RIA-gnost® hCG
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1. Standards S rum de Echantillons ul contr le ul ui N des tubes So S S2 S3 S4 S5 Se S7 C 1 2 etc Standards 100 100 So S 100 100 S2 100 100 S3 100 100 S4 100 100 S5 100 100 Se 100 100 S7 100 100 S rum de contr le 100 100 100 Echantillons 100 etc Tampon d incubation q 100 pl gt Agiter pendant 30 minutes Tampon de lavage qA Ml gt D canter aspirer rincer avec 1 ml Traceur anti a hCG o 200 pl gt Agiter pendant 60 minutes qQ ml gt Tampon de lavage z R D canter aspirer rincer avec 1 ml Compter 5 R gles de base de radioprotection Ce produit radioactif ne peut tre re u achet d tenu ou utilis que par des personnes autoris es cette fin et dans des laboratoires couverts par cette autorisation Cette solution ne peut en aucun cas tre administr e ni l homme ni aux animaux L achat la d tention l utilisation et l change de produits radioactifs sont soumis aux r glementations en vigueur dans le pays de l utilisateur L application des r gles de base de radioprotection assure une s curit ad quate Un aper u en est donn ci2. T moin n gatifT moin positif Standard de Echantillons s rum ou urine So S rum de r f rence S3 ul ul contr le ul ul Num rotation des tubes gt So C S3 1 2 etc T moin n gatif So 100 100 T moin positif C S rum de 100 100 contr le Standard de r f rence S3 100 100 Echant S rum urine 1 100 100 Echant S rum urine 2 etc 100 100 etc Tampon d incubation 100 pl gt Agiter pendant 10 30 min Tampon de lavage Al ml gt Traceur anti a hCG e 200 pl gt Tampon de lavage q 1 ml gt D canter aspirer laver avec 1 ml Compter RIA gnost hCG Cisbio Bioassays Janvier 2011 Mod le 11 Lecture des r sultats du dosage qualitatif 1 Etablir les moyennes des cpm des chantillons de patients et des chantillons t moin mesur s en double t moin n g pos standard de r f rence 2 Le nombre de cpm du t moin n gatif So doit tre significativement inf rieur celui du standard de r f rence S3 lequel doit tre inf rieur celui du t moin positif s rum de contr le nettement sup rieur 3 Les chantillons dont le nombre de cpm est significativement sup rieur celui du standard de r f rence seront consid r s comme positifs Si l on enregistre un nombr
3. percentile ainsi que du 5 et du 95 percentile cf Fig 1 et Tabl 1 RIA gnost hCG Cisbio Bioassavs Janvier 2011 Mod le 11 Fig 1 Plage normale de la concentration d hCG Tabl 1 Plage normale de la concentration d hCG dans le s rum de femmes en d but de grossesse dans le s rum de femmes pendant la grossesse Semaine de la Nombre M diane Plage ne NS grossesse en n mUl ml mUI mI hCG cours hCG FE RATE Non enceintes So A 0 SA0 200000 i5 N 5 42 480 60 7 100 50 000 5 6 105 2 300 110 16 200 m 5 percentile 6 7 115 8 400 530 62 200 cu 7 8 81 30 700 3000 130 000 8 9 69 82 700 17 800 207 400 ir 9 10 69 121 500 30 600 254 600 2000 10 11 53 121 600 34 400 244 800 1 000 11 12 46 97 300 29 100 213 300 a 12 13 35 67 650 25900 208 400 13 14 28 71 100 30 600 189 000 ZR 2 trimestre 92 27 500 10 100 92 200 100 E o di 32T trimestre 34 15 200 3 360 43 500 semaine de la grossesse en cours 3 Principe de mesure et caract ristiques du RIA gnost hCG 3 1 Principe Le RIlA gnost hCG permet le dosage s rique in vitro de la gonadotrophine chorionique humaine hCG totale et biologiquement active selon le principe d un test sandwich Cette technique n cessite la pr sence d anticorps monoclonaux anti B hCG immobilis s sur la paroi interne de la partie inf rieure du tube essai Apr s addition des standards et des chantillons de patients
