1 Les infections à staphylocoques sont ubiquitaires et
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1. C est ainsi que NDAO S K 54 dans son pedigree d identification des staphylocoques a utilis la fermentation du glucose et l acidification du glyc rol PILET C BOURDON J L et Coll 56 ont utilis la catalase 1 ADH et la fermentation de nombreux hydrates de carbone pour le diagnostic de genre Cette m thode utilis e doit tre remise en question parce que toutes les souches appartenant au genre Staphylococcus ne sont pas ADH positif Les caract res retenus pour le diagnostic du genre dans notre algorithme sont de r alisation facile et rapide La coagulase et la DNase sont des caract res compl mentaires n cessaires une bonne identification Cependant l API staph ne fait la diff rence entre Staphylococcus aureus et Staphylococcus sciuri qu avec la production d ADH d ur ase et de coagulase 54 En effet il pr sente des donn es qui montrent que 20 et 17 des Staphylcoccus aureus peuvent ne pas produire d ADH ou d ur ase respectivement Ces discordances montrent la n cessit de proc der en premi re intention la recherche de l oxydase de la DNase et de la coagulase et non de les rechercher en dernier recours comme il a t soulign par certains auteurs 2 C est ainsi que notre algorithme va permettre une identification correcte de ces esp ces car tenant compte en premi re intention de tous ces caract res oxydase coagulase DNase 62 Pour l identifica2. Streptocoques non h molytiques m la pr sence d antig nes polyosidiques sp cifiques de groupe dans leur paroi cellulaire Un antig ne de la paroi le polyoside C permet de d finir plusieurs groupes A B C D E F G H K L M N O P R S T U V Les streptocoques d pourvus de polyoside C sont dits non groupables m les r actions biochimiques sp cifiques Les streptocoques non groupables constituent un vaste ensemble d esp ces Ils comprennent particuli rement le groupe des streptocoques viridans notamment les diff rents germes bucco pharyng s commensaux qui peuvent devenir ventuellement pathog nes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguis Streptococcus oralis et les six esp ces du groupe Streptococcus mutans englobant Streptococcus mutans serotypes c e f Streptococcus gucetus serotype a Streptococcus rattus serotype b Streptococcus sobrinus serotypes d et g pr sents chez l homme ainsi que Streptococcus ferus et Streptococcus mucacae 12 IL3 CARACTERES BACTERIOLOGIQUES IL 3 1 Caract res morphologiques 44 Les streptocoques se pr sentent sous forme de cocci Gram positif ovoides sph riques ou lanc ol s de 0 5 1 mm de diam tre non mobiles et non sporul s Ils se divisent dans un seul plan avec s paration incompl te des cellules filles formant ainsi des paires diplocoques Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis ou le plus souvent
3. Une suspension bact rienne est pr par e partir d une culture de 24 heures sur milieu solide La turbidit de la suspension bact rienne est ajust e 1 l chelle Mac Farland pour les staphylocoques 4 l chelle Mac Farland pour les streptocoques 100 ul de chaque suspension bact rienne sont d pos s dans les puits correspondants de la plaque et ceci pour chaque galerie 27 Pour les cupules contenant les sucres la suspension bact rienne est m lang e avec le MEVAG Strepto Staph puis nous avons ensemenc les cupules avec le MEVAG ainsi inocul 100 pl Les cupules LDC ODC ADH URE et tous les sucres sont ferm s avec une goutte d huile de paraffine Les plaques sont ensuite d pos es sur un plateau recouvert d un papier buvard imbib d eau puis incub es 37 C l tuve pendant 18 24 heures 28 Tableau IT Plan des plaques pour le contr le des staphylocoques Tableau Ila Plaque des contr les positifs URE ADH ees VP ONPG S aureus S aureus 4 LEUS S aureus S xylosus mirabilis NIT GLU TRE MAN XYL S aureus S aureus S xylosus S aureus S xylosus SAC GLY MNE LAC RAF S aureus S aureus S xylosus S aureus Kleb siella pneumoniae Tableau IIb Plaque des contr les n gatifs URE ADH ODC VP ONPG S cohnii S xylosus S aureus S cohnii S aureus NIT GLU TRE MAN XYL S cohnii Micrococcus sp S capitis S haemolyticus S au
4. des diff rents milieux d isolement galeries d identification et autres tests utilis s 79 la deuxi me phase a permis de valider la th orie bay sienne qui repose sur la sensibilit et la sp cificit des m thodes grace l utilisation de souches appartenant diff rentes esp ces bact riennes enfin une troisi me phase de notre d marche reposant sur l valuation des algorithmes d identification Dans notre d marche les caract res retenus taient ceux qui taient n cessaires et indispensables une bonne identification nous avons commenc d abord par identifier la famille ensuite le genre et enfin l esp ce Toutefois les algorithmes tablis garantissent une bonne identification des staphylocoques coagulase n gative et des streptocoques non groupables les plus fr quemment rencontr s en pathologie humaine
5. enzyme ne sera pas synth tis e et les bact ries vont perdre leur capacit de m taboliser les substrats correspondants En effet le g nome des bact ries est constitu d un seul chromosome et toute mutation aussi minime soit elle se traduit directement par un ph nom ne visible comme l absence de m tabolisme d un substrat donn Les bact ries ne poss dent pas un deuxi me chromosome qui pourrait compenser les mutations subies par le premier 19 63 D apr s les r sultats obtenus nous pouvons dire que notre algorithme garantit une bonne identification des staphylocoques coagulase n gative les plus fr quemment rencontr s en pathologie humaine Ainsi pour l identification des esp ces rarement rencontr es en pathologie comme par exemple Staphylococcus lugdunensis il faut tenir compte de PODC qui est un caract re majeur d identification de cette esp ce 38 II 2 LES STREPTOCOQUES NON GROUPABLES Les streptocoques non groupables ont t isol s sur g lose au sang de mouton additionn de chlorhydrate de pyridoxal Ces streptocoques poussent visiblement bien sur cette g lose avec des colonies isol es distinctes ou non h molytiques En particulier le pneumocoque qui pr sente certaines exigences a t bien isol sur g lose au sang cuit plus gentamicine Cependant certains auteurs comme DIOP F 18 avait utilis le CLED et la g lose au chlorhydrate de pyridoxal pour isoler ces s
6. isolement galeries d identification et autres tests utilis s la deuxi me phase a permis de valider la th orie bay sienne qui repose sur la sensibilit et la sp cificit des m thodes grace l utilisation de souches appartenant diff rentes esp ces bact riennes enfin une troisi me phase de notre d marche reposant sur l valuation des algorithmes d identification Dans notre d marche les caract res retenus taient ceux qui taient n cessaires et indispensables une bonne identification nous avons commenc d abord par identifier la famille ensuite le genre et enfin l esp ce Pour les staphylocoques coagulase n gative 17 caract res taient retenus pour le diagnostic microbiologique Certains caract res comme le Gram la catalase la recherche de l oxydase du type respiratoire de la fermentation du glucose de la coagulase et de la DNase sont indispensables pour l orientation diagnostique 67 Les caract res biochimiques viennent en deuxi me position ceci pour viter d ventuelles confusions Toutes les souches de staphylocoques ont t bien identifi es partir de l algorithme avec une probabilit relative de 94 2 pour Staphylococcus warneri 100 pour Staphylococcus xylosus 97 48 et 97 73 pour Staphylococcus cohnii 89 47 pour Staphylococcus capitis Pour les streptocoques non groupables 14 caract res taient retenus pour le diag
7. Les deux souches tudi es ont donn le m me profil Tableau XIV Identification de Streptococcus mitis La probabilit absolue pour que X appartienne Streptococcus mitis 1 0 57 X appartienne Streptococcus mitis 2 6 7 10 X appartienne a Streptococcus sanguis 0 026 Esp ces X Bo a Streptococcus Streptococcus Streptococcus Streptococcus Caract res mitis 1 mitis 2 sanguis mitis probable Gram 100 100 100 Catalase 0 0 0 Bile esculine 0 0 0 BHS 0 0 0 B HEM 0 0 0 Sels biliaires 0 0 0 VP 1 0 0 ESC 3 3 42 ADH 19 99 90 RAF 26 31 55 f 1 f La probabilit relative pour que X appartienne a Streptococcus mitis 1 95 X appartienne a Streptococcus mitis 2 1 11 X appartienne a Streptococcus sanguis 4 3 58 La probabilit relative pour que X appartienne Streptococcus mitis I est 95 Donc l algorithme a permis une identification acceptable de Streptococcus mitis II 7 IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS MILLERI Les deux souches de Streptococcus milleri tudi es ont donn le m me profil On parle de groupe milleri Tableau XV Identification de Streptococcus milleri Esp ces X a a Streptococcus Streptococcus Streptococcus Streptococcus Caract res intermedius salvar
8. d ficients sous la forme de colonies minutes entourant la culture en touche du germe r v lateur 13 11 3 3 Caract res biochimiques 4 14 30 65 De nombreuses r actions biochimiques ont t d crites pour le diagnostic des streptocoques une tude sur 600 souches a d montr que certains tests taient peu significatifs et surtout qu ils n taient pas constants pour des groupes de souches pourtant bien individualis es du point de vue s rologique Cependant certains tests ont une grande valeur diagnostique et permettent l individualisation des streptocoques non groupables Les principales r actions se r sument comme suit fermentation de divers sucres hydrolyse de l amidon de l arginine de l esculine et de la g latine croissance sur milieux hostiles bile esculine et 6 5 p 100 de NaCl r sistance 60 C et au tellurite de potassium production d ac tyl m thyl carbinol et formation de glucanes Certaines esp ces de streptocoques telles que Streptococcus mutans Streptococcus sanguis et Streptococcus salivarius sont facilement diff renci es par la caract risation de ces polyosides sur des milieux hypersaccharos s Le principe du test est bas sur l hydrolyse du saccharose en ses composants monosaccharidiques glucose et fructose par des enzymes sp cifiques extracellulaires labor es par les streptocoques Certaines souches forment du dextrane partir du glu
