SOMMAIRE : Introduction Objectifs du travail Méthodologie
Contents
1. la ligne de base de I appareil Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale e Une solution de Kreb s HEPES B dite pauvre en ions chlorures Les solutions de Kreb s utilis es sont inspir es de la solution de Kreb s Henseleit Annexe 2 milieu fr quemment utilis pour la biologie cellulaire et dont on a remplac le tampon Phosphates Bicarbonates par de l HEPES substance ne p n trant pas dans les cellules Le test se d roule en plusieurs tapes 1 Introduction au niveau nasal Figure 5 d une sonde de Foley contenant du gel pour ECG Une sonde de Foley est un type de sonde urinaire ayant deux branches Photographie 1 Dans cette sonde est introduite une lectrode de mesure Cette lectrode est l lectrode du p le apical de la cellule Photographie 1 Sonde de Foley Figure 5 Anatomie des fosses nasales 2 Pose d une lectrode dite lectrode de r f rence au niveau de l avant bras apr s avoir r alis une abrasion de la peau Cette lectrode est consid r e comme l lectrode se situant sur le p le basal des cellules 16 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale 3 D placement de l lectrode nasale l int rieur de la cavit nasale jusqu trouver le site pr sentant la ddp la plus grande Durant toutes ces manipulations l int rieur de la sonde de Foley est perfus l aide d une solution de Ringer la2. pr paration magistrale Spectre UV PICS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 18 Anm 194 0 ABS 1 581 2 888 T T 1 1 508 N 1 000 ABS 8 588 j 7 RES 8 888 1 1 ee 198 0 200 0 210 0 220 0 230 0 250 0 LONGEUR D ONDE Figure 4 Spectre UV de HEPES enregistr entre 190 et 250nm E 1 194 66 35 Spectre obtenu partir d une solution d HEPES 0 001 M avec un spectrophotom tre double faisceau UNICAM UV2 en utilisant des cuves en quartz Solubilit soluble dans l eau Incompatibilit physico chimique agents oxydants forts acides forts Produits de d gradation mission de vapeur de monoxyde de carbone de dioxyde de carbone oxyde d azote et d oxydes de soufre Modalit s d obtention HEPES est un produit chimique courant fourni par de nombreux laboratoires SIGMA MERCK avec une puret annonc e sur les bulletins d analyse fournis par les laboratoires de plus de 99 Mais aucun fournisseur n accepte de communiquer les modalit s de synth se et les produits apparent s On peut juste dire que la s quence de synth se fait intervenir et ou produit 3 10 acide ac tique sous forme d acide ac tique glaciale N 2 hydroxyethyl piperazine et chloroethanesulfonate de sodium Le N 2 hydroxy thyl pip razine est un produit irritant ayant n anmoins une faible toxicit DL o 4920mg kg chez le rat utilis uniquement en synth se org
3. 0001 Ba lt 0 0001 Bi lt 0 0001 Ca lt 0 0005 Cd lt 0 0001 Co lt 0 0001 Cr lt 0 0001 Cu lt 0 0001 Fe lt 0 0001 Li lt 0 0001 Mg lt 0 0001 Mn lt 0 0001 Mo lt 0 0001 Ni lt 0 0001 Pb lt 0 0001 Sr lt 0 0001 Zn lt 0 0001 Autres Mati res insolubles Solution st rile et apyrog ne Dnase Rnase Prot ases phosphatases Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale L ensemble de forme d HEPES produite par le groupe SIGMA ALDRICH a une teneur th orique en m taux lourd sup rieure a la teneur pr vue par la pharmacop e europ enne sous la rubrique essai limite des m taux lourds Il faut noter que ce groupe fourni deux solutions d HEPES dont la teneur en HEPES est sup rieure ou gale 99 5 Cependant la solution produite par le laboratoire FLUKA ne semble pas pouvoir tre utilis e celle ci contenant un tampon phosphate et du dextrose dont l effet dans les solutions de Kreb s et les solutions de glutarald hyde n est pas document 2 Recherche d un tampon pour le test diagnostic Description du test Principes Les canaux ioniques sont impliqu s dans le maintien des caract ristiques physico chimiques du milieu intracellulaire Leur fonctionnement induit pour chaque ion sodium potassium calcium magn sium etc une dissym trie de concentration de part et d autre de la membrane plasmique Pou
4. 05 Nas 0 005 Cus 0 0005 Cus 0 0005 Cu lt 0 0005 Nis 0 0005 Fe lt 0 0005 Fe lt 0 0005 Fe lt 0 0005 Pb lt 0 0005 Li lt 0 0005 Li lt 0 0005 Li lt 0 0005 Zn lt 0 0005 Mg lt 0 0005 Mg lt 0 0005 Megs 0 0005 Mns 0 0005 Mn lt 0 0005 Mn lt 0 0005 Mos 0 0005 Mo lt 0 0005 Mos 0 0005 Nas 0 005 Na lt 0 005 Nas 0 005 Nis 0 0005 Ni lt 0 0005 Nis0 0005 Pbs 0 0005 Pb lt 0 0005 Pbs 0 0005 Sr lt 0 0005 Sr lt 0 0005 Sr lt 0 0005 Zn lt 0 0005 Zn lt 0 0005 Zn lt 0 0005 P d lt 0 5 P d lt 0 5 P d lt 0 5 P d lt 0 5 Cs lt 0 1 Cs lt 0 1 Cs lt 0 1 Cs lt 0 1 Mati res Mati res insolubles Mati res insolubles insolubles Dnase Rnase Prot ases Test de luminescence phosphatases Pad Perte la dessication Cs Cendres sulfuriques Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Tableau 4 Solution d HEPES fabriqu es par le groupe SIGMA ALDRICH 21 HEPES sous forme de sel de sodium H3784 puret gt 99 5 m taux lourds lt 5 ppm fer lt S5ppm Dnase et Rnase Prot ases apyrog ne Fournisseur FLUKA SIGMA Code 51558 H0887 Formule HEPES 10 g l HEPES IM NaCl 16 g l Correspondant a un m lange KCI 0 74 g l d HEPES acide libre H4034 et Na HPO 2H20 0 27 g l HEPES sous forme de sel de Dextrose 2 g l sodium H3784 Contaminants Al lt 0
