Pour HISTOLOGIE
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1. g Microscope optique objectifs 10x 20x en option 40x PR CAUTIONS 6 1 Utilisation diagnostique in vitro 6 2 Les tapes de nettoyage des lames n cessitant du xyl ne doivent tre mises en uvre sous une hotte aspirante agr e 6 3 Le r actif anticorps ProEx C contient de l azide de sodium NaN un produit chimique extr mement toxique l tat pur Bien que non class parmi les compos s pr sentant un danger aux concentrations du produit l azide de sodium est susceptible de r agir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour donner des azides m talliques hautement explosifs Lors de l limination rincer avec de grandes quantit s d eau pour viter l accumulation d azides m talliques dans les canalisations 6 4 Le DAB 3 3 diaminobenzidine est class parmi les produits suspect s d tre canc rig nes viter tout contact physique ou exposition prolong e ou r p t e Utiliser sous une hotte aspirante agr e 6 5 Les chantillons et tous les mat riels expos s aux chantillons doivent tre manipul s comme s ils pouvaient transmettre des infections et limin s conform ment aux pr cautions en vigueur Ne jamais pipeter les r actifs avec la bouche et viter de mettre en contact les r actifs et les chantillons avec la peau et les muqueuses Laver grande eau en cas de contact des r actifs avec des r gions sensibles 6 6 Minimiser la contamination microbienne de r actifs2. incorrect Incubation inad quate de Revoir le protocole de l anticorps primaire coloration L anticorps primaire a t Emploi de l anticorps dilu primaire conform ment aux instructions du fabricant les tapes du dosage protocole de coloration Dur es d incubation Revoir le protocole de excessives avec les coloration r actifs cl s Lames soumises un dess chement pendant le traitement post rieur au dosage Coloration de fond excessive Recommencer le protocole de coloration March 2006 TriPath Imaging Inc All rights reserved Doc No 779 06555 00 Rev C 8 27 14 BIBLIOGRAPHIE 1 Kastan M and Bartec J Cell cycle checkpoints and cancer Nature 2004 Vol32 316 323 2 Massague J G1 cell cycle control and cancer Nature 2004 Vol 432 298 432 3 Freeman A Morris LS Millis AD Stoeber K Laskey RA Williams GH and Coleman N Minichromosome Maintenance Proteins as Biological Markers of Dysplasia and Malignancy CI Cancer Research 1999 Vol 5 2121 2132 4 Ishimi Y Okayasu l Kato C Kwon H Kimura H Yamada K and Song S Enhanced expression of MCM proteins in cancer cells derived from uterine cervix Eur J Biochem 2003 270 1089 1101 5 Lei M and Tye BK Initiating DNA synthesis from recruiting to activating the MCM Complex J Cell Science 2001 Vol 114 8 1447 1454 15 GLOSSAIRE DE SYMBOLES Num ro de catalogue Utilisation diagnostique in vitro Consulter les inst
3. lame puis une lamelle est mise en place Les r sultats sont interpr t s par un professionnel exp riment l aide d un microscope optique MAT RIELS ET R ACTIFS N CESSAIRES MAIS NON FOURNIS pour la proc dure Ventana Benchmark XT a Tampon de r action 10X n de cat 950 300 2 litres Ventana Medical Systems a LCS Lamelle liquide n de cat 650 010 2 litres Ventana Medical Systems e SSC 10X n de cat 950 110 2 litres Ventana Medical Systems o EZ Prep n de cat 950 102 2 litres Ventana Medical Systems o CC1 Conditionnement des cellules n de cat 950 124 2 litres Ventana Medical Systems Kit de d tection iView DAB n de cat 760 091 Ventana Medical Systems o Kit d amplification A amp B n de cat 760 080 Ventana Medical Systems Distributeur Prep Kit avec bouton Prep Kit n de cat 786 3034 Ventana Medical Systems H matoxyline n de cat 760 2021 Ventana Medical Systems o R actif bleuissant n de cat 760 2037 Ventana Medical Systems Lames de verre SuperFrost Plus ou quivalent o Milieu de montage Acrytol ou quivalent Horloge capable de mesurer des dur es de 1 60 minutes H20 distill e thanol 95 100 a Lamelles de verre Marqueur de laboratoire g Bonbonne de 20 litres Nalgene ou quivalent S cheur de lames 2 Panier de lames avec bacs de coloration o Xyl ne ou substituts du xyl ne
