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Mercodia Oxidized LDL ELISA

1. tre soumis un mme des m langes de concentration chantillions et les r sultats doivent tre report s sur un graphique journalier C est une bonne pratique pour un laboratoire d enregistrer les donn es suivantes pour chaque dosage num ro de lot du kit dates de reconstitution des composan CALCUL Calcul p Pour calcu s valeurs OD du blanc des Calibrators et des contr les DES RESULTATS ar ordinateur er la concentration en LDL oxyd es r duisez les donn es d absorbance des Calibrators sans Calibrator 0 compar es la concentration en appliquant une quation de r gression de la spline cubique Multipliez la concentration des chantillons par le facteur de dilution par exemple x 6561 Calcul manuel 1 Placez les points correspondant aux valeurs d absorbance obtenues pour les Calibrators sans Calibrator 0 en fonction de la concentration de LDL oxyd es sur du papier pour graphi ques lin logarithmiques et tracez la courbe d talonnage 2 Lisez la 3 Multipl concentration des Controls et chantillons partir de cette courbe iez la concentration des Controls et des chantillons par le facteur de dilution par exemple x 6561 Puits Identit Ae Conc mU I un 1A B Calibrator 0 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 1E F Calibrator 2 0 369 1G H Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34
2. 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 Q2 50 59 3 09 5 56 5 147 34 Q3 60 69 3 09 5 56 8 147 5 4 Q4 70 117 3 09 5 56 24 47 16 3 CARACTERISTICAS DEL RENDIMIENTO Limite de detecci n El limite de detecci n es 1 mU I calculado como tres desviaciones est ndar por encima del Calibrator 0 Recuperaci n La recuperaci n a la adici n es del 85 107 media 95 Precisi n Cada muestra se analiz 3 muestra en 3 8 replicados en 20 ocasiones diferentes Muestra Valor siguientes Coeficiente de variaci n mU I intra inter total ensayo ensayo ensayo 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 7 3 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 74 Diluci ns Muestra Diluci n Valor siguientes Siguientes mU l Esperados Assay 1 Assay 2 Muestra 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Muestra 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Muestra 3 1 3321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 1 8 0 1 05 1 00 Muestra 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Muestra 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Media siguientes esperados valor 1 03 rango 0 94 1 13 52 Calibraci n Hasta el momento no existe resferencia internacional El ensayo de Mercodia Oxidized LDL ELISA es calibrado en unidades relativas y arbitrarias contra una preparaci n de referencia manofacturada por nosotros mismos GARANT A Los datos de rendimiento presentados aqu se obt
3. H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34 12 Concentration indicated on vial label Result multiplied by dilution factor x 6561 Example of calibrator curve A typical calibrator curve is shown here Do not use this curve to determine actual assay results 3 1 10 100 muli LIMITATIONS OF THE PROCEDURE As With all diagnostic tests a definitive diagnosis should not be based on the results of a single test but should be made by the physician after all clinical findings have been evaluated Grossly lipemic icteric or hemolyzed samples do not interfere in the assay EXPECTED VALUES Good practice dictates that each laboratory establishes its own expected range of values The following results may serve as a guide until the laboratory has gathered sufficient data of its own The following results were obtained from 149 ambulatory randomly selected individuals in the Stockholm area Sweden Distribution of Oxidized LDL 6 00 Frequency 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 100 75 Oxidized LDL U L 50 25 0 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 11 The following results were obtained from 149 ambulatory randomly selected individuals in the Stockholm area Sweden Mean Median Range OxLDL U I 61 59 26 117 Chol HDL ratio 4 10 3 90 1 68 7 89 Arbitrary units See CALIBRATION Mea
4. Lavare come descritto sopra Aggiungere 200 pl Substrate TMB Mettere in incubatrice per 15 minuti a temperatura ambiente Aggiungere 50 pl di Stop Solution ad ogni pozzetto Mettere la piastra in uno shaker per approssimativamente per 5 secondi per garantire lamiscelazione Leggere l assorbivit a 450 nm e calcolare i risultati Leggere entro 30 minuti Nota Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate pipette distinte 60 CONTROLLO DI QUALITA INTERNO I controlli commerciali tale e o il siero interno proveniente da diversi donatori con basse inter medie e alte concentrazione di C peptide dovrebbero essere analizzate periodicamente come se fossero esterne e i risultati tracciati di giorno in giorno E buona norma di un laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi un certo numero di kit una ricostituzione dei dati e dei componenti del kit i valori di OD per il modulo Calibrators e controlli IL CALCOLO DEI RISULTATI Calcolo computerizzato La riduzione dei dati computerizzati dell assorbenza per le Calibrator senza Calibrator 0 verso la concentrazione usando un regressione cubica flessibile potrebbe essere effettuata per ottenere la concentrazione di LDL Ossidato Moltiplicare la concentrazione dei campioni con un fattore di diluizione e g x 6561 Il Calcolo manuale 1 Tracciare i valori di assorbenza ottenuti per le Calibrator senza Calibrator 0 contro la co
5. The performance data presented here was obtained using the procedure indicated Any change or modification in the procedure not recommended by Mercodia AB may affect the results in which event Mercodia AB disclaims all warranties expressed implied or statutory including the implied warranty of merchantability and fitness for use Mercodia AB and its authorized distributors in such event shall not be liable for damages indirect or consequential 14 ZIELSETZUNG Der Mercodia Oxidized LDL ELISA Kit dient zur quantitativen in vitro Messung oxidierter low density lipoproteins oxidierter LDL in humanem Serum oder Plasma Lipoproteinmessungen werden in der Diagnose und Behandlung von Fettstoffwechselst rungen wie Diabetes mellitus Arteriosklerose und verschiedenen Leber und Nierenerkrankungen eingesetzt ZUSAMMENFASSUNG UND ERKL RUNG DES TESTES Die oxidative Umwandlung von low density lipoproteins LDL zu oxidierten low density lipopro teins oxidierte LDL gilt heute als eine Hauptursache f r den biologischen Prozess welcher die Entwicklung der arteriosklerotischen Sch digung dem fettstoffwechselbedingten Schlaganfall 1 5 initiiert und beschleunigt Experimentelle Untersuchungen zeigten dass k rpereigenes LDL atherogen wird wenn es zu oxidiertem LDL umgewandelt wird und dass oxidiertes LDL st rker atherogen ist als k rperei genes LDL 1 5 Oxidiertes LDL befindet sich in Makrophagen die sich aus Monozyten gebildet habe
6. e sur l tiquette Ajoutez 1000 ul Stockage apr s reconstitution 2 8 C pour 1 semaine d eau redistill e Pour le stockage et la reconstitution des Controls au del d une par fiole semaine conservez les 20 C Enzyme Conjugate 11X 1 fiole 1 2 ml A pr parer Peroxidase conjug monoclonal murin anti apoB voir ci dessous Enzyme Conjugate Buffer 1 fiole 12 ml Pr te l emploi Code couleur bleu Assay Buffer 1 fiole 12 ml Pr te l emploi Code couleur rouge Sample Buffer 4X 1 fiole 50 ml A diluer avec 150 Code couleur jaune ml d eau destill e Remarque Un pr cipit peut se former aux temp ratures pour pr parer la comprises entre 2 et 8 C Placez Sample Buffer 4X temp rature solution de sample ambiante jusqu ce que sa temp rature soit gale celle de la buffer 1X pi ce Secouez le jusqu ce que le pr cipit soit dissous Stockage apr s dilution 2 8 C pour 4 semaines Wash Buffer 21X 1 fiole 50 ml Diluez avec 1000 ml Stockage apr s dilution 2 8 C pour 4 semaines d eau distill e pour pr parer la solution de wash buffer 1X Substrate TMB 1 fiole 22 ml Pr te l emploi Solution incolore Remarque Cette solution est sensible la lumi re Stop Solution 1 fiole 7 ml Pr te l emploi 0 5 M H 50 31 sie5ueJJ Pr paration la solution d Enzyme Conjugate 1X Pr parez le volume de la solution d Enzyme Conjugate 1X n cessaire en diluant 11X l Enzyme Conjugate 1 10 dans l E
7. fueron los primeros en demostrar de forma clara que los pacientes con enfermedad coronaria ten an niveles plasm ticos significativamente elevados de LDL oxida da y que estos niveles circulantes de LDL oxidada eran muy similares en pacientes con enferme dad coronaria estable y en pacientes con s ndromes coronarios agudos Hallaron que los niveles de LDL oxidada eran significativamente mayores en pacientes con angina estable angina ines table e infarto agudo de miocardio en comparaci n con sujetos de control de la misma edad y supuestamente sanos En las publicaciones de Holvoet 9 13 los niveles plasm ticos de LDL oxidada se midieron con un ELISA competitivo utilizando un anticuerpo monoclonal murino espec fico el mAb 4E6 Debe observarse que el kit ELISA para LDL oxidada de Mercodia utiliza el mismo anticuerpo monoclonal murino espec fico mAb 4E6 que Holvoet 9 10 utiliz en sus ensayos Sin embargo el kit de ensayo de Mercodia es un ELISA de captura tambi n conocido como ELISA sandwich en el que los pocillos de las placas de microtitulaci n est n recubiertos con anticuerpo de captura mAb 4E6 Varios estudios han sido publicados por investigadores cl nicos que han utilizado kits ELISA para LDL oxidada de Mercodia Hulthe y Fagerberg 14 demostraron la relaci n entre la aterosclerosis subcl nica y los niveles circulantes de LDL oxidada al mostrar que los niveles de LDL oxidada estaban relacionados con el grosor de la int
8. re obtenir une dilution finale de 1 6561 selon les crit res suivants 1 Echantillon patient 25 yl Solution de Sample Buffer 1X 2000 ul Boucher les tubes les retourner trois fois puis m langer le contenu dans un vortex Dilution 1 81 2 Dilution de l chantillon 1 81 25 yl Solution de Sample Buffer 1X 2000 ul Boucher les tubes les retourner trois fois puis m langer le contenu dans un vortex Dilution 1 6561 Il est ESSENTIEL de v rifier que chaque tape de dilution donne lieu un m lange correct avant de passer l tape suivante Cette proc dure aboutit une dilution des chantillons de 1 6561 32 PROC DURE DE TEST Tous les r actifs et chantillons doivent tre mis temp rature ambiante avant utilisation Pr parez une courbe d talonnage pour chaque dosage 9 10 11 12 13 Pr parez solution d Enzyme Conj Buffer 1X et d echantillons Pr parez un et les chan nombre suffisant de puits de Coated Plate pour loger les Calibrators Controls tillons Pipetez 25 ul de Calibrators Controls et d chantillons dilu es dans les puits appropri s Ajoutez 100 pl de Assay Buffer dans chaque puits Laissez incuber sur un agitateur secoueur de plaques 700 900 rpm pendant deux heures temp rature ambiante entre 18 et 25 C Lavez 6 fois automatiqu solution de fermemen avec 700 yl solution de Wash Buffer 1X par puit avec un laveur de plaques ugate 1X solution de Sampl
9. tilf ldigt udvalgte individer i Stockholm om r det i Sverige gennesmit medianv rdi interval OxLDL U I 61 59 26 117 Kolesterol HDL forhold 4 10 3 90 1 68 7 89 Arbitr re enheder Se KALIBRERING M lte data Kolesterol mmol l og HDL mmol l Fordeling af oxideret LDL og Kolesterol HDL forhold Oxideret LDL Kolesterol HDL Patient Total un forhold Quartile 1 Q1 26 49 1 68 3 13 22 49 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 5 49 34 di 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 3 21 3 86 71149 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 71149 114 Q3 60 69 3 21 3 86 0 149 6 7 d 70 117 3 21 3 86 3 49 2 0 Quartile 3 Q1 26 49 3 87 4 79 71149 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 1 49 7 4 Q3 60 69 3 87 4 79 1 49 7 4 Q4 70 117 3 87 4 79 9 49 6 0 Quartile 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1149 07 Q2 50 59 4 80 7 89 4149 2 7 Q3 60 69 4 80 7 89 71149 4 7 En 70 117 4 80 7 89 25 149 16 8 Folgende resultater blev opn et fra 147 ambulante tilf ldigt udvalgte individer i Stockholm om r det i Sverige gennesmit medianv rdi interval OxLDL U l 61 59 26 117 LDL HDL forhold 2 51 2 36 0 55 5 56 Arbitr re enheder Se KALIBRERING Malte data LDL mmol l og HDL mmol l Fordeling af oxideret LDL og LDL HDL forhold Oxideret LDL LDL HDL Patient Total un forhold Quartile 1 Q1 26 49 0 55 1 79 19 47 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 1
10. 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 73 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 74 Sp dningar Prov Sp dning Erh llet v rde Erh llet mU l F rv ntat Assay 1 Assay 2 Prov 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Prov 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Prov 3 1 3321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 7 8 0 1 05 1 00 Prov 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Prov 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Medelv rde f r Erh llet F rv ntat v rde r 1 03 intervall 0 94 1 3 PIE Kalibrering F r n rvarande finns ingen internationell referens preparation av oxiderat LDL Mercodia Oxidized LDL ELISA kalibreras i relativt arbitr ra enheter mot en intern referens preparation av humant oxiderat LDL GARANTI De uppgifter som presenteras h r erh lls med anv ndning av p visat f rfarande F r ndringar eller modifieringar av f rfarandet som inte rekommenderas av Mercodia AB kan p verka re sultaten I dessa fall fr ns ger sig Mercodia AB allt ansvar underf rst tt s v l som lagstadgat inklusive underf rst dd s ljbarhets anv ndarbarhetsgaranti Mercodia AB och deras auktoriserade distribut rer skall i dessa fall inte h llas ansvariga f r direkta eller indirekta skador 92 REFERENCES REFERENZEN REFERENCES REFERENCIAS RIFERIMENTI REFERENCER REFERENSER 1 Steinberg D 1997 Low density lipoprotein oxidation an