5. 1 Al lt 0 0005 As lt 0 0001 Ba lt 0 0005 Bi lt 0 0005 Cd lt 0 0005 Co lt 0 0005 Cr lt 0 0005 Cu lt 0 0005 Fe lt 0 0005 Li lt 0 0005 Mg lt 0 0005 Mn lt 0 0005 Na lt 0 0005 Ni lt 0 0005 Pb lt 0 0005 Sr lt 0 0005 Zn lt 0 0005 M taux lourds lt 5 ppm M taux lourds lt 5 ppm Fer lt 5 ppm Dnase Rnase et prot ases non d tect es Endotoxines test es Autres Perte la dessication 110 C lt 1 Cendres sulfuriques lt 0 1 Embryo test Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Tableau 2 suite HEPES sous forme de poudre produit par le groupe SIGMA ALDRICH 21 Fournisseur FLUKA FLUKA FLUKA FLUKA Code 54461 54459 54457 54455 Puret gt 99 5 2 99 5 2 99 5 2 99 5 Contaminants Cl lt 0 005 Cl lt 0 005 C1 lt 0 005 CIS 0 005 K lt 0 005 K lt 0 005 K lt 0 005 K lt 0 005 SO4s 0 005 SO4 lt 0 005 SO4 lt 0 005 SO4 lt 0 005 Cas 0 005 Cas 0 001 Ca lt 0 001 Ca lt 0 001 Cds 0 0005 AIS 0 0005 AI lt 0 0005 Als 0 0005 Cos 0 0005 Ass 0 00001 As lt 0 00001 Ass 0 00001 Crs 0 0005 Ba lt 0 0005 Bax 0 0005 Bas 0 0005 Cus 0 0005 Bi lt 0 0005 Bi lt 0 0005 Bi lt 0 0005 Fes 0 0005 Cd lt 0 0005 Cd lt 0 0005 Cds 0 0005 Mg lt 0 01 Cos 0 0005 Co lt 0 0005 Co lt 0 0005 Mns 0 0005 Cr lt 0 0005 Cr lt 0 0005 Crs 0 00
6. 152 mmol l Ca 2 mmol l Mg 1 mmol l Na 140 mmol l K 6 mmol l Cl 6 mmol l Ca 2 mmol l Mg 1 mmol l Na 143 mmol l K 5 9 mmol l Cl 127 7 mmol l Ca 2 5 mmol l Mg 1 2 mmol l Les solutions de Kreb s A et B sont pr par es de mani re st rile En effet la st rilit est un l ment permettant d assurer la conservation de ces solutions Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale BIBLIOGRAPHIE 1 Code de la sant publique Edition 1997 2 P G Middleton D M Geddes E W F W Alton Protocols for in vivo measurement of ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium European respiratory journal 1994 7 2050 2056 3 J Zhao B Zerhusen J Xie M L Drumm P B Davis J Ma Rectification of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channel mediated by extracellular divalent cations Biophysical Journal 1996 71 2458 2466 4 L P Ho J M Samways D J Porteous J R Dorin A Carothers A P Greening J A Innes Correlation between nasal potential difference measurements genotype and clinical condition in patients with cystic fibrosis European respiratory journal 1997 10 2018 2022 5 E W F W Alton D Currie R Logan Sinclair J O Warner M E Hodson D M Geddes Nasal potential difference a clinical diagnostic test for cystic fibrosis European respiratory journal 1
7. 990 3 922 926 6 A Carpentier G Lemaire L Robert S Carpentier C Dubost Biological factors affecting long term results of valvular heterografts Journal of thoracic and cardiovascular surgery 1969 58 4 467 483 7 Index Merck 12 dition 1999 8 The Aldrich library of infrared spectra auteur C J Pouchert diteur Milwaukee Wis Aldrich Chemical 1981 dition 3rd ed 2nd printing 9 The Aldrich library of NMR nuclear magnetic resonance spectra auteur C J Pouchert diteur Milwaukee Wis Aldrich Chemical 1983 dition 2nd ed 31 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale 10 L Abas M Guppy Acetate A contaminant in hepes buffer Analytical biochemistry 1995 229 139 140 11 Catalogue Merck r actifs et produits chimique 1998 1999 12 T R Theodore R L Van Zandt R H Carpenter Preliminary evaluation of a fixed dose of zwitterionic piperazine TVZ 7 in clinical cancer Cancer biotherapeutic radiopharmacy 1997 12 3 345 349 13 http www inpi fr 14 J Kane R L Macdonald J Zhang B Sima Hepes inhibits contractile responses of canine basilar artery Neurological research 1997 19 october 527 533 15 Dresel Negative cardiac inotropic effects of calcium ion and N 2 hydroxyethylpiperazine N 2 ethansulfonic acid HEPES buffer at normal and low sodium concentration Canadian journal of physiology and phar
8. ES Cette substance devra tre pharmaceutique fabriqu e par un laboratoire pharmaceutique ou susceptible de le devenir contr le d identification et de puret recherche des impuret s et d approvisionnement facile Dans un deuxi me temps cette substance devra permettre de r aliser les pr parations avec une dur e limite de conservation compatible avec l activit de routine des services cliniques et de la pharmacie La recherche de cette substance se fera en tenant compte des caract ristiques de I HEPES trouv es lors de l tude de pr formulation et motivant son utilisation dans les solutions de Kreb s et de glutarald hyde Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale RESULTATS 1 Etude de pr formulation de HEPES Etude chimique 7 D nomination Acide 2 4 2 Hydroxyethyl 1 piperazinyl thanesulfonique Formule brut CgH 3N2O0 4S MM 238 3 Formule d velopp e PKa 22 C 7 41 Point de fusion 206 240 C Spectre Infrarouge Figure 1 Spectre IR de l HEPES 8 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Spectre RMN Sete Be UNE _ jo 7 wotee aA aii i Parman TEINI BEG Dieu dai at Figure 2 Spectre RMN de la forme acide de l HEPES 9 OR es Figure 3 Spectre RMN de la forme salifi e de l HEPES 9 Strat gie de recherche d un tampon pour