9. e positive et 1 est ur e n gative Tableau XI Identification de Staphylococcus cohnii La probabilit absolue pour que X appartienne Staphylococcus cohnii sp urealyticum 0 93 X appartienne a Staphylococcus cohnii sp cohnii 0 008 X appartienne a Staphylococcus xylosus 0 016 Esp ces Xi X2 La Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Stapyloccoccus Staphylococcus cohnii sp cohnii sp xylosus cohnii cohnii Cadas urealyticum cohnii probable probable Gram 100 100 100 Catalase 100 100 100 Oxydase 0 0 0 Mannitol 94 88 90 Coagulase 0 0 0 D Nase 0 0 0 UREE 99 65 90 ADH 0 30 5 ONPG 0 1 10 XYL 0 0 82 SAC 0 96 87 f 1 4 54 La probabilit relative pour que X appartienne a Staphylococcus cohnii sp urealyticum 97 48 X appartienne a Staphylococcus cohnii sp cohnii 0 8 X appartienne a Staphylococcus xylosus 1 6 La probabilit relative pour que Xj soit Staphylococcus cohnii sp urealyticum est de 96 87 Ce qui veut dire que l esp ce Staphylococcus cohnii identifi e partir de l algorithme est bien Staphylococcus cohnii sp urealyticum L algorithme a donc permis une tr s bonne identification de Staphylococcus cohnii La probabilit absolue pour que X2 appartienne a Staphylococcus cohnii sp urealyticum 0
10. s bonne identification gt 90 bonne identification gt 80 identification acceptable lt 80 identification inacceptable 50 C est ainsi que nous allons exploiter les r sultats de quelques souches identifi es pour essayer de valider nos algorithmes en raisonnant en terme de probabilit IL 1 IDENTIFICATION DE STAPHYLOCOCCUS WARNERI Toutes les souches de Staphylococcus warneri tudi es ont donn le m me profil Tableau IX Identification de Staphylococcus warneri Esp ces X Staphylococcus Staphylococcus Staphyloccus Staphylococcus saprophyticus warneri simulans warneri Caract res probable Gram 100 100 100 Catalase 100 100 100 Oxydase 0 0 0 Mannitol 88 70 73 Coagulase 0 0 0 D Nase 0 0 4 UREE 65 97 84 ADH 30 77 97 LAC 90 19 95 VP 719 90 38 f 1 Probabilit absolue pour que X appartienne Staphylococcus saprophyticus 0 013 X appartienne a Staphylococcus warneri 0 38 X appartienne Staphylococcus simulans 0 01 51 Probabilit relative pour que X appartienne a Staphylococcus saprophyticus p 3 22 X appartienne Staphylococcus warneri p 94 2 X appartienne Staphylococcus simulans p 2 48 L algorithme a permis une bonne identification de Staphylococcus warneri car la probabil
11. En 1884 ils sont class s en fonction de la pigmentation des colonies par ROSENBACH en Staphylococcus aureus du latin orange et Staphylococcus albus du latin blanche 1 2 2 Habitat 13 Le r servoir naturel des staphylocoques est l homme et les animaux a sang chaud Cependant limin es dans le milieu ext rieur ces bact ries tr s r sistantes sont fr quemment retrouv es dans l environnement Le site de colonisation pr f rentielle de Staphylococcus aureus chez l homme est la muqueuse nasale Les staphylocoques a coagulase n gative repr sentent les principaux commensaux de la peau avec les coryn bact ries et les propionibact ries La densit de colonisation est plus importante au niveau des zones humides partie ant rieure des narines p rin e creux axillaires et les plis inguinaux Les staphylocoques coagulase n gative sont en r gle g n rale des bact ries opportunistes essentiellement responsables d infections nosocomiales 1 2 3 Classification 3 20 25 48 50 Les staphylocoques appartiennent a la famille des Micrococcaceae qui comprend quatre genres Micrococcus Staphylococcus Stomatococcus et Planococcus m Le genre Micrococcus Il comprend des microcoques qui sont galement des h tes normaux de la peau et des muqueuses de l homme et par cons quent souvent pr sents dans les pr l vements Ce sont presque toujours des contaminants qu il importe de dist
12. L identification est d identification cf tableau VI rendue possible gr ce l utilisation de tableau 4 42 V 3 IDENTIFICATION DES STREPTOCOQUES NON GROUPABLES V 3 1 Isolement En vue d obtenir les colonies des germes identifier les souches conserv es 20 C ou 70 C ont t r g n r es dans un bouillon glucos tamponn puis ensemenc es sur une g lose au chlorhydrate de pyridoxal incub e l tuve 37 C pendant 24 heures V 3 2 Identification V 3 2 1 Examen macroscopique Les streptocoques non groupables se pr sentent sous forme de petites colonies translucides amp ou non h molytiques En particulier le pneumocoque donne de petites colonies mucoides ou a d pression centrale avec une h molyse viridans V 3 2 2 Examen microscopique A partir d une colonie nous avons confectionn un frottis que nous avons color au Gram L observation microscopique a l objectif immersion des streptocoques non groupables montre des cocci Gram positif group s en chainettes Cependant le pneumocoque se pr sente sous forme de diplocoques Gram positif en flamme de bougie V 3 2 3 Test la catalase cf V 2 2 4 Les streptocoques sont catalase n gative V 3 2 4 Type respiratoire cf V 2 2 3 Les streptocoques non groupables sont des bact ries a ro ana robies facultatives 43 V 3 2 5 Bile esculine e Principe Ce milieu est d
13. acide le milieu d tude sera donc acidifi par la fermentation du glucose puis alcalinis par l action des d carboxylases sur le substrat qui est un acide amin Les d carboxylases scindent les acides amin s avec formation de l amine correspondante et lib ration de dioxyde de carbone selon la r action suivante D carboxylase R CH COOH R CH NH CO NH Les enzymes le plus souvent recherch es sont ornithine d carboxylase ODC arginine dihydrolase ADH la lysine d carboxylase LDC 1 3 3 4 Production d ac toine 38 L ac toine en langage courant ou hydroxy 3 butanone ou encore dans la nomenclature ancienne acetyl methyl carbinol AMC est un produit de d gradation du glucose au cours de la fermentation du 2 3 butyl ne glycolique en passant par l ac tolactate et le diacetyl Elle peut galement tre obtenue par la condensation de deux mol cules de pyruvate Il existe entre autres la m thode conventionnelle de Voges Proskauer miniaturis e ou non incorpor e aux m thodes biochimiques d identification des staphylocoques O2 CH CHOH CO CH gt CH CO CO CH OK Hydroxy 3 butanone Butane dione rouge v CH3 CHOH CHOH CH3 Butane diol 2 3 1 3 3 5 Production de galactosidase 38 La B galactosidase est une enzyme bact rienne inductible existant un niveau de base dans le milieu intracellulaire capable de scinder la mol cule
14. des plaques pr sentant des cupules qui renferment des substrats d shydrat s destin s a la mise en vidence d activit s enzymatiques ou d assimilation de substrats carbon s en milieu appropri e ou hostile e Mode op ratoire Pr parer une suspension bact rienne de turbidit gale celle de l chelle 4 Mac Farland dans 1 ml d eau distill e st rile avec une bo te enti re de culture de 24 heures sur g lose au sang Distribuer 100 ul d inoculum bact rien par cupule de VP BHS Verser le reste de la suspension bact rienne dans 1 ml de MEVAG streptocoque et m langer Ensemencer les cupules de ARA GLY avec le MEVAG ainsi inocul 100 ul par cupule Fermer les cupules ADH et tous les sucres avec 2 gouttes d huile de paraffine Incuber 37 C sur un plateau recouvert de papier buvard imbib d eau Lire apr s 4 heures puis apr s 18 heures d incubation La lecture et l identification sont rendues possibles gr ce au tableau suivant Tableau VII Lecture des streptocoques 46 Tests Substrats R actions R actifs R sultats R sultats Enzymes ajouter positifs n gatifs VP Glucose Production 1 goutte de Rose rouge Incolore Pyruvate d ac toine KOH 1 goutte de cr atinine 1 goutte de ot naphtol ESC Esculine B glucosidase Noir Incolore ADH Arginine Arginine Rouge Jaune dihydrolase BHS Glucose Croissance en Jaune Viol
15. e R sultats Les staphylocoques sont Dnase n gative a l exception de Staphylococcus aureus Staphylococcus schleiferi Staphylococcus hyicus et certaines souches de Staphylococcus epidermidis Staphylococcus simulans V 2 2 8 Recherche de la fermentation du mannitol e Principe Certaines bact ries sont capables de fermenter le mannitol inclus dans le milieu de culture e Technique Elle consiste ensemencer les colonies dans la g lose chapman et incuber l tuve a 37 C pendant 24 heures e Lecture R action positive coloration jaune du milieu R action n gative l aspect reste inchang 39 V 2 2 9 Microm thode d identification Nous avons eu recours aux microplaques CSB staph e Principe Les galeries CSB staph permettent la mise en vidence d activit s enzymatiques ou d assimilation de substrats carbon s en milieu appropri fermentation ou hostile Avec 15 tests biochimiques il permet de faire un diagnostic d esp ces de staphylocoques e Technique La suspension bact rienne est pr par e en d layant des colonies bien isol es de 24 heures dans 1 ml d eau physiologique par couvillonnage La turbidit de la suspension bact rienne est ajust e l chelle 1 de l talon Mac Farland Il faut distribuer 100u1 d inoculum bact rien par microcupule de URE NIT verser le reste de la suspension bact rienne dans 1 ml de MEVAG et m langer ensemencer les cu