11. 12 Concentration indiqu e sur l etiquette du flacon R sultat multipli par le facteur de dilution x 6561 34 Exemple de courbe d talonnage La courbe pr sent e est une courbe d talonnage type Ne l utilisez pas pour d terminer les r sultats des dosages r els 3 35 DD 450 nm 0 5 10 100 mU I LIMITES DE LA PROC DURE Comme pour tous les tests de diagnostic le diagnostic clinique d finitif ne doit pas reposer sur les conclusions d un seul test il doit tre effectu par le m decin apr s valuation de tous les r sultats cliniques L h molyse l ict re ou la lip mie n affectent pas le dosage 35 sie5ueJ4 VALEURS MOYENNES La d ontologie incite chaque laboratoire tablir sa propre gamme de valeurs Les r sultats suivants peuvent servir de guide jusqu ce que le laboratoire ait rassembl suffisamment de donn es provenant de ses propres sources Une tude portant sur 149 individus en ambulatoire s lectionn s au hasard dans la r gion de Stockholm Su de a donn les r sultats suivants Distribution of Oxidized LDL 6 00 5 00 4 00 3 00 Frequency 2 00 1 00 0 00 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 100 75 Oxidized LDL U L 50 25 0 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 36 Une tude portant sur 149 individus en ambulatoire s lectionn s au h
12. 70 117 3 87 4 79 9 149 6 0 Quartile 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1149 0 7 Q2 50 59 4 80 7 89 41149 2 7 Q3 60 69 4 80 7 89 71149 4 7 Q4 70 117 4 80 7 89 25 149 6 8 64 I seguenti risultati sono stati ottenuti da 147 individui selezionati casualmente in laboratorio nel la zona di Stoccolma Svezia Media mediana serie OxLDL U I 61 59 26 117 LDL HDL rapporto 2 51 2 36 0 55 5 56 Unit arbitrarie Vedi calibratura Dati del LDL valutati mmol l e HDL mmol Rapporto della distribuzione dell LDL Ossidato e del LDL HDL LDL ossidato LDL HDL Patient Total 9 6 Ul rapporto Quartile 1 Q1 26 49 0 55 1 79 19 147 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 47 82 Q3 60 69 0 55 1 79 6 147 41 Q4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 147 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 Q4 70 117 1 79 2 33 3147 20 Quartile 3 Q1 26 49 2 36 3 08 8147 54 Q2 50 59 2 36 3 08 11 147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 Q4 70 117 2 36 3 08 8 147 54 Quartile 4 S Q1 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 a Q2 50 59 3 09 5 56 5 47 34 5 Q3 60 69 3 09 5 56 8 147 54 o Q4 70 117 3 09 5 56 24 47 16 3 65 CARATTERISTICHE E ESECUZIONE Il limite della scoperta Il limite della scoperta lt 1mU I calcolato come tre deviazioni standard sopra della Calibrator 0 Riacquisto Il riacquisto sull aggiunta 85 107 significa 95
13. Afl s optisk densitet ved 450 nm og beregn resultaterne Afl s inden for 30 minutter won Obs For at forhindre kontermination mellem konjugatet og substratet anbefales det at anvende s rskilte pipetter 73 INTERN KVALITETSKONTROL Kommercielle Kontroller og eller interne serumpuljer med lave mellem og h je oxideret LDL koncentrationer skal regelm ssigt analyseres som pr ver og resultaterne afbildes fra dag till dag Det er god laboratoriepraksis at registrere falgende data for hver analyse kittets partinum mer rekonstitueringdatoer for kittets komponenter OD v rdier for blindprover Calibrators og Controls BEREGNING AF RESULTATER Computerberegning Computerstyret datareduktion af absorbansen for Calibrator udder Calibrator 0 i forhold till koncentration ved hj lp af cubic spline regression skal udf res for at opn koncentrationene af oxideret LDL Gang koncentrationen for de praver med fortyndingsfaktoren f eks x 6561 Manuel beregning 1 Plot de absorbansveerdier der er opn et for Calibrator udder Calibrator O mod oxideret LDL koncentrationen p lin logaritmisk papir og tegn en kalibratorkurve 2 Afl s koncentrationen for de Controls og praver fra kalibratorkurven 3 Gang koncentrationen for de praver med fortyndingsfaktoren f eks x 6561 Eksempel p resultater Brande Identitet Asso Konc mU l un 1A B Calibrator 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 1E F Calibrator 2 0 369 1G H
14. Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34 12 Koncentration angivet p h tteglassets etiket Resultat multipliceret med fortyndningens faktor x 6561 74 Eksempel p kalibratorkurve Der vises en typisk kalibratorkurve Brug ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyse resultater 0 D 450 nm 1 10 100 mU I PROCEDURENS BEGR NSNINGER Som ved alle diagnosticeringsanalyser m en definitiv klinisk diagnose ikke baseres p resultatet af en enkelt analyse men skal foretages af l gen efter at alle kliniske resultater er blevet bed mt St rkt lip miske ikteriske eller h molyserede pr ver forstyrrer ikke analysen 75 FORVENTEDE V RDIER God praksis foreskriver at hvert laboratorium fastl gger sine egne intervaller for forventede v rdier Folgende resultater kan fungere som en vejledning indtil laboratoriet selv har indsamlet tilstr kkelige data Folgende resultater Heu opn et fra 149 ambulante tilf ldigt udvalgte individer i Stockholm omr det i Sverige Distribution of Oxidized LDL Frequency 35 45 55 65 75 85 95 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 e LJ 100 ee 3 2 3 15 e 9 ae E H 3 e s eb D As 25 ed 0 0 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 76 Folgende resultater blev opn et fra 149 ambulante
15. Enzyme Conjugate Buffer entsprechend der folgenden Tabelle W hrend Sie die enzyme conjugate 1X L sung f r die ganze Platte vorbereiten sch tten Sie den Enzyme Conju gate Buffer komplett in das Fl schchen mit Enzyme Conjugate 11X Vorsichtig mischen Anzahl Streifen Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 Streifen 1 Fl schchen 1 Fl schchen 8 Streifen 700 ul 7 0 ml 6 Streifen 500 ul 5 0 ml 4 Streifen 350 ul 3 5 ml Lagerung nach Verd nnung 1 Monat bei 2 8 C PROBENGEWINNUNG UND HANDHABUNG F r den Mercodia oxidized LDL ELISA empfiehlt sich frisches EDTA Plasma Heparin Plasma und Serum k nnen gegebenen Falls auch verwendet werden Plasma Entnehmen Sie das Blut durch Punktieren der Vene in R hrchen die EDTA oder Heparin als Anti koagulans enthalten und trennen Sie die Plasmafraktionen auf Die Proben k nnen bei 80 C mindestens sechs Monaten gelagert werden Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auf auen Serum Gewinnen von Blut durch Venenpunktion gerinnen lassen and das Serums durch Zentrifugieren abtrennen Die Proben k nnen bei 80 C mindestens sechs Monaten gelagert werden Wieder holtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden VERD NNUNG DER PROBEN Bereiten Sie zwei R hrchen f r jede Patientenprobe vor Jede Probe muss in zwei Schritten bis zu einer 1 6561 Verd nnung wie folgt verd nnt werden 1 Patientenprobe 25 yl Sample buffer 1X L sung 2000 yl VerschlieBen Sie d
16. K hne H Julius U Graessler J 2002 In vivo evidence for increased oxidation of circulating LDL in impaired glucose tolerance Diabetes 51 3102 3106 17 Duntas LH Mantzou E Koutras DA 2002 Circulating levels of oxidized low density lipoprotein in overt mild hypothyrodism Thyroid 12 1003 1007 18 Johnston N Lagerqvist B Siegbahn A Wallentin L 2002 Oxidized LDL and unstable coro nary artery disease Presented at the American Heart Association Scientific Sessions 2002 in Chicago 94 SUMMARY PROTOCOL SHEET ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLBLATTES FEUILLE DE PROTOCOLE RESUMEE HOJA DE RESUMEN DEL PROTOCOLO PRO TOCOLLO DI SINTESI OVERSIGTSPROTOKOLARK SAMMANFATTNINGSPROTOKOLL Mercodia Oxidized LDL ELISA Add Calibrators and samples 25 ul Calibrators und Proben beigeben Ajout de Calibrators et d chantillons A adir Calibrators y muestras Aggiungere Calibrators e campioni Tils t Calibrators og prover Tills tt Calibrators och prover Wash 6 times Waschen 6 mal Rincage 6 rincages Lavar 6 veces Lavare 6 volte Vask 6 gange Tv tta 6 g nger Add Assay Buffer Assay Buffer beif gen Ajout d Assay Buffer A adir Assay Buffer Aggiungere Assay Buffer Tils t Assay Buffer Tills tt Assay Buffer 100 pl Add Substrate TMB Substrat TMB beigeben Ajout de Substrat TMB A adir Substrate TMB Aggiungere Substrate TMB Tils t Substrate TMB Tills tt Substrate TMB 200 yl Incubate 2 hours at 18 25 C on a shaker In
17. Precisione L esattezza stata calcolata dai tre campioni analizzati ripetutamente 3 8 volte in 20 diverse circostanze Campioni Valore principale Coefficiente di variazione mU I Nell analisi Fra analisi 96 totale analisi 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 7 3 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 7 4 Diluizione Campioni Diluizione Valore principale Principale mU I Prevesti Essere 1 Essere 2 Campioni 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Campioni 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Campioni 3 1 3321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 1 8 0 1 05 1 00 Campioni 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Campioni 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Media principale prevesti valori 1 03 serie 0 94 1 13 66 Calibratura Nessun riferimento internazionale disponibile al momento Il Mercodia Oxidized LDL ELISA calibrato in determinate unita arbitrarie contro una preparazione di riferimento interna GARANZIA dati dei rendimenti presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere effetti su i risultati nel caso in cui Mercodia rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse implicite o fissate inclusa la garanzia implicita per l uso commerciale e appropriato Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati in
18. Quartile 3 Q1 26 49 2 36 3 08 8 147 5 4 Q2 50 59 2 36 3 08 11 147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 Q4 70 117 2 36 3 08 8 47 5 4 Quartile 4 Q1 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 Q2 50 59 3 09 5 56 5 147 34 Q3 60 69 3 09 5 56 8 147 5 4 Q4 70 117 3 09 5 56 24 147 16 3 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Detection Limit The detection limit is lt 1 mU I calculated as three standard deviations above the Calibrator 0 Recovery Recovery upon addition is 85 107 mean value is 95 13 Precision Precision was calculated from three samples assayed in 3 8 replicates on 20 different occasions Sample Obtained value Coefficient of variation mU l within between total 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 73 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 7 4 Dilutions Sample Dilution Obtained value Obtained mU l Expected Assay 1 Assay 2 Sample 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Sample 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Sample 3 1 3321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 718 0 1 05 1 00 Sample 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Sample 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Mean Obtained Expected value is 1 03 range 0 94 1 13 Calibration No international reference is at date available The Mercodia Oxidized LDL ELISA is calibrated in relative arbitrary units against an in house reference preparation WARRANTY
19. be negative Nevertheless all recommended pre cautions for the handling of blood derivatives should be observed Please refer to HHS Publication no CDC 88 8395 or corresponding local national guidelines on laboratory safety procedures MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED e Pipettes for 25 ul 50 ul 100 ul 200 ul and 1000 ul repeat pipettes preferred for addition of enzyme conjugate solution Substrate TMB and Stop Solution Beakers and cylinders for reagent preparation Redistilled water Test tubes with caps 3 5 ml Microplate reader 450 nm filter Plate shaker The recommended velocity is 700 900 cycles per minute orbital movement Microplate washing device Appropriate mixing device REAGENTS Each Mercodia Oxidized LDL ELISA kit contains reagents for 96 wells sufficient for 40 samples two Controls and one calibrator curve in duplicate For larger series of assays use pooled reagents from packages bearing identical lot numbers The expiry date for the complete kit is stated on the outer label The recommended storage temperature is 2 8 C Coated Plate 1 plate 96 wells Ready for Use Mouse monoclonal anti oxidized LDL 8 well strips For unused microplate strips reseal the bag using adhesive tape store at 2 8 C and use within 8 weeks Calibrators 1 2 3 4 5 5 vials 1000 ul Lyophilized Human oxidized LDL Add 1000 pl Color coded yellow redistilled water Concentration indicat
20. dass der Mercodia Oxidized LDL ELISA denselben monoklonalen Mausantik rper mAb 4E6 verwendet den Holvoet 9 10 in seinem Assays ver wendet Der Assay Kit von Mercodia ist jedoch ein Capture ELISA auch als Sandwich ELISA bekannt in dem die Vertiefungen der Mikrotiterplatten mit dem Capture Antik rper mAb 4E6 beschichtet sind Es wurden eine Reihe von interessanten Untersuchungen von klinischen Forschern vorgenom men die die ELISA Kits f r oxidiertes LDL verwendet haben Hulthe und Fagerberg 14 zeigten die Beziehung zwischen subklinischer Arteriosklerose und den Konzentrationen an oxidertem LDL im Kreislauf indem sie demonstrierten dass die Konzentrationen an oxidiertem LDL in Be ziehung zur Intimadicke und dem Auftreten von Plaquen in Kopf und Oberschenkelschlagadern steht Sigurdardottir Fagerberg und Hulthe 15 fanden erh hte Konzentrationen von oxdiertem LDL bei Patienten mit metabolischem Syndrom Ausserdem stellten sie fest dass erh hte Konzen trationen an oxidiertem LDL bei den Patienten mit dem metabolischen Syndrom in Verbindung mit einer geringen Partikelgr sse des LDL stand Kopprasch et at 16 fanden erh hte 15 y sinaq Konzentrationen an oxidiertem LDL im Kreislauf bei Personen mit beeintr chtiger Glukose Tole ranz IGT Und Duntas Mantzou und Koutras 17 fanden signifikant erh hte Plasmawerte f r oxidiertes LDL bei unbehandelten Patienten mit offenkundiger Hypothyreose Bei den American Hear
21. destilliertes Wasser Testr hrchen mit Kappen 3 5 ml Mikroplatten Leser mit 450 nm Filter Plattensch ttler Die empfohlene Geschwindigkeit liegt bei 700 900 Umdrehungen pro Minute Orbitalbewegung Waschger t f r Mikroplatten Geeigneter Mischer yos naq REAGENZIEN Jeder Mercodia Oxidized LDL ELISA enth lt Reagenzien f r 96 Brunnen ausreichend f r 40 Pro ben zwei Kontrollmessungen und eine Eichkurve im Duplikat F r eine gr ere Reihe an Tests sollten Reagenzien die miteinander vermischt werden aus Packungen mit verwendet werden gleicher Lot Nummer Das Verfallsdatum f r den gesamten Kit ist auf dem u eren Aufkleber angegeben Die empfohlene Lagertemperatur liegt bei 2 8 C Coated Plate 1 Platte 96 Brunnen Gebrauchsfertig Monoklonales anti oxidiertes LDL der Maus 8 Brunnen Strips Die unbenutzten Mikrotiterstreifen k nnen in der mit Klebeband versiegelten Original verpackung bei 2 8 C bis zu zwei Monate lang aufbewahrt werden Calibrators 1 2 3 4 5 5 Fl schchen 1000 ul Gefriergetrocknet Humanes oxidiertes LDL Geben Sie 1000 ul Gelbf rbung redstilliertes Wasser Konzentrationen sind auf den Fl schchen angegeben pro Fl schchen Lagerung von rekonstituierten Calibrators 2 8 C max 1 Woche hinzu Lagerung von rekonstituierten Calibrators l nger als eine Woche erfordern eine Temperatur von 20 C Calibrator 0 1 Fl schchen 1000 pl Gebrauchsfertig Gelbf rbung Co
