LM DNA Kit Product Insert
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1. streptavidine PE labri de la lumi re temp rature ambiante car la streptavidine PE est photosensible La solution de dilution peut tre pr chauff e 45 C pendant 5 minutes et agit e au vortex jusqu dissolution compl te des r actifs La solution de dilution doit tre temp rature ambiante 18 30 C avant de proc der au m lange La pr parer avant toute utilisation et jeter toute solution restante Page 5 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 n Tableau _ 5 Volumes de pr paration de la solution de dilution 8 20 340l 50 8500 4 42 5 pl Remarque NE PAS INTERROMPRE LE PROGRAMME D HYBRIDATION AVANT DE RETIRER LA PLAQUE DU THERMOCYCLEUR 8 Dans la plaque maintenue une temp rature de 56 C et directement dans le thermocycleur diluer chaque chantillon avec 170 ul du m lange de la solution de dilution streptavidine PE Il est essentiel de diluer tous les chantillons dans un d lai de 5 minutes apr s l tape MAINTIEN 56 C de 10 minutes 9 Retirer la plaque du thermocycleur et la placer dans l appareil Luminex D Analyse de l chantillon avec l appareil Luminex Pour de meilleurs r sultats tester imm diatement les chantillons avec l appareil Luminex La lecture des chantillons peut tre effectu e jusqu 30 minutes apr s leur dilution Conserver les chantillons l abri de la lumi re en cas de lecture ult rieure 1 Allumer l appareil Luminex entre 30 minutes et 4 heures2. 5 5 cm ATTENTION GelStar est un produit carcinog ne risque REMARQUE il est possible de r aliser des gels avec 20 ul d une solution de bromure d thidium 10 mg ml au lieu d utiliser un marqueur d acide nucl ique GelStar L intensit de la bande du produit form e est moins prononc e dans les gels base de bromure d thidium que dans ceux contenant le produit Ne ATTENTION Le bromure d thidium est un carcinog ne Conserver le gel l abri de la lumi re et patienter jusqu sa polym risation F Charger un m lange de 2 5uL de chaque produit PCR et 2 5uL 2 X tampon avec colorant visible par chantillon par amplification de chargement Laisser le gel migrer dans l obscurit environ 160 volts pendant 45 minutes ou jusqu ce que l chantillon migre suffisamment loin pour apercevoir les bandes des s quences d ADN double brin et simple brin bande de bleu de bromoph nol ou tout autre marqueur visible migrant une distance de 2 5 5 cm des puits 5 Photographier en utilisant un transilluminateur UV quip d un filtre photographique jaune GelStar Lonza Group Ltd n 50536 ATTENTION Porter un quipement de protection lors de la manipulation d un marqueur d acide nucl ique GelStar ou de bromure d thidium et lors de la photographie avec un transilluminateur UV HLA 6 Analyse du gel Double brin bp 280 240 Simple brin bp 180 160 Interpr tation du del
3. Amplification Aucune amplification Puits C C ADN double brin Lumineux ADN simple brin Moins lumineux Bande d amorces Page 9 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13
4. avant d analyser les chantillons 2 Avant de proc der au test des chantillons sur l appareil Luminex d finir l ordre d analyse des chantillons a S lectionner Create a New Batch Cr er un nouveau lot dans le menu Fichier Par exemple en cas d analyse HLA DPB ajouter Lot pour HLA DPB L chantillon du lot est fourni et intitul dans ce cas HLA DPB Noter que les versions d chantillon d pendent du num ro de lot et correspondent aux num ros de lot du kit Suivre les instructions successives apparaissant sur l cran pour la cr ation des lots Ne pas ins rer de virgule au nom attribu au lot au risque de perdre les informations suivant cette virgule lors de l exportation des donn es Pour en savoir plus sur la cr ation des lots et lots multiples consulter le manuel de l utilisateur du Luminex b Cliquer sur l ic ne Eject Ejecter pour ouvrir le porte plaque Placer la plaque 96 puits du thermocycleur contenant les chantillons dans le bloc thermique XYP se trouvant sur le porte plaque c Cliquer sur l ic ne Retract R tracter Les chantillons sont maintenant pr ts pour l analyse Une tape pr alable doit tre effectu e avant de lancer l analyse d Une fois les chantillons analys s par l appareil une tape de nettoyage avec de l isopropanol 70 ou l eau de Javel usage domestique 20 doit tre effectu e suivie par deux autres tapes de nettoyage L appareil