4. 2 50 2 8 5 22 8 7 3 90 1 8 6 149 3 8 4 Mode d emploi 4 1 Mat riel n cessaire Micropipettes de pr cision ou mat riel similaire embouts jetables permettant la distribution de 20 ul 50 ul 100 et 200 il 1 Leur calibration doit tre v rifi e r guli rement Distributeur de 1 ml Eprouvettes gradu es Agitateur horizontal Compteur gamma r gl pour la mesure de l iode 125 4 2 Pr paration des r actifs Les r actifs conserv s entre 2 et 8 sont pr ts l emploi lorsqu ils ont atteint une temp rature comprise entre 18 et 25 Les r actifs lyophilis s standards et contr le doivent tre dissous dans 0 5 ml d eau distill e Apr s reconstitution ils sont utilisables pendant 4 heures temp rature ambiante 18 25T Ensuite ils peuvent tre conserv s pendant 15 jours 2 8 ou 45 jours sous forme congel e lls peuvent tre congel s d congel s une fois Les 5 comprim s tampon de lavage doivent tre dissous dans 500 ml d eau distill e Remarques Les r actifs de diff rentes trousses d un m me lot peuvent tre rassembl s si l on veut effectuer une s rie assez importante Conserver les tubes non utilis s dans la bo te referm e entre 2 et 8 Les tubes rev tus d anticorps sortis de leur emballage et non utilis s doivent tre stock s dans le sachet plastique fourni dans la trousse RIA gnost hCG Cisbio Bioassays Janvier 2011 Mod le 11 4 3 Pr pa
5. dessous Les produits radioactifs seront stock s dans leur conteneur d origine dans un local appropri Un cahier de r ception et de stockage de produits radioactifs sera tenu jour La manipulation de produits radioactifs se fera dans un local appropri dont l acc s doit tre r glement zone contr l e Ne pas manger ni boire ni fumer ni appliquer des cosm tiques en zone contr l e Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche Eviter le contact direct avec tout produit radioactif en utilisant des blouses et des gants de protection Le mat riel de laboratoire et la verrerie qui ont t contamin s doivent tre limin s au fur et mesure afin d viter une contamination crois e de plusieurs isotopes Chaque cas de contamination ou perte de substance radioactive devra tre r solu selon les proc dures tablies Toute limination de d chets radioactifs se fera conform ment aux r glementations en vigueur
6. RIA gnost hCG Cisbio Bioassavys Janvier 2011 Mod le 11 Trousse pour la d termination radioimmunologique de la gonadotrophine chorionique humaine hCG tubes rev tus sp cificit f Contenu de la trousse 1 flacon de I Anti a hCG monoclonal souris lt 300 kBq 22 mI de tampon contenant de l albumine bovine du s rum de rat de l azoture de sodium et un colorant rouge 2 x 50 tubes rev tus d anticorps anti B hCG monoclonal souris 8 flacons de standards d hCG lyophilis s qsp 0 5 ml d eau distill e S rum humain et azoture de sodium concentration allant de 0 1000 mUI hCG ml 1 flacon de s rum de contr le d hCG lyophilis qsp 0 5 ml d eau distill e S rum humain et azoture de sodium concentration indiqu e sur l tiquette 1 flacon de tampon d incubation contenant 50 ml de tampon de l albumine bovine de l azoture de sodium et un colorant bleu 1 r actif de lavage 5 comprim s sous blister 1 sachet plastique 1 mode d emploi Certains r actifs contiennent de l azoture de sodium comme conservateur Eviter toute absorption des r actifs ainsi que tout contact avec la peau ou les muqueuses L azoture de sodium peut r agir avec les canalisations de plomb et de cuivre pour former des azotures de m taux fortements explosifs Les diluer abondamment lors de l vacuation des d chets 1 Introduction La gonadotrophine chorionique humaine hCG qui se compose de 237 aci
7. des amin s et d environ 30 de glucides poids mol culaire environ 40000 renferme comme les autres hormones glycoprot iques hLH hFSH et hTSH deux sous unit s a et B li es entre elles de fa on non covalente seule la mol cule totale hCG tant biologiquement active Du point de vue structure elle s apparente le plus la hLH qui poss de 3 acides amin s de moins dans la cha ne et 30 de moins dans la cha ne p L identit de plusieurs s quences partielles entra ne un comportement analogue du point de vue liaison aux r cepteurs et aux anticorps De m me l action physiologique de l hCG s apparente celle de l hLH au d but de la grossesse la fonction du corps jaune est stimul e ainsi que la synth se et la s cr tion des st ro des placentaires 2 R sultats cliniques obtenus avec le RIA gnost hCG 2 1 Importance clinique du dosage de l hCG L hCG n est normalement pas d tectable dans le s rum des femmes non enceintes et des hommes Le taux d hCG augmente par contre rapidement dans les 2 semaines qui suivent la conception 3 4 semaines apr s la derni re menstruation et il atteint son maximum au cours du 2 et du 3 mois Il s abaisse nouveau nettement pendant le et le trimestre des diff rences importantes pouvant tre enregistr es pour certains cas particuliers Apr s la naissance le taux d hCG se situe nouveau en dessous du seuil de d tection avec une demi vie de 24 36 heures Des taux s