9. O 10 gt B Amil Ringer Isuprel B Amil p 20 ou TS j 40 Sol A J j ddp mV 60 Temps secondes Figure 7 Graphique obtenu chez un sujet atteint de mucoviscidose Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Propri t s n cessaires a un tampon pour tre utilisable dans ce test Pour tre utilisable dans ce test diagnostic la substance tampon doit Ne pas perturber l activit des canaux ioniques par une action pharmacologique ou par modification des conditions physico chimiques du milieu Avoir un pKa proche du pH physiologique ceci afin de fabriquer une solution dont le pH est proche du pH physiologique En effet le fonctionnement des canaux ioniques est d pendant des conditions du milieu et notamment du pH Ne pas p n trer dans les cellules pour ne pas perturber les propri t s physico chimiques du cytoplasme l activit des canaux ioniques tant influenc e par le milieu intra cellulaire concentration des diff rents ions pH Dans le cas de la CFTR une modification du pH entra ne une modification de la conductance des ions chlorures mais galement une modification de l activation de cette prot ine par la proteine kinase A impliqu e dans l activation de la CFTR par phospharylation 23 24 Etudes de substances tampons Il existe de nombreuses substances tampons utilis es en biologie Ces substances se subdivisent en deux grand
10. Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale SOMMAIRE Introduction Page 2 Objectifs du travail Page 4 M thodologie Page 5 R sultats Page 6 1 Etude de pr formulation Etude chimique Page 6 Propri t s physiologiques Pharmacologie toxicologie Page 9 Utilisation Page 10 2 Recherche d un tampon pour le test diagnostic de la mucoviscidose Page 15 Description du test Etudes de substances tampon Page 20 Conclusion Page 23 3 Recherche d un tampon pour la solution de glutarald hyde Page 23 Utilisation de la solution de glutarald hyde Mode d emploi et int r ts Page 23 Farication des solutions de glutarald hyde Choix d un tampon Page 24 Farication des solutions de glutarald hyde Probl me de la glutarald hyde Page 25 Conclusion Page 27 Annexe 1 Composition de la solution base de glutarald hyde Page 29 Annexe 2 Composition des solutions de Kreb s Page 30 Bibliographie Page 31 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale INTRODUCTION Les pr parations hospitali res permettent d adapter la forme des m dicaments leur usage en m decine humaine Elles permettent galement d obtenir des m dicaments avec une qualit propre assurer la s curit du patient Pour leur r alisation le pharmacien doit utiliser des produits inscrit la pharmacop e 1 ou le cas ch ant tablir des contr l
11. anique 11 Le chloro thanesulfonate de sodium est un produit utilis en synth se organique capable d irriter Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale la peau et les muqueuses L acide ac tique est produit caustique pouvant occasionner en cas d ingestion vomissements h mat m se diarrh es collapsus circulatoire ur mie et d c s En cas d exposition chronique l acide ac tique on peut avoir une rosion dentaire une irritation des yeux et des bronches Propri t s physiologiques Pharmacologie L HEPES tant un compos chimique de laboratoire il existe peu de donn es sur ses propri t s pharmacocin tiques et pharmacodynamiques N anmoins des tudes r centes ont montr que l HEPES poss de des propri t s anti inflammatoires De plus on recense un essai clinique d administration par voie parent rale a des patients atteints d un cancer 12 Cet essai limit seulement 3 patients a montr une am lioration de l tat de ces patients avec une diminution de la douleur objectiv es par la diminution des doses d analg siques et par une diminution des marqueurs tumoraux Enfin un brevet a t d pos concernant l utilisation d HEPES et de ses d riv s comme agents anti inflammatoires 13 Cette action anti inflammatoire et antitumorale proviendrait d une stimulation du syst me immunitaire L HEPES aurait galement des propri t s vasodilatatrices
12. bilize biological materials for cardiovascular surgery Annals New York academy of sciences 27 R M Anthony F J Schoen Alkaline phosphatase activity of glutaraldehyde treated bovine pericardium used in bioprosthetic cardiac valves Circulation research 1998 63 844 848 28 British Pharmacopoeia 1993 diteur London Her Majesty s Stationery Office 1993 1997 29 The United States Pharmacopeia the National Formulary dition 2000 33
13. cherche d un tampon pour pr paration magistrale galement tre utilis e en m decine humaine pour le traitement des verrues pure ou apr s dilution a une concentration de 10 ainsi que dans le traitement des hyperhydrose plantaire apres avoir ramen la concentration a 10 La glutarald hyde pouvant tre obtenu aupr s d un laboratoire pharmaceutique pour une utilisation en m decine humaine il ne semble pas y avoir d obstacle r glementaire son utilisation pour traiter des fragments de p ricarde une simple r action d identification devant n anmoins tre r alis e Tableau 7 26 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale CONCLUSIONS L HEPES est une substance tampon tr s connue en biologie cellulaire et mol culaire On recense des r f rences bibliographiques contenant le mot HEPES depuis la fin des ann es 60 Cependant si dans le domaine des manipulations en biologie cellulaire on dispose de nombreuses informations sur l HEPES et sur ses avantages les r f rences sur ses propri t s physiologiques pharmacologiques et toxicologiques sont peu nombreuses Le faible nombre d tudes disponibles ce jour indique que HEPES ne semble pas avoir de toxicit aigu particuli re et aurait des propri t s anti inflammatoires L utilisation d un tampon phosphate dans les solutions base de glutarald hyde est possible de part la litt rature l u
