guide d`utilisation
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1. Conservation l arriv e conserver le produit 20 C l abri de la lumi re jusqu la date de p remption Conservation des lames Conserver les lames hybrid es a 20 C l abri de la lumi re Remarque Ces conditions de conservation s appliquent la fois aux produits non ouverts et ouverts Le nombre de cycles de gel d gel ne doit pas d passer le nombre de tests recommand s par flacon Conserver dans le flacon d origine Les flacons conserv s dans d autres conditions peu vent ne pas offrir de performance optimale et par cons quent affecter les r sultats du test Manipulation Tous les r actifs doivent tre manipul s comme s ils taient capables de trans mettre des agents infectieux Apr s usage tout le mat riel doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur Manipuler tous les r actifs et lames contenant des fluorophores en clairage r duit afin d viter toute d t rioration du signal fluorescent Avertissements et mises en garde Lire le mode d emploi avant toute utilisation Tout transport ou conservation impropre peut d truire ou d t riorer la perfor mance du produit En cas de r ception d emballage ou de flacon endommag de d faillance du dispositif apr s utilisation conforme au mode d emploi ou de blessure de l utilisateur contacter le fabricant Tout flacon endommag doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur et auc2. TA 12 Rincer la lame en 2 changements de SSC 2X de 5 min chacun TA 13 Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer la sonde DNA FISH pendant 2 3 secondes et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH la zone cible sur la lame et la recou vrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 5 min 90 C sur une plaque chauffante temp rature contr l e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe 11 Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Ne pas laisser la lame s cher avant la fin des lavages 1 1 Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 2 Tremper la lame dans la solution SSC 2X TA et retirer la lamelle couvre objet 3 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C 4 Rincer la lame en la trempant dans de l eau distill e 5 Laisser s cher la lame l air libre l
3. Italia S r l Version 05 31 12
4. abri de la lumi re directe 6 Appliquer 20 uL de DAPI antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm Remarque sur la proc dure Selon la fixation l ge de la coupe et les conditions de pr traitement on peut apercevoir un bruit de fond vert Si le bruit de fond vert est excessif ou interf re avec l attribution de score les lames peuvent tre re lav es de mani re plus stringente Avant le relavage retirer l antifade en enlevant la lamelle couvre objet et en proc dant au lavage en deux changements de solution SSC 2X Tween 20 0 1 de 5 min chacun avec agitation TA Proc der imm diatement au relavage ne pas laisser la lame s cher La stringence peut tre accrue en ajoutant une tape de lavage de 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C Une stringence sup pl mentaire peut tre obtenue en augmentant la dur e de lavage et ou la tem p rature jusqu 65 C Accessoires pour microscope Objectifs Un objectif 10X est adapt au balayage de la zone cible Un grossissement sup rieur s av re n cessaire pour l analyse des signaux et doit avoir lieu avec un objectif immersion huile 63X ou 100X Huile d immersion L huile d immersion doit tre adapt e la microscopie en fluorescence Lampe Une lampe mercure de 100 watts avec une dur e de vie maximale de 200 heures est recommand e Remplacer la lampe avant qu elle ne d passe l
5. dans deux bains d thanol 100 de 5 min chacun TA S cher l air peut rester a TA pendant plusieurs heures Remarque sur la proc dure La lame peut tre conserv e s che TA pendant plus ieurs heures Incuber la lame dans du HCI 0 2N pendant 20 min TA 4 Rincer la lame dans un bain d eau distill e pendant 1 min TA et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA 5 Incuber la lame dans une solution de NaSCN 1M pr chauff e pendant 10 min 80 C Remarque sur la proc dure Certain types de tissus tel le tissue mammaire n ces sitent un temps d incubation plus long 30 60 minutes 6 Rincer la lame dans un bain d eau distill e et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA W Suite la page suirante Proc dure pour section FFPE 7 Mettre la lame soit dans une chambre humide ou dans un Thermobrite Couvrir la zone cible avec au moins 100 mL de pepsine 0 4 garder la lame en cours d incubation dans des conditions humides Ne pas laisser l chantillon se dess cher 8 Incuber pendant 10 min 37 C Remarque sur la proc dure Cette dur e peut devoir tre ajust e en fonction des conditions de fixation et de l ge de la coupe 9 Rincer la lame pendant 5 min dans de l eau distill e TA Rincer la lame en deux bains de SSC 2X de 5 min chacun TA Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air Incuber la lame dans du formol neutre tamponn 10 pendant 15 min