22. durch Umdrehen der Mikrotiterplatte ber einem Ausgussbecken verwerfen 350 ul wash buffer 1X L sung in jede Vertiefung geben Wasch buffer 1X L sung verwerfen und mehrmals kr ftig gegen saugf higes Papier schlagen um bersch ssige Fl ssigkeit zu entfernen 5 mal wieder holen L ngere Einwirkzeiten w hrend dieser Waschprozedur vermeiden 100 ul enzyme conjugate 1X L sung in jeden Brunnen geben Auf dem Plattensch ttler 1 Stunde bei Raumtemperatur 18 25 C inkubieren Wie oben beschrieben waschen 200 pl Substrate TMB zugeben Mindestens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Sch tteln inkubieren 50 pl Stop Solution hinzugeben Die Probe 5 Sekunden lang auf den Sch ttler stellen damit die Vermischung sichergestellt ist Die optische Dichte bei 450 nm ablesen und die Ergebnisse berechnen Die Resultate sollten innerhalb von 30 Minuten abgelesen werden Beachten Sie Um Kontaminationen zwischen dem Konjugat und dem Substrat zu vermeiden empfehlen wir Ihnen separate Pipetten zu verwenden 20 INTERNE QUALIT TSKONTROLLE Kommerziell erh ltliche Contols und oder interne Plasma Serum Mischungen mit niedriegen mittleren und hohen Konzentrationen an oxidiertem LDL sollten routinem ig in einem Test zusammen mit den Proben gemessen und jeden Tag aufgezeichnet werden Es empfielt sich die folgenden Daten f r jeden Test aufzuzeichnen Lot Nummer des Kits Datum des Ansatzes der Kit Komponenten Wert der optischen Di
23. fortyndet 1 6561 72 TESTPROCEDURE Alle reagenser og pr ver skal bringes till stuetemperatur for brug Lav en kalibreringskurve til hver analysekersel 1 Forbered enzym conjugate 1X opl sning sample buffer 1X opl sning wash buffer 1X opl sning og pr ver Klarg r tilstr kkeligt med mikrotiterpladebr nde til Calibrators Controls og pr ver Pipetter 25 ul af bade Calibrators Controls og pr ver i de relevante br nde Tils t 100 ul Assay Buffer i hver br nd Inkuber p et rystebord 700 900 rpm i 2 time ved stuetemperatur 18 25 C Vask 6 gange med 700 ul wash buffer 1X opl sning per br nd anvend en automatisk pladevasker med overflow funktion Benyt ikke soak funktion i vaske proceduren Eller manuelt Bortkast v sken i pladen ved at vende den p hovedet over en vask Tils t 350 ul wash D um Es D FA buffer 1X opl sning til hver brand Bortkast wash buffer 1x opl sningen bank pladen flere gange mod absorberende papir for at fjerne overskydende v ske Gentag 5 gange Undg at forl nge perioden hvor br ndene st r med v ske i l bet af vaskeperioden Tils t 100 ul enzyme conjugate 1X opl sning i hver br nd Inkuber p et rystebord i 1 time ved stuetemperatur 18 25 C Vask som beskrevet ovenfor 10 Tils t 200 ul Substrate TMB 11 Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur 12 Tils t 50 ul Stop Solution til hver br nd Placer pladen p et rystebord i cirka 5 sekunder for at sikre blandingen 13
24. l utilisation diagnostique in vitro Ne convient pas l usage interne ou externe chez les humains ou les animauz Vous devez viter tout contact entre le contenu ou les r sidus de ce kit et les ruminants ou les suid s e La Stop Solution fournie contient 0 5 M d acide sulfurique H SO Respectez les pr cautions habituelles relatives l utilisation de produits chimiques dangereux Tous les sp cimens patient doivent tre trait s comme des chantillons contagieuz Attention Ce kit contient des r actifs qui peuvent s av rer infectieux Ce kit contient des r actifs fabriqu s soumis des dosages immunologiques visant d tecter l antig ne de surface de l h patite B ainsi que les anticorps du VIH et du virus de l h patite C Ces tests ont donn des r sultats n gatifs Toutefois il convient de respecter toutes les pr cautions recommand es pour la manipulation des d riv s sanguins Reportez vous la publication HHS n CDC 88 8395 ou aux directives nationales ou locales correspondantes sur les proc dures de s curit en laboratoire MAT RIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI e Pipettes de 25ul 50 100 200 et 1000 ul pipettes r p tition recommand es pour l ajout la solution de l Enzyme Conjugugate de Substrate TMB et de Stop Solution B chers et prouvettes cylindriques pour la pr paration des r actifs Eau redistill e Tubes essai avec capuchon 3 5 ml Lecteur de microplaques f
25. meses Evitar la congelaci n y descongelaci n de forma repetida DILUCI N DE LAS MUESTRAS Preparar dos tubos por cada muestra de paciente Cada muestra tiene que diluirse en dos pasos hasta obtener que se haya diluido 1 6561 veces de la forma siguiente 1 Muestra del paciente 25 yl Soluci n de sample buffer 1X 2000 yl Tapar los tubos invertirlos tres veces y mezclar en v rtex Diluci n 1 81 2 Diluci n 1 81 de la muestra 25 yl Soluci n de sample buffer 1X 2000 yl Tapar los tubos invertirlos tres veces y mezclar en v rtex Diluci n 1 6561 Es IMPORTANTE asegurarse de que cada paso de diluci n se mezcla adecuadamente antes de continuar con el siguiente paso Como resultado de este procedimiento las muestras se diluir n 1 6561 45 PROCEDIMIENTO DE EVALUACI N Todos los reactivos y muestras deben estar a temperatura ambiente antes de su uso Preparar una curva de calibraci n para cada ensayo 1 Preparar soluci n de la enzyme conjugate 1X soluci n de sample buffer 1X soluci n de wash buffer 1X y muestras 2 Preparar suficientes pocillos de microplaca para los Calibrators Controls y muestras por duplicad 3 Pipetear 25 pl de cada Calibrator Controls y muestra en los pocillos correspondientes 4 A adir 100 ul de Assay Buffer a cada pocillo 5 Incubar en un agitador de placas 700 900 rpm durante 2 horas a temperatura ambiente 18 250 6 Lavar 6 veces con 700 pl soluci n de wash buffer 1X por pocillo med
26. mikrotiterstrips terf rslut p sen med tejp F rvara vid 2 8 C och anv nd inom tv m nader Calibrators 1 2 3 4 5 5 flasor 1000 ul Frystokade Humant oxiderat LDL Tills tt 1000 pl Gul f rgm rkning destillerat vatten Koncentration an pa etikett per flaska F rvaring efter rekonstituering 2 8 C i 1 vecka F r f rvaring av rekonstituerade Calibrators i mer n 1 vecka f rvara vid 20 C Calibrator 0 1 flaska 1000 ul F rdig att anv ndas Gul f rgm rkning Controls H L 2 flasor 1000 ul Frystokade Koncentration angen p etikett Tills tt 1000 pl F rvaring efter rekonstituering 2 8 C i 1 vecka destillerat vatten F r l ngre f rvaring av rekonstituerade Calibrators per flaska f rvara vid 20 C Enzyme Conjugate11X 1 flaska 2 ml Sp dning enligt Peroxidaskonjugerat monoklonalt mus anti apoB nedan Enzyme Conjugate Buffer 1 flaska 2 ml F rdig att anv ndas Bl f rgm rkning Assay Buffer 1 flaska 2 ml F rdig att anv ndas R d f rgm rkning Sample Buffer 4X 1 flaska 50 ml Sp d med 150 Gul f rgm rkning ml destillerat Observera F llning kan f rekomma n r l sningen f rvarats vid 2 8 C vatten f r att L t Sample Buffer 4X n rumstemperatur Mixa tills f llningen har bereda sample l sts upp F rvaring efter sp dning 2 8 C i 4 veckor buffer 1X l sning Wash Buffer 21X 1 flaska 50 ml Sp d med 1000 ml F rvaring efter sp dning 1 m nad vid 2 8 C destiller
27. oxideret LDL koncentrationer er relateret til intima media tykkelsen og bel gningen i halspuls ren og arteria femoralis Sigurdardottir Fagerberg og Hulthe 15 p viste forh jede oxideret LDL koncentrationer hos patienter med metabolisk syndrom Desuden p viste de at forhajede oxideret LDL koncentrationer hos patienter med metabolisk syndrom var knyttet til sm LDL partikler Kopprasch et al 16 p viste forh jede koncentrationer af cirkulerende oxideret LDL hos individer med nedsat sukkerfalsomhed impaired glucose tolerance IGT Og Duntas Mantzou og Koutras 17 p viste betydeligt forhejede oxideret LDL plasmakoncentrationer hos patienter med ubehandlet benbar hypothyreose Ved American Heart Association Scientific Sessions 2002 rapporterede Johnston et al 18 at plasmakoncentrationer af oxideret LDL var v sentligt h jere hos patienter med ustabil koronararteriesygdom sammenlignet med sunde kontrolpersoner Det vigtigste var at der ikke var en betydelig forskel mellem kolesterolniveauerne hos patienter med ustabil koronararteriesyg dom og sunde kontrolpersoner PRINCIP FOR PROCEDUREN Mercodia Oxidized LDL ELISA er en tosidet solid phase enzymimmunanalyse Den er baseret p den direkte sandwich teknik hvor to monoklonale antistoffer rettes mod separate antigene de terminanter p oxideret apolipoprotein B molekylet Under inkubation reagerer oxideret LDL pr ven med anti oxideret LDL antistofferne de
28. oxyd es l aide d un test ELISA concurrent utilisant l anticorps monoclonal murin mAb 4E6 celui qu utilise le kit Mercodia Oxidized LDL ELISA Cependant le kit Mercodia est un test ELISA de type sandwich dans lequel les puits des plaques de microtitration contiennent une couche de l anticorps d capture anticorps mAb 4E6 Plusieurs tudes dignes d int r t ont t r alis es par des chercheurs cliniciens utilisant les ki Mercodia Oxidized LDL ELISA Ainsi Hulthe et Fagerberg 14 ont montr que les niveaux s rique de LDL oxyd es taient corr l s avec l paisseur de l intima et de la m dia et avec la pr sence d plaques dans les art res carotide et f morale tablissant la relation entre l ath roscl rose subcli nique et les niveaux s riques de LDL oxyd es Chez des patients pr sentant un syndrome m tabo lique Sigurdardottir Fagerberg et Hulthe 15 ont observ des niveaux lev s de LDL oxydees ils ont en outre identifi une association de ces niveaux de LDL avec une faible taille des particules de LDL Kopprasch et al 16 ont d cel des niveaux s riques lev s de LDL oxyd es chez des patients pr sentant une tol rance au glucose perturb e impaired glucose tolerance IGT Enfin Duntas Mantzou et Koutras 17 ont d tect des niveaux s riques de LDL oxyd es nettement sup rieurs la normale chez des patients pr sentant une hypothyroidie clinique Lors des conf rences American Heart Association Scient
29. seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il laboratorio abbia raccolto dati suf ficienti del tutto suoi I seguenti risultati sono stati ottenuti da 149 individui selezionati casualmente in laboratorio nella zona di Stoccolma Svezia Distribution of Oxidized LDL 6 00 5 00 4 00 3 00 Frequency 2 00 1 00 0 00 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 100 754 H Oxidized LDL U L 50 ef e bcn 25 s 0 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 63 KIT I seguenti risultati sono stati ottenuti da 149 individui selezionati casualmente in laboratorio nel la zona di Stoccolma Svezia Media mediana serie OxLDL U I 61 59 26 117 Col HDL rapporto 4 10 3 90 1 68 7 89 Unit arbitrarie Vedi calibratura Dati del Colesterolo valutati mmol l e HDL mmol l Rapporto della distribuzione dell LDL Ossidato e del Colesterolo HDL LDL Ossidato Colesterolo HDL Patient Total 96 U I rapporto Quartile 1 Q1 26 49 1 68 3 13 22 149 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 5 49 34 Q4 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 3 21 3 86 71149 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 17 49 114 Q3 60 69 3 21 3 86 10 149 6 7 Q4 70 117 3 21 3 86 3 49 2 0 Quartile 3 Q1 26 49 3 87 4 79 71149 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 11149 74 Q3 60 69 3 87 4 79 11149 74 Q4
30. tal caso non sar soggetto a danni indiretti o consequenziali E gt 67 68 TILSIGTET ANVENDELSE Mercodia Oxidized LDL ELISA er beregnet til kvantitativ in vitro m ling af iltede lavdensitetsli poproteiner oxideret LDL i humant serum eller plasma M linger af lipoproteiner bruges ved diagnosticering og behandling af problemer med lipidmetabolismen f eks diabetes mellitus reforkalkning og forskellige lever og nyresygdomme OVERSIGT OG FORKLARING AF ANALYSEN Oxidationskonverteringen af lavdensitets lipoproteiner LDL til iltede lavdensitets lipoproteiner iltede LDL anses nu for at v re en afg rende h ndelse i den biologiske proces der starter og fremskynder udviklingen af tidlige aterosklerotiske l sioner fedtstriber 1 5 Forsag har vist at nativ LDL bliver atherogenetisk n r det omdannes til oxideret LDL og at oxideret LDL er mere atherogenetisk end nativ LDL 1 5 Oxideret LDL findes i monocyt afledte makrofager i aterosklerotiske l sioner men ikke i normaler arterier 6 Optagelsen af LDL i makrofager finder ikke sted ved hj lp af den klassiske Brown Goldstein LDL receptor 7 Talrige unders gelser 1 5 8 har p vist at LDL der er den vigtigste transportar af blodkolesterol f rst skal omdannes til oxideret LDL s det kan genkendes af scavenger eller oxideret LDL recepto rerne p monocyt afledte makrofager Bindingen af oxideret LDL til makrofager er et nadvendigt trin hvor oxider
31. tv steg till en slutgiltig sp dning p 1 6561 enligt f ljande 1 Patientprov 25 yl Sample buffer 1X l sning 2000 ul S tt kork p r ren v nd tre g nger och blanda med Vortex Sp dning 1 81 2 1 81 sp dning av prov 25 ul Sample buffer 1X l sning 2000 ul S tt kork p r ren v nd tre g nger och blanda med Vortex Sp dning 1 6561 Det r VIKTIGT att varje sp dning blandas ordentligt f re fortsatt anv ndning Denna procedur ger att proverna blir sp dda till 1 6561 84 TESTPROCEDUR Alla reagenser och prover m ste rumstempereras f re anv ndning En kalibratorkurva skall ing i varje analys 1 Bered enzyme conjugate 1X l sning sample buffer 1X l sning wash buffer 1X l sning och prover 2 G r iordning tillr ckligt med mikrotiterbrunnar f r att rymma Calibtrators Controls och prover i duplikat 3 Pipettera 25 ul av vardera av Calibrators Controls och utsp dda prover i l mpliga brunnar 4 Tills tt 100 ul Assay Buffer till varje brunn 5 Inkubera p en plattskak 700 900 rpm under 2 timmar vid rumstemperatur 18 25 C 6 Tv tta 6 g nger med 700 ul wash buffer 1X l sning per brunn anv nd en automatisk microtiterplatt tv tt med overflow funktion Anv nd inte soak funktion vid tv ttproceduren Eller manuellt Avl gsna reaktionsl sningen genom att v nda microtiterplattan upp och ner ver en slask Tills tt 350 pl tv ttl sning till varje brunn Avl gsna wash buffer1X l sn