16. et m taboliques des staphylocoques a permis le d veloppement de galeries d identification rapides et efficaces permettant de d finir les diff rents profils biochimiques des souches appartenant une m me esp ce 1 3 3 1 Caract res g n raux 24 37 55 Les staphylocoques poss dent une catalase l exception de Staphylococcus aureus sous esp ces anaerobius que l on retrouve exclusivement chez les moutons et qui est une souche ana robie stricte Ce sont des germes d pourvus d oxydase en dehors de Staphylococcus lentus Staphylococcus sciuri et Staphylococcus caseolyticus 1 3 3 2 Production d ur ase 38 Les bact ries hydrolysent toute l ur e mais seules celles ayant une ur ase constitutive c est a dire dont la synth se est ind pendante de la pr sence du substrat vont arriver alcaliniser le milieu entra nant le virage de l indicateur color L ur ase est galement une enzyme inductible La recherche de l ur ase repose sur la lib ration d ions ammonium qui alcalinisent le milieu entra nant le virage de l indicateur color au rose framboise selon la r action suivante NH Ur ase CO H 0 COOH NH NH D ae Ur e COO H NH CO NH CO 2 NH H O CO NH CO NH 4 2 Carbonate d NH 4 1 3 3 3 Production de d carboxylases 38 Les d carboxylases sont des enzymes qui sont actives a pH
17. milleri pour distinguer les streptocoques non h molytiques responsables d infections buccales COLMAN et WILLIAMS 1972 ont propos de rapprocher Streptococcus milleri des streptocoques d crits par MIRICK et coll 1944 et des streptocoques d crits par OTTENS et WINKLER 1962 en raison de la similitude de leurs caract res physiologiques et de la composition de leur paroi En 1977 FACKLAM proposait d individualiser deux esp ces au sein de Streptococcus milleri sur la base de la fermentation du lactose Streptococcus intermedius lactose et Streptococcus anginosus constellatus lactose Actuellement le compos Streptococcus milleri comporte trois esp ces Streptococcus constellatus Streptococcus intermedius et Streptococcus anginosus IL 2 2 Habitat 28 Les streptocoques non groupables sont des commensaux de la cavit buccale dont ils repr sentent 30 a 60 p 100 de la flore bact rienne de l intestin de la peau et des voies g nitales 11 IL 2 3 Classification 15 21 31 59 61 62 La famille des Streptococcaceae comprend sept genres Parmi eux Streptococcus et Enterococcus regroupent la plupart des esp ces responsables d infections humaines La classification se fonde sur plusieurs crit res m la capacit d h molyser les rythrocytes h molyse incompl te Streptocoques o h molytiques h molyse compl te Streptocoques B h molytiques pas d h molyse
18. n 44 55 NOVICK R P Staphylococci In Microbiology 4 th ed NY 1990 539 560 56 PILET C BOURDON J L TOMA B MARCHALL N BALBASTRE C Bact riologie M dicale et v t rinaire Syst matique bact rienne Doins Editeurs Paris 2 ed 1983 57 PINA G RAYMOND D Crit res de choix d une m thode d identification DES Bact riologie Virologie 2003 1 27 58 POTEL G BARON D Infections a staphylocoques EMS Mal infect 8001 A 10 1990 59 RIEGEL P Actualit s de identification des streptocoques Spectra Biologie 1999 18 102 23 26 77 60 RUOFF K L Streptococcus anginosus Streptococcus milleri The unrecognised pathogen Clin Microbiol Rev 1998 1 102 108 61 SCHLEGEL L BOUVET A Streptocoques et germes apparent s Bull Soc for Microbiol 1996 62 SCLEIFER K H KILPPER BALZ R Molecular and chemotaxonomic approaches to the classification of streptococci enteroccoci and lactococci a review System Appl Microbiol 1987 10 1 19 63 THIAW C Bact riologie des rhinopharyngites purulentes de l enfant au S n gal Th se Pharm Dakar 1995 n 73 64 VAN DER AUWERA P Clinical significance of S milleri Eur J Clin Microbiol 1985 4 386 390 65 WAHL et MEYER P Les preuves dites biochimiques pour l identification des streptocoques Ann Inst Pasteur 1956 91 147 164 66 WHILEY R A BREIG
19. surface du premier et du second quadrant de la g lose nous avons d pos un disque d optochine et incub la bo te en atmosph re enrichie en CO pendant 18 heures environ Nous avons ensuite recherch la pr sence ou l absence d une zone d inhibition autour du disque d optochine e Lecture Une zone d inhibition sup rieure ou gale 14 mm de diam tre oriente vers Streptococcus pneumoniae Une absence d inhibition oriente g n ralement vers les streptocoques non groupables o viridans autre que Streptococcus pneumoniae V 3 2 8 Test de solubilit dans la bile e Principe Ce test repose sur la mise en vidence de la lyse d une colonie de streptocoques en 30 minutes en pr sence d une solution de 10 de d soxycholate de sodium e R sultats Nous avons utilis la m thode en boite de p tri 45 Sur une colonie a amp h molytique caract ristique nous avons d pos une ou deux gouttes d une solution de d soxycholate de sodium a 10 La bo te de p tri est incub e a l tuve 35 C pendant deux heures couvercle vers le haut l g rement entrouvert pour acc l rer l vaporation du r actif e Lecture Si l h molyse a viridans demeure et que la colonie dispara t il s agit de Streptococcus pneumoniae V 3 2 9 Microm thode d identification Nous avons eu recours aux microplaques CSB strepto e Principe C est une microm thode d identification Elle consiste ensemencer
20. 0094 X2 appartienne a Staphylococcus cohnii sp cohnii 0 836 X2 appartienne a Staphylococcus xylosus 0 01 La probabilit relative pour que X2 appartienne a Staphylococcus cohnii sp urealyticum 1 09 X2 appartienne a Staphylococcus cohnii sp cohnii 97 73 X2 appartienne a Staphylococcus xylosus 1 16 L algorithme nous a donc permis de bien identifier une souche de cohnii ur e n gative avec une probabilit de 97 48 55 II 4 IDENTIFICATION DE STAPHYLOCOCCUS CAPITIS Les trois souches de Staphylococcus capitis tudi es ont donn le m me profil Tableau XII Identification de Staphylococcus capitis Esp ces X Staphylococcus Staphyloccoccus Staphylococcus Staphylococcus auricularis capitis haemolyticus capitis Caract res probable Gram 100 100 100 Catalase 100 100 100 Oxydase 0 0 0 Mannitol 9 36 60 Coagulase 0 0 0 D Nase 0 0 4 UREE 1 35 1 ADH 90 85 85 VP 1 90 57 ONPG 0 0 13 TRE 90 2 91 Lf La probabilit absolue pour que X appartienne Staphylococcus auricularis 8 02 10 X appartienne Staphylococcus capitis 0 17 X appartienne Staphylococcus haemolyticus 2 16 107 La probabilit relative pour que X appartienne Staphylococcus auricularis 0 04 X appartienne Staphylococcus capitis 89 4
21. 7 X appartienne Staphylococcus haemolyticus 11 84 56 L algorithme a permis une identification acceptable de Staphylococcus capitis avec une probabilit relative de 89 47 II 5 IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Les deux souches de Streptococcus pneumoniae tudi es ont donn le m me profil Tableau XIII Identification de Streptococcus pneumoniae Esp ces X Streptococcus Streptococcus Streptococcus Streptococcus pneumoniae sanguis mitis pneumoniae Caract res probable Gram 100 100 100 Catalase 0 0 0 Bile esculine 0 0 0 BHS 0 0 0 B HEM 1 0 0 Sels biliaires 98 0 0 Optochine 90 0 0 VP 0 0 0 ESC 39 42 3 ADH 57 90 99 RAF 87 55 31 TRE 98 98 1 3 La probabilit absolue pour que X appartienne Streptococcus pneumoniae 2 6 10 X appartienne Streptococcus mitis 0 X appartienne a Streptococcus sanguis 0 La probabilit relative pour que X appartienne a Streptococcus pneumoniae 100 X appartienne a Streptococcus mitis 0 X appartienne a Streptococcus sanguis 0 La probabilit relative pour que X soit Streptococcus pneumoniae est de 100 L algorithme tabli a permis donc une excellente identification de Streptococcus pneumoniae Il 6 IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS MITIS
22. 795 834 30 HORODNICEANU T DELBOS F Les streptocoques non groupables dans les infections humaines Identification et sensibilit aux antibiotiques Ann Microbiol Inst Pasteur 1982 1336 255 269 31 HOUNKPONOU E Etude compar e de identification et de la sensibilit de Streptococcus pneumoniae et Strepcoccus pyogenes isol s d infections humaines donn es prospectives a Dakar Th se Pharm Dakar 2003 n 42 32 HUSSAIN Z STOAKES L STEVENS D L SCHIEVEN B C LANNIGAN R JONES C Comparaison of the Micro Scan System with API Staph Ident System for species identification of coagulase negative staphylococci J Clin Microbiol 1986 23 1 126 128 33 JACQUES C Les syst mes automatiques d identification bact rienne Pr cis de Bact riologie Clinique 2000 6 147p 73 34 KECHRID A BEN REDJEB S GARGOURI J FENDRI C BEN HASSEN E BOUJNAH A Les streptocoques non groupables Identification sensitivit aux antibiotiques M decine Tropicale 1991 51 2 181 184 35 KELLOGG J A BANKERT D A ELDER C J GIBBS J L SMITH M C Identification of Streptococcus pneumoniae revisited J Clin Microbiol 2001 39 3373 3375 36 KLOOS W E and BANNERMAN T L Staphylococcus and Micrococcus In P R Murray E J Barron M P Faller F C Tenover and R H Yolken eds Manual of Clinical Microbiology Washington 1995 6th ed ASM Press 282 298 37 KL
23. HTON D Emended descriptions and recognition of Streptococcus intermedius Streptococcus anginosus as distinct species Bacteriol 1991 41 1 5 78 RESUME Les infections staphylocoques sont ubiquitaires et repr sentent un pourcentage important des infections graves Consid r s depuis des ann es comme des germes commensaux de la peau et des muqueuses les staphylocoques coagulase n gative sont actuellement reconnus comme des agents majeurs d infections nosocomiales Les streptocoques non groupables sont des commensaux de la cavit buccale dont ils repr sentent 30 60 de la flore bact rienne de l intestin de la peau et des voies g nitales Ces streptocoques jouent un r le tiologique pr dominant dans la formation des caries dentaires et des parodontopathies Le diagnostic microbiologique et le traitement de ces infections imposent l identification correcte de l agent tiologique en vue d une bonne prise en charge th rapeutique C est dans cette optique que nous avons entrepris l laboration d algorithmes d identification des staphylocoques coagulase n gative et des streptocoques non groupables Pour valider le processus d identification nous avons utilis une approche comprenant trois phases essentielles la premi re phase a consist en la validation des m thodes d identification gr ce l utilisation de souches de r f rence garantissant l efficacit
