 cells correlation between binding to estrogen receptor and inhibition of cell growth Cancer Res 1982 42 317 23 Costantini D Metcalfe NB Monaghan P Ecological processes in a hormetic framework Ecol Lett 2010 13 1435 47 Crane M Watts C Boucard T Chronic aquatic environmental risks from exposure to human pharmaceuticals Sci Total Environ 2006 367 23 41 Darvari R Boroujerdi M Concentration dependency of modulatory effect of amlodipine on P glycoprotein efflux activity of doxorubicin a comparison with tamoxifen J Pharm Pharmacol 2004 56 985 91 Desai PB Nallan
236. ee ee 35 1380 Le colo hand ain cinema N RE Ei 36 11 3 8 e Pr sence dans l environnement 38 11 3 8 f D termination des gammes de concentrations retenues pour l tude 6 40 lll Outils d valuation en cotoxicologie ss 41 111 1 Typologie des strat gies de caract risation des effets en cotoxicologie 41 111 2 D termination d une batterie de tests pour la mesure des effets biologiques 43 ILZ 1 Lee biotests MONOsSPOCNQUSS ssscciis secssaceresdecsaicasdiderteariegerseiase EEN 44 111 2 1 a Le test Microtox ena 45 Le Le test Algaltox FY Ed nn renard ninanns 46 Ill 2 1 c Le test d inhibition de la croissance sur Lemna minor 46 WL LOS BISMATQUSURS kicn A 47 1 2 2 a Biomarqueurs de viabilit Test MTS 48 W220 Biomargueurs de GRO Neil iuaindar EEE 49 111 2 2 b 1 Mesure des effets perturbateur endocrinien test YES YAS 49 L St CSS COM nn oriente 50 111 2 2 b 8 Technique de post marquage des adduits l ADN au 2P 51 111 2 2 c Utilisation de lign es cellulaires humaines comme mod le d tude 00 00s100100 53 111 2 2 c 1 Avantages et inconv nients li s leur utilisation 53 111 2 2 c 2 Description des lign es utilis es 54 111 2 2 c 2 1 Les cellules h patiques humaines HepG2 54 111 2 2 c 2 2 Les cellules
237. ellules canc reuses qui perdent le contr le du cycle cellulaire Cette prolif ration est souvent associ e a la pr sence d un p53 mut qui n assure plus sa fonction cf figure 6 Ceci perturbe galement l expression de nombreux r cepteurs et peut expliquer les ph nom nes de perturbations endocriniennes Pour v rifier si ces m dicaments aux doses environnementales pouvaient avoir un effet perturbateur endocrinien et ou g notoxique nous avons analys trois types d effets i perturbation endocrinienne tests YES YAS ii la formation de cassures de l ADN en utilisant le test des com tes iii la formation d adduit encombrant en utilisant la m thode du post marquage au P Depuis le d but des ann es 1980 l tude de la g notoxicit en milieu aquatique s est d velopp e suite l observation de cancers dans des populations d esp ces marines ou d eau douce Black amp Baumann 1991 Pfohl Leszkowicz et al 1993 Burgeot et al 1996 Akcha et al 2003 ainsi que des perturbations endocriniennes f minisation des poissons Manickum amp John 2014 en relation avec la persistance voire la bioaccumulation de compos s chimiques ayant des propri t s mutag nes et canc rog nes La contamination des milieux aquatiques par des polluants m me tr s faibles concentrations peut modifier le m tabolisme de l individu et alt rer l int grit du g nome de deux mani res diff rentes i impact dire
238. ement des compos s lectrophilespouvant cr er des adduits l ADN Ils agissent sur transformation n oplasique des cellules en agissant sur les oncog nes ou les g nes suppresseurs de tumeur Ils affectent la transformation en augmentant les esp ces r actives de l oxyg ne ROS l oxyde d azote et les produits de la lipo peroxydation qui ont eux le potentiel de modifier l ADN notamment des cassures l origine de mutations Kawanishi et al 2002 Williams amp Jeffrey 2000 Ceci va interf rer avec le processus de r paration de l ADN ou le contr le du cycle cellulaire Hartwig amp Schwerdile 2002 McMurray amp Tainer 2003 Hughes 2002 Ils peuvent galement affecter la m thylation de l ADN ou encore l ac tylation des histones Bombail et al 2004 qui sont aussi des ph nom nes primordiaux dans l expression des g nes et le cycle cellulaire Exposition aux canc rog nes ae excr tion Organisme m tabolisme G nes Cycle cellulaire R paration ADN M canisme g notoxiques Diff renciation M canisme non g notoxiques Adduits l ADN FROPRRE Inflammation Immunosuppression Cassure de chromosomes _ ROS fusion d l tion mauvaises FE Activation des r cepteurs s parations non disjonction Epigenetic silencing ATT O m Signal de transduction alt r Dommages g nomiques Hypermutabilit t Instabilit g nomique
239. endues dans 3 mL de milieu complet Une suspension pH 7 2 contenant 500 uL de cellules 300 uL de tampon PBS et 200 uL de bleu de Trypan Sigma France est incub e l tuve 37 C 5 COz pendant 5 10 min puis les cellules viables sont d nombr es sur cellules de Malassez La viabilit des cellules en phase exponentielle de croissance doit tre au final au dessus de 95 Les cellules sont ensuite trait es par des solutions de m dicaments seuls ou en m langes dilu es dans du milieu de culture st rile non suppl ment en SVF puis incub es a l tuve a 37 C selon un temps pr d fini 24 h 48 h 72 h La ciprofloxacine le tamoxif ne citrate et le cyclophosphamide Sigma France sont respectivement dissout dans de I HCI 0 1 N du m thanol pur et de l eau milliQ pour pr parer des solutions m res 1 g L conserv es a 20 C pendant 3 semaines maximum Bien que la concentration des solvants dans le milieu de culture des cellules au d but du test soit consid r e comme n gligeable lt 1 une analyse du milieu additionn aux diff rents solvants a t faite pour v rifier l absence d effets toxiques donn es non pr sent es 1 5 2 Test de viabilit cellulaire MTS 5 2 a Produits utilis s Le test de prolif ration a t r alis sur des plaques de 96 puits de chez Falcon fournies par Becton Dickinson Le pont de Claix Allemagne Les r actifs viennent du kit Celltiter 96 Aqueous
240. entre valeur attendue E et valeur observe O Mis a part les effets induits apr s 24 h d exposition dans la condition 1 du m lange binaire CIP TAM on peut observer que les tendances des courbes a 24 h et 72 h sont comparables avec celles obtenus pour le m lange en doses croissantes Ainsi toutes les conditions CIP TAM en doses inverses entrainent des effets antagonistes E O lt 1 En effet lorsque l on compare les valeurs du tableau 10 on constate a 24 h que seules les conditions 4 et 5 induisent une toxicit significativement moins importante que celle attendue tandis qu a 72 h cette observation est valable pour toutes les conditions Ces r sultats semblent indiquer que ce n est pas le TAM qui joue le r le pr pond rant dans la r ponse de toxicit lorsqu il est additionn a la CIP 4 2 Evaluation de la viabilit des cellules mammaires MCF 7 l 4 2 a Toxicit respective et en m lange de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide en doses croissantes La viabilit des cellules MCF 7 expos es pendant 24 h et 72 h de faibles doses non th rapeutiques de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide seuls ou en m lange sont respectivement pr sent s dans les figures 36 et 37 Les r sultats sont exprim s en valeurs m dianes de 15 mesures triplicata de 5 points de mesure A B 105 105 TE R aie 1 100 Sa ee SS SaaS 4 x R 95 95 i I q z
241. ents tr s particuliers o l on retrouve la pr sence de nombreux produits pharmaceutiques ainsi que des microorganismes le plus souvent pathog nes et beaucoup de produits d sinfectants Bien que l on analyse le plus souvent les param tres physico chimiques pour tenter de les caract riser DCO DBO MES NTK le danger r siderait plus dans la pr sence de certaines bact ries multir sistantes aux antibiotiques Proteus vulgaris Mycobact ries et de certaines souches typiquement hospitali res Enterobacter sakazakii SFHH 1993 Leprat 1998 Schwartz et al 2003 Emmanuel et al 2005 Hartemann et al 2006 Les germes t moins repr sentent assez fid lement le risque li la pr sence de pathog nes dont les caract ristiques de r sistance restent finalement assez banales dans le contexte hospitalier si l on excepte une r sistance assez pr occupante aux antibiotiques de synth se de la famille des quinolones On peut noter galement la pr sence d l ments radioactifs utilis s en m decine des fins th rapeutiques ou pour tablir des diagnostics in vivo ou in vitro Fremery amp Rigaud 2001 Certains de ces l ments sont utilis s en sources non scell es et sont donc susceptibles d tre dispers s m me si l vacuation de ces effluents est soumise une r glementation stricte On peut citer par exemple l utilisation d iode131 pour le traitement de l hyperthyro die des cancers thyro diens rejet e
242. er C Mitchelmore C L Moore M N Peters L D Pipe R K 2000 Development of biomarkers to detect the effects of organic pollution on aquatic invertebrates recent molecular genotoxic cellular and immunological studies on the common mussel Mytilus edulis L and other mytilids International Journal of Environment and Pollution 13 56 91 Lopez Serna R Petrovic M Barcelo D 2012 Occurrence and distribution of multi class pharmaceuticals and their active metabolites and transformation products in the Ebro River basin NE Spain Science of the Total Envionment 440 280 289 Lu L J W Disher R M Reddy M V Randerath K 1986 32P postlabelling assay in mice of transplacental DNA damage induced by the environmental carcinogens safrole 4 aminobuphenyl and benzo a pyrene Cancer Research 46 3046 3054 Lu S C Huang H Y 1994 Comparison of sulfur amino acid utilization for GSH synthesis between HepG2 cells and cultured rat hepatocytes Biochemical Pharmacology 47 859 869 Luch A 2005 Nature and nurture lessons from chemical carcinogenesis Nature Reviews Cancer 5 113 125 M Ma J Lu N Qin W Xu R Wang Y Chen X 2006 Differential responses of eight cyanobacterial and green algal species to carbamate insecticides Ecotoxicology and Environmental Safety 63 268 274 Majima M Amano H and Hayashi 1 2003 Prostanoid receptor signaling relevant to tumor growth and angiogenesis Tren
243. ermany Le Roti ph nol ph nol satur en Tris HCl provient de Roth Sochiel Lauterbourg France La poudre de cellulose MN 301 vient de chez Macherey Nagel D ren Allemagne La poly thyl neimine HCI 5 Corcat PEI P 600xE est fournie par CORCAT Virginia Chemicals Portsmouth VA USA 72 Mat riels amp M thodes 1 5 4 a 2 Les enzymes La phosphodiest rase bovine de rate SPD P 9041 la nucl ase de staphylocoque MN N 3755 la prot inase K P 6556 la ribonuclease T1 RNAse T1 d Aspergillus R 1003 et la Ribonucl ase pancr atique de boeuf RNAse A R 4875 sont fournies par Sigma chimie St Quentin Fallavier France La nucl ase P1 236 225 Penicillium citrinum et la T4 polynucl otide kinase R838 292 proviennent de Roche Diagnostic Meylan France 5 4 a 3 Mat riels de chromatographie Les plaques de poly thyl ne imine cellulose PEI sont pr par es au laboratoire Le support en plastique 130 cm x 20 cm provient de chez France Plastics Lyon France Soixante treize grammes de cellulose sont m lang s 48 mL d une solution de poly thyl ne imine HCI 5 et 500 mL d eau distill e L taleur Desaga Heidelberg Allemagne sert couler le m lange apr s d gazage sous vide sur les supports plastiques Les plaques s chent temp rature ambiante pendant environ 16 h Elles sont ensuite d coup es au format 18 cm x 26 cm lav es au m thanol 1 minute et rinc es
244. ermining whether a chemical or a complex mixture has genotoxic properties elucidation of the toxicological pathways of carcinogens and monitoring DNA repair Hemminki et al 1997 Pfohl et al 1993 2008 Williams Brown et al 2011 Chatel et al 2012 2014 Cachot et al 2013 The aim of this paper was to analyze DNA adduct formation as potential sensitive biomarker for early stage genotoxic evaluation of low doses of three drugs found in hospital effluents river or drinking water DNA adducts formation was evaluated on human hepatoma cell line HepG2 and human mammary cell line MCF 7 exposed to the drugs in range of environmental concentrations ranging from 1 ng L to 100 ug L In parallel the both cell lines have been exposed to raw effluents from hospital and to the inflow and outflow of the municipal waste water treatment plant WWTP HepG2 cells have been chosen because they are extensively used for toxicity and genotoxicity evaluation of pure compounds and retained many of the properties of primary liver cells including the metabolic activation Lu and Huang 1994 Amat et a 2004 2007 Owing their endogenous expression of a variety of xenobiotic metabolizing enzymes this cell lines are useful for detecting the combined effects of chemical in mixture Zegura et al 2009 Mersch Sundermann et al 2004 MCF 7 cells have been chosen to detect the endocrine disruptor potential of compounds including when they are present in mixtures L
245. es aquatiques Shugart amp Theodorakis 1994 Stein et al 1994 Burgeot et al 1996 Livingstone et al 2000 Shugart 2000 Bocqu n et al 2004 Amat et al 2006 Toutefois m me si l utilisation de batterie de test n a fait qu augmenter pour mesurer l impact de x nobiotiques sur des esp ces et milieux aquatiques Orias amp Perrodin 2013 il est important aujourd hui d largir les champs d investigation de l cog notoxicit l Homme 111 2 2 b 1 Mesure des effets perturbateur endocrinien test YES YAS L action d un x nobiotique dans la cellule peut se faire directement sur un r cepteur cellulaire La substance qui entre alors en comp tition avec diverses autres mol cules endog nes peut entrainer une d r gulation du syst me endocrinien Cette substance est alors qualifi e de perturbateur endocrinien De mani re g n rale les perturbateurs endocriniens PE sont des compos s qui ont t d crits comme des substances exog nes qui alt rent le fonctionnement du syst me endocrinien et par cons quent causent des effets n fastes sur la sant d un organisme intact de sa descendance ou d une sous population WHO 2002 De ce fait les PE correspondent une classe de compos s d finis non pas chimiquement mais par leur action biologique Il existe un grand nombre de m canismes par lesquels les PE peuvent moduler le syst me endocrinien et engendrer des effets n fastes
246. es m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC E O repr sente le ratio entre valeur attendue E et valeur observe O 102 Cell viability R sultats amp Discussion Partie 1 Contrairement ce qui avait pu tre observ dans la partie pr c dente avec les cellules HepG2 aucun effet antagoniste n est observ apr s exposition 24 h et 72 h des cellules mammaires MCF 7 aux m langes binaires CIP TAM De la m me mani re que pour les m langes binaires on ne constate aucune interaction lorsque les cellules sont expos es pendant 24 h aux m langes CIP TAM CP Par contre apr s 72 h d exposition aux m langes ternaires on observe un ph nom ne d antagonisme En effet alors que toutes les doses de cyclophosphamide seul entrainaient une l g re inhibition significative de la croissance cellulaire figure 36 l exposition a des m langes ternaires n entrainent plus aucune r ponse de toxicit figure 37 1 4 2 6 Etude de la toxicit des m langes CIP TAM en doses inverses Comme dans le chapitre 1 4 1 6 nous avons galement valu l impact des m langes de CIP TAM en dose inverse sur la viabilit cellulaire mammaire MCF 7 Les r sultats sont pr sent s dans la figure 39 et sont exprim s en valeurs m dianes de 15 mesures triplicata de 5 points de mesure A B 110 110 105 7 105 100 a i 3 ae renee 100 z
247. es ou cycles hydrocarbon s Bliefert amp Perraud 2001 Lavou et al 2002 Tant que la concentration en tensioactifs est faible la partie hydrophobe des surfactants a tendance a fuir les solutions aqueuses et forme spontan ment un film mono mol culaire l interface qui lui procure un espace disponible Lorsque la surface libre de la solution aqueuse ne se voit plus capable d accueillir de nouvelles mol cules le film mono mol culaire entre en comp tition avec la formation d agr gats organis s de mol cules les micelles On parle alors de la CMC ou Concentration Micellaire Critique LePerchec amp Richard 1994 Lin et a 2004 La structure des surfactants engendrent des propri t s physico chimiques sp cifiques qui constituent le facteur essentiel dans les op rations de nettoyage Rodier et al 1996 On distingue plusieurs types de surfactants Les surfactants anioniques qui sont g n ralement tr s utilis s et d origine naturelle savons sels d acides gras lls poss dent un pouvoir d tergent important et sont galement utilis s comme agents hydrotropes pour favoriser la solubilisation dans la solution d tergente d agents peu solubles dans l eau Les tensioactifs anioniques pr sentent une faible activit bact riostatique r versible ils sont sensibles la duret de l eau et certains sont susceptibles de subir une hydrolyse partielle dans la solution nettoyante Lavou et al 2002 Les surfact
248. esaeeneeetene 67 1 5 1 6 5 Conditions de traitement des cellules 68 1 5 2 Test de viabilit cellulaire MTS iii 68 Povey POUR Ulise Sania ennui a ne es ue 68 Rs PROD anna einen ide nettes 68 ARR Se PR AA NORS cre rer creme ere ts 69 1 5 3 Test des com tes sur cellules humaines 70 ESS Produits WBS crire eei e 70 baD FEDE eaaa 70 Iae 62 116 0 E ee A ER 71 1 5 4 Technique de post marquage au P des adduits l ADN 72 loaa PROCS WHS a acess RE PE ER SU 72 Fes Les produis chiniigut S sero Fe adaz ES nonita Ta 1 5 4 a 3 Mat riels de chromatographie ccceeeceseseeeseeeseeeeeeeeeeeaeeeseeteeeeneeteae 73 LS Aaa Les addurs standards sionrornrin a E EE 73 L540 PIMPE nsn O AE 73 SRE PPV sree a E cece E E 75 LS ACA Exrachomde ADN se ccs ccc nc nn nt n e nero E 75 ERA Punmicaion del ADN orioa E EN 75 1 5 4 c 3 Estimation de la qualit et de la quantit d ADN 76 5464 Marquage d s adults sisi icnsaneesememsemenseneesensamcistes SACS fydorso del AIN ed teste dre ernder etienne 15 4c42 Ennchissementa la nuclease PT sssssinisisseesensnrnnens 1 5 4 c 4 3 Marquage des adduits au P en position 5 1 5 4 c 4 4 Test d efficacit de l hydrolyse 1 5 4 c 4 5 Test d efficacit de l enrichissement 1 5 4 c 5 S paration des adduits par chromatographies bidimensionnelles sur gauche mince FE eNOS assii 78 1 5 4 c 6 Autoradio
249. est on calcule le pourcentage d inhibition du taux de croissance en pourcentage par rapport au taux de croissance moyen des lots t moins d72n do T x 100 dizan do o d7zn est la densit cellulaire moyenne des deuxr plicas de l chantillon apr s 72 h d incubation dvn est la densit cellulaire moyenne des t moins et do est ladensit initiale inoculum Crit res de validit de l essai La concentration cellulaire moyenne des lots t moins est multipli e par un facteur sup rieur 67 en 72 heures Le coefficient de variation des solutions t moins ne d passe pas 5 Le pH des solutions t moins n a pas augment de plus de 1 5 unit s pendant l essai par rapport au pH du milieu de croissance La sensibilit de la souche du laboratoire est contr l e par des essais r guliers avec le dichromate de potassium 1 3 Le test d inhibition de la croissance sur Lemna minor 1 3 1 Principe Cet essai chronique est r alis d apr s la norme ISO 20079 2005 Il consiste valuer l effet inhibiteur d une solution ou d un effluent sur la croissance de populations de lentilles d eau en 7 jours en fonction de deux crit res le taux de croissance du nombre de fronde et de la surface verte 63 Mat riels amp M thodes 1 3 2 Protocole L essai est r alis avec des colonies de deux ou trois frondes de Lemna minor issues d une culture du laboratoire acclimat e pendant au moins
250. eurs g notoxiques Shaw et al 2000 Smart et al 2006 D autre part on notera que les cellules dites circulantes dans l organisme sont g n ralement moins sensibles que les h patocytes et les cellules de branchies dans le cas d esp ces aquatiques Pandey et al 2006 Kim et al 2006 Huang et al 2007 A l heure actuelle des directives de l OCDE recommandent son utilisation dans l valuation de la g notoxicit chez les mammif res le protocole de cet essai n est pas pour autant standardis Par cons quent de faibles variations dans le protocole peuvent aboutir des diff rences majeures de r sultats Il existe d ailleurs un consensus pour inclure des mesures de cytotoxicit lors de l exp rimentation afin de mieux interpr ter les r sultats Hartmann et al 2003 Burlinson et al 2007 111 2 2 b 3 Technique de post marquage des adduits l ADN au P L objectif de beaucoup d tudes men es ces derni res ann es a t d tablir les relations entre la biotransformation la r paration et le d veloppement de cancers chez l Homme lors d exposition des contaminants environnementaux De par la capacit de ces polluants nuire l int grit g n tique d une cellule la d tection sp cifique de dommages l ADN repr sente une n cessit dans l valuation de la g notoxicit Bartsch et al 1998 51 Synth se bibliographique La formation d adduits l ADN est une tape essent
251. eux crit res de mesure d effets mortalit inhibition de croissance immobilisatio etc lls sont d sormais normalis s k l gt substances x substances H a L 4 Lp substances avec effets combin s caract risation 3 4 des effets E batterie de bioessais 4 5 J bioessais L ou a bioessais pluri sp cifiques Figure 11 Les diff rentes strat gies de caract risation des effets th se C Boillot 2008 Cette caract risation n cessite de choisir les processus simuler et de hi rarchiser les ph nom nes que l on souhaite mod liser La qualit des r sultats produits s en trouve fortement affect e et l utilisation de diff rents mod les d analyses peut souvent conduire l obtention de r sultats diff rents et difficiles interpr ter Devillers et al 2000 De plus compte tenu de la grande diversit des esp ces animales et v g tales dans les cosyst mes aquatiques naturels producteurs primaires consommateurs primaires et secondaires d composeurs et du fait de la complexit des diverses 42 Synth se bibliographique bioc noses pr sentes dans ces cosyst mes le choix des esp ces mod les utilis es au laboratoire est particuli rement complexe pour tre repr sentatif de ces diverses bioc noses En pratique il n est pas envisageable de r aliser des exp rimentations sur l ensemble des esp ces et dans ces conditions
252. eux limites L une des limites concerne la qualification et la quantification des m canismes explicatifs de la variabilit spatio temporelle de la mesure la seconde une certaine difficult interpr ter les r sultats 47 Synth se bibliographique une organisation biologique suffisante pour extrapoler un danger vis vis des organismes et leur population Forbes et al 2006 et motiver des mesures de gestion cons quentes Mais les tudes men es depuis une trentaine d ann e tendent a monter que la surveillance des effets des polluants par la mesure de la r ponse biomarqueur chez des organismes reste pertinente et valable surtout dans le cas o une batterie de biomarqueurs est analys e sur le m me chantillon Ils peuvent notamment permettre la d tection sp cifiques de dommages l ADN ce qui repr sente une n cessit dans valuation de la g notoxicit Burgeot et al 1996 Bartsch et al 1998 Dans une revue relativement r cente r alis e par des chercheurs britanniques et fran ais les biomarqueurs font d ailleurs partie de la boite a outils propos e pour mener bien la surveillance chimique et biologique dans le cadre de la DCE Allan et al 2006 Pourtant l heure actuelle l valuation du risque par les biomarqueurs n est pas encore envisag e dans la mise en uvre de la Directive Cadre sur l Eau DCE 2000 Marine Pollution Bulletin 2007 Dose Effet de la substance Para
253. evenson amp Craig Jordan 1997 Charles et al 2002 Wong amp Cheng 2012 John Wiley amp Sons Inc Page 4 of 42 Page 5 of 42 OONDOOARWND 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 Environmental and Molecular Mutagenesis Materials and methods Chemicals Ciprofloxacin CIP tamoxifen citrate TAM and cyclophosphamide CP Figure 1 were obtained from Sigma Aldrich France Cell culture reagents including fetal calf serum material and enzymes were obtained from Fisher scientific France The P Adenosine 5 triphosphate tetra triethylammonium salt 10mM Tricine pH 7 6 was obtained from PerkinElmer SAS France All solutions were prepared using ultrapure water Sample collection and pre treatment Wastewater samples were collected from effluent of Dr Josep Trueta Hospital of Girona Spain around 400 beds and from influent and effluent of the municipal WWTP of Girona The town counts approximately 96 236 inhabitants Hospital effluent and WWTP influent samples were taken during the morning between 10 to 11 h am The WWTP effluent samples were taken 27 h after around 13 h pm Amber glass bottles pre rinsed with ultrapure water were used for sample collection The samples were immediately vacuum filtered through 1 um glass fiber filters fol
254. ex effluents Dans Aquatic toxicology and Hazard Assessment Fifth Conference ASTM J G Pearson R B Foster et W E Bishop ds p 179 195 Philadelphia PA ASTM R Rabiet M 2006 Contamination de la resource en eau par les eaux us e dans un bassin versantm diterran en Apport des l ments majeurs traces et terres rares Th se Universit deMontpellier I Sp cialit Terre solide g odynamique des enveloppes sup rieures pal obiosph re Sciences de l Eau dans l Environnement Continental 368p Ramade 2007 Introduction l cotoxicologie Fondements et applications Editions TEC amp DOC France 618 p Randall W A Price C W Welch H 1947 Demonstration of Hormesis Increase in Fatality Rate by Penicillin American Journal of Public Health and the Nations Health 37 421 425 Randerath K Reddy M V Gupta R C 1981 32P postlabelling test for DNA damage National Academic of Science of the Unites States of America 78 6126 6129 Ravi P R Vats R Kora U R 2013 Effect of ciprofloxacin and grapefruit juice on oral pharmacokinetics of riluzole in Wistar rats CYP1A2 inhibitors and riluzole kinetics Journal of Pharmacy and Pharmacology 65 337 344 Reddel R R Murphy L C Sutherland R L 1983 Effects of biologically active metabolites of tamoxifen on the proliferation kinetics of MCF 7 human breast cancer cells in vitro Cancer research 43 4618 4624 Reddersen K Heberer
255. ez l homme 57 g nes et 47 pseudog nes ont t s quenc s http drnelson utmem edu Cytochrome P450 html Dans le syst me des mono oxyg nases la vari t des propri t s catalytiques trouve son origine dans la diversit de structure de la partie apoprot ique du cytochrome P450 Selon le degr d homologie entre les s quences primaires des acides amin s constitutifs les crit res phylog n tiques et l organisation g n tique les cytochromes P450 ont t r partis en familles et sous familles Nebert et al 1987 La nomenclature actuelle des cytochromes P450 consiste nommer un g ne ou un ADNc par le symbole CYP suivi d un chiffre arabe d signant la famille d une lettre majuscule d signant la sous famille puis d un chiffre arabe pour chaque g ne Nelson et al 1996 Pour d signer ARNm ou la prot ine la m me nomenclature est employ e sans l attribut italique En r gle g n rale les CYPs appartenant une m me famille poss dent plus de 40 d homologie de s quence et l int rieur d une m me sous famille l identit peut tre sup rieure 55 Les g nes appartenant une m me sous famille sont group s sur un m me chromosome en clusters I 1 1 d Implication dans la m tabolisation des x nobiotiques En pr sence de substrat exog ne les CYPs catalysent un tr s grand nombre de biotransformations figure 3 qui se distinguent principalement par l activit biologique ventuelle du p
256. f CP max 10ug L Considering that these drugs can co occur in water the toxic effects of mixtures CIP TAM and CTC were compared to their individual effects Both binary and ternary exposures of cells revealed globally a dose dependent increase of the total DNA adducts amount more pronounced on MCF 7 cells than in HepG2 In addition the DNA adduct pattern in hepatic cells was modified when TAM was in presence of CIP or CIP CP When HepG2 cells were exposed to TAM and CIP CIP inhibited the formation of the specific TAM adducts 1 amp 2 and induced the formation of another adduct 3 This can be explained by the interaction of CIP on biotransforming enzymes involved in the metabolic pathway of TAM Indeed CIP is an inhibitor of CYP 3A activity in vitro and in vivo Xie et al 2003 The inhibition of CYP 3A favors the formation of 4 OH TAM exhibiting the estrogenic activity and which can undergo further transformation into quinone methide resulting in formation of E a deoxyguanosin N2 yl 4 OH TAM Figure 15 When the cells were exposed to the three drugs the interaction is more complex The DNA adducts 2 and 3 were not formed anymore whereas adduct 1 was increased While CIP inhibits CYP 3A4 Xie et al 2003 and glucuronidase Kodawara et al 2014 TAM and its metabolites N desmethyl TAM 4 OH TAM induce CYP 3A4 Desai et al 2002 Sane et al 2008 but inhibit CYP 2B6 2C9 and 2D6 Sridar et al 2002 It has been show
257. f ICRA Institute Girona Spain within the trans Pyrenean MbRMed Project The authors declare that there are no conflicts of interests References Afsharian P M llgard ZH Xie H Kimby E Hassan M 2005 The effect of ciprofloxacin on cyclophosphamide pharmakocinetics in patients with non Hodgkin lymphoma European Journal of Haematology 75 3 206 211 Altenburger R Nendza M Sch rmann G 2003 Mixture toxicity and its modeling by quantitative structure activity relationships Environ Toxic Chem 22 1900 1915 Amat A Castegnaro M Pfohl Leszkowicz A 2004 Genotoxic activity of thiophenes on human cell line HEPG2 Polycyclic aromatic hydrocarbon 24 733 742 Amat A Castegnaro M Pfohl Leszkowicz A 2007 Genotoxic activity and induction of biotransformation enzymes in two human cell lines after treatment by Erika fuel extract Environ Toxicol Pharmacol 23 89 95 Anadon A Martinez Larragna MR lturbe J Martinez MA Diaz MJ Frejo MT Martinez M 2001 Pharmacokinetics and residues of ciprofloxacin and its metabolites in broiler chickens Research in Veterinary Science 71 2 101 109Aranha O Wood D P Sarkar F H 2000 Ciprofloxacin mediated cell growth inhibition S G2 M cell cycle arrest and apoptosis in a human transitional cell carcinoma of the bladder cell line Clinical Cancer Research 6 891 900 Barltrop JA Owen TC Cory AH Cory JG 1991 5 3 carboxymethoxyphenyl 2 4 5 dimethylthiazolyl 3 4 sulfophenyl te
258. f chemical toxicity to environmental bacteria and its use in interspecies comparisons and correlations Research Journal of Water Pollution Control Federal 63 3 198 207 Bocquen G Chantereau S Cl rendeau C Beausir E M nard D Raffin B Minier C Burgeot T Pfohl Leszkowicz A Narbonne J F 2004 Biological effects of the Erika oil spill on the common mussel Mytilus edulis Aquatic Leaving Resources 17 3 309 316 Boddy A V Yule S M 2000 Metabolism and pharmacokinetics of oxazaphosphorines Clinicological Pharmacokinetic 38 291 164 Bibliographie Bohnenstengel F Hofmann U Eichelbaum M Kroemer H K 1996 Charact rization of the cytoochrome P450 involved in side chain oxidation of cyclophosphamide in humans European Journal of Clinical Pharmacology 51 297 301 Boillot C 2008 Evaluation des risques cotoxicologiques li s aux rejets d effluents hospitaliers dans les milieux aquatiques Th se Vaulx en Velin INSA de Lyon SSEIU 298p Bombail V Moggs J G Orphanides G 2004 Perturbation of epigenetic status by toxicants Toxicology Letters 149 51 58 Bonnard N Brondeau M T Jargot D Lafon L 2001 Fiche toxicologique n 239 L acide perac tique INRS Paris 5p Boocock D J Brown K Gibbs A H Sanchez E Turteltaub K W White I N H 2002 Identification of human CYP forms involved in the activation of tamoxifen and irreversible bindin
259. f provenant du y 32 ATP sur la position 5 du nucl otide Les adduits marqu s sont ensuite d pos s sur des plaques de polyethyl neimine cellulose et s par s par chromatographie multidirectionnelle changeuse d anions encouche mince TLC dans unsyst me de solvants bas s sur les propri t s chimiques des mol cules adduit es La d tection des adduits se fait par autoradiographie sur des crans amplificateurs pendant 18 h 24 h qui seront analys s sur un bioimager typhoon Bien que la technique soit extr mement sensible pour la d tection des adduits l ADN elle n est qu une m thode semi quantitative et ne permet pas de fournir des informations structurales sur les adduits 52 Synth se bibliographique En effet la structure chimique peut tre suppos e a partir de la mobilit chromatographique des spots d adduit observ s mais leur attribution doit tre accomplie indirectement par des analyses cochromatographiques avec des adduits standards synth tiques ou par spectrom trie de masse s il est possible d isoler une quantit suffisante d adduit analysable La quantification s effectue par mesure de la radioactivit incorpor e En connaissant l activit sp cifique le nombre d adduits modifi s par ug d ADN peut tre calcul Les r sultats sont finalement exprim s en nombre d adduits 10 nucl otides I11 2 2 c Utilisation de lign es cellulaires humaines comme mod le d tude Selon la d
260. fects that were calculated from single toxin toxicity obtained in the same experiments The two reference models of concentration addition CA and the independent action IA were used to derive patterns of joint effects of mixture Chou 2006 2011 The CA model assumes that mixed chemicals have the same mode of action MoA whereas the IA model is based on the idea of a dis similar action of mixture components usually to answer the question whether the probability of toxicity from exposure to no chemical is inde pendent from the probability to another chemical Altenburger et al 2003 Jonker et al 2004 2005 Data modeling allowed us to infer that all three toxins exerted inter active effects in HepG2 cell viability bacteria viability microtox algae proliferation algaltoxkit F and genotoxicity comet assay A U shape dose response was observed for the cell viability test and microtox test with both kinds for the mixture Both of these latter tests reflect a mainly acute toxic effect The application of the CA model showed that the observed cytotoxic effects were lower than expected and an antagonistic pattern was identified Concerning the algaltoxkit F test and the comet assay reflecting a chronic toxic effect both mixtures have a synergistic effect While indi vidually the three drugs would not be expected to cause DNA breaks or inhibition of algae growth at these low doses the drugs in the mixture lead to a dose
261. fet chronique 1 2 1 Analyse des cassures l ADN induites sur cellules h patiques HepG2 La formation de cassures l ADN ont t valu e sur des cellules HepG2 expos es 24 h et 72 h de faibles doses non th rapeutique de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide figures 44 et 45 Les r sultats sont exprim s en valeurs m dianes de 8 mesures 4 s ries ind pendantes r alis es en duplicata A B 25 1 25 aCIP BTAM mCP oCIP TAM mCP 20 4 20 4 15 15 10 10 5 me J iW a i 0 r 0 i a i a i control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Concentration ug L Figure 44 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP blanc tamoxif ne TAM gris et cyclophosphamide CP noir Les r sultats sont exprim s en m dianes et les valeurs consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 Dans la gamme de concentrations test es 10 ng L 10 ug L l exposition des cellules h patiques a chaque mol cule respective n entraine pas de cassures ADN quelque soit le temps d exposition figure 44 M me l exposition une dose 10 fois plus concentr e de ciprofloxacine 100 ug L n induit pas de g notoxicit Lorsque les cellules sont expos es aux m langes binaires ou te