32. un diagn stico clinico definitivo no debe estar basado nicamente en los resultados de una sola prueba sino que el m dico debe hacerlo s lo despu s de haber evaluado todos los datos cl nicos Las muestras lip micas ict ricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo 48 VALORES ESPERADOS Una buena pr ctica de laboratorio dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores Los siguientes resultados pueden servir de guia hasta que el laboratorio haya reunido suficientes datos por su cuenta Se obtuvieron los siguientes resultados en 149 individuos ambulatorios seleccionados aleatoria mente en el rea de Estocolmo Suecia Distribution of Oxidized LDL 6 00 5 00 4 00 3 00 Frequency 2 00 1 00 0 00 35 45 55 65 15 85 95 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 100 4 M a n S Oxidized LDL U L 25 eo 0 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 49 Se obtuvieron los siguientes resultados en 149 individuos ambulatorios seleccionados aleatori amente en el rea de Estocolmo Suecia Media Mediana Rango OxLDL U I 61 59 26 117 Chol HDL cociente 4 10 3 90 1 68 7 89 Unidades arbitrarias Ver CALIBRACI N Datos medidos Colesterol mmol l y HDL mmol l Distribuci n de LDL oxidada y cociente Colesterol HDL LDL oxidada Colesterol HDL Patient Total un Cociente Quartile 1 Q1 26
33. und dem Cholesterin HDL Verh ltnis Oxidiertes LDL Cholesterin HDL Patient Gesamt u Verh ltnis Quartil 1 Q1 26 49 1 68 3 13 22 149 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 51149 3 4 Q4 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Quartil 2 Q1 26 49 3 21 3 86 71149 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 71149 11 4 Q3 60 69 3 21 3 86 0 149 6 7 Q4 70 117 3 21 3 86 3149 2 0 Quartil 3 Q1 26 49 3 87 4 79 71149 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 1149 4 Q3 60 69 3 87 4 79 1149 7 4 Q4 70 117 3 87 4 79 9 149 6 0 Quartil 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1149 0 7 Q2 50 59 4 80 7 89 4149 2 7 Q3 60 69 4 80 7 89 71149 4 7 Q4 70 117 4 80 7 89 25 149 16 8 24 Die folgenden Ergebnisse wurden von 147 ambulanten zuf llig ausgew hlten Personen aus der Umgebung Stockholms in Schweden ermittelt Mittelwert Median Spannweite OxLDL U I 61 59 26 117 LDL HDL Verh ltnis 2 51 2 36 0 55 5 56 Beliebige Einheiten Siehe KALIBRIERUNG Messdaten LDL mmol l und HDL mmol l Verteilung von oxidiertem LDL und dem LDL HDL Verh ltnis Oxidiertes LDL LDL HDL Patient Gesamt un Verh ltnis Quartil 1 Q1 26 49 0 55 1 79 19 147 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 147 8 2 Q3 60 69 0 55 1 79 6 147 4 1 Q4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Quartil 2 Q1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 147 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 Q4 70 117 1 79 2 33 3147 2 0 Quartil 3 Q
34. 1 26 49 2 36 3 08 8 147 5 4 Q2 50 59 2 36 3 08 11 147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 Q4 70 117 2 36 3 08 8 47 5 4 Quartil 4 Q1 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 Q2 50 59 3 09 5 56 5 47 34 Q3 60 69 3 09 5 56 8 47 5 4 Q4 70 117 3 09 5 56 24 47 16 3 y sinaq TESTCHARAKTERISI Nachweisgrenze ERUNG Die Nachweisgrenze liegt bei lt 1 mU I berechnet in drei Standardabweichungen ber dem Ca librator 0 Wiederfindung Die Wiederfindung bei der Zugabe betr gt 85 107 Mittelwert ist 95 Pr zision Die Pr zision wurde aus drei Proben berechnet die in 3 bis 8 Wiederholungen bei 20 verschie denen F llen gemessen wurden Probe Erhaltener Wert Variationskoeffizient mU I innerhalb zwischen gesamt 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 73 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 74 Verd nnungen Probe Verd nnung Erhaltener Wert Erhalten mU l Erwartet Assay 1 Assay 2 Probe 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Probe 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Probe 3 1 3321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 1 8 0 1 05 1 00 Probe 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Probe 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Mittelwert Erhaltener Erwarteter Wert ist 1 03 Spannweite 0 94 1 13 26 Kalibrierung Momentan sind keine internationalen Referenzen verf gbar Der ELISA f r oxdiertes LDL von Mercod
35. 149 2 7 Q3 60 69 4 80 7 89 7 49 4 7 Q4 70 117 4 80 7 89 25 149 16 8 DE F ljande resultat erh lls fr n 147 slumpm ssigt utvalda individer i Stockholmsomr det Sverige Medelv rde Median M tomr de Oxiderat LDL U I 61 59 26 117 LDL HDL kvot 2 51 2 36 0 55 5 56 Arbitr ra enheter Se KALIBRERING M tresultat av LDL mmol l och HDL mmol l F rdelning av oxiderat LDL och LDL HDL kvot Oxiderat LDL LDL HDL Patient Totalt U I Kvot Kvartil 1 1 26 49 0 55 1 79 19 147 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 47 82 Q3 60 69 0 55 1 79 6 147 4 1 4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Kvartil 2 1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 147 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 4 70 117 1 79 2 33 3 147 2 0 Kvartil 3 1 26 49 2 36 3 08 8 147 5 4 Q2 50 59 2 36 3 08 111147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 4 70 117 2 36 3 08 8 147 5 4 Kvartil 4 Q1 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 Q2 50 59 3 09 5 56 5 147 3 4 03 60 69 3 09 5 56 8 147 5 4 70 117 3 09 5 56 24 147 16 3 90 ANALYTISKA PRESTANDA EGENSKAPER Detektionsgr ns Detektionsgr nsen r lt 1 mU I och ber knas som tre standardavvikelser ver Calibrator 0 Recovery Recovery vid tillsats r 85 107 95 Precision Varje prov analyserades i 3 8 replikat vid 20 olika tillf llen Prov Erh llet v rde Variationskoefficient mU l inom mellan totalt testet testet testet
36. 321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 118 0 1 05 1 00 Echantillon 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Echantillon 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Valeurs moyenne obtenu estim est 1 03 tendue 0 94 1 13 39 sie5ueJJ Etalonnage Aucune r f rence internationale n est actuellement disponible le LDL oxid es de Mercodia est calibr avec une pr paration de r f rence faite maison utilisant des unit s arbitraires relatives GARANTIE Les donn es de performances pr sent es dans ce document ont t obtenues lors de tests re spectant la proc dure indiqu e Tout changement ou modification dans la proc dure non re command par Mercodia AB est susceptible d affecter les r sultats Si la proc dure n est pas respect e Mercodia AB d cline toute responsabilit concernant les garanties exprim es l gales ou implicites y compris la garantie implicite relative la qualit marchande et la conformit d usage de ce kit Mercodia AB et ses distributeurs agr s ne sauront tre tenus pour passibles de dommages indirects ou immat riels si la proc dure d crite n est pas respect e 40 UTILIZACI N PREVISTA El kit Mercodia Oxidized LDL ELISA est indicado para ser utilizado en la determinaci n cuantitativa in vitro de lipoprote nas de baja densidad oxidadas LDL oxidadas en suero o plasma de sangre humana Las dete
37. 47 8 2 Q3 60 69 0 55 1 79 6 147 41 Q4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 147 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 Q4 70 117 1 79 2 33 3 147 2 0 Quartile 3 Q1 26 49 2 36 3 08 8 147 5 4 Q2 50 59 2 36 3 08 11 147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 Q4 70 117 2 36 3 08 8 147 5 4 Quartile 4 Q1 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 Q2 50 59 3 09 5 56 5 147 3 4 Q3 60 69 3 09 5 56 8 147 5 4 Q4 70 117 3 09 5 56 24 47 16 3 78 YDEEVNE Registreringsgr nse Registreringsgraensen er 1 mU I beregnet som tre standardafvigelser over Calibrator 0 Genfinding Genfinding efter tils tning er 85 107 gennemsnit 95 Nojagtighed Hver prove analyseres 3 prover 3 8 gange ved 20 forskellige lejligheder Prove Gennemsnit Variationskoefficient mU l inden for mellem samlet analyse analyse analyse 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 7 3 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 7 4 Fortynding Prove Dilution Opn et v rdier Opn et mU l Farventede Assay 1 Assay 2 Prave 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Prove 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Prove 3 1 3321 29 1 32 0 1 6642 5 6 15 5 1 07 0 97 1 13284 7 7 8 0 1 05 1 00 Prove 4 1 3321 21 6 20 2 1 6642 0 4 10 4 0 97 1 03 1 13284 5 9 5 7 1 08 1 12 Prove 5 1 3321 5 9 15 7 1 6642 8 1 8 0 1 02 1 02 1 13284 4 0 4 4 1 02 1 13 Gennemsnit opndet forventede v rdier e
38. 49 1 68 3 13 22 149 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 5 49 34 Q4 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 3 21 3 86 71149 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 17 49 11 4 Q3 60 69 3 21 3 86 10 149 6 7 Q4 70 117 3 21 3 86 3 49 2 0 Quartile 3 Q1 26 49 3 87 4 79 71149 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 11 149 74 Q3 60 69 3 87 4 79 11 149 74 Q4 70 117 3 87 4 79 9 149 6 0 Quartile 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1149 0 7 Q2 50 59 4 80 7 89 4149 2 7 Q3 60 69 4 80 7 89 71149 4 7 d 70 117 4 80 7 89 25 149 16 8 50 Se obtuvieron los siguientes resultados en 147 individuos ambulatorios seleccionados aleatori amente en el rea de Estocolmo Suecia Media mediana rango OxLDL U I 61 59 26 117 LDL HDL conciente 2 51 2 36 0 55 5 56 Unidades arbitrarias Ver CALIBRACI N Datos medidos LDL mmol l y HDL mmol l Distribuci n de LDL oxidada y cociente LDL HDL LDL oxidada LDL HDL Patient Total U I Cociente Quartile 1 Q1 26 49 0 55 1 79 19 147 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 47 8 2 Q3 60 69 0 55 1 79 6 147 41 Q4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 147 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 di 70 117 1 79 2 33 3147 2 0 Quartile 3 Q1 26 49 2 36 3 08 8 147 5 4 Q2 50 59 2 36 3 08 11 1147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 Q4 70 117 2 36 3 08 8147 5 4 Quartile 4 Q1
39. 500 ul 5 0 ml 4 strisce 350 ul 3 5 ml Conservazione dopo la diluzione 2 8 C per uno mese LA RACCOLTA E IL TRATTAMENTO DEL MODELLO L uso consigliato del modello del Mercodia Oxidized LDL ELISA plasma EDTA fresco Il plasma eparina e il siero possono essere usati Plasma Prelevare il sangue direttamente in vena con provette contenenti EDTA o eparina come anticoa gulante e separare la frazione del plasma campioni possono essere conservati a 80 C per almeno sei mesi Evitate di ripetere il congelamento o lo scongelamento Siero Il prelievo in vena di sangue permette di coagulare e separare il siero con la centrifugazione campioni possono essere conservati a 80 C per almeno sei mesi Evitare di ripetere il congela mento e lo scongelamento DILUIZIONE DEI CAMPIONI Preparare due provette per ciascun paziente campione Ogni campione deve essere diluito in due tempi per una diluizione finale di 1 6561 come segue 1 Paziente campione 25 yl Soluzione de sample buffer 1X 2000 yl Incapsulate le provette capovolgetele tre volte e miscelatele con il Vortex Diluizione 1 81 2 1 81 diluizione del campione 25 yl Soluzione de sample buffer 1X 2000 yl Incapsulare le provette capovolgerle tre volte e miscelatele con il Vortex Diluizione 1 6561 E importante assicurarsi che ogni fase di diluizione sia propriamente miscelata prima di ul teriori usi Como risultato di questa procedura i campioni saranno diluiti 1
40. 6561 59 gt 5 PROCEDURA DEL TEST Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso Preparare una calibratura curva per ciascuna serie di anilisi 1 co Y 11 12 13 Preparare di soluzione de enzyme conjugate 1X di soluzione de sample buffer 1X di soluzione de wash buffer 1X e campioni Preparare sufficienti pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators Controls e campioni Pipette 25 ul per ogni Calibrators Controls e campioni in appropriati pozzetti Aggiungere 100 pl al Assay Buffer per ogni pozzetto Mettere in incubatrice in una piastra shaker 700 900 rpm per 2 ora a temperatura am biente 18 25 C Lavare 6 volte con 700 yl di soluzione de wash buffer 1X per pozzetto usando un lavatore automatico per piastre con la funzione traboccare lavare Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione O manualmente Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo Aggiungere 350 ul di soluzione de wash buffer 1X ad ogni pozzetto Eliminare la soluzione de wash buffer 1X sbattere con forza diverse volte contro carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso Ripetere 5 volte Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura di lavaggio Aggiungere 100 pl di soluzione della enzyme conjugate 1X per ogni pozzetto Mettere in incubatrice in una piastra shaker per 1 ora a temperatura ambiente 18 25 C
41. C LCULO DE RESULTADOS C lculo computarizado Para obtener la concentraci n de LDL oxidada realize la reducci n de datos informatizados de la absorbancia para los Calibrators sin Calibrator O frente a la concentraci n utilizando una regresi n spline c bica Multiplicar la concentraci n de las muestras por el factor de diluci n p ej x 6561 C lculo manual 1 Representar gr ficamente los valores de absorbancia obtenidos para los Calibrators sin Calibrator 0 frente a la concentraci n de LDL oxidadas en papel lin log y construir una curva de calibraci n 2 Leer la concentraci n de las muestras a partir de la curva de calibraci n 3 Multiplicar la concentraci n de los Controls y de las muestras por el factor de diluci n p ej x 6561 Pocillos Identidad Aen Conc mU I un 1A B Calibrator 0 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 1E F Calibrator 2 0 369 1G H Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34 12 Concentraci n indicada en la etiqueta del vial Resultado multiplicado por el factor de diluci n x 6561 47 Ejemplo de curva de calibracion Aqui se presenta una curva de calibraci n tipica Esta curva no debe utilizarse para verificar resultados de un ensayo 3 15 0 D 450 nm 0 5 0 i 1 10 100 mu l LIMITES DEL PROCEDIMIENTO Igual que todas las pruebas diagn sticas
42. DL Oxidized LDL LDL HDL Patient Total un Ratio Quartile 1 Q1 26 49 0 55 1 79 19 147 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 47 8 2 Q3 60 69 0 55 1 79 6147 41 Q4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 47 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 Q4 70 117 1 79 2 33 3147 20 Quartile 3 Q1 26 49 2 36 3 08 8147 54 Q2 50 59 2 36 3 08 11 147 7 5 Q3 60 69 2 36 3 08 10 147 6 8 Q4 70 117 2 36 3 08 8147 54 Quartile 4 Q1 26 49 3 09 5 56 0 147 0 0 Q2 50 59 3 09 5 56 5 47 34 Q3 60 69 3 09 5 56 8147 5 4 Q4 70 117 3 09 5 56 24 147 16 3 38 CARACT RISTIQUES DE PERFORMANCES Limites de d tection La limite de la d tection est inf rieure 1 mU l trois carts type au dessus du Calibrator 0 R cup ration Le dosage en retour donne une valeur comprise entre 85 et 107 moyenne 95 Pr cision Chaque chantillon a t analys de 3 echantillon en 3 8 exemplaires 20 occasions diff rentes Echantillon Valeur moyenne Coefficient de variation mU l pendant entre total du dosage le dosage les dosages 1 8 5 5 5 6 2 8 3 2 19 73 4 0 8 3 3 32 6 2 4 0 7 4 Dilutions Echantillon Dilution Valeurs obtenues Obtenues mU l Estim es Assay 1 Assay 2 Echantillon 1 1 3321 1 6642 9 9 18 3 1 13284 9 4 9 5 0 94 1 04 Echantillon 2 1 3321 1 6642 20 6 20 4 1 13284 0 6 9 8 1 02 0 97 Echantillon 3 1 3