24. Les infections staphylocoques sont ubiquitaires et repr sentent un pourcentage important des infections graves Consid r s depuis des ann es comme des germes commensaux de la peau et des muqueuses les staphylocoques coagulase n gative sont actuellement reconnus comme des agents majeurs d infections nosocomiales La pathog nicit des staphylocoques pose peu de probl mes en ce qui concerne Staphylococcus aureus mais elle est plus discut e pour les staphylocoques coagulase n gative D ind niables infections nosocomiales caus es par ces staphylocoques non pathog nes ont suscit des travaux visant les identifier et les classer Les streptocoques non groupables sont des commensaux de la cavit buccale dont ils repr sentent 30 60 de la flore bact rienne de l intestin de la peau et des voies g nitales Ces streptocoques jouent un r le tiologique pr dominant dans la formation des caries dentaires et des parodontopathies En outre ces streptocoques sont fr quemment rencontr s dans les infections du tractus respiratoire dans les abc s pulmonaires Streptococcus milleri ost omy lites arthrites et pleur sie 17 30 64 Malgr ce r le pathog ne devenu vident la bonne identification de ces genres n tait pas souvent possible en routine dans les laboratoires En effet la mise au point et la simplification des sch mas d identification biochimique n a pas pu r soudr
25. NEGATIVE V 2 1 Isolement En vue d obtenir les colonies des germes identifier les souches conserv es 20 C ou 70 C ont t r g n r es dans un bouillon glucos tamponn puis ensemenc es sur une g lose au sang ordinaire incub e l tuve a 37 C pendant 24 heures 35 V 2 2 Identification V 2 2 1 Examen macroscopique Les staphylocoques donnent sur g lose au sang de mouton des colonies opaques lisses jaunes ou blanches entour es d une zone d h molyse V 2 2 2 Examen microscopique A partir d une colonie nous avons confectionn un frottis que nous avons ensuite color au Gram L examen microscopique l objectif immersion montre des diplocoques Gram positif dispos s en amas ou en grappes de raisin V 2 2 3 Test la catalase e Principe La catalase est une enzyme qui hydrolyse le peroxyde d hydrog ne en eau plus oxyg ne e Technique Ce test consiste r aliser un frottis partir de colonies isol es sur un milieu exempt de sang comme la g lose trypticase soja Nous y avons d pos quelques gouttes de peroxyde d hydrog ne a 3 et recherch imm diatement une lib ration d oxyg ne e Lecture Catalase positive apparition de bulles d oxyg ne Catalase n gative l aspect reste inchang e R sultats Les staphylocoques sont catalase positive l exception de Staphylococcus saccharolyticus et Staphylococcus aureus anaerobius qui s
26. OOS W E and BANNERMAN T L Update on Clinical significance of coagulase negative staphylococci J Clin Microbiol Rev 1994 7 117 140 38 KLOOS W E and LAMBE J R D W Staphylococcus In Manual of Clinical Microbiology 4 th ed Am Soc For Microbiology Washington DC 1981 222 235 39 KLOSS W E and SCHLEIFER K H Genus Staphylococcus Bergy s Manual of Systematic Bacteriology Baltimore Williams and Wilkins 1986 2 1013 1035 74 40 KLOOS W E SCHLEIFER K H Simplified scheme for routine identification of human staphylococcus species J Clin Microbiol 1975 1 82 88 41 KLOSS W E and WOLFSHOAL J F Identification of Staphylococcus with API staph J Clin Microbiol 1982 16 3 503 516 42 KONATE B Microm thodes d identification et d tude de la sensibilit des staphylocoques ent rocoques et streptocoques Int r t et application dans le diagnostic rapide des infections microbiennes Th se Pharm Dakar 2001 n 100 43 KONTIAINEN S SIVONEN A Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae strains isolated from blood and midde ear fluid Eur J Clin Microbiol 1987 6 422 424 44 LE MINOR L VERON M Bact riologie M dicale Flammarion M d Science Paris 1989 45 LEMOZY J et SUC C Actualit s sur les streptocoques et ent rocoques Donn es taxonomiques et identification Feuillets de Biologie 1997 15 22 46 MARA M Etud
27. actifs Quantit L tryptophane 0 6 g Phosphate monopotassique 0 2 g Phosphate dipotassique 0 2 g NaCI lg Eau distill e 100 ml St riliser par filtration m Milieu de Falkow C est le milieu de base pour la recherche des d carboxylases Il est commercialis sous forme d shydrat e e Formule R actifs Quantite Extrait de levure 0 6 g Glucose 0 2 g NaCl lg Rouge de Ph nol 0 03 g Acide amin L ornithine ou L arginine lg Eau distill e 100 ml Le milieu ainsi pr par doit tre autoclav a 120 C pendant 15 minutes et son pH ajust a 6 3 6 4 23 Milieu de Clark et Lubs r action de Voges Proskauer e Formule R actifs Quantit Polypeptone ou peptone sans NaCl 0 7 g Glucose 0 5 g Phosphate dipotassique 0 5 g Eau distill e 100 ml Ajuster pH 6 9 et autoclaver 120 C pendant 20 minutes m Milieu l ONPG Il concourt la caract risation de la f galactosidase Dix disques d ONPG ont t immerg s dans 5 ml d eau distill e puis le milieu obtenu a t homog n is pour favoriser l lution des disques m Milieu pour la recherche de la nitrate r ductase Il s agit d un bouillon nutritif nitrat e Formule R actifs Quantit Peptone 0 5 g Extrait de viande 0 3 g Eau distill e 100 ml Ajuster pH 7 et ajouter 2 g de nitrate de sodium dissoudre et autoclaver 121 C pendant 15 minutes NB Avec du bouillon nutritif d shydrat il suffit de dissoudre 1 6 g d
28. alement par la voie oxydative se traduit presque toujours par l accumulation de d riv s acides quelque soit la voie de d gradation II LES STREPTOCOQUES NON GROUPABLES II 1 DEFINITION Les streptocoques bact ries ovoides ou sph riques associ es en chainettes appartiennent a la vaste famille des Streptococcaceae ensemble h t rog ne de cocci prenant la coloration de Gram d pourvues de cytochrome et de catalase Ils sont immobiles non sporul s a ro ana robies facultatifs II 2 TAXONOMIE II 2 1 Historique 15 16 60 62 66 En 1877 BILROTH et EHRLICH ont donn le nom de Streptococcus des cocci formant des chainettes observ s dans les blessures infect es 10 Streptococcus salivarius a t d crit depuis le d but du si cle ANDREWES et HORDER 1906 Il doit son appellation au fait qu il soit retrouv de fa on commune au niveau de la salive CLARKE 1924 d crit Streptococcus mutans Il fut tr s vite reconnu comme agent d endocardite infectieuse ABERCOMBRE et SCOTT 1928 Streptococcus mutans est en fait un groupe h t rog ne divis d abord en quatre esp ces Streptococcus mutans la plus fr quente Streptococcus rallus Streptococcus cricetus et Streptococcus sobrinus auxquels sont venus se rajouter deux nouvelles esp ces isol es chez le rat Streptococcus ferus ou le singe Streptococcus mucacae GUTHOF 1956 utilise pour la premi re fois le terme de Streptococcus
29. cose et d autres du levane partir du fructose Les principaux caract res biochimiques des streptocoques non groupables sont r sum s dans le tableau ci dessous 14 15 I MATERIEL ET REACTIFS I 1 MATERIEL I 1 1 Cadre d tude Ce travail a t effectu Unit de Recherche et de Biotechnologie microbienne du Laboratoire de Bact riologie Virologie de H pital Aristide Le Dantec 1 1 2 Souches bact riennes Nous avons utilis des souches de staphylocoques et de streptocoques 1 1 3 Mat riel pour la pr paration des milieux Balance de pr cision Agitateur magn tique pH m tre Seringues Filtres millipores Micropipettes de 100 et 200 ul Embouts st riles Flacons en verre Tubes st riles bouchon Erlen meyer Bain marie Autoclave 1 1 4 Mat riel pour l enrichissement et l isolement Tube nunc Anse de platine Bo tes de P tri Bec bunsen Etuve Autoclave Jarre d incubation G n rateur de CO ou bougie 1 1 5 Mat riel pour l identification 1 1 5 1 Mat riel de laboratoire Bec bunsen Etuve Four micro ondes Agitateur magn tique Appareil de scellage Dessiccateur sous vide air renouvel Microscope optique 1 1 5 2 Mat riel de paillasse Micropipettes Microplaques Embouts st riles Becher rempli d eau de javel Plateau inoxydable de pr
30. cro ondes Dans ces conditions les substrats sont d shydrat s soit 37 C pendant 48 heures soit 40 C pendant 14 heures soit 42 C pendant 15 heures m Contr le de qualit des milieux d shydrat s e Contr le de st rilit Apr s 24 48 heures d incubation et apr s r v lation de certains tests le lot est consid r comme st rile en l absence de virage de l indicateur et en l absence de r action positive pour les tests r v l s e Contr le d efficacit Nous avons eu recours la m me technique que celle utilis e pour les milieux liquides La diff rence est que les cupules renferment des milieux d shydrat s V METHODOLOGIE Il s agissait de suivre les diff rentes proc dures d crites dans les algorithmes ci apr s 31 32 33 34 V 1 SOUCHES ETUDIEES L valuation a port sur des souches d j identifi es par les m thodes conventionnelles La r partition des souches bact riennes par genre et par esp ce est donn e dans le tableau IV Tableau IV R partition des souches bact riennes Genre Esp ces Nombre Staphylococcus cohnii 6 Staphylococcus xylosus 5 Staphylococcus Staphylococcus haemolyticus l Staphylococcus capitis 3 Staphylococcus warneri 3 Streptococcus pneumoniae 2 Streptococcus sanguis 3 Sure incogeys Streptococcus milleri 2 Streptococcus mitis 2 Total 27 V 2 IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE
31. de lactose en sucres simples que sont le glucose et le galactose apr s avoir travers la paroi cellulaire sous l action de la B galactosidase perm ase Le terme ONPG hydrolase est plus propos que celui de B galactosidase dans la mesure o il pr cise que le substrat utilis est ONPG et non le lactose Le test a ONPG est une technique relativement simple bas e sur l action directe de l enzyme sur une mol cule chromog ne pouvant tre lortho nitroph nyl B D galactopyranoside ou le 2 naphtol B D galactopyranoside Ceux ci sont utilis s comme substrats et lib rent respectivement l orthonitrophenol jaune et le B naphtol qui se combine au sel de Fast blue B en solution dans le 2 methoxyethanol pour donner une coloration rouge pourpre Les r actions chimiques mises en jeu peuvent tre d crites de la fa on suivante B galactosidase Lactose H O Galactose Glucose Orthonitrophenyl B D Galactopyranoside H O Se T Incolore B galactosidase ONP ortho nitro 2 phenol naphtol jaune 1 3 3 6 R duction des nitrates 54 Les compos s oxyg n s de l azote peuvent tre utilis s comme accepteurs terminaux d lectrons dans les cha nes d oxydo r duction cellulaires La r duction des nitrates et des nitrites constitue un des caract res taxonomiques importants chez les staphylocoques lors de leur identification Ce test permet d tudier la r action de r duction des nitrates en n
32. des chainettes de longueur variable se pr sentant comme une suite de diplocoques li s par du mat riel de la paroi cellulaire Les streptocoques ne poss dent pas de capsule externe autour de la paroi sauf chez les formes S smooth des pneumocoques irr guli rement et transitoirement cultures jeunes chez certaines souches des groupes A et C IL 3 2 Caract res culturaux 1 3 4 10 42 La pousse de nombreuses esp ces exige des milieux nutritifs enrichis de sang ou de s rum Les milieux g los s nutritifs g lose nutritive ordinaire g lose trypticase soja milieu de Miiller Hinton g lose Columbia additionn s de 5 de sang de cheval ou de mouton conviennent tr s bien La temp rature optimale de croissance est de 35 37 C Les streptocoques non groupables sont des germes tr s exigeants qui repoussent difficilement sur les milieux usuels pour streptocoques apres leur isolement d une h moculture trouble uniforme du milieu liquide La mise en vidence de ces souches est possible en milieu de culture thiol s L cyst ine acide thioglycolique polyvitex etc de pyridoxine et de D alanine La croissance est plus riche en ana robiose ou en pr sence de 10 de CO Habituellement la croissance de ces germes est r v l e par la croissance d autres souches staphylocoques ent robact ries sur le milieu g los au sang Ce ph nom ne de satellitisme est caract ris par la croissance des streptocoques
33. e d eau distill e autoclaver le m lange 118 C pendant 15 minutes II 3 REACTIFS DE REVELATION e Potasse 10 VP1 Potasse 10 g Eau distill e 100 ml e Cr atinine 1 VP2 Cr atinine lg Eau distill e 100 ml e a naphtol VP3 Naphtol lg Ethanol 70 C 100 ml e Acide sulfanilique Acide sulfanilique 0 8 g Ethanol 95 C 100 ml e o naphtylamine amp naphtylamine 0 5 g Ethanol 100 ml 26 Ill CONTROLE DE QUALITE DES MILIEUX LIQUIDES Chaque lot de milieu pr par est soumis un contr le de st rilit et un contr le d efficacit sur le plan bact riologique HI 1 CONTROLE DE STERILITE Un millilitre de chaque milieu pr par est d pos dans des tubes h molyse st riles qui sont incub es 37 C tude pendant 24 48 heures Les milieux sont consid r s comme st riles en l absence de trouble et virage de l indicateur color HI 2 CONTROLE D EFFICACITE Il est r alis avec des souches de r f rence et de contr le dont le profil biochimique est stable et bien connu Ainsi le milieu consid r comme st rile doit faire l objet d une tude en ce qui concerne sa capacit donner un r sultat positif ou n gatif pour un caract re donn m Technique Deux plaques sont pr vues pour chaque galerie contr les positifs et n gatifs 100 ul de chaque milieu sont d pos s dans le puits correspondant au niveau de la plaque de fa on extemporan e
34. e des maladies streptococciques en Afrique Occidentale Th se M d Dakar 1973 n 26 75 47 MARCHAL N BOURDON J L RICHARD C L Les milieux de culture pour l isolement et l identification biochimique des bact ries Doins Editeurs Paris 1987 48 MARCHOU B LEMOZY J Infection streptocoques Editions Techniques Encycl Med Chir Paris France Maladies Infectieuses P diatrie 8 009 A 10 et 4 250 A 20 1993 20 p 49 MILLER J M O HARA M C Substrate utilization systems for the identification of bacteria and yeasts in diagnostic technologies in clinical Microbiology ASM Press Washington DC 1995 6 eds 103 109 50 MINTO E C BARELLI C MARTINEZ R DA COSTA DARINI A Identification and medical importance of coagulase negative Staphylococci species Med J Sao Paulo 1999 Jul 1 117 4 175 178 51 MOUDEWHENOU E M Place des germes non exigeants et les bact ries ana robies dans les infections respiratoires basses Dakar Th se Pharm Dakar 2000 n 90 52 MOUNIER M DENIS F Les cocci Gram positif Bact riologie M dicale Techniques Usuelles SIMEP ed Paris 1987 105 116 76 53 MURRAY H W GROSS K C MASUR H and al Serious infections caused by Streptococcus milleri Amer J Med 1978 64 759 764 54 NDAOS K Mise au point d une microm thode d identification biochimique des staphylocoques Th se Pharm Dakar 1999
35. e le probl me puisque cette m thode pr sentait l inconv nient de n cessiter le recours un grand nombre de r actions biochimiques des milieux sp cifiques et des temps d incubation tr s longs 1 Ainsi le but de notre travail tait d laborer des algorithmes qui permettent une identification correcte rapide et pr cise des staphylocoques coagulase n gative et des streptocoques non groupables Cela rendra le travail de routine plus rapide plus fiable et plus accessible financi rement aux populations m me les plus d munies I LES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE NEGATIVE 1 1 DEFINITION Les staphylocoques sont des cocci a Gram positif classiquement dispos s en amas immobiles non sporul s Actuellement on distingue 44 esp ces L esp ce Staphylococcus aureus se distingue g n ralement des autres staphylocoques a coagulase n gative par la pr sence d une coagulase 1 2 TAXONOMIE 1 2 1 Historique 42 Les staphylocoques ont t l objet de nombreuses investigations men es par d minents microbiologistes l instar de KOCH PASTEUR OGSTON et ROSENBACH En 1878 KOCH souligne le r le pathog ne de bact ries se pr sentant sous forme de cocci Gram positif Ces cocci seront ensuite isol s puis identifi s d un pus par Louis Pasteur en 1880 Ils seront baptis s en 1883 par Ogston sous le nom de staphylocoques du latin staphylle ou grappe et coccus ou grain
36. e milieu sec dans 100 ml d eau distill e pour pr parer le bouillon 24 m Milieu pour la mise en vidence de l attaque de l esculine e Formule R actifs Quantit Peptone 20 g l Citrate de fer ammoniacal 2 g l Glucose 2 g l Ajuster le m lange pH 7 4 St riliser 110 C pendant 30 minutes m Pr paration des sucres Glucides St rilisation Temp rature et dur e Arabinose 10 Tyndalisation ou filtration 60 C 30 minutes x 3 jours Mannitol 10 Autoclavage 110 C 10 minutes Sorbitol 10 Autoclavage 110 C 10 minutes Tr halose 10 Autoclavage 110 C 10 minutes Raffinose 10 Autoclavage 110 C 10 minutes Sorbose 10 Autoclavage 110 C 10 minutes Inuline 5 Autoclavage 110 C 10 minutes Lactose 10 Tyndalisation ou filtration 60 C 30 minutes x 3 jours Amidon 2 5 Autoclavage 115 C 30 minutes Glyc rol 10 Autoclavage 115 C 30 minutes Glucose 10 Autoclavage 110 C 10 minutes Xylose 10 Filtration Saccharose 10 Tyndalisation ou filtration 60 C 30 minutes x 3 jours Mannose 10 Autoclavage 110 C 10 minutes 25 m MEVAG Strepto Staph Il s agit d une base de culture au rouge de ph nol commercialis e sous forme de poudre d shydrat e e Formule approximative par litre R actifs Quantit Extrait pancr atique de cas ine 10 0 g Chlorure de sodium 5 0 g Rouge de ph nol 0 018 g e Mode d emploi Suspendre 15 g de poudre dans un litr
37. ervation des souches Bouillon c ur cervelle 10 de glyc rol s rum de veau foetal Lait cr m G lose Miiller Hinton Billes 19 II PREPARATION DES DIFFERENTS MILIEUX II 1 MILIEUX POUR L ENRICHISSEMENT ET L ISOLEMENT Bouillon glucos tamponn C est un milieu de r g n ration des souches conserv es 20 C et 70 C e Formule R actifs Quantit Bouillon glucos tamponn 19 g Eau distill e 500 ml R partir dans les tubes vis et autoclaver 115 C pendant 20 minutes ajuster le pH 7 4 e G lose au sang chlorhydrate de pyridoxal C est un milieu d isolement des streptocoques non groupables Milieu de base R actifs Quantit G lose Agar 8 5 Trypticase Soja 15 g Eau distill e 500 ml Autoclaver le m lange pendant 15 minutes 121 C Laisser refroidir Milieu complet R actifs Quantit Milieu de base 500 ml Sang de mouton 25 ml Chlorhydrate de pyridoxal 0 05 g Homog n iser le m lange et le r partir dans des bo tes de p tri 20 e G lose au sang ordinaire C est le milieu utilis pour isoler les staphylocoques Il permet d obtenir des colonies de taille plus importante Milieu de base R actifs Quantit G lose Agar 8 5 Trypticase Soja 15 g Eau distill e 500 ml Autoclaver le m lange 121 C pendant 15 minutes Laisser refroidir Milieu complet R actifs Quantit Milieu de base 500 ml Sang de mouton 25
38. estin lisolement s lectif et a la diff renciation des streptocoques D pour lesquels la tol rance la bile et l hydrolyse de l esculine sont consid r es comme des caract res constants e Technique La colonie pr lev e avec soin est ensemenc e dans la g lose bile esculine par piq re centrale puis incubation l tuve 37 C pendant 24 heures e Lecture Les streptocoques du groupe D et les ent rocoques sont bile esculine positifs Les autres streptocoques sont bile esculine n gatifs Cependant des souches bile esculine positive peuvent s observer avec Streptocococcus mutans V 3 2 6 Bouillon hypersal e Principe C est un bouillon qui permet de diff rencier les ent rocoques des non ent rocoques e Technique Les colonies pr lev es avec soin sur la g lose sont d lay es dans le bouillon hypersal puis incubation l tuve a 37 C pendant 24 heures e Lecture Les ent rocoques vrais se d veloppent en 24 48 heures Les non ent rocoques sont incapables de pousser e R sultats Les streptocoques non groupables sont BHS 44 V 3 2 7 Test de sensibilit a l optochine e Principe oy Les colonies de Streptococcus pneumoniae sont g n ralement sensibles oy l optochine alors que les autres streptocoques non groupables sont r sistants l optochine e Technique Une boite de g lose au sang est inocul e avec une culture pure pr sum e de Streptococcus pneumoniae A la