6. EGFR Cen7 DNA FISH Probe Sonde d num ration bicolore 22 007 CE Mode d emploi JE 6 Usage pr vu La sonde EGFR et Cen7 DNA FISH de Cancer Genetics Italia est con ue pour d tecter le nombre accru de copies du g ne EGFR sur 7p11 2 affect aupara vant la bande 7p12 par rapport la sonde t moin Cen7 par hybridation in situ en fluorescence FISH Fluorescence in situ hybridization sur un tissu fix au formol et inclus paraffine FFPE formalinfixed paraffin embeddedl Le g ne EGFR code une prot ine transmembranaire impliqu e dans la prolif ra tion cellulaire Un nombre accru de copies du g ne EGFR a t rapport dans le cancer pulmonaire non petites cellules NSCLC non small cell lung cancer et dans d autres carcinomes y compris le cancer colorectal celui de la t te et du cou ainsi que du sein Un nombre accru de copies EGFR est pr dictif d une r ponse des traitements anti EGFR 3 6 ITALIA EGFR ec EGFR centrom re 5 3 t lom re 7p11 495kb 7 Repr sentation sch matique de la sonde DNA FISH EGFR Cen7 L id ogramme du chromosome 7 illustre les sites d hybridation de la sonde EGFR et Cen7 DNA FISH La sonde Cen7 verte marqu e directement hybride l ADN satel lite 7p11 1 q11 La sonde EGFR rouge marqu e directement couvre la majeure partie du g ne indiqu par la barre horizontale rouge dans le sch ma ci dessus approximativement l chelle NCBI Build 36 1 Hg18 2006
7. Pepsine Lampe mercure 100 watts Bain marie 20 Tween Microcentrifugeuse Citrisolv est une marque enregistr e de Fisherbrand Pr paration des r actifs Remarque Utiliser de l eau distill e pour la pr paration de toutes les solutions m res et de toutes les solutions de travail S rie d thanol 70 85 et 100 Pr parer des dilutions vol vol d thanol 100 et d eau distill e Conserver TA HCI 0 01N acide chlorhydrique Ajouter 0 5 mL de HCI 1N 49 5 mL d eau distill e Conserver TA Pr chauffer la solution 37 C dans un bain marie avant usage Solution m re de pepsine 0 4 4 mg mL Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL 0 2N Conserver des aliquots de 500 uL 20 C Formald hyde 1 Ajouter 12 5 mL de formaline 10 4 formaldehye 37 mL de PBS 1X Ajouter 500 uL de MgCl 100X Conserver 4 C jusqu une semaine SSC 0 5X Citrate de sodium salin Tween 20 0 1 Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 974 mL d eau distill e Bien m langer en tour noyant Conserver TA PBS 1X solution saline dans un tampon phosphate M langer 100 mL de PBS 10X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver TA SSC 2X M langer 100 mL de SSC 20X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver temp rature ambiante TA SSC 2X Tween 20 0 1 Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 899 mL d eau distill e Bien m langer en tour
8. aux cellules inflammatoires aux cellules musculaires aux fibroblastes ou autres cel lules stromales Des r gions invasives discontinues peuvent tre identifi es par le pathol ogiste et celles ci peuvent toutes recevoir des scores et tre combin es dans l analyse Dans les cellules avec amplification du g ne le nombre de signaux rouges EGFR est augment par rapport au nombre de signaux verts t moins Cen7 Dans certains types de tumeurs les cellules avec forte polysomie de chromosome 7 par ex nombre accru de copies des signaux EGFR et Cen7 peuvent aussi tre compt es comme amplifi es pour l EGFR I L amplification peut aussi tre observ e comme un groupement de sig naux EGFR rouges correspondant gt 4 signaux en luminosit ff y y Recommendations and limitations Les informations tir es de l analyse FISH doivent tre interpr t s dans la totalit du contexte des ant c dents cliniques du patient Aucune d ci sion m dicale ne peut tre prise en se fondant uniquement sur les r sul tats de l essai FISH Ce produit a t optimis pour tre utilis sur des lames pr par es partir de sp cimens de tissu FFPE Le fabricant assure que ce produit r pond aux caract ristiques de performance analytique sensibilit sp cificit reproductibilit et intervalle de validit tablies sur le tissu pr vu Les cellules normales l int rieur du sp cimen doivent tre utilis es comme t