14. ctate 4 Perfusion dans la sonde de Foley de la solution de Kreb s permettant de faire la ligne de base On peut voir a ce stade une diff rence entre les sujets malades et les sujets sains En effet la ddp chez le sujet sain est proche de 20mV contre 40mV chez le sujet atteint de mucoviscidose 5 Perfusion d un m lange solution de Krebs amiloride L amiloride est une mol cule bloquant l absorption du sodium provoquant une augmentation de la ddp Chez le sujet malade la capacit d absorption est r duite de sorte que l ajout d amiloride dans le milieu bloque la capacit r siduelle de s cr tion provoquant une brutale augmentation de la ddp comparativement au sujet sain 6 Perfusion d amiloride dans une solution de Krebs pauvre en ions chlorures La teneur faible en ions chlorures est destin e a stimuler la s cr tion des ions chlorures par les cellules ce qui se traduit par une diminution de la ddp En cas de mucoviscidose la capacit de s cr tion des ions chlorures est diminu e 7 Perfusion d un m lange amiloride isopr naline dans une solution de Krebs pauvre en ions chlorures L isopr naline est agoniste B provoquant une augmentation de la concentration en AMPc intracellulaire activant les fonctions du canal chlore d o une augmentation de la s cr tion des ions chlorures avec pour cons quence une diminution de la ddp La ddp est enregistr e en permanence pour obtenir un graphique en fonc
15. d hyde 25 25 ml Ajuster le pH 7 4 avec de la soude ou de acide chlorhydrique Compl ter 1000ml avec de l eau ppi Probl me de la glutarald hyde La solution de glutarald hyde servant de mati re premi re est titr e 25 La glutarald hyde est inscrite la pharmacop e britannique et la pharmacop e nord am ricaine sous forme d une solution concentr e 50 Son contr le est donc possible en suivant l une ou l autre des deux monographies Tableau 8 Comparaison des monographies de la glutarald hyde 28 29 Britannique Nord am ricaine Identification R action avec du chlorhydrate R action la 2 4 d hydroxylamine et de l ac tate de sodium Dinitroph nylhydrazine gt 2 4 R action avec du nitrate d argent dinitroph nylhydrazone ammoniacal gt Pr cipit d argent Essai M taux lourd lt 0 001 pH 3 7 4 5 Dosage Dosage par retour utilisant du chlorhydrate Dosage par retour utilisant une d hydroxylamine et de la soude solution de chlorhydrate d hydroxylamine une solution de triethanolamine et de l acide sulfurique La glutarald hyde peut tre obtenue aupr s de Coop rative pharmaceutique Cooper qui la commercialise sous la forme d une solution 25 Cette solution est propos e comme d sinfectant et comme agent de st rilisation pour les instruments non autoclavables Elle peut 25 Strat gie de re
16. e apical et absorber les ions sodium 2 3 La cons quence physiologique est une insuffisance d hydratation des secr tions d o une viscosit accrue aboutissant une colonisation bact rienne chronique des poumons avec infections r p titions provoquant termes une fibrose et une bronchiectasie 4 Le diagnostic de la mucoviscidose se fait classiquement par le test la sueur permettant de mettre en vidence la diminution de la s cr tion des ions chlorures au niveau des secr tions et par la biologie mol culaire permettant de mettre en vidence la mutation en cause Le nombre de mutations est proche de 500 4 Un troisi me Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale test possible est la mesure de la diff rence de potentiel trans pith liale 5 celle ci tant diminu e en cas de mucoviscidose La solution a base de glutarald hyde est utilis e depuis les ann es 80 Elle a t mise au point par l quipe du Professeur A Carpentier 6 Pendant des ann es elle tait fabriqu e par des laboratoires Exemple BAXTER ceux ci s en servant pour traiter les p ricardes de porcs afin de fabriquer des bioproth ses valvulaires Mais la cession aux h pitaux a t supprim e depuis 4 ans obligeant les pharmaciens hospitaliers a en assurer la fabrication La solution de glutarald hyde est utilis e pour traiter les morceaux de p ricarde pr lev s chez le patient Ce
17. e greffons porcins Lors de ces recherches cette quipe a pu constater 3 cat gories de ph nom nes de d gradation du greffon apr s la greffe n cessitant terme une r intervention 6 e R actions immunologiques de rejet du greffon e R actions inflammatoires e D naturation des fibres de collag ne aboutissant la formation d an vrismes au niveau du greffon 23 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Pour viter ces ph nom nes les greffons doivent subir une tape de conditionnement pour les pr server Ce traitement doit pr server les qualit s m caniques du greffon tout en pr venant les r actions immunologiques et la d gradation du collag ne Le traitement par la glutarald hyde pr sente toutes ces propri t s d sinfection d naturation des mol cules de HLA m diateur de la r action immune formation de liaison intra chaines entre les 3 cha nes peptidiques du collag ne et inter cha nes renfor ant sa stabilit 6 Ce traitement ne pr serve cependant pas le greffon du ph nom ne de calcification long terme car la glutarald hyde ne d grade pas l int gralit des mol cules de phosphatases alcalines impliqu es dans le ph nom ne 27 Ce traitement vise aussi bien tanner le tissu utilisation de concentration de l ordre de 0 62 qu conserver le tissu sur un longue dur e utilisation de concentration de l ordre de 0 2 Il permet galement d a