39. et milieu hypersal ARA L Arabinose MAN Mannitol SOR Sorbitol TRE Tr halose RAF Raffinose SOS Sorbose Fermentation Jaune Rouge INU Inuline LAC Lactose RIB Ribose AMD Amidon GLY Glyc rol 47 48 I MISE AU POINT DES ALGORITHMES Seuls les caract res majeurs c est a dire ceux suppos s indispensables pour Videntification d une esp ce ont t retenus dans nos algorithmes Ces caract res peuvent diff rer d une esp ce une autre L 1 LES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE NEGATIVE Les caract res suivants ont t retenus Gram type respiratoire recherche de la catalase de l oxydase de la coagulase de la DNase de la fermentation du mannitol et du glucose synth se d ur ase d ADH de B galactosidase sensibilit la novobiocine d gradation du glucose en ac toine assimilation du tr halose du xylose du saccharose du mannose et du lactose I 2 LES STREPTOCOQUES NON GROUPABLES Les caract res suivants ont t retenus Gram type respiratoire recherche de la catalase croissance sur bile esculine et sur milieu hypersal type d h molyse lyse par la bile la sensibilit l optochine d gradation du glucose en ac toine 49 hydrolyse de l esculine synth se d ur ase d ADH assimilation du tr halose du raffinose et de l inuline II VALIDATION DES ALGORITHMES 57 Apres avoir labor nos algorith
40. f rence Papier buvard Etalon de Mac Farland Anse de platine Emballage plastique Lame porte objet Lamelles 16 1 1 6 Mat riel pour la conservation Tubes nunc Tubes st riles a vis Cryotubes avec billes Portoirs Anse de platine I 2 REACTIFS 1 2 1 R actifs pour l enrichissement et l isolement Bouillon glucos tamponn G lose Miiller Hinton MH G lose trypticase soja Sang de mouton G lose chapman Chlorhydrate de pyridoxal L cyst ine 1 2 2 R actifs pour l identification 1 2 2 1 Substrats pour Videntification Eau oxyg n e Disques oxydase Violet de gentiane Lugol Alcool 95 C Fuchsine de Zieh Plasma de lapin G lose l ADN Bile esculine Bouillon hypersal Milieu ur e tryptophane 17 18 Milieu de Clark et Lubs Milieu ONPG Eau distill e Milieu pour la recherche de la nitrate r ductase Esculine Milieu de Falkow L ornithine L arginine Bouillon rouge de ph nol Glucides glucose mannitol xylose saccharose glyc rol mannose lactose raffinose L arabinose sorbitol Tr halose sorbose inuline lactose ribose amidon Huile de paraffine 1 2 2 2 R actifs de r v lation Acide sulfanilique 8 g l amp naphtylamine 5 g l Potasse 10 Cr atinine 1 amp naphtol 1 2 3 R actifs pour la cons
41. hodes diagnostiques des staphylocoques coagulase n gative M d et Mal Infect 1990 hors s rie Mars 16 23 13 CIUPEK C PANGON B GHNASSIA J C Staphylocoques coagulase n gative habitat pouvoir pathog ne Identification r sistance aux antibiotiques Feuillets de Biologie Paris 2002 43 245 19 29 70 14 COLY I Microm thodes d identification biochimique des bact ries M moire Sciences 1999 15 COYKENDALL A L Classification and identification of the viridans streptococci J Clin Microbiol Rev 1989 2 315 328 16 COYKENDALL A L WESBECKER P M GUSTAFAON K B Genetic Similarities among four species of Streptococcus S milleri S anginosus S constellatus and S intermedius Int J Syst Bacteriol 1987 37 222 228 17 DENIS F SAMBA A CHIRON J P DIOP MAR I Infections streptocoques en Afrique vues par les laboratoires Bull Soc M d Afr 1978 23 347 350 18 DIOP F Donn es sur la sensibilit aux antibiotiques des souches de streptocoques d ficients isol es d infections respiratoires ost o articulaires et cardiovasculaires Th se Pharm Dakar 2002 n 67 19 DIOUF M F Evaluation de diff rentes m thodes de conservation des souches bact riennes exigeantes Th se Pharm Dakar 2004 n 13 20 Encyclop die m dicale de la famille Larousse s lection du Reader s Digest 1991 71 21 FACKLAM R What hap
42. inguer des staphylocoques m Le genre Staphylocococcus Il comprend de nombreuses esp ces certaines sont des h tes de l homme d autres des animaux d autres sont rencontr s la fois chez l homme et l animal Chez l homme les esp ces les plus couramment rencontr es sont Staphylococcus aureus le plus pathog ne Staphylococcus epidermidis souvent consid r comme un opportuniste Satphylococcus saprophyticus responsable d infections urinaires chez la femme jeune et une fr quence moindre Sfaphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus capitis et Staphylococcus auricularis 4 Staphylococcus aureus exprime des caract res qui le diff rencient des autres staphylocoques il poss de notamment une coagulase En pratique bact riologique courante ce caract re permet de faire la distinction entre Staphylococcus aureus d une part et les staphylocoques coagulase n gative d autre part m Le genre Stomatococcus Il comprend Stomatococcus mucilaginosus qui fait partie de la flore buccale m Le genre Planococcus Il comprend des bact ries du milieu marin 1 3 CARACTERES BACTERIOLOGIQUES 1 3 1 Caract res morphologiques 24 38 55 Les staphylocoques se pr sentent l examen microscopique sous l aspect de coques Gram positif isol s ou group s en diplocoques ou en amas Le mode de groupement dit en grappe ou en amas est plus caract ris
43. ispensables de permettre une bonne identification I 1 CARACTERES D IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE NEGATIVE Sur les 17 caract res retenus dans l algorithme d identification des staphylocoques coagulase n gative 2 taient n cessaires au diagnostic de famille Gram et catalase 3 au diagnostic du genre recherche de l oxydase fermentation du glucose type respiratoire 12 au diagnostic d esp ces coagulase DNase fermentation du mannitol novobiocine ur e ADH VP ONPG lactose xylose mannose tr halose I 2 CARACTERES D IDENTIFICATION DES STREPTOCOQUES NON GROUPABLES Sur les 14 caract res retenus dans l algorithme d identification des streptocoques non groupables 2 taient n cessaires au diagnostic de famille Gram et catalase 2 au diagnostic de genre croissance sur bile esculine et sur BHS 10 au diagnostic d esp ces h molyse sensibilit l optochine lyse par la bile VP ESC ADH raffinose inuline tr halose mannitol 61 II IDENTIFICATION II 1 LES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE NEGATIVE Les staphylocoques se d veloppent bien sur g lose au sang ordinaire en donnant des colonies distinctes isol es D apr s Brun Y BES M 12 le diagnostic du genre comprend la r alisation d un ou de plusieurs de ces tests fermentation du glucose acidification du glyc rol recherche de l oxydase sensibilit la lysostaphine
44. it relative pour que l esp ce X identifi comme warneri partir de l algorithme soit warneri est de 94 2 52 II 2 IDENTIFICATION DE STAPHYLOCOCCUS XYLOSUS Les cing 5 souches de Staphylococcus xylosus tudi es ont donn le m me profil Tableau X Identification de Staphylococcus xylosus Esp ces X Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus xylosus cohnii sp saprophyticus xylosus Caract re urealyticum probable Gram 100 100 100 Catalase 100 100 100 Oxydase 0 0 0 Mannitol 90 94 88 Coagulase 0 0 0 D Nase 0 0 0 UREE 90 99 65 ADH 5 0 30 Xylose 82 0 0 f 1 f Probabilit absolue pour que X appartienne Staphylococcus xylosus 0 63 X appartienne Staphylococcus cohni sp urealyticum 0 X appartienne a Staphylococcus saprophyticus 0 Probabilit relative pour que X appartienne a Staphylococcus xylosus 100 X appartienne Staphylococcus cohni sp urealyticum 0 X appartienne Staphylococcus saprophyticus 0 53 La probabilit relative pour que X appartienne l esp ce Staphylococcus xylosus est de 100 Notre d marche a permis une excellente identification de Staphylococcus xylosus II 3 IDENTIFICATION DE STAPHYLOCOCCUS COHNII Les souches de Staphylococcus cohnii tudi es ont donn deux profils diff rents 5 sont ur
45. itrites sous l action de la nitrate r ductase produite par certains staphylocoques La r action sera mise en vidence par l addition d acide sulfanilique et d alpha naphtylamine qui r v lent la pr sence de l ammoniaque lib r 1 3 3 7 R sistance la novobiocine 47 Les staphylocoques coagulase n gative sont habituellement class s selon le crit re de sensibilit ou de r sistance la novobiocine La novobiocine est un antibiotique bact riostatique peu utilis en th rapeutique pouvant s av rer tr s actif sur les bact ries Gram positif en particulier les staphylocoques Son action consiste en l inhibition de la r plication de l acide d soxyribonucl ique ADN ce qui emp che la fixation de l ATP sur la sous unit B de l ADN gyrase ph nom ne fournissant l nergie n cessaire au fonctionnement de cette enzyme Ce sont g n ralement les souches de Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus cohnii cohnii Staphylococcus cohnii urealyticum et Staphylococcus xylosus qui sont r sistantes la novobiocine 1 3 3 8 Utilisation des hydrates de carbone 47 Les glucides sont utilis s de trois mani res diff rentes par les staphylocoques soit apr s conversion par l action d isom rases apr s hydrolyse en sucres simples ou directement s ils sont fournis sous une forme simple glucose fructose L assimilation tudi e surtout par la voie fermentaire mais g
