Lettre à la rédaction
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1. 1450 Microbeta TRI LUX en coup par minute Une droite de r gression trac e par un programme partir de ces valeurs permet de d terminer la CI50 de chaque produit sur les deux souches pour chaque type de s rum Le s rum humain r f rentiel ajout au RPMI 1640 de lavage permis d obtenir des maturations de trophozo tes de P falciparum en schizontes sup rieur 20 taux de maturation r f rentiel pour valider la culture in vitro et ce quelque soit la souche plasmodiale Cette maturation est de 83 pour FCB1 75 pour PFB et 90 pour K1 Lorsque le s rum n est pas d compl ment SND essai le taux de maturation varie de 77 pour FCB1 70 pour PFB et de 80 pour K1 Les r sultats obtenus dans les tests de chimiosensibilit in vitro des souches dans un milieu contenant du s rum non d com pl ment avoisinent ceux obtenus avec le s rum de r f rence t lt 2 776 Les CL moyenne de la pyrim thamine sont respecti vement 253 60 52 75 48 94 1 34 et 4876 8 562 57 nM pour les souches FCB1 PFB et K1 sur SR Ces CI moyennes taient de 230 58 29 69 48 29 0 04 et 4877 216 37 nM sur SND tableau 1 A analyse des r sultats obtenus avec le SND 77 pour FCB1 70 pour PFB et 80 pour K1 il ressort que le s rum non d compl ment ne pr sente pas de risque d inhibition de la matu ration des plasmodies en culture in vitro Il permet d obtenir des Tableau 1 Sensibilit in vitro la py2. 9 Le s rum humain ajout est soit d compl ment et a servi de r f rence SR soit non d compl ment SND La d compl mentation se fait dans un bain marie 50 C pendant au moins 45 minutes 3 suivit d une st rilisation sur filtre millipore Ainsi deux tubes contenant le m me s rum dont le pre mier est d compl ment et le deuxi me non d compl ment SND ont t pr par s pour r aliser les tests de maturation in vitro dans les m mes conditions La v rification de la maturation est faite apr s 42 heures d incubation par le comptage du nombre de schizontes pour 200 parasites asexu s apr s lecture des gouttes paisses r alis es partir des cultures en absence d antipaludique La deuxi me partie de ce travail a t consacr e au test de chimiosensibilit la pyrim thamine en utilisant le SR parall le ment au SND pour v rifier la sensibilit des souches la pyrim thamine C est la variante isotopique du microtest OMS qui a t uti lis e dans ce travail 2 Elle mesure la capacit de doses croissantes d un antipaludique inhiber la croissance de Plasmodium dans un milieu de culture RPMI contenant du s rum humain Apr s 42 heures d incubation l ADN est recueilli apr s lavage sur un papier de fibre de verre l aide d un collecteur cellulaire puis la quan tit d hypoxanthine incorpor e par les parasites est mesur e par un compteur scintillation liquide WALLAC
3. antig ne HRP2 Histidine Rich Protein 2 qui est une glycoprot ine avec le galac tose comme sucre La reconnaissance de cette prot ine par les anti corps antiplasmodiaux permet de former un complexe qui exerce une action destructrice sur le Plasmodium l int rieur du globule rouge La s rie de lavage trois fois entreprise suivie de centrifu gations puis de l limination de la couche leuco plaquettaire avant la mise en culture des parasites a pour but d liminer les prot ines HRP2 pr sentes la surface des h maties parasit es et n cessaires la fixation des anticorps et la formation du complexe anticorps anti HRP2 A la fin de ce lavage nous obtenons des globules rouges d pourvus ou faiblement pourvus de prot ines HRP2 d s lors le Plasmodium peut subir une maturation par division mitotique de son noyau et atteindre le stade schizontes stade plusieurs noyaux Ces r sultats sont en accord avec les tests de Djaman qui a obtenu des r sultats similaires avec des isolats de la nature et une m me sensibilit avec la chloroquine 11 Dans ces conditions il est possible avec le SND de r ali ser un test de chimiosensibilit qui permet de mesurer la capacit de concentrations croissantes d un antipaludique inhiber la for mation des schizontes Il a t possible de r aliser les cultures in vitro de P falci parum en utilisant un SND Le paludisme tant une maladie infec tieuse qui touche parti