8. e de cpm situ la limite de la plage effectuer nouveau un pr l vement 48 heures apr s et contr ler le r sultat en proc dant une nouvelle mesure cf Tabl 3 Les chantillons dont le nombre de cpm est significativement inf rieur celui du standard de r f rence seront consid r s comme n gatifs Tabl 3 Exemple de lecture des r sultats du dosage qualitatif de hCG Moyenne cpm R sultats Standard de r f rence S3 1 128 T moin n gatif So 120 T moin positif s rum de contr le 2 584 Echantillon 1 167 n gatif Echantillon 2 2 192 positif Echantillon 3 140 n gatif Echantillon 4 1 070 valeur limite 4 5 2 Dosage quantitatif 1 Num roter un nombre suffisant de tubes rev tus d anticorps comme indiqu dans le Tabl 4 So S7 s rum de contr le chantillons inconnus Il est recommand d effectuer l essai en double Distribuer 100 ul des standards et des chantillons de patients s rum ou dilutions tampon bleu au fond des tubes pr par s cet effet Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque chantillon Distribuer dans chaque tube 100 ul de solution de tampon d incubation Agjiter les tubes sur un agitateur horizontal pendant 30 minutes entre 18 et 25 Distribuer avec un distributeur 1 ml de tampon de lavage dans chaque tube d canter aspirer et rincer avec 1 ml Distribuer 200 Ul de solution de traceur au fond de chaque tube Agiter pendant 60 m
9. inutes comme indiqu en 4 Laver comme indiqu en 5 Mesurer la radioactivit des tubes pendant 1 minute l aide d un compteur gamma D NO 0 Row Lecture des r sultats du dosage quantitatif Apr s avoir mesur la radioactivit exprim e en coups par minute cpm de tous les standards S0 S7 porter les r sultats sur une feuille pr par e cet effet en fonction de la concentration d hCG correspondante cf fig 2 exemple d une courbe d talonnage Construire la courbe talon en reliant les points sauf ceux qui indiquent des taux de comptage pr sentant de forts carts On peut encore agrandir l chelle la base de la courbe en vue de faciliter la lecture de tr s faibles concentrations d hCG Etablir la moyenne des valeurs cpm obtenues pour les s rums de patients et le s rum de contr le puis lire leur concentration en hCG partir de la courbe d talonnage Fig 2 Exemple d une courbe d talonnage Groupes cpm Concentration de tubes moyens mUlI ml 100 000 Standard 0 176 0 Standard 1 543 3 6 80 000 Standard 2 1246 9 0 Standard 3 3346 28 5 g 000 Standard 4 11168 97 0 2 Standard 5 32766 285 0 E Standard 6 69704 600 0 r Standard 7 86786 900 0 Contr le 14017 122 0 200 400 600 800 1 000 mUl mi hCG RIA gnost hCG Cisbio Bioassavs Janvier 2011 Mod le 11 Tab 4 R alisation du dosage quantitatif de hCG
10. lhCG se fixe pendant la premi re incubation sur la paroi du tube par l interm diaire des anticorps de la phase solide Apr s limination du s rum et de l antig ne en exc s l hCG pr sente est dos e au cours de la 2 incubation au moyen de la liaison d un anticorps anti a hCG monoclonal marqu l iode 125 Etant donn que les taux d hCG que l on peut escompter physiologiquement pendant la grossesse d passent 200 000 mUl mI mais que par ailleurs une plus grande sensibilit est exig e pour la d tection pr coce d une grossesse et le diagnostic de tumeurs on a associ dans le RIA gnost hCG une plage de mesure tendue 0 1000 mUI d hCG ml une sensibilit lev e lt 1 mUI d hCG ml variance de So Dans le pr sent essai le rapport signal concentration est net dans toute la plage de mesure pas d effet crochet La standardisation du RIA gnost hCG a t r alis e l aide du 1 IRP OMS 75 537 en mUl ml Etant donn que seule hCG totale est mesur e en m thode IRMA on obtient des valeurs identiques m me en cas de calibration au moyen du 2 IS talon international de L OMS 61 6 de 1963 contamin par des sous unit s 3 2 Impr cision Elle a t valu e l aide de 3 chantillons dos s 10 fois dans la m me s rie et dans 22 s ries diff rentes Intra essai Inter essai Echantillon Moyenne CV Echantillon Moyenne CV S mUl ml s mUl ml 1 12 9 2 4 4 11 7 11 4