5. blancs d eau doivent tre en dessous de la valeur seuil d finie pour l oligonucl otide sp cifique d une s quence indiqu e dans la feuille de travail du tableau Seuil La ou les solutions de sondes nucl iques LIFECODES contiennent une ou plusieurs sondes oligonucl otides sp cifiques d une s quence consensus identifi es dans les feuilles de travail des kits de typage Ces sondes consensus s hybrident tous les all les et servent de contr les internes pour v rifier amplification et confirmer que les hybridisations ont eu lieu Si la valeur minimale n est pas obtenue pour ces oligosondes sp cifiques d une s quence il est possible que l chantillon ne fournisse pas le typage correct et l chantillon doit faire l objet d un nouveau test Le test doit tre r alis de la mani re recommand e dans la notice d accompagnement du produit et en suivant toutes les proc dures de contr le qualit conformes aux exigences locales r gionales et nationales et ou des organismes d agr ment LIMITES DE LA PROC DURE Les performances de PCR et de test d crites requi rent des conditions pr cises Tout cart de ces param tres risque d entra ner une d faillance du produit Tous les appareils doivent tre calibr s conform ment aux recommandations du fabricant et utilis s en respectant les param tres prescrits par le fabricant 1 Les billes doivent tre pr chauff es et compl tement remises en suspension avant toute utilisat
6. l assurance qualit ou pour contr ler une manipulation il peut s av rer n cessaire de faire une lectrophor se sur gel pour visualiser l ADN amplifi dans la r action de PCR Mat riel requis indiqu ci dessous ou quivalent lectrophor se sur gel de gradient d agarose Lonza Group Ltd Marqueur d acide nucl ique sur gel GelStar IDNA n 50170 Lonza Group Ltd n 50535 e Appareil pour l lectrophor se alimentation e Transilluminateur UV ChromatoVUE UVP Inc mod le TM36 e ampon de gel 1X TAE 40x Promega No V4281 Syst me d imagerie photographique La migration relative du produit simple brin d pend de la concentration du gel et du type de tampon utilis s Les migrations approximatives de chaque amplification sont indiqu es ci dessous pour les chantillons analys s sur un gel dagarose 2 dans un tampon TAE 1X Page 8 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 Conditions d lectrophor se 1 Retirer le marqueur d acide nucl ique GelStar Lonza Group Ltd n 50535 du cong lateur et le d congeler Le conserver l abri de la lumi re 2 Utiliser un gel 2 pour cette proc dure Pour un gel final de 200 ml ajouter 4 grammes d agarose dans une solution tampon TAE 1X dilu e partir d une solution TAE 40X Ajouter 10 ul de marqueur d acide nucl ique GelStar l agarose liquide Lors du coulage du gel s assurer de conserver suffisamment d espace pour que l ADN puisse migrer 2
7. la solution de sondes nucl iques e Soniquer bri vement environ 15 s puis m langer au vortex la solution de sondes nucl iques pendant environ 15 secondes pour que les billes soient compl tement en suspension Faire tr s attention lors de l aliquotage en utilisant des pipettes calibr es Le non respect de cette proc dure risque d entra ner une perte de r actifs et de fausser l chantillon e l est imp ratif de maintenir les temp ratures constantes Des variations aussi petites que 0 5 C peuvent affecter les r sultats e Lors de l tape d hybridation il est imp ratif que les chantillons ne restent pas dilu s plus de 5 minutes 56 C voir la section R sultats e Il est recommand de tester les chantillons amplifi s d s que possible Si les chantillons ne peuvent pas tre test s le m me jour sur l appareil Luminex le produit amplifi peut tre conserv 3 jours au maximum une temp rature de 2 8 C Pour une conservation prolong e il est recommand de le congeler 20 C pendant une semaine maximum jusqu l ex cution du test Le produit amplifi ne peut tre congel et d congel qu une seule fois Les cong lations d cong lations successives risquent de d grader les chantillons amplifi s et d entra ner des r sultats m diocres lors du test A Purification de l ADN g nomique en utilisant une m thode permettant d obtenir une concentration finale comprise entr
8. peut d sormais tre teint S il n est plus utilis dans la journ e 3 Une fois la lecture termin e les donn es sont export es sous forme d un fichier CSV avec les valeurs s par es par une virgule Ces fichiers sont appel s OUTPUT CSV et enregistr s dans un dossier sous le nom de lot saisi dans le Luminex Ces donn es sont d sormais disponibles pour l attribution du typage comme d crit ci dessous Consulter le manuel de l utilisateur du Luminex IS pour en savoir plus sur le fonctionnement de l appareil le d marrage quotidien la calibration l entretien et les proc dures d arr t R SULTATS Le typage des chantillons peut tre r alis en proc dant comme suit Les fichiers CSV cr s peuvent tre ouverts et les donn es trait es avec des programmes de tableur courants tels que Microsoft Excel Lotus 123 Corel Quattro Pro ou tout logiciel similaire L analyse comprend les tapes suivantes 1 V rifier que le nombre d v nements pour chaque oligosonde et dans chaque chantillon est de 60 Ces informations figurent dans la section Data type count du fichier CSV 2 V rifier si les valeurs des sondes nucl iques consensus de chaque chantillon sont sup rieures au minimum de leur intensit m diane de fluorescence ou IFM Les seuils minimaux d pendent du lot et figurent dans le tableau des valeurs de Seuil au verso du certificat d analyse Attention e Pour obtenir des r sultats fiables l appareil Lumin