46. ius mutans milleri probable Gram 100 100 100 Catalase 0 0 0 Bile esculine 0 0 10 BHS 0 0 0 B HEM 40 1 1 Sels biliaires 0 0 0 VP 100 85 99 ESC 87 98 99 ADH 100 0 18 INU 3 34 81 O Lf 59 La probabilit absolue pour que X appartienne Streptococcus intermedius 0 51 X appartienne a Streptococcus salvarius Q X appartienne Streptococcus mutans 0 03 La probabilit relative pour que X appartienne Streptococcus intermedius 94 44 X appartienne Streptococcus salvarius 0 X appartienne Streptococcus mutans 5 5 La probabilit relative pour que l esp ce du groupe milleri identifi appartienne Streptococcus intermedius est de 94 44 L algorithme nous a permis de bien identifier Streptococcus milleri D autres calculs effectu s ont galement montr que la probabilit relative pour que cette esp ce appartienne Streptococcus anginosus est de 95 3 La diff rence n est pas significative 60 Comme tout processus de diagnostic microbiologique nous avons commenc par une validation des m thodes d identification grace l utilisation de souches de r f rence garantissant l efficacit des diff rents milieux d isolement galeries d identification et autres tests utilis s I MISE AU POINT DES ALGORITHMES Les caract res retenus taient ceux qui taient susceptibles et ind
47. ive NB pour pr lever les colonies tester il ne faut pas utiliser des fils m talliques charg s d oxydes qui pourraient tre responsables d un r sultat faussement positif V 2 2 6 Test la coagulase e Principe La coagulase est une enzyme d origine chromosomique Ce test met en vidence la coagulase lib r e dans le milieu de culture e Technique Ce test consiste 4 mettre dans un tube a essai 0 5 ml de suspension bact rienne et 0 5 ml de plasma de lapin et l incubation se fait l tuve pendant 3 a 24 heures e Lecture Une r action positive se traduit par une coagulation du plasma de lapin au bout de 3 heures R action n gative l aspect reste inchang e R sultats Les staphylocoques sont coagulase n gative l exception de Staphylococcus aureus Staphylococcus schleiferi et certaines souches de Staphylococcus hyicus V 2 2 7 Test la DNase e Principe Certaines bact ries sont capables de d grader l ADN inclus dans le milieu de culture 38 e Technique Ce test consiste ensemencer les colonies suspectes sous forme de strie dans la g lose a l ADN et incuber l tuve 37 C pendant 24 heures Apr s culture le milieu est inond d acide chlorhydrique normal e Lecture L apparition d une zone claire autour de la strie d ensemencement indique une r action positive L absence d une zone claire traduit une r action n gative
48. mes et identifi les diff rentes esp ces dont nous disposons nous avons essay de valider ces algorithmes Cette validation va passer par l identification de souches suppos es inconnues Cette identification est bas e sur la mesure de similitude entre son profil et celui des esp ces identifiables l aide de donn es recueillies tables diagnostiques Cependant nous avons utilis les r sultats de la galerie API staph et API strepto comme r f rence Dans les tables diagnostiques ou matrices de donn es est contenue pour chaque taxon la probabilit de positivit f aux diff rents tests Si la r ponse de la souche pour un test est positive on retient la valeur f si elle est n gative on retient la valeur 1 f probabilit de n gativit Le produit des valeurs probabilit cumul e donne la fr quence th orique de la souche dans l esp ce ou probabilit absolue Cette fr quence th orique est ensuite divis e par la somme des fr quences th oriques pour chaque taxon soumis a la comparaison Le r sultat 100 donne la probabilit d appartenance a l esp ce ou probabilit relative Probabilit absolue produit des valeurs obtenues pour chaque esp ce Probabilit absolue Probabilit relative _ x 100 Somme des probabilit s absolues On consid re g n ralement les seuils suivants gt 99 9 excellente identification gt 99 tr
49. ml Le sang est ajout apr s refroidissement du milieu de base Le m lange est homog n is puis r parti dans des bo tes de p tri II 2 MILIEUX POUR L IDENTIFICATION Milieu Chapman C est le milieu qui permet la recherche de la fermentation du mannitol par les staphylocoques C est une poudre pr te a l emploi Verser 55 5 g de poudre dans 500 ml d eau distill e e Formule R actifs Quantite Chapman SE Eau distill e 500 ml 21 Porter le m lange bullition jusqu dissolution compl te Ajuster pH 7 5 0 2 et st riliser l autoclave 121 C pendant 15 minutes m Milieu pour la recherche de la DNase C est un milieu pr t l emploi R g n rer le flacon au bain marie et le r partir dans des boites de p tri Milieu Bile esculine e Formule R actifs Quantit Extrait de levure 3 g Peptone 5g Bile 40 g Esculine lg Citrate de fer 0 5 g Agar agar Dg Eau distill e 100 ml Ajuster a pH 6 6 0 2 Porter le m lange bullition jusqu dissolution compl te le r partir dans des tubes vis St riliser l autoclave 120 C pendant 15 minutes Bouillon hypersal e Formule R actifs Quantit Bouillon MH 5g NaCl 13 g Glucose 0 2 g Bromocr sol pourpre 1 6 200 ul Eau distill e 100 ml Ajuster le pH 7 7 2 et autoclaver 121 C pendant 20 minutes 22 m Milieu ur e tryptophane Il permet la recherche de l ur ase e Formule R
50. nostic de famille de genre et d esp ces Les caract res suivants Gram catalase croissance sur bile esculine et sur BHS optochine sels biliaires taient indispensables pour l identification d un streptocoque non groupable au laboratoire L algorithme a permis de bien identifier les streptocoques non groupables avec une probabilit relative de 100 pour Streptococcus pneumoniae 95 pour Streptococcus mitis 94 44 et 95 3 pour Streptococcus milleri Cependant l algorithme ne permet pas l identification des diff rentes esp ces du groupe milleri Pour cette raison certaines m thodes modernes en particulier celles permettant une tude pr cise de la GC ou du potentiel g nomique sont de plus en plus recommand es et utilis es pour la diff renciation d esp ces ou de sous esp ces croissance difficile Toutefois les algorithmes tablis garantissent une bonne identification des staphylocoques coagulase n gative et des streptocoques non groupables les plus fr quemment rencontr s en pathologie humaine 68 ALBERT B WILLIAM J H KENNETH L H HENRY D I SHADOMY H J Manual of clinical microbiology AMS 1991 5 edition 233 244 ALMEIDA J JORGENSEN J H and JOHNSON J E Evaluation of the Auto Microbic System Gram Positive Identification of coagulase negative staphylococci J Clin Microbiol 1993 18 2 438 439 AVRIL J L DABENAT H DENIS F MONTEIL H Bact
51. ococcus mitis et Streptococcus sanguis Ces deux esp ces ont beaucoup de caract res semblables et ne se diff rencient que par le raffinose Cette limite est galement retrouv e dans la galerie API De m me l algorithme nous a permis de bien identifier le groupe milleri mais il ne nous permet pas d identifier les diff rentes esp ces de ce groupe Pour cette raison les m thodes DNA DNA hybridation et GC qui donnent de bons r sultats doivent tre utilis es Mais l inconv nient est que ces m thodes demandent des moyens financiers normes 66 Les infections bact riennes dues aux staphylocoques a coagulase n gative et aux streptocoques non groupables si diverses dans leurs manifestations cliniques sont aujourd hui parmi les plus fr quentes Le diagnostic microbiologique et le traitement de ces infections imposent l identification correcte de l agent tiologique en vue d une bonne prise en charge th rapeutique C est dans cette optique que nous avons entrepris l laboration d algorithmes d identification des staphylocoques coagulase n gative et des streptocoques non groupables Pour valider le processus d identification nous avons utilis une approche comprenant trois phases essentielles la premi re phase a consist en la validation des m thodes d identification gr ce l utilisation de souches de r f rence garantissant l efficacit des diff rents milieux d
52. ont catalase n gative 36 V 2 2 4 Type respiratoire L identification bact rienne va chercher caract riser le type respiratoire de la bact rie en fonction de l apport en oxyg ne e Technique Nous avons eu recours a la g lose viande foie a 6 d Agar conditionn e en tube veillon Le milieu est r g n r pendant 30 minutes au bain marie puis refroidit a 40 45 C et enfin ensemenc en spirale L incubation se fait l tuve 37 C pendant 24 heures e R sultats Les staphylocoques se sont d velopp s tout au long du tube Ils sont donc des bact ries a ro ana robies facultatives V 2 2 5 R action l oxydase e Principe Cette r action est recherch e sur des cultures en milieu g los exempt de sucre ou de sang Les bact ries poss dant des oxydases en pr sence de sucre donnent des m tabolites qui se combinent avec les r actifs utilis s pour donner une coloration variable selon la bact rie e Technique Elle consiste a placer un disque OX sur une lame porte objet et l imbiber avec une goutte d eau Pr lever la pipette boutonn e une parcelle de culture et la poser sur le disque e Lecture Une r action positive se traduit par une coloration violette Une absence de coloration signe un test n gatif 34 e R sultats Les staphylocoques sont oxydase n gative l exception de Staphylococcus lentus Staphylococcus sciuri et Staphylococcus vutulus qui sont oxydase posit
53. particulier Streptococcus bovis 4 L tude de l h molyse est fondamentale pour Jidentification d un streptocoque car elle oriente la d marche suivre La sensibilit l optochine et la lyse par la bile ont t recherch es sur les colonies a h molytiques et non h molytiques Nous avons eu d abord recours au test de sensibilit l optochine Ce test nous a permis de faire le diagnostic diff rentiel avec les streptocoques viridans qui sont r sistants l optochine N anmoins afin de nous assurer que ces derniers m taient pas des pneumocoques r sistants l optochine d crits par certains auteurs 35 43 64 nous avons utilis la lyse par les sels biliaires Le test de solubilit dans la bile est en effet le test le plus fiable d identification du pneumocoque Nous pouvons dire que le test de solubilit dans la bile est un caract re fondamental n cessaire pour une bonne identification des streptocoques non groupables Les streptocoques amp et non h molytiques qui ne sont pas lys s par la bile et r sistants l optochine sont des streptocoques non groupables autre que Streptococcus pneumoniae L algorithme a permis une excellente identification de Streptococcus pneumoniae 65 Streptococcus milleri Streptococcus mitis et Streptococcus sanguis ont t bien identifi s Cependant les caract res biochimiques retenus ne suffisent pas pour diff rencier Strept