262. finition du Comit de terminologie de l Association am ricaine de culture de tissu Schaeffer 1979 les cultures cellulaires correspondent au maintien en dehors de l organisme de cellules non organis es en tissu mais capables de se diviser et d exprimer in vitro des m tabolismes et des fonctions sp cifiques Les cultures cellulaires se sont d velopp es pour deux raisons majeures d une part car les cultures cellulaires ont atteint un tr s haut niveau de technicit d autre part pour des raisons thiques En effet les pays industrialis s ont pris conscience que la souffrance des animaux n tait pas indispensable aux progr s de la sant humaine L utilisation des cultures primaires chez l homme est limit e par les difficult s d obtention de pr l vements ad quats en particulier chez les sujets sains De plus ce type de culture a une dur e de vie limit e m me dans des conditions de culture optimales Gruenert et al 1990 C est la raison pour laquelle ont t d velopp es des techniques d immortalisation cellulaire donnant lieu des lign es cellulaires Sous le nom de lign es cellulaires on regroupe e Les lign es d rivant de tissus sains de caract re diploide et a dur e de vie limit e Ces cellules meurent in luctablement au bout d un certain nombre de subcultures cette mort tant pr c d e par une p riode de vieillissement e Les lign es cellulaires issues de tumeurs qui sont des lign es tra
263. flatoxin B1 DNA binding in vivo in rainbow trout at dietary levels that do not induce CYP1A enzymes Carcinogenesis 17 79 87 Tang J Y M McCarty S Glenn E Neale PA Warne M St J Escher B I 2013 Mixture effects or organic micropollutants present in water Towards the development of effect based water quality baseline toxicity Water Research 47 3300 3314 Tang J Y M Aryal R Deletic A Gernak WGlenn E McCarty S Neale P A Warne M St J Escher B I 2013 Waste water 47 5594 5606 Tannenbaum S R 1997 Comparative metabolism of tamoxifenand DNA adduct formation and in vitro studies on genotoxicity Seminars inOncololgy 24 81 86 Taub F B 1989 Standardized Aquatic Microcosm Development and Testing In Boudou A Rybeyre F Aquatic Ecotoxicology Fundamentals Concepts and Methodologies Boca Raton Florida CRC Press 2 47 91 Ternes T A 1998 Occurrence of drugs in German sewage treatment plants and rivers Water Research 32 11 3245 3260 Ternes T A Joss A Eds 2006 Human Pharmaceuticals Hormones and Fragrances The Challenge of Micro pollutants in Urban Water Management IWA Publishing London Thoumelin G 1995 Les tensio actifs LAS APE dans les eaux douces et marines Analyse comportement et cotoxicologie IFREMER Rep res oc an n 9 Plouzan 113p Tjan Heijnen V Manegold C Buchholz D 1999 Reduction of chemotherapy induced febrile leukopenia by ciprofloxacin an
264. fluent correspond a plus de 80 du volume finale analys les chantillons d eaux us es sont quivalents 10 du volume final test avec le test Algaltox F Dans le cas de la culture cellulaire le volume d effluent ajout quivaut galement 10 du volume final de culture Une proportion plus importante entrainerait une perturbation de la croissance cellulaire du fait de la faible teneur en l ments nutritifs dans le milieu On notera galement que nous n avons pas voulu vaporer les chantillons pour les rependre dans le milieu de culture afin de ne pas modifier la matrice de l chantillon qui peut jouer un r le dans l induction d une r ponse de toxicit 133 R sultats amp Discussion Partie 2 I Evaluation de la bioluminescence de la bact rie V Fischeri Microtox Les bact ries marines Vibrio fischeri ont t expos es a 5 15 et 30 min aux diff rents chantillons d effluents hospitaliers et d effluents d entr e et sortie de STEP Les resultats mesur s a 5 et 15 min d exposition pr sentaient le m me profil que ceux obtenus a 30 min mais d intensit plus faible Pour des raisons de simplification de l analyse seuls les r sultats obtenus 30 min sont pr sent s dans la figure 58 Les valeurs sont exprim es en moyenne de 6 points de mesure 3 s ries en duplicata La condition contr le correspond aux bact ries n ayant re u aucun traitement 120 100
265. fois sont diff rents d une esp ce l autre afin de mieux caract riser les risques d organismes expos s aux polluants y compris l Homme cet effet les biomarqueurs ont t largement d velopp s partir des ann es 80 sur poissons invert br s v g taux puis finalement appliqu s des mod les cellulaires humains pour r pondre ce besoin de caract risation de la pression chimique sur les milieux et de la mise en vidence de perturbations pr coces 1 2 D termination d une batterie de tests pour la mesure des effets biologiques Au cours de ce travail de th se nous nous sommes donc int ress caract riser la toxicit de diff rents m langes de m dicaments en utilisant plusieurs biomarqueurs de toxicit et g notoxicit sur des lign es cellulaires ou des r cepteurs strog niques humains int gr s de mani re stable chez une levure pour tester le potentiel perturbateur endocrinien En parall le l valuation des effets toxiques vis vis de la flore et de la faune aquatiques reposant au moins en partie sur la r alisation de bioessais de toxicit de laboratoire nous avons d cid d utiliser galement en parall le des bioessais standardis s L utilisation de ces outils a pour but d valuer la sensibilit des diff rents mod les d tude procaryotes ou eucaryotes avec des doses environnementales de m dicaments ou des chantillons bruts d eaux us es de comparer les r ponses obtenus res
266. further migration was performed after turning the plate 90 anticlockwise in 1 M NaH PO and 4 5 M urea pH 6 4 for 2 h D3 Finally the chromatogram was run in the same direction in 1 7 M NaH2PQ pH 6 for 2 h D4 Autoradiography was carried out at 80 C for 48 h in the presence of an intensifying screen Radioactive spots were detected by autoradiography on Kodak super X Ray film Quantification of DNA adducts Quantitation of DNA adducts was obtained by storage phosphor imaging techniques employing intensifying screens at room temperature for 18 h The screens were scanned using a Typhoon 9210 Amersham Software for processing the data was ImageQuant version 5 0 After background subtraction the amounts of DNA adducts were expressed amount of adduct per 10 nucleotides To calculate the amount of screen response screen pixel in dpm samples of P ATP at different concentrations from 10 to 500 dpm were John Wiley amp Sons Inc OONOOARWND D 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 Environmental and Molecular Mutagenesis appropriately diluted and spotted on a TLC plate The plate was then scanned with the samples to obtain a radioactivity scale Alkaline single cell gel electrophoresis SCGE assay Treatment Subcultures for experiments were prepared the d
267. g to DNA Carcinogenesis 23 1897 1901 Borgert C J Quill T F McCarty L S Mason A M 2004 Can mode of action predict mixture toxicityfor risk assessment Toxicology Applied in Pharmacology 201 85 96 Borner K H ffken G Lode H Koeppe P Prinzing C Glatzelc P Wiley R Olschewski P Sievers B Reinitz 1986 Pharmacokinetics of ciprofloxacin in healthy volunteers after oral and intravenous administration European Journal of Clinical Microbiology 5 2 179 186 Boy D Cheveign S 2000 Enqu te les attentes du public vis a vis de la science Sabouter JF Caro P Chercher jour apr s jours les aventuriers du savoir Edition autrement Paris 202 214 Boyer B Jouanneau J Tucker G Valles A M Sastre X Moens G Thiery J P 1999 La m tastase canc reuse Medecine Sciences 6 442 Brain R A Solomon K R Brooks B W 2009 Targets Effects and Risks in Aquatic Plants Exposed to Veterinary Antibiotics ACS symposium series 1018 169 189 Brandt S Heller H Schuster K D Grot J 2004 Tamoxifen induces suppression of cell viability and apoptosis in the human hepatoblastoma cell line HepG2 via down regulation of telomerase activity Liver international 24 46 54 Brandt S Heller H Schuster K D Grot J 2005 The tamoxifen induced suppression of telomerase activity in the human hepatoblastoma cell line HepG2 a result of post translational regulation Journal of Cance
268. ges which may or not be revealed by comet assay COM 2000 Toxicology has long been dominated by an emphasis on very high doses and the assessment of toxic responses In comparison with human health risk assessment ecological risk assessment is poorly understood particularly with low doses exposures The concentrations chosen were based on the range reported in the literature although the concentrations of contaminants depend on the pharmaceutical usage patterns the size of the surrounding population the specific wastewater treatment available and the John Wiley amp Sons Inc Page 12 of 42 Page 13 of 42 J O O1 BR D 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 Environmental and Molecular Mutagenesis discharge location The concentrations are not meant to be an exact match to what is found in one municipal wastewater treatment plant or field site but to represent concentrations that are environmentally reasonable The high concentration tested was near the highest reported concentrations found in hospital wastewater up to 150 ug L Martins et al 2008 Santos et al 2013 Negreira et al 2013 In the range of doses tested ng L 10 ug L CIP and CP did not induce any DNA damages independently of the cells lines On the contrary the exposure of hep
269. giques n cessaires et pr parer Apr s pr paration de la plaque des les cultures de r action Ajouter respectivement contenant 20ml de sos in vo p A milieu basal chacun des volumes calcul s NEURE ONDES PURE US HR EEN 100 de culture de r action dans chaque puits des plaques d di es 32 C 100rpm 48h Placer 32 C 100rpm pour 48h Jour 3 mercredi Lecture et interpr tation DO Inspecter les plaques Lire les DO et DOgo9 Reporter les donn es dans le programme Excel fourni ou dans votre propre syst me et interpr ter En r sum Apr s un week end de culture fongique 100y1 de milieu de r action 2ul d chantillon 100yl de culture de r action gt Interpr tation apr s 48h d incubation 191 Annexes 192 Annexes Article 1 In vitro tests aiding ecological risk assessment of ciprofloxacin tamoxifen ans cyclophosphamide in range of contentrations released in hospital and surface waters Publi 193 Environment International 63 2014 191 200 Contents lists available at ScienceDirect Environment International journal homepage www elsevier com locate envint ENVIRONMENT Full length article In vitro tests aiding ecological risk assessment of ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface water CrossMark N Mater F Geret L Castillo V Faucet Marquis
270. graphie et quantification des adduits cceseeeeeeeeeeeeeee 79 1 6 Traitement statistique des donn es nn 80 Table des mati res R sultats amp Discussions 83 Partie 1 Etude de la toxicit des mol cules mod les ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide l aide d une batterie de bioessais et de biomarqueurs Chapitre 1 Impact de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide sur la viabilit d organismes procaryotes et eucaryotes 87 1 1 Evaluation de la bioluminescence de la bact rie V fischeri Microtox 88 1 2 Evaluation de la croissance de l algue P subcapitata Algaltox F s0008 90 1 3 Evaluation de l inhibition de la croissance de lentilles d eau Lemna minor 91 1 4 Evaluation de la viabilit de cellules humaines test MTS 95 1 4 1 Evaluation de la viabilit des cellules h patiques HEPG2 eeecceeeeeeeeeesteeeeeeeeeees 95 1 4 1 a Toxicit respective et en m langes de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide en doses croissantes nnnnnneeeeooeeneneeeeennn nr reseenn ne neeeeee nnne 95 1 4 1 6 Etude de la toxicit des m langes CIP TAM en doses croissantes inverses 98 1 4 2 Evaluation de la viabilit des cellules mammaires MCF 7 ccccsssccessseeeeessteeeees 100 1 4 2 a Toxicit respective et en m lange de la ciprofloxacine
271. gs in drinking water a prediction and risk assessment exercise for the Thames catchment in the United kingdom Environ Toxicol Chem 2009 28 2733 43 Sane RS Buckley DJ Buckley AR Nallani SC Desai PB Role of human pregnane X receptor in tamoxifen and 4 hydroxytamoxifen mediated CYP3A4 induction in primary human hepatocytes and LS174T cells Drug Metab Dispos 2008 36 946 54 Santos LHLML Gros M Rodriguez Mozaz S Delarue Matos C Penas A Barcelo D et al Contribution of hospital effluents to the load of pharmaceuticals in urban wastewa ters identification of ecologically relevant pharmaceuticals Sci Total Environ 2013 461 462 302 16 Scripture CD Sparreboom A Figg WD Modulation of cytochrome P450 activity implica tions for cancer therapy Lancet Oncol 2005 6 780 9 Singh NP McCoy MT Tice RR Schneider EL A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells Exp Cell Res 1988 175 184 91 Sridar C Kent UM Notley LM Gillam EM Hollenberg PF Effect of tamoxifen on the enzy matic activity of human cytochrome CYP2B6 J Pharmacol Exp Ther 2002 301 945 52 Thomas KV Hilton MJ The occurrence of selected human pharmaceutical compounds in UK estuaries Mar Pollut Bull 2004 49 436 44 Tice RR Agurell E Anderson D Burlinson B Hartmann A Kobayashi H et al Single cell gel comet assay guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing Environ Mol Mutagen 2000 35 206 21 Tjan Heijnen
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274. he Comet and post labelling assays are equally well suited for the ecotoxic assessment The advantages of in vitro assay are their simple handing high reproducibility and the possibility to screen a large number of compounds in a short time In the future genotoxicity assays notably DNA adduct detection in cell lines can be a valuable tool in the risk assessment to estimate and rank the genotoxicity of compound in order to minimize toxicity test in vivo They may be involved in a tired approach to assess the ecotoxicity of pharmaceuticals Statement of Author Contributions Pfohl Leszkowicz A Albasi C Castillo L designed the study in the context of the PhD of Mater N Rodriguez Mozaz S and Barcelo D designed the field study and collected water samples Mater N and Pfohl Leszkowicz A analyzed the data and prepared draft figures and tables All authors approved the final manuscript and had complete access to the study data John Wiley amp Sons Inc Page 17 of 42 J O O1 BR D 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 Environmental and Molecular Mutagenesis Acknowledgments This paper was prepared with financial support by the French national research agency in the frame work of the call 2010 CD2I within the project PANACEE and with the collaboration o
275. hondrie tant impliqu e dans la respiration cellulaire et la production d nergie n cessaire au fonctionnement de la cellule via le cycle de Krebs et la production d ATP son activit est donc r v latrice de la viabilit cellulaire En mesurant l activit mitochondriale de cellules expos es un x nobiotique le test MTS permet de r v ler un ralentissement de l activit m tabolique des cellules qui rend compte des v nements apoptotiques et n crotiques intervenants dans la cellule 1 5 2 c Protocole Apr s d tachement du tapis cellulaire coll au fond de la boite par trypsination 2 min 37 C la suspension cellulaire est centrifug e 2000 rpm Sigma 3k10 pendant 10 min 4 C Apr s avoir limin le surnageant le culot cellulaire est repris dans 4 mL de milieu 5 SVF pour effectuer le comptage des cellules sur cellule de Mallassez Chaque puits de la plaque de 96 puits est ensemenc avec 5 10 cellules Apr s une nuit d adh sion des cellules sur le support 37 C 10 pL des concentrations de m dicament tester sont ajout s en triplicata dans les puits pendant 24 h 37 C De m me un t moin sans traitement est r alis par l ajout de 10 uL de milieu Pour les cellules MCF 7 le milieu est chang au bout de 24 h avant l ajout des traitements Les puits sont vid s en tapotant sur du papier ou de la gaze st rile et le milieu est remplac par un nouveau milieu Il s agit d aj
276. i SC Sane RS Moore LB Goodwin BJ Buckley DJ et al Induction of cytochrome P450 3A4 in primary human hepatocytes and activation of the human pregnane X receptor by tamoxifen and 4 hydroxytamoxifen Drug Metab Dispos 2002 30 608 12 Desta Z Ward BA Soukhova NV Flockhart DA Comprehensive evaluation of tamoxifen sequential biotransformation by the human cytochrome P450 system in vitro prominent roles for CYP3A and CYP2D6 J Pharmacol Exp Ther 2004 310 1062 75 EFSA Minimum criteria for the acceptance of in vivo alkaline comet assay reports Efsa J 2012 10 11 2977 89 Eguchi K Nagase H Ozawa M Endoh YS Goto K Hirata K et al Evaluation of antimicro bial agents for veterinary use in the ecotoxicity test using microalgae Chemosphere 2004 57 1733 8 Emmanuel E Perrodin Y Keck G Blanchard JM Vermande P Ecotoxicological risk assess ment of hospital wastewater a proposed framework for raw effluents discharging into urban sewer network J Hazard Mater 2005 117 1 11 Frenzilli G Nigro M Lyons B The comet assay for the evaluation of genotoxic impact in aquatic environments Mutat Res Rev Mutat Res 2009 681 80 92 Fucic A Jazbec A Mijic A Seso Simic D Tomek R Cytogenetic consequences after occupa tional exposure to antineoplastic drugs Mutat Res 1998 416 59 66 Gartiser S Brinker L Erbe T K mmerer K Willmund R Contamination of hospital waste water with hazardous compounds as define 7a Acta Hydrochim Hydrobiol 1996
277. ia drink ing water Johnson et al 2008 Rowney et al 2009 Zegura et al 2009 Cytostatic agents are mainly found in hospital wastewater and their use increases by 10 each year WWTPs can eliminate some cytostatic agents but the removal rate is not equal between molecules e g 25 for cyclophosphamide and 75 for methotrexate Catastini et al 2010 Concentrations of contaminants in potable water are usually in the range from subnanogram L to ug L which is generally below the detection limit of biological assays Besse et al 2012 Nevertheless many of them or their metabolites raise considerable toxicological con cerns particularly when present as components of complex mixtures Hernando et al 2006 Zegura et al 2009 For example some endocrine active drugs possess an extremely high biological potency down to the g day therefore it is very likely that they also cause effects at very 192 N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 low concentrations in the environment Thus the contraceptive 176 ethinylestradiol adversely affects the reproduction of zebrafish Danio rerio at concentrations as low as 1 ng L Wenzel et al 2001 Data reported by Coe et al 2008 suggest that exposure to some estro gens at low ng L concentrations detected in recipient water bodies can even deteriorate the reproductive behavior by alternating mating habits The risk posed by cytostatic molecules and by mixtures is still no
278. ibliographique l environnement Predicted Environmental Concentration PEC et d une concentration pr dite sans effet toxique Predicted Non Effect Concentration PNEC Cette caract risation des effets cotoxicologiques peut tre r alis e selon deux types d approches l approche substances et l approche bioessais figure 11 L approche substance qui examine diff rents param tres de mesure consid re l analyse physico chimique de la matrice agressive d chet effluent et se base sur les diff rents polluants plomb PCB chlore etc qu elle contient tandis alors que l approche bioessais prend en compte la matrice comme une entit globale Chacune de ces deux approches ou strat gies de caract risation des effets peut se subdiviser en deux sous strat gies L approche substances comprenant l approche substance seule qui consid re les effets de chacun des agresseurs de mani re ind pendante et l approche substances avec effets combin s qui se base sur l ensemble des toxiques identifi s et consid re leurs effets combin s Les approches bioessais comprenant les bioessais mono sp cifiques qui visent un groupe d fini d individus et les bioessais plurisp cifiques qui se d finissent sur des niveaux d organisation biologique plus lev s de type communaut Les bioessais s appuient sur de nombreuses esp ces tant animales que v g tales ainsi que sur de nombr
279. ic class 2B During the treatments the drugs are eliminated in large proportion as parent compounds or metabolites in urine or feces As sorting of the excretions of cancer patients is regarded as intractable and dangerous WHO 1999 antineoplastic drugs are continuously released into hospital wastewater and sewage network without pretreatment They represent an indisputable release source of many bioactive substances used for medical and research purposes such as pharmaceuticals radioisotopes or solvents Emmanuel et al 2005 Lenz et al 2007 Verlicchi et al 2012 Although many of these compounds are removed in wastewater treatment plants WWTP some molecules are directly released into the environment K mmerer et al 1997 Halling Sorensen et al 1998 Besse et al 2012 where they represent a potential toxic hazard for ecosystems and Human health via drinking water Johnson et al 2008 Concentrations of contaminants in drinking water are usually in the range from subnanogram L to ug L which is generally below the detection limit of classical biological assays Besse et al 2012 Nevertheless many of them or their metabolites raise considerable toxicological concerns particularly when present as components of complex mixtures Hernando et al 2006 Zegura et al 2009 Mater et al 2014 The risk posed by cytostatic molecules and by mixtures is still not well documented and it is not possible to conclude on their long term effects on
280. ic le traitement ou la pr vention de maladies mais galement pour des usages v t rinaires comme promoteurs de croissance pour emp cher les maladies ou comme parasiticides La pr sence de ces compos s pharmaceutiques dans les milieux aquatiques peut compromettre la qualit de l eau comme l indique de nombreuses tudes Pomati et al 2006 Jonhson et al 2008 Aga et al 2008 Santos et al 2010 Malheureusement les niveaux de contamination de ces substances pharmaceutiques sont en augmentation du fait du vieillissement des populations de la densit grandissante des villes Le Corre et al 2012 et de la p nurie d eau li e aux changements climatiques dans certaines zones g ographiques du monde Osorio et al 2012 Petrovic et al 2012 A ce constat vient s ajouter un nombre de cancers d pist s en Europe toujours plus important avec une augmentation des traitements administr s Les bases de ces traitements qui sont la chimioth rapie et la radioth rapie seules ou en association sont effectu es l aide de m dicaments anticanc reux qui ont des propri t s toxiques pour les cellules Un grand nombre de ces subtances sont class es par le Centre International de Recherche sur le Cancer CIRC selon trois cat gories canc rog ne pour l Homme classe 1 canc rog ne probable classe 2A canc rog ne possible classe 2B Apr s administration aux patients certains de ces m dicaments sont excr t s en qu
281. ielle dans le processus de carcinog nicit Le mode d action implique en premier lieu l interaction d une mol cule lectrophile avec un site nucl ophile de l ADN qui produit un adduit Les bases azot es de l ADN repr sentent ce titre des cibles privil gi es En absence de r paration ou lors d une r paration erron e ces adduits peuvent provoquer une mutation et une alt ration de la fonction du g ne ce qui peut entrainer une cascade de r ponses d l t res tous les niveaux de l organisation cellulaire Pfohl Leszkowicz 1994 2008 L analyse de la formation d adduits par des mol cules lectrophiles ou leurs m tabolites est donc importante mais les alt rations sont g n ralement faibles et impliquent que les m thodes de d tection soient sensibles Depuis plus de vingt ans de nombreuses m thodes ont t d velopp es pour l analyse des adduits Les m thodes les plus utilis es incluent des techniques de d tection lectrochimique de spectrom trie de masse de spectroscopie par fluorescence ou phosphorescence d immunologie et d immuno histochimie ainsi que de post marquage au P La sensibilit de chacune de ces techniques d pend du taux d ADN qui peut tre analys et varie g n ralement de 1 adduit 107 nucl otides 1 adduit 10 nucl otides Suivant les m thodes d enrichissement de ces adduits cette sensibilit peut m me atteindre un niveau de d tection de 1 adduit 10 nucl otides pour la techni
282. ier 2 d effluents en entr e deSTEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 141 Exemple de profils d adduit d ADN 4 ug de cellules h patique HepG2 expos es A eau ultra pure B effluents hospitaliers C effluents d entr e de STEP D eaux en sortie d amp s TEP RAR nn dre GeO nn O tit Ge 142 Nombre d adduits l ADN form s par 10 nucl otides dans des cellules h patiques HepG2 expos es 24 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 143 Exemple de profils d adduits l ADN de cellules mammaires MCF 7 expos es a A eau ultra pure B effluents hospitaliers C effluents d entr e de STEP D eaux en sortie de STEP im ia MAT Re ne woe tar ste tonite een ities 144 Nombred adduits l ADN par 10 nucl otides dans les cellules de glandes mammaires MCF 7 expos es 24 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs 144 XXV XXVi xxvii Liste des tableaux XXiX Liste des tableaux Tableau 1 Evolution de la r partition des achats de m dicaments par les pharmacies dans le monde entre d cembre 2005 et 2OOG iscicsists ssc Mn Rendre as de it dase ca ad sn est teste en re tae Gast da 9 Tableau 2 Compos s phar
283. ificance was accepted at p lt 0 05 and p lt 0 01 A second post hoc test analysis for multiple comparisons was performed using Dunnett s procedure Values were considered significant at p lt 0 05 Results DNA adducts formation in human cells exposed to three pure pharmaceuticals DNA adduct formation in hepatic cells HepG2 Exposure of human hepatic cells HepG2 to CIP and CP whatever the concentration did not induce any DNA adducts In contrast TAM induced DNA adducts An example of DNA adducts patterns obtained after exposure of HePG2 cells is given figure 2 Depending of the exposure conditions one to three individual adducts numbered 1 3 are formed when TAM was present alone or in the mixture Exposure to TAM alone Fig 2 B induced formation of two individual adducts 1 2 Whatever the concentration of exposure TAM induced a significant p lt 0 01 DNA adducts formation A dose dependent response was observed figure 3 The exposure to concentration of TAM 10 ug L lead to three folds more DNA adducts p lt 0 01 compared to exposure to the lowest dose 10 ng L Only one individual adduct was formed when HePG2 cells were exposed to CIP in addition to TAM Figure 2 C The nature of this adduct was different of the two previous one and for this reason has been numbered 3 In this condition a non monotone dose response for the DNA adducts formation was observed With the exposure to the lowest doses of CIP TAM a
284. ignificatives p lt 0 05 Les valeurs obtenues avec la condition contr le agoniste antagoniste sp cifique est d crite par la courbe verte Par contre l exposition au tamoxif ne une dose de 10 mg L dilution 102 entraine un effet agoniste significatif qui se traduit par un taux d induction 4 fois sup rieur p lt 0 05 l activit basale des r cepteurs L exposition cette m me dose de tamoxif ne entraine galement un effet antagoniste 106 Induction Ratio R sultats amp Discussion Partie 1 r v l par une activit des r cepteurs r duite de moiti p lt 0 05 Pour des expositions a des doses plus faibles de tamoxif ne il ny a ni effet agoniste ni antagoniste Par comparaison avec le t moin positif 4 hydroxytamoxif ne qui induit des effets antagonistes a des doses de l ordre du ug L 10 a 10 g L figure 40 B la diff rence de sensibilit observ e ici pourrait s expliquer par une absence ou une lenteur de m tabolisation de la mol cule m re de tamoxif ne par les levures La mol cule n tant pas sous forme active son affinit avec le r cepteur en est affect e Lorsque les levures sont expos es aux m langes binaires CIP TAM ou ternaires CTC de mol cules figure 41 il ny a pas d effet agoniste significatif m me si une l g re stimulation est observ e lors de l exposition au m lange des trois mol cules une dilution de 102 10 mg L de chaque mol cule en m
285. il analysis 2 5 3 Slide analysis Few minutes before analysis 50 uL of ethidium bromide 40 pg mL was dropped onto the agarose and covered with a coverslip Fifty cells per slide were randomly scored at 250 x magnification with an Olympus BX50 fluorescence microscope equipped with an excitation filter of 515 560 nm and a barrier filter of 590 nm DNA damage was quantified by tail DNA and median values were calculated by a Komet 5 5 image analysis system ANDOR Technology Belfast UK Positive control was run using ethyl methanesulfonate EMS 2 6 Algaltoxkit F assay Selenastrum capricornutum The growth inhibition of green algae S capricornutum bioassays from MicroBioTests Inc Gent Belgium was performed following the standard operational procedures of algaltoxkit F 1996 This test was conducted in accordance with OECD Guideline 201 2002 Tests were carried out with S capricornutum obtained from the Culture Collection of Algae and Protozoa CCAP Argyll Scotland All microalgae growth inhibition tests were conducted at 25 C with continuous illumination of 10 000 Ix The algaltoxkit technology is based on the rapid measurement of the optical density OD of 25 mL algal cell suspensions in disposable spectrophotometric cells of 10 cm path length called long cells Negative controls were incorporated for each test containing only algal growth media and algal inoculum The initial algal density was 1 x 10 cell
286. illon du mois de Janvier J1 en induit environ le double 400 adduits 10 nucl otides 143 R sultats amp Discussion Partie 2 A B G D Figure 68 Exemple de profils d adduits l ADN de cellules mammaires MCF 7 expos es A eau ultra pure B effluents hospitaliers C effluents d entr e de STEP D eaux en sortie de STEP Les chantillons d effluents en entr e de STEP N2 D2 J2 induisent significativement p lt 0 01 moins d adduits l ADN que ceux des effluents hospitaliers Comme pr c demment la r ponse induite par chaque chantillon est significativement diff rente des deux autres Concernant les eaux en sortie de STEP N3 D3 J3 on constate un abattement important de la g notoxicit ind pendamment de la p riode de pr l vement Les taux totaux d adduits sont nettement inf rieurs a 100 adduits 10 nucl otides L chantillon du mois de D cembre D3 en sortie de STEP est celui qui induit le moins d adduits 500 x 8 400 D g S 30 A a a a 2 20 FT Le on 5 a 3 100 ak TD sok i EE D l B pl control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 November December January Samples Figure 69 Nombred adduits l ADN par 10 nucl otides dans les cellules de glandes mammaires MCF 7 expos es 24 h diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en
287. ing environments Costantini et al 2010 Deviations from linearity are favored by the oc currence of multiple concurrent and sequential events in toxicological responses Mechanisms contributing to hormetic responses at low doses included overcompensation to a disruption in homeostasis A 25 20 TAIL DNA 1 i a CONCENTRATION pg L Fig 5 Comparison of DNA breaks induced on HepG2 exposed to CIP white TAM gray adaptive responses based on inducible repair processes interactions among cell proliferation cell cycle delay apoptosis and DNA damage enhancement of gap junction intercellular communication at low doses but inhibition at high doses etc for a review see Hoffmann 2009 Hormesis is a biphasic dose response that often results from the actions of partial agonists and partial antagonists TAM is an endocrine disruptor due to its agonist and antagonist effect on estrogen receptor Coezy et al 1982 Vandenberg et al 2012 The low dose stimulating hormetic responses could lead to undesirable effects e g proliferation of harmful bacteria Randall et al 1947 or enhancement of proliferation of tumor cells by antitumor drugs Calabrese 2005 2013 In the case of chemo therapeutic agents the low dose stimulation appears to reflect an adap tive response to tumor tissue To address the interaction of binary CIP TAM or ternary mixtures CIP TAM CP the effects were compared to the expected ef
288. internal standards Chemosphere 57 1479 1488 Lindberg RH Wennberg P Johansson MI Tysklind M Andersson BAV 2005 Screening of human antibiotic substances and determination of weekly mass flows in five sewage treatment plants in Sweden Environ Sci Technol 39 3421 3429 Liwei S Jinmiao Z Philip AS Zijian W 2007 Tamoxifen effects on the early life stages and reproduction of Japanese medaka Oryzias latipes Environ Toxicol Pharmacol 24 23 29 Lovell DP 2009 Statistical Analysis of Comet Assay date The comet assay in toxicology Toxicology 5 422 450 Lu SC Huang HY 1994 Comparison of sulfur amino acid utilization for GSH synthesis between HepG2 cells and cultured rat hepatocytes Biochem Pharmacol 47 859 869 Ma J Lu N Qin W Xu R Wang Y Chen X 2006 Differential responses of eight cyanobacterial and green algal species to carbamate insecticides Ecotoxicol Environ Safety 63 268 274 Martins AF Vasconcelos TG Henriques DM Frank CS K nig A K mmerer K 2008 Concentration of Ciprofloxacin in Brazilian Hospital Effluent and Preliminary Risk Assessment A Case Study CLEAN Soil Air Water 36 264 269 Mater N 2014 Evaluation de l impact co toxicologique de r sidus m dicamenteux pr sents dans les effluents hospitaliers urbains et dans l environnement l aide d une batterie de bioessais et de biomarqueurs PhD thesis form Toulouse University INPT 20th June 2014 in french Mate
289. io V Perez S Ginebreda A Barcelo D 2012 Pharmaceuticalson a sewage impacted section of a Mediterranean River LlobregatRiver NE Spain and their relationship with hydrological conditions Environmental Science Pollution Research 19 4 1013 1025 Ostling O Johanson K J 1984 Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells Biochemical and Biophysical Research Communications 123 1 291 298 Otieno M A Baggs R B Hayes J D Anders M W 1997 Immunolocalization of microsomal glutathione S transferase in rat tissues Drug Metabolism And Disposition The Biological Fate Of Chemicals 25 12 20 177 Bibliographie Palaniyappan V Nagalingam A K Ranganathan H P Kandhikuppam K B Kothandam H P Vasu S 2013 Antibiotics in South Indian coastal sea and farmed prawns Penaeus monodon Food Additive and Contaminant 6 3 196 199 Pandey S Nagpure N S Kumar R Sharma S Srivastava S K Verma M S 2006 Genotoxicity evaluation of acute doses of endosulfan to freshwater teleost Channa punctatus Bloch by alkaline single cell gel electrophoresis Ecotoxicology and Environmental Safety 65 56 61 Parry J M Tweats D J Al Mossawi M A J 1976 Monitoring the marine environment for mutagens Nature 264 5586 538 540 Peck M Gibson R W Kortenkamp A Hill E M 2004 Sediments are major sinks of steroidal estrogens in two United Kingdom rive
290. istiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 05 entre les expositions au TAM et au CP Le tamoxif ne entraine une stimulation dose d pendante de la croissance algale significative p lt 0 05 par rapport au t moin Les algues expos es respectivement a 1 ug L et 10 ug L TAM pr sentent un taux de croissance sup rieur de 10 p lt 0 05 et 20 p lt 0 01 par rapport au t moin L exposition des algues au cyclophosphamide se caract rise par une dose r ponse non monotone refl tant une adaptation de la r ponse de toxicit des algues selon la dose horm se courbe en S Le traitement des algues avec la faible concentration de 10 ng L CP entraine une inhibition 90 R sultats amp Discussion Partie 1 significative de la croissance de l ordre de 6 p lt 0 05 alors qu l inverse une dose de 10 ug L induit une prolif ration des algues d environ 10 p lt 0 01 par rapport au t moin Les concentrations interm diaires de cyclophosphamide comprises entre 100 ng L et 1 ug L ne semblent pas induire de r ponse de toxicit bien que les valeurs soient significativement diff rentes de celle obtenue pour un traitement de 10 ug L Aucun effet toxique n a t mesur avec la cirpofloxacine quelle que soit la dose 80 a CIP TAM CTG eg 7 60 S 50 E 40 He 30 E 6 ai F 10 j 7 0 mis Wa gt pr MMMM js