18. e se substituer 17 HEPES pas de p n tration dans les cellules pK proche du pH physiologique Aucune de ces substances ne remplit la condition n cessaire a une utilisation en m decine humaine l inscription la pharmacop e Conclusion Les substances susceptibles d tre utilis e comme tampon dans les solutions de Kreb s utilis es pour le diagnostic de la mucoviscidose doivent Ne pas perturber l activit des canaux ioniques avoir un pKa proche du pH physiologique et ne pas p n trer dans les cellules S il existe des substances inscrites la pharmacop e remplissant les deux premi res conditions aucune ne remplit la troisi me condition car toutes peuvent p n trer dans les cellules De ce fait on doit utiliser une substance non inscrite la pharmacop e remplissant les trois conditions comme le TES ou le MOP ou l HEPES On peut donc dire que l HEPES ne peut pas tre remplac par une substance inscrite la pharmacop e 3 Recherche d un tampon pour la solution de glutarald hyde Utilisation de la solution de glutarald hyde Mode d emploi 26 e Pr l vement d un fragment de p ricarde chez le patient e Immersion du fragment dans la solution de glutarald hyde durant 10 minutes e Ringage du greffon avec du NaCl 0 9 Int r ts La solution de glutarald hyde a t mise au point par l quipe du Professeur A Carpentier lors des essais d h t rogreffes partir d
19. es r aliser pour rendre ces produits pharmaceutiques La pharmacie de l h pital Necker Enfants Malades pr pare pour le service de chirurgie cardiaque une solution base de glutarald hyde suite au transfert du service de chirurgie cardiaque de l h pital Laennec l h pital N cker Enfants malades La formule utilis e est celle fournie par le service Annexe 1 La pharmacie a galement re u une demande de faisabilit pour des solutions dite de Kreb s Annexe 2 par le service d explorations fonctionnelles Ces deux pr parations ont en commun de contenir de l HEPES substance tampon fabriqu e par des laboratoires non pharmaceutiques et ayant le statut de r actif de laboratoire de ce fait l utilisation de l HEPES dans des pr parations destin es la m decine humaine et animale est interdite 1 priori Les solutions de Kreb s sont utilis es dans le diagnostic de la mucoviscidose pathologie affectant de nombreux organes avec un retentissement clinique surtout pulmonaire La mucoviscidose est due au dysfonctionnement d une prot ine la CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator r gulateur transmembranaire de la fibrose kystique 2 3 Cette prot ine membranaire a principalement un r le de canal pour les ions chlorures mais aussi des fonctions de r gulation de canaux ioniques Son dysfonctionnement se traduit par l incapacit des membranes cellulaires a s cr ter les ions chlorures sur le p l
20. groupe ont leurs composants inscrits a la pharmacop e europ enne et certains m langes sont m me class s sous la rubrique tampons de cette m me pharmacop e 21 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Tableau 7 Substances tampons ne p n trant pas dans les cellules 17 Tampon Pka Acide 2 N morpholino thane sulfonique 6 15 MES Acide N 2 Ac tamido diac tique 6 60 ADA Acide pip razine N N bis 2 thane sulfonique 6 80 PIPES Acide N 2 ac tamido 2 amino thane sulfonique 6 90 ACES Acide 3 N morpholino propane sulfonique 7 20 MOPS Acide N tris hydroxymethyl m thyl 2 amino thanesulfonique 7 50 TES Acide N 2 hydroxyethyl pip razine N 2 thane sulfonique 7 41 HEPES Acide N 2 hydroxy thyl pip razine N 3 propane sulfonique 8 00 HEPPS N tris hydroxym thyl m thylglycine 8 15 Tricine N N bis 2 hydroxy thyl glycine 8 35 Bicine Glycylglycine 8 40 Acide N tris hydroxym thyl m thyl 3 amino propane sulfonique 8 55 TAPS Acide cycloh xyl amino thane sulfonique 9 50 CHES Acide 3 cyclohexylamino propane sulfonique 10 40 CAPS Aucune de ces substances n est inscrite a la pharmacop e europ enne 22 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale On constate que si certaines substances du Tableau 5 MOPS TES sont susceptibles d
21. ins la fabrication de ces pr parations ne peut tre envisager sans avoir cherch une alternative l utilisation d une substance ayant le statut de r actif L objectif du travail est de palier a l absence de statut pharmaceutique des mati res premi res base d HEPES rendant leur utilisation en l tat impossible dans les pr parations pour usage chez l homme Le but est d essayer de rendre ces mati res premi res pharmaceutiques par la r alisation des contr les ad quates identification recherche des impuret s dosage ou en trouvant une substance susceptible de se substituer a 17 HEPES dans les solutions de Kreb s et les solutions a base de glutarald hyde Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale METHODOLOGIE Le travail se subdivise en deux grandes tapes R alisation d une tude de pr formulation de HEPES destin e mettre en vidence les caract ristiques chimiques physiques physiologiques pharmacologiques et toxicologiques de l HEPES Le but de cette tude est double r daction d une fiche de contr le identification impuret s dosage pour le contr le de la mati re premi re et mise en vidence des caract ristiques chimiques et biologiques de l HEPES qui motive son choix pour l usage que l on en fait Cette tude de pr formulation sera avant tout bibliographique Recherche d une substance de substitution de l HEP
