Culture cellulaire
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1. BIOTI MAR ns Biotechnalogical valorisation of marine products and by products Utilisation des cultures cellulaires pour valuer la cytotoxicit et l activit anti tumorale de mol cules ou d extraits 08 Juillet 2011 La Rochelle C eine Ingrid Fruitier Arnaudin ifruitie univ tr fr M ENS eee Ya Par des tests de biologie cellulaire mesurant les effets sur n croissance de EINIGE tumorales ou saines c INVESTING IN OUR COMMON FUTURE Co financed with the support of the European Union ERDF Atlantic Area Programme MARNE ENVTIELIMENT amp RENEWABLE ENSRLAES AMBENTE MARINO Y ENERGIAS RE NONVAHLTS ENVIRONNEMENT MARITIME ET ENERDES RENOLIVEL AFS AMBIENTE MARTTIMID E ENERCIAS RENCIVAVES Sommaire BIOTECMAR Culture cellulaire d finition utilit Le criblage biologique d extraits mode d emploi Avec quels quipements Avec quelle proc dure Avec quels chantillons Extraits bruts mol cules purifi es Exemple de criblage d extraits marins ATLANTIC AREA Culture cellulaire definitions BIOTECMAR D finition Technique de labo pour faire vivre des cellules in vitro Le but est de multiplier des cellules ou de les maintenir vivantes pour les utiliser 2 types de cultures cellulaires Lign es immortelles ou Cultures primaires partir d organes ou tissus En suspension ou en adh sion ATLANT2. parsa mise en culture Et son contact avec les extraits tester Celluloth que de plusieurs lign es tumorales cellules humaines obtenues partir de tumeurs sein Prostate Glioblastome Foie Poumons MCF7 PC3 U8 HuH7 H460 MCF7 AZ U251 A549 MDA MB231 e Evaluation des propri t s cytotoxiques des mol cules ou extraits p s a programme Investing in ommun futur Evaluation des effets des mol cules ou extraits sur la croissance ra cellulaire ENS e Evaluation des propri t s cytotoxiques des mol cules ou extraits Ces tests permettent de d terminer les doses cytotoxiques des mol cules extraits DL50 c est dire les concentrations tol rables pour les cellules Techniques utilis es pour le criblage d extraits ou de mol cules SUCCESSION ETAPES eet A498 Incubation des extraits dose d pendante 48h 7 Ajout du r actif MTT sese XSolubilisation des cristaux pe s 1600 Er Produit bleu violet dosable 7 y i e 540nm 4mm Lecture BifSorbent J gfeur pig extrait capable de r duire de 50 la pop cellulaire Ajout d un sel de t trazolium MTT r duit par les cellules vivantes deshydrog nases mitochondriales des cellules vivantes Dans l exp rience de cytotoxicite 13 doses pour un m me extrait ont t test es sur 3 lign es diff rentes pour le calcul de la DL50 TIT Lign e 1 Lign e 2 Lign e 3
3. 3 mises en culture 1 2 semaines pour obtenir la confluence D collement et ensemencement des microplaques une 1 2 journ e 24h d adh rence Incubation avec chantillons apres les avoir dilu une 1 2 journ e 48h pour r sultat Soit environ 3 semaines d exp riences pour obtenir les valeurs de DL50 pour un extrait o Evaluation des effets des mol cules ou extraits sur la croissance cellulaire Ces tests permettent de mesurer si les mol cules extraits stimulent ou inhibent la croissance des cellules Ld bel Cellules tumorales ou saines Comptage cellulaire 3 Ensemencement 96 puits 24h adh rence a 24h D48h m 72h b e o MCF7 Viability inhibition J gt D o So N o o i Incubation des extraits dose d pendante 24h48h72h OS Ajout du r actif MTT U87 viability inhibition 0J Protamex Trypsin Neutrase Esperase NS37005 Savinase Alcalase 660004 D 24h o 48h Ei 72h Solubilisation des cristaux rt 10 Fig 3 Effect of gelatin hydrolysates on the viability of cancer cells for 24 48 and 72 h in cell culture medium containing a concentration of 1 mg mL of hydrolysate MCF 7 cell line wa i oq SS EAE x 1 A U87 cell line B Different letters a b c within the same time period indicate significant differences p lt 0 05 Different letters x y z within the same hydrolysate indicate significant differen
4. IC AREA BIOTECMAR Culture cellulaire definitions Cellules en lign es Dont les cellules canc reuses transform es par un virus qui les rend immortelles nombre de passages illimit s donnant une lign e continue sont les plus utilis es en culture cellulaire ATLANTIC AREA BIOTECMAR Culture cellulaire utilit gt Faire le lien entre l exp rimentation l animal et les essais de phase clinique Le but est de chercher reproduire en culture les caract ristiques principales d un tissu gt Utilit particuli re des mod les in vitro pour le criblage biologique d extraits bruts ou purifi s ATLANTIC AREA Avantages et inconv nients des _ lign es et des cultures primaires Cultures Prolif ration Diff renciation Utilisation Dur e de vie de quelques semaines au maximum Lign es multiples ensemencements d finition des passages Prolif ration Ensemencement Diff renciation ua Utilisation l Trypsination Cong lation N2 Ou r cup ration par grattage o of the European Union ERDF Le criblage biologique d extraits 1ode d emploi Ali Mise en place de tests cellulaires in vitro Sur des mod les cellulaires tumoraux sp cifiques d un organe donn 1 Evaluation des propri t s cytotoxiques des mol cules extraits D termination des doses tol rables pour les cellules DL10 DL50 2 Eval