291. it la concentration ce compos entraine la formation significative d adduits p lt 0 01 A Figure 48 Exemple de profils d adduits a d ADN de cellules h patiques HepG2 expos s a diff rentes conditions pendant 24h A contr le B cellules expos es au TAM C cellules expos es aux m langes CIP TAM D cellules expos es aux m langes CTC De mani re quantitative on observe une g notoxicit dose d pendante suite l exposition des cellules au tamoxif ne seul figure 49 L exposition 10 ug L de tamoxif ne induit trois fois plus d adduits p lt 0 01 compar la plus faible dose de la gamme de concentration 10 ng L 20 oCIP a TAM mCP 15 kk 10 k k k k Control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 CONCENTRATION ug L Adducts 10 nucleotides Figure 49 Nombres d adduits l ADN par 10 nucl otides form s dans les cellules h patiques HepG2 expos es 24 h diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP tamoxif ne TAM et cyclophosphamide CP Les r sultats sont exprim s en moyennes et les valeurs consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 112 R sultats amp Discussion Partie 1 Dans le cas d exposition des cellules au m lange CIP TAM seulement un adduit individuel est observ figure 48 C Comme la nature de l adduit est diff rente des deux pr c dents il a t num rot 3 La courb
292. ith a low dose corresponding to real water contamination The con centrations chosen were based on the range reported in the literature although the concentrations of PPCPs vary at each site with pharmaceu tical usage patterns the size of the surrounding population the specific wastewater treatment available and the discharge location Thus the concentrations are not meant to be an exact match to what is found at one municipal wastewater treatment plant or field site but to represent concentrations that are environmentally reasonable The high concen tration tested was near the highest reported concentrations found in hospital wastewater up to 150 ug L Martins et al 2008 Negreira et al 2013a 2013b Santos et al 2013 Table 3 summarized and compared the four bioassays In the range of doses tested ng L 10 ug L the dose response of cell viability observed after exposure of HepG2 cells to TAM CIP and CP mainly after 72 h of exposure exhibited a U shape This type of curve was also observed when microalgae were exposed to CP These kinds of non linear dose response relationships are referred to hormetic re sponses and have been described across a wide range of organisms from bacteria to vertebrates in response to exposure to at least 1000 different chemicals and environmental stressors Hormesis is connected with both acclimation and phenotypic plasticity and may play an impor tant role in allowing animals to adjust to chang
293. ity data not shown nor genotoxicity data not shown Hepatic cells HepG2 and mammary cells MCF 7 were exposed 24 h to increasing concentrations of respective drugs CIP TAM CP or to binary mixture of CIP TAM or to mixture of the 3 drugs CTC in the range of concentrations found in water as described in table 1 Conditions 1 and 2 represent low concentrations close to environmental concentrations surface water condition 3 close to waste water treatment plant WWTP conditions 4 and 5 represent hospital wastewater concentrations In condition 0 cells received only medium This latter condition corresponds to control In parallel cells were treated 24 h with 1 10 hospital effluent WWTP influent and WWTP effluent The control condition received only ultrapure water in same proportion Table 1 Nominal drug concentrations used for cell treatments Drugs Unit individually CIP ug L 0 0 01 0 1 1 10 100 TAM ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 CP ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 Drugs Unit Code Conditions in mixture 0 4 2 3 4 5 CIP ug L 0 0 01 0 1 1 10 100 TAM ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 CIP ug L 0 0 01 0 1 1 10 100 TAM ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 CP ug L 0 0 01 0 1 0 5 1 10 DNA adducts analysis DNA isolation The DNA was isolated as described by Pfohl amp Castegnaro 2005 Briefly cells were homogenized in 0 7 mL of a solution containing NaCl 0 1 M EDTA 20 mM and Tris HCI pH 8 50 mM SET To the homogenate 1
294. ka F Mrizek N Saad A Elghezal H 2011 Assessment of chromosomal aberrations micronuclei and proliferation rate index in peripheral lymphocytes from Tunisian nurses handling cytotoxic drugs Environ Toxicol Pharmacol 31 250 257 Brandt S Heller H Schuster KD Grot J 2004 Tamoxifen induces suppression of cell viability and apoptosis in the human hepatoblastoma cell line HepG2 via down regulation of telomerase activity Liver international 24 46 54 Brandt S Heller H Schuster KD Grot J 2005 The tamoxifen induced suppression of telomerase activity in the human hepatoblastoma cell line HepG2 a result of post translational regulation J Cancer Res Clin Oncol 131 120 128 Breithofer A Graumann K Scicchitano MS Karathanasis SK Butt TR Jungbauer A 1998 Regulation of human estrogen receptor by phytoestrogens in yeast and human cells J Steroid Biochem Mol Biol 67 421 429 Buerge lJ Buser H R Poiger T M ller MD 2006 Occurrence and fate of the cytostatic drugs cyclophosphamide and ifosfamide in wastewater and surface waters Environ Sci Technol 40 7242 7250 Burgaz S Karahalil B Bayrak P Taskin L Yavuzaslan F Bokesoy Anzion RB Bos RP Platin N 1999 Urinary cyclophosphamide excretion and micronuclei frequencies in peripheral lymphocytes and in exfoliated buccal epithelial cells of nurses handling antineoplastics Mutat Res 439 97 104 Burgaz S Karahalil B Canhi Z Terzioglu F Angel G Anzion RBM Bos RP
295. la prolif ration cellulaire sans provoquer la mort cellulaire Elle joue sur des facteurs de transcription comme NFkB et AP1 activant l apoptose Keher et Biswal 2000 La N d chloro thylation conduit la perte de l activit anticanc reuse du cyclophosphamide et la formation de compos s toxiques tels que le chloroacetald hyde Cette r action est catalys e par le cytochrome CYP3A4 Tous ces m tabolites sont excr t s dans les urines Dans notre tude l importance de ce ph nom ne de m tabolisation est clairement observ e lors des analyses des m langes notamment lors de la formation des adduits l ADN De m me dans certains tests aucune r ponse n tait observ e alors qu en m lange tous les tests r pondent Les interactions m dicamenteuses sont souvent li es une interaction des voies de m tabolisation Micheaud amp Turgeon 2010 Zanger amp Schwab 2013 mais aussi sur les transporteurs Zamek Gliszczynski et al 2006 La ciprofloxacine module l activit des CYP Janknegt 1990 Chez l homme elle inhibe le CYP1A2 Fuhr et al 1993 et les CYP3A Xie et al 2003 ainsi que la B glucuronidase Kodawara et al 2014 De m me le tamoxif ne et ses m tabolites actifs N d m thyltamoxif ne et 4 hydroxytamoxif ne inhibent les cytochromes CYP2B6 CYP2C9 et CYP2D6 Sridar et al 2002 alors qu ils augmentent l activit du cytochrome CYP3A Desai et al 2002 Sane et al 2008 L inductio
296. la s quence d administration de la susceptibilit individuelle etc De mani re g n rale on note 5 types d interactions possibles tableau 4 Effet d antagonisme survient lorsque les effets combin s d au moins deux compos s est moins toxique que les effets individuels de chaque substances ou lorsque l effet du m lange aboutit une inversion de la r ponse de toxicit Effet d additivit survient lorsque l effet combin d au moins deux produits chimiques est gal la somme des effets de chaque produit individuel aucune interaction directe entre mol cules Effet de potentialisation survient lorsqu une substance qui na pas d effet toxique est combin e un produit chimique et a pour effet de rendre ce dernier beaucoup plus toxique Effet de synergie ph nom ne par lequel plusieurs facteurs agissant ensemble cr ent un effet plus grand que la somme des effets attendus s ils avaient op r ind pendamment Effet d action coalitive survient lorsque chacune des substances prises individuellement ne produit pas d effets toxiques mais que leur combinaison est toxique Interaction Mod le Effet toxique Antagonisme 2 3 lt 5 Diminution Effet inverse Addition 2 3 5 Aucune interaction Synergie 2 3 gt 5 Augmentation Potentialisation 0 3 gt 3 Amplification Action coalitive 0 0 4 R v lation d un effet Tableau 4 Types d interactions possibles dans les m langes
297. lap 1999 De plus des facteurs externes peuvent galement modifier l intensit de la luminescence Par exemple l accroissement de l osmolarit ou de la teneur en ald hyde substrat de la lucif rase augmente la luminescence de la bact rie Stabb et al 2004 Il est donc important de contr ler et maitriser les conditions de l exp rimentation Figure 13 Dispositif exp rimental de l essai Microtox 1 1 2 Protocole Les cellules de V fischeri NRRL B 11177 utilis es pour le test Microtox sont fournies sous forme lyophilis e par R Biopharm et conserv es 20 C Leur r hydratation est r alis e dans une solution nomm e solution de reconstitution commercialis e par Strategic Diagnostics Inc Les cellules ainsi r hydrat es peuvent alors tre stock es 4 C durant un maximum de 4 heures ou tre dilu es et exploit es imm diatement La dilution des bact ries s effectue l aide d une solution appel e SDBR contenant 20 g L de NaCl 2 035 g L deMgCle 6 H20 et 0 3 g L de KCI Afin d ajuster la pression 61 Mat riels amp M thodes osmotique du milieu une solution OAS 22 de NaCl est pr par e au laboratoire pour tre ajout e aux chantillons avant leur mise en contact avec les bact ries Enfin les t moins positifs de CrVI 50 mg L et de Zn a 4 mg L sont obtenus l aide de poudre de K2CrO4 et de ZnSO4 7 H20 distribu es par VWR Calcul du facteur d inhibition de la lumines
298. lass 2B Cytostatic drugs act on cell growth inhibition or directly kill cells but in an unselective way on both tumoral and healthy cells Therefore many antineoplastic agents have cytotoxic mutagenic carcinogenic embryotoxic and or teratogenic effects During the treatments these drugs are eliminated in large proportion under parent compounds or metabolite forms via the urine and feces of patients Hospital effluents which are generally released directly to the sewage Corresponding author at Universit de Toulouse Institut National Polytechnique Laboratoire de G nie Chimique UMR CNRS INPT UPS 5503 France Tel fax 33 534 323 947 E mail address leszkowicz ensat fr A Pfohl Leszkowicz 1 Present address Anabiotox 16 rue Montcalm 31520 Ramonville Saint Agne France 0160 4120 see front matter 2013 Elsevier Ltd All rights reserved http dx doi org 10 1016 j envint 2013 11 011 of many bioactive substances used for medical and research purposes such as pharmaceuticals radioisotopes or solvents Emmanuel et al 2005 Verlicchi et al 2012 Although many of these compounds are removed by adsorption Carabineiro et al 2011 or biodegradation in wastewater treatment plants WWTP some molecules are directly re leased into the environment Besse et al 2012 Gartiser et al 1996 Halling Sorensen et al 1998 Kuemmerer et al 1997 where they repre sent a potential toxic hazard for ecosystems and human health v
299. le choix des esp ces consid r es ne peut r sulter que d un compromis entre repr sentativit et faisabilit Par ailleurs de multiples facteurs influent sur la sensibilit des organismes vivants tels que la composition du milieu d essai le rapport biomasse volume les conditions de temp rature et d clairement et les conditions d exposition des organismes condition de r alisation de l essai mode de pr paration de l chantillon En outre deux param tres majeurs sont a prendre en consid ration la nature des effets toxiques tudi s et la dur e de l essai De mani re g n rale l expression des perturbations dans le milieu quel que soit le niveau d organisation biologique concern organisme population communaut est la cons quence d interactions complexes qui ne peuvent pas aujourd hui tre simul es au laboratoire La capacit a tablir des diagnostics sur l intensit voire la cause source type de contamination des perturbations biologiques induites par des stress chimiques in situ a t et reste une probl matique de recherche r currente en cotoxicologie D autre part se pose la question de la pertinence de ces outils biologiques pour corr ler les impacts de pollutions environnementales r currentes sur la sant humaine Dans ce sens il est essentiel de prendre en compte une approche d tude pluridisciplinaire permettant de mieux appr hender les m canismes d action qui peuvent avoir lieu et qui par
300. lectrophor se contenant un tampon de d naturation NaOH 300 mM NazEDTA 1 mM pH gt 13 et en les orientant dans le sens de passage du courant Les cellules sont laiss es a d naturer 20 min 4 C puis soumises a une lectrophor se de 20 min 26 V 350 mA 4 C dans le m me tampon Apr s migration les lames sont r cup r es d licatement goutt es et neutralis es par trois lavages 71 Mat riels amp M thodes successifs 5 min d intervalles avec 500 uL de tampon Tris 0 4 M Les lames sont alors plong es dans du m thanol pur puis laiss es s cher une nuit temp rature ambiante Lors de la quantification des cassures l ADN des lames 50 75 uL de bromure d thidium 40 pg mL sont d pos s sur la lame et recouverts d une lamelle Une cinquantaine de noyaux sont analys s un grossissement x250 l aide d un microscope pifluorescence Olympus BX50 quip d un filtre d excitation de 515 560 nm et d une cam ra pour prendre photographies des lames Les images obtenues sont finalement analys es avec le logiciel Komet 5 5 Andor Technology 100 x Tail DNA Intensity Cell DNA Intensity Tail DNA Tail Moment peut tre mesur de 2 fa ons a Olive Tail Moment Tail DNA x Tail Moment Length Tail Moment Length b Extent Tail Moment Tail DNA x Length of Tail Figure 20 Param tres de quantification des dommages l ADN Les r sultats du test com te peu
301. les valeurs sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 Les cellules HepG2 ont ensuite t trait es avec diff rents m langes de mol cules Quel que soit le temps d exposition des cellules h patiques la courbe dose r ponse est non monotone figure 32 Les doses les plus faibles conditions 1 et les plus fortes conditions 5 de CIP TAM entrainent une inhibition de la croissance plus importante Ce ph nom ne s amplifie avec le temps d exposition La m me tendance est observ e a 72 h lorsque que les cellules sont expos es simultan ment aux trois mol cules Cependant l addition de cyclophosphamide au m lange CIP TAM conduit a un effet antagoniste et att nue consid rablement la toxicit Seules les doses des conditions 4 et 5 inhibent l g rement la croissance a 24 h p lt 0 05 p lt 0 01 ainsi que celles des conditions 1 et 5 a 72 h p lt 0 01 Bien que les valeurs mesur es soient significatives le taux d inhibition ne d passe pas les 5 Afin de comparer les diff rentes interactions des m langes binaires CIP TAM et ternaires CIP TAM CP les effets observ s ont t compar s avec les effets attendus de la m me mani re que pour le test de croissance sur Lemna minor cf 1 3 Les valeurs attendues de toxicit ont t 96 R sultats amp Discussion Partie 1 calcul es a partir de la toxicit respective des mol cules tableau 10 Les 2
302. logy 46 1 293 302 Zhou R Treeck O Horn F Ortmann O 2005 Effects of prolonged tamoxif ne treatment on receptor expression and apoptosis of ovarian cancer cells Gynecology Oncology 96 678 683 Zorita S Martensson L Mathiasson L 2009 Occurrence and removal of pharmaceuticals in a municipal sewage treatment system in the south of Sweden Science of the Total Environment 407 2760 2770 Zounkova R Kovalova L Blaha L Dott W 2010 Ecotoxicity and genotoxicity assessment of cytotoxic antineoplastic drugs and their metabolites Chemosphere 81 253 60 Zounkova R Odra vska P Dole vzalova L Hilscherova K Mar vsalek B Blaha L 2007 Ecotoxicity and genotoxicity assessment of cytostatic pharmaceuticals Environmental Toxicology and Chemistry 26 2208 2214 Zounkova R Hilscherova K Blaha L Houloubek l 2006 Evaluation of ecotoxicity and genotoxicity of special hospital wastewaters Poster In SETAC Europe 7 11 05 06 Zuccato E Castiglioni S Fanelli R 2005 ldentification of the pharmaceuticals for human use contaminating the Italian aquatic environment Journal of Hazardous Materials 122 205 209 Zuccato E Calamari D Natangelo M Fanelli R 2000 Presence of therapeutic drugs in the environment Lancet 355 1789 1790 185 Bibliographie 186 Annexes Annexes 188 Annexes m Pr paration du milieu de culture et d essai pour Lemna mino
303. lophosphamide 1 cccccceeeteeetettees 90 Inhibition de la croissance des algues P subcapitata expos es 72 h a diff rentes concentrations de m langes de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne CYCIODNOSPNMAITIO SS nis baeas aana bag ede bd aua as ne Panne ot a tune Ana ANNE 91 Inhibition de la croissance de la lentille d eau Lemna minor expos e 7 jours diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP blanc tamoxif ne et cyclophosphamide 92 Liste des figures Figure 29 Figure 30 Figure 31 Figure 32 Figure 33 Figure 34 Figure 35 Figure 36 Figure 37 Figure 38 Figure 39 Figure 40 Figure 41 Figure 42 Figure 43 Inhibition de la croissance de cultures de Lemna minor expos es 7 jours diff rentes concentrations de m langes de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne CyClopDhosphamide 5 288 nement magie eine chit delete cones tence 93 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour des cultures de Lemna minor expos es 7 jours diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide 93 Taux de survie des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 het 72ha diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide 95 Taux de survie des cellules
304. lors d une exposition 100 ug L 70 CIP m TAM mCP 60 l 50 40 30 20 Growth inhibition control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Figure 28 Inhibition de la croissance de la lentille d eau Lemna minor expos e 7 jours diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP blanc tamoxif ne TAM gris et cyclophosphamide CP noir Les r sultats sont exprim s en moyennes et les valeurs sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 05 entre les expositions CIP et TAM Le cyclophosphamide inhibe galement de mani re dose d pendante la croissance des algues Toutefois dose quivalente l inhibition est beaucoup moins importante que pour la ciprofloxacine 20 versus 30 respectivement L inhibition s chelonne de 10 p lt 0 05 20 p lt 0 01 d inhibition pour des doses comprises entre 100 ng L et10 ug L de cyclophosphamide Le traitement 10 ng L de CP n entraine pas de r ponse significative de la toxicit L inhibition de croissance des lentilles d eau expos es diff rents m langes binaires et ternaires de mol cules est pr sent e dans la figure 29 L exposition des lentilles aux deux types de m langes de m dicaments binaires et ternaires entraine une inhibition significative variant de 10 60 suivant les concentrations et l
305. lors qu il n y a aucun effet de cette m me dose de TAM lorsque l exposition est combin e une concentration 10 000 fois sup rieure de CIP 100 ug l 103 R sultats amp Discussion Partie 1 104 R sultats amp Discussion Partie 1 Chapitre 2 Etude du potentiel perturbateur endocrinien et de la g notoxicit de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide Dans le chapitre pr c dent nous avons montr que la viabilit cellulaire tait affect e par des doses non th rapeutiques de m dicaments utilis s dans le traitement des cancers Suivant les m dicaments ou leur pr sence simultan e nous avons observ soit un ph nom ne de prolif ration soit une stimulation de la mort cellulaire Ces deux v nements peuvent tre la cons quence d une alt ration du mat riel g n tique En effet la mort cellulaire peut survenir soit par des ph nom nes de n crose soit des ph nom nes d apoptose Ce deuxi me mode de mort cellulaire appel e mort programm e fait intervenir des enzymes sp cifiques qui sont inductibles L apoptose est souvent le stade ultime d une mauvaise r paration de dommages l ADN Lors d agression d une cellule par un agent g notoxique le g ne suppresseur de tumeur p53 stoppe la r plication pour donner un temps la cellule pour r parer ces dommages Si la r paration n est pas correcte la cellule part en apoptose La prolif ration est une caract ristique des c
306. lowed by 0 45 um nylon membrane filters from Whatman Teknokroma Barcelona Spain The samples were kept frozen at 20 C in amber polyethylene terephthalate PET containers for a period inferior of 1 month based on the stability studies performed until their analysis Ferrando Climent et al 2013 Cell lines and culture The HepG2 cell line ATCC number HB 8065 or MCF 7 cell line ATCC number HTB 22 was cultured in 75 cm polystyrene flasks with Minimum Essential Medium and Dulbecco s Modification of Eagle s Medium respectively All media were supplemented with 10 Fetal Bovine Serum 10 L glutamine 200 mM 1 penicillin 100 U mL 1 streptomycin 100 mg mL 1 mM sodium pyruvate Cells are maintained under an atmosphere of 5 CO at 37 C and viable cell count was assessed by Trypan Blue exclusion before toxic evaluation Cell treatments Ciprofloxacin CIP tamoxifen citrate TAM and cyclophosphamide CP are dissolved in HCI methanol and water respectively for stock solution and stored at 20 C Prior the treatments the compounds are diluted in the culture medium in order to give a final solvent concentration below 0 01 None of these solvents at this John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 Environmental and Molecular Mutagenesis dose neither affected cell viabil
307. lt 0 01 L exposition l effluents d entr e de STEP pr lev au mois de Novembre N2 figure 63 A induit une activation des r cepteur hAR douze fois plus importante p lt 0 01 que la condition normale de r f rence et celui du mois de janvier J2 induit une suractivit des r cepteurs d un taux 10 fois plus important p lt 0 01 figure 63 C Aucun effet agoniste n a t mesur pour l ensemble des 139 Tail DNA 20 a 5 R sultats amp Discussion Partie 2 pa rt 1 L li d control N1 N2 N3 chantillons issus des effluents en sortie de STEP ni pour les chantillons pr lev s au mois de d cembre figure 63 B Pour ce qui est de l valuation du potentiel antagoniste des r cepteurs aux androg nes on constate la aussi qu un tiers induit des effets de toxicit Aucun des pr l vements effectu s au mois de janvier na un effet antagoniste figure 62 C Par contre les effluents en entr e de STEP pr lev s en novembre N2 et en d cembre D2 entrainent un effet antagoniste important en inhibant approximativement de 20 fois p lt 0 01 l activit Concernant les effluents hospitaliers seul le mois de D cembre induit des effets toxiques p lt 0 01 se traduisant par un effet antagoniste tr s marqu sur les r cepteurs hAR De plus on peut noter que la courbe est superposable celle des effluents en entr e de STEP figure 63 B V Analyse des cassures l
308. lt 0 05 d adduits que les m langes CIP TAM tableau 13 Il 3 2 Analyse de la formation d adduit l ADN sur cellules mammaires MCF 7 L exposition des cellules mammaires MCF 7 a la ciprofloxacine et au cyclophosphamide n induit pas d adduits l ADN et ce quelle que soit la concentration A contrario le tamoxif ne induit la formation d un adduit unique 4 qui est diff rent de ceux observ s dans les cellules h patiques Un exemple de profils types obtenus apr s l exposition des cellules sont donn s figure 51 A B C D gt i e e Figure 51 Exemple de Profils d adduits l ADN de cellules mammaires MCF 7 expos es diff rentes conditions pendant 24h A contr le B cellules expos es au TAM C cellules expos es aux m langes CIP TAM D cellules expos es aux m langes CTC Une relation dose r ponse non monotone courbe en U invers est observ e lorsque les cellules MCF 7 sont expos es au tamoxif ne figure 52 Les deux concentrations interm diaires de la gamme induisent significativement des adduits p lt 0 01 L exposition 0 5 ug L de tamoxif ne induit deux fois plus d adduits a l ADN p lt 0 01 compar une concentration de 1 ug L Les autres concentrations n induisent pas de g notoxicit significative 114 R sultats amp Discussion Partie 1 25 Q oCIP TAM mCP 2 20 O 0 E 45 o id 2 3 5 4 TD lt
309. luminescence est statistiquement plus importante p lt 0 01 qu avec les pr l vements du mois de novembre L chantillon en sortie de STEP du mois de d cembre induit une prolif ration statistiquement moins importante que les autres pr l vements de ce mois En janvier on voit clairement une diff rence entre les 3 zones de pr l vements Les chantillons en sortie d h pital J1 et en entr e de STEP J2 inhibent la bioluminescence et donc la croissance de la bact rie L chantillon pr lev en entr e de STEP au mois de janvier est significativement plus toxique que l chantillon provenant de la sortie d h pital Les substances a 134 R sultats amp Discussion Partie 2 l origine de la toxicit des chantillons J1 et J2 ont t limin es en station d puration puisqu on observe une prolif ration des bact ries avec l chantillon J3 pr lev en sortie de STEP ll Evaluation de la croissance de l algue P subcapitata Algaltox F Des algues d eau douce Pseudokirchneriella subcapitata ont t expos es pendant 72 h auxdiff rents chantillons d effluents hospitaliers et d effluents d entr e et sortie de STEP Les r sultats obtenus sont pr sent s dans la figure 59 Les valeurs sont exprim es en moyenne de 6 points de mesure 3 s ries en duplicata 120 ee 1 100 lt gt x I 80 3 60 40 a E 20 E 0 _ z ro 20 rare 2 x 40 60 x a 80
310. m tre de mesure Application temporelle Affect par le polymorphisme Concentration de la substance dans Dose externe Te Directe non l environnement air eau aliment Dose interne Concentration de la substance dans a AAAA Minute H biomarqueur d exposition les fluides biologiques sang urine PUE TRIG Re ie ag Adduits l ADN i Dose biologique efficace NAEK DOENE Jour Mois oui Biomarqueurs de susceptibilit Induction enzymatique GST CYP Minute Heure oui Effets biologiques pr coces Aberration chromosomique CA biomarqueurs d effets Micronoyaux MN Aneuploidie Sane ine SA fi ut ers 4 Semaine Mois R ponse biologique Expression d oncog nes oui Effet tardif Marqueurs tumoraux Mois Ann es non tudi Maladie Tumeur Ann es oui Tableau 8 Marqueurs biologiques apparition temporelle et influence du polymorphisme enzymatique d apr s Pfohl Leszkowicz 2008 2014 I11 2 2 a Biomarqueurs de viabilit Test MTS Tr s r pandu dans le monde scientifique pour sa simplicit et sa rapidit d analyse de toxicit de compos s chimiques sur des cellules humaines le test de viabilit cellulaire MTS est une alternative plus sensible Cory et al 1991 du test MTT mis au point dans les ann es 80 Mosmann 1983 La survie de lign es cellulaires est valu e par une m thode colorim trique bas e sur la d tection de la conversion d un d riv
311. maceutiques les plus fr quents dans l environnement 17 Tableau 3 Fonction m taboliques des cytochromes P450 u ccssessssssceccceseessscsecscessessscscesscsssesusassessesssestsasseseeeees 25 Tableau 4 Types d interaction possibles entre les m langes de mol cules 28 Tableau 5 Concentrations en ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide mesur es dans diff rents types d effluen ts travers IC MONDE aaa a nette til e elle aa ataa etes ter net 39 Tableau 6 Gammes de concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide utilis es respectivement OU en m lange pour l tude 40 Tableau 7 Caract ristiques des essais couramment utilis dans le cadre d valuation des risques environnementaux associ s la pr sence de polluants 44 Tableau 8 Marqueurs biologiques apparition temporelle et influence du polymorphisme enzymatique 48 Tableau 9 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de culture de Lemna minor expos es pendant 7 jours des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide 94 Tableau 10 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les r sultats obtenus en de cellules h patiques HepG2 expos es pendant 24 het 72 h des m langes de ciprofloxacine tamoxif neet ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide
312. mammaires humaines MCF 7 55 IV Objectif de la th se et d marche scientifique 211 1 cccccccccceeessenteeeeeeseeeeeneees 55 Mat riels amp M thodes 59 I Description des essais biologiques retenus pour l tude 61 Lis ES PORT errr arr ere er saree ae a renr rene 61 Bed ap ae e E A E E E E 61 kies FCO ae A nue 61 a E e e aati 62 ST FNO DE aana A GR 62 Le POCO re ee ant hieneentes 62 viii Table des mati res 1 3 Le test d inhibition de la croissance sur Lemna minor 63 ko POO SR NL 1 63 bods COL a a ie an a phy 64 1 4 Evaluation du potentiel perturbateur endocrinien test YES YAS 00 e 0 64 FPG E E E A E E E E E peaueeebaddantuns 64 HS POCOS nn eu de a ee eae 65 1 5 Biomarqueurs de toxicit sur lign es cellulaires humaines 65 L51 Cuur dos CoS as vista mid n 65 15 1 4 Produits utilis s en culture cellulaire vi sccccicsneccevevvecesessssseveseecivdeveveveversareevesenvaenea ese 65 15 1 b Conditions de culture des celliles ccssccccocasessccsarcs scqnsresnaeseecsdassasaecunadsiaednsassdesnacons 66 1 5 1 6 1 Maintien des constantes physico chimiques 66 1 5 1 b 2 Mise en culture d une lign e cellulaire 0 2 eeeeeeeeeeeseeeeeeeeeeeeteeeeeeeeeeee 66 1 5 1 6 3 Amplification d une lign e cellulaire 66 1 5 1 b 4 Conservation d une lign e cellulaire 2 0 0 eeeeeeeeeseeeeeeeeseeeeeseee
313. mations disponibles tant encore trop faible il est difficile de conclure avec certitude de l impact de ces compos s pharmaceutiques sur les populations bact riennes dans l environnement K mmerer et al 2005 1 4 3 6 Perturbations endocriniennes D apr s la d finition propos e en 2002 par l organisation Mondiale de la Sant un perturbateur endocrinien est une substance ou un m lange exog ne poss dant des propri t s susceptibles d induire une perturbation hormonale dans un organisme intact chez ses descendants ou au sein de sous populations De mani re g n rale il s agit de substances chimiques d origine naturelle ou artificielle qui peuvent interf rer avec le fonctionnement des glandes endocrines organes responsables de la s cr tion des hormones Cette action peut passer par diff rentes voies Mim tisme d action d une hormone naturelle entrainant ainsi la r ponse due cette hormone Comp titivit au niveau des r cepteurs emp chant la fixation de l hormone et inhibant ainsi la transmission du signal hormonal 19 Synth se bibliographique Perturbation de la production ou de la r gulation des hormones et ou de leurs r cepteurs Certaines hormones naturelles ou synth tiques sont connues pour provoquer des effets n fastes sur la sant des organismes aquatiques m me de tr s faibles concentrations Lange et al 2001 Par ailleurs certains travaux ont galement montr
314. me notamment en milieu hospitalier et du fait de leur caract re souvent persistant dans l environnement les mol cules pharmaceutiques repr sentent un risque la fois pour les organismes aquatiques mais galement pour l Homme Le risque est d autant plus important que ces mol cules sont le plus souvent pr sentes en m lange et que leur propri t th rapeutique intrins que les d finit comme biologiquement actives C est le cas par exemple des m dicaments anticanc reux ou de perturbateurs endocriniens Bien que l valuation de l impact de ces pollutions soit maintenant une probl matique mondiale et que de nombreuses tudes soient men es l aide d outils normalis s sur divers niveaux trophiques des cosyst mes aquatiques le risque potentiel concernant l exposition de l Homme reste encore mal document 55 Synth se bibliographique Dans ce contexte l objectif g n ral de ce travail de th se a t d utiliser une batterie de tests de toxicit afin d valuer le caract re toxique de faibles doses de m dicaments rejet s seuls ou en m lange dans les effluents hospitaliers et d tect s dans l environnement Cette batterie de tests a ensuite t appliqu e sur des chantillons bruts d eaux us es afin d valuer sa pertinence dans l valuation du risque environnementale et d terminer la capacit d puration des traitements biologiques classiquement utilis en STEP Le premier objectif de la th se
315. men e par Vannini et al 2011 sur les effets en m langes de mol cules th rapeutiques dont le cyclophosphamide a permis de montrer un effet d l t re sur les chloroplastes de cette algue Il a notamment t mis en vidence une modification du ratio de chlorophylle a par rapport la chlorophylle b ainsi qu une diminution du taux de Glutamine synth tase GS Cette enzyme est impliqu e dans l assimilation d ammoniaque ou de nitrates du sol ainsi que dans le transport d azote Les interactions observ es apparaissaient intrins quement d pendantes de la nature et de la dose des compos s Bien que notre tude ne soit pas tout a fait comparable de tels m canismes d action pourraient expliquer les r sultats obtenus ici Seul le test des Lemna et de viabilit cellulaire MTS d crivent un seul et m me type de r ponse inhibition stricte ou horm se quelle que soit la condition test e Cependant la toxicit des m langes est chaque fois plus faible compar e l analyse individuelle des compos s Par ailleurs on peut souligner que les m langes n induisent pas les m mes effets chez les mod les d tudes utilis s et que les concentrations des mol cules jouent un r le d terminant dans la r ponse de toxicit C est le cas notamment pour les m langes ternaires CTC qui induisent plut t un ph nom ne d horm se chez 125 R sultats amp Discussion Partie 1 la bact rie et les cellules h
316. merer et al 2009 Li et al 2010 Kristiansson et al 2011 Xu et al 2014 la question de leur pr sence dans l environnement s impose aujourd hui comme une priorit A l heure actuelle le nombre croissant de polluants issus de l activit humaine a consid rablement accru cet int r t pour le d veloppement des recherches sur le comportement et les impacts de ces mol cules sur l environnement et la sant humaine Christensen 1998 Schulman et al 2002 Cardoso et al 2014 C est pourquoi l utilisation d outils simples et rapides repr sente une approche indispensable en cotoxicologie afin d valuer les cons quences d une exposition court ou long terme d organismes non cibles Deblonde et al 2013 Par exemple certaines micro algues sont connues et utilis es en bioessais standardis s du fait de leur sensibilit aux contaminations dans les milieux aquatiques Blaise amp Couture 1984 Eguchi et al 2004 Tang et al 2013 a b Elles sont consid r es comme des bioindicateurs d effets et d exposition de par leur r le cl dans l quilibre des cosyst mes aquatiques o elles sont impliqu es la fois dans la chaine alimentaire mais aussi dans la production d oxyg ne Ma et al 2006 Cependant le risque pos par les mol cules cytostatiques pr sentes en m lange dans l eau n est pas assez document et il est encore impossible de conclure sur leurs effets long terme vis vis d o