54. pened to the streptococci overview of taxonomic and nomenclature changes J Clin Microbiol Rev 2002 15 613 630 22 FACKLAM R ELLIOT J A Identification classification and clinical relevance of catalase negative Gram positive cocci excluding the streptococci and enterococci J Clin Microbiol 1995 8 479 495 23 FACKLAM R R THACKER L G FOX B ERIQUEZ L Presumptive identification of streptococci with a new test system J Clin Microbiol 1982 15 987 990 24 FLEURETTE J Staphylocoques et Microcoques Dans le Minor L Veynon M Bacterio Med Flammarion M d Sciences Paris 1 ed 1982 773 792 25 FLEURETTE J Taxonomie et cologie des staphylocoques M d Mal Inf 1990 hors s rie Mars 6 15 26 FRENEY J RENAUD F HANSEN W BOLLET C Pr cis de bact riologie Clinique Edition ESKA Paris 2000 783 830 27 GALLIS H A Viridans and beta haemolytic non group A Band D streptococci In G L Mandel R G Douglas J E Bennett eds Principals and practice of infections diseases 3 rd ed Churchill Livingstone ed New York 1990 1563 1572 72 28 HARDIE J M Genus streptococcus Bergey s Manual of systematic bacteriology Baltimore Williams amp wilkins 1986 2 1043 1077 29 HORAUD T LE BOUGUENEC C Streptococcaceae In Le Minor L Veron M eds Bact riologie M dicale M decine Sciences Flammarion Paris 1990 2 ed
55. pules de GLU RAF avec 100 ul de MEVAG ainsi inocul recouvrir les puits URE ADH ODC et tous les sucres avec 2 gouttes d huile de paraffine afin de maintenir l ana robiose n cessaire aux r actions incuber 37 C sur un plateau recouvert de papier buvard imbib d eau lire apr s 4 heures puis apr s 18 heures d incubation e Lecture et interpr tation La lecture repose sur le changement de la coloration initiale des diff rents milieux Pour la plupart des milieux la lecture s est faite directement par contre pour d autres elle a n cessit l addition de r actifs La lecture des caract res est faite sur une fiche de lecture cf tableau V Tableau V Lecture des staphylocoques 40 Tests Substrats R actions R actifs a R sultats R sultats Enzymes ajouter positifs n gatifs URE Ur e Ur ase Rose Orange framboise ADH Arginine Arginine Rouge Jaune dihydrolase ODC Ornithine Ornithine Rose rouge Jaune d carboxylase VP Glucose Production 1 goutte de Rose rouge Incolore Pyruvate d ac to ne KOH 1 goutte de a naphtol ONPG ONPG B galactosidase Rouge Incolore NIT Nitrate de Nitrate 1 goutte Rouge Incolore potassium r ductase d acide sulfanilique 1 goutte a naphtylamine GLU Glucose TRE Tr halose MAN Mannitol XYL Xylose SAC Saccharose Fermentation Jaune Rouge GLY Glyc rol MNE Mannose LAC Lactose RAF Raffinose
56. reus SAC GLY MNE LAC RAF S cohnii Micrococcus sp S haemolyticus S cohnii S aureus 29 Tableau III Plan des plaques pour le contr le des streptocoques Tableau IIa Plaque des contr les positifs VP ESC ADH BHS ARA Enterecoccus Enterococcus Streptococcus Enterococcus Enterococcus faecalis faecalis pyogenes faecalis avium MAN SOR TRE RAF SOS Enterococcus Enterococcus Enterococcus Klebsiella Enterococcus faecalis faecalis faecalis pneumoniae faecalis INU LAC RIB AMD GLY Streptococcus Streptococcus Enterococcus Enterococcus Enterococcus pneumoniae pneumoniae faecalis faecalis faecalis Tableau IIb Plaque des contr les n gatifs VP ESC ADH BHS ARA Streptococcus Streptococcus Enterococcus Streptococcus Streptococcus pneumoniae agalatiae avium pyogenes pyogenes MAN SOR TRE RAF SOS Micrococcus sp Streptococcus Micrococcus sp Streptococcus Enterococcus pyogenes pyogenes avium INU LAC RIB AMD GLY Enterococcus Enterococcus Streptococcus Enterococcus Enterococcus faecalis faecalis pyogenes avium avium 30 IV DESHYDRATATION DES MILIEUX La distribution de milieux se fait dans les m mes plaques que celles utilis es pour le contr le d efficacit des milieux liquides 100 ul de milieu sont distribu s dans chaque puit La d shydratation se fait en pr sence d un dessiccateur dans un four mi
57. riologie clinique Edition Marketing Paris 1988 49 52 AVRIL J L PLAISANCE J Caract res culturaux et biochimiques des streptocoques Sensibilit aux antibiotiques M d Mal Infect 1980 10 627 632 AZELE FERRON Bact riologie M dicale Edition C et R 13 1998 BAKER J S Comparaison of various methods for differentiation of staphylococci and micrococci J Clin Microbiol Rev 1984 19 875 879 BAKHOUM I M N S Contr le de qualit et validation des diff rentes microm thodes d identification bact rienne Th se Pharm Dakar 2004 n 08 8 9 10 69 BANNERMAN T L KLEEMAN K T KLOOS W T Evaluation of the vitek system Gram positive Identification card for species identification of coagulase negative staphylococci J Clin Microbiol 1993 31 5 1322 1325 BES M FRENEY J BRUN Y FLEURETTE J Identification des staphylocoques au laboratoire de microbiologie clinique Lyon Pharm 1989 41 1 37 46 BOUVET A et ACAR J F Isolement et tudes des streptocoques cultivant en satellitisme Mise en vidence au cours des endocardites bact riennes INSERM 1997 65 327 338 11 BOYE C S NDAO S K GASSAMA A KAIRE O MACONDO E 12 DABO L DIOP M M MBOUP S Microm thodes d identification des ent robact ries des staphylocoques des streptocoques et des mycoplasmes J OAPI OMPI 1 998 26 32 35 BRUN Y BES M M t
58. tion biochimique certains caract res de la microm thode d identification ne sont pas directement impliqu s ce sont ODC et le nitrate Ce constat rejoint le choix de NDAO S K 54 qui dans son pedigree n a pas utilis l ADH et le nitrate car ils n ont pas t jug s n cessaires de m me dans la galerie API Staph 41 PODC n y figure pas Par contre l tude de ces caract res est retrouv e dans la plupart des microm thodes existant sur le march a l instar du System Micro Scan 32 du syst me auto microbic d identification des Gram positifs 2 La plupart des souches de Staphylococcus cohnii tudi es ont donn une ur ase fortement positive Ce ph nom ne s explique par le fait que ces esp ces poss dent une ur ase tr s active qui entra ne la lib ration d ions ammonium qui alcalinisent le milieu et donc virage de l indicateur de l orange au rose framboise Cependant une des souches de Staphylococcus cohnii test e a donn une ur e n gative Cette souche ur e n gative a t bien identifi e comme tant Staphylococcus cohnii sp cohnii avec une probabilit relative de 99 2 Cette variation pourrait tre due des mutations ponctuelles au niveau du g ne codant pour la synth se de l enzyme qui d grade le substrat Ces mutations consistent soit une interversion de la position des bases qui constituent les codons soit une perte d une base Dans tous les cas l
59. tique apr s culture sur un milieu gelos Sur le plan individuel ce sont des cocci qui mesurent 0 8 1 um de diam tre immobiles asporul s g n ralement acapsul s ou ayant une faible capacit de synth se de capsule 1 3 2 Caract res culturaux 12 24 42 55 Les staphylocoques se d veloppent en a robiose ou en ana robiose sur la plupart des milieux usuels Certaines souches n cessitent cependant une forte pression en CO pour une croissance optimale ainsi que la pr sence d autres m tabolites tels que l h mine ou la m nadione La temp rature optimale de croissance est de 30 C 45 C avec un maximum 37 C et le pH varie entre 4 8 9 4 avec un optimum 7 5 En bouillon les staphylocoques se multiplient en quelques heures formant un trouble homog ne Sur g lose ordinaire les colonies sont lisses rondes opaques plus ou moins bomb es avec un diam tre variant de 1 5 4 mm La plupart des souches produisent un pigment jaune dor parfois jaune citrin En milieu g los au sang on observe fr quemment une zone claire d h molyse B h molyse autour des colonies La plupart des souches de staphylocoques pousse sur un milieu synth tique contenant entre autres du glucose des sels min raux acides amin s dont la cyst ine la vitamine B et l acide nicotinique 1 3 3 Caract res biochimiques et m taboliques L tude des diff rents caract res biochimiques
60. treptocoques Il faut noter que l isolement sur CLED n a pas beaucoup d importance car ce milieu ne nous donne aucune information sur le type d h molyse qui est un caract re fondamental pour Videntification des streptocoques non groupables Donc la g lose au chlorhydrate de pyridoxal reste le milieu de choix pour Videntification des streptocoques non groupables D apr s FACKLAM et Coll 23 cinq caract res permettent de d terminer avec une approximation int ressante le groupe des streptocoques les plus souvent rencontr s Au sujet de ces tests de pr somption il faut souligner que la totalit des Listeria donne une r action positive avec le milieu Bile esculine et que 2 3 des souches de Listeria hydrolysent l hippurate Ce constat nous rappelle l importance de la recherche de la catalase pour l identification d un streptocoque comme d crit dans notre algorithme pour viter des confusions 64 Le milieu bile esculine ne doit pas tre confondu avec le milieu l esculine qui ne doit pas tre utilis comme test de pr somption La culture et le noircissement du milieu bile esculine est tr s sp cifique des ent rocoques et des streptocoques du groupe D Il faut noter que parmi les streptocoques non groupables des souches bile esculine positive peuvent s observer avec certaines souches de Streptococcus mutans Ceci avait t par le pass cause de confusion avec les streptocoques du groupe D en
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