4. la possibilit de mesurer l efficacit d un antipaludique sans que n in terviennent les facteurs d interf rences dans la multiplication des parasites telle que l immunit de l h te 2 La culture de Plasmodium falciparum n cessite un milieu de culture le RPMI 1640 Roosvelt Park Medium Institute dont l efficacit est li e l addition de s rum humain soit d pourvu d an ticorps antiplasmodiaux soit d compl ment lorsque le s rum pro vient de sujet vivant en zone d end mie palustre 3 4 En effet la pr sence d anticorps antiplasmodiaux tout comme les leucocytes dans le sang ajoute ses effets schizonticides ceux du m dicament tudi in vitro La croissance des plasmodies est alors impossible par suite d inhibition des jeunes trophozo tes 5 Si le s rum d pourvu d anticorps est difficilement accessi ble cause de son co t lev le deuxi me type de s rum d com pl ment n cessite un travail suppl mentaire de d compl menta tion et de st rilisation sur filtre millipore L objectif de ce travail est d valuer l efficacit du s rum humain non d compl ment dans la culture in vitro de souches de P falciparum Trois souches de Plasmodium falciparum PFB et FCB1 souches r sistantes la chloroquine et sensible la pyrim thamine et K1 souche r sistante la chloroquine et la pyrim thamine ainsi que des globules rouges sains du groupe 0 ont servi de mat riels biologiques Ces h mat
5. Influence de la nature du s rum sur la r alisation de test de chimiosensibilit in vitro de Plasmodium falciparum Effect of serum on the outcome of in vitro testing of the chemosensitivity of Plasmodium falciparum ABSTRACT Plasmodium falciparum the parasite responsible for poten tially fatal malaria is a major cause of morbidity and of mortality in tropi cal countries In vitro culture of Plasmodium remains indispensable for iden tification of phenotype and surveillance of the efficacy of antimalarial drugs Culture of Plasmodium falciparum requires the use of RPMI 1640 medium the efficacy of which depends on addition of human serum Culture with medium containing either reference human serum of RS or serum contai ning Plasmodium antibodies SND provides a plasmodial maturation rate exceeding 20 lower threshold of validity according to WHO Comparison of these two culture supplements for in vitro testing of the che mosensitivity of Plasmodium strains to pyrimethamine showed no difference in IC50 lt 2000 nM for sensitive strains FCB1 and PFB and gt 2000 nM for resistant strains K1 KEY WORDS Plasmodium antibodies Plasmodium strains Human serum p la lutte contre le paludisme l tude in vitro permet d va luer la sensibilit intrins que des parasites aux antipaludiques et de caract riser au plan pid miologique la nature des isolats de Plasmodium circulant dans une zone donn e 1 Cette tude donne
6. alciparum sur milieu contenant du s rum humain non d compl ment Rev Iv Sci Tech 2002 3 119 26 12 O Neil MJ Bray DH Boardman P Phillipson JD Warhurst DC Peters W et al Plants as sources of antimalarial drugs in vitro antimalarial activities of some quas sinoids Antimicrob Agents Chemother 1986 30 101 4 O 1 w Phillipson JD O Neil MJ Novel antimalarial drug from plants Parasitology Today 1986 2 355 8 eocoocoooocoococooooooooooeoooooooooooooooooooooooooooooooo M decine Tropicale 2010 70 5 6 EJ
7. culi rement l Afrique subsaharienne 4 luti lisation SND additionn au RPMI est de permettre aux laboratoires du sud avec les moyens dont ils disposent de r aliser une surveil lance des souches de P falciparum circulant dans une zone donn e Il est galement possible de mesurer la sensibilit de ces souches par rapport aux antipaludiques usuels et permettre le criblage sys t matique de nouvelles substances antipaludiques comme celles issues de la pharmacop e traditionnelle africaine 12 13 Kipre GR Guede Guina F Outtara L Grellier P Djaman AJ 1 Laboratoire de Pharmacodynamie biochimique UFR Biosciences Universit de Cocody Abidjan 2 Laboratoire de biochimie Institut Pasteur de C te d Ivoire 3 USM 0504 Biologie fonctionnelle des protozoa res EA 3335 D partement R gulation D veloppement Diversit Mol culaire Mus um National d Histoire Naturelle e Correspondance kip_rolland yahoo fr e Article re u le 17 11 2008 d finitivement accept le 26 07 2010 en Guiguemde TR Gbary AR Coulibaly SO Ouedraogo JB Comment r aliser et inter pr ter les r sultats d une preuve de chimior sistance de Plasmodium falciparum chez les sujets malades en zone tropicale Sante 1996 6 187 91 N Rieckmann KH L pez Antu amo FJ Chloroquine resistance of Plasmodium fal ciprum in Brazil detected by a simple in vitro method Bull World Health Organ 1971 45 157 67 Schlich