22. ix de la mati re premi re est arr t sur la solution st rile d HEPES fournie par le laboratoire SIGMA le caract re st rile de cette solution tant un gage pour la bonne conservation des solutions pr par es avec cette mati re premi re Cette solution devra subir pour chaque lot re u e La r alisation d un spectre UV devant mettre en vidence le pic d absorption 194 nm concourant au faisceau de pr somption sur l identit de la mati re premi re 27 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale e Essai de recherche de m taux lourds selon la m thode de la pharmacop e avec du thioac tamide mettant en vidence le plomb m taux lourds le plus abondant dans l environnement Les m taux lourds sont recherch s cause de leur toxicit notoire sur l organisme e Essai de recherche des sulfates selon la m thode de la pharmacop e au chlorure de baryum En effet HEPES est une mol cule pr sentant une fonction acide sulfonique Il est donc l gitime de penser que sa synth se inclut l utilisation d ion sulfates e Essai de recherche de l arsenic L arsenic est recherch cause de sa toxicit Les contaminants recherch s peuvent aussi tre mis en vidence par des m thodes autres que celles d crites la pharmacop e condition qu elles aient t valid es vis vis de la m thode de la pharmacop e celle ci servant de r f rence Le dosage n est pa
23. macology 1974 52 5 1025 1029 16 J W Hanrahan J A Tabcharani Inhibition of an outwardly rectifying anion channel by HEPES and related buffers Journal of membrane biology 1990 116 65 77 17 Appareils et m thodes en biochimie et biologie mol culaire P Kamoun Coll M decine sciences Ed Flammarion 18 T R Theodore R L Van Zandt R H Carpenter Pilot ascending dose tolerance study of parenterally administered 4 2 hydroxyethyl 1 piperazine ethane sulfonic acid TVZ 7 in dogs Cancer biotherapeutic radiopharmacy 1997 12 3 351 353 19 http www dojindo com 20 Catalogue Merck 1998 1999 21 http www sigma aldrich com 32 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale 22 MR knowles J L Carson A M Collier J T Gatzy R C Boucher Measurement of nasal transepithelial electric potential differences in normal human subjects in vivo American revue of respiratory diseases 1981 124 484 490 23 La biochimie auteur L Stryer S Weinman P Kamoun diteur Paris Flammarion m decine sciences 1992 dition 3e d 24 M M Reddy R R Kopito P M Quinton Cytosolic pH regulates Ga through control phosphorylation states of CFTR American journal of physiology 1998 Cell physiology 44 C1040 C1047 25 Pharmacop e europ enne 3 dition 1997 26 J C Chachques B Vasseur P Perier J Balansa S Chauvaud A Carpentier rapid method to sta
24. on mol cule neutre aussi bien l tat protonn que d protonn Son pKa est proche du pH physiologique On l utilise donc comme tampon dans des exp riences de biologie cellulaire 7 Elle est produite par diff rents laboratoires Si tous les laboratoires fournissent un produit d une puret sup rieure ou gale 99 les contr les effectu s sur le produit fini sont diff rents d un laboratoire un autre et en fonction de la forme de commercialisation Tableau 1 2 3 et 4 Tableau 1 HEPES fourni par le laboratoire DOJINDO 18 Nom HEPES Pr sentation Poudre cristalline blanche Puret gt 99 Contaminants Sulfates lt 0 1 M taux lourds lt 0 0005 Fer lt 0 0005 Le laboratoire japonais DOJINDO ne fabrique l HEPES que sous forme de poudre dont la qualit est tr s peu renseign e 19 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Tableau 2 HEPES par le laboratoire MERCK 20 Nom HEPES acide libre qualit pour HEPES acide libre HEPES acide libre biologie mol culaire solution 1M qualit qualit ULTROL ULTROL Pr sentation Poudre blanche Solution Poudre cristalline blanche Puret 299 299 299 Contaminants Dnase Non d tect es Chlorures lt 0 01 Chlorures lt 0 01 Rnase Non d tect es Sodium lt 0 1 Sodium lt 0 1 Prot ases Non d tect es Sulfates lt 0 05 Sulfates lt 0 05 M taux lourd
25. r les ions sodium potassium et chlorure cette dissym trie induit une diff rence de potentiel entre les deux faces de la membrane plasmatique La technique de mesure de cette diff rence de potentiel ddp est connue depuis le d but des ann es 1980 22 La mucoviscidose touchant les canaux chlore par modification de leur fonctionnement elle induit une modification de la r partition des ions chlorures de part et d autre de la membrane plasmique d o une modification de la diff rence de potentiel ce qui permet d utiliser cette mesure de la ddp comme un test diagnostic de la mucoviscidose Cette technique est utilis e pour les patients pr sentant les signes cliniques de la mucoviscidose avec un test la sueur limite un d pistage et une recherche par biologie mol culaire n gative L importance de la variation de la ddp est corr l e avec la gravit de la maladie 4 Chez les sujets atteints de mucoviscidose la ddp est inf rieure 41mV celle des sujets sains 19mV Cependant la r partition est large pour les deux populations 2 Aussi pour am liorer le test la technique initiale a t modifi e pour rendre le test plus sensible Technique 2 La r alisation du test n cessite l utilisation de 3 types de solution pour l irrigation de l lectrode de mesure e Une solution de Ringer lactate permettant de faire le blanc de l appareillage de mesure e Une solution de Kreb s HEPES A permettant de faire