43. Mercodia Oxidized LDL ELISA Enzyme immunoassay Directions for Use Gebrauchsinformation Mode d emploi Instrucciones para el uso Instruzioni per l uso Brugsanvisning Bruksanvisning 10 1143 01 REAGENTS FOR 96 DETERMINATIONS Manufactured by Hersteller Fabriqu par Fabricado por Prodotto da Fremstillet af Tillverkad av Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE 754 50 Uppsala Sweden Schweden Su de Suecia Svezia Sverige Mercodia P EXPLANATION OF SYMBOLS USED ON LABELS ERKL RUNG DER SYMBOLE AUF DEN ETIKETTEN EXPLICATION DES SYMBOLES UTILISES SUR LES ETIQUETTES EXPLICACI N DE LOS SIMBOLOS UTILIZADOS EN LAS ETIQUETAS SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE FORKLARING AF SYMBOLER ANVENDT P ETIKETTER F RKLARING AV SYMBOL ERNA SOM ANV NDS P ETIKETTERNA 96 Reagents for 96 determinations Reagenzien f r 96 Bestimmungen Reactifs pour 96 mesures Reactivos para 96 determinaciones Reagenti per 96 rilevazioni Reagens til 96 bestemmelser Reagenser f r 96 best mningar Expiry date Verfallsdatum A utiliser avant Fecha de caducidad Data di scadenza Udlabsdato Utg ngsdatum Store between 2 8 C Lagerungstemperatur 2 8 C A conserver entre 2 et 8 C Conservar a entre 2 8 C Conservare tra i 2 8 C Opbevar ved 2 8 C F rvara vid 2 8 C LOT Lot no Lot Nr N de lot N lote Lotto n Partinr Lotnr IVD For in vitro diagnostic use Zum Gebrauch in der
44. Several noteworthy studies have been reported by clinical researchers who have used the Mercodia Oxidized LDL ELISA kits Hulthe and Fagerberg 14 demonstrated the relationship bet ween subclinical atherosclerosis and circulating oxidized LDL levels by showing that oxidized LDL levels were related to intima media thickness and plaque occurrence in the carotid and femoral arteries Sigurdardottir Fagerberg and Hulthe 15 found elevated levels of oxidized LDL in patients with metabolic syndrome In addition they found that elevated oxidized LDL levels in metabolic syndrome patients were associated with small LDL particle size Kopprasch et a 16 found elevated levels of circulating oxidized LDL in subjects with impaired glucose tolerance IGT And Duntas Mantzou and Koutras 17 found significantly elevated plasma oxidized LDL levels in untreated patients with overt hypothyroidism At the American Heart Association Scientific Sessions 2002 Johnston et a 18 reported that plasma levels of oxidized LDL were substantially higher in patients with unstable coronary artery disease compared to healthy controls Most important there was no significant difference I ive a between the cholesterol levels of the unstable coronary artery disease patients and the healthy controls References page 93 PRINCIPLE OF THE PROCEDURE Mercodia Oxidized LDL ELISA is a solid phase two site enzyme immunoassay It is based
45. anticuerpos anti LDL oxidada unidos a al pocillo de microtitulaci n Despu s una limpiza simple se agrega anticuerpos anti humano apolipoproteina B conjugados en peroxidasa y se lo deja incubar una segunda vez Un paso de limpieza simple elimina el anticuerpo etiquetado de enzima sin ligar El conjugado ligado se detecta por reacci n con 3 3 5 5 tetrametilbencidina TMB La reacci n se detiene a a diendo cido para dar un punto final colorim trico que se alcanza espectrofotom tricamente ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES e Para uso diagn stico in vitro No para uso interno o externo en humanes o animales e El contenido de este kit y sus residuos no deben dejarse entrar en contacto con animales rumiantes o cerdos La Stop Solution de este kit contiene H SO 0 5 M Seguir las precauciones rutinarias para el manejo de productos qu micos peligrosos Las muestras de los pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infecciones Precauci n Advertencia Este kit contiene reactivos que podr an ser infecciosos Este kit contiene reactivos preparados a partir de componentes de sangre humana Estos com ponentes han sido analizados por inmunoensayo frente al ant geno de superficie de la hepatitis B frente a anticuerpos de la hepatitis C y frente a los anticuerpos del VIH siendo todas estas determinaciones negativas Sin embargo deben seguirse todas las precauciones recomendadas para el manejo de derivados de la sangr
46. asard dans la r gion de Stockholm Su de a donn les r sultats suivants Moyenne m diane tendue OxLDL U I 61 59 26 117 Chol HDL ratio 4 10 3 90 1 68 7 89 Unit s arbitraires Voir talonnage Mesure du Cholest rol en mmol l et des lipoprot ines HDL en mmol l Distribution des mesures de LDL oxyd es et du ratio Cholest rol HDL LDL oxyd es Cholest rol HDL Patient Total U I Ratio Quartile 1 Q1 26 49 1 68 3 13 22 149 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 5 49 34 Q4 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 3 21 3 86 7 49 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 17 49 11 4 Q3 60 69 3 21 3 86 10 149 6 7 Q4 70 117 3 21 3 86 3 49 20 Quartile 3 Q1 26 49 3 87 4 79 7 49 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 11 1149 74 Q3 60 69 3 87 4 79 11 49 74 Q4 70 117 3 87 4 79 9 149 6 0 Quartile 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1 49 0 7 Q2 50 59 4 80 7 89 4149 27 Q3 60 69 4 80 7 89 71149 4 7 a 70 117 4 80 7 89 25 149 16 8 sie5ueJJ Une tude portant sur 147 individus en ambulatoire s lectionn s au hasard dans la r gion de Stockholm Su de a donn es r sultats suivants Moyenne m diane tendue OxLDL U 1 6 59 26 117 LDL HDL ratio 2 51 2 36 0 55 5 56 Unit s arbitraires Voir talonnage Mesure des lipoprot ines LDL en mmol l et HDL en mmol l Distribution des mesures de LDL oxyd es et du ratio LDL H
47. at vatten f r att bereda wash buffer 1X l sning Substrate TMB 1 flaska 22 ml F rdig att anv ndas F rgl s v tska Obs Ljusk nslig Stop Solution 1 flaska 7 ml F rdig att anv ndas 0 5 MH S0 83 IE Beredning av enzyme conjugate 1X l sning Bered nskad m ngd enzyme conjugate 1X l sning genom att sp da Enzyme Conjugate 11X 1 10 i Enzyme Conjugate Buffer enligt tabellen nedan Vid beredning av enzyme conjugate 1X l sning till hela plattan h lls hela inneh llet av Enzyme Conjugate Buffer i flaskan med Enzyme Conjugate 11X Blanda varsamt Antal strips Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 strips 1 flaska 1 flaska 8 strips 700 ul 7 0 ml 6 strips 500 ul 5 0 ml 4 strips 350 ul 3 5 ml PROVTAGNING OCH HANTERING Det rekommenderas att f rsk EDTA plasma anv nds i Mercodia Oxidized LDL ELISA Serum och heparinplasma kan ven anv ndas Plasma Ta blod genom venpunktion i r r som inneh ller heparin eller EDTA som motverkar koagulation och separera plasmadelen genom centrifugering Prover kan f rvaras vid 80 C i upp till sex m nader Undvik upprepad frysning och upptining Serum Ta blod genom venpunktion l t det koagulera och separera serumet genom centrifugering Prover kan f rvaras vid 80 C i upp till sex m nader Undvik upprepad frysning och upptining PROVBEHANDLING F rbered tv r r f r varje patientprov Vart och ett av proverna m ste sp das i
48. ate Buffer over i Enzyme Conjugate 11X raret Bland forsigtigt Antal strimler Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 strimler 1 haetteglas 1 heetteglas 8 strimler 700 ul 7 0 ml 6 strimler 500 ul 5 0 ml 4 strimler 350 ul 3 5 ml Opbevaring efter fortynding 2 8 C i en m ned UDTAGNING OG H NDTERING AF PROVER Det anbefales at bruge frisk EDTA plasma til prover i Mercodia Oxidized LDL ELISA Der kan ogs bruges heparinplasma og serum Plasma ag blod ved venepunktur i r r med EDTA eller heparin som antikoagulant og adskil plasma raktionen Prover kan opbevares ved 80 C i mindst seks m neder Undg at nedfryse og opta af flere omgange Serum ag blod ved venepunktur lad det koagulere og adskil serummet ved centrifugering Prover kan opbevares ved 80 C i mindst seks m neder Undg at nedfryse og opto af flere omgange FORTYNDING AF PROVER Klargor to ror til hver patientprove Huer prove skal fortyndes i to trin til en endelig fortynding p 1 6561 p falgende m de 1 Patientprave 25 yl Sample buffer 1X oplesning 2000 ul S t hette p rorene vend tre gange og bland i Vortex blander Fortynding 1 81 2 1 81 fortynding af prove 25 yl Sample buffer 1X oplasning 2000 yl S t h tte p r rene vend tre gange og bland i Vortex blander Fortynding 1 6561 Det er VIGTIGT at sikre at hver enkelt fortynding blandes grundigt fer der forts ttes Efter denne fremgangsm de er proverne
49. azienti con problemi di arteria coronaria instabile in confronto ai controlli sani Molto importante non c era una differ enza significativa tra i livelli di colesterolo nei pazienti con problemi instabili di arteria coronaria i controlli sani Riferimenti pagina 93 PRINCIPIO DI PROCEDURA Mercodia Oxidized LDL ELISA una fase concreta dell immunoanalisi Enzyme due sito E basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determi nanti antigenici separati sulla molecula apolipoproteina B ossidato Durante l incubazione la LDL ossidato nella reazione del campione con anticorpi anti LDL ossidato diretto microtit razione nei pozzetti Dopo il lavaggio gli anticorpi anti umano apolipoproteina B perossidasi conjugata sono aggiunti e dopo la seconda incubazione e un semplice lavaggio che rimuove indirettamente gli anticorpi degli enzimi marcati Il Conjugate diretto scoperto dalla reazione con 3 3 5 5 tetrametibenzidine TMB La reazione fermata aggiungendo acido per dare una posizione estrema colorimetrica che letta spettrometricamente PREACAUZIONI E AVVISI e Per l uso diagnostico in vitro Non per uso interno o esterno nell uomo o negli animali e contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con animali ruminanti o suini e La Stop Solution in questo kit contiene 0 5 M H SO Seguire le precauzioni quotidiane di routine per maneggiare sosta
50. b 4E6 che Holvoet 9 10 o LDL ELISA usa lo stesso specifico anticorpo murino usava nelle sue analisi Comunque il kit analisi Mer codia una cattura ELISA conosciuta anche come un sandwich ELISA nel quale i pozzetti microtiter delle piastre sono ricoperte con Diversi studi autorevoli sono stati riporta ossidato LDL e ELISA Hulthe e Fagerberg clinica e i livelli di LDL ossidato circolante anticorpo cattura mAb 4E6 ti dai ricercatori clinici che hanno usato i kits Mercodia 14 dimostrarono la relazione tra aterosclerosi sub dimostrando attraverso i livelli di LDL ossidato erano correlati allo spessore di media intim e placche impreviste nelle arterie femorali e carotidee Sigurdadottir Fagerberg e Hulthe 15 trovarono elevati livelli di LDL ossidato in pazienti con sindrome metabolico In aggiunta trovarono che elevati livelli di LDL ossidato in paziente con sindrome metabolico erano associatocon particelle di piccola taglia di LDL Kopprasch et a 16 trovarono elevato livelli di LDL ossidatocircolante in soggetti con una ridotta tolleranza al gluco sio IGT E Duntas Mnatzou e Koutras 17 trovarono significativamente elevati livelli di plasma LDL ossidato in paziente non trattati con manifesto ipotiroidisimo Alla riunione dell Associazione Americana del Cuore 2002 Johnston et al 18 relazionarono 55 2 E 5 che i livelli del plasma del LDL ossidato erano sostanzialmente pi alti in p
51. cade se non attraverso il classico recettore LDL Brown Goldstein 7 Numerosi studi 1 5 8 hanno stabilito che LDL il maggior portatore di colesterolo nel sangue deve essere prima trasformato in LDL ossidato perch possa essere ri E conosciuto da macrofago o dal LDL ossidato recettori dei monoliti derivati macrofagi Il legante dell LDL ossidato ai macrofagi un passaggio necessario nel quale LDL ossidato induce l accumulazione di colesterolo nei macrofagi e di conseguenza trasforma i macrofagi in cellule schiumose cariche di lipide 8 Holvoet e i suoi colleghi 9 furono i primi a dimostrare chiaramente che i pazienti malati di arteria coronaria hanno aumentato signi che questi livelli circolanti di LDL ossidato icativamente i livelli del plasma dell LDL ossidato e erano molto simili in pazienti stabili malati di arteria coronaria e in pazienti con sindrome coronaria acuta Essi trovarono i risultati dell LDL ossidato del plasma essere significativamente mol o pi alti nei pazienti con un angina stabile l angina instabile e acuto infarcimento miocardiaco quando confrontato all et selezionata presumibil mente soggetti controllati e sani Nella pubblicazione di Holvoet 9 13 i ivelli di plasma LDL ossidato furono misurati da una ELISA competitiva utilizzando un anticorpo specifico murino monoclinale mAb 4E6 Dovrebbe essere di rilievo che il kit Mercodia Ossida monoclinale mA
52. chte der Blanke der Calibrators und Controls BERECHNUNG DER ERGEBNISSE Computergest tzte Berechnung Es wird emfohlen die Kalibratorkurve mit Hilfe der Cubic Spline Regression zu berechnen um die Konzentration an oxidiertem LDL zu ermitteln Der Calibrator 0 wird in den Berechnungen nicht miteinbezogen Multiplizieren Sie die Konzentration der Proben mit dem Verd nnungsfak tor z B x 6561 Manuelle Berechnung 1 Tragen Sie die Absorptionswerte die f r die Calibrators erhalten wurden gegen die Konzen ration an oxidiertem LDL auf einem linear logarithmisch skalierten Papier auf und erstellen Sie eine Kalibratorkurve Dabei wird der Calibrator 0 nicht in die Berechnungen miteinbe zogen 2 Lesen Sie die Konzentration der Controls und der Proben aus der Kalibratorkurve ab 3 Multiplizieren Sie die Konzentration der Controls und der Proben mit dem Verd nnungs aktor z B x 6561 Beispiel von Resultaten ys n q Vertiefungen Identifikation Aaso Konz mU I un 1A B Calibrator 0 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 1E F Calibrator 2 0 369 1G H Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34 12 Die Konzentration ist auf dem Fl schchen angegeben Ergebnis multipliziert mit dem Verd nnungsfaktor x 6561 21 Beispiel einer Kalibratorkurve Nachfolgend wird eine typische Kalibratorkurve gezeigt Diese sollte nicht zur Berech