317. mes in human HepG2 hepatoma cells Cellular and Molecular Aspects of Cirrhosis 216 327 330 FDA 2011 Studies to evaluate the metabolism and residue kinetics of veterinary drugs in food producting animals validation of analytical methods used in residue depletion studies guidance of industry VICH GL49 Fent K Weston A A Caminada D 2006 Ecotoxicology of human pharmaceuticals Aquatic Toxicology 76 2 122 159 Ferrari B Paxeus N Giudice R L Pollio A Garric J 2003b Ecotoxicological impact of pharmaceuticals found in treated wastewaters study of carbamazepine clofibric acid and diclofenac Ecotoxicology Environmental Safety 55 3 359 370 Ferrando Climent L Rodriguez Mozaz S Barcelo D 2013 Development of UPLC MS MS method for the determination of ten anticancer drugs in hospital and urban wastewaters and its application for the screening of human metabolites assisted by information dependent acquisition tool IDA sewage samples Anal Bioanalytical Chemistry 405 5937 5952 169 Bibliographie Ferrando Climent L Collado N Buttiglieri G Gros M Rodriguez Roda Rodriguez Mozaz S Barcelo D 2012 Compr hensive Study of ibuprofen and its metabolites in activated sludge batch experiments and aquatic environment Science of the Total Environment 438 404 413 Flammarion P Brion F Babut M Garric J Migeon B Noury P Thybaud E 2000 Induction of Fish Vitellogenin an
318. mod les de r f rence d addition des concentrations CA et de l action ind pendante IA ont t utilis s pour tirer les mod les des effets conjugu s en m lange figure 33 A B Synergism Synergism AS i Additive effect 4 Additive effect E A r O __ Ww i r e OE Antagonism aS Antagonism 7 0 5 0 5 1 3 4 5 1 3 5 CONDITIONS CONDITIONS Figure 33 Comparaison des ratios valeur attendue E valeur observ e O calcul s pour les cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne m et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide X A M langes de Condition mol cule 1 2 3 4 5 CIP TAM at 85 71 90 88 90 35 88 34 83 43 CIP TAMobs 91 52 2 39 94 64 1 51 93 97 0 96 91 67 1 09 90 23 0 80 E O 0 94 0 96 0 96 0 96 0 92 CTC att 84 04 90 91 89 84 87 14 80 94 CT Cobs 98 57 1 42 99 34 1 10 98 44 0 73 97 28 1 21 94 52 0 87 E O 0 85 0 92 0 91 0 90 0 86 B M langes de Condition mol cules 1 2 3 4 5 CIP TAMatt 67 34 78 92 82 51 83 19 69 24 CIP TAMobs 83 93 0 11 89 22 0 15 91 29 0 38 91 03 1 77 82 51 0 18 E O 0 80 0 88 0 90 0 91 0 84 CTC att 64 12 78 26 81 72 82 38 66 91 CT Cobs 95 33 1 46 99 72 0 07 98 87 0 78 98 24 0 82 95 36 1 54 E O 0 67 0 78 0 83 0 84 0 70 Tableau 10 Comparaison entre les valeurs additives attendues et les
319. n grande quantit dans les urines Dremont amp Hadjali 1997 11 Synth se bibliographique L IRSN Institut de Radioprotection et de S ret Nucl aire est d ailleurs r guli rement amen intervenir sur des probl mes li s la pr sence de radioactivit artificielle d origine m dicale dans les stationsd puration STEP L identification et la quantification des radiopharmaceutiques au sein des r seaux d assainissement et dans les STEP a notamment permis de mettre en vidence la pr sence d iode 131 et le techn tium 99m avec des quantit s pouvant d passer 10 Bq L dans le cas de l iode 131 et allant jusqu 75 Bq L dans le cas du techn tium 99m Adam et al 2006 Le dernier param tre qui caract rise les effluents hospitaliers concerne bien videmment les rejets m dicamenteux qui font partie des polluants dits mergeants Chapman 2006 Bien que les donn es concernant leur pr sence et leur diversit dans les effluents aient t pendant longtemps d risoires de plus en plus d tudes s y consacrent pour palier ce manque A l heure actuelle les antin oplasiques et les immunomodulateurs repr sentent les postes de d pense les plus importants de l h pital en g n ral 25 7 puis viennent ensuite les m dicaments du sang et des organes h matopoi tiques qui se situent au deuxi me rang devant les anti infectieux Concernant les m dicaments li s aux cancers et l infection par le virus d
320. n e en lui donnant les moyens de ma triser sa f condit et les conditions de sa naissance de modifier l volution spontan e de certaines maladies et de retarder son tr pas La r volution g n tique et le d cryptage du g nome entretiennent l illusion de conna tre l homme en lui permettant de scruter le moindre recoin de son ADN et engendre chez lui l attente du grand jour o il deviendra ainsi totalement ma tre de sa destin e Toutes ces volutions se sont accompagn es d une part d avanc es techniques et technologiques consid rables mais galement d une production et d une utilisation toujours plus importante de compos s chimiques incluant les m dicaments M me si les concentrations de ces contaminants environnementaux sont g n ralement faibles de l ordre du ng L au ug L et en dessous des limites de d tection des essais biologiques Besse et al 2012 le risque li aux rejets liquides et notamment des services de sant suscitent chez les scientifiques un questionnement sur le risque environnemental pour la faune et la flore expos e de telles polluants dans les milieux mais aussi pour l homme via les eaux de boisson Le risque est d autant plus pr occupant lorsque ces compos s et leurs m tabolites sont pr sents en m lange Hernando et al 2006 Zegura et al 2009 De plus la demande et la production d eau potable ne pouvant pas tre totalement satisfaite par les eaux souterraines d autres source
321. n des enzymes par le TAM est r gul par le PXR pregnane receptor et le recepteur l androstane CAR Une exposition a des doses faibles de TAM conduit l induction des enzymes CYP FMO et d une modification du profile m tabolique Kisanga et al 2005 Ces diff rents CYP sont impliqu s dans la m tabolisation des trois mol cules Leur modulation va de ce fait modifier les voies de m tabolisation de chacun d entre eux figure 55 Dans le cas des m langes binaire CIP TAM l interaction pourrait aussi tre due l impact du tamoxif ne sur les changes membranaires En effet Darvari amp Boroujerdi 2004 ont montr que le tamoxif ne modulait de mani re biphasique le transport membranaire de la doxorubicine un antibiotique semblable la ciprofloxacine N anmoins la modulation des r ponses semble directement li e l interf rence de chacun des mol cules sur les enzymes de m tabolisation L inhibition des CYP3A4 par la CIP va favoriser la formation du 4 OH TAM qui a les propri t s endocriniennes et qui peut tre transform en d riv quinone capable de former un adduit La stimulation du CYP3A4 va au contraire favoriser la formation des formes d m thyl es qui apr s sulfoconjugaison par la sulfotransf rase SULT A2 vont conduire deux adduits Il est int ressant de noter que lorsque les cellules h patiques ont t expos es au TAM seul on observe deux adduits Ceci est en accord avec les tude
322. n in John Wiley amp Sons Inc Page 14 of 42 Page 15 of 42 J O O1 BR D 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 Environmental and Molecular Mutagenesis human that low dose of TAM modified the metabolic profil Kisanga et al 2005 Induction or inhibition of CYP activity mediated by concomitantly administered drugs can change the balance between the activating and inactivating metabolic pathways of CP Scripture et al 2005 Inhibition of CYP 3A4 by CIP will increase preferentially in one hand the formation of 4 OH TAM and in another hand the formation of acrolein and 4 OH cyclophosphamide The immunosuppressive effect of CP is hampered by CIP explaining that treatment did not anymore combine these two drugs CIP CP as described by Afsharian et al 2005 These two latter metabolites are known to be responsible of DNA breaks This can explain the formation of DNA breaks in cells Mater et al 2014 when the cells were exposed to binary or ternary mixture whereas no breaks was found when the drugs were applied alone In the same time inhibition of CYP 2B6 and induction of CYP 3A4 by TAM lead to the formation of chloroacetaldehyde the dechlorinated metabolites of CYP which is highly cytotoxic Interference between the different drugs can be also due
323. nant une perturbation endocrinienne et une g notoxicit les cassures l ADN test com te et les adduits l ADN sont des marqueurs de g notoxicit alt ration de l ADN pouvant entrainer une mauvaise expression des g nes La d r gulation des hormones et ou de l expression g nique ont pour cons quence une modification de la viabilit cellulaire signant une adaptation plus ou moins r ussie Le but de notre tude n tant pas d valuer le m canisme d action mais d appr hender le risque pos par ces mol cules dans l environnement les gammes de doses test es taient bien plus basses que les doses th rapeutiques Elles ont t adapt es en fonction des donn es disponibles de contamination des eaux la sortie des h pitaux en entr e et sortie de STEP ainsi que dans les rivi res D autre part comme un contaminant n est jamais seul nous avons test deux types de m langes un m lange binaire et un m lange ternaire Le choix d tudier la toxicit de ces mol cules sur des cellules humaines en culture deux justifications la premi re est que nous savons que chez les malades ces m dicaments sont m tabolis s en produits biologiquement actifs qui seront excr t s dans les urines Ce sont en fait eux que l on retrouve dans les effluents et qui ne sont pas trac s La deuxi me raison est que ces faibles doses de mol cules pourraient aussi affecter les humains sains expos s soit en milieux hospitalier infirmier
324. national Programme on chemical safety 183 Bibliographie Wiegel S Aulinger A Brockmeyer R Harms H L ffler J Reincke H Schmidt R Stache B Von T mpling W Wanke A 2004 Pharmaceuticals in the river Elbe and its tributaries Chemosphere 57 2 107 126 Williams C S Mann M DuBois R N 1999 The role of cyclooxygenases in inflammation cancer and development Oncogene 18 7908 7916 Williams J A Phillips D H 2000 Mammary expression of xenobiotic metabolizing enzymes and their potential role in breast cancer Cancer Research 60 4667 4677 Williams G M Jeffrey A M 2000 Oxidative DNA damage endogenous and chemically induced Regulatory Toxicology And Pharmacology 32 283 292 Willson T M Henke B R Momtahen T M Charifson P S Batchelor K W Lubahn D B Moore L B Oliver B B Sauls H R Triantafillou J A 1994 3 4 1 2 Diphenylbut 1 enyl phenyllacrylic acid a non steroidal estrogen with functional selectivity for bone over uterus in rats Journal of Medicinal Chemistry 37 1550 1552 Wolowicz M Smolarz K SokoA owski A Dame R F Olenin S 2005 Neoplasia inEstuarine Bivalves Effect of Feeding Behaviour and Pollution in the Gulf of Gdansk Baltic Sea Poland Earth and Environmental Series 47 165 182 Wolska L Sagajdakow A Kuczy ska A Namiesnik J 2007 Application of ecotoxicological studies in integrated environmental monitoring P
325. nctionnelle ais e mettre en uvre pour les gestionnaires de la qualit environnementale Mais il n en reste pas moins que lier les effets n fastes de la pollution dans des organismes sentinelles leurs cons quences cologique reste un d fi majeur dans l valuation des impacts et des risques pour une gestion int gr e de l environnement Il est en effet crucial de d montrer ce qui apparait comme intuitivement vident aux cotoxicologues afin de faire face la critique de sur valuation des risques Grue et al 2002 La conclusion de nos travaux est bien videmment que l utilisation d une batterie de tests est incontournable mais qu elle doit int grer a la fois des bioessais visant diff rents niveaux trophiques de l cosyst me et des biomarqueurs pouvant porter sur plusieurs mod les d tudes dont des lign es cellulaires humaines afin d tre la plus pertinente pour extrapoler les r sultats un risque envrionnemental Ces biomarqueurs vocation cologique que nous avons utilis pr sentent des avanc es cons quentes par rapport aux proc dures ent rin es par l usage Dans le domaine de la biosurveillance ils peuvent tre d une grande utilit en r v lant des alt rations de la sant du milieu et de l homme avant qu il n y ait des effets massifs au niveau de l organisme de la population ou encore des communaut s Ils ont donc vocation contribuer une d marche pronostique notamment d
326. ndatheerthavarada et al 1997 22 Synth se bibliographique Les composants du systeme MFO sont au nombre de 5 le cytochrome P450 h moprot ine poss dant au niveau du site catalytique un noyau protoporphyrine a atome de fer central et une prot ine apoprot ine qui lui m nage une cavit hydrophobe la NADPH cytochrome c P450 r ductase flavoprot ine qui poss de une partie hydrophobe se liant a la membrane du r ticulum endoplasmique Elle fait partie int grante du syst me monooxyg nasique mais dans certaines conditions elle peut elle m me catalyser la r duction de certains x nobiotiquesau niveau du foie le cytochrome b5 prot ine h minique ayant sa partie N terminale hydrophobe qui contribue au transfert d lectron a partir de NADPH et de NADH la NADH cytochrome b5 r ductase flavoprot ine a partie terminale hydrophobe Cette enzyme ne semble pas tre indispensable au fonctionnement de tous les cytochromes P450 la phosphatidylcholine phosphoglyc ride agissant comme transporteur d lectrons du cofacteur NADPH au complexe cytochrome P450 substrat et facilitant l interaction d un substrat liposoluble a l h moprot ine Il 1 1 c Classification et nomenclature des cytochromes P450 La purification et le s quen age de nombreux CYP ont t r alis s dans diff rents laboratoires Il existe plus de 3 000 s quences de g nes de CYP connus appartenant a toutes les esp ces Ch
327. ndo et al 2013 sur l analyse chimique des contaminants dans l eau avait d ailleurs confirm la diminution de la concentration des m dicaments en d cembre L tude a aussi montr un abattement des concentrations des m dicaments depuis les effluents hospitaliers jusqu aux effluents de sortie de STEP tableau 18 sauf le docetaxel qui se concentre en entr e de STEP quelle que soit la p riode avant d tre pur ou le m thotrexate qui se concentre en STEP au mois de D cembre Par comparaison avec notre tude ces r sultats laissent penser que d autres types de contaminants rejet s au mois de d cembre sont impliqu s dans les effets biologiques observ s puisque les concentrations en m dicaments d tect s pendant cette p riode sont les plus faibles compar es aux mois de novembre et janvier Cependant aucune analyse chimique n a t faite pour d terminer la nature et la concentration des d autres polluants ou des m tabolites qui pourraient tre l origine des effets observ s notamment les produits d tergeants L utilisation en parall le de biomarqueurs de g notoxicit lors de l tude vient confirmer ces observations puisqu on ne constate pas non plus de diff rence de r ponse en fonction du lieu de pr l vement ou de la p riode de pr l vement des chantillons tableau 19 Par exemple le test YES YAS ou encore le test des com tes ne permettent pas de d tecter syst matiquement des effets endocriniens
328. ne substance unique et l valuation des m langes repr sente un v ritable changement de paradigme L US EPA 2003 a propos une valuation du risque cumul en trois tapes La premi re phase est une phase de planification et de formulation du probleme La seconde phase est celle de l analyse qui int gre les 27 Synth se bibliographique donn es sur les dangers l exposition les doses r ponses de chaque substance isol e et sur leur m lange interactions des agents de stress toxicit chimique conjointe Ces renseignements constituent la cl pour l valuation de la toxicit des m langes Callahan amp Sexton 2007 La derni re phase est celle de l interpr tation et de la caract risation du risque Une des premi res d marches concernant une action conjointe entre les mol cules selon que le mode d action soit diff rent ou non et qu il y ait interaction ou non se basait sur des mod les de m langes binaires Plackett amp Hewlett 1952 Or les polluants sont rarement en m lange binaire dans l environnement D autres m thodes de d termination des effets toxiques ont depuis t propos es pour mieux caract riser les ph nom nes observ s mais il n existe pas de solutions id ales et d application imm diate Borgert et al 2004 La pr diction de la toxicit des m langes est d autant plus complexe que les effets d pendent de la concentration de chaque constituant de la dur e d exposition de
329. nhibant le CYP2B6 et induisant le CYP3A4 favorise la formation essentiellement de chloroac taldh hyde qui est cytotoxique L interf rence des mol cules entre elles sur leur m tabolisation explique la r ponse observ e avec le test YES YAS o seule la plus forte dose de tamoxif ne entraine un effet agoniste sur les r cepteurs hER a tandis que le t moin positif anti YES utilis qui est le 4 OH TAM un m tabolite du tamoxif ne entraine une r ponse antagoniste tr s prononc e et de tr s faibles doses compar la mol cule m re Lorsque le TAM est combin au CIP et ou au CP il y a disparition de l effet strog nique Nous avons galement pu constater avec les cellules humaines que la r ponse de g notoxicit est d pendante du type cellulaire utilis Ainsi une simple exposition des deux types de lign es cellulaires au tamoxif ne seul induit la formation dose d pendante d adduits sur les cellules h patiques HepG2 l apparition d un ph nom ne d horm se dans la formation des adduits sur les cellules mammaires MCF 7 mais aucune cassure l ADN sur les deux lign es La r ponse est tout autant complexe lorsque les cellules sont expos es des m langes puisqu une exposition de 24h des cellules HepG2 aux m langes binaires CIP TAM entraine une formation d adduits l ADN non monotone horm se alors que c est une r ponse g notoxique dose d pendante de forte intensit qui est observ e avec les
330. nicity correlates with ciprofloxacin concentrations in German hospital waste waters Archaic Environmental Contamination Toxicology 36 115 119 Hartwig A Schwerdtle T 2002 Interactions by carcinogenic metal compounds with DNA repair processes toxicological implications Toxicology Letters 127 47 54 Harwood V J Whitlock J Withington V 2000 Classification of Antibiotic Resistance Patterns of Indicator Bacteria by Discriminant Analysis Use in Predicting the Source of Fecal Contamination in Subtropical Waters Applied and Environmental Microbiology 66 3698 3704 Hasler J A 1999 Pharmacogenetics of cytochromes P450 Molecular Aspects of Medicine 20 25 137 Hastings J W Nealson K H 1977 Bacterial bioluminescence Annual Reviews in Microbiology 31 549 595 Hayes J D Pulford D J 1995 The glutathione S transferase supergene family regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance Critical Reviews In Biochemistry And Molecular Biology 30 445 600 171 Bibliographie Heberer T Dunnbier U Reilich C Stan H J 1997 Detection of drugs and drug metabolites in ground water samples of a drinking water treatment plant Fresenius Environmental 6 438 443 Heberer T 2002 Occurrence fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment a review of recent research data Toxicology Letters 131 1 2 5 17 Hebert P D L
331. nmental estrogen alters reproductive hierarchies disrupting sexual selection in group spawning fish Environ Sci Technol 42 5020 5025 Coezy E Borgna J L Rochefort H 1982 Tamoxifen and Metabolites in MCF7 Cells Correlation between Binding to Estrogen Receptor and Inhibition of Cell Growth Cancer Res 42 317 323 Collins AR Oscoz AA Brunborg G Gaivao Giovannelli L Kruszewski M Smith CC Stetina R 2008 The comet assay topical issues Mutagenesis 23 143 151 COM Committee on Mutagenicity of Chemicals in Food Consumer Products and the Environment COM guidance on a strategy for testing of chemicals for mutagenicity United Kingdom December 2000 Costantini D Metcalfe NB Monaghan P 2010 Ecological processes in a hormetic framework Ecology Letters 13 1435 1447 Crane M Watts C Boucard T 2006 Chronic aquatic environmental risks from exposure to human pharmaceuticals Sci Total Environ 367 23 41 Darvari R Boroujerdi M 2004 Concentration dependency of modulatory effect of amlodipine on P glycoprotein efflux activity of doxorubicin A comparison with tamoxifen J Pharm Pharmacol 56 985 991 Desai PB Nallani SC Sane RS Moore LB Goodwin BJ Buckley DJ Buckley AR 2002 Induction of cytochrome P450 3A4 in primary human hepatocytes and activation of the human pregnane X receptor by tamoxifen and 4 hydroxytamoxifen Drug Metab Dispos 30 608 612 Desta Z Ward BA Soukhova NV Flockhart DA
332. nseils judicieux tout au long de ma th se Elle a t pour moi d un soutien ind fectible qui m a initi beaucoup de techniques et m a accompagn en toute simplicit dans de nombreux moments tant sur le plan travail qu au niveau des pauses g teaux matinales Je remercie le Dr Claire Albasi ainsi que toutes les personnes avec qui j ai pu collaborer au sein des divers projets Jordan Isariebel Sylvie Cl mence Sara Laura etc Je remercie les Dr S lim Ait Aissa et Luis Castillo de m avoir accompagn au travers de mes comit s de th se Leurs conseils sur le d roulement de mes travaux m ont t d une grande aide Je remercie les organismes qui m ont financ e l Agence Nationale de la Recherche travers le projet PANACEE ainsi que VEOLIA Eau Recherches et Innovation Je remercie galement l quipe de l ICRA et le projet trans Pyr n en MbrMed Un grand merci au Dr Marie Carmen Monje pour sa gentillesse son coute et son soutien aux moments de mes premiers pas dans le monde tumultueux de la recherche Merci d avoir cru en moi et d avoir apport cette gait qui a pu faire d faut a certains moments au laboratoire Merci aussi d avoir pris des nouvelles si souvent Je remercie Marion ainsi que mon petit Jean Yves pour toute leur aide leur bonne humeur et pour tous ces moments pass s a rire ensemble autour de ces nombreuses pauses caf s Je remercie galement tous les membres du laborat
333. nsform es immortelles ayant acquis toutes les caract ristiques des cellules tumorales e Les lign es cellulaires immortalis es grace des virus e Les lign es r sultant de transfections de mat riel g n tique tranger Ces deux derni res lign es immortalis es sont des lign es cellulaires a dur e de vie illimit e obtenues par transfection de g nes viraux ou cellulaires immortalisants Type T de SV40 ou cmyc 111 2 2 c 1 Avantages et inconv nients li s leur utilisation Les avantages vidents des lign es tablies sont la disponibilit d un mat riel exp rimental en principe identique au d part et cela sans proc dure d isolement la facilit de culture dans des milieux connus et en ce qui concerne les lign es d origine humaine l absence de restriction thique pour l obtention des chantillons Elles conservent certaines propri t s sp cifiques des enzymes y sont inductibles Certaines fonctions teintes peuvent tre restaur es par un choix judicieux du milieu 53 Synth se bibliographique de culture Elles peuvent aussi tre apport es dans le milieu ou encore transfect es Ces lign es sont tr s utilis es en toxicologie et en particulier dans des tudes de g notoxicit et de m tabolisme Cependant elles ne sont pas toujours repr sentatives du tissu d origine Elles sont partiellement d diff renci es En g n ral elles sont plus r sistantes aux toxiques que les cellules
334. nt variables selon la classe consid r e le compartiment tudi et selon la pression anthropique a laquelle le site d tude est soumis Ils varient g n ralement du ng l au g l dans l eau Les fortes concentrations mesur es en aval des stations d puration traduisent l efficacit partielle des stations de traitement des eaux a liminer certains compos s Ainsi le taux d puration de la ciprofloxacine est faible et estim a 15 environ Watkinson et al 2007 celui du cyclophosphamide est estim a 25 Catastini et al 2008 alors que le tamoxif ne ne serait pas du tout limin en station d puration Zini et a 2008 Il est toutefois important de souligner que ces taux d purations peuvent varier puisqu ils d pendent bien videment de plusieurs param tres dont notamment le type de traitement utilis en STEP 11 3 3 f D termination des gammes de concentrations retenues pour l tude A partir de recherches bibliographiques sur les concentrations de ces trois mol cules retrouv es depuis les eaux us es hospitali res jusqu l environnement les gammes de concentrations utilis es pour l tude ont t d finies entre le nanogramme et le microgramme par litre tableau 6 Du fait de l emploi de plusieurs essais et d un grand nombre de concentrations les combinaisons des doses et des mol cules sont la fois nombreuses et complexes Nous avons donc choisi de limiter le nombre de m lange utilis s pou
335. ntraire les effluents hospitaliers N1 D1 et J1 qui induisent la plus forte g notoxicit De plus on observe un abattement de la toxicit depuis les rejets hospitaliers jusqu la sortie de STEP quelle que soit la p riode de pr l vement Quelle que soit la lign e cellulaire on note que les chantillons du mois de d cembre sont toujours les moins g notoxiques Ce r sultats est identique pour le test YES YAS et le test des com tes Il est int ressant de souligner que la diff rence de r ponse de g notoxicit observ e entre les lign es cellulaires confirme le r le pr pond rant de la m tabolisation dans l induction d une toxicit On constate notamment que les cellules h patiques permettent de d tecter le plus souvent l apparition de cette toxicit indiquant que les responsables sont sans doute les m tabolites non pris en compte l heure actuelle dans les analyses Ces diff rences ont d j t observ es lors de l utilisation du test MTS et du test des com tes les cellules mammaires n ayant pas permis d valuer la toxicit des effluents test s Cela avait aussi t remarqu avec ces m mes tests lors de l analyse de la toxicit 149 R sultats amp Discussion Partie 2 de mol cules pures dans la partie 1 des r sultats Cependant l utilisation de la lign e cellulaire mammaire tout de m me permis de r v ler la formation d adduits l ADN diff rents et compl mentaires de ceux form s
336. nts sous forme inchang e et sous forme de produits de d gradation 15 36 est retrouv e dans les urines 24 h apr s le traitement et 60 80 apr s 72 h D apr s 36 Synth se bibliographique l AFSSAPS la consommation de cyclophosphamide en France s levait 281 84 kg en 2004 Besse amp Garric 2007 De mani re g n rale les agents alkylants stoppent la croissance de tumeur et agissent a n importe quel stade du cycle cellulaire en attaquant directement l ADN via trois principaux modes d action Fixation de groupes m thyle CHs sur les bases de l ADN provoquant la fragmentation de l ADN lorsque les enzymes de r paration tentent de remplacer les bases alkyl es arr t de la synth se transcription d ADN R ticulation de l ADN pontage emp chant galement la synth se d ADN et sa transcription Induction de m sappariements de nucl otides l origine de mutations Le cyclophosphamide interagit directement avec l ADN mitochondrial et nucl aire et forme des liaisons covalentes avec les substrats nucl ophiles par l interm diaire de ses radicaux alcoyles Ceci entra ne la formation de ponts alcoyles intrabrins ou interbrins et ainsi une inhibition de la transcription et de la r plication de l ADN lors de la division cellulaire aboutissant la mort cellulaire par apoptose Son action antimitotique est cycle d pendante il n a aucune action sur les cellules en Go we
337. ociprofloxacin tamoxifene or cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital waste water and surface water soumis Mater N Rodriguez Mozaz S G ret F Ferrando Climent L Barcel D Albasi C Pfohl Leszkowicz A 2014 Ecotoxic and genotoxic risk assessment of Gerone hospital waste water inflow and outflow of the municipal WWTP en pr paration Mater N Rodriguez Mozaz S Ferrando Climent L Barcel D Geret F Faucet Marquis V Pfohl Leszkowicz A 2012 Optimisation de bioessais in vitro pour l valuation de la toxicit induite par des m langes de m dicaments rejet s dans les effluents hospitaliers application aux effluents d un h pital Abstract tendu Colloque Gruttee Communication orale 1 Mater N Geret F Rodriguez Mozaz S Castillo L Barcel D Pfohl Leszkowicz A 2013 In vitro bioassays for risk assessment of oncologic treatments released in hospital waste water and surface water 11 International Conference of Environmental Mutagens 11 ICEM Nov 2013 Brazil Mater N G ret F Rodriguez Mozaz S Castillo L Albasi C Pfohl Leszkowicz A 2013 Molecular tools for assessing ecological risk of ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide released in hospital waste water and surface water 2 International conference on occupational and environmental toxicology Sept 2013 Porto Portugal Mater _N Rodriguez Mozaz S G ret F Ferrando Climent L Barcel D Pfohl Leszkowicz A
338. ociprofloxacine Formylciprofloxacine Figure 7 Structure chimique de la ciprofloxacine et de ses principaux m tabolites connus La m tabolisation de cet antibiotique se fait chez l homme principalement au niveau du foie avec un taux qui varie entre 55 et 75 le reste est excr t inchang dans les urines Quatre m tabolites ont t identifi s desethylcirpofoxacine oxofloxacine sulfociprofloxacine formylciprofloxacine dans l urine humaine figure 7 La sulfociprofloxacine et l oxociprofloxacine repr sentent respectivement 10 34 Synth se bibliographique et 7 du ratio des m tabolites et la desethylciprofloxacine 1 8 Borner et al 1986 Anadon et al 2001 Drusano 1987 Ces m tabolites ont une activit antimicrobienne mais ils sont moins actifs que la mol cule m re Zeiler et a 1987 11 3 3 c Le tamoxif ne Le tamoxif ne est un modulateur des r cepteurs aux strog nes administr par voie orale en hormonoth rapie contre le cancer du sein chez les femmes en pr ou post m nopause Ce m dicament est galement utilis comme un adjuvant th rapeutique pour limiter la r currence tumorale pour son potentiel comme agent chimio pr ventif et il aurait galement un effet positif dans le traitement des maladies osseuses ou cardiovasculaires chez la femme La consommation de tamoxif ne en France pour l ann e 2006 a t estim e a 335 kg d apr s les quantit s de m dicaments pay
339. of in vitro bioassays for the determi nation of cytotoxic and genotoxic potential of wastewater surface water and drink ing water samples Chemosphere 2009 75 1453 60 Zorita S Martensson L Mathiasson L Occurrence and removal of pharmaceuticals in a municipal sewage treatment system in the south of Sweden Sci Total Environ 2009 407 2760 70 Zounkova R Kovalova L Blaha L Dott W Ecotoxicity and genotoxicity assessment of cy totoxic antineoplastic drugs and their metabolites Chemosphere 2010 81 253 60 Zuccato E Castiglioni S Fanelli R Identification of the pharmaceuticals for human use contaminating the Italian aquatic environment J Hazard Mater 2005 122 205 9 Annexes Article 2 Genotoxicity assessment in human cell lines exposed to ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface water Soumis 205 Environmental and Molecular Mutagenesis Genotoxicity Environmental and _ Molecular Mutagenesis assessment in human cell lines exposed to ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface Journal Manuscript ID fe Wiley Manuscript type Date Submitted by the Author Complete List of Authors 9 Key Words water Environmental and Molecular Mutagenesis Draft Research Article n a Mater Nicolas INP ENSAT
340. oire que j ai pu rencontrer ou c toyer pour leur sympathie leurs p tisseries leur humour et leur aide scientifique ou non Kheira Patricia Marianna Safwan Rayenne Philippe Nathalie Sylvain Estelle Remerciements Bien videmment un grand merci a tous les amis qui m ont apport de pr s ou de loin leur soutien et leur aide au cours de ma th se et lors de la r daction Je pense notamment a toi Grigou alias Magret 09 mon coloc et partenaire de th se Je te remercie pour ton soutien ton humour immuable et pour m avoir support significativement p lt 0 01 au travers de tout ce qu on a v cu ensemble ces quatre derni res ann es et il y en a eu hein Evidemment que serait ces remerciements sans citer le troisi me trouble f te l homme incontournable de la triade A toi Mickey dit la moulinette de Bess ge merci d avoir su tre pr sent malgr ton travail harassant je plaisante videmment de nous avoir motiv de nous avoir train si souvent jusqu flunch et de nous avoir vendu du r ve pour nous faire oublier la th se Merci les saucisses vous avez t au top Je remercie galement mes deux am ricaines pr f r es Cece et Cristella deux amies ch re mes yeux Votre rencontre et tous ces moments partag s ont cr l atmosph re propice au d marrage decette th se sur les chapeaux de roue Merci galement vous Mimine Poussin et Jbou d avoir particip
341. olite Rabiet 2006 Il est tout de m me important de rappeler que le taux d excr tion peut varier avec la constitution physique des patients la nature du m dicaments la posologie ou encore le mode d administration K mmerer et al 1997 Une synth se r dig e par Rabiet 2006 a permis de mettre en vidence pr s de 3 300 compos s vis s humaines actuellement utilis s en Europe Apr s les effluents domestiques les effluents hospitaliers repr sentent galement une source importante de substances bioactives Chapman 2006 Parmi ces mol cules on peut citer les analg siques antibiotiques anti pileptiques b tabloquants anti cholest rols anticanc reux les radio isotopes ou encore les solvants K mmerer 2001 Heberer 2002 Emmanuel et al 2005 Verlicchi et al 2012 La communaut europ enne interdit actuellement la d charge des produits chimiques et de m tabolites ayant des propri t s canc rog nes ou mutag nes potentielles dans le syst me des eaux us es Directive du Conseil 80 68 EWG 1991 directive du Conseil 76 464 EWG 2000 Pourtant des agents cytostatiques et de nombreux autres produits pharmaceutiques utilis s de mani re compl mentaire lors des traitements th rapeutiques y sont pr sents Concernant les h pitaux la r glementation n encadre pas les rejets des m dicaments autres que les substances radioactives avec pour cons quence la non d tection ni l valuation des r sidus en sor
342. on des deux Williams amp Phillips 2000 Bien que l activit des g nes CYP se passe majoritaire au niveau des cellules h patiques l activit de certains cytochromes CYP1A1 CYP1B1 CYP3A4 est aussi d tect dans les cellules mammaires Tsuchiya et al 2004 La lign e cellulaire mammaire MCF 7 a t choisie pour son utilisation dans l valuation de la toxicit et l apparition de ph nom ne perturbateur endocrinien induit par des compos s chimiques Ces cellules sont cit es dans un tiers des publications scientifiques et pr sentent la particularit de conserver une grande vari t de r cepteurs aux oestrog nes androg nes progest rone et glucocorticoides Horwitz et al 1975 Lippman et al 1976 De ce fait cette lign e cellulaire repr sente un outil pertinent pour la recherche d effets perturbateur endocrinien de m langes de mol cules Levenson amp Craig Jordan 1997 Charles et al 2002 On peut citer par exemple certaines tudes portant sur le bisph nol A comme celle men e par Iso et al 2006 o la pr sence de cassures l ADN avait t recherch e sur ce mod le cellulaire IV Objectif de la th se et d marche scientifique Au travers de cette synth se bibliographique nous avons pu constater que la probl matique des polluants mergeants dans l environnement et les milieux aquatiques est une pr occupation importante De par la consommation grandissante des produits pharmaceutiques com
343. onal care products in wastewater treatment plants Conception of a database and firts results Poster SETAC Potro Cory A H Owen T C Barltrop J A Cory J G 1991 Use of an aqueous soluble tetrazolium formazan assay for cell growth assays in culture Cancer Commun 3 207 212 Costantini D Metcalfe N B Monaghan P 2010 Ecological processes in a hormetic framework Ecology Letters 13 1435 1447 Crane M Watts C Boucard T 2006 Chronic aquatic environmental risks from exposure to human pharmaceuticals Science of the Total Environment 367 23 41 Cox MF 1994 Surfactants Detergents and Cleaners A handbook for formulators In Munich Hanser Gardner Publications Inc pp 43 89 Crewe H K Ellis S W Lennard M S Tucker G T 1997 Variable contribution of cytochromes P4502D6 2C9 and 3A4 to the 4 hydroxylation of tamoxifen by human liver microsomes Biochemestry Pharmacology 53 171 178 D D Abrosca B Fiorentino A Izzo A Cefarelli G Pascarella M T Uzzo P Monaco P 2008 Phytotoxicity evaluation of five pharmaceutical pollutants detected in surface water on germination and growth of cultivated and spontaneous plants Journal of Environmental Science and Health Part A 43 285 294 167 Bibliographie Dansette P M Bonierbale E Minoletti C Beaune P H Pessayre D and Mansuy D 1998 Drug induced immunotoxicity European journal of drug metabolism and pharmacokinetics 23 4