9. es 200 heures Filtres recommand s Fluorophore Excitation missio n max Visualisation et interpr tation des signaux Le signal doit tre visualis l aide d un microscope pifluorescence qui p des filtres appropri s Remarque sur la proc dure Les signaux peuvent tre diff rents plans focaux c est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des sp ci mens afin de s assurer du comptage de tous les signaux Dans la m taphase diplo de normale et dans les noyaux en interphase la sonde EGFR et Cen7 DNA FISH g n re deux signaux rouges et deux verts correspondant respectivement aux loci EGFR et Cen7 des deux chromosomes 7 normaux La d tection de tels signaux dans des cellules normales l int rieur du sp cimen est cruciale pour un essai FISH r ussi Dans certaines cellules des signaux rouges et verts adjacents peuvent se chevaucher ou fusionner pour appara tre jaunes ceci doit tre compt comme un signal rouge et un vert La troncature des noyaux en coupes peut entra ner l observation de cel lules partielles comportant moins de signaux que le nombre pr vu y Une lame color e en H amp E doit tre pr par e partir d une coupe adja cente celles utilis es pour l analyse FISH et la r gion de cancer invasif doit tre d termin e par un pathologiste qualifi Seuls les noyaux de tumeurs doivent recevoir un score ne pas donner de score
10. moin interne de l essai FISH Il incombe au laboratoire d tablir les intervalles de validit l aide de sp cimens de contr le positifs et n gatifs du tissu pr vu L utilisation de filtres aux caract ristiques spectrales autres que celles sp cifi es peut affecter n gativement la force du signal Par exemple le fluorophore rouge est visible travers un filtre orange mais les signaux apparaissent faibles Suite la page suirante Glossaire des symboles Num ro de lot Dispositif m dical de diagnostic in Cancer Genetics Italia S r l Ea Risques biologiques vitro Viale Luigi Majno 17 20122 Milano Italia www cancergeneticsitalia com support cancergeneticsitalia com e AA rK REF Num ro de catalogue Conserver l abri de la lumi re du A Attention consulter la documenta soleil tion d accompagnement ad Fabricant CE Marquage CE de conformit X Limite sup rieure de temp rature Utiliser avant le DNA FISH Probe fabriqu e dans la communant europ enne par Y Contient suffisamment pour 10 tests Cancer cena rl Bibliographie 1 Toschi L et al The Oncologist 2007 12 221 220 Bhargava R et al Modern Patholy 2005 18 1027 1033 Hirsch F et al J Clin Oncol 2008 26 3351 3357 Personeni N et al Clin Cancer Res 2008 14 18 5869 5876 Zimmermann R et al Radiation Oncology 2006 1 11 Varella Garcia M et al J Clin Pathol 2009 62 970 977 Or Vi SR 2012 Cancer Genetics
11. noyant Conserver TA MgCl 100X Chlorure de magnesium dans PBS 1X Ajouter 50 uL de MgCl2 1M a 450 uL de PBS 1X Proc dure pour section FFPE Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul un e technologiste familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis correspond des sections FFPE de 4 5 um d paisseur Les lames doivent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Remarque sur la proc dure Simultan ment aux coupes s ri es utilis es pour l analyse FISH une ou des coupet s doivent tre pr par es pour coloration l h matoxyline et l osine H amp E 1 Les coupes pour essai FISH doivent tre mont es sur des lames Plus en rob es 2 Cuire les lames sur la nuit 12 18 heures 55 C avant l hybridation Utilise sous 3 jours Pr traitement des lames r aliser sous une hotte aspiration 1 D paraffiner la lame dans 3 bains de CitriSolv de 10 min chacun TA Remarque sur la proc dure Les bocaux de CitriSolv peuvent tre utilis s deux fois Toutefois le troisi me bocal doit contenir du r actif encore inutilis 2 D shydrater la lame en l incubant
12. un essai ne doit tre r alis partir d un tel r actif Manipuler tous les r actifs avec soin et porter un quipement de protection in dividuelle appropri Leformamide la solution saline de citrate de sodium SSC Saline Sodium Citrate et le dod cyl sulfate de sodium SDS peuvent avoir des effets t ratog nes et mutag nes viter toute inhalation ingestion ou contact avec la peau Le DAPI estun irritant Consulter le Material Safety Data Sheet MSDS du produit pour les informations concernant la s curit R actif fourni Sonde DNA FISH pr te l emploi 100 uL par flacon 10 tests Un test est d fini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm Sonde tiquet e au fluorophore pour le locus EGFR rouge et au fluo rophore pour le locus centrom re 7 vert pr m lang e avec de l ADN bloquant et un tampon d hybridation formamide sulfate de dextran SSC et SDS R actifs et mat riel n cessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microtube centrifuger tanol 100 Lamelles couvre objets 0 5 mL PBS 10X 22x22 e 25x25 Micropipettes 1 200 mL HCIIN Microscope pifluores Parafilm MgCl 1M cence pH m tre NaOH 1M Pinces Lames plus NaSCN 1M Hotte aspirante Colle de caoutchouc SSC 20X Gants Plateau pour lames Formaline 10 Chambre humidifi e Thermom tre calibr DAPI et Antifade Huile d immersion 37 C to 80 C Eau distill e Incubateur Plaque chauffante
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