53. curva in duplicato Per diverse serie di analisi usare reagenti provenienti da scatole portant identici numeri di lotto La data di scadenza del kit completo e stabilita sull etichetta all esterno Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2 8 C Coated Plate topo monoclonale anti LDL ossidato 1 piastra 8 strips de pozzetti 96 pozzetti Pronti per l uso Per le strisce di microtitolazione non utilizzati sigillare nuovamente la confezione con nastro adesivo e conservare a 2 8 C per otto settimane Calibrators 1 2 3 4 5 5 fiale ossidato LDL umano Giallo colore codificato Concentrazione indicata sull etichetta della fiala Conservare dopo la ricostituzione 2 8 C per 4 settimana 1000 ul Liofilizzato Aggiungere 1000 ul acqua ridistilata per fiala Per la conservazione del Calibrator ricostituito per periodi superiori ad una settimana conservare a 20 C Calibrator 0 1 fiala 1000 ul Pronti per l uso Giallo colore codificato Controls H L 2 viales 1000 ul Liofilizzato Concentrazione indicata sull etichetta della fiala Conservare dopo la ricostituzione 2 8 C per 4 settimana Per la conservazione del Calibrator ricostituito per periodi superiori ad una settimana conservare a 20 C Aggiungere 1000 ul acqua ridistilata per fiala Enzyme Conjugate11X fiala 1 2 ml Peroxidasi Conjugate topo monoclonale anti apoB Per la preparazione vedi sotto Enzyme Conjugate Buffer
54. d before the next step As a result of this procedure the samples will be diluted 1 6561 8 TEST PROCEDURE All reagents and samples must be brought to room temperature before use Prepare a standard curve for each assay run 1 Prepare enzyme conjugate 1X solution sample buffer 1X solution wash buffer1X solution and samples 2 Prepare sufficient Coated Plate wells to accommodate Calibrators Controls and samples in duplicate Pipette 25 ul of each Calibrator Control and diluted sample into appropriate wells Add 100 ul Assay Buffer to each well Incubate on a plate shaker 700 900 rpm for 2 hours at room temperature 18 25 C Wash 6 times with 700 pl wash buffer 1X solution per well using an automatic plate washer with overflow wash function Or manually discard the reaction volume by inverting the microplate over a sink Add 350pl wash buffer 1X solution to each well Discard the wash solution tap firmly several times against absor bent paper to remove excess liquid Repeat 5 times Avoid prolonged soaking during washing procedure 7 Add 100 pl enzyme conjugate 1X solution to each well 8 Incubate on a plate shaker for 1 hour at room temperature 18 25 C 9 Wash as described above 10 Add 200 yl Substrate TMB 11 Incubate for 15 minutes at room temperature no shaking 12 Add 50 yl Stop Solution Place plate on the shaker for 5 seconds to ensure mixing 13 Read optical density at 450 nm and calculate results Read within 30 minute
55. d its pathobiological significance J Biol Chem 272 20963 20966 2 Berliner Lusis AJ JA Navab M Fogelman AM Frank JS Demer LL Edwards PA Watson AD 1995 Atherosclerosis basic mechanisms oxidation inflammation and genetics Circulation 91 2488 2496 3 Steinberg D 1997 Oxidative modification of LDL and atherogenesis Circulation 95 1062 1071 4 Heinecke JW 1998 Oxidants and antioxidants in the pathogenesis of atherosclerosis im plications for the oxidized low density lipoprotein hypothesis Atherosclerosis 141 1 15 5 Witztum JL Horkko S 1997 The role of oxidized LDL in atherogenesis immunological re sponse and anti phospholipid antibodies Ann N Y Acad Sci 811 88 99 6 Yla Herttuala S 1998 Is oxidized low density lipoprotein present in vivo Curr Opin Lipidol 9 337 344 7 Brown MS Goldstein JL 1983 Lipoprotein metabolism in the macrophage implications for cholesterol deposition in atherosclerosis Annu Rev Biochem 52 223 226 8 Chisolm GM Hazen SL Fox PL Cathcart MK 1999 The oxidation of lipoproteins by monocy 9 Holvoet mal ond e macrophages J Biol Chem 274 25959 25962 P Vanhaecke J Janssens S Van de Werf F Collen D 1998 Oxidized LDL and ialdehyde modified LDL in patients with acute coronary syndromes and stable coronary artery disease Circulation 98 1487 1494 10 Holvoe a Usefu Thromb 11 Holvoe 12 Holvoe von Wi 13 Holvoe lipopro 14 Hul
56. e Rem tase a la publicaci n del HHS servicio de salud humana n CDC 88 8395 o a las directrices locales y nacionales correspondientes sobre pro cedimientos de seguridad en laboratorios 42 MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO Micropipetas de 25 ul 50 ul 100 ul 200 ul y 1000 u para la adici n disoluci n de conjugado enzim tico Substrate TMB y Stop Solution se prefieren las pipetas de repetici n Cubetas y probetas para preparar los reactivos Agua bidestilada Tubos de ensayo con tapones 3 5 ml Lector de microplacas filtro de 450 nm Agitador de placas La velocidad recomendable es de 700 900 vueltas por minuto movimiento orbital Lavador de microplacas Apropiado dispositivo de mezclar 43 REACTIVOS Cada kit de Mercodia Oxidized LDL ELISA contiene reactivos para 96 pocillos suficientes para 40 muestra y una curva de calibraci n por duplicado Para series de ensayos m s amplias mez clar reactivos de paquetes de n mero de lote id ntico La fecha de caducidad del kit completo est en el exterior identificada en una etiqueta La temperatura de conservaci n recomendada es 2 8 C Coated Plate Anticuerpo monoclonal de rat n anti LDL o 1 placa 96 pocillos xidada 8 tiras de pocillos Listor para usar Para cintas de microtitraci n sin utilizar cerrar la bolsa con cinta adhesiva y conservar a 2 8 C durante ocho semanas Calibrators 1 2 3 4 5 LDL oxidada humana Codif
57. e Buffer 1X solution de Wash e en utilisant la fonction aspiration verticale Evitez l tape de trempage dans la proc dure de lavage Ou lavez manuellement Jetez le volume r actionnel en retournant la plaque au dessus d un vier Ajoutez 350 pl Wash Buffer 1X dans chaque puit Jetez la solution de Wash Buffer 1X tapez plusieurs fois sur un papier absorbant pour ter l exc s de liquide R p tez 5 fois Evitez les trempages prolong s pendant l tape de lavage Ajoutez 100 ambiante el Ajoutez 200 5 secondes ul solution d Enzyme Conjugate 1X dans chaque puits Laissez incuber sur un agitateur secoueur de plaques pendant une heure temp rature ntre 18 et 25 C Rincez par la m thode d crite plus haut ul de Substrate TMB Laissez incuber pendant 15 minutes temp rature ambiante Ajoutez 50 pl de Stop Solution Placez la plaque sur un agitateur secoueur pendant environ afin que le m lange s effectue bien Lisez la densit optique 450 nm et calculez les r sultats La lecture doit tre r alis e sous 30 minutes Note Pour viter les contaminations du conjugu avec le substrat il est recommand d utiliser des pipettes diff rentes 33 sie5ueJ4 CONTR LE DE QUALIT INTERNE Les contr tration en dosage co es disponibles dans le commerce ou les m langes de s rums internes dont la concen LDL oxid es est faible moyenne ou lev e doivent syst matiquement
58. eceptor 7 Numerous studies 1 5 8 have established that LDL the major carrier of blood cholesterol must first be converted to oxidized LDL so that it can be recognized by scavenger or oxidized LDL receptors on monocyte derived macrophages The binding of oxidized LDL to macrophages is a necessary step by which oxidized LDL induces cholesterol accumulation in macrophages thus transforming the macrophages into lipid laden foam cells 8 Holvoet and his colleagues 9 were the first to clearly demonstrate that patients with coronary rtery disease had significantly elevated plasma levels of oxidized LDL and that these circulating levels of oxidized LDL were very similar in patients with stable coronary artery disease and in patients with acute coronary syndromes They found plasma oxidized LDL levels to be significantly higher in patients with stable angina unstable angina and acute myocardial infarction when compared to age matched presumably healthy control subjects n publications by Holvoet 9 13 plasma oxidized LDL levels were measured by a competi ELISA utilizing a specific murine monoclonal antibody mAb 4E6 It should be noted that the Mercodia Oxidized LDL ELISA kit uses the same specific murine monoclonal antibody mAb 4E6 that Holvoet 9 10 used in his assays However the Mercodia assay kit is a capture ELISA also known as a sandwich ELISA in which the wells of the microtiter plates are coated with the apture antibody mAb 4E6
59. ed on vial label per vial Storage after reconstitution 2 8 C for 1 week For storage of reconstituted Calibrators for more than 1 week store at 20 C Calibrator 0 vial 1000 ul Ready for Use Color coded yellow Controls H L 2 vials 1000 pl Lyophilized Antigen concentration indicated on vial label Add 1000 pl Storage after reconstitution 2 8 C for 1 week redistilled water For storage of reconstituted Controls for more than 1 week per vial store at 20 C Enzyme Conjugate 11X vial 1 2 ml Preparation Peroxidase conjugated mouse monoclonal anti apoB see below Enzyme Conjugate Buffer vial 12 ml Ready for use Color coded blue Assay Buffer vial 12 ml Ready for use Color coded red Sample Buffer 4X bottle 50 ml Dilute with 150 ml Color coded yellow redistilled water to Note Precipitate may occur when stored at 2 8 C make sample 1X Allow Sample Buffer 4X to reach room temperature solution Mix until precipitate has dissolved Storage after dilution 2 8 C for 4 weeks Wash Buffer 21X 1 bottle 50 ml Dilute with 1000 ml Storage after dilution redistilled water to 2 8 C for 4 weeks make wash buffer 1X solution Substrate TMB 1 bottle 22 ml Ready for Use Colorless solution Note Light sensitive Stop Solution 1 vial 7ml Ready for Use 0 5 M H SO Preparation of enzyme conjugate 1X solution Prepare the needed volume of enzyme conjugate 1X solution by dilution of Enzyme Conjugate 11X 1 10 in Enzyme Co
60. et LDL fremkalder kolesterolakkumulering i makrofager og dermed omdannes makrofagerne til lipidfyldte skummende celler 8 Holvoet og hans kolleger 9 var de farste der klart p viste at patienter med koronararteriesyg domme har betydeligt forhejede oxidere LDL koncentrationer i plasma og at disse cirkulerede oxideret LDL koncentrationer svarede meget til patienter med en stabil koronarar teriesygdom og patienter med akutte koronarsyndromer De viste at oxideret LDL resultater i plasma var betydeligt hejere hos patienter med stabil angina pectoris ustabil angina pectoris og akut myokardieinfarkt ved sammenligning med tilsyneladende sunde kontrolpersoner med samme alder Holvoets udgivelser 9 13 blev oxideret LDL koncentrationerne i plasma m lt med en kompe titiv ELISA ved hj lp af et specifikt monoklonalt antistof fra mus mAb 4E6 Det skal bem rkes at der i Mercodia Oxidized LDL ELISA kit anvendes det samme specifikke monoklonale antistof fra mus mAb 4E6 som Holvoet 9 10 har anvendt i sine analyser Men Mercodia kittet er en capture ELISA ogs kaldet en sandwich ELISA hvor brandene p mikrotitreringsplader er belagt med opsamlingsantistoffet mAb 4E6 Der er gennemfort adskillige bem rkelsesv rdige undersagelser af kliniske forskere der har brugt Mercodia Oxidized LDL ELISA kittet Hulthe og Fagerberg 14 p viste sammenhaengen mellem subklinisk reforkalkning og cirkulerende oxideret LDL koncentrationer ved at vise at
61. etitionspipetter foretr kkes til tils tning af enzymkonjugatopl sning Substrate TMB og Stop Solution B gerglas og m leb gre til klarg ring af reagenser Redestilleret vand Reagensglas med h tter 3 5 ml Mikropladeaflaeser 450 nm filter Rystebord Anbefalet hastighed er 700 900 omdrejninger per minut orbital bevaegelse Vasker til mikrotiterplader Passende mixer vortex 70 REAGENSER Hvert Mercodia Oxidized LDL ELISA kit indeholder reagenser til 96 br nde nok til 40 pr ver og en kalibratorkurve i dublet Til storre analyseserier skal der bruges puljereagenser fra pakker med samme lotnummer Udlobsdatoen for hele kittet er angivet p den yderste etiket Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2 8 C Coated Plate 1 plade 96 br nde Kar til brug Monoklonalt anti oxideret LDL fra mus Strimler med 8 br nde Ved ubrugte mikrotiterpladebrande skal posen genforsegles med kl beb nd Opbevares ved 2 8 C og bruges inden for 2 m neder Calibrators 1 2 3 4 5 5 haetteglas 1000 ul Frystorret Humant oxideret LDL Tills t 1000 ul Farvekodet gu redestilleret Koncentration angivet p h tteglasets etiket vand pr h tteglas Opbevaring efter rekonstituering 2 8 C for 1 uge Opbevaring af rekonstitueret Calibrator i mere end en uge ber ske ved 20 C Calibrator 0 1 heetteglas 1000 pl Klar til brug Farvekodet gu Controls H L 2haetteglas 1000 ul Frystorret Koncentra
62. eviennent ath rog nes lorsqu elles sont oxyd es et que les LDL oxyd es sont plus fortement ath rog nes que les LDL non oxyd es 1 5 On trouve des LDL oxyd es dans les macrophages des l sions ath roscl reuses mais non dans les art res saines 6 L absorption des LDL par les macrophages ne s effectue pas par l interm diairemdes r cepteurs B E aux LDL 7 Selon de nombreuses tudes 1 5 8 les LDL qui sont le principal transporteur du cholest rol sanguin doivent d abord tre oxyd es afin d tre reconnues par les r cepteurs scavenger r cepteurs des LDL oxyd es des macrophages La liaison des LDL oxyd es aux macrophages est une tape n cessaire elle provoque l accumulation de cholest rol dans les macrophages qu elle transforme en cellules spumeuses 8 Holvoet et ses coll gues 9 ont t les premiers tablir clairement que les patients atteints de maladies coronariennes pr sentaient des taux plasmatiques de LDL oxyd es nettement sup rieurs la normale et que ces valeurs taient similaires chez les patients pr sentant une maladie coronarienne stable et chez les patients pr sentant un syndrome coronarien aigu Selon cette quipe ces valeurs sont nettement plus lev es chez les patients pr sentant un angor stable ou instable ou un infarctus que dans un groupe de contr le compos de sujets pr sum s sains d ge similaire Dans son tude Holvoet 9 13 mesurait les niveaux plasmatiques de LDL
63. fiala 12 ml Blu colore codificato Pronti per l uso Assay Buffer fiala 12ml Rosso colore codificato Pronti per l uso Sample Buffer 4X Giallo colore codificato Nota Precipitato pu servie quando conservato a 2 8 C bottiglia 50 ml Lasciare che Sample Buffer 4X raggiunga la temperatura ambiente Agitare o mescolare forte fino a che il precipitato venga dissolto Conservazione dopo la diluizione 2 8 C per 4 settimane Diluir con 150 ml d aqua ridistillata per fare diluenti la soluzione de sample buffer 1X Wash Buffer 21X bottiglia 50 ml Conservazione dopo la diluizione 2 8 C per 4 settimane Diluir con 1000 ml d aqua ridistillata per fare diluenti la soluzione de wash buffer 1X Substrate TMB 1 fiala 22 ml Soluci n incolore Nota Sensibile alla luce Pronti per l uso Stop Solution 1 fiala 7 ml 0 5 M H SO Pronti per l uso 58 Preparazione di soluzione della enzyme conjugate 1X Preparare la quantit necessaria soluzione della enzyme conjugate 1X on la diluzione dell Enzyme Conjugate 11X 1 10 nel Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra versare tutto il tam pone Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell Enzyme Conjugate 11X Mescolare lievemente Numero de strisce Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 strisce 1 fiala 1 fiala 8 strisce 700 pl 7 0 ml 6 strisce