344. one dose response U shape curve mainly with CIP TAM Fig 10 The addition of CP in the mixture induced an antagonist effect For the lowest doses in the mixture the inhibition of bacteria biolumi nescence was much higher when the three drugs were present com pared to only CIP TAM For the other conditions the inhibitions were lower in the presence of the three drugs compared to CIP TAM Fig 10 Table 2 4 Discussion Recent studies show that among many environmental contami nants pharmaceutical and personal care product PPCP residues in the environment are of emerging concern Cytostatic drugs and human metabolites are directly discharged into the sewage system without any specific control after being administered in the hospitals Household discharge by out patients presents another pathway of cyto statics to the environment Bound and Voulvoulis 2006 Due to their highly potent mechanism of action cytotoxicity genotoxicity mutage nicity and teratogenicity cytostatic drugs could induce adverse effects on any growing eukaryotic organism and bacteria Besse et al 2012 Johnson et al 2008 Another point is also the deleterious effects of these drugs for the hospital staff Bouraoui et al 2011 Burgaz et al 1999 2002 Fucic et al 1998 In fact some cytostatics have been detected in hospital wastewaters and even influent wastewaters at concentrations ranging from ng L to ug L Buerge et al 2006 Johnson e
345. onosyltransf rases e Les enzymes de phase Ill permettent l limination des conjugu s hydrophiles Ce sont essentiellement des glycoprot ines membranaires permettant le transport actif des x nobiotiques et des conjugu s de la phase Il hors de la cellule Silverman 1999 ABSORPTION Circulation sanguine i METABOLISME orale respiratoire foie poumon peau transcutan e placenta reins intestins Excr tion Fonctionnalisation biliaire ou urinaire oxydation r duction PHASE 7 lipophiles Conjugaison PHASE Il polaires Excr tion Transport biliaire ou urinaire p PHASEN 3 hydrophiles 4 Combinaison avec les Adduits aux macromol cules Adduits l ADN prot ines cellulaires Mutations Dysfonctionnement cellulaire Initiations de la canc rog n se Figure 2 Sch ma g n ral de la biotransformation des x nobiotiques sources diverses x Toutefois la m tabolisation des x nobiotiques ne conduit pas toujours a une d toxication Dans certains cas le produit oxyd ou r duit form peut manifester une tr s forte r activit avec les macromol cules nucl ophiles telles que les prot ines ou les acides nucl iques Les l sions qui en 21 Synth se bibliographique d coulent cassures l ADN adduits a l ADN etc peuvent entra ne
346. ons Inc Page 18 of 42 Page 19 of 42 OONDOOARWND D 553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 Environmental and Molecular Mutagenesis Ch tel A Faucet Marquis V Perret M Gourlay Franc C Uhrer Pfohl Leszkowicz A Vincent Hubert F 2012 Genotoxicity assessement and detoxification induction in Dreissena polymorpha exposed to benzo a pyrene Mutagenesis 27 6 703 711 Ch tel A Faucet Marquis V Gourlay Franc C Pfohl leszkowicz A Vincent Hubert F 2014 Genotoxicity and activation of cellular defenses in transplanted zebra mussels Dreissena polymorpha along the Seine River Ecotoxicology and environmental safety in press http dx doi org 10 1016 j ecoenv 2014 03 023 Chung FL Young R Hecht SS 1984 Formation of Cyclic 1 N2 Propanodeoxyguanosine Adducts in DNA upon Reaction with Acrolein or Crotonaldehyde Cancer Res 44 990 995 Chou T C 2006 Theoretical Basis Experimental Design and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies Pharmacological Reviews 58 621 681 Chou T C 2011 The mass action law based algorithm for cost effective approach for cancer drug discovery and development American J Cancer res 1 925 935 Coe TS Hamilton PB Hodgson D Paull GC Stevens JR Sumner K Tyler CR 2008 An enviro
347. ons endocriniennes ont t observ s dans l environnement et les mol cules incrimin es ont pu tre identifi es Revue par Jobling et al 1998 Sumpter et al 2005 WHO 2002 Hotchkiss et al 2008 Certaines tudes ont notamment mis en vidence des impacts plus ou moins importants chez l Homme dont des perturbations au niveau neurologiques immunitaire comportementale ou encore de la reproduction suite des expositions diverses mol cules chimiques telle que les PCB PCDDF ou DES Colborn et al 1993 Guo et al 1995 Au cours de notre tude nous avons choisi d utiliser la levure de boulanger ou de brasseur commune Saccharomyces cerevisiae g n tiquement modifi e et qui poss de un g ne exprimant le r cepteur humain aux strog nes hERa dit test YES pour Yeast Estrogen Screen ainsi que le r cepteur humain aux androg nes hAR dit test YAS pour Yeast Androgen Screen coupl un g ne rapporteur Les levures ont la capacit par une suite de r actions enzymatiques de produire la B galactosidase qui transforme la couleur jaune de d part du m lange en couleur rose qui absorbe a 540 nm en spectroscopie ultraviolet visible La mise en contact des cultures de levure avec un x nobiotique ou un effluent permet de rendre compte directement des v nements perturbateurs endocriniens induit pas les solutions 111 2 2 b 2 Test des com tes La premi re observation de dommages l ADN a t faite par
348. os es 48 h des chantillons d effluents hospitaliers et d effluents d entr e et sortie de STEP pour valuer leur potentiel perturbateur endocrinien Les valeurs sont les moyennes de 4 points de mesure 2 s ries en duplicata Ill 1 Potentiel agoniste antagoniste sur les r cepteurs strog niques hERa YES Les r sultats de l analyse du potentiel strog nique des chantillons est pr sent figure 62 L activation des r cepteurs humain hERa effet agoniste est multipli e par 3 avec l chantillon des effluents hospitaliers pr lev s au mois de Novembre N1 figure 62 A et du mois de Janvier J1 figure 62 C Les effluents d entr e de STEP du mois de Janvier J2 entrainent une induction de 2 5 fois p lt 0 05 plus importante que la condition contr le de r f rence Il est noter que bien que le taux d induction des r cepteur hERa induit par l chantillon J3 figure 62 C soit l g rement sup rieur 1 il nest cependant pas significatif Aucun des chantillons pr lev s au mois de d cembre figure 62 B n a d effet agoniste 137 Induction Ratio Induction Ratio Induction Ratio R sultats amp Discussion Partie 2 10 0 gt 178 Estradiol N1 N2 N3 8 0 6 0 4 0 20 0 0 1 0E 12 1 0E 10 1 0E 08 1 0 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Samole Dilution 10 0 gt 170 Estradiol D1 D2 D3 8 0 6
349. osomal P 450 profiles Drug Metabolism Disposition 27 655 Rowney N C Johnson A C Williams R J 2009 Cytotoxic drugs in drinking water a prediction and risk assessment exercise for the thames catchment in the United kingdom Environmental Toxicology Chemistry 28 2733 2743 Russell A D Hugo W B 2004 Principles and Practice of Disinfection Preservation and Sterilization 4 ed Ayliffe GA Oxford Blackwell Science 688p Rydberg B Johanson K J 1978 Estimation of DNA strand breaks in single mammalian cells In DNA Repair Mechanisms Friedberg EC Fox CF eds Academic Press New York 465 468 Sane R S Buckley D J Buckley A R Nallani S C Desai P B 2008 Role of human pregnane X receptor in tamoxifen and 4 hydroxytamoxifen mediated CYP3A4 induction in primary human hepatocytes and LS174T cells Drug Metabism Disposition 36 946 954 Santiago S Becker Van Slooten K Ch vre N Pardos M Benninghoff C Thybaud E Garrivier F 2002 Guide pour l utilisation des tests cotoxicologiques avec les daphnies les bact riesluminescentes et les algues vertes appliqu s aux chantillons de l environnement Soluvallnstitut Forel Universit de Gen ve Ecole Polytechnique F d rale de Lausanne Suisse 55p Santos LHMLM Araujo A N Fachini A Pena A Delerue Matos C Montenegro MCBSM 2010 Ecotoxicological aspects relatedto the presence of pharmaceuticals in the aquatic environment
350. ossibilities and problems TrAC Trends in Analytical Chemistry 26 332 344 Wong C Chen S 2012 The development application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 131 3 5 83 92 Wyckoff E Natalie D M Nolan J M Lee M Hsieh T S 1989 Structure of the Drosophila DNA topoisomerase Il gene nucleotide sequence and homology among topoisomerase Il Journal of Molecular Biolology 205 1 X Xie H J Broberg U Griskevicius L Lundgren S Carlens S Meurling L Paul C Rane A Hassan M 2003 Alteration of pharmacokinetics of cyclophosphamide and suppression of the cytochrome P450 genes by ciprofloxacin Bone Marrow Transplantation 31 197 203 Xu J Xu Y Wang H Guo C Qiu H He Y Zhang Y Li X Meng W 2014 Occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes in a sewagetreatment plant and its effluent receiving river Chemospshere sous presse Y Yang Y Fu J Peng H Hou L Liu M Zhou J L 2011 Occurrence and phase distribution of selected pharmaceuticals in the Yangtze Estuary and its coastal zone Journal of Hazardous Materials 190 1 3 588 596 Yu L Waxman D J 1996 Role of cytochrome P450 in oxazaphosphor ine metabolism Deactivation via N dechloroethylation and activation via 4 hydroxylation catalyzed by distinct subsets of rat liver
351. otal Environment 408 2146 2154 Hirsch R Ternes T Haberer K Kratz K L 1999 Occurrence of antibiotics in the aquatic environment Science of the Total Environment 225 109 118 Hoffmann G R 2009 A Perspective on the Scientific Philosophical and Policy Dimensions of Hormesis Dose Response 7 1 51 Horwitz K B Costlow M E McGuire W L 1975 MCF 7 a human breast cancercell line with estrogen androgen progesterone and glucocorticoid receptors Steroids 26 785 795 Hotchkiss A K Rider C V Blystone C R Wilson V S Hartig P C Ankley G T Foster P M Gray C L Gray L E 2008 Fifteen years after Wingspread Environmental endocrine disrupters and human and wildlife health Where we are today and where we need to go Toxicological Sciences 105 2 235 259 Huang D Zhang Y Wang Y Xie Z Ji W 2007 Assessment of the genotoxicity in toad Bufo raddei exposed to petrochemical contaminants in Lanzhou Region China Mutation Research Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 629 81 88 Huang Z Roy P Waxman D J 2000 Role of human liver microsomal CYP3A4 and CYP2B6 in catalyzing N dechloroethylation of cyclophosphamide and ifosfamide Biochemical Pharmacology 59 961 Hukkanen J 2000 Xenobiotic metabolizing cytochrome P450 enzymes in human lung University of Oulu Acta universitatis Ouluensis D media 621 69p Hughes M F 2002 Arsenic toxicity and potential me
352. outer dans chaque puits 90 uL de milieu DMEM incomplet sans SVF au quel on ajoute 5 de milieu CS trait sur charbon actif Le SVF non trait peut contenir des hormones bovines qui pourraient influencer la croissance des cellules et biaiseraient le test Les cellules trait es sont alors incub es pendant 24 h 72 h 37 C A la fin de l incubation 20 uL de solution de MTS sont ajout s Apr s 3 h d incubation 37 C l absorbance de chaque puits est mesur e gr ce un lecteur de plaques 96 puits 490 nm figure 18 69 Mat riels amp M thodes Spectrophotom tre X nobiotiques Traitement des cellules Ensemencement Ajout de 20 uL de Incubation de 3h Lecture U V des cellules r actif MTS 37 C 5 CO 490 nm Figure 18 Etapes du test de viabilit cellulaire MTS Mesure du taux d inhibition de la croissance cellulaire Les analyses sont effectu es en triplicata de 5 points de mesures Les r sultats repr sentent les moyennes des valeurs m dianes obtenues et sont calcul s en pourcentage de viabilit cellulaire par rapport la condition contr le cellules sans traitement D O s90nm Cellules trait es inhibition de la viabilit X 100 D O s90nm Cellules contr les 1 5 3 Test des com tes sur cellules humaines 1 5 3 a Produits utilis s Lames non lav es et lamelles le NazEDTA le triton X 100 le Trizma base le NaOH le NaCl le DMSO le Na Lauroyl Sarcosinate l
353. ozaz S Barcelo D 2014 Incidence of anticancer drugs in an aquatic urban system From hospital effluents through urban wastewater to natural environment Environmental Pollution 193 216 223 Frenzilli G Nigro M Lyons B 2009 The Comet assay for the evaluation of genotoxic impact in aquatic environments Mut Res Reviews Mut Res 681 80 92 Fucic A Jazbec A Mijic A Seso Simic D Tomek R 1998 Cytogenetic consequences after occupational exposure to antineoplastic drugs Mutat Res 416 59 66 Gamboa da Costa G McDaniel Hamilton P Heflich RH Marques MM Beland FA 2001 DNA adduct formation and mutant induction in Sprague Dawley rats treated with tamoxifen and its derivatives Carcinogenesis 22 8 1307 1315 Gamboa da Costa G Marques Fu X Churchwell MI Wang YP Doerge R Beland FA 2007 Effect of N N didesmethyltamoxifen upon DNA adduct formation by tamoxifen and a hydroxytamoxifen Cancer Letters 257 2 191 198 Gartiser S Brinker L Erbe T Kummerer K Willmund R 1996 Contamination of hospital wastewater with hazardous compounds as define 7a Acta hydrochimt Hydrobiol 24 90 97 Gyorffy E Anna L Kovacs K Rudnai P Schoket B 2007 Correlation between biomarkers of human exposure to genotoxins with focus on carcinogen DNA adducts Mutagenesis 23 1 18 Halling Sgrensen B Nors Nielsen S Lanzky PF Ingerslev F Holten L tzhoft HC Jorgensen SE 1998 Occurrence fate and effects of pharmaceutical substances in
354. pectivement et de v rifier leurs compl mentarit s ou au contraire leurs redondances Ces diff rents outils sont pr sent s et d velopp s dans les parties ci apr s 43 Synth se bibliographique I11 2 1 Les biotests mono sp cifiques Historiquement les premiers essais de laboratoire visaient valuer les effets l taux effets aigus ou subl taux effets chroniques d une substance sur des organismes issus d une culture ou d un levage en laboratoire Ces essais ont d j trouv une application dans l valuation de l cotoxicit de matrices complexes liquides ou solides tels que des effluents des d chets ou des sols pollu s Volatier 2004 Les finalit s de ces valuations sont diverses la gestion des d chets des sols et des sites pollu s la valorisation des boues en agriculture la classification des d chets ou encore la caract risation des sources de pollutions environnementales Les essais mono sp cifiques concernent en r gle g n rale des groupes d individus d finis plac s dans des conditions de milieu et d environnement conventionnelles De ce fait ils ne pr tendent pas simuler toutes les conditions de l environnement et ne prennent pas en compte des ventuelles interactions entre l chantillon test et d autres compos s pr sents dans l environnement qu ils soient d origine naturelle ou anthropique tableau 7 Niveau Type Dur e t Norme Cremas
355. pendante du TAM De faibles doses de CIP 0 01 0 1 1 ug L m lang es de fortes doses de TAM 0 5 1 10 ug L induisent des r ponses de toxicit significatives p lt 0 05 98 R sultats amp Discussion Partie 1 Si on compare l exposition des cellules pendant 72 h a CIP 100 ug L TAM 0 01 ug L et a CIP 100 ug L TAM 10ug L on constate que le taux d inhibition est significativement plus important lors de l exposition la plus forte concentration de TAM pour une quantit fixe de CIP figure 34 B De m me lorsque 10 ug L de TAM est associ soit 0 01 ug L ou 100 ug L de CIP on constate que le taux d inhibition est le m me environ 82 de survie N anmoins l effet n est pas exclusivement du au TAM puisque si on compare les conditions dans lesquelles les cellules ont t expos es au plus faibles doses de CIP 0 01 ug l avec soit 0 01 ug l de TAM ou 10 ug l de TAM bien que la concentration en TAM soit 10 000 fois sup rieure l inhibition de la viabilit est la m me Le ph nom ne est le m me pour des expositions des cellules 0 1 ug L de CIP soit 0 1 ug L de TAM ou 1 ug L de TAM L inhibition est identique bien que la quantit de TAM soit 100 fois plus importante Les effets observ s ici ont ensuite t compar s avec les effets attendus comme pr c demment cf 1 4 1 a Les valeurs attendues de toxicit ont t calcul es partir de la toxicit respective des mol cules mesur e ta
356. phosphamide courbe rouge Les r sultats sont consid r s statistiquement significatifs p lt 0 05 Les valeurs obtenues avec la condition contr le est d crite par la courbe verte Lorsque les levures sont expos es a des dilutions de m langes binaires CIP TAM ou ternaires CTC de mol cules figure 43 on ne constate pas de modification de l activit des r cepteurs pour ce qui est du potentiel agoniste des m dicaments Bien que l exposition aux m langes des trois mol cules la dilution de 102 10 mg L de chaque mol cule en m lange semble entrainer un tr s l ger effet agoniste la valeur mesur e n est pas significative Elle est n anmoins moins lev e que celle mesur e lors de l exposition des levures au tamoxif ne seul A B 50 0 lt 5a dihydrotestosterone CIP TAM CTC Flutamide CIP TAM CTC 40 0 2 z m a a 8 30 0 4 a n c A 2 20 3 100 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 1 0E 10 1 0E 08 1 0E 06 1 0E 04 1 0E 02 1 0 Concentration g L Concentration g L Figure 43 Evaluation du potentiel agoniste A et antagoniste B sur les r cepteurs androg niques hAR YAS apr s l exposition de levures S cerevisiae des m langes binaires CIP TAM courbe bleue et ternaires CTC courbe marron Les r sultats sont consid r s statistiquement significatives p lt 0 05 Les valeurs obtenues avec la
357. pper and carbendazim copper to the nematode Caenorhabditis elegans Environ Toxicol Chem 2004 23 1529 37 Jonker MJ Svendsen C Bedaux JJM Bongers M Kammenga JE Significance testing for synergistic antagonistic dose level dependent or dose ration dependent effects in mixture dose response analysis Environ Toxicol Chem 2005 24 10 2701 13 Jordan VC Koerner S Tamoxifen ICI 46 474 and the human carcinoma 8S oestrogen receptor Eur J Cancer 1975 11 205 6 Kanuri M Minko IG Nechev LV Harris TM Harris CM Lloyd RS Error prone translesion synthesis past gamma hydroxypropano deoxyguanosine the primary acrolein derived adduct in mammalian cells J Biol Chem 2002 277 18257 65 Karthikeyan KG Meyer MT Occurrence of antibiotics in wastewater treatment facilities in Wisconsin USA Sci Total Environ 2006 361 196 207 Kerbusch T de Kraker J Keizer HJ van Putten JW Groen HJ Jansen RL et al Clinical phar macokinetics and pharmacodynamics of ifosfamide and its metabolites Clin Pharmacokinet 2001 40 41 62 Kolpin DW Furlong ET Meyer MT Thurman EM Zaugg SD Barber LB et al Pharmaceu ticals hormones and other organic wastewater contaminants in U S streams 1999 2000 a national reconnaissance Environ Sci Technol 2002 36 1202 11 Kuemmerer K Steger Hartmann T Meyer M Biodegradability of the anti tumour agent ifosfamide and its occurrence in hospital effluents and communal sewage Water Res 1997 31 2705 10 Lindberg R J
358. pr s 72 h d exposition 136 R sultats amp Discussion Partie 2 IV 2 Evaluation de la viabilit des cellules mammaires MCF 7 Les r sultats de la viabilit cellulaire obtenus avec les cellules MCF 7 sont repris dans la figure 61 Les valeurs sont exprim es en m diane de 18 points de mesures 3 s ries ind pendantes de 8 points de mesure Aucune toxicit n est observ e ni apr s 24 h ni apr s 72 h d exposition des cellules A B 120 120 110 110 2 100 L 4 100 h 4 rf m 5 I rt i a gt 3 90 90 80 80 control Ni N2 N D1 O02 DB 1 2 3 contol N1 N2 N3 D1 D2 D3 Jf 32 J3 November December January November December January Samples Samples Figure 61 Taux de viabilit de cellule mammaires MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement IV Analyse du potentiel perturbateur endocrinien sur les r cepteurs cestrogeniques hERa et androg niques hAR test YES YAS Des cultures de levures de Saccharomyces cerevisiae ont t exp
359. pure et 5 yL du m lange r actionnel suivant 100 pCi de y P ATP pr alablement s ch s 2 ul de tampon bicine 0 32 uL de polynucl otides kinase T4 10 UI uL 2 68 uL d H20 ultra pure Apr s une heure d incubation la totalit du volume r actionnel est compl t jusqu 300 uL par de l eau ultra pure soit 282 uL puis 3 uL sont pr lev s et d pos s sur une plaque de PEl cellulose de 18 cm de long Celle ci est mise migrer 1h30 dans du tampon a 250 mM de NH4 2SO4 et 40 mM de NaH2PO4 La plaque est ensuite s ch e expos e 40 min temp rature ambiante puis autoradiographi e 1 5 4 c 4 5 Test d efficacit de l enrichissement Les gouttes r siduelles restantes dans le tube de marquage apr s d p t sur la plaque sont dilu es dans 50 uL d eau ultra pure Cinq uL de ce m lange est pr lev et d pos sur une plaque de PEI cellulose de 18 cm de long Celle ci est mise migrer 1h30 dans du tampon 250 mM de 77 Mat riels amp M thodes NH4 2SO4 et 40 mM de NaH2PO4 La plaque est ensuite s ch e expos e 40 min temp rature ambiante puis autoradiographi e Ce test permet de savoir si l hydrolysat d ADN a bien t enrichi en adduits par le traitement avec la nucl ase P1 qui catalyse la d phosphorylation en 3 des nucl otides normaux Ceux ci ne sont plus des substrats de la polynucl otide kinase et ne doivent donc pas tre marqu s au 3P pendant le marquage des adduits l ADN Su
360. que de post marquage au P et de 1 adduit 10 nucl otides par la technique dite AC MS Accelerator Mass Spectrometry utilisant un acc l rateur de particules La technique de post marquage au 3P est aujourd hui largement r pandue pour la d tection et la caract risation d adduits l ADN form s par de nombreux canc rog nes allant des compos s aromatiques aux compos s aliphatiques Phillips 1997 Elle est exploit e en tant que biomarqueur dosim trique de l exposition a des polluants environnementaux Pfohl Leszkowicz 1994 On peut citer par exemple le suivi de la g notoxicit chez plusieurs esp ces aquatiques expos es une mar e noire suite au naufrage de l Erika en 1999 au large des c tes bretonnes Amat et al 2005 2006 Cette technique est r alis partir d ADN isol extraction purification o toute traces d ARN et de prot ines pouvant entrainer des art facts ont t limin s Gupta 1993 L ADN est tout d abord hydrolys en nucl osides 3 monophosphate puis s en suit une tape dite d enrichissement la nucl ase P1 afin de ne garder que les nucl osides 3 P modifi s Cette tape d enrichissement permet d liminer les nucl otides normaux en les convertissant en nucl osides Les nucl otides adduit s poss dant un phosphate du c t 3 vont ainsi tre les seuls substrats de la T4 polynucl otide kinase du phage T4 qui a pour propri t de transf rer un phosphate radioacti
361. qui r v le un effet s apparentant une interaction additive entre les mol cules toutes les autres conditions des m langes entrainent des effets antagonistes ratios E O lt 1 On observe aussi que les courbes CIP TAM et CTC d crivent globalement la m me tendance et que le m lange CTC condition 5 entraine un effet antagoniste marqu E O proche de 0 5 De mani re g n rale on observe a partir du tableau 9 que les plus faibles concentrations conditions 1 m lang es entres elles CIP TAM CTC induisent une toxicit plus importante que celle attendue par les calculs tandis qu elle est chaque fois beaucoup moins importante pour les autres conditions On notera tout de m me que seule la toxicit attendue et observ e des concentrations de la condition 5 du m lange CIP TAM sont elles quasiment identiques On constate que le TAM modifie la r ponse du CIP seule puisque l inhibition est plus importante lors de l exposition au m lange binaire compar l exposition la CIP seule De plus on peut souligner que l ajout de faibles doses de CP en m lange induit des r ponses variables elles aussi La comparaison des conditions 1 2 et 3 ne permet pas de mettre en vidence de diff rences significatives entre les m langes CIP TAM et CTC tandis que l ajout de CP dans les conditions 4 et 5 entraine un antagonisme d autant plus prononc que les concentrations augmentent 94 Cell viability R sultats
362. r Selon la norme AFNOR NF XP T 90 337 1996 Substance MgsO 7H 0 KNO Ca NO 4H 0 KH PO EDTA femque H BO MnSO 7H 0 ZnSO TH O CuSO 5H 0 OH MoO 4H 0 NH VO CrK SO 12H 0 NiSO 7H 0 Co NO 6H 0 Na Mo0 2H 0 TiOSO 4H 0 Rajustement du pH St rilisation Concentration Milieu ee vi mg L 2 gp debase ka 123 3 xx 4932 493 2 101 1 20 5 055 505 5 118 x10 11 800 1 180 0 68 X100 680 68 0 346 x1w 34 6 3 46 286 xww 286 2 86 15 5 x1000 155 1 55 22 n 22 0 22 0 79 7 0 79 0 079 128 i 1 28 0 128 2 296 i 2 296 0 229 6 0 96 7 0 96 0 096 0 4785 f 0 4785 0 047 9 0 493 i 0 493 0 049 3 01794 01794 0 017 94 02416 o 0 241 6 0 024 16 nL nL Solution 1 DD DD Ww amp KF NY WwW Rajuster le pH des milieux de culture et d essai 5 5 0 5 au moyen de NaOH ou de HCI Passer sur un filtre ouvertures de 0 22 um Concentration de la substance dans le milieu pr par Milieu nutritif concentre prepare immediatement avant emploi Les milieux de culture et d essai sont constitu s 10 de milieu nutritif concentre et 90 d eau distill e ou d une eau de qualit equvalente 189 Annexes 190 Annexes m Protocole simplifi du test YES YAS tir du manuel d utilisation fournit par la soci t xenometrix Jour 1 vendredi matin culture des levures Ajouter dans le flacon de milieu basal les 4 solutions de vitamines 7 as pa acide L
363. r ponse des organismes et d autre part de comparer des r sultats obtenus notamment surdiff rents polluants et entre diff rents laboratoires Taub 1989 Volatier 2004 Cl ment 2006 Ils r pondent au mieux aux crit res de r p tabilit reproductibilit fiabilit et robustesse en plus de leur facilit de r alisation du faible investissement n cessaire pour leur mise en place de leur co t mod r ainsi que de leur capacit pr dire les effets d une grande vari t de substances sur des organismes diff rents Toutefois ils ne permettent pas de r v ler une toxicit ou un m canisme cellulaire sp cifique L utilit des essais mono sp cifiques pour caract riser les substances ou les matrices complexes vis vis de leurs caract ristiques cotoxiques intrins ques n est plus prouver Ils s av rent essentiels l obtention d informations sur les concentrations d une substance ou d une matrice et les dur es d exposition qui induisent des effets sur la mortalit la reproduction la physiologie ou encore le comportement d un organisme Cairns Jr 1983 Chaque esp ce a ses propres sensibilit s Toutefois le mythe du bioessai universellement sensible a tous les polluants est aujourd hui abandonn Cairns Jr 1986 et les bioessais sont le plus souvent associ s pour former des batteries de bioessais Elles permettent alors de r aliser le screening le plus complet du potentiel toxique de la
364. r N Geret F Castillo L Faucet Marquis V Albasi C Pfohl Leszkowicz A 2014 In vitro tests aiding ecological risk assessment of ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface water Environment International 63 191 200 McLellan RA Drobitch RK Monshouwer M Renton KW 1996 Fluoroquinolone antibiotics inhibit cytochrome P450 mediated microsomal drug metabolism in rat and human Drug Metab Dispos 24 1134 1138 Mersch Sundermann V Knasm ller S Wu X J Darroudi F Kassie F 2004 Use of a human derived liver cell line for the detection of cytoprotective antigenotoxic and cogenotoxic agents Toxicology 198 329 340 Miao X S Bishay F Chen M Metcalfe CD 2004 Occurrence of Antimicrobials in the Final Effluents of Wastewater Treatment Plants in Canada Environmental Sci Techno 38 3533 3541 Negreira N L pez de Alda M Barcel D 2013 On line solid phase extraction liquid chromatography tandem mass spectrometry for the determination of 17 cytostatics and metabolites in waste surface and ground water samples J Chromatogr A 1280 64 74 Negreira N Mastroianni N Lopez de Alda M Barcel D 2013 Multianalyte determination of 24 cytostatics and metabolites by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry and study of their stability and optimum storage conditions in aqueous solution Talanta 116 290 299 John Wiley amp Sons Inc
365. r Research and Clinical Oncology 131 120 128 Breder C D Dewitt D L Kraig R P 1995 Characterization of an inducible cyclooxygenase in rat brain Journal of Comp Neurology 355 296 415 Brown K Heydon R T Jukes R White I N Martin E A 1999 Further characterisation of the DNA adducts formed in rat liver after the administration of tamoxifen N desmethyltamoxifen or N N didesmethyltamoxifen Carcinogenesis 20 2011 2016 Buser H R Muller M D Theobald N 1998 Occurrence of the Pharmaceutical Drug Clofibric Acid and the Herbicide Mecoprop in Various Swiss Lakes and in the North Sea Environmental Science Technology 32 1998 188 192 Bulich A A 1979 Use of luminescent bacteria for determining toxicity in aquatic environment Aquatic Toxicology Philadelphia American Society for Testing and Materials 98 Bulich A A 1986 Bioluminescenceassays Toxicity Testing Using Microorganisms 57 74 Burgeot T Bocqu n G Porte C Dimeet J Santella R M Garcia de la Parra L M Pfohl Leszkowicz A Raoux C Galgani F 1996 Bioindicators of pollutant exposure in the northwestern mediterranean sea Marine Ecology Program 131 125 141 Burlinson B Tice R R Speit G Agurell E Brendler Schwaab S Y Collins A R Escobar P Honma M Kumaravel T S Nakajima M Sasaki Y F Thybaud V Uno Y Vasquez M Hartmann A 2007 Fourth International Workgroup on Genotoxicity testing res
366. r l apparition de mutations ponctuelles et initier des processus de canc rogen se La formation d adduits aux prot ines peut galement entra ner une n crose tissulaire ou des ph nom nes d allergies Dansette et al 1998 1 1 1 Les mono oxyg nase cytochrome P450 I1 1 1 a Localisation et distribution Les cytochromes P450 CYP constituent une superfamille de 57 g nes codant des enzymes qui m tabolisent des substances endog nes st ro des eicosano des vitamines etc mais galement un grand nombre de m dicaments Ces enzymes jouent un r le majeur dans le m tabolisme des x nobiotiques dont les m dicaments et ont un r le primordial dans la protection de l organisme contre les agressions ext rieures polluants pesticides etc Parmi un grand nombre de r actions possible la plus importante est l hydroxylation Les CYPs sont pr sents essentiellement au niveau h patique mais on peut galement les retrouver en quantit non n gligeable dans les reins zone corticale les poumons l intestin la peau le cerveau la vessie les glandes surr nales etc De Waziers et al 1990 Tr daniel et al 1995 Hukkanen 2000 Leur activit est d pendante du g notype et de l environnement Hietanen et al 1997 et les propri t s catalytiques d oxydation et de r duction varient en fonction de la nature de leur partie prot ique apoprot ine Il existe aussi une distribution diff rente des cytochromes P450
367. r le film d autoradiographie les bases de l ADN ne doivent tre que d une tr s faible intensit 1 5 4 5 S paration des adduits par chromatographies bidimensionnelles sur couche mince PEl cellulose Plusieurs chromatographies figure 23 sur des plaques de PEI cellulose sont n cessaires afin de s parer les adduits selon leurs propri t s chromatographiques selon l ordre suivant A D p t des chantillons et purification des adduits Dimension 1 A l extr mit de chacune des plaques de cellulose de 18 cm x 13 cm est agraf un papier Whatman n 1 de 20 cm de longueur Chaque plaque est pr vue pour recevoir six d pdts d chantillons espac s entre eux de 2 cm La migration dure 16 h dans du phosphate monosodique 3 M pH 5 7 pour la s paration des adduits Ce solvant ne permet pas la migration des adduits qui tant hydrophobes restent au point de d p t Par contre l exc s d ATP et les nucl otides normaux sont limin s Une fois la migration termin e la bande de papier est jet e et la plaque est lav e deux fois 5 min dans de l eau distill e sous agitation Une autoradiographie des plaques 20 min en salle obscure r v lation rin age a l eau distill e fixation et rin age l eau distill e permet de v rifier la puret de l chantillon B Transfert et migration bidimensionnelle pour la s paration des adduits Dimension 2 Cette tape permet de transf rer le d p t sur une plaque de
368. r les cellules HepG2 V 2 Analyse des cassures l ADN sur cellules mammaires MCF 7 Les cellules humaines mammaires MCF 7 ont t expos es pendant 24 h 72 h diff rents chantillons d eaux us es ou trait es L valuation des cassures l ADN sont pr sent s dans la figure 65 Les valeurs sont exprim es en moyenne de 6 points de mesures 3 s ries en double On constate que l exposition des cellules n entraine jamais la formation de cassure l ADN quel que soit le temps d exposition et quel que soit le pr l vement A B 20 i j f i i i j j i j f i control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 November December January November December January Samples Samples Figure 65 Taux de cassures l ADN induites sur les cellules mammaires MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e deSTEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 141 R sultats amp Discussion Partie 2 VI Analyse de la formation d adduits l ADN sur cellules humaines technique du post marquage au P VI 1 Analyse des adduits l ADN form s sur les cellules h patiques HepG2 L exposition des cellules HePG2 aux diff rents effluents en
369. r qui deviennent alors le support du travail de l analyse La radioactivit des plaques est scann e sur Bioimager Typhoon puis la quantification des spots radioactifs correspondant aux adduits de l autoradiogramme est r alis e grace au logiciel Ambis CSP incorporation Billerica USA 1 5 4 c Protocole 1 5 4 c 1 Extraction de l ADN Cette tape consiste casser les membranes des cellules afin de lib rer l ADN des noyaux L extraction se fait froid dans de la glace pour limiter l activit des DNAses cellulaires et ainsi pr server l int grit de l ADN Pour ce faire 3 flasques de cellules correspondant au m me traitement sont plong es dans un bac de glace pour figer l tat cellulaire et viter la d gradation de l ADN Le tapis cellulaire est gratt deux fois avec des grattoirs dans 4 mL de SET NaCl 5 M EDTA 0 4 M TRIS 2 M pH 8 Les fractions contenant les cellules des trois boites sont r colt es dans un tube de 50 mL et centrifug es 10 min 4 C 2400 rpm Sigma 3k10 Le surnageant est limin et le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans 700 uL de SET a 4 C puis transvas dans un micro tube de 2 mL Cent uL de SDS 20 sont ajout s l chantillon qui est ensuite incub 10 min 65 C pour casser les membranes Les prot ines sont alors pr cipit es par ajout de 800 uL d ac tate de potassium 6 M pH 5 pendant 30 min dans la glace L chantillon est centrifug 25 min
370. r simplifier la d marche exp rimentale Dans ce sens nous avons choisi d valuer de la toxicit respective de la ciprofloxacine CIP du tamoxif ne TAM et du cyclophosphamide CP puis la toxicit de m langes ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et finalement la toxicit de m lange des trois mol cules ensemble CTC Mol cules CIP 0 01 0 1 1 10 100 TAM 0 01 0 1 0 5 1 10 CP 0 01 0 1 0 5 1 10 1 2 3 4 5 M langes binaires concentration ug L CIP 0 01 0 1 1 10 100 TAM 0 01 0 1 0 5 1 10 M langes ternaires concentration ug L CIP 0 01 0 1 1 10 100 TAM 0 01 0 1 0 5 1 10 CP 0 01 0 1 0 5 1 10 Tableau 6 Gammes de concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide utilis es respectivement ou en m lange pour l tude 40 Synth se bibliographique Les m langes ne sont pas dans tous les cas constitu s de parts gales de m dicament En effet la CIP est retrouv e a des concentrations au moins 10 fois plus lev es dans les eaux us es hospitali res et 2 fois plus dans les stations d puration par rapport au TAM et au CP Ces donn es s expliquent notamment par une large utilisation de cet antibiotique en milieu hospitalier pour viter les infections pouvant survenir lors de la chimioth rapie Les conditions 4 et 5 des m langes s apparentent aux concentrations retrouv es dans les effluents hospitaliers