9. ECODES 15 Li ADN g nomique Total d environ 10 200 ng 1i 200 ng Taq polym rase 0 5 ui 2 5 U Eau non contamin e en s Pour un volume final nucl ases our un volume final de 50 qd Tableau 2 Conditions du thermocycleur pour amplification Mode vitesse de mont e en temp rature Mode 9600 3 5 C sec 9700 MAX mode 3 9 C sec SAFE mode vitesse de Eppendorf Mastercycler Nexus mont e en temp rature MAX 3 0 C sec Thermocycleur Syst me PCR GenAmp 9700 Thermocycleur Veriti 96 puits Tableau 3 Conditions du thermocycleur pour amplification tape PE ne a dur e ye de cycles 1 95 C pour 5 min 1 95 C pour 30 sec 2 60 C pour 45 sec 8 72 C pour 45 sec 95 C pour 30 sec 3 63 C pour 45 sec 32 72 C pour 45 sec 72 C pour 15 min 1 4 C perp tuel 1 Remarque pour v rifier l amplification de l chantillon consulter lectrophor se sur gel du produit de PCR Annexe C H ybridation V rifier que les r actifs tampon d hybridation et solution de sondes nucl iques LIFECODES sont bien solubilis s et que les billes sont compl tement en suspension Allumer l appareil Luminex et la plateforme XY pour un pr chauffage d environ 30 minutes Pr chauffer la solution de sondes nucl iques dans un bloc thermique 55 60 C pendant au moins 5 10 minutes pour solubiliser compl tement les r ac
10. LIFECODES utiliser avec Luminex produit n 628910 R f rence du Sur 20 ockage mu Volume g V7 Quantit suffisante MXDPE Menge global HLA DPB 628903 420 ETE 2 ETTE ETTE pour 20 chantillons Sondes nucl iques HLA DPB 2a8 C SN DEE LIFECODES Le 860 uL l abri de la lumi re Ds Solution de dilution 628155 18 30 C TAQ Polym rase Taq LIFECODES 628075 25 uL 10 30 C t Les sondes nucl iques sont photosensibles les conserver si possible l abri de la lumi re ATTENTION Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date d expiration ATTENTION les carts par rapport aux protocoles recommand s et aux mat riaux requis et notamment le polym rase Taq LIF CODES n ont pas encore t valid s Page 2 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 USAGE PREVU Typage des all les HLA de classe I et de classe Il sur l ADN R SUM ET EXPLICATION Le typage HLA bas sur l analyse de l ADN au moyen d ADN amplifi par PCR est une proc dure couramment utilis e en laboratoire L amplification de l ADN par PCR est utilis e pour augmenter le nombre de copies d une s quence d ADN particuli re Pour le typage HLA des tests ult rieurs la PCR sont utilis s pour d terminer les propri t s de l ADN amplifi Plusieurs types de tests tels que la PCR SSP 1 la SSOP directe 2 les RFLP 3 et la r verse SSOP 4 sont utilis s pour le typage HLA Comme pour les m thodes de SSOP et de r verse SSOP le
11. MAARRER D LIF CODES Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford Connecticut 06902 Etats Unis T l 1 203 328 9500 ou 888 329 0255 aux tats Unis et au Canada T l copie 1 203 328 9599 WWW IMMUCOR COM Documentation sur le produit et traductions disponibles l adresse www immucor com L MENT DE PRODUIT KITS DE TYPAGE HLA SSO LIFECODES Destin au diagnostic in vitro TABLE DES MATI RES D finition des symboles 1 Mode d emploi inner 4 Kits R actifs et num ro de r f rence 2 A Purification de l ADN g nomique 4 Usage pr vu nrrrrrrnnrrenrrrennnennns 3 B AMPIHCAUON a 4 R sum et explication 3 C HyDridatiON Sd de ad i 5 Principes de la proc dure 3 D Analyse avec l appareil LUMINEX aisrseninnreo1nnrea11nrn 6 RS MR SCA 6 A Identification 3 C ntrol Qualit nnrrnrnnnrrrrrnnnernnennnnnne 7 B Avertissements et mises en garde 3 Limites de la proc dure ssnnsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 7 C Instructions de stockage 3 Causes d erreurs 2 ss nnnm 7 D Purification ou traitement avant emploi 3 Valeurs attendues nn 8 E Conservation et stabilit 3 Performances sp cifiques 8 quipement FEQUIS mrnrrrrrnrrerrrnrnersrsrnres 3 R G ONCES a nd ennenen 8 Pr l vement et pr paration Licences limit es 8 des chantillons 2 4 delie olo mA 4 informations c