4. r sultats provient souvent de diff rences de manipulations des chantillons qui s cartent des proc dures de test recommand es Pour plus d informations consulter les directives en mati re de contr le qualit du College of American Pathologists CAP Certification Program for Immunohistochemistry 10 2 Chaque cycle de coloration doit comporter un contr le tissulaire positif afin de v rifier les performances du dosage Si le contr le tissulaire positif ne pr sente pas de coloration positive les r sultats obtenus pour les autres chantillons du test doivent tre consid r s comme suspects ou invalides 10 3 Chaque cycle de coloration doit comporter un contr le tissulaire n gatif afin de v rifier la sp cificit de l anticorps primaire et de fournir une indication relative la coloration de fond Si le contr le tissulaire n gatif pr sente une coloration positive les r sultats obtenus pour les autres chantillons du test doivent tre consid r s comme suspects ou invalides 10 4 Un r actif de contr le n gatif non sp cifique peut galement tre utilis la place de l anticorps primaire afin d valuer la coloration non sp cifique ou la coloration de fond INTERPR TATION Une coloration brune mod r e intense dans le noyau des cellules signale la pr sence d une induction de la phase S aberrante Un pathologiste doit valuer les lames color es l aide d un microscope optique L interpr t
5. sur le carrousel 8 8 Charger les distributeurs de r actifs et monter le plateau des r actifs sur le carrousel 8 9 Remplir les bonbonnes de r actifs en vrac 8 10 V rifier la bonbonne du module d limination des d chets et la vider si n cessaire 8 11 S lectionner EX CUTER sur l cran de l ordinateur principal du Benchmark XT avant de commencer la coloration 8 12 Une fois le cycle termin imprimer le r sum du protocole et les rapports d ex cution des colorations 8 13 Retirer les lames de l instrument et les rincer dans de l eau savonneuse pendant 3 5 minutes ou jusqu ce que le r sidu de lamelle liquide ne soit plus visible 8 14 D shydrater les lames 8 14 1 Immerger les lames dans de l thanol 95 pendant 1 minute ou 25 reprises 8 14 2 Immerger les lames dans l alcool absolu 4 reprises de 1 minute ou 25 fois chacune 8 14 3 Nettoyer avec du xyl ne 3 reprises de 1 minute ou 25 fois chacune 8 15 Recouvrir les lames d une lamelle avec un milieu de montage non aqueux 10 11 12 13 STABILIT 9 1 Quandils sont conserv s la temp rature recommand e les flacons de r actifs non ouverts sont stables jusqu la date de p remption indiqu e sur le flacon 9 2 Une fois ouverts les r actifs sont stables pendant quatre vingt dix 90 jours s ils sont conserv s la temp rature recommand e CONTR LE QUALIT 10 1 La variabilit des
6. TRIPATH AMAGING ProEy C aberrant 5 Phase induction Pour HISTOLOGIE 005 11000 40 V7 7ml CE 1 8 C DESCRIPTION DU R ACTIF MCM2 26H6 19 MCM2 27C5 6 TOP2A SWT3D1 Classe d Ig IgG Immunog ne MCM2 et TOP2A humaines recombinantes UTILISATION PR VUE Utilisation diagnostique in vitro Utiliser dans le cadre d une coloration automatique sur le Ventana Benchmark XT l aide du syst me de d tection iView Le test immunohistochimique ProEx C est destin l valuation qualitative de l induction aberrante de la phase S sur des biopsies tissulaires fix es au formol et incluses en paraffine L interpr tation des r sultats doit tre faite par un professionnel agr en tenant compte des ant c dents du patient et des autres tests diagnostiques R SUM ET EXPLICATION Les prot ines MCM prot ines de maintenance du minichromosome et topoisom rase ll alpha TOP2A jouent un r le r gulateur important dans la r plication de l ADN eucaryote par exemple le contournement par les oncoprot ines E6 et E7du PVH des points de contr le du cycle cellulaire ce qui se traduit par un cycle d induction prolong et aberrant de la phase S Pendant l activation transcriptionnelle du cycle cellulaire aberrant les niveaux des prot ines MCM2 et TOP2A augmentent dans les cellules en mitose Il a t montr que les prot ines MCM2 et TOP2A sont surexprim es dans de nombreux et divers tissus dysplasiques et malins dont les n