371. ra pure B effluents hospitaliers C effluents d entr e de STEP D eaux en sortie de STEP 142 R sultats amp Discussion Partie 2 500 400 o S xx 5 a T 2 300 2 I S S a 200 es p h 8 rH S 100 TD D lt 0 control N1 N2 N3 D1 D2 D3 J1 J2 J3 November December January Samples Figure 67 Nombre d adduits l ADN form s par 10 nucl otides dans des cellules h patiques HepG2 expos es 24 h a diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en moyennes et sont consid r es statistiquement significatifs p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement L volution de la g notoxicit entre la sortie d h pital et la sortie de STEP est comparable pour chaque mois de pr l vement une augmentation p lt 0 01 de la toxicit depuis l h pital jusqu la station d puration puis un abattement de celle ci apr s traitement biologique VI 2 Analyse des adduits l ADN form s sur les cellules mammaires MCF 7 Tout comme pour les cellules h patiques l analyse des r sultats mettent en vidence la formation 24 h de plusieurs adduits l
372. rations test es 10 ng L 10 ug L l exposition des cellules des glandes mammaires chaque mol cule n entraine pas de cassures l ADN quel que soit le temps d exposition figure 46 M me l exposition une dose 10 fois plus concentr e de ciprofloxacine 100 ug L n induit pas de cassures A B 25 CIP TAM CTC CIP TAM CTC 20 H 0 1 2 3 CONDITIONS CONDITIONS Figure 47 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules humaines de glandes mammaires MCF7 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM gris et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC blanc Les r sultats sont exprim s en m dianes et les valeurs consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 Concernant l exposition des cellules mammaires MCF 7 aux diff rents types de m langes binaire ou ternaire aucune cassure l ADN significativement diff rente de la condition contr le de l ADN n a t observ e et ce quel que soit le temps d exposition figure 47 II 3 Analyse de la formation d adduits l ADN sur cellules humaine h patiques et mammaires technique du post marquage au P Dans notre tude nous avons valu la g notoxicit par la mesure des adduits encombrants Les r sultats quantitatifs obtenus a partir de la technique de post marquage au 22P sont exprim s en
373. re les m langes CIP TAM et CTC M langes de Sondikon mol cules 1 2 3 4 5 CIP TAMat 2 14 4 39 5 51 5 71 7 07 CIP TAMobs 8 77 1 14 6 41 1 17 5 14 1 95 8 44 0 58 8 46 0 72 CTC att 2 14 4 39 5 51 5 71 7 07 CT Cobs 2 70 0 7 2 82 2 19 2 82 1 08 8 12 0 91 4 61 1 24 Tableau 13 Comparaison entre les valeurs additives du nombre d adduits attendus et ceux observ s avec des cellules mammaires MCF 7 expos es pendant 24 h des m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC 113 R sultats amp Discussion Partie 1 Concernant l exposition des cellules HepG2 a des concentrations croissantes des trois mol cules en m lange on constate la formation d un seul adduit l ADN dont les caract ristiques correspondent l adduit 1 figure 48 D Dans ce cas de figure nous avons un effet d antagonisme puisque l adduit 2 n est plus form et que globalement le taux d adduits est bien plus faible que lors de l exposition au TAM seul figure 50 Mais on peut tout de m me noter que les valeurs absolues d adduits form s semblent d crire une r ponse l g rement dose d pendante avec un nombre d adduits form s par les fortes doses condition 5 significativement plus important p lt 0 05 que les faibles doses condition 1 On peut galement constater les conditions 1 et 2 des m langes CTC induisent significativement moins p
374. rganismes non cibles faune et flore confondus Cette premi re partie est consacr e l analyse compar e de la viabilit d organismes procaryotes et eucaryotes expos s de faibles doses de m dicaments en solution Plusieurs bioessais dont certains sont standardis s et largement utilis s dans l valuation de la qualit de l eau ont t s lectionn s pour caract riser l impact de trois m dicaments selon qu ils soient seuls ou en m langes en solution De plus contrairement l approche de base qui est g n ralement utilis e en cotoxicologie et qui permet le calcul de la concentration efficace m diane ECs50 nous avons choisi de suivre l approche du test de comparaison ou d inhibition pour l ensemble des tests utilis s Cette deuxi me approche moins courante consiste comparer des mesures de la toxicit de plusieurs chantillons dont la toxicit respective est trop faible pour calculer les ECso Elle permet dans notre cas de comparer directement la sensibilit des essais et biomarqueurs entre eux et d appr hender les effets toxiques et interactions pouvant tre induits par des doses environnementales de m dicaments ou des effluents bruts hosptaliers ou urbains 87 R sultats amp Discussion Partie 1 I 1 Evaluation de la bioluminescence de la bact rie V fischeri Microtox A l heure actuelle de nombreuses tudes utilisent le test Microtox pour valuer la toxicit aig e d un o
375. rnaires des cassures l ADN significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 apparaissent quelle que soit la condition test e et quel que soit le temps d exposition figure 45 Les cassures l ADN sont plus importantes apr s 24 h d exposition qu apr s 72 h aussi bien pour l exposition au m lange binaire CIP TAM que ternaire CTC On constate un ph nom ne de potentialisation entre ciprofloxacine et tamoxif ne par contre les concentrations n ont que peu d influence 109 R sultats amp Discussion Partie 1 A B 25 25 CIP TAM CTC CIP TAM CTC 20 15 4 10 4 li 5 4 0 2 CONDITIONS CONDITIONS Figure 45 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules h patiques humaine HepG2 expos es 24 h A et 72 h B a diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC Les r sultats sont exprim s en m dianes et les valeurs consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 On constate galement que la formation des cassures ADN sont dose d pendantes lorsque les cellules sont expos es aux trois mol cules en m lange Ces cassures sont significativement plus importantes p lt 0 01 que celles induites par les m langes de CIP TAM Bien que globalement le nombre de cassures ADN diminue avec le temp
376. roduit obtenu Dans la plupart des cas ceci permet de faciliter l limination du compos initial par l ajout de groupements polaires Une tape de conjugaison vient ventuellement parachever ce m canisme de d toxication initi par le CYP 23 Synth se bibliographique strog nes Acides biliaires Progest rone Cholest rol Neurost roides Eicosanoides St roides surr naliens C tones Vitamine D Endocrinologie M tabolisme Cytochromes P450 Pharmacologie Toxicologie 5 environnementale Pesticides Th rapeutique Carcinogen se Polluants Polymorphismes Interactions m dicamenteuses Conception de m dicaments Activation mutag ne Produits naturels Procarcinog nes Figure 3 Implications physiologiques et physiopathologiques des cytochromes P450 Gueguen et al 2006 Les mono oxyg nases cytochrome P450 CYP sont essentielles dans les ph nom nes de biotransformation de substances physiologiques st ro des acides biliaires vitamine D acides gras prostanglandines leucotri nes r tinoides amines biog nes etc tableau 3 Les CYPs des familles 1 4 sont localis s dans le foie et peuvent tre impliqu s dans la phase du m tabolisme des m dicaments et d autres compos s trangers l organisme bien que leur r le premier soit la m tabolisation des substances endog nes Les proportions des diff rents CYPs au niveau du foie sont connues le CYP3A4 20 50 le CYP2
377. rs Environmental Toxicology Chemistry 23 945 952 Perry R Kang Y Greaves B 1995 Effects of tamoxifen on growth and apoptosis estrogen dependent and independent human breast cancer cells Annals of Surgical Oncology 2 238 245 Persoone G 1997 Development and first validation of a stock culture free algal microbiotest the Algaltoxkit Wells P G et al Ed 1997 Microscale testing in aquatic toxicology advances techniques and practice Persoone G Marsalek B Blinova l Torokne A Zarina D Manusadzianas L Nalecz Jawecki G Tofan L Stepanova N Tothova L Kolar B 2003 A practical and user friendly toxicity classification system with microbiotests for natural waters and wastewaters Environmental Toxicology 18 395 402 Petrovic M Ginebreda A Acu a V Batalla R J Elosegi A Guasch H De Alda M L Marc R Mu oz l Navarro Ortega A Navarro E Vericat D Sabater S Barcelo D 2012 Combined scenarios ofchemical and ecological quality under water scarcity inMediterranean rivers TrAC Trends in Analytical Chemistry 30 8 1269 1278 Pfohl Leszkowicz A 1994 D tection des adduits l ADN comme biomarqueurs d exposition aux canc rog nes de l environnement Analysis magazine 22 1 12 15 Pfohl Leszkowicz A 2008 Formation persistence and significance of DNA adduct formation in relation to some pollutants from a broad perspective Advance in Toxicolo
378. rt elements PLoS ONE 6 1 7 Kolpin D W Furlong E Meyer M Thurman E M Zaugg S 2002 Pharmaceuticals hormones and other organic wastewater contaminants in U S streams 1999 2000 a national reconnaissance Environmental Science amp Technology 36 6 1202 1211 K mmerer K 2005 Pharmaceuticals in the Environment 2nd ed Springer Verlag K mmerer K Henninger A 2003 Promoting resistance by the emission of antibiotics from hospitals and households into effluent Clinical Microbiology and Infection 9 1203 1214 K mmerer K 2001 Drugs in the environment emission of drugs diagnostic aids and disinfectants into wastewater by hospitals in relation to other sources a review Chemosphere 45 6 7 957 969 K mmerer K Meyer M Steger Hartmann T 1997 Biodegradability of the anti tumour agent fosfamide and its occurrence in hospital effluents and communal sewage Water Research 31 2705 2710 Lafaurie M Narbonne J F Galgani F 1992 Indicateurs biochimiques de contamination de l environnement marin Analysis Magazine 20 27 33 Lagadic L Caquet T Amiard J C Ramade F 1997 Biomarqueurs en cotoxicologie Aspects fondamentaux Masson Paris Lange R Hutchinson T H Croudace C P Siegmund F Schweinfuryh H Hampe P Panter G H Sumpter J P 2001 Effects of the synthetic estrogen 17 alpha ethinylestradiol on the life cycle of the fathead minnow Pimephales promela
379. rtant de souligner que les effluent ne sont pas toujours agonistes et antagonistes la fois et qu ils n interagissent pas forc ment non plus sur les deux types de r cepteurs en m me temps C est le cas par exemple avec les effluents hospitaliers qui n induisent 148 R sultats amp Discussion Partie 2 pas de toxicit en Novembre N1 induit un antagonisme en D cembre D1 alors qu on observe un effet agoniste en Janvier J1 A l inverse les effluents de sortie de STEP N3 D3 et J3 n ont aucun effet perturbateur androg nique ind pendamment de la p riode de pr l vement Bien que ce test mette en vidence des activit es de perturbation endocrienne de certains effluents il est important de souligner que les r sultats sont tr s difficiles a interpr ter et qu ils ne permettent de suivre concr tement un abattement de la toxicit L analyse faite ici ne permet pas en l tat actuel de conclure sur un risque potentiel vis a vis d organismes qui pourraient tre expos s a long terme a de tels polluants Pour ce qui est du test des com tes les taux de cassures les plus importants n exc dent pas 12 mais on n anmoins on observe un abattement de la toxicit depuis les effluents en entr e de STEP jusqu leur rejet dans l environnement On observe galement une diminution de la g notoxicit au niveau des cellules h patiques a 72 h qui peut s expliquer par la mise en place des m canismes de
380. rtants en termes d antibiotiques d hormone ou encore d antiparasitaire 1 2 Rappel sur les traitements de chimioth rapie Dans le monde entier le nombre de cancers d pist s est en constante progression entrainant une importante augmentation des traitements Ces traitements sont la chimioth rapie et la radioth rapie qui peuvent tre utilis es ou non en combinaison La chimioth rapie est r alis e l aide d un grand nombre de m dicaments anticanc reux ayant des propri t s toxiques pour les cellules Ces mol cules cytostatiques peuvent agir sur l inhibition de la croissance cellulaire ou directement tuer celles ci mais de mani re non s lective entre les cellules saines ou tumorales La plupart des agents antin oplasiques ont des propri t s cytotoxiques mutag niques carcinog niques embryotoxiques et ou t ratog niques Durant les traitements de chimioth rapie ces m dicaments sont limin s via les urines et les f ces des patients en grande partie sous leur forme initiale ou m tabolis e Il existe aujourd hui plus de 50 m dicaments utilis s en routine en chimioth rapie dans les h pitaux des pays d velopp s administr s dans 80 des cas par voie intraveineuse et 20 par voie orale Il est toutefois important de souligner que la majorit de ces m dicaments sont administr s dans les services ambulatoires le reste tant donn aux patients hospitalis s BMA 2006 Par ailleurs la demande en tr
381. s PIAGET Sonsini a xiii Liste dos OURS Se en i ee de eo ee BP Oe Mae Ur eter Ur Ue lar d neeene XX Loe des Tablica ninrin nan xxviii CON ADO cerir a AA AEA AT xxxxii Introduction G n rale 1 Synth se bibliographique 7 I Pr sentation du cadre de l tude 9 1 1 Usage et consommation des produits pharmaceutiques en Europe sssssssssssssu 9 1 2 Rappel sur les traitements de chimioth rapie scccseseeseeeeseeeseeeeseeeeenens 10 LS Les effluents hosphaliers is sineissarsansennesaceniannnianrnanntes 11 Bs Ac TE EE Le Re Me 11 1 3 2 Substances susceptibles d tre l origine de la toxicit 12 Se LS WRIA ES Sn nn e 13 FN LES tTesINectante ir sceapivdeiedcivaed N E 14 326 Les r sidus erica ris RB ss seca sseccaadpdsceesecesacsatchapianessaosaonrneciantenespaatinescasunens 15 1 4 Probl matique des compos s pharmaceutiques dans l environnement 15 1 4 1 Pr sence dans les stations d puration 15 1 4 2 Pr sence dans l environnement iii 16 RS CO an a a da en Get en ann 18 145 4 R sistances aux ATION QUES occ cede ssacoroonesdenanmsenenerneenendenrninndt 19 LAS PorurDatons Gn OCnnleni Nes eseese ae 19 CRE PR CURTIN PRIE E D RP ET DE E E E 20 Il M tabolisation des x nobiotiques et canc rog n se 20 11 1 M tabolisation des x nobiotiques dans l organisme 2
382. s Environmental Toxicology Chemistry 20 1216 1227 Lavou J B gin D G rin M 2002 La substitution des solvants par les nettoyants aqueux Led graissage des m taux IRSST Universit de Montr al Bilans de connaissances Rapport B 064 Montr al 138p Lawrence J W Darkin Rattray S Xie F Neims A H Rowe T C 1993 4 Quinolones cause a selective loss of mitochondrial DNA from mouse L1210 leukemia cells Journal of Cellular Biochemistry 51 165 174 Le Corre K S Ort C Kateley D Allen B Escher B I Keller J 2012 Consumption based approach for assessing the contributionof hospitals towards the load of pharmaceutical residues in municipalwastewater Environment International 45 99 111 Lefebvre E 2008 En France les bact ries r sistent mieux que les antibiotiques Les Echos n 11 01 08 pp 17 Le Perchec P Richard M 1994 Les mol cules de la beaut de l hygi ne et de la protection Uneintroduction a la science cosm tologique Editions C Paris Nathan 144p Leprat P 1998 Les rejets liquides hospitaliers quels agents et quelles solutions techniques In Sant etenvironnement hospitalier les Assises Nationales QUALIBO 1998 Caen 10 13 Leprat P 1999 Caract ristiques et impacts des rejets liquides hospitaliers Techniques hospitali res 634 56 57 L mi re S 2004 Int r t du test des com tes pour l valuation de la g notoxicit environnementale Th
383. s aides soignantes technicien de surface etc soit par l eau de boisson soit encore de mani re ponctuelle par les eaux de baignades par exemple Les cellules h patiques ont t choisies car elles comportent tous les syst mes de m tabolisation CYP P450 glucuroconjugaison etc qui permettent de refl ter ce qui se passe dans l organisme Les cellules des glandes mammaires sont quant elles un mod le de choix pour mimer un effet perturbateur endocrinien Elles poss dent les r cepteurs aux strog nes et la mesure de la viabilit est le reflet de cette activit D autre part d un point de vue m tabolique elles sont pauvres en CYP P450 l exception des CYP1A1 et CYP1B1 qui sont inductibles dans ces cellules et qui n existent pas dans les cellules h patiques Les cellules MCF 7 expriment aussi les aromatases permettant sp cifiquement la m tabolisation des strog nes des NADP quinones r ductase impliqu es dans la m tabolisation des cat chols form s partir des strog nes Ces cellules sont aussi riches en cyclooxyg nase aussi appel prostaglandines synth tase 117 TESTS DE VIABILITE Microtox toxicit aigu Algaltox F toxicit chronique Lemna minor toxicit chronique Viabilit cellulaire MTS toxicit aigu et chronique H patique HepG2 Mammaire MCF 7 Commentaires L activit antimicrobienne de CIP peut expliquer
384. s effets aigus et chroniques iii 119 Tableau 17 Nomenclature des chantillons d effluents cccccccccccessssscscccscesssscesecsseesessseesecsseesesssesseeseseneaasaeees 132 Tableau 18 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de bioessais refl tant les effets aigus et Chroniques sida eee ne UE ina E Buteutgees EA A EE 146 Tableau 19 Comparaison des r sultats obtenus via l utilisation de biomarqueurs de g notoxicit refl tant les ffets aigus t ChFONIQUES 11h oii cacietin dans sd re dea rene VaddaseccuddestdvaBucsud dade std eudealedcddesbadveds odrddete died 147 Tableau 20 Concentration des principaux m dicaments recherch s dans les effluents hospitalier et les effluents en entr e et sortie de STEP de la ville de G rone Espagne pendant les trois mois CONS CUTIS rss rare tele ruse A dedans diese ed tel E A a a dite die dates da baba Obst ened AA Re eee A ia 146 XXX XXxi Communications xxxii xxxiii Communications Publications Nicolas Mater 1 Mater N G ret F Castillo L Marquis Faucet V Albasi C Pfohl Leszkowiz A 2014 In vitro tests aiding ecological risk assessment of ciprofloxacin tamoxifen and cyclophosphamide in range of concentrations released in hospital wastewater and surface water Environment International 63 191 200 Mater N Faucet Marquis F Rodriguez Mozaz S Albasi C Pfohl Leszkowicz A 2014 Genotoxicity assessment in human cell lines exposed t
385. s formald hyde glutarald hyde etc qui peuvent r agir avec les acides nucl iques et les groupements amines des prot ines de structure et de fonction d naturer les glycoprot ines de surface inhiber les fonctions enzymatiques et nucl iques des cellules Les diald hydes peuvent galement induire la formation deponts entre acides amin s et rigidifier les structures prot iques aboutissant une perte de leur activit biologique Rihn et al 2001 L acide perac tique de plus en plus utilis dans les h pitaux et qui tend remplacer le glutarald hyde Il n existe pratiquement pas l tat pur et se pr sente sous forme de solution aqueuse en m lange avec l acide ac tique et le peroxyde d hydrog ne Bonnard et al 2001 Parmi les d sinfectants utilis s de fa on restreinte on peut citer Les produits base d alcool m lang avec de l eau Gr ce l eau l alcool franchit les parois de la cellule et p n tre dans les bact ries o il d nature les prot ines cytoplasmiques et membranaires induit ainsi une inhibition des fonctions enzymatiques une alt ration des membranes et entra ne une coagulation cytoplasmique qui tue la bact rie Rihn et al 2001 Les d riv s iod s halog n s qui agissent en oxydant les acides amin s aromatiques des prot ines induisant une inhibition de certaines enzymes et une modification des prot ines structurelles Russell amp Hugo 2004 Les sels ammoni
386. s from the GEPARTRIO study Annals of Oncology 19 292 298 Moldovan Z 2006 Occurrences of pharmaceutical and personal care products as micropollutants in rivers from Romania Chemosphere 64 11 1808 1817 Monks T J Anders M W Dekant W Stevens J L Lau S S Van Bladeren P J 1990 Glutathione conjugate mediated toxicities Toxicology and Applied Pharmacology 106 1 19 176 Bibliographie Moore M J 1991 Clinical pharmacokinetics of cyclophosphamide Clinical Pharmacokinetics 20 194 Mosmann T 1983 Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays Journal of Immunology Methods 65 55 63 Mourato L L Beland F A Marques M M 1999 32P postlabeling of N deoxyguanosin 8 ylharylamine adducts a comparative study of labeling efficiencies Chemical Research in Toxicology 12 661 669 Mugford C A Kedderis G L 1998 Sex dependent metabolism of xenobiotics Drug Metabolism Reviews 30 441 498 N Nacci D E Cayula S Jackim E 1996 Detection of DNA damage in individual cells from marine organisms using the single cell gel assay Aquatic Toxicology 35 3 4 197 210 Nash J P Kime D E Van der Ven L T M Wester P W Brion F Maack G Stahlschmidt Allner P Tyler C R 2004 Long Term Exposure to Environmental Concentrations of the PharmaceuticalEthynylestradiol Causes Reproductive Failure in Fish Environmental Healt
387. s on peut noter l aussi une r ponse de g notoxicit diff rente compar e une exposition au tamoxif ne seul En effet les conditions 1 2 3 et 4 des m langes CTC induisent peu ou pas de formation d adduits l ADN tandis que l exposition des cellules la condition 5 aboutit un taux d adduits plus de dix fois sup rieure 116 R sultats amp Discussion Partie 1 DISCUSSION Le but de ce chapitre tait de s lectionner un ou plusieurs bioessais ou biomarqueurs qui permettraient de caract riser un effluent et de suivre son puration Nous nous sommes int ress a trois m dicaments fr quemment utilis s dans les protocoles anticanc reux et faisant partie de classes de m dicaments diff rentes la ciprofloxacine un antibiotique ayant des propri t s anticanc reuses par elle m me le tamoxif ne un r gulateur endocrinien qui est un m dicament de choix en hormonoth rapie le cyclophosphamide un agent alkylant utilis en chimioth rapie dans une majorit de cancers Les tests choisis refl tent soit un effet toxique aigu Microtox et viabilit cellulaire 24 h soit un effet toxique chronique Algaltox F Lemna viabilit cellulaire 72 h L impact des substances sur la viabilit des organismes fait suite un effet biologique pr coce pouvant tre une alt ration du statut hormonal ou une alt ration du patrimoine g n tique Le test YES YAS peut tre consid r comme un biomarqueur sig
388. s telles que les eaux de surface ont d tre aussi consid r es Cette question environnementale occupe aujourd hui une large place dans les pr occupations de la soci t Une enqu te command e par le CNRS fin 1999 sur les attentes du public vis vis de la science a permis de constater que le th me de la maladie venait en premi re position parmi les questions qui int ressaient le plus de personnes et que les th mes relatifs l environnement occupaient tr s largement la seconde place Boy amp cheveign 2000 R pondant la demande soci tale de nombreuses mesures l gislatives et r glementaires ont t adopt es en particulier dans les pays d velopp s et des agences sp cialis es ont t charg es d en assurer la mise en uvre ainsi que le suivi Dans ce contexte le r le des scientifiques est de contribuer r pondre la demande soci tale en fournissant des outils pour pouvoir mettre en uvre les lois et les r glements existants dans le cadre d une ing nierie cologique mais aussi en agissant en tant qu expert dans les instances de gestion et de d cision pour communiquer sur les volutions scientifiques et techniques qui permettront d am liorer les d marches visant la protection des milieux naturels et de la sant de l homme Au cours de cette tude nous avons pu constater partir du nombre important de donn es g n r es que la mise en place d une batterie de tests n cessit
389. s and LS174T Cells Drug Metab Disp 36 946 954 Santos LHLML Gros M Rodriguez Mozaz S Delarue Matos C Penas A Barcelo D Montenegro MCBSM 2013 Contribution of hospital effluents to the load of pharmaceuticals in urban wastewaters Identification of ecologically relevant pharmaceuticals Sci Total Environ 461 462 302 316 Scripture CD Sparreboom A Figg WD 2005 Modulation of cytochrome P450 activity implications for cancer therapy Lancet Oncol 6 780 789 Shibutani S Shaw PM Suzuki N Dasaraghi L Duffel MW Terashima 1998 Sulfation of alpha hydroxytamoxifen catalyzed by human hydroxysteroid sulfotransferase results in tamoxifen DNA adducts Carcinogenesis 19 11 2007 2011 Shibutani S Suzuki N Laxmi YRS Schild LJ Divi RL Grollman AP Poirier MC 2003 Identification of Tamoxifen DNA Adducts in Monkeys Treated with Tamoxifen Cancer Res 63 4402 4406 Singh NP McCoy MT Tice RR Schneider EL 1988 A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells Experimental Cell Res 175 184 191 Sridar C Kent UM Notley LM Gillam EM Hollenberg PF 2002 Effect of tamoxifen on the enzymatic activity of human cytochrome CYP2B6 JPharmacol Experim Therapeutics 301 945 952 Thomas KV Hilton MJ 2004 The occurrence of selected human pharmaceutical compounds in UK estuaries Mar Pollut Bull 49 436 444 Tice RR Agurell E Anderson D Burlinson B Hartmann A Kobayashi H Miyamae Y Rojas E
390. s d exposition apr s 72 h la g notoxicit restent significativement plus lev e avec l exposition aux m langes ternaires CTC par rapport aux m langes binaires p lt 0 01 figure45 B La cyclophosphamide a un r le de potentialisation 1 2 2 Analyse des cassures l ADN sur cellules mammaires MCF 7 La formation de cassures l ADN a aussi t valu e sur les cellules MCF 7 expos es 24 h et 72 h de faibles doses de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide Les r sultats pr sent s dans les figures 46 et 47 sont exprim s en valeurs m dianes de 8 mesures 4 s ries ind pendantes r alis es en duplicata A B 25 25 aCIP BTAM mCP ocIP HB TAM BCP 20 20 15 15 10 10 5 5 i T e On CON CHE METEEN 0 E y T T T T 1 0 T T T T T Og 1 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Concentration ug L Figure 46 Taux de cassures l ADN induites sur des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP blanc tamoxif ne TAM gris et cyclophosphamide CP noir Les r sultats sont exprim s en m dianes et les valeurs consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 110 Tail DNA R sultats amp Discussion Partie 1 25 20 Dans la gamme de concent
391. s du matin dans lesquels les doses de m dicaments seront le plus lev es Les effluents en entr e de STEP point 2 ont t pr lev s dans la foul e le m me jour distance courte de 9 km entre les points d chantillonnages Apr s un temps de r sidence effectif de 27 h le troisi me pr l vement s est fait en sortie de STEP point 3 Le but de cet chantillonnage est de caract riser la fois l volution de la toxicit des effluents dans le temps mais galement valuer efficacit puratoire de la STEP Le mat riel utilis le mode op ratoire de pr l vement et de pr paration des chantillons sont d crits dans les travaux de quantification des contaminants dans leau r alis par Ferrando Climent et al 2012 2013 Bri vement des bouteilles en verre ambr es et pr rinc es avec de l eau milliQ ont t utilis es pour l chantillonnage Les effluents bruts ont t imm diatement filtr s sur filtre millipore 1 um puis 0 45 um afin d liminer les mati res en suspensions et autre d chets parasites Les chantillons ont t stock s dans des r cipients en poly thyl ne terephtalate PET puis conserv s congel s 20 C pendant une p riode de un mois maximum FDA 2011 Concernant l exposition des organismes dans nos essais les volumes des chantillons utilis s sont en accord avec les proc dures pr vues dans les essais standardis s Outre le test Microtox pour lequel le volume d ef
392. s in vivo et sur culture d h patocytes Gambacoa et al 2007 Schild et al 2003 En pr sence de CIP nous n avons qu un seul adduit mais de nature diff rente montrant bien qu il y a eu une d viation des voies de m tabolisation L inhibition de la voie CYP3A4 par la CIP peut avoir favorise la formation de 4 OH TAM pouvant aussi g n rer un adduit 122 R sultats amp Discussion Partie 1 Ciprofloxacine 4 LK ae K y 7 Na a s Sy x INTERACTIONS ee eee eee eu eee eus ee es ms ee Inhibe CYP 2B6 Active CYP 3A Cyclophosphamide a Tamoxif ne CYP 344 CYP 206 CYP 286 CYP 3A4 CYP 286 CYP 3A5 286 209 2019 3A FO OU Metabolites Chioroacetaldenyde Acrolein a hydroxy TAM N desm thyl TAM 4 hydroxy TAM primares M taboltes secondares CYP CYP3A CYP3A CYP 2B6 CYP 3A CYP3A 9 4 hydroxy CP RRN P NH OH Moutarde a hydroxy N didesm thyl TAM Endoxifen 3 4 dihydroxy TAM phosphoramide N desm thyt TAM Figure 55 Sch ma possible d interaction entre les mol cules en m lange au niveau des diff rentes voies de m tabolisation propos partir des voies de m tabolisation du cyclophosphamide mis en vidence par Huang et al 2000 et celle du tamoxif ne par Desta et al 2004 Les deux mol cules tant prises en charge par les sulfotransf rases en plus de l interf rence sur les CYP il y a galement comp tition entre elles pour les sulfotransf rases L
393. s joue un r le pr pond rant dans l induction de la toxicit Ceci est flagrant dans l analyse des adduits o l on constate clairement que les profils d adduits sont diff rents entre les lign es cellulaires qui ne poss dent pas le m me patrimoine enzymatique La m tabolisation conduit plusieurs m tabolites potentiellement g notoxiques l origine de la formation d adduits de nature diff rente D autre part la modulation du profil des adduits avec les m langes est li e aux interactions des mol cules sur les voies de m tabolisation des unes et ou des autres En effet nos mol cules ne sont pharmacologiquement actives qu apr s m tabolisation Lors de cette m tabolisation plusieurs formes chimiques interm diaires sont form es Bien qu elles n aient pas d activit pharmacologique elles peuvent n anmoins avoir une activit biologique sur des organismes non cibles La ciprofloxacine est m tabolis e en quatre m tabolites identifi s et dont la majorit 75 est excr t e dans les urines la des thylciprofloxacine la sulfociprofloxacine l oxociprofloxacine et la formylciprofloxacine voir figure 9 Bien que les voies de m tabolisation aboutissant la formation de ces mol cules soient mal connues elles pr sentent toutes des activit s antimicrobiennes de par leur forte r activit Le tamoxif ne doit tre m tabolis par les cytochromes P450 pour induire des effets hormonaux via des m tabolites an
394. s mL and the density of each replicate was measured at 670 nm after 72 h using a spectrophotometer Average of specific growth and percentage of inhibition for each concentration were calcu lated by comparison with standard condition Test validity criteria required algal growth in control flasks to increase by a factor of 16 with in the 72 h test period and pH not to have varied by more than 1 5 units relative to the initial pH in the growth medium The reference chemical 194 N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 potassium dichromate K2Cr207 was employed as a positive control to ensure the validity of the test method 2 7 Microtox assay Vibrio fischeri Microtox Reagent V fischeri NRRL B 11177 from AZUR Environ mental Carlsbad CA USA was reconstituted and bacteria were cultured harvested and frozen in cryoprotectant Bioluminescence inhibition was evaluated using the basic test protocol and was determined at 5 15 and 30 min intervals Azur Environmental 1998 The thawed bacterial suspension was used for the toxicity tests The number of viable bacteria in the photobacterial luminescence inhi bition tests was 10 bacteria per mL of test solution and the toxicity testing was performed at 15 C The measurements were made by using a 1253 Luminometer Labsystems Helsinki Finland connected to a personal computer and the calculation of inhibitory was performed by means of standard software Lab
395. s par le syst me social de sant francais et distribu s parmi la population frangaise Coetsier et al 2009 Il s agit tr s certainement d une valeur minimale puisqu il ne s agit que des traitements ambulatoires Une des particularit s de ce compos est qu il peut agir comme un anti cestrog ne agent inhibiteur par comp titivit au niveau des r cepteurs strog niques dans les tissus mammaires mais galement comme un strog ne agent stimulateur au sein du m tabolisme du cholest rol de la densit osseuse et de la prolif ration cellulaire des cellules pith liales de l ut rus chez les mammif res Coezy et al 1982 Jordan amp Koerner 1975 Willson et al 1994 De par sa capacit modifier l expression des g nes strog ne d pendants le tamoxif ne induit une modification des m canismes cellulaires en entrainant notamment une diminution de l activit de l ADN polym rase une alt ration de l utilisation des thymidines et surtout un blocage du signal strog nique Mais du fait de la g n ralisation de son utilisation la communaut scientifique commence toutefois porter une attention particuli re sur ses effets d l t res au niveau h patique puisque des cas de st atoses h patiques cirrhoses et infiltrations graisseuses h patiques ont t report s chez des patients trait s avec ce m dicament Albukhari et al 2009 De plus des tudes utilisant des cellules ne poss dant pas de r
396. s with concentrations of several hundred ng L Karthikeyan and Meyer 2006 Kolpin et al 2002 Miao et al 2004 Higher concentrations up to 150 ug L were even reported in the effluents from hospitals Martins et al 2008 A B ST 0 Ci7HisFN303 MM 331 34 g mol C16H19NO MM 371 515 g mol The application of bioassays is an important approach for investigat ing the causal relationship between exposure to environmental pollut ants and the effects on individuals and populations For example some microalgae are known to be highly sensitive to the contamination of aquatic environments Eguchi et al 2004 Algae play an important role in the equilibrium of aquatic systems where they are involved in nutrient cycling and O production They therefore form the base of many aquatic food chains consequently death of algae will impact aquatic life They are considered indicators of bioactivity such as indus trial waste and vary in response to a variety of toxicants Ma et al 2006 and reflect chronic aquatic toxicity On the other hand Microtox reflects acute aquatic toxicity The use of a battery of bioassays in field monitoring has been increas ing over the past 15 years Orias and Perrodin 2013 Genotoxicity biomarkers are now considered to be an integral part of this approach because exposure to genotoxic agents may exert damage beyond that of individuals and may be detected through several generations Frenzilli et al
397. same nature Only small qualitative differences between exposure to Hospital effluents and WWTP inflow can be observed except a significantly higher amount of adduct 2 and the formation of adduct 6 after WWTP inflow exposure In contrast the DNA adduct pattern was qualitatively different when the cells were exposed to WWTP outflow For example the DNA adducts 3 4 disappeared and new adducts were formed John Wiley amp Sons Inc Page 10 of 42 Page 11 of 42 J O O1 BR D 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 Environmental and Molecular Mutagenesis adducts 7 8 9 10 Quantitatively exposure of hepatic cells HepG2 to hospital effluents induced a significant amount of DNA adducts reaching more than 200 adducts 10 nucleotides figure 9 A higher genotoxic effect p lt 0 01 was observed when HepG2 cells were exposed to the WWTP inflow sample more than 300 adducts 10 nucleotides Exposure to WWTP outflow induced a significant DNA adducts formation p lt 0 01 compared to control but significantly less p lt 0 01 compared to the two other samples about 120 adduct adducts 10 nucleotides DNA adduct formation in mammary cells MCF7 exposed to water effluents In MCF 7 cells two to seven individual DNA adducts numbered 1 2 6 11