5. ces p lt 0 05 on ore bleu violet dosable inhibition de croissance pour un extrait donne Quels echantillons Extraits bruts d origine marine et ou terrestre animale v g tale Hydrolysats bruts de prot ines pour l tude des peptides Hydrolysats bruts de polysaccharides pour l tude des oligosaccharides Fractions enrichies en compos s d int r t Besoin d avoir la carte d identit mol culaire de l extrait Solvant d extraction pH Facteur de concentration Teneur en prot ines sucres lipides AN co financed wth the suppor Application de techniques biochimiques de caract risation des extraits OM Exemple d une demarche Food Chemistry 126 2011 1006 1012 Contents lists available at ScienceDirect aoa Food Chemistry journal homepage www elsevier com locate foodchem Anti proliferative and potential anti diabetic effects of phenolic rich extracts from edible marine algae Felix Nwosu Jennifer Morris Victoria A Lund Derek Stewart Heather A Ross Gordon J McDougall Plant Products and Food Quality Programme Scottish Crop Research Institute Invergowrie Dundee DD2 5DA Scotland UK E Extraction des compos s Etapes chimiques Qualification des chantillons Contenu total en compos s ph noliques Caract risation LC MS des compos s de l extrait Fractionnement par exclusion LA Etapes biologiques gt Tests biologiques de viabi
6. ernational journal homepage www elsevier com locate foodres Squid gelatin hydrolysates with antihypertensive anticancer and antioxidant activity A Alem n E P rez Sant n S Bordenave Juchereau I Arnaudin M C G mez Guill n P Montero Instituto de Ciencia y Tecnologia de Alimentos y Nutrici n ICTAN CSIC formerly Instituto del Fr o C Jos Antonio Novais 10 28040 Madrid Spain gt Laboratoire Littoral ENvironnement et Societ s LIENSS Universit de La Rochelle CNR UMR 6250 UFR Sciences Avenue M Crepeau 17042 La Rochelle France Hydrolysats bruts fractionn s de g latines marines ont t testes pour plusieurs activites biologique anti hypertensives anti oxydantes et anti canc reuses The Alcalase hydrolysate was the most potent angiotensin converting enzyme ACE inhibitor IC50 0 34 mg mL the Esperase hydrolysate showed the highest cytotoxic effect on cancer cells with IC50 values of 0 13 and 0 10 mg mL for MCF 7 human breast carcinoma and U87 glioma cell lines respectively BIOTECMAR Co financed with the support of the European Union ERDF Atlantic Area Programme Investing in our commun future x ATLANTIC AREA Vous pouvez gt Obtenir la signature biologique d actifs sur des mod les cellulaires simples gt Identifier et caract riser des mol cules bioactives D termination des doses tol rables pour les cellules DL10 DL50 D
7. lit cellulaire Cellules tumorales de colon Caco 2 gt Tests enzymatiques varies co financed with the suppor of the European Union Amylase lipase Atlantic Area Programme Investing in our commun future ATLANTIC AREA European Union European Regional Develenment Find MS spectra of the Ascophyllum Sephadex LH 20 bound fraction ESI Full ms 80 0 2000 0 100 amis a FSD 1 31e6 90 OH 80 HO O 1117 1 70 495 1 371 1 1365 0 0 OH 745 1 rs OH 247 1 353 2 477 2 869 1 2202 1489 1 619 1 20 601 2 867 1 973 2 1613 0 5 1 1737 0 1861 1 1800 2000 110 100 Control co 8386888888 0 10 20 30 40 50 Phenol content ug ml Co financed with the support of the European Union ERDF Atlantic Area Programme Fig 1 Effect of seaweed extracts on proliferation of cultured colon cancer Caco 2 cells filled squares Alaria open squares Ascophyllum and closed triangles Palmaria Investing in our commun future extracts The proliferation values are averages of values obtained from quadruplicate assays on the microtitre system carried out on three separate days i e n 12 standard error SE Values for A aria at lower concentrations marked with asterisks are average values from one experiment standard error n 4 ATLANTIC AREA European Union Food Research International 44 2011 1044 1051 lt L Contents lists available at ScienceDirect Food Research Int
8. termination des d inhibition de croissance A quel co t Sous forme de contrats de prestation co t sera fonction du nombre et de la nature des chantillons cribler ATLANTIC AREA Co financed with the suppo pean Union ER rt ERDF
9. uation des effets des mol cules extraits sur la croissance cellulaire Cofanced vith the suppor Tests de prolif ration cellulaire Teen aie D termination des d inhibition de croissance I ATLANTIC AREA Avec quels equipements Sur une plateforme de culture cellulaire Qui nous permet de cribler des banques de compos s chimiques ou d extraits naturels Nous disposons d un laboratoire de niveau L2 de confinement associ aux quipements suivants Un incubateur cellules 2 postes de s curit microbiologique 1 autoclave 1 salle de pr paration des milieux et de mesure des activit s 2 robots pipeteurs diluteurs Microscopes contraste de phase Lecteurs de microplaque fluorescence absorbance Et d une expertise dans la mise en place de divers tests biologiques utilis s dans la recherche de mol cules bioactives et de tests d interaction Lib ration de facteurs solubles survie cell toxicit Co financed with the support of the European Union ERDF Atlantic Area Programme Investing in our commun future N ATLANTIC AREA pe European Union Eur n Regional Devel ent Fund opean Reg dom Co financed with the support of the European Union ERDF Atlantic Area Programme Investing in our commun future ATLANTIC AREA European Union European Regional Nevelonmen nd Avec quelle procedure xis Par le choix d un modele cellulaire adapt aux applications
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