8. ies saines ont servi pour la dilution du sang parasit lorsque la densit parasitaire tait sup rieure 8 000 para sites asexu s par microlitre de sang Le RPMI 1640 contenant de l HEPES 25 mM et du bicar bonate de sodium NaHCO3 25 mM a t utilis comme milieu de culture pour les souches de P falciparum L HEPES et le NaHCO3 jouent un r le de double tampon et maintiennent le milieu de culture un pH compris entre 7 2 et 7 4 6 A ce milieu de cul ture il est ajout 10 de s rum humain soit d compl ment soit non d compl ment EJ M decine Tropicale 2010 70 5 6 Les souches PFB FCB1 et K1 conserv es dans l azote liquide sont d congel es et maintenues en culture en absence d an tipaludique pendant quelques jours afin d obtenir une bonne den sit parasitaire Avant la culture en pr sence d antipaludique on r a lise une synchronisation de la culture par un traitement du sang parasit par du sorbitol 5 afin d obtenir pour les tests des para sites au stade de jeunes parasites ring uniquement 7 Le sang est ensuite dilu si n cessaire par des globules rouges non parasi t s pr alablement lav s Dans la premi re partie du travail les souches sont main tenues en culture dans le RPS RPMI appauvri en acide folique et contenant 10 de s rum humain dans une tuve r gl e 37 C en pr sence de gaz carbonique et 95 d humidit pendant 42 heures dans une jarre bougie 8
9. rim thamine des souches de P falciparum selon le s rum ajout au milieu de culture RPMI 1640 CI en nM de la pyrim thamine n 3 S rum d compl ment S rum non d compl ment Test de student SR SND 5 FCBI 253 31 52 75 230 58 29 69 0 043 PFB 48 94 1 34 48 29 0 04 0 002 K1 4876 8 52 57 4804 75 216 37 0 001 n est le nombre de tests r alis s r sultats aussi satisfaisants que le SR sugg r et utilis jusqu alors au cours de l valuation in vitro de la chimiosensibilit de P falci parum Le taux r f rentiel de croissance des jeunes trophozo tes en schizontes indiqu par l OMS pour valider un test de chimiosen sibilit et d terminer ensuite l activit antiplasmodiale d une subs tance est de 20 3 L int r t de cette tude tait d obtenir au moins 20 de schizontes dans les cultures sans antipaludique et sans hypoxanthine qui nous ont servi de t moins afin de lancer nos tests isotopiques et de d terminer la CI des souches vis vis de la pyrim thamine sur milieu contenant du SND En effet si certains auteurs ont d montr le r le d termi nant des anticorps antiplasmodiaux dans l immunit contre les formes sanguines asexu es de P falciparum 5 de nombreux tra vaux ont tent de d terminer le mode d action de ces anticorps 10 Il a t mis en vidence la surface des globules rouges parasit s par P falciparum un antig ne sp cifique appel
10. therle M Wahlgren M Perlmann H Scherl A Methods in Malaria Research Third Ed Available from Malaria Research and Reference Resource Center MR4 Manassas Virginia USA 2000 77 p WHO Paludisme Aide m moire N 94 r vis Octobre 1998 6 p y v p Danis M Mouchet J La r ponse immune de l h te et l adaptation du parasite et chi mior sistance des Plasmodiums in Paludisme Marketing Ellipses ed 1991 240 p 6 WHO Mode d emploi du n cessaire d preuve Microtest pour l valuation de la r ponse de Plasmodium falciparum la chloroquine et la m floquine in vitro OMS Gen ve MAP 84 2 1984 9 p Lambros C Vanderberg JP Synchronization of Plasmodium falciparum erythro cytic stages in culture J Parasitol 1979 65 418 20 1 00 Le Bras J Deloron P in vitro study of drug sensitivity of Plasmodium falciparum evaluation of a new semi micro test Am J Trop Med Hyg 1983 32 447 51 Le Bras J Deloron P Ricour A Andrieu B Savel J Coulaud JP Plasmodium fal ciparum drug sensitivity in vitro of isolates before and after adaptation to conti nuous culture Exp Parasitol 1983 56 9 14 10 Bruce Chwatt LJ Black RH Canfield GJ Clyde DF Peters W Wernsdorfer WH R le de l immunit dans la chimioth rapie du paludisme in chimioth rapie du palu disme 2 dition OMS ed Gen ve 1984 274 p 11 Djaman JA Coulibaly PA Gu d Guina F Culture in vitro d isolats de Plasmodium f
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