398. se SEVAB 285p Martins N Pereira R Abrantes N Pereira J Gon alves F Marques C R 2012 Ecotoxicological effects of ciprofloxacin on freshwater species data integration and derivation of toxicity thresholds for risk assessment Ecotoxicology 21 1167 1176 Martins A F Vasconcelos T G Henriques D M Frank C S K nig A K mmerer K 2008 Concentration of Ciprofloxacin in Brazilian Hospital Effluent and Preliminary Risk Assessment A Case Study CLEAN Soil Air Water 36 264 269 Mayfield C I 1993 2 Microbial Systems In Calow P Handbook of ecotoxicology London Blackwell scientific publications 1 9 27 McLellan R A Drobitch R K Monshouwer M Renton K W 1996 Fluoroquinolone antibiotics inhibit cytochrome P450 mediated microsomal drug metabolism in rat and human Drug Metababolism Disposition 24 1134 1138 McMurray C T Tainer J A 2003 Cancer cadmium and genome integrity Nature Genetics 34 239 241 Mersch Sundermann V Knasmuller S Wu X j Darroudi F and Kassie F 2004 Use of a human derived liver cell line for the detection of cytoprotective antigenotoxic and cogenotoxic agents Toxicology 198 329 340 Metcalfe C D Miao X C Koenig B G Struger J 2009 Distribution of acidic and neutral drugs in surface waters near sewage treatment plants in the lower Great Lakes Canada Environmental Toxicology and Chemistry 22 12 2881 2889 Michaud
399. siste a mesurer la densit cellulaire apr s 72 h d exposition a plusieurs dilutions de l chantillon L incubation des algues est effectu e dans un syst me statique sans renouvellement et dans des conditions de temp rature et de lumi re contr l es Les r ponses mesur es int grent les effets de toutes les composantes chimiques physiques et biologiques de l chantillon pouvant affecter le potentiel de croissance de l organisme et r v lant ainsi leur toxicit vis a vis des v g taux aquatiques L inhibition de la croissance de l algue P subcapitata 3 s ries en duplicata expos e de la ciprofloxacine du tamoxif ne et du cyclophosphamide est pr sent e dans la figure 26 Un contr le positif utilisant du dichromate de potassium K2Cr2O7 a t fait pour v rifier le bon tat physiologique des algues avant le test donn es non pr sent es inhibition gt 95 Le contr le n gatif pr sent dans les figures suivantes correpond aux algues n ayant pas re u de traitement 30 CIP amp TAM mCP 20 10 0 4 AS 10 Growth inhibition control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 Concentration ug L Figure 26 Inhibition de la croissance d algues P subcapitata expos es 72 h a diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP blanc tamoxif ne TAM gris et cyclophosphamide CP noir Les r sultats sont exprim s en valeurs moyennes et sont consid r es stat
400. sition et avec diff rents tests L application d une telle batterie de tests des chantillons environnementaux permet de qualifier les effluents et de suivre l efficacit de moyens d puration A terme son application pourrait permettre de mieux appr hender les risques co toxiques associ s aux rejets de m dicaments dans l environnement et pouvant tre l origine de cancer secondaire chez l Homme Mots cl s Ciprofloxacine Tamoxif ne Cyclophosphamide Effluents hospitaliers Bioessais Biomarqueurs G notoxicit Adduits al ADN Horm se Abstract In Europe cancers rate is constantly raising which explain the increase in treatments They are usually chemotherapy and radiotherapy alone or combine Chemotherapy is done with anticancer drugs with toxic characteristics on cells After administer the treatments to the patients some of the drugs are excreted in significant proportion and released in hospital and communal effluents Even though a lot of the compounds are either removed by adsorption or bio degradation in waste water treatment plant WWTP some of their are not are directly released in the environment and represent a toxic risk for aquatic organisms and the Human health Despite low concentrations ng L ug L few data are available about the ecotoxicological impact The importance of chemical compounds pollutants especially anticancer drugs are a real concern because the metabolites of the
401. sque font partie des grandes pr occupations actuelles Vindimian 2006 La directive 2000 60 CE du parlement europ en et du conseil du 23 Octobre 2000 tablit un cadre pour une politique communautaire dans le domaine de l eau Elle vise entre autre au maintien et l am lioration de l environnement aquatique Pour ce faire les Etats membres ont pour objectif de parvenir au minimum un bon tat cologique des eaux et lorsque ce bon tat est d j assur il doit tre maintenu Aujourd hui la protection et la surveillance des milieux s appuient largement sur les m thodes de l cotoxicologie et la d finition de normes de qualit environnementale NQE Ces normes sont la base de la r glementation des rejets de l valuation de la qualit chimique des milieux et deleur surveillance impos e par la Directive Cadre Europ enne sur l Eau DCE La mise en uvre de cette DCE met en vidence la n cessit d une science pr dictive de l impact des substances chimiques qui s appuie non seulement sur les m canismes d action biotique et abiotique des produits chimiques mais qui s int resse galement la diversit biologique et la r alit du fonctionnement des cosyst mes Ce faisant la DCE ignore encore toute une cat gorie d outils biologiques comme les biomarqueurs qui sont des indicateurs pr coces et sensibles capables de r v ler l exposition et ou la d gradation de la sant d organismes suite une pollu
402. sses th rapeutiques ont t d tect s a des concentrations pouvant aller du nanogramme par litre eaux superficielles douces ou marines eaux souterraines eaux de boisson jusqu au microgramme par litre dans les effluents et les eaux r siduaires avec des variations spatio temporelles d pendant des activit s anthropiques Heberer 2002 Gros et al 2006 Ces r sidus s ajoutent aux nombreuses substances non m dicamenteuses li es aux activit s humaines et galement pr sentes dans l environnement telles que les produits phytosanitaires d tergents hydrocarbures m taux etc Parmi les principales sources de contamination des eaux superficielles on peut citer principalement les effluents domestiques mais galement les effluents hospitaliers ou encore les usines de fabrication et de conditionnement des m dicaments Besse amp Garric 2007 On peut toutefois noter que la situation est tr s in gale selon les pays et qu elle d pend de leur d veloppement socio conomique de l acc s de leurs populations aux soins ou encore de leurs r glementations Le tableau 2 regroupe quelques compos s parmi ceux le plus souvent retrouv s dans l environnement Groupe Produits pharmaceutiques Oflaxacin Chlort tracycline Oxyt tracycline Streptomycine Flum quine Lincomycine Ciprofloxacine Trometoprim Penicilline Antibiotiques Lincomycine Amoxycilline Spiramycine Azithromycine Clarithromycine Erythromycine
403. ssessment Sci Total Environ 430 109 118 Wong C Chen S 2012 The development application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifene and aromatase inhibitor resistance J Steroid Biochem Molecular Biology 131 83 92 Wenzel SDA Schafers C Vollmer G Michna H Diel P K ln DS Weg C D 2001 Research efforts towards the development and validation of a test method for the identification of endocrine disrupting chemicals Contract 6 000015 WHO World Health Organisation 1999 Safe Management of Wastes from Health Care Activities World Health Organisation Geneva Williams Brown MY Salih SM Xu X Veenstra TD Saeed M Theiler SK Diaz Arrastia CR Salama SA 2011 The effect of tamoxifen and raloxifene on estrogen metabolism and endometrial cancer risk J Steroid Biochem Molecular Biology 126 78 86 Wong C Chen S 2012 The development application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance J Steroid Biochem Molecular Biology 131 3 5 83 92 Xie H J Griskevicius L Broberg U Lundgren S Carlens S Meurling L Paul C Rane A Hassan M 2003 Alteration of pharmacokinetics of cyclophosphamide and suppression of the cytochrome P450 genes by ciprofloxacin Bone Marrow Transplant 31 197 203 Yusuf AT Vian L Sabatier R Cano JP 2000 In vitro detection of indirect acting genotoxins in the comet assay using HeP G2 cells Mutation Research 468 227 2
404. synergy was observed whereas for higher concentrations a dose dependent decrease of DNA adducts occurred Low doses of CIP TAM induced two folds more DNA adducts p lt 0 01 compared to highest doses Simultaneous exposure to increasing concentrations of the three drugs CIP TAM CP lead to formation to only one adduct corresponding to the adduct 1 The DNA adducts formation was dose dependent when the three drugs are present In ternary exposure CP has an antagonist effect on DNA adducts formation John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 Environmental and Molecular Mutagenesis compared to binary exposure DNA adducts are three folds higher when cells are exposed to 10 ng L TAM 10 ng L CIP p lt 0 01 compared to 10 ng L CP 10 ng L TAM 10 ng L CIP p lt 0 05 condition 1 DNA adducts analysis on mammary cell MCF 7 Exposure of human mammary cells MCF 7 to CIP and CP whatever the concentrations did not induce any DNA adducts In contrast TAM induces formation of one individual adduct numbered 4 An example of DNA adducts patterns obtained after exposure of MCF 7 cells is given figure 5 non monotone dose effect relation U shape form was observed when MCF 7 cells are exposed to TAM alon
405. systems Helsinki Finland A basic test was also conducted with the reference standard phenol for each fresh vial of bacteria opened to ensure the validity of the test method 2 8 Statistical analysis All experiments were independently performed three times under the same conditions and results were calculated in median values with standard deviation SD As the distribution of cell viability and SCGE assays deviated from normality data following the Kruskal Wallis test a non parametric analog of the Dunnett s procedure for multiple comparisons was used Values were considered significant at p lt 0 05 and at p lt 0 01 The statistical significance of values from standardized bioassays microtox algaltoxkit F was checked using a one way analysis of variance ANOVA test using Statistica 9 0 package software Post hoc comparisons between control and samples were made using Fisher s test to determine which values significantly differed at p lt 0 05 2 9 Interaction analysis To address the interaction of binary CIP TAM or ternary mixtures CIP TAM CP the effects were compared to the expect ed effects that were calculated from single compound toxicity obtained in the same experiments The two reference model of concentration addition CA and the independent action IA were used to derive patterns of joint effects of mixture Chou 2006 2011 If the interaction is strictly additive 1 E Ca x 1
406. t peroxydase de la COX repr sente les cas les plus importants dans la cellule Elle sert d enzyme d activation m tabolique en compl ment ou en remplacement des mono oxyg nases a cytochromes P450 dans des r actions de bioactivation in vivo Degen 1993 Un certain nombre de compos s chimiques peuvent tre oxyd s soit directement par la peroxydase de la COX soit par des radicaux peroxyl s g n r s lors de la r action de cette enzyme Par exemple plusieurs amines aromatiques ou ph nols tels que les cestrog nes st ro diens ou encore l hydroquinone m tabolite du benz ne sont oxyd s in vitro par les peroxydases Degen et al 1982 Schlosser et al 1990 Ces m tabolites peuvent r agir avec des prot ines et des acides nucl iques et induire des effets d l t res sur la cellule l origine de cancers Ce type de m canisme a t mis en vidence au laboratoire avec une toxine alimentaire l Ochratoxine A Pinelli et al 1999 Manderville amp Pfohl Leszkowicz 2008 L implication de ces enzymes dans la m tabolisation peut jouer un r le pr pond rant dans l apparition de cancer C est le cas notamment de la surexpression de la COX2 qui semble tre impliqu e dans la formation de certains cancers comme celui du colon Prescott amp Fitzpatrick 2000 ou des voies urinaires Williams et al 1999 Khan et al 2000 Majima et al 2003 L implication des COX2 dans le processus de canc rogen se se ferait soit en r
407. t de dioxan e Peu soluble dans Ether thylique Ac tone Log Kow 0 63 6 3 1 74 pKa 12 78 8 76 5 76 Chimiquement stable pour de Chimiquement stable a forte RAES longue p riode 28 jours 4 C concentration mg L pour une 7 Instable en solution alcaline pH gt 9 11 p riode maximum de 60 jours a 20 C M tabolites actifs Acrol ine moutardes phorpohramide et nor azot e a hydroxytamoxif ne N desmethyl tamoxif ne 4 hydroxytamoxif ne Des thylcirpofoxacine oxofloxacine sulfociprofloxacine formylciprofloxacine 1 3 3 6 La ciprofloxacine La ciprofloxacine est un antibiotique de la classe des fluoroquinolones qui peut tre administr par voie orale intraveineuse ou topique Son utilisation prophylactique est en autre recommand e en pr vention des fi vres et infections survenant apr s chimioth rapie pour le traitement des cancers de l ovaire du sein Minckoitz et al 2008 et du SCLC Small Cell Lung Cancer Tjan Heijnen et al 1999 Il est aussi couramment utilis pour traiter la pneumonie les infections des voies urinaires certaines maladies sexuellement transmissibles ou encore des intoxications l anthrax De plus son 33 Synth se bibliographique potentiel th rapeutique en tant qu agent anticanc reux a t d termin ces derni res ann es et est utilis d sormais dans le traitement du cancer de la vessie par exemple Kamat et al 19
408. t well documented and it is not possible to conclude on their long term effects on non target organisms Until today ecotoxicological effects have been assessed by standardized tests or by non specific in vitro as says Such a test however may not suitable for anticancer drugs Zounkova et al 2010 Tools to characterize the drug removal process efficiency and to assess the impact of these pollutants on aquatic life and human health must be further developed and refined The aim of this paper was to compare potential biomarkers sensitive enough for toxic evaluation of low doses of drugs found in hospital efflu ents river or drinking water We selected three compounds ciproflox acin CIP cyclophosphamide CP tamoxifen TAM Fig 1 frequently used in cancer treatment and found at low doses in hospital wastewater municipal wastewater treatment plants WWTPs and surface water Hartmann et al 1998 Thomas and Hilton 2004 Zuccato et al 2005 Cyclophosphamide CP is primarily used as an anticancer chemotherapeutic but is also used as an immunosuppressive agent in several treatments of arthritis interstitial pneumonia etc or during organ transplantation Tamoxifen TAM is a selective estrogen receptor modulator used in breast cancer treatment which acts as an antagonist competitor in the a ER1 estrogen receptor mammary tissues and like an agonist competitor in cholesterol metabolism Coezy et al 1982 Jordan and Koerner 1975
409. t 24h A contr le B cellules expos es au TAM C cellules expos es aux m langes CIP TAM D cellules expos es aux m langes CTC 112 Nombres d adduits l ADN par 10 nucl otides form s dans les cellules h patiques HepG2 expos es 24 h diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP tamoxif ne TAM et cyclophosphamide CP iii 112 Nombre d adduits l ADN par 109 nucl otides form s dans les cellules h patiques HepG2 expos es 24 h diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC 113 Exemple de Profils d adduits l ADN de cellules mammaires MCF 7 expos es a diff rentes conditions pendant 24h A contr le B cellules expos es au TAM C cellules expos es aux m langes CIP TAM D cellules expos es aux m langes CTC srl else lent ft nas chen ht nee martial 114 Taux d adduits l ADN par 10 nucl otides form s chez des cellules mammaires MCF 7 expos es 24 h a diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP tamoxif ne TAM et cyclophosphamide CP rennes 115 Taux d adduits l ADN par 109 nucl otides form s dans les cellules mammaires MCF 7 expos es 24 h diff rentes m langes de ciprofloxacine tamoxif ne CIP TAM et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide CTC 115
410. t al 2008 Negreira et al 2013a 2013b Rowney et al 2009 Although environmental concentrations are below human therapeutic doses the persistent release of these drugs may lead to chronic effects at low concentration Mass fluxes alone are insufficient to evaluate the risk stemming from pharmaceuticals their ecotoxic potential needs to be considered Despite recent large efforts to increase the database on ecotoxicological effects of pharmaceuticals PhACT Database 2006 the implications of chronic low dose exposure of aquatic fauna and humans to environ mental discharge of these drugs remain largely unknown Crane et al 2006 The lack of chronic toxicity data for drugs hinders the ability to predict effects In addition using only physico chemical analysis it is impossible to predict the toxic and or genotoxic properties of complex Comparison between expected additive values and results obtained in percentage from HepG2 cell exposed during 24 h A and 72 h B to CIP TAM and CTC E O is the ratio between expected values E compared to observed values 0 Drugs in mixture Condition 1 2 3 4 5 A CIP TAM 91 52 2 39 94 64 1 51 93 97 0 96 91 67 1 09 90 23 0 80 CIP TAMexp 85 71 90 88 90 35 88 34 83 43 E O 0 94 0 96 0 96 0 96 0 92 CTC 98 57 142 99 34 1 10 98 44 0 73 97 28 1 21 94 52 0 87 CTCexp 84 04 90 91 89 84 87 14 80 94 E O 0 85 0 92 0 91 0 90 0 86 B CIP TAM 83 9
411. t des oncog nes c est dire qu ils contribuent au passage des cellules d un ph notype normal un ph notype canc reux 31 Synth se bibliographique La perturbation de ces g nes engendre la diff renciation la croissance et la coordination cellulaire anarchique qui caract risent les cellules canc reuses Les g nes suppresseurs de tumeur n activent pas la prolif ration cellulaire mais au contraire l inhibent L un d eux le g ne P53 codant la prot ine p53 joue un r le important dans la r gulation du cycle cellulaire ainsi que dans le contr le de la r plication de l ADN et de la diff rentiation cellulaire figure 6 ALT RATION DU G NOME G S v po v G Cycle division g P 53 NORMAL cellulaire P53 MUT M Bloque la division cellulaire Poursuite du cycle cellulaire VW lt Py se Accumulation d alt rations apoptose 990000009000 Reprise du cycle CANCEROGENESE cellulaire normal R paration Figure 6 Implication du g ne P53 dans la mise en place de la canc rog n se 11 3 3 Mol cules pharmaceutiques retenues pour l tude Au cours de l tude nous avons choisi de retenir trois classes de mol cules pharmaceutiques afin de repr senter de mani re pertinente l tat actuel de la contamination des milieux aquatiques De par leurs caract ristiques chimiques intrins ques ainsi que leur pr sence r currente dans l environnement ces m dicaments
412. t mis en vidence la modulation de l expression de prot ines pro et anti apoptotiques familles de prot ines bcl 2 et p53 des cellules MCF 7 expos es a de fortes doses de cyclophosphamide ce qui pourrait expliquer la toxicit observ ici A B 105 105 100 mn oe 95 95 90 90 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS CONDITIONS Figure 37 Taux de survie des cellules mammaires humaine MCF 7 expos es 24 h A et 72 h B a diff rentes concentrations de m lange de ciprofloxacine tamoxif ne m et ciprofloxacine tamoxif ne cyclophosphamide X Les r sultats sont exprim s en m dianes et les valeurs sont consid r es statistiquement significatives a p lt 0 05 et p lt 0 01 Les cellules ont ensuite t expos es aux diff rents m langes Quel que soit le temps d exposition des cellules ou les doses des m langes aucune r ponse de toxicit n est observ e dans la gamme des concentrations test es figure 37 Tout comme cela a t fait pour les cellules h patiques HepG2 les interactions entre les mol cules m langes binaires ou ternaires ont t calcul es a partir de la toxicit respective de chaque mol cule sur les cellules mammaires MCF 7 Les mod les de r f rence d addition des concentrations CA et de l action ind pendante IA ont t utilis s pour tirer les mod les des effets conjugu s en m lange figure 38 Les valeurs des effets observ s compar s aux effets atten
413. tant d croissant entre la p riode 1 Novembre et la p riode 2 D cembre cause de la diminution des 131 R sultats amp Discussion Partie 2 traitements administr s on peut supposer un abattement de la toxicit A l inverse la reprise des activit s des services oncologiques lors de la p riode 3 Janvier devrait induire une toxicit plus marqu e du fait de la pr sence plus grande quantit et diversit de m dicaments rejet s dans les effluents compar a la p riode 2 En effet l analyse physico chimique r alis e par l quipe espagnole permet tout d abord de mettre en vidence que les concentrations de m dicaments mesur es dans les effluents sont plus faibles en aval de la STEP mais galement que celles ci sont plus faibles au mois de D cembre tableau 18 Ces r sultats laissent a penser le profil de toxicit des chantillons pourrait tre diff rents pour le mois de D cembre Par ailleurs on constate que parmi les m dicaments d tect s la ciprofloxacine le tamoxif ne et le cyclophosphamide sont pr sents dans les diff rents types d eflluents analys s ce qui conforte la pertinence des mol cules retenues dans la partie 1 des travaux de th se La nomenclature des chantillons analys s est pr sent e au travers de la figure 57 et du tableau 17 H pital Station d puration Figure 57 Repr sentation sch matique de la zone d chantillonnage
414. te t appliqu e a des effluents bruts hospitaliers station d puration pour en valuer le potentiel g no toxique Des chantillons proximit de l h pital de G rone Espagne ont t pr lev s en sortie de l h pital en entr e et en sortie de station d puration pendant trois mois cons cutifs Plusieurs effets de toxicit ont t observ s sur les mod les d tude comme notamment I apparition de ph nom nes d horm ses sur la viabilit des cellules h patiques expos e au tamoxif ne et la ciprofloxacine seuls ou en m lange Le m me sch ma est observ pour les m langes avec le test Microtox D autre part l exposition respective des cellules h patiques et mammaires aux m dicaments n entra ne pas de cassures de l ADN et entraine l apparition d adduits seulement avec le tamoxif ne alors qu on note une augmentation dose d pendant des cassures et des adduits 1 ADN apr s exposition aux m langes De m me une r ponse positive est observ e avec le test Algaltox F Concernant les effluents les effets d pendent la fois du type d organisme et du temps d exposition Les tests Microtox Algaltox F et le post marquage des adduits l ADN sont apparus tre les pertinents pour l analyse Les interactions observ es entre les compos s mettent en avant la n cessit d valuer les effets des contaminants petites doses en m langes plusieurs temps d expo
415. te of HepG2 cells exposed to CIP TAM CTC x during 24 h A to 72 h B The numbers 0 5 refer to the mixture condition described in the M amp M part Table 1 Results are expressed as median value SD of the percentage of viable cells compared to control condition 0 Statistically significant at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell even after 72 h the amount of DNA damages observed when the cells are exposed to the three drugs is significantly higher p lt 0 01 com pared to treatment with CIP TAM Fig 6B and compared to control 3 3 Growth inhibition of microalgae S capricornutum TAM significantly p lt 0 05 stimulated the growth of microalgae Fig 7 CIP has no effect on microalgae The dose effect induced by CP exhibited a U shape form With the lowest dose a slight but significant inhibition of algae growth was observed p lt 0 05 the highest CP dose tested induced a proliferation When microalgae were exposed to the mixture CIP TAM or CTC whatever the exposure time the algae growth was dose dependently inhibited Fig 8 There is no difference between exposure to binary mixture CIP TAM compared to mixture of the three drugs 3 4 Extinction of bioluminescence of bacteria V fischeri Except with CIP at the highest dose 100 ug L none of these drugs inhibited V fischeri bioluminescence Fig 9 In contrast exposure of bacteria to the mixture induced a non monot
416. tement LT v Culot cellulaire a a Pal Ensemencement des boites Ajout du milieu de culture F l mL de suspension cell 14 mL de milieu Suspension cellulaire Figure 16 Sch ma g n ral de culture de cellules 1 5 1 b 4 Conservation d une lign e cellulaire Les cellules a confluence d une flasque sont d coll es par trypsination addition de 3 mL de trypsine 1 X pour les cellules HepG2 et de 3 mL de trypsine 0 5 X pour les cellules MCF 7 elles sont culott es par centrifugation 10 min 4 C 2400 rpm Sigma 3k10 puis le culot est remis en suspension dans 1 mL de milieu de cong lation Le milieu de cong lation est compos comme suit il s agit de milieu de culture sans antibiotiques suppl ment avec 10 DMSO et 40 SVF Le mL de milieu de cong lation contenant les cellules est dispos dans des tubes cryog niques NALGENE plac une nuit 80C dans une boite de cryocong lation puis conserv dans l azote liquide 67 Mat riels amp M thodes 1 5 1 6 5 Conditions de traitement des cellules Quel que soit le type cellulaire les traitements ont t effectu s avec un milieu suppl ment avec 5 de s rum de veau foetal et 1 de p nicilline streptomycine 1 L glutamine L int grit des cellules est valu e avant chaque traitement par m thode d exclusion au bleu de Trypan Une partie des cellules cultiv es sont aliquot es apr s trypsination et centrifugation puis resusp
417. ther conditions c significant difference p lt 0 05 between WWTP outflow compare to the other conditions Figure 11 Total DNA adducts level per 10 nucleotides in MCF 7 cells exposed during 24h to Hospital effluent black WWTP inflow effluent gray and WWTP outflow effluent light gray The results are expressed as median value SD corresponding to the median value of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically significant at p lt 0 01 compared to control cell a significant difference p lt 0 05 between exposure to hospital effluent compare to other conditions b significant difference p lt 0 05 between WWTP inflow compare to the other conditions c significant difference p lt 0 05 between WWTP outflow compare to the other conditions Figure 12 Total of DNA breaks level in HepG2 cells exposed during 24h to Hospital effluent black WWTP inflow effluent gray and WWTP outflow effluent light gray The results are expressed as median value SD corresponding to the median value of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically significant at p lt 0 01 compared to control cell a significant difference p lt 0 05 between exposure to hospital effluent or WWTP inflow compare to WWTP outflow b significant difference p lt 0 05 between WWTP outflow compare to the other conditions Figure 13 DNA breaks induced on HepG2 cells exposed during 24h to Hospital effluent black WWTP inflow effl
418. ti cestrog niques plus actifs que le compos parent Coezy et al 1982 Les principaux m tabolites du tamoxif ne sont les N d m thyltamoxif ne form s par le cytochrome CYP3A le 4 hydroxytamoxif ne 4 OH TAM et l endoxif ne form par le cytochrome CYP2D6 Desta et al 2004 Ces diff rents m tabolites sont pris en charge par I hydroxysteroide 120 R sultats amp Discussion Partie 1 sulfotransferase Shibutani et al 1998 Nishiyama et al 2002 et deviennent r actif vis a vis de l ADN Gamboa da Costa et al 2001 2007 Il a t montr que suivant le m tabolite form la nature des adduits tait diff rente Trois adduits proviennent de la sulfoconjugaison des m tabolites primaires figure 55 Ces adduits sont mutag nes Le 4 OH TAM peut aussi tre oxyd en cat chol puis en O quinone Ce m tabolite est capable de former un adduit Dowers et al 2006 Ce dernier type de m tabolisation s effectue suivant un m canisme analogue la m tabolisation des strog nes par intervention notamment de l aromatase et de quinone r ductase pr sentes dans les tissus extra h patiques tel que les glandes mammaires Wong amp Chen 2012 CYP 2D6 Ze o 4 Hydroxytamoxifen 4 Hydroxytamoxifen E o Deoxyguanosin N yi quinone methide 4 Hydroxytamoxifen TAMOXIFEN are ag _ ap 9 TE 9 te G O 2 T Sat a ddTAM a Hydroxytamoxifen a Sulfoxytamoxifen E c Deoxyguanosin N yl ke tamo
419. tie d tablissement Ce constat nous a amen nous int resser plus sp cifiquement ces compos s pharmaceutiques rejet s en m lange dans les effluents 1 4 Probl matique des compos s pharmaceutiques dans l environnement 1 4 1 Pr sence dans les stations d puration La premi re d tection de substances pharmaceutiques dans les STEP date des ann es 70 Hignite amp Azarnoff 1977 partir des ann es 90 de nombreuses tudes ont port sur ces nouvelles substances et ont r v l la pr sence quasi syst matique de toutes les cat gories de substances pharmaceutiques dans les effluents issus de STEP des concentrations allant jusqu plusieurs microgrammes par litre Ternes 1998 K mmerer 2001 Kolpin et al 2002 Fent et al 2006 15 Synth se bibliographique Moldovan 2006 Coquery et al 2007 Les compos s les plus fr quemment d tect s sont des antibiotiques anti pileptiques antiphlogistiques produits de contraste r gulateurs de lipides b tabloquants et tranquillisants Ternes amp Joss 2006 Mais les proc d s conventionnels d puration n apparaissent pas toujours suffisants leur d gradation Ternes 1998 En effet bien que la plupart de ces compos s soient limin s par adsorption Carabineiro et al 2011 ou biod grad s certaines mol cules sont directement rejet s dans l environnement Gartiser et al 1996 Kuemmerer et al 1997 Besse et al 2012 H
420. timation de la qualit et de la quantit d ADN Les solutions d ADN sont mises 15 min au bain marie 37 C avant lecture au spectrophotom tre Secomam Anthelie advanced 5 afin d avoir une solution homog ne L int gralit de l chantillon est transf r e dans des cuves en quartz de 1 mL de contenance La puret et la quantit d ADN en solution sont valu es en faisant un spectre entre 220 et 320 nm Le maximum d absorption de la mol cule d ADN se situe entre 258 et 260 nm Un d placement du maxima d absorption vers 250 nm ou 280 nm indique une contamination de ADN par de l ARN ou par des prot ines respectivement figure 22 Par cons quent la purification de cette solution doit tre renouvel e Figure 22 Spectre d ADN contamin en prot ines photo de gauche et d ADN pur photo de droite La quantit d ADN de l chantillon est calcul e en consid rant que 1 unit d absorbance quivaut 50 ug mL Des aliquotes contenant 4 ug d ADN sont pr par s partir de la solution m re d ADN et sont ensuite s ch s l aide d une centrifugeuse vaporation sous vide Speedvac concentrator de Savant A partir de cette tape l aliquote d ADN est pr t tre hydrolys en vue du marquage 1 5 4 c 4 Marquage des adduits 1 5 4 c 4 1 Hydrolyse de l ADN L ADN 4ug est s ch et hydrolys s 4 h 37 C en nucl osides 3 monophosphates par actions de la phosphodiest rase de rate et de la nu
421. tion AFNOR 1996 de l institut des normes de Su de SIS 1995 ou encore de Institute of Applied Environmental Research ITM 1990 111 2 2 Les biomarqueurs Bien que les tudes cotoxicologiques sur les polluants mergeants dans l environnement aient t effectu s sur plusieurs types d organismes mod les non cibles les effets ont t valu s a l aide de tests standardis s ou de tests in vitro non sp cifiques qui ne sont pas appropri s pour les m dicaments anticanc reux Zounkova et al 2010 Ces outils ne permettent pas toujours de d terminer la toxicit des m tabolites et les interactions en m lange et ne sont sensibles g n ralement qu avec de fortes concentrations Il faut galement souligner que la majorit des tudes porte sur l valuation de doses th rapeutiques et que le risque d une exposition de la faune et la flore aquatique ou encore l homme a de doses environnementales de compos s pharmaceutiques reste encore largement inconnu Crane et a 2006 Avec l av nement des techniques de biologie mol culaire le concept de biosurveillance ou biomonitoring gt qui repose sur la r ponse biologique des organismes aux polluants est aujourd hui en plein essor Les effets biologiques peuvent tre assimil s des indicateurs biologiques ou biomarqueurs de pollution dans le r gne animal et v g tal Ces biomarqueurs sont des changements structuraux ou fonctionnels observables
422. tion Les l ments de la qualit biologiques retenus permettent un constat conduisant engager des processus de rem diation co teux alors qu on peut attendre des biomarqueurs une fonction de pr vention Les biomarqueurs sont des changements structuraux ou fonctionnels observables et ou mesurables divers niveaux d organisation biologique mol culaire biochimique cellulaire physiologique comportementale qui r v lent l exposition pr sente ou pass e d un individu au moins une Introduction g n rale substance chimique Lagadic et al 1997 Ce sont des outils mis en uvre pour tablir un diagnostic de risque environnemental Concernant plus particuli rement les biomarqueurs de g notoxicit ils permettent l valuation de l impact des contaminants chimiques sur l int grit structurelle de l acide d soxyribonucl ique ADN et peuvent servir dans certains cas d indicateur pr dictif d effets au niveau populationnel Depuis la fin des ann es 90 plusieurs ouvrages ont fait le point sur cette m thodologie comme Utilisation des biomarqueurs pour la surveillance de la qualit de l environnement Tec amp Lavoisier 1998 Pourtant les biomarqueurs restent encore d un emploi tr s marginal dans les programmes de surveillance de l environnement Synthese bibliographique Synth se bibliographique I Pr sentation du cadre de l tude 1 1 Usage et consommation des produits pharmace
423. tique HepG2 expos es 24 h A et 72 h B diff rents chantillons 1 d effluents hospitalier 2 d effluents en entr e de STEP 3 d eaux en sortie de STEP pr lev s pendant 3 mois cons cutifs Les r sultats sont exprim s en moyennes et sont consid r es statistiquement significatives p lt 0 05 et p lt 0 01 diff rence significative P lt 0 01 entre les chantillons pr lev s le m me mois a diff rence significative p lt 0 01 entre les p riodes de pr l vement Lorsque les cellules sont expos es 72 h ces chantillons figure 60 B uniquement 2 chantillons modifient significativement la viabilit cellulaire D une part l chantillon N2 entr e de STEP pr lev en novembre induit une prolif ration significative p gt 0 01 tandis que l chantillon J3 sortie de STEP pr lev en janvier entraine une inhibition p gt 0 01 de la croissance cellulaire Les taux de viabilit sont respectivement de 105 et 95 Bien qu il n y ait pas de diff rence statistique entre les chantillons pr lev s au mois de d cembre on constate une tendance a une inhibition de la croissance cellulaire avec chantillon D3 sortie de STEP Lorsqu on compare l impact sur la viabilit cellulaire observ apr s 24 h ou 72 h d exposition on constate une amplification de la prolif ration cellulaire induite par l chantillon N2 L effet de prolif ration induit par l chantillon J2 a disparu a