26. s lt 1 ppm M taux lourds lt 1 ppm Solutions st riles Autres Stabilit de 3 ans Stabilit de 3 ans Stabilit de 5 ans Le laboratoire MERCK commercialise 3 formes d HEPES dont une solution st rile dont la concentration en m taux lourds est inf rieure la limite fix e par la pharmacop e 1 2 ppm mais dont la concentration en sulfates est sup rieure la teneur limite fix e par cette m me pharmacop e 10 ppm 0 001 Le groupe SIGMA ALDRICH fournit de nombreuses l interm diaire de ses diff rentes filiales Sch matiquement pr sentations d HEPES par on peut distinguer 4 pr sentations HEPES acide libre HEPES sous forme de sel de sodium HEPES sous forme de sel de potassium HEPES sous forme d h mi sel de sodium HEPES en solution Seules P HEPES sous forme d acide libre Tableau 3 ou en solution Tableau 4 nous int ressent En effets les formes salifi es de HEPES sont susceptibles d apporter du sodium ou du potassium modifiant les caract ristiques des solutions pr par es Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Tableau 2 HEPES sous forme de poudre produit par le groupe SIGMA ALDRICH 21 Fournisseur SIGMA SIGMA SIGMA SIGMA Code H7523 H6147 H4034 H3375 Puret gt 99 5 gt 99 5 gt 99 5 gt 99 5 Contaminants Cl lt 0 005 K lt 0 005 Ca lt 0 00
27. s greffons sont utilis s pour 1 R aliser des op rations de reconstruction des vaisseaux notamment l art re pulmonaire afin la plupart du temps d en augmenter le diam tre 2 Boucher les orifices pathologiques du muscle cardiaque orifice du septum inter ventriculaire dans la maladie du sang bleu 3 Effectuer des reconstitutions valvulaires en cas d insuffisance valvulaire Ce traitement des greffons permet d viter la formation d an vrismes susceptibles de se rompre a plus ou moins long terme au niveau du greffon Il offre de plus la possibilit de conserver la capacit du greffon cro tre au fur et mesure de la croissance de l enfant Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale OBJECTIFS DU TRAVAIL La mucoviscidose est une maladie grave dont le diagnostic des formes frustres est difficile La mesure de la ddp trans pith liale permet de diagnostiquer ces formes limites La solution a base de glutarald hyde est d j fabriqu e par la pharmacie de l h pital Necker Enfants malades selon la formule fournie par le service de chirurgie cardiaque ceci afin de garantir l approvisionnement en glutarald hyde 0 62 indispensable pour la r alisation de certaines interventions aucune autre m thode de traitement des greffons n tant disponible La r alisation des solutions de Kreb s et des solutions a base de glutarald hyde est n cessaire N anmo
28. s groupes les substances p n trant dans les cellules Tableau 4 et les substances ne p n trant pas dans les cellules Tableau 5 Au sein de chaque groupe les substances sont ensuite class es en fonction de leur pKa Tableau 6 Tampons usuels en biologie 25 Tampon dont les composants sont inscrits la pharmacop e Tampon pharmacop e Nom Utilisation pH KCI HCl 1 0 2 2 Glycocolle HCl 1 2 3 4 Citrate de sodium HCI 1 2 5 Biphtalate de potassium HCl 2 4 4 0 Biphtalate de potassium NaOH 4 2 6 2 Citrate de sodium NaOH 5 2 6 6 Phosphates 5 0 8 0 Barbital de sodium HCI 7 0 9 0 Borate de sodium HCI 7 8 9 2 20 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Glycocolle NaOH 8 6 12 8 Borate de sodium NaOH 9 4 10 6 Acide citrique Phosphates 2 2 7 8 Citrate Phosphates Borates HCI 2 0 12 0 Ac tates 3 8 5 6 Acide di thylglutarique NaOH 3 2 7 6 Pip razine HCI 4 6 6 4 8 8 10 6 T tra thyl thyl nediamine 5 0 6 8 8 2 10 4 Tris Mal ate 5 2 8 6 Di thyl thyl nediamine 5 6 7 4 8 6 10 4 Imidazole HCI 6 2 7 8 Tri thanolamine HCl 7 0 8 8 N dim thylaminaminoleucylglycocolle NaOH 7 0 8 8 Tris HCl 7 2 9 0 2 amino 2 m thylpropane 1 3 diol HCl 7 8 10 0 Carbonates 9 2 10 8 De nombreux tampons de ce
29. s r alis car la solution contient deux formes diff rentes de l HEPES acide libre et sel de sodium De m me les impuret s ne peuvent tre recherch es leur identit tant inconnue 28 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale ANNEXE 1 Composition de la solution base de Glutarald hyde Glutarald hyde 25 48 ml NaCl 20 48 ml MgCl 6H20 10 80 ml Tampon HEPES 1M st rile et apyrog ne 40 ml Eau pour pr paration injectable 1770 ml Cette solution de glutarald hyde doit tre pr par e de mani re st rile d une part pour assurer une bonne conservation et d autre part parce que cette solution est destin e tre mise en contact avec des fragments de p ricarde devant rester st riles 29 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale ANNEXE 2 Composition des solutions de KREB S Solution de Kreb s HEPES A NaCl 8 18 g l KCI 0 44 g l MgCl 6H20 0 20 g l CaCb 2H20 0 30 g l Glucose 1 80 g l HEPES 2 38 g l Solution de Kreb s HEPES B Gluconate de sodium 30 54 g l Gluconate de potassium 1 44 g l MgCl 6H20 0 20 g l CaCb 2H20 0 30 g l Glucose 1 80 g l HEPES 2 38 g l Solution de Kreb s Henseleit NaCl 118 mmol l KCI 4 7 mmol l CaCl 2 5 mmol l MgSO 1 2 mmol l KH gt PO 1 2 mmol l NaHCO 25 mmol l Glucose 10 mmol l Na 140 mmol l K 6 mmol l Cl