12. e 10 et 200 ng ui Si n cessaire ajouter de l eau non contamin e en nucl ases Tous les chantillons doivent avoir la m me concentration B AMD MICAUON d ADN PCR Laisser d congeler le m lange global jusqu ce qu il soit temp rature ambiante 18 30 C M langer doucement au vortex les r actifs pendant environ 10 secondes Cela permet la dissolution des sels Centrifuger bri vement 5 10 secondes dans la microcentrifugeuse pour faire tomber le contenu au fond du tube 3 Consulter le tableau 1 ci dessous pour pr parer les composants de la r action d amplification pour n 1 r actions en utilisant la quantit indiqu e pour chaque r actif par r action l exception de l ADN Ajouter de l eau non contamin e en nucl ases pour compl ter le volume 50 ul par r action M langer doucement au vortex 4 Pipeter la quantit appropri e d ADN g nomique 100 300 ng dans les tubes PCR 5 Aliquoter le m lange d amplification dans les tubes PCR contenant l ADN g nomique Le volume final contenant le m lange PCR et l ADN g nomique doit tre de 50 ul pour chaque r action 6 Bien fermer les tubes pour viter tout risque d vaporation pendant la PCR 7 Placer les chantillons dans le thermocycleur et lancer le programme voir les tableaux 2 et 3 Page 4 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 Tableau 1 Composition de la r action d amplification R actif Volume par chantillon M lange global LIF
13. e des brevets U S N 5 338 671 et 5 587 287 et de leurs brevets trangers correspondants L achat de ce produit est soumis une licence non transmissible limit e accord e au titulaire du brevet am ricain 5 981 180 ou ses contreparties trang res propri t s de Luminex Corporation s engageant n effectuer que des analyses multiplex des pr l vements cliniques pour le typage HLA INFORMATIONS CONCERNANT LE FABRICANT Fabricant Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford Connecticut 06902 tats Unis T l phone 1 203 328 9500 888 329 0255 T l copie 1 203 328 9599 Repr sentant autoris Emergo Europe Molenstraat 15 2513 BH La Haye Pays Bas T l phone 31 0 70 345 8570 T l copie 31 0 70 346 7299 Service technique europ en T l phone 32 3 385 4791 Derni res r vision et mission de ce document R v 3 2013 08 29 MARQUES COMMERCIALES UTILIS ES AB Gene AB Gene House Luminex Luminex Corporation Costar Corning Incorporated Veriti Applied Biosystem MicrosealTM Bio Rad Laboratories Inc Mastercycler Eppendorf IDNA Agarose Lonza Group Ltd LIFECODES Immucor Inc GelStar Lonza Group Ltd ANNEXE A Electrophor se sur gel Les r actions de PCR effectu es avec les kits de typage HLA SSO LIFECODES sont con ues pour g n rer la fois des s quences d ADN double brin et simple brin s hybridant majoritairement aux oligosondes Pour
14. e en poly thyl ne e Tubes et capuchons PCR bandes de tubes de puits Costar n r f 6524 LIFECODES n r f 888635 thermom trique Corning Costar n r f 6542 LIFECODES n e Streptavidine R Phyco rythrine conjugu e SA PE 1mg mL r f 888640 ou PCR Corning puits thermom trique quip LIFECODES n r f 628511 a d une plaque 96 puits n r f CLS6551 ou PCR thermo e Kits de calibration Luminex kit de calibration Luminex 100 200 kit de v rification de performance Luminex 100 200 LIF CODES n ne z es 5 scientifique AB Gene quip d une super plaque 96 puits n r f 628018 et 628019 respectivement r f AB 2100 C Mat riaux suppl mentaires devant tre fournis par l utilisateur Agitateur m langeur vortex Mat riel de compression de silicone Axygen Scientific n CM FLAT ou quivalent Bain sonicateur Pointes filtres de microcentrifugeuse Pipettes pipettes multicanaux et embouts 1 20uL 20 200uL 1000uL Logiciel de type tableur Bloc thermique Isopropanol 70 ou eau de Javel 20 Plateau de retenue Applied Biosystems n 403081 usage avec le thermocycleur 9700 seulement MODE d EMPLOI REMARQUES Les sondes nucl iques et la streptavidine PE sont photosensibles conserver l abri de la lumi re et ne pas congeler e Pr chauffer les billes 55 60 C pendant au moins 5 10 minutes pour solubiliser compl tement les r actifs dans
15. e m lange de sondes e Ces tableaux de valeurs seuil d pendent du lot II faut donc v rifier la concordance entre le num ro de lot des tableaux de valeurs seuil et celui du kit de typage utilis Page 6 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 e Siune valeur standardis e d une sonde nucl ique particuli re d passe le seuil maximal d une attribution n gative et chute en dessous de la valeur minimale d une attribution positive l chantillon doit tre consid r comme tant ind termin pour cette sonde nucl ique Un typage de l chantillon doit tre effectu en supposant que la valeur est d abord n gative puis positive e Voir la section VALEURS ATTENDUES pour plus d informations sur les