7. ation des r sultats doit tre faite par un professionnel agr en tenant compte des ant c dents du patient et des autres tests diagnostiques LIMITES 12 1 La coloration immunohistochimique exige une formation sp cialis e dans le domaine de la s lection et de l application des r actifs 12 2 Ce r actif permet de r aliser 50 tests en supposant que l on applique 100 u1 de r actif par lame 12 3 Un certain nombre de cellules normales peuvent tre color es positivement vis vis de l induction d une phase S aberrante 12 4 La coloration optimale des tissus d pend de la fixation et du traitement de l chantillon 12 5 Une coloration non sp cifique ou une coloration de fond accrue peuvent survenir en raison mais se limiter des variations de la proc dure d un rin age inad quat entre les tapes du dosage et ou d un traitement inad quat des chantillons R SOLUTION DES PROBL MES Cause possible Action Absence de coloration R actifs appliqu s dans Revoir le protocole de un ordre incorrect coloration des lames de contr le positives Omission d un r actif Recommencer le protocole de coloration Faible coloration des Restauration de l antig ne V rifier les dur es lames de contr le insuffisante d incubation et les positives temp ratures du tampon de restauration de l antig ne pitope Revoir le protocole de coloration Emploi d un tampon de restauration de l antig ne
8. ciel Consulter les instructions de fonctionnement fournies par le fabricant du Ventana Benchmark XT 8 2 S lectionner les param tres du protocole suivants dans le logiciel Benchmark XT 8 2 1 Paraffine s lectionn 8 2 2 D paraffinage s lectionn 8 2 3 Conditionnement des cellules s lectionn 8 2 4 Conditionneur n 1 s lectionn 8 2 5 CC1 l ger s lectionn 8 2 6 CC1 standard s lectionn 8 2 7 CC1 tendu s lectionn 8 2 8 Temp ratures d incubation de l Ac s lectionn 8 2 9 Inc Ac 37 C s lectionn 8 2 10 Anticorps s lectionn 8 2 11 Appliquer 1 goutte de PREP KIT 100 Anticorps et incuber pendant 1 heure 8 2 12 Amplifier s lectionn 8 2 13 Colorant de contraste s lectionn 8 2 14 Appliquer 1 goutte de H matoxyline Colorant de contraste appliquer la lamelle et incuber pendant 8 minutes 8 2 15 Post colorant de contraste s lectionn 8 2 16 Appliquer 1 goutte de R actif bleuissant Post colorant de contraste appliquer la lamelle et incuber pendant 4 minutes 8 3 Enregistrer tous les r actifs utilis s au cours du dosage 8 4 D terminer le nombre de lames devant tre color es y compris les contr les 8 5 S lectionner ou cr er les tiquettes de chaque lame en vous assurant que chaque tiquette correspond un seul protocole de coloration 8 6 Appliquer l tiquette appropri e sur chaque lame 8 7 Charger les lames
9. ier que le pH est compris entre 6 5 et 7 1 7 2 2 EZ Prep 10X Solution de d paraffinage 7 2 2 1 Enregistrer un nouveau flacon de EZ Prep concentr 7 2 2 2 Ajouter un 1 flacon de EZ Prep concentr 18 litres d eau distill e Bien m langer 7 2 2 3 Remplir le flacon n 1 EZ Prep sur le Benchmark XT V rifier que le pH est compris entre 6 90 et 7 2 7 2 3 SSC 10X 7 2 3 1 Enregistrer deux 2 flacons de SSC concentr 7 2 3 2 Ajouter deux 2 flacons de SSC concentr 16 litres d eau distill e Bien m langer 7 2 3 3 Remplir le flacon n 3 SSC sur le Benchmark XT V rifier que le pH est compris entre 7 1 et 7 5 March 2006 TriPath Imaging Inc All rights reserved Doc No 779 06555 00 Rev C 7 27 7 2 4 Prep Kit remplissable 7 2 4 1 Enregistrer le bouton Prep Kit 7 2 4 2 Remplir le distributeur Prep Kit conform ment aux instructions du fabricant 7 3 Remarques concernant la proc dure de coloration 7 3 1 Ce protocole doit tre utilis dans le cadre d une coloration automatique sur le Ventana Benchmark XT l aide du syst me de d tection iViewTM 7 3 2 Ne laisser les lames s cher aucun moment au cours de la proc dure Les lames qui ont pu s cher pendant la proc dure peuvent conduire un accroissement du bruit de fond PROTOCOLE DE COLORATION AUTOMATIQUE pour le Ventana Benchmark XT 8 1 Allumer le module de coloration du Ventana Benchmark XT et lancer le logi