64. hos friska kontrollpersoner Referenser sida 93 man 81 TET S PRINCIP F R PROCEDUREN Mercodia Oxidized LDL ELISA r en fast fas enzym immunoassay som baserar sig p sandwich teknik med tv monoklonala antikroppar som r riktade mot separata antigendeterminanter p den oxidativt modifierade apolipoprotein B molekylen Under inkubation reagerar oxiderat LDL i provet med specifik antikropp mab 4E6 bunden till mikrotiterplattans fasta fas Efter tv tt d r ickereaktiva plasmakomponenter avl gsnas k nner peroxidaskonjugerad anti human apolipo protein B antikropp igen det oxiderade LDL som r bundet till fasta fasen Efter en andra inkuba tion och en enkel tv tt f r att avl gsna obunden enzyminm rkt antikropp detekteras det bundna konjugatet genom reaktion med 3 3 5 5 tetrametylbenzidin TMB Enzymreaktionen avl ses spektrofotometriskt efter att ha stoppats genom tillsats av syra VARNINGAR OCH F RSIKTIGHETS TG RDER e F r in vitro diagnostiskt bruk Ej f r intern eller externt bruk p m nniskor eller djur Inneh llet i detta kit eller rester av det f r inte komma i kontakt med idisslande djur eller svin Stop Solution i detta kit inneh ller 0 5 M H SO F lj standards kerhets tg rder f r hantering av farliga kemikalier e Alla patientprover skall hanteras som om de vore smittb rande Varning Detta kit inneh ller komponenter som kan vara smittb rande Detta kit inneh ller komponenter so
65. ia wird in relativen Einheiten gegen eine interne Referenzaufbereitung kalibriert HAFTUNG Die hier angegebenen Leistungsdaten wurden mit Hilfe des oben angegebenen Verfahrens er zielt nderungen oder Modifikationen des Verfahren die nicht von Mercodia AB empfohlen sind k nnen die Ergebnisse beeintr chtigen In diesem Fall bernimmt Mercodia AB keine Garantien inklusive der impliziten Garantie der Handelsf higkeit und Gebrauchsf higkeit wenn nicht aus dr cklich genannt implizit oder gesetzlich gegeben wurden Mercodia AB und seine autorisierten Distributoren sind in diesem Fall nicht haftbar f r indirekte Sch den oder Folgesch den 27 ysinag 28 UTILISATION PREVUE Le kit de test Mercodia Oxidized LDL ELISA est destin la mesure in vitro des quantit s des lipoprot ines LDL lipoprot ines de faible densit oxyd es dans le s rum ou le plasma sanguin de l homme Les mesures des quantit s de lipoprot ines sont utilis es dans le diagnostic et le traite ment des troubles du m tabolisme des lipides par exemple le diab te sucr de l ath roscl rose et de diverses affections du foie et des reins R SUM ET EXPLICATION DU TEST L oxydation des lipoprot ines LDL est d sormais consid r e comme un v nement cl du proces sus biologique d apparition et d acc l ration du d veloppement de la strie graisseuse l sion ath roscl reuse pr coce 1 5 Des tudes exp rimentales ont montr s que les LDL d
66. iante Lavador de placas autom tico con funci n de sobre flujo de lavado No usar el paso de remojo durante el proceso O manualmente Verter el l quido invirtiendo la microplaca en una pila A adir 350 ul soluci n de wash buffer 1X golpeando firmemente la placa contra papel absorbente para eliminar todo el l quido en exceso Repetir 5 veces Evitar remojo prolongado durante el proceso A adir 100 yl soluci n de la enzyme conjugate 1X a cada pocillo Incubar en un agitador de placas durante 1 hora a temperatura ambiente 18 25 C Lavar de la forma descrita anteriormente 10 A adir 200 yl de Substrate TMB 11 Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente 12 A adir 50 pl de Stop Solution a cada pocillo Colocar la placa en un agitador durante aproximadamente 5 segundos para asegurar el mezclado 13 Leer la densidad ptica a 450 nm y calcular los resultados Leer en 30 minutos vo Aviso Usar pipetas distintas para prevenir contaminaci n entre conjugado y sustrato 46 CONTROL DE CALIDAD INTERNA Los controles comerciales y o mezclas de sueros internas con concentraciones de LDL oxidadas bajas medias y altas se analizar n de forma rutinaria como muestras y los resultados se repre sentar n d a a d a Es una buena pr ctica de laboratorio registrar los siguientes datos en cada ensayo n mero de lote del kit fechas de reconstituci n de los componentes del kit valores de DO de blanco Calibrators y Controls
67. icado en amarillo Concentrati n indicada la etiqueta del vial Almacenaje despu s de la reconstituci n 2 5 viales 1000 ul 8 C durante 1 semana Liofilizado A adir 1000 ul de agua bidestilada por vial Para el almacenaje de Calibrators reconstituidos durante m s de 1 semana conservar a 20 C Calibrator 0 1 vial 1000 ul Listo para usar Codificado en amarillo Controls H L 2 viales 1000 ul Liofilizado Concentrati n indicada la etiqueta del vial Almacenaje despu s de la reconstituci n 2 8 C durante 1 semana Para el almacenaje de Calibrators reconstituidos durante m s de 1 semana conservar a 20 C A adir 1000 ul de agua bidestilada por vial Enzyme Conjugate 11X vial 1 2 ml Preparaci n Monoclonal de rat n Enzyme Conjugate con peroxidasa anti apoB ver abajo Enzyme Conjugate Buffer vial 12 ml Listo para usar Codificado en azul Assay Buffer vial 12 ml Listo para usar Codificado en rojo Sample Buffer 4X botella 50 ml Diluir con 150 ml Codificado en amarillo Atenci n Puede producir un precipitado cuando se conserva a 2 8 C Dejar que el Sample Buffer 4X alcance de temperatura ambiente Agitar o pasar por v rtex hasta que se disu elva el precipitado agua bidestilada para preparar la soluci n de sample buffer 1X Almacenaje despu s de diluir 2 8 C durante 4 semanas Wash Buffer 21X botella 50 ml Diluir con 1000 ml Almacenaje des
68. ie R hrchen mit Kappen drehen Sie diese dreimal um und mischen Sie diese durch Verwirbelung Verd nnung 1 81 2 1 81 Verd nnung der Probe 25 yl Sample buffer 1X L sung 2000 yl VerschlieBen Sie die R hrchen mit Kappen drehen Sie diese dreimal um und mischen Sie diese durch Verwirbelung Verd nnung 1 6561 Es ist WICHTIG dass die Proben bei jedem Verd nnungsschritt ordnungsgem B gemischt wer den bevor sie weiter verwendet werden Als Ergebnis dieser Prozedur werden die Proben 1 6561 verd nnt sein 19 yos naq TESTDURCHF HRUNG Alle Reagenzien und Proben m ssen vor deren Anwendung auf Raumtemperatur gebracht wer den Bereiten Sie eine Kalibratorkurve f r jeden Test vor 1 won 11 12 Vorbereitungen von enzyme conjugate 1X L sung sample buffer 1X L sung wash buffer 1X L sung und Proben Ausreichend Coated Plate Vertiefungen f r die Calibrators Controls und Proben vorbereiten Jeweils 25 ul der Calibrators der Controls und der verd nnten Proben in die entsprechend Brunnen pipettieren 100 ul Assay Buffer in jede Vertiefung geben Auf einem Plattensch ttler 700 900 rpm 2 Stunden bei Raumtemperatur 18 25 C inkubieren 6mal waschen mit 700 pl wash buffer 1X L sung pro Vertiefung unter Verwendung eines Platten Waschautomaten mit berlauf Waschfunktion Einwirkzeit w hrend den Wasch prozedur sollte vermieden werden Wird manuell gewaschen bitte folgenderma en vorgehen Reaktionsvolumen
69. ific Sessions de 2002 Johnston et ai 29 D va D sie5ueJJ 18 ont signal s que les niveaux plasmatiques de LDL oxyd es taient nettement plus lev s chez les patients atteints de maladie coronarienne instable que chez les sujets sains En revanche selon une observation d importance capitale ils ne relevaient aucune diff rence significative en tre les taux de cholest rol de ces deux groupes de patients R f rences page 93 PRINCIPE DE LA PROC DURE Une caract ristique du test Mercodia Oxidized LDL ELISA est le dosage immunologique enzy matique double site en phase solide II repose sur une technique de type sandwich direct dans laquelle deux anticorps monoclonaux sont dirig s contre deux d terminants antig niques distincts du apolipoprotein B oxyd es mol cule En phase d incubation les mol cules de LDL oxyd es de l chantillon r agissent avec les anticorps anti oxyd es LDL fix s aux puits de mi crotitration Apr s rincage on ajute des anticorps anti apolipoprotein B humaine conjugu s la peroxydase Apr s la deuxi me incubation un rincage simple limine les anticorps marqu s non li s Le conjugu est d tect par r action avec la 3 3 5 5 tetramethylbenzidine TMB Pour arr ter la r action on ajoute de l acide Cette solution fournit un point d valuation colorim tric qui sera lu par spectrophotmetri AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS e Ce kit est r serv
70. iltre de 450 nm Agitateur secoueur de plaques Le r gime recommand est de 700 900 tours par minute mouvement orbital Dispositif de rin age de microplaques M langeur appropri 30 R ACTIFS Chaque kit Mercodia Oxidized LDL ELISA contient suffisamment de r actifs pour 96 puits soit une quantit permettant de traiter 40 chantillons deux Controls et une courbe d talonnage en double Pour des s ries de dosages plus importantes m langez les r actifs de kits portant des nu m ros de lot identiques La date de p remption du kit figure sur l tiquette appos e l ext rieur La temp rature de stockage recommand e est 2 8 C Coated Plate plaque 96 puits Pr te l emploi Monoclonal murin anti oxyd es LDL Bandes de 8 puits Les puits de microtitration non utilis s peuvent tre conserv s pendant deux mois entre 2 8 C apr s les avoir replac s dans leur emballage herm tiquement ferm l aide de papier adh sif Calibrators 1 2 3 4 5 5 fioles 1000 ul Lyophilis LDL oxyd es humaine Ajoutez 1000 pl Code couleur jaune d eau redistill e Conc indiqu e sur l tiquette par fiole Stockage apr s reconstitution 2 8 C pour 1 semaine Pour le stockage et la reconstitution des Calibrators au del d une semaine conservez les 20 C Calibrator 0 1 fiole 1000 ul Pr te l emploi Code couleur jaune Controls H L 2 fioles 1000 ul Lyophilis Conc indiqu
71. ima media y la aparici n de placas en las arterias car tida y femoral Sigurdardottir Fagerberg y Hulthe 15 hallaron niveles elevados de LDL oxidada en pacientes con s ndrome metab lico Adem s hallaron que los niveles elevados de LDL oxidada en pacientes con s ndrome metab lico se asociaban con unas particulas de LDL de tama o peque o Kopprasch et al 16 hallaron niveles circulantes elevados de LDL oxidada en sujetos con tolerancia an mala a la glucosa TAG Duntas Mantzou y Koutras 17 hallaron niveles plasm ticos significativamente elevados de LDL oxidada en pacientes no tratados con hipotiroidismo evidente En las sesiones cient ficas de la Asociati n Cardiol gica Americana de 2002 Johnston et al 18 notificaron que los niveles plasm ticos de LDL oxidada fueron sustancialmente m s altos en pacientes con enfermedad coronaria inestable comparado con los controles sanos Es de desta car que no se hallaron diferencias significativas entre los niveles de colesterol de pacientes con enfermedad coronaria inestable y los controles sanos Referencias p gina 93 PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO Mercodia Oxidized LDL ELISA es un inmunoensayo de fase s lida de dos emplazamientos Se basa en la t cnica de sandwich directa en la que se dirigen dos anticuerpos monoclonales contra determinantes antig nicos separados de la mol cula de apolipoproteina B oxidata Durante la incubaci n el LDL oxidada de la muestra reacciona con los
72. in vitro Diagnose Ce kit est r serv l utilisation diagnostique in vitro Para uso diagn stico in vitro Per l uso diagnostico in vitro il in vitro diagnosticering F r in vitro diagnostiskt bruk Mercodia 2008 2009 Directions for Use Gebrauchsinformation Mode d emploi Instrucciones para el uso Instruzioni per l uso Brugsanvisning Bruksanvisning 15 29 41 55 69 81 INTENDED USE he Mercodia Oxidized LDL ELISA kit is intended to be used for the in vitro quantitative mea surement of oxidized low density lipoproteins oxidized LDL in human blood serum or plasma Lipoprotein measurements are used in the diagnosis and treatment of lipid disorders such as diabetes mellitus atherosclerosis and various liver and renal diseases SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST he oxidative conversion of low density lipoproteins LDL to oxidized low density lipoproteins oxidized LDL is now considered to be a key event in the biological process that initiates and accelerates the development of the early atherosclerotic lesion the fatty streak 1 5 Experimental studies have shown that native LDL becomes atherogenic when it is converted o oxidized LDL and that oxidized LDL is more atherogenic than native LDL 1 5 Oxidized LDL is found in monocyte derived macrophages in atherosclerotic lesions but not in normal arteries 6 The uptake of LDL into macrophages does not occur by way of the classic Brown Goldstein LDL r
73. ingen knacka plattan best mt flera g nger p absorberande papper f r att ta bort verf dig v tska Upprepa 5 g nger Undvik l ngvarig soak under tv ttproceduren 7 Tills tt 100 ul enzyme conjugate 1X l sning till varje brunn 8 Inkubera p plattskak under 1 timme vid rumstemperatur 18 25 C 9 Tv tta enligt beskrivningen ovan 10 Tills tt 200 ul Substrate TMB till varje brunn 11 Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur Skaka inte 12 Tills tt 50 ul Stop Solution i varje brunn Placera plattan p en plattskak i 5 sekunder f r att s kerst lla att l sningen r ordentligt blandad 13 Avl s optisk densitet vid 450 nm och ber kna resultaten Avl s inom 30 minuter Obs F r att undvika kontamination rekommenderas att separata pipetter anv nds f r konjugat och substrat 85 IE INTERN KVALITETSKONTROLL Kommersiella kontroller och eller interna kontrollprover med l ga mellan och h ga oxiderat LDL koncentrationer b r regelm ssigt analyseras som prover och resultaten kartl ggas dag f r dag Det tillh r goda laboratorierutiner att anteckna f ljande uppgifter vid varje analystillf lle kitets lotnummer kitkomponenternas rekonstitutionsdatum OD v rden f r Blank Calibrators och Controls BER KNING AV RESULTATEN Datorber kning Kalibratorkurva kan konstrueras genom att anv nda cubic spline regression med absorbans v rdena f r Calibrators utan Calibrator 0 mot oxiderat LDL koncentrationen Mu