valeurs seuil CONTR LE QUALIT Il est recommand d utiliser un contr le n gatif et un contr le positif avec chaque test tel qu un blanc d eau et un chantillon typ auparavant respectivement Les sondes oligonucl otides oligosondes sp cifiques d une s quence consensus indiqu es dans le tableau Seuil s hybrident aux all les sp cifiques de leur locus respectif Les valeurs obtenues avec les oligonucl otides sp cifiques d une s quence consensus partir des contr les positifs doivent d passer la valeur seuil d finie pour l oligonucl otide sp cifique d une s quence indiqu e dans la feuille de travail du tableau Seuil Les valeurs obtenues avec les oligonucl otides sp cifiques d une s quence consensus partir des
16. es nucl iques et recommencer le test fonctionnant pas Luminex IS correctement Obstruction de la voie de Retirer et soniquer l aiguille Effectuer un rin age contre circulation des chantillons courant Contacter Immucor Transplant Diagnostics Inc si le probl me persiste 32 3 385 47 91 Valeur de la sonde chec d amplification ou Contr ler la concentration et la puret de l ADN consensus amplification m diocre inf rieure au seuil de l chantillon Chauffer le m lange global 37 C pendant 5 minutes sels du m lange global m langer doucement au vortex et centrifuger bri vement Taq polym rase de Utiliser une Taq polym rase LIFECODES valid e n de mauvaise qualit catalogue 628075 Conditions d amplification hors des param tres Effectuer un profil thermique sur le thermocycleur pour sp cifiques v rifier que les param tres sont compris dans la plage sp cifi e Valeur de l intensit de fluorescence m diane IF M Pr chauffer la solution de dilution 45 C pendant 5 faible minutes avant toute utilisation et agiter au vortex Conserver temp rature ambiante Remplacer la streptavidine PE D faillances Amplification d all les Conditions d amplification Effectuer un profil thermique sur le thermocycleur pour multiples des SSO sp cifiques hors des param tres v rifier que les param tres sont compris dans la plage Pas de r sultat de sp cifiques sp cifi e typage HLA pour Contamination de l cha
17. ex doit collecter une quantit suffisante de donn es e Collecter au moins 60 v nements pour chaque s quence sp cifique oligonucl otidique 3 Pour chaque sonde soustraire sa valeur de contr le du bruit de fond de la valeur de l chantillon pour obtenir les valeurs corrig es par rapport au bruit de fond Les valeurs de contr le du bruit de fond figurent dans le tableau des valeurs de Seuil et d pendent du lot Les valeurs de contr le du bruit de fond correspondent aux valeurs IFM moyennes de chaque bille pour compenser le bruit de fond engendr par les variations de billes 4 Pour chaque chantillon diviser les donn es de bruit de fond corrig de chaque oligosonde par la valeur de bruit de fond corrig e de la sonde nucl ique consensus correspondante afin de fournir un ensemble de donn es normalis es IFM oligosonde IFM valeur de contr le du bruit de fond de l oligosonde IFM consensus IFM valeur de contr le du bruit de fond de la sonde consensus 5 Pour chaque oligosonde enregistrer la valeur normalis e dans le tableau des valeurs de Seuil fourni au verso du certificat d analyse 6 Une fois toutes les valeurs calcul es le profil des r sultats des oligosondes c d la combinaison de toutes les attributions positives et n gatives peut tre compar celui figurant dans le ou les tableaux d interpr tation fournis Attention e Chaque locus poss de son propre tableau de valeurs seuil et pour chaqu
18. iner la pr sence ou l absence de s quences d ADN particuli res dans l ADN amplifi et pour identifier les all les de l chantillon La technique de typage HLA SSO LIFECODES utilise des sondes nucl iques fix es des microsph res Luminex con ues pour tre utilis es avec l appareil Luminex L appareil Luminex permet d analyser jusqu 100 populations diff rentes de microsph res Luminex combin es du fait que chaque population se distingue de par sa fluorescence ou sa couleur unique Une sonde oligonucl otidique sp cifique peut tre fix e chaque microsph re de couleur diff rente Il est donc possible de diff rencier les diff rentes sondes nucl iques d une solution de sondes en fonction de leur fixation une microsph re de couleur particuli re L appareil Luminex permet galement la quantification relative du produit de PCR marqu qui s est hybrid chaque microsph re Luminex Comme pour les autres m thodes de SSOP il est donc possible d utiliser le signal relatif obtenu avec les oligosondes du test LIFECODES pour identifier les sondes pr sentant une r activit positive ou n gative avec l chantillon d ADN amplifi voir la section R sultats Vous disposez alors des informations requises pour d terminer le ph notype HLA d un chantillon R ACTIFS A Identification Voir les tableaux dans la section Kits R actifs et num ro de r f rence pour la liste compl te des produits et num ros de r f re