10. oplasies cervicales La surexpression de ces prot ines dans des cellules morphologiquement anormales d montr e par un profil de coloration nucl aire mod r e intense apr s emploi de techniques immunohistochimiques IHC est indicative de la pr sence d une induction d une phase S aberrante R ACTIFS FOURNIS Le r actif anticorps ProEx C contient des anticorps monoclonaux de souris anti MCM2 et anti TOP2A purifi s partir d un surnageant de culture tissulaire et dilu s dans une solution saline tamponn e contenant des agents de stabilisation prot iques et de l azide de sodium 0 09 PRINCIPES DE LA PROC DURE Des coupes d chantillons tissulaires fix s au formol inclus en paraffine sont r alis es d pos es sur des lames de verre et d paraffin es Les coupes d chantillons sont pr trait es l aide d un tampon afin d exposer les sites antig niques Des agents de blocages sont ajout s afin de minimiser le bruit de fond due aux peroxydases endog nes et la liaison aux prot ines non sp cifiques L chantillon est alors incub avec le r actif anticorps ProEx C L addition d un syst me chromog ne constitu d une enzyme li e un anticorps se traduit par la formation d un produit chromog ne visible localis au niveau des sites de liaison antig ne anticorps L chantillon fait alors l objet d une contre coloration par lh matoxyline un agent bleuissant est appliqu sur la
11. pour viter les colorations non sp cifiques 6 7 Des dur es d incubation des temp ratures ou des m thodes autres que celles qui sont sp cifi es peuvent conduire des r sultats erron s 6 8 Ne pas utiliser le r actif anticorps ProEx C au del de la date de p remption figurant sur le conditionnement L utilisateur doit valider les conditions si les r actifs sont conserv s dans des conditions autres que celles qui sont sp cifi es dans la notice 6 9 Porter des v tements de protection appropri s pour viter le contact avec les yeux et la peau Pour plus d informations se r f rer aux Fiches de donn es de s curit MSDS MODE D EMPLOI 7 1 Pr paration des chantillons 7 1 1 R aliser des coupes de 4 um dans le bloc de tissu et placer les coupes sur des lames de verre SuperFrost Plus 7 1 2 tiqueter les lames 7 1 3 Placer les lames dans une tuve circulation d air pendant 20 minutes Si les lames sont d j s ches d posez les sur un Histo Orienter jusqu ce que la paraffine fonde 7 2 Pr paration du r actif pour le Ventana Benchmark XT Remarque Consulter les instructions du fabricant 7 2 1 Tampon de r action 10X 7 2 1 1 Enregistrer un nouveau flacon de tampon de r action 10X concentr 7 2 1 2 Ajouter un 1 flacon de tampon de r action 10X concentr 18 litres d eau distill e Bien m langer 7 2 1 3 Remplir le flacon n 4 EZ Prep sur le Benchmark XT V rif
12. ructions d emploi Contenu 7 ml Attention consulter le manuel d accompagnement Respecter la temp rature d entreposage P lt HEA LOT Code de lot 2 Utiliser avant AAAA MM JJ ou AAAA MM il Fabricant INFORMATION TECHNIQUE Aux tats Unis appeler le service technique TriPath frais vir s 1 866 874 7284 TRIPATH AMAGING TriPath Imaging Inc al 780 Plantation Drive Burlington NC 27215 USA 800 426 2176 D velopp avec la technologie de Millennium Pharmaceuticals Inc INN MILLENNIUM MA et MILLENNIUM sont des marques commerciales de Millennium Pharmaceuticals Inc Millennium Pharmaceuticals Inc 40 Landsdowne Street Cambridge MA 02139 USA www millennium com TriPath Imaging est une marque commerciale de TriPath Imaging Inc ProEx est un produit et une marque commerciale de TriPath Imaging Inc March 2006 TriPath Imaging Inc All rights reserved Doc No 779 06555 00 Rev C 9 27
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