11. ration des chantillons Apr s le pr l vement sanguin pr parer le s rum ou le plasma selon le proc d habituel Le s rum ou le plasma peut tre utilis imm diatement pour le test ou conserv pendant 24 heures au maximum entre 2 et 8 Pour une conserva tion plus longue une temp rature de 20C est recommand e Apr s d cong l ation bien agiter les chantillons Les s rums dont le taux d hCG est sup rieur celui de la plage de mesure doivent tre dilu s La trousse renferme un tampon d incubation qui est employ non seulement comme milieu d incubation mais aussi comme agent de dilution Si l agent de dilution ne suffit pas pr parer la 1 dilution des hautes dilutions l aide du tampon de lavage Pour le suivi des grossesses utiliser une dilution au 1 20 ainsi qu au 1 200 Bien homog n iser lorsqu on op re les dilutions On peut galement utiliser des chantillons d urine pour le dosage qualitatif 4 4 Mises en garde et pr cautions d emploi Les mati res premi res d origine humaine contenues dans les r actifs de cette trousse ont t test es avec des trousses agr es et trouv es n gatives en ce qui concerne les anticorps anti HIV 1 anti HIV 2 anti HCV et l antig ne HBs Cependant aucune m thode d analyse ne permet ce jour de garantir totalement qu une mati re premi re d origine humaine soit incapable de transmettre l h patite le virus HIV ou toute autre infection virale Aussi fa
12. up rieurs la normale font suspecter une grossesse multiple tandis que des taux d hCG trop bas s observent en cas de grossesses perturb es par exemple grossesse ectopique menace d avortement Des concentrations d hCG pathologiquement lev es sont d tect es en cas de tumeurs trophoblastiques et souvent aussi en cas de tumeurs non trophoblastiques Il en ressort que l emploi clinique du dosage de l hCG en gyn cologie et en oncologie a pour but la d tection et le suivi des grossesses et des affections tumorales p me g me 2 2 Taux normaux 2 2 1 Diagnostic des tumeurs La limite sup rieure de la plage normale a t tablie l aide de 165 chantillons de s rums d hommes sains et de 96 chantillons de s rums de femmes non enceintes au moyen du 95 percentile Chez les femmes avant la m nopause et chez les hommes la limite sup rieure s l ve 5 mUl ml hCG tandis que ce taux passe 10mUI mI hCG n 157 chez les femmes apr s la m nopause Les taux s riques d hCG d passant cette limite peuvent servir d indicateur tumoral Le marqueur tumoral hCG convient particuli rement la surveillance des tumeurs productrices d hCG 2 2 2 Grossesse La plage normale a t tablie pour le RIA gnost hCG par la mesure de 329 s rums de femmes dont la grossesse se d roulait normalement et pr lev s entre la 5 et la 14 semaine de grossesse en cours Cette plage a t calcul e au moyen de la m diane 50
13. ut il consid rer toute mati re premi re d origine humaine y compris les chantillons doser comme potentiellement infectieuse 4 5 Protocoles de dosage Il convient de faire la distinction entre le dosage qualitatif destin la d tection pr coce d une grossesse et le dosage quantitatif servant contr ler l volution de la grossesse et tablir le diagnostic de tumeurs 4 5 1 Dosage qualitatif 1 Num roter un nombre suffisant de tubes rev tus d anticorps comme indiqu dans le tableau 2 1 t moin n gatif So 1 t moin positif s rum de contr le 1 standard de r f rence S3 au maximum 47 chantillons inconnus 2 Distribuer 100 ul des standards et des chantillons de patients au fond des tubes pr par s cet effet Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque chantillon Distribuer dans chaque tube 100 ll de solution du tampon d incubation Agjiter les tubes sur un agitateur horizontal pendant 10 30 minutes et entre 18 et 25 Distribuer dans chaque tube 1 mI de tampon de lavage l aide d un distributeur d canter aspirer puis rincer avec 1 ml Distribuer ensuite 200 ul de solution de traceur au fond de chaque tube Agiter pendant 10 60 minutes comme indiqu en 4 1 Laver comme indiqu en 4 2 Mesurer la radioactivit des tubes pendant 1 minute l aide d un compteur gamma NO ER co Tabl 2 R alisation du dosage qualitatif de hCG
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