19. ion Cela permet la dissolution des composants du tampon d hybridation 2 Les incubations 47 C et 56 C n cessitent un niveau de pr cision de la temp rature tr s lev 0 5 C Il est donc essentiel d utiliser un thermocycleur La temp rature doit tre contr l e au niveau des 96 puits de la plaque du thermocycleur l aide d une sonde de temp rature BioRad mod le VPT 0300 ou quivalent La temp rature interne de chaque puits et la variation entre les puits ne doivent pas fluctuer de plus de 0 5 C 3 La dur e d incubation 56 C est critique et ne doit pas d passer 15 minutes Cette dur e comprend l incubation de 10 minutes plus un maximum de 5 minutes pour diluer tous les chantillons dans le m lange de la solution de dilution streptavidine PE 4 Une fois dilu s les chantillons sont stables temp rature ambiante pendant 2 heures maximum l abri de la lumi re L analyse d une plaque de 96 puits par l appareil Luminex pouvant prendre jusqu 1 5 heures il est recommand de le lancer 30 minutes au plus tard apr s la dilution pour s assurer que le dernier chantillon est analys dans la limite autoris e des deux heures 5 Ne pas m langer entre eux les r actifs d autres kits ou lots En raison de la complexit du typage HLA il est recommand qu un personnel qualifi v rifie l interpr tation des donn es et les attributions de typage CAUSES D ERREURS insuffisant nucl iques sond
20. llon doit tre nouveau test et r amplifi si possible et retest Si plus de deux oligosondes sont ind termin es l chantillon doit tre nouveau test s Si le profil des r sultats des sondes nucl iques ne fournit aucun typage HLA l chantillon doit alors tre r amplifi et nouveau test Il peut galement s av rer n cessaire d isoler de nouveau l ADN partir de l chantillon et de proc der une nouvelle amplification ou un nouveau test Comme indiqu dans la section Limites de la proc dure il est essentiel de suivre exactement le protocole Tout cart peut fausser le typage de l chantillon PERFORMANCES SPECIFIQUES Lorsque les kits de typage HLA SSO LIFECODES sont utilis s selon la proc dure d crite dans l l ment de produit le type HLA de classe et de classe Il des chantillons d ADN peut tre d termin Les kits HLA DPB et HLA DQA montrent une concordance de 100 intervalle de confiance de 95 de 91 9 100 pour 30 chantillons de comp tences CAP et compar s des r sultats de comp tences CAP R F RENCES 1 Olerup O et al 1992 Tissue Antigens 39 225 3 Maeda M etal 1989 Tissue Antigens 34 290 2 Saiki RK et al 1986 Nature 324 163 4 Bugawan TL et al 1990 Immunogenetics 32 231 LICENCES LIMIT ES Taq polymerase est fabriqu pour Immucor Transplant Diagnostics par Promega Corp La licence de ce produit est octroy e Promega dans le cadr
21. n produites comme matrices pour g n rer de l ADN simple brin Cette m thode produit la fois des s quences d ADN double brin et des s quences d ADN simple brin qui apr s d naturation participent toutes la r action d hybridation Chacune des diff rentes sondes correspond la s quence compl mentaire unique d un all le ou d un groupe d all les En d autres termes ces sondes sont d finies de fa on ce que chacune d entre elles s hybride pr f rentiellement une r gion compl mentaire pr sente ou non sur la s quence d ADN amplifi e de l chantillon De plus la s quence d ADN amplifi e est galement hybrid e une ou plusieurs sondes consensus compl mentaires de s quences pr sentes dans tous les all les du locus Le r sultat du typage en r verse SSOP est d pendant du type de mat riel biologique et de la m thode de purification utilis s ainsi que de la quantit et de la puret de l ADN g nomique Le signal obtenu pour chaque sonde nucl ique consensus est ainsi utilis comme indicateur de succ s des tapes d amplification et d hybridation De m me le signal obtenu pour chaque sonde nucl ique consensus peut galement tre utilis pour standardiser celui des oligosondes sp cifiques d all les et pour corriger les variations de quantit de produits de PCR dans la r action d hybridation L analyse des r sultats obtenus par la technique de typage en r verse SSOP peut tre utilis e pour d term