30. selon des tudes in vitro r alis es sur des art res de chiens 14 et inotropes n gatives 15 quand la concentration en sodium et ou calcium diminue Les propri t s vasodilatatrices seraient dues a la g n ration de peroxyde d hydrog ne et d autres radicaux libres Enfin HEPES est susceptible de bloquer les canaux ioniques aux ions chlorures quand il est sur la face intra cytoplasmique de ces canaux 16 17 ce qui arrive rarement tant donn que l HEPES p n tre peu voir pas du tout dans les cellules 17 Toxicologie Comme pour la pharmacologie on dispose de peu de donn es concernant la toxicit de HEPES On peut juste citer une exp rience d administration par voie parent rale chez des chiens de race beagle 18 Cette exp rience n a pas montr de toxicit imm diate mais a permis de mettre en vidence une modification du my logramme dans le sens de Vhyper cellularit et l apparition d un ph nom ne d h matopo se au niveau du foie partir d une dose de 400 mg kg Cette dose correspond au bras des hautes doses de l tude ce qui fait conclure par les auteurs la grande marge th rapeutique du produit Cette exp rience n a cependant pas tudi les propri t s canc rig nes mutag nes et les effets sur la fertilit et la descendance Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Utilisation L HEPES est une mol cule ayant des propri t s de zwitteri
31. ssurer la st rilit 6 des greffons la solution tant utilis e ce moment la concentration de 0 2 Dans l utilisation faite Necker Enfants malades c est l effet tannant de la glutarald hyde qui est essentiellement recherch Fabrication des solutions de glutarald hyde Choix d un tampon La formule qui est demand e par le service prescripteur contient de 1 HEPES Annexe 2 Or d apr s la litt rature la solution utilis e initialement par l quipe du Professeur A Carpentier contenait un tampon base de phosphates Apr s entretien avec Madame Carpentier il s av re que l HEPES n est pas indispensable pour la fabrication des solutions de glutarald hyde de sorte que l quipe de chirurgie cardiaque de l h pital Broussais est revenue la formule initiale mise au point en 1969 La formule contenant de l HEPES a t mise au point au cours des ann es 1970 dans le but d tre utilis e sur des cultures cellulaires pour tudier le m canisme d action de la glutaraldehyde sur le tissu p ricardique La formule demand e par le service de chirurgie cardiaque de l h pital pourra donc tre remplac e par la formule publi e par l quipe du Professeur A Carpentier 6 24 Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Glutarald hyde 0 62 pH 7 4 Eau ppi 800ml KH2PO anhydre 0 416 g Na HPO anhydre 2 404 g NaCl 5 3 g Glutaral
32. tilisation de I HEPES pour ces solutions ne se justifie donc absolument plus La formule fournie par le service de chirurgie cardiaque peut donc tre substitu e par une formule contenant un tampon phosphate La pharmacie de l h pital Necker Enfants malades fabriquera donc les solutions base de glutarald hyde l aide d un tampon phosphate dont les l ments sont disponibles aupr s de laboratoires pharmaceutiques le tampon phosphate tant inscrit la pharmacop e europ enne et de glutarald hyde obtenue aupr s de la coop rative pharmaceutique Le test diagnostic de la mucoviscidose par mesure de la ddp trans pith liale n cessite l utilisation de solutions tamponn es dont le tampon ne doit pas alt rer le fonctionnement des canaux ioniques que ce soit par ses propri t s pharmacologiques ou par ses propri t s physico chimiques Le tampon ne doit notamment pas p n trer dans les cellules L analyse des monographies de la pharmacop e europ enne indique qu aucune des substances tampons qui y sont inscrites ne r pond ce dernier crit re de sorte que l on est oblig d envisager l utilisation d une substance non pharmaceutique ayant subie au pr alable des contr les aptes garantir son identit sa puret et l absence d impuret s effets notoires en quantit s excessives Ces l ments font que l on doit s orienter vers l utilisation d HEPES ayant subi au pr alable des contr les Le cho
33. tion des temps ou sont not s les changements du solut de perfusion Chaque modification de la nature du solut perfus induit chez le sujet sain une variation brusque de la ddp visible sous la forme d une cloche sur le graphique alors que chez le sujet atteint de mucoviscidose ces variations sont inapparentes ou peu marqu es Ces variations sont observ es a chaque modification des conditions du milieu changement de la solution perfus e dans la sonde de Foley sauf pour le passage de la solution de Kreb s A la solution de Kreb s A suppl ment e en amiloride Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale Tableau 5 Variation de la d d p en fonction des conditions op ratoires Mucoviscidose Sujet sain Solution de Kreb s d d p 40mV d d p 20 mV Solution de Kreb s amiloride TT d d p T d d p Solution de Kreb s pauvre en chlorure amiloride Pas de variation de la d d p d d p Solution de Kreb s pauvre en chlorure amiloride Pas de variation de la d d p d d p Isuprel Strat gie de recherche d un tampon pour pr paration magistrale LE OD ONON nn O NWN on hn O DO DD 1004 1063 1122 sole B Amil amil Isuprel ringer temps sec Figure 6 Graphique obtenu chez un sujet sain T es z z Oe AO ee CO OO ce KO es AO ee CO n NON ORn NOR nn NOR NN NN OO KR un ON OM OM OU wo ON D DH OO e NN
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