424. tive metabolite 4 hydroxy derivative is produced mainly by CYP2B6 These metabolites are excret ed in the urine N dechloroethylation results in inactivation of anticancer activity of CP and formation of the toxic byproduct chloroacetaldehyde 100 0 M oe ol t F m 4 x a K2Cr207 control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 CONCENTRATION pg L Growth inhibition Fig 7 Growth inhibition of microalgae exposed 72 h to ciprofloxacin CIP white tamox ifen TAM gray and cyclophosphamide CP black K2Cr207 corresponds to the positive control Results are expressed as median value SD of the percentage of viable algae compared to control condition Statistically significant at p lt 0 05 compared to control algae without any treatment This reaction is catalyzed by CYP3A4 Induction or inhibition of CYP activity mediated by concomitantly administered drugs can change the balance between the activating and inactivating metabolic pathways of cyclophosphamide Scripture et al 2005 Ciprofloxacin is an inhibitor of cytochrome P450 3A activity in vitro and in vivo Xie et al 2003 Cip rofloxacin inhibits the CYP which mediates CP biotransformation leading to reduction in the metabolic ratio and a decrease in the levels of active 4 OH CP The immunosuppressive effect of CP is hampered by ciprofloxa cin which is detrimental to the treatment explaining that treatment did not anymore combine these two drugs In the s
425. tive response If one makes measurements too late the system may have already returned from the induced state to the ground state Comparison between impact of both mixtures CIP TAM versus CTC shows that CP increased the antagonistic effect on cell viability and bacteria bioluminescence and the synergistic effect on DNA breaks for mation comet assay These data show clearly that the three drugs have a different mode of action In the case of binary mixture TAM CIP interaction could be due to the impact of TAM on membrane efflux In deed Darvari and Boroujerdi 2004 showed that tamoxifen biphasically modulated the membrane efflux of doxorubicin an antibiotic like CIP For all the three drugs the interaction could be due to interference on biotransforming enzymes Tamoxifen must be activated by the cyto chrome P450 system to exert its effects via anti estrogenic metabolites that are more potent than the parent compound Coezy et al 1982 The main metabolites of tamoxifen are N desmethyltamoxifen formed by CYP3A and 4 hydroxytamoxifen and endoxifen formed by CYP2D6 Desta et al 2004 CP is not cytotoxic by itself but undergoes activation through a metabolic step in vivo Numerous metabolites are known Kerbusch et al 2001 and the major ones are chloroacetaldehyde acrolein and 4 hydroxycyclophosphamide produced by the mixed function of cytochrome P450 oxidase CYP present in he patic microsomes Huang et al 2000 The ac
426. to CIP TAM mixture and D cells exposed to CTC mixture Figure 3 Total DNA adducts levels per 10 nucleotides in HepG2 cells exposed 24h to CIP white TAM gray and CP black respectively The results are expressed as median value SD corresponding to the median of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically different from control cell at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell Figure 4 Total DNA adducts level per 10 nucleotides in HepG2 cells exposed to CIP TAM hatched or CTC stippling during 24h The results are expressed as median value SD corresponding to the median value of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically significant at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell significant difference at p lt 0 05 between exposure to three drugs CTC compared to CIP TAM The concentration exposure are described in table 1 section 2 3 Figure 5 DNA adduct pattern of DNA 4ug from MCF 7 cells exposed to different condition during 24 h A control B cells exposed to TAM C cells exposed to CIP TAM mixture and D cells exposed to CTC mixture Figure 6 Total DNA adducts levels per 10 nucleotides in MCF 7 cells exposed 24h to CIP white TAM gray and CP black respectively The results are expressed as median value SD corresponding to the median of 6 measurements 3 experiments 2 replicates Statistically different from control cell at p lt
427. to the conjugating pathway Indeed one main metabolite of CIP is sulfociprofloxacine Borner et al 1986 Anadon et al 2001 Drusano 1987 Thus a competition for sulfonation can occur between CIP and TAM reducing the formation TAM DNA adducts and N oxid TAM adducts Gamboa Da Costa et al 2001 2007 In the case of MCF7 pathway responsible of DNA adduct formation induced by TAM was different of that of HepG2 Only one DNA adduct was formed and was not of the same nature as the three DNA adducts observed in hepatic cells Moreover when the cells were exposed to binary or ternary mixture the nature of the DNA adduct was similar in all conditions Only the intensity of the DNA adduct changed and was the highest when TAM and CIP were applied together The increase was dose dependent whereas a hormetic dose response was observed when MCF7 cells were exposed to TAM alone Hormesis is connected with both acclimation and phenotypic plasticity and may play an important role in allowing animals to adjust to changing environments Costantini et al 2010 Deviations from linearity are favored by the occurrence of multiple concurrent and sequential events in toxicological responses Mechanisms contributing to hormetic responses at low doses included overcompensation to a disruption in homeostasis adaptive responses based on inducible repair processes interactions among cell proliferation cell cycle delay apoptosis and DNA damage enhancement of gap junction
428. traine la formation de plusieurs adduits l ADN Les valeurs sont exprim es en moyenne de 4 points de mesures 2 s ries en double Un exemple de profil est pr sent dans la figure 66 Cinq dix adduits sont form s num rot s 1 10 en fonction du type d chantillon test De mani re quantitative on observe que les effluents hospitaliers atteignent un nombre total d adduits sup rieur a 150 adduits 10 nucl otides p lt 0 01 ind pendamment du mois de pr l vement figure 67 De plus on note que l chantillon du mois de Novembre N1 induit une g notoxicit significativement plus importante p lt 0 05 que les deux autres mois D1 J1 Concernant les chantillons d eaux en entr e de STEP le taux d adduits d passe 200 adduits 10 nucl otides quelle que soit la p riode N2 D2 et J2 La g notoxicit de l chantillon N2 est significativement plus importante compar e celle de l chantillon D2 Bien que sup rieur 300 adduits 10 nucl otides ce taux ne diff re pas statistiquement de l chantillon J2 Dans le cas des effluents en sortie de STEP N3 D3 J3 on observe un abattement de la toxicit par rapport aux autres types d effluents analys s Le nombre d adduits pour l chantillon N3 est significativement diff rents de D3 et J3 A B Figure 66 Exemple de profils d adduit d ADN 4 ug de cellules h patique HepG2 expos es a A eau ult
429. trazolium inner salt MTS and related analogs of 3 4 5 dimethylthiazolyl 2 5 diphenyltetrazolium bromide MTT reducing to purple water soluble formazans As cell viability indicators Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters 1 611 614 Baumgartner A Cemeli E Anderson D 2007 The comet assay in male reproductive toxicology Cell Biol Toxicol 25 81 98 Beach AC Gupta RC 1992 Human biomonitoring and the 32P postlabeling assay Carcinogenesis 13 1053 1074 Besse J P Latour J F Garric J 2012 Anticancer drugs in surface waters what can we say about the occurrence and environmental significance of cytotoxic cytostatic and endocrine therapy drugs Environ Int 39 73 86 Borner K H ffken G Lode H Koeppe P Prinzing C Glatzelc P Wiley R Olschewski P Sievers B Reinitz 1986 Pharmacokinetics of ciprofloxacin in healthy volunteers after oral and intravenous administration European JClin Microbiol 5 2 179 186 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 Environmental and Molecular Mutagenesis Bound JP Voulvoulis N 2006 Predicted and measured concentrations for selected pharmaceuticals in UK rivers Implications for risk assessment Water Research 40 2885 2892 Bouraoui S Brahem A Tab
430. trophique d exposition d exposition SHIRTS Daphnia magna inhibition de la NF EN ISO 6341 CP aigu 24 et 48h ai etre g mobilit T90 301 Vibrio fischeri Qu inhibition de la ne D aigu 15 et 30 min lurnii econce ISO 11348 3 Pseudokirchneriella inhibition de la FN NF EN ISO 8662 subcapitata PP chronique 72h croissance de la te population T90 304 Ceriodaphnia dubia oe 24 et 48h inhibition de la NF EN ISO 6341 PAR CP aigu mobilit invert br o e et ISO 20665 Brachionus calyciflorus inhibition de la hroni 48h PR NF I 2 rotif re CP caronique 8 reproduction 9 20868 Lemna minor inhibition de la ue Ki PP chronique 7j croissance de la ISO 20079 v g tal sup rieur population CP consommateur primaire D d composeur PP producteur primaire biotest retenu pour l tude Tableau 7 Caract ristiques des essais couramment utilis dans le cadre d valuation des risques environnementaux associ s la pr sence de polluants Ces bioessais sont r alis s dans des conditions exp rimentales biotiques esp ce ge et abiotiques temp rature photop riode nature de l clairement dur e d exposition composition physico chimique du milieu contr l es et souvent standardis es tant au niveau national qu international AFNOR ISO UE OCDE Cela permet d une part de fixer et ma triser au mieux les facteurs connus pour influer sur 44 Synth se bibliographique la
431. tures Conference Oct 2011 USA Mater N Faucet Marquis V Albasi C Castillo L Pfohl Leszkowicz A 2011 Ecotoxicity test to evaluate the toxicity of some anticancer drugs released in hospital waste water SETAC Europe 21st Annual Meeting Ecosystem Protection in a Sustainable World a Challenge for Science and Regulation May 2011 Milan Italy XXXIV Introduction G n rale Introduction g n rale Depuis la fin du XX si cle se pose au niveau mondial le probl me de la raret de l eau douce En plus de ce constat la communaut scientifique s int resse depuis de nombreuses ann es l impact des activit s anthropiques sur l tat de sant de notre environnement C est ainsi que d s le d but des ann es 70 en France le Pr Truhaut 1975 1977 soulevait la question d un risque croissant pour la sant et l environnement li au d veloppement de l industrie chimique et la m decine Il soulignait d ja les besoins de connaissances et de recherche sur le devenir et les effets des produits chimiques dans l environnement proposait en m me temps une des premi res d finitions de l cotoxicologie sous discipline de la toxicologie m dicale et reconnaissait le caract re n cessairement multidisciplinaire des approches De nos jours des tonnes de substances pharmacologiquement actives sont consomm es annuellement en Europe et dans le monde de par leurs utilisations en m decine pour le diagnost
432. u plusieurs polluants environnementaux vis vis des bact ries Kaiser 1988 L int r t de ce bioessai bas sur la mesure de la bioluminescence de la photobact rie marine repose la fois sur sa rapidit et sa relative facilit d ex cution L int grit du m tabolisme cellulaire et par cons quence l intensit lumineuse permet d valuer tr s simplement l induction d un stress de toxicit Cette m thode pr sente galement l avantage d tre standardis e NF EN ISO 11348 3 1999 permettant ainsi de comparer les r sultats obtenus dans les laboratoires du monde entier L extinction de la bioluminescence a ainsi t mesur e chez V fischeri expos e diff rentes concentrations de ciprofloxacine CIP tamoxif ne TAM et cyclophosphamide CP Les r sultats 3 s ries en triplicata obtenus apr s 30 min d exposition sont pr sent s dans la figure 24 Un contr le positif utilisant du sulfate de cuivre CuSO4 a t r alis en parall le pour v rifier le bon tat physiologique des bact ries avant le test donn es non pr sent es inhibition gt 90 Le contr le n gatif pr sent dans les figures suivantes correpond aux bact ries n ayant pas recu de traitement Par ailleurs les r sultats obtenus apr s 5 15 et 30 min d exposition pr sentant les m mes tendances seules les valeurs les plus importantes mesur es a 30 min sont pr sent es dans les figures 24 et 25 S
433. u sida ils repr sentent une part de plus en plus importante des achats de m dicaments par les h pitaux Cavali et a 2005 Enfin on peut noter que les milieux hospitaliers utilisent aussi de mani re importante des produits destin s aux personnels tels que l antifongique itraconazole l antibiotique vancomycine etc Cavali et al 2003 Besse amp Garric 2007 1 8 2 Substances susceptibles d tre l origine de la toxicit Du fait de l utilisation d un grand nombre de produits par tablissements de sant et de la difficult suivre leur volution jusqu en STEP puis dans l environnement aucune tude ce jour n a v ritablement r ussie a d montr l origine de l cotoxicit des effluents hospitaliers Une tude men e dans les ann es 90 sur des h pitaux de la r gion Rh ne Alpes a malgr tout permis de confirmer la toxicit lev e des effluents hospitaliers et d mettre des hypoth ses quant aux causes possibles Deloffre Bonnamour 1995 L hypoth se principale porte sur la pr sence de rejets contenant des produits d tergents et des d sinfectants qui sont quantitativement majoritaires dans les effluents Les quantit s de lessives sont par exemple estim e 12 tonnes 1000 lits an ou encore celles du chlore a 800 kg par an pour un tablissement Mansotte et al 2000 Cependant des travaux men s par d autres quipes soulignent que de par leur activit biologique th rapeutique
434. ue verte unicellulaire d eau douce Pseudokirchneriella subcapitata anciennement Selenastrum capricornutum ou Raphidocelis subcapitata et qui mesure la toxicit chronique de solutions aqueuses en mesurant l inhibition de la croissance Cet organisme dul aquicole de la famille des Chlorophyceae pr sent dans une grande diversit de milieux aquatiques et pouvant se d velopper dans la colonne d eau des s diments ou sur des supports divers Cauzzi 2007 est repr sentatif des producteurs primaires Le kit a t d velopp par une quipe belge du laboratoire de recherches biologiques en Pollution aquatique LABRAP de l universit de Ghent Persoone et al 1997 et il est commercialis depuis une dizaine d ann es II permet de r aliser moindre co ts des tests de toxicit Simple sensible et reproductible il pr sente l avantage de fournir tout le mat riel n cessaire pour l essai y compris les organismes tests pouvant tre activ s selon les besoins A l heure actuelle cet outil biologique est fr quemment utilis pour d terminer la toxicit d chantillons liquides tels que les eaux us es industrielles municipales agricoles les eaux de lixiviation les lixiviats de r sidus solides les eaux r ceptrices les substances chimiques solubles dans l eau toute solution susceptible de contenir des substances toxiques ou encore pour identifier les chantillons qui entra nent une stimulation de la croissan
435. uent gray and WWTP outflow effluent light gray The results are expressed as median value SD 3 experiments 2 replicates John Wiley amp Sons Inc Page 27 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis 857 Figure 14 Metabolic pathways of tamoxifen leading to the formation of DNA adduct adapted from Shibutani et al 858 2003 Gamboa Da Costa et al 2001 2007 CYP cytochrome P 450 Sult sulfotransferase FMO flavin monooxygenase 859 Figure 15 Scheme of interaction between the three drugs in relation with metabolic pathways of 860 cyclophosphamide and tamoxifen adapted from Huang et al 2000 Desta et al 2004 861 J O O1 BR D John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 1 Ci7HisFN303 C26H29NO MM 331 34 g mol MM 371 515 g mol John Wiley amp Sons Inc Page 28 of 42 C7HysCy2N202P MM 261 085 g mol Page 29 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 2 OONDOARWND 40 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D Figure 3 Environmental and Molecular Mutagenesis Adducts 10 nucleotides 20 15 10 Control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 CONCENTRATION ug L John Wiley amp Sons Inc Page 30 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Page 31 of 42 Figure 4 NO lt LW OR OOD wt O O o Ka a x F ee N Q
436. uents J Environ Manage 103 113 121 Johnson AC Jurgens MD Williams RJ Kummerer K Kortenkamp A Sumpter JP 2008 Do cytotoxic chemotherapy drugs discharged into rivers pose a risk to the environment and human health An overview and UK case study JHydrology 348 167 175 Jonker MJ Piskiewicz AM Castella NII Kammenga JE 2004 Toxicity of binary mixtures of cadmium copper and carbendazim copper to the nematode Caenorhabditis elegans Environ Toxicol Chem 23 1529 1537 Jonker MJ Svendsen C Bedaux JJM Bongers M Kammenga JE 2005 Significance testing for synergistic antagonistic dose level dependent or dose ration dependent effects in mixture dose response analysis Environ Toxicol Chem 24 10 2701 2713 Jordan VC Koerner S 1975 Tamoxifen ICI 46 474 and the human carcinoma 8S oestrogen receptor Eur J Cancer 11 205 206 Kanuri M Minko IG Nechev LV Harris TM Harris CM Lloyd RS 2002 Error prone translesion synthesis past gamma hydroxypropano deoxyguanosine the primary acrolein derived adduct in mammalian cells J Biol Chem 277 18257 18265 Karthikeyan KG Meyer MT 2006 Occurrence of antibiotics in wastewater treatment facilities in Wisconsin USA Sci Total Environ 361 196 207 Keher JP Biswal SS 2000 The molecular effects of acrolein Toxicological Sci 57 1 6 15 Kerbusch T de Kraker J Keizer HJ van Putten JW Groen HJ Jansen RL Schellens JH Beijnen JH 2001 Clinical pharmacokinetics
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438. ular Mutagenesis Page 38 of 42 Figure 11 400 a 0 D 300 ao a k k b g 20 ER c 100 xx D O lt 0 T T T Control Hospital WWTP inflow WWTP outflow SAMPLES John Wiley amp Sons Inc Page 39 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 12 J O O1 BR D 20 26 control Hospital WWTP inflow WWTP outflow 28 SAMPLES 40 John Wiley amp Sons Inc J O O1 BR D Environmental and Molecular Mutagenesis Page 40 of 42 Figure 13 20 15 Tail DNA 3 oa Lu control Hospital WWTP inflow WWTP outflow SAMPLES John Wiley amp Sons Inc Page 41 of 42 Environmental and Molecular Mutagenesis Figure 14 i 2 3 4 DNA 3 4 Dihydroxytamoxifon o Quinone ui Adduct 7 8 roma 9 10 CYP 206 DNA 12 13 14 15 16 4 Hydroxytamoxifen 4 Hydroxytamoxifen an quinone methide 17 E Deoxyguanosin N yl 18 i on TAMOXIFEN Mt De mens 19 OCH A n PR A 21 Q D em th 22 CYP 3A 33 a wo ue Sult ne x 24 25 O N oxide 26 Hydroxytamoxifen a Sulfoxytamoxifen a onal ove M E Deoxyguanosin N y 29 Adduct 30 cH CH 31 n s 32 33 E a CPIA ue Suit 34 35 36 N Desmethyl o Hydroxy N des Sulfoxy N des 37 tamoxifen methyltamoxifen methyttamoxifen 38 39 E 2 Deoxyguenosin N yf 40 John Wiley
439. ulation of luminescence in Vibrio fischeri Journal of Molecular microbiology and Biotechnology 1 pp 5 12 Eguchi K Nagase H Ozawa M Endoh Y S Goto K Hirata K Miyamoto K Yoshimura H 2004 Evaluation of antimicrobial agents for veterinary use in the ecotoxicity test using microalgae Chemosphere 57 1733 1738 Ehlhardt W J Beaulieu Jr B B Goldman P 1988 Mammalian cell toxicity and bacterial mutagenicity of nitrosoimidazoles Biochemical pharmacology 37 2603 2606 Emmanuel E 2004a valuation des risques sanitaires et cotoxicologiques li s aux effluentshospitaliers Th se INSA de Lyon Sp cialit Sciences et Techniques du D chet Lyon 259p Emmanuel E 2004b valuation des risques sanitaires et cotoxicologiques li s aux effluents hospitaliers Th se Sp cialit Sciences et Techniques du D chet Villeurbanne et Vaulx en Velin INSA de Lyon et LSE ENTPE 259p Emmanuel E Keck G Blanchard J M Vermande P Perrodin Y 2004 Toxicological effects of disinfections using sodium hypochlorite on aquatic organisms and its contribution to AOX formation in hospital wastewater Environment International 30 7 891 900 Environment Canada 1992 Biological Test Method Growth InhibitionTest Using FreshwaterA Iga Selenastrum capricornutum Environment Canada EPS 1 25 Fardel O Morel F Ratanasavanh D Fautrel A Beaune P Guillouzo A 1992 Expression of drug metabolizing enzy
440. ultidrug resistance transporters Pharmaceutical Biotechnology 12 353 386 Simmons D L Xie W Chapman J G Evett G E 1991 Multiple cyclooxygenases cloning of a mitogen inducible form In Prostaglandins Leukotriens Lipoxins and PA F JM Bradley Ed 67 78 Plenum Press New York Singh N P McCoy M T Tice R R Schneider E L 1988 A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells Experimental Cell Research 175 184 191 Sladek N E 1999 Aldehyde dehydrogenase mediated cellular relative insensitivity to the oxazaphosphorines Current Pharmaceutical Design 5 607 Smart D J Chipman J K Hodges N J 2006 Activity of OGG1 variants in the repair of pro oxidant induced 8 oxo 2 deoxyguanosine DNA Repair 5 11 1337 1345 Sohoni P Sumpter J P 1998 Several environmental oestrogens are also anti androgens Journal of Endocrinology 158 327 339 Sonnenschein C Soto A M 1998 An updated review of environmental estrogen and androgen mimics and antagonists The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 1 6 143 150 Sorsa M Hemminki K Vainio H 1985 Occupational exposure to anticancer drugs potential and real hazards Mutation Research Reviews in Genetic Toxicology 154 135 149 Springate J Zamlauski Tucker M J Lu H Chan K K 1997 Renal clearance of ifosfamide Drug Metabolism Disposition 25 1081 Sridar C Kent U M Notley L M
441. ults of the in vivo Comet assay workgroup Mutation Research 627 31 35 165 Bibliographie C Cairns Jr J 1983 Are single species toxicity tests alone adequate for estimating environmental hazard Hydrobiologia 100 47 57 Cairns Jr J 1986 The myth of the most sensitive species BioScience 36 670 671 Calabrese E J 2013 Hormesis once marginalized evidence now support hormesis as the most fundamental dose response Mattson MP Calabrese EJ editors Hormesis Springer Science Buisness Media Calabrese E J Stanek E J Nascarella M A 2011 Evidence for hormesis in mutagenicity dose response relationships Mutatation Research 726 91 97 Calabrese E J 2005 Cancer biology and hormesis human tumor cell lines commonly display hormetic biphasic doses responses Critical Review of Toxicology 35 463 582 Callahan M A Sexton K 2007 If cumulative risk assessment is the answer what is the question Environment Health Perspective 115 799 806 Carabineiro S A C 2011 Adsorption of ciprofloxacin on surface modified carbon materials Water research 45 15 4583 4591 Cardoso O Porcher J M Sanchez W 2014 Factory discharged pharmaceuticals could be a relevant sourceof aquatic environment contamination Review of evidence and needfor knowledge Chemosphere sous presse Carmona E Andreu V Pico Y 2014 Occurrence of acidic pharmaceuticals and personal care products in Turia River
442. ums quaternaires qui ont la fois un pouvoir d tergent et un pouvoir d sinfectant Ils se lient aux groupes phosphates et aux cha nes d acides gras des lipides de la membrane cellulaire qu ils alt rent cr ant une fuite des constituants cellulaires et une coagulation cytoplasmique Russell amp Hugo 2004 14 Synth se bibliographique Les d riv s ph noliques qui d naturent les prot ines cytoplasmiques et membranaires et induisent ainsi une inhibition des fonctions enzymatiques une alt ration des membranes et entra nent une coagulation cytoplasmique Russell amp Hugo 2004 Ils ont un tr s bon pouvoir d sinfectant mais ne sont pas biod gradables Dans le cas d une d sinfection pr alable de l eau par le chlore ou ses d riv s les substances ph noliques peuvent g n rer des compos s toxiques tels que les chloroph nols 1 3 2 c Les r sidus m dicamenteux Apr s ingestion les compos s pharmaceutiques sont distribu s dans l organisme par la circulation sanguine et subissent pour la plupart des biotransformations chimiques au niveau des tissus cibles pour tre actif Cette phase de m tabolisation donne naissance des m tabolites plus ou moins r actifs selon la nature de la mol cule entrainant des effets biologiques et toxiques Finalement leur limination peut se faire par voie biliaire ou r nale dont la majorit de la dose administr e est retrouv e en 24 h dans les urines sous formes de m tab
443. ure time Fig 5 Even exposure of cells to 10 more CIP concentration did not induce any DNA breaks Simultaneous exposure to increasing concentrations of the three drugs whatever the time of exposure significantly increased DNA dam ages Fig 6 DNA breaks are two folds higher when cells are exposed to 10 ug L of CP 10 pg L TAM 100 ug L CIP compared to 10 pg L TAM 100 pg L CIP condition 5 Fig 5A The increase of DNA damage was dose dependent when the three drugs are present simultaneously Fig 6 and was significantly higher compared to exposure to binary mixture Although DNA breaks decreased with the time of exposure 105 1 00 hi aa 1 I l i 95 a cs we by kiai 90 t T LL mm a an i 85 7 i 80 l control 0 01 0 1 0 5 1 10 100 CONCENTRATION pg L Fig 2 Survival rate of HepG2 cells exposed to CP A CiP TAM during 24 h A to 72 h B Results are expressed as median value SD of the percentage of viable cells com pared to control condition Statistically significant at p lt 0 05 and p lt 0 01 compared to control cell N Mater et al Environment International 63 2014 191 200 195 105 100 t j gt Eo T4 ae a 95 a LA 4 lt ae ae ee 10 i ae w t 85 80 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS 105 100 lt lt aa 1 DT 95 i PA ak T LL I s 90 s n nn 85 a 80 0 1 2 3 4 5 CONDITIONS Fig 3 Survival ra
444. ures de levure S cerevisiae puis trait es avec diff rentes dilutions semi logarythmiques de solutions tester Au total 4 microplaques sont utilis es chacune permettant de r v ler un type d activit induit par la solution agoniste antagoniste des r cepteurs aux strog nes agoniste antagoniste des r cepteurs aux androg nes Les chantillons sont incub s en pr sence d une gamme de concentration d un perturbateur connu pour d finir le contr le de r f rence le 17B stradiol agoniste ou le 4 hydroxytamoxif ne pour le r cepteur aux strog nes hERa et le 5a dihydrotestost rone agoniste ou le flutamide antagoniste pour le r cepteur aux androg nes hAR Les levures sont ensuite incub es pendant 48 h 32 C en pr sence d un substrat de la B galactosidase L expression de la B galactosidase est directement proportionnelle a la pr sence de compos s agonistes activateurs ou antagonistes inhibiteurs qui conduisent la conversion du substrat jaune en un produit de d gradation rouge le chloroph nol rouge Le d veloppement colorim trique et la croissance fongique sont quantifi s par spectrophotom trie respectivement 570 et 690 nm Les r sultats sont interpr t s comme activit s agonistes ou antagonistes aux strog nes et androg nes aussi bien ainsi que comme fongicides ou fongistatiques Les explications simplifi es de la proc dure de l essai ainsi que les formules utilis es pour les calculs in
445. utiques en Europe A l heure actuelle les pays industrialis s sont les plus gros consommateurs de produits pharmaceutiques avec l Europe l Am rique du Nord et le Japon qui repr sentent environ 80 du march mondial pour moins de 15 de la population Acad mie Nationale de Pharmacie 2008 En 2006 la France tait le 4 e consommateur mondial de m dicaments 25 630 M apr s les Etats Unis 197 802 M le Japon 56 675 M et l Allemagne 27 668 M tableau 1 On peut toutefois souligner qu il est plus facile d obtenir des donn es concernant les chiffres d affaires que des tonnages fabriqu s ou utilis s en France Le prix de vente des m dicaments dans l hexagone tant plus faible que dans d autres pays la France devrait se retrouver en r alit beaucoup plus proche du haut du classement Une comparaison internationale tablie en 2004 Rapport Landrain 2004 estimait d ailleurs la position de la France au deuxi me rang mondial derri re les Etats Unis en volume de consommation de m dicaments par habitant et par an Le montant tait alors 2 fois plus lev qu aux Pays Bas et deux fois et demi sup rieur celui du Danemark ou de l Irlande Achat de m dicament par les pharmacies de d tail Ann e 2005 Ann e 2006 en million US en million US Monde s lection 370 015 388 281 Am rique du Nord 196 190 211 521 USA 184 196 197 802 Canada 11 994 13719 Europe 91 5
446. ux endommag s et NON CNOOMMAGE cassis M RS M M ate ue eel Tak Ss tae MN es ae 51 Dispositif exp rimental de l essai Microtox 61 Dispositif exp rimental de l essai Algaltox F TM eee 63 Dispositif exp rimental de l essai sur Lemna minor 64 Sch ma g n ral de culture de cellules 67 Structure du MTS t trazolium et son produit le formazan 69 Etapes du test de viabilit cellulaire MTS 70 Etapes du test Com te en condition alcaline th se C Michel 2011 71 Param tres de quantification des dommages l ADN 72 Principe de la m thode du post marquage au Z2P 74 Spectre d ADN contamin en prot ines et d ADN pur 76 Chromatographies successives pour la purification et la s paration des adduits sur des plaques d PEFCellulos z same une M Le DR nt 79 Inhibition de la bioluminescence chez la bact rie Vibrio fischeri expos e 30 minutes diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et cyclophosphamide 88 Inhibition de la bioluminescence chez Vibrio fischeri expos e 30 minutes a diff rentes concentrations de m langes de ciprofloxacine tamoxif ne ou ciprofloxacine tamoxif ne amo 07 0 6 416 6 1 111 0 _ esse 89 Inhibition de la croissance d algues P subcapitata expos es 72 h diff rentes concentrations de ciprofloxacine tamoxif ne et cyc
447. value of the comet assay and DNA adduct measurement in dab Limanda limanda for assessment of in situ exposure to genotoxic compounds Mutation Research 534 21 32 Albukhari A A Gashlan H M El Beshbishy H A Nagy A A Abdel Naim A B 2009 Caffeic acid phenethyl ester protects against tamoxifen induced hepatotoxicity in rats Food and Chemical Toxicology 47 1689 1695 Allain P 2000 Les M dicaments Ed Pharmacoloie 3rd Ed CdM Allan I J Vrana B Greenwood R Mills G A Roig B Gonzalez C 2006 A tool box for biological and chemical monitoring requirements for European Union s Water Framework Directive Talanta 69 302 322 Allwood M C 2002 Parenteral nutrition formulation Artificial nutrition support in clinical practice 2001 435 443 Amat A Burgeot T Castegnaro M Pfohl Leszkowicz A 2006 DNA adducts in fish following an oil spill exposure Environmental Chemistry Letter 4 93 99 Amat A Burgeot T Castegnaro M Pfohl Leszkowicz A 2005 Genotoxic impact of ERIKA fuel Fuel N 2 on fish liver Soleasolea Environmentalchemistry green chemistry and pollutant in ecosystems Eric Lichtfouse Jan Scwhartzbauer Didier Robert eds Springer verlags Heidelberg 743 756 Amenu D 2014 Assessment of disinfectant and antibiotic resistant bacterian in hospital wastewater World Journal of Life Sciences Research 1 1 1 7 Ames B N Durston W E Yamasaki E Lee F D
448. vent tre exprim s de plusieurs mani res la distance de migration de l ADN l intensit de fluorescence de la t te et la queue de la com te ainsi que la distance entre le centre de gravit de chacune d elle figure 20 Parmi les param tres les plus utilis s on retrouve le Tail DNA qui correspond au pourcentage d ADN dans la queue de la com te le Tail Moment et I Olive Tail Moment qui correspond au pourcentage d ADN dans la queue de la com te multipli par la distance s parant les centres de la queue et de la t te Les r sultats obtenus au cours de l tude repr sentent les moyennes des valeurs m dianes de Tail DNA mesur s 1 5 4 Technique de post marquage au P des adduits l ADN 5 4 a Produits utilis s 1 5 4 a 1 Les produits chimiques Les produits chimiques utilis s sont dits de qualit pour analyse Le Phosphate de Sodium Dihydrat NaH2PO4 2H20 Ur e l Hydroxyde de Lithium LiOH la soude l acide chlorhydrique l acide formique l ac tate de potassium le SDS sodium dod cyl sulfate l isopropanol et thanol proviennent de VWR International Fontenay sous bois France La bicine le chlorure de magn sium MgClz le dithiothr itol DTT la spermidine le chlorure de sodium NaCl l EDTA le Tris le Trizmabase le triton X 100 le sucrose proviennent de Sigma St Quentin Fallavier France Le y32P ATP 6000 Ci mmole 10 uCi uL provient de Perkin Elmer G
449. vidual drug or in a mixture for 24 48 or Tamoxifen 72 h The time exposure of bacteria and algae ranged between 5 and 30 min and 72 h respectively A Cyclophosphamide non monotonic dose response on cell viability was observed when HepG2 cells were exposed to TAM alone or Wastewater in the presence of CIP The same scheme was observed with microtox when the bacteria were exposed to the Hormesis mixtures On the other side an individual drug does not induce any DNA breaks on hepatic cells whereas a mixture Bioassays leads to a dose dependent increase of DNA breaks Similarly a positive response was observed with algaltoxkit F only with mixtures Synergistic effects observed when drugs are in a mixture highlight the importance of investigating the ecotoxicological effects of contaminants at low concentrations and in mixtures 2013 Elsevier Ltd All rights reserved 1 Introduction network without pretreatment represent an incontestable release source All over the world the number of cancers is in constant progression leading to a dramatic increase of treatments These treatments are chemotherapy and radiotherapy which can be used combined or not Chemotherapy is realized by means of anticancer drugs having toxic properties for cells and of which most are classified in three categories by the International Agency for Research on Cancer IARC carcinogenic impact for humans class 1 likely carcinogenic class 2 and potentially carcinogenic c
450. xifen YV CYP 1A1 CYP 3A H CH O CH o a9 Qa9 OO hil CYP 3A HC a H C H C DNA D 1e mm O N Desmethyl ddTAM o Hydroxy N des a Sulfoxy N des E c Deoxyguanosin N yl tamoxifen methyltamoxifen methyltamoxifen N desmethyl tamoxifen O Q9 H C cr N N Didesmethyl tamoxifen ddTAM Figure 54 Voie de m tabolisation du tamoxif ne aboutissant la formation d adduits l ADN d apr s Shibutani et al 2003 Gamboa Da Costa et al 2001 2007 Pour ce qui est du cyclophosphamide il n est pas cytotoxique par lui m me et doit galement tre activ par m tabolisation in vivo Plusieurs m tabolites sont connus Kerbusch et al 2001 dont les principaux sont le chloroac tald hyde l acrol ine et le 4 hydroxy CP produit par l action conjointe de diff rents cytochromes P450 pr sents dans les microsomes h patiques Huang et al 2000 Les m tabolites actifs d rivent du 4 hydroxy CP produit principalement par le cytochrome CYP2B6 Chang 121 R sultats amp Discussion Partie 1 et al 1993 Il s agit des moutardes phosphoramides qui forment des pontages entre les brins d ADN et sont l origine de la cytotoxicit des cellules Bohnenstengel et al 1996 L acrol ine quant elle est responsable d alkylation de l ADN La r paration de ces alkylations conduit des sites apuriniques et des cassures d ADN Il a t montr que l acrol ine faible concentration inhibait
451. xposed to ciprofloxacin and tamoxifen alone or in mixture Same results were observed the Microtox assays after mixtures exposures On the other hand the individually hepatic and mammary cell exposure to the drugs doesn t induce DNA break and induce DNA adduct only with the tamoxifen Furthermore we observe a dose dependent increasing of the DNA break and adduct if the cells are exposed in mixture Same results were observed with Algaltox F Concerning the effluents effects depending on the kind of organisms and time exposure The Microtox Algaltox F and the DNA adducts post labelling appeared to be the most relevant for the analysis The interactions observed between drugs pinpoint the necessity to assess the effect of contaminants in low doses mixtures at many exposure times and using different tools The application of this battery with environmental raw samples is in use to rank outflows toxicity and follow the WWTP efficiency which could lead to a better understanding of the human health risks Keywords Ciprofloxacin Tamoxifen Cyclophosphamide Hospital effluents Bioassays Biomarkers Genotoxicity DNA adducts Hormesis

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