22. nce B Avertissements et mises en garde 1 Destin au diagnostic in vitro 2 Utiliser des pipettes s par es pour les manipulations pr PCR et post PCR 3 Risque biologique Tous les chantillons de sang et chantillons biologiques doivent tre trait s comme potentiellement dangereux Respecter les pr cautions universelles lors de la manipulation 4 Les solutions de dilution les sondes nucl iques la Taq polym rase et la streptavidine PE contiennent des compos s dangereux viter tout contact avec la peau et les yeux et jeter tous les produits apr s usage conform ment aux r glementations locales Voir les fiches signal tiques pour plus d informations 5 La d cision clinique touchant le traitement d un patient ne doit pas reposer uniquement sur les seuls r sultats de ces kits C Instructions de stockage 1 Consulter l tiquette d emballage des r actifs du kit pour les temp ratures de stockage correctes 2 Les sondes nucl iques et la streptavidine PE sont photosensibles CONSERVER L ABRI DE LA LUMI RE NE PAS CONGELER 3 Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date d expiration D Purification ou traitement requis avant emploi Voir la section Pr l vement et pr paration E Conservation et stabilit 1 Si les sels d une solution ont pr cipit pendant l envoi ou le stockage il est n cessaire de les resolubiliser avant toute utilisation temp rature ambiante 18 30 C avec un m lange
23. ntillon d ADN Isoler de nouveau l ADN partir d un chantillon de sang l chantillon D gradation partielle de l ADN vaporation pendant l tape d hybridation En cas d utilisation incompl te de la plaque laisser une ligne libre de chaque c t des chantillons analyser pour permettre une fermeture herm tique de la plaque L amplification par PCR peut tre contr l e par lectrophor se sur gel voir Annexe A Page 7 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 VALEURS ATTENDUES Les valeurs peuvent g n ralement tre d finies comme positives et n gatives Dans de rares cas les valeurs peuvent tre ind termin es Une valeur ind termin e repr sente une plage dans laquelle aucune valeur positive ou n gative n a t observ e Si un chantillon contient des valeurs ind termin es pour une sonde oligonucl otidique particuli re un typage de l chantillon doit tre effectu avec la sonde nucl ique en supposant que cette derni re est d abord n gative puis positive Trois cas sont possibles 1 Quel que soit le choix effectu sonde positive ou n gative l un aboutit une correspondance 2 Les deux choix aboutissent des typages L chantillon peut tre nouveau test ou les all les obtenus partir des deux typages peuvent tre rapport s 3 Aucun des choix n aboutit un typage Dans ce cas il est probable que l attribution d autres sondes nucl iques est incorrecte Cet chanti
24. oncernant le fabricant 8 A Mat riel fourni 4 Marques commerciales utilis es 8 B Mat riel r actifs et quipement requis ANNEXE a 8 mais non fournis 4 C Mat riaux suppl mentaires devant tre lectrophor se sur gel 8 fournis par l utilisateur 4 Interpr tation du gel 9 D FINITION DES SYMBOLES tiquettes de produit et documents suppl mentaires Num ro de lot LOT MAE AMIES 0e T oa de r f rence temp rature temp rature Quantit Q suffisante pour Ne pas congeler Zi N tests Attention Voir le mode AN Vo ir le mode hi i Fabricant d emploi d emploi Page 1 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 conserver Date d expiration l abri de la j lumi re Repr sentant europ en KITS R ACTIFS ET NUM RO DE R F RENCE LCT DQA Kit de typage HLA DQA1 SSO LIFECODES catalogue n 628931 LM DQA Kit de typage LIFECODES HLA DQA utiliser avec Luminex produit n 628061 R f rence du 20 produit Volume Stockage W M l HLA DQA g Quantit suffisante ER LIF CODES i RUE 420 uL 2 D zasc D zasc pour 20 chantillons Sondes nucl iques HLA DQA 2 8 C LIFECODES 628063 360 uL l abri de la lumi re Solution de dilution de dilution 628155 18 18 30C 18 30C TAQ Polym rase Taq LIFECODES 628075 25 uL 10 30 C LCT DPB Kit de typage HLA DPB1 SSO LIFECODES catalogue n 628935 B Kit de typage HLA DPB
25. s kits de typage HLA SSO LIFECODES utilisent des s quences sp cifiques oligonucl otidiques ou oligosondes SSO pour d tecter la pr sence des all les HLA d un chantillon amplifi par PCR C est le jeu de s quences sp cifiques oligonucl otidiques utilis et non les m thodes qui permet la d tection de tous les all les pr sents dans l chantillon amplifi par PCR Alors que les m thodes de r verse SSOP et de SSOP directe emploient des marqueurs enzymatiques et des substrats colorim triques n cessitant une tape de r v lation le test LIFECODES est un syst me multiplex homog ne Ceci signifie que toutes les oligosondes sont analys es simultan ment et que l int gralit du test est r alis e dans un seul tube en ajoutant un seul r actif PRINCIPES DE LA PROC DURE La technique de typage HLA SSO LIFECODES consiste hybrider un produit de PCR simple brin marqu des oligosondes sp cifiques L amplification d ADN par PCR utilise g n ralement des quantit s quimolaires d amorces sens et anti sens pour g n rer une s quence d ADN double brin Toutefois si la quantit d une des amorces est sup rieure celle de l autre la r action g n re des s quences d ADN simple brin en plus des s quences double brin L ADN double brin est synth tis au cours des premiers cycles de l amplification LIF CODES Une fois la solution d amorce limitante puis e l autre amorce utilise les s quences d ADN double bri
26. t dans la solution sa concentration finale ne doit pas d passer 0 5 mM d La pr sence d alcool de d tergents ou de sels risque de provoquer des effets ind sirables sur l amplification d ADN e La concentration d ADN finale doit tre comprise entre 10 et 200 ng l f Le rapport des mesures d absorption de l chantillon d ADN effectu es 260 et 280 nm doit tre compris entre 1 65 et 2 0 g Une fois l ADN isol ou congel 20 C il est utilisable pendant une p riode d un an viter les cong lations d cong lations successives de l ADN au risque de le d grader PROTOCOLE Attention les carts par rapport aux protocoles recommand s et aux mat riaux requis n ont pas encore t valid s A Mat riel fourni voir les tableaux dans la section Kits R actifs et num ro de r f rence pour des informations sp cifiques e M lange global appropri MX Tableau x de seuil s profil s des r sultats des oligosondes e Sondes nucl iques appropri es BM e Polym rase Taq LIFECODES LIFECODES n r f 628075 e Solution de dilution DS B Mat riel et quipement requis mais non fournis L utilisation des mat riaux suivants avec le kit a t valid e e Liquide de gaine Luminex 1x Lifecodes n r f 628005 e Plaque Costar Costar n r f 6509 LIFECODES n r f e Eau non contamin e en nucl ases Lifecodes n r f 757003 20 888630 ml e Ruban transparent de puits thermom triqu
27. tifs dans la solution Soniquer bri vement environ 15 s puis m langer au vortex la solution de sondes nucl iques pendant environ 15 secondes pour que les billes soient compl tement en suspension Combiner 15 ul de la solution de sondes nucl iques 5 ul d un produit de PCR d un locus sp cifique dans chaque puits d un thermocycleur quip d une plaque de 96 puits Costar n 6509 Lors de l aliquotage de la solution de sondes nucl iques dans plus de 10 puits m langer doucement au vortex la solution de sondes nucl iques apr s chaque ensemble de dix Sceller la plaque avec du ruban en poly thyl ne Costar n 6524 Placer le tapis de compression en silicone sur le dessus de la plaque avant l hybridation Proc der l hybridation des chantillons en respectant les conditions d incubation suivantes Tableau 4 Conditions d hybridation 97 C pendant 5 minutes du thermocycleur 47 C pendant 30 minutes 56 C pendant 10 minutes MAINTIEN 56 C Pendant l hybridation des chantillons pr parer une solution de dilution de streptavidine PE au 200 1 M langer 170 ul de la solution de dilution DS et 0 85 ul de la solution de streptavidine PE SA PE mg mL par chantillon est recommand de pr parer un m lange de solution de dilution suffisant pour n 1 chantillons pour compenser la perte de volume engendr e lors du pipetage Voir le tableau 5 Conserver le m lange de la solution de dilution
28. ur vortex 2 Ne pas utiliser de streptavidine conjugu e la R Phyco rythrine qui a t congel e pendant l envoi ou le stockage QUIPEMENT REQUIS 1 Appareil Luminex PLATE FORME LUMINEX XY Num ro de produit 888300 888310 2 Les thermocycleurs suivants ont t valid s syst me PCR GeneAmp 96 puits 9700 en mode 9600 n r f N8050200 bloc or n r f 4314878 Thermocycleur Veriti 96 puits en mode 9700 MAX n r f 4375786 Eppendorf Mastercycler Nexus en mode SAFE n r f 6333000 014 Se reporter au tableau 2 pour les vitesses de mont e en temp rature Attention les autres thermocycleurs et vitesses de mont e en temp rature n ont pas t valid s Page 3 sur 9 LC775TCEFR 3 08 13 PR L VEMENT ET PR PARATION DES CHANTILLONS a L ADN humain peut tre purifi partir de sang total de couches leucocytaires et d couvillons buccaux en utilisant une m thode valid e qui satisfait aux crit res ci dessous b L ADN extrait du sang conserv dans de l EDTA et de l ACD acide citrate dextrose a t test et il a t d montr qu il donne les performances attendues dans ce test L ADN extrait du sang conserv dans de l h parine ne peut pas tre utilis dans ce test D autres conservateurs n ont pas t test s c L ADN isol doit tre dilu dans une solution de TRIS 10 mM pH 8 9 ou dans de l eau non contamin e en nucl ases Si un ch lateur tel que l EDTA est pr sen
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