74. kubieren 2 Stunden auf einem Sch ttler bei 18 25 C Incubation 2 heures 18 25 C sur un agitateur secoueur de plaques Incubar 2 horas a 18 25 C en un agitador de placas Incubazione 2 ore a 18 25 C in una piastra shaker Inkuber 2 timer ved 18 25 C p et rystebord Inkubera 2 timmar vid 18 25 C p en plattskak Wash 6 times Waschen 6mal Rin age 6 rin ages Lavar 6 veces Lavare 6 volte Vask 6 gange Tv tta 6 g nger Add enzyme conjugate 1X solution Die Enzyme Conjugate 1X L sung beif gen Ajout le solution d enzyme conjugate 1X A adir soluci n de enzyme conjugate 1X Aggiungere soluzione di enzyme conjugate 1X Tils t enzyme conjugate 1X oplasing Tills tt enzyme conjugate 1X l sning 100 yl Incubate 1 hour at 18 25 C on a shaker Inkubieren 1 Stunde auf einem Sch ttler bei 18 25 C Incubation 1 heure 18 25 C sur un agitateur secoueur de plaques Incubar 1 hora a 18 25 C en un agitador de placas Incubazione 1 ora a 18 25 C in una piastra shaker Inkuber 1 time ved 18 25 C p et rystebord Inkubera 1 timme vid 18 25 C p en plattskak Incubate 15 minutes Inkubieren 15 Minuten Incubation 15 minutes Incubar 15 minutos Incubazione 15 minuti Inkuber 15 minutter Inkubera 15 minuter Add Stop Solution Stop Solution beif gen Ajout de Stop Solution A adir Stop Solution Aggiungere Stop Solution Tils t Stop Solution Tills tt Stop Solution 50 ul Shake for 5 sec
75. lesen wird WARNUNG UND VORSICHTSMABNAHMEN Zum Gebrauch in der in vitro Diagnostik Nicht f r die innere oder u ere Anwendung bei Menschen oder Tieren Der Inhalt dieses Kits und dessen R ckst nde d rfen nicht mit Wiederk uern oder Schweinen in Kontakt kommen e Die Stop Solution in diesem Kit enth lt 0 5 M H SO Befolgen Sie die Routinevorkehrungen beim Umgang mit gef hrlichen Chemikalien e Alle Patientenproben sollten so behandelt werden als ob sie Infektionen bertragen k nnten Warnung Dieser Kit enth lt Reagenzien die Infektionserreger enthalten k nnen Dieser Kit enth lt Reagenzien die aus Komponenten menschlichen Bluts produziert wurden Die Materialquellen wurden mit einem Immunassay auf das Hepatitis B Oberfl chenantigen Anti k rper f r den Hepatitis C virus und auf Antik rper f r den HIV Virus getestet und diese Tests haben sich als negativ erwiesen Nichtsdestotrotz m ssen alle empfohlenen Vorkehrungen f r den Umgang mit Blutderivaten beachtet werden Bitte sehen Sie dazu in der HHS Ver ffentlich ung Nr CDC 88 8395 oder entsprechenden lokalen nationalen Richtlinien ber Sicherheitsab l ufe im Labor nach ZUS TZLICH BEN TIGTES MATERIAL 25 yl 50 pl 100 ul 200 pl und 1000 pl Multipipetten vorzugsweise Mehrfachpipetten f r die Zugabe des Enzyme Conjugate 1X l sung des Substrate TMB und der Stop Solution Becher und Zylindergl ser f r die Vorbereitung der Reagenzien Doppelt
76. ltiplicera koncentrationen f r Controls de proverna med sp dningsfaktorn t ex x 6561 Manuell ber kning 1 M rk ut absorbansv rdena som erh lls f r Calibrator utan Calibrator 0 mot oxidierat LDL koncentrationen p ett lin logpapper och konstruera en kalibratorkurva 2 Avl s provernas koncentration fran kalibratorkurva 3 Multiplicera koncentrationen f r Controls och prover med sp dningsfaktorn t ex x 6561 Exempel p resultat Brunnar Identitet Aen Konc mU l un 1A B Calibrator 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 1E F Calibrator 2 0 369 1G H Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34 12 Koncentrationen anges p flaskans etikett Resultaten har multiplicerats med sp dningsfaktorn x 6561 86 Exempel p kalibratorkurva En typisk kalibratorkurva visas h r Anv nd inte den h r kurvan f r att fastst lla verkliga test resultat 25 DD 450 nm 0 5 mu METODENS BEGR NSNINGAR likhet med alla andra diagnostiska tester b r man inte basera en definitiv klinisk diagnos p resultatet fr n ett enstaka test Diagnosen b r st llas av en l kare efter att alla kliniska fynd har utv rderats Starkt lipemiska ikteriska eller hemolyserade prover p verkar inte testresultatet 87 BIEL F RV NTADE V RDEN Det tillh r god laboratorierutin good practice att varje laboratoriu
77. m r framst llda fr n humana blodderivat K llmaterialet har med hj lp av immunanalys testats f r f rekomst av hepatit B ytantigen antikroppar mot hepatit C virus och antikroppar mot HIV virus och funnits vara negativa Alla f rsiktighets tg rder g llan de hantering av blodderivat ska dock iakttas Information finns i HHS publikationsnummer CDC 88 8395 eller motsvarande lokala nationella riktlinjer f r s kerhetsprocedurer p laboratorier MATERIAL SOM KR VS MEN EJ TILLHANDAH LLS e Pipetter f r 25 41 50 ul 100 ul 200 ul and 1000 yl repeterbara pipetter r att f redra f r illsats av enzymkonjugatl sning Substrate TMB och Stop Solution B gare och m tglas f r iordningst llande av reagens Destillerat vatten Provr r med kork 3 5 ml Mikrotiterplattl sare med 450 nm filter Plattskak Rekommenderad hastighet r 700 900 varv per minut orbital r relse v ttutrustning f r mikrotiterplattor L mplig mixer 82 REAGENSER Varje Mercodia Oxidized LDL ELISA kit inneh ller reagenser till 96 brunnar tillr ckligt f r 40 prover tv kontroller och en kalibratorkurva i duplikat F r st rre analysserier anv nd samman slagnareagenser fr n f rpackningar med identiska lotnummer Utg ngsdatum f r hela kitet st r p ytteretiketten Rekommenderad f rvaringstemperatur r 2 8 C Coated Plate 1 platta 96 brunnar F rdig att anv ndas Monoklonalt mus anti oxiderat LDL Strips med 8 brunnar F r oanv nda
78. m skall fastst lla sina egna f rv ntade v rden F ljande resultat kan tj na som en v gledning till dess att laboratoriet har samlat tillr ckligt med egna uppgifer F ljande resultat erh lls fr n 149 slumpm ssigt utvalda individer i Stockholmsomr det Sverige Distribution of Oxidized LDL 6 00 Frequency 35 45 55 65 75 85 95 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 100 75 50 Oxidized LDL U L 25 0 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 88 F ljande resultat erh lls fr n 149 slumpm ssigt utvalda individer i Stockholmsomr det Sverige Medelv rde Median M tomr de Oxiderat LDL U I 61 59 26 117 Kolesterol HDL kvot 4 10 3 90 1 68 7 89 Arbitr ra enheter Se KALIBRERING Matresultat av Cholesterol mmol l och HDL mmol l F rdelning av oxiderat LDL och Cholesterol HDL kvot Oxiderat LDL Kolesterol HDL Patient Totalt U I Kvot Kvartil 1 Q1 26 49 1 68 3 13 22 149 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 5 49 34 Q4 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Kvartil 2 Q1 26 49 3 21 3 86 7 49 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 17 49 114 Q3 60 69 3 21 3 86 10 149 6 7 Q4 70 117 3 21 3 86 3 149 2 0 Kvartil 3 Q1 26 49 3 87 4 79 7149 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 11 49 7 4 Q3 60 69 3 87 4 79 11 149 7 4 Q4 70 117 3 87 4 79 9 149 6 0 Kvartil 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1149 0 7 Q2 50 59 4 80 7 89 4
79. n in arteriosklerotischen Sch digungen aber nicht in normalen Arterien 6 Die Aufnahme von LDL in Makrophagen geschieht ber den klassischen Brown Goldstein LDL Rezep tor 7 Zahlreiche Untersuchungen 1 5 8 haben ergeben dass LDL der wesentliche Carrier von Cholesterin zuerst in oxidiertes LDL umgewandelt werden muss um von den Sca venger oder Rezeptoren f r oxidiertes LDL auf den Makrophagen erkannt zu werden Die Bin dung von oxidiertem LDL an Makrophagen ist ein notwendiger Schritt bei dem oxidierte LDL die Cholesterinansammlung in den Makrophagen hervorruft und die Makrophagen damit in lipidreichen Zellenschaum umwandelt 8 Holvoet und seine Mitarbeiter 9 konnten als erste klar demonstrieren dass Patienten mit Herzkranzgef erkrankungen deutlich erh hte Plasmakonzentrationen an oxidiertem LDL auf wiesen und dass diese Kreislaufkonzentrationen an oxidiertem LDL hnlich zu den Patienten mit stabilen Herzkranzgef erkrankungen und bei Patienten mit akuten Herzkranzgef syndromen waren Sie fanden heraus dass bei Patienten mit stabiler Angina instabiler Angina und akuten Herzinfarkten die Werte f r oxidiertes LDL im Plasma im Vergleich zu gleichaltrigen gesunden Kontrollpersonen signifikant h her waren In der Ver ffentlichung von Holvoet 9 13 wurden die Konzentrationen von oxidiertem LDL durch einen kompetitiven ELISA mit Hilfe eines spezifischen monoklonalen Mausantik rpers mAb 4E6 gemessen Es ist anzumerken
80. ncentrazione di LDL ossidato in un registro e formula lin log una calibratura curva 2 Leggere la concentrazione dei campioni dalla calibratura curva La calibratura curva pu anche essere calcolata usando un algoritmo liscio cubico flessibile Moltiplicare la concentrazione dei Controls e dei campioni con il fattore di diluizione e g x 6561 w Risultati ottenuti Pozzetti Identit Aus Conc mU I un 1A B Calibrator 0 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 T 1E F Calibrator 2 0 369 1G H Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control H 1 234 12 2 80 04 2G H Control L 0 513 5 2 34 12 Concentrazione indicata sull etichetta della fiala Il risultato viene moltiplicato per il fattore di diluizione x 6561 61 Esempio di una calibratura curva Una calibratura rappresentativa mostrata qui Non usare questa curva per determinare i risultati attuali delle analisi 25 0 D 450 nm 0 5 0 T 10 100 mU I LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Come tutti i test diagnostici una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere basata sui ri sultati di un singolo test ma dovrebbe essere fatto medico dopo averne valutate le conclusioni cliniche Grossolanamente campioni lipemic itterico o hemolysed non interferiscono nell analisi 62 VALORI PREVISTI E buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di presunti valori
81. njugate Buffer according to the table below When preparing enzyme conjugate 1X solution for the whole plate pour all of the Enzyme Conjugate Buffer into the Enzyme Conjugate 11X vial Mix gently Number of strips Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 strips 1 vial 1 vial 8 strips 700 ul 7 0 ml 6 strips 500 ul 5 0 ml 4 strips 350 ul 3 5 ml Storage after dilution 2 8 C for 1 month SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING The recommended use of specimen in the Mercodia Oxidized LDL ELISA is fresh EDTA plasma Heparin plasma and serum may also be used Plasma Collect blood by venipuncture in tubes containing EDTA or heparin as anticoagulant and sepa rate the plasma fraction Samples can be stored at 80 C for at least six months Avoid repeated freezing and thawing Serum Collect blood by venipuncture allow to clot and separate the serum by centrifugation Samples can be stored at 80 C for at least six months Avoid repeated freezing and thawing DILUTION OF SAMPLES Prepare two tubes for each patient sample Each sample has to be diluted in two steps to a final dilution of 1 6561 as follows 1 Patient samples 25 yl Sample buffer 1X solution 2000 ul Cap tubes invert three times and vortex mix Dilution 1 81 2 1 81 dilution of sample 25 yl Sample buffer1X solution 2000 ul Cap tubes invert three times and vortex mix Dilution 1 6561 t is IMPORTANT to ensure that each dilution step is properly mixe
82. nos och behandling av lipidrubbningar t ex diabetes mellitus ateroskleros och olika lever och DL terfinns Studier har fastst llt att LDL den fr msta b raren av v rt blodkolesterol f rst m ste omvandlas till oxiderat LDL varefter det kan kan tas upp av makrofager via den s k renhallningsreceptor eller rn p makrofagerna Bindningen av oxiderat LDL till makrofager r ett avg rande steg i den mekanism genom vilken oxiderat LDL orsakar ansamling av kolesterol oxiderat LDL recepto i makrofagerna som d rigenom omvandlas till lipidfyllda s k skumceller Holvoet et al 9 var de f rsta som tydligt visade att patienter med kransk rlsjukdom hade avsev rt f rh jda plasmaniv er av oxiderat LDL och att cirkulerande niv er av oxiderat LDL ven var f rh jt hos patienter med stabil kransk rlssjukdom samt patienter med akut koronarsjuk dom De fann vidare att plasmaniv erna av oxiderat LDL var signifikant h gre hos patienter med angina och akut hj rtinfarkt vid j mf relse med f rmodat friska kontroll stabil angina instabil personer av samma lder Holvoets arbeten 9 13 m ttes plasmaniv er av oxiderat LDL med ett kompetitivt ELISA test vilken den oxiderat LDL specifika monoklonala antikroppen mab 4E6 anv ndes Mercodia Oxidized LDL ELISA anv nder samma specifika monoklonala antikropp mAb 4E6 som Holvoet 9 10 anv nde i sina analyser Mercodia Oxidized LDL ELISA test ba
83. ntrols H L 2 Fl schchen 1000 pl Gefriergetrocknet Konzentrationen sind auf den Fl schchen angegeben Geben Sie 1000 pl Lagerung von rekonstituierten Controls 2 8 C max 1 Woche redstilliertes Wasser Lagerung von rekonstituierten Controls l nger als eine Woche pro Fl schchen erfordern eine Temperatur von 20 C inzu Enzyme Conjugate 11X Fl schchen 1 2 ml Zubereitung Peroxidasekonjugiertes monoklonales anti apoB der Maus siehe nachfolgend Enzyme Conjugate Buffer Fl schchen 12 ml Gebrauchsfertig Blauf rbung Assay Buffer Fl schchen 12 ml Gebrauchsfertig Rotf rbung Sample Buffer 4X Flasche 50 ml Mit 150 ml re Gelbf rbung destillertem Wasser Achtung Aufgrund der Lagerung bei 2 8 C kann es zu Aus verd nnen um die f llungen kommen Lassen Sie den Sample Buffer 4X auf sample buffer 1X Raumtemperatur kommen Solange sch tteln oder verwirbeln L sung herzustellen bis sich die Ausf llung wieder gel st hat Lagerung nach Verd nnung 2 8 C max 4 Wochen Wash Buffer 21X Flasche 50 ml Mit 1000 ml re Lagerung nach Verd nnung 4 Wochen bei 2 8 C destilliertem Wasser die wash buffer1X L sung herstellen Substrate TMB Flasche 22 ml Gebrauchsfertig Farblose L sung Achtung Lichtempfindlich Stop Solution Fl schchen 7 ml Gebrauchsfertig 0 5 M H SO 18 Vorbereitung der enzyme conjugate 1X L sung Vorbereitung der ben tigten enzyme conjugate 1X L sung durch mischen von Enzyme Conjugate 11X 1 10 mit
84. nung aktuel ler Testergebnisse benutzt werden 0 D 450 nm 0 5 0 T 1 10 100 mu l GRENZEN DES VERFAHRENS Wie bei allen diagnostischen Tests sollte auch hier eine endg ltige klinische Beurteilung nicht auf den Resultaten eines Einzeltests beruhen sondern erst nach Erhalt der Ergebnisse aller klinischen und Laborbefunde abgegeben werden Lipemic Icteric oder h molysierte Proben beeintr chtigen den Versuch nicht 22 ERWARTETE WERTE Gute Laborpraxis besagt dass jedes Labor seinen eigenen Wertebereich ermittelt Die folgenden Resultate k nnen als Richtlinie gelten bis das Labor gen gend eigene Daten gesammelt hat Die folgenden Ergebnisse wurden von 149 ambulanten zuf llig ausgew hlten Personen aus der Umgebung Stockholms in Schweden ermittelt Distribution of Oxidized LDL 6 00 Frequency 35 45 55 65 75 85 95 105 115 Oxidized LDL U L Oxidized LDL vs Total Cholesterol 125 e 100 at 3 8 75 3 e ZS 2 50 o e o 25 ed 0 r 0 00 2 00 Am 6 00 8 00 10 00 Total Cholesterol mmol L 23 ysnaq Die folgenden Ergebnisse wurden von 149 ambulanten zuf llig ausgew hlten Personen aus der Umgebung Stockholms in Schweden ermittelt Mittelwert Median Spannweite OxLDL U I 61 59 26 117 Chol HDL Verh ltnis 4 10 3 90 1 68 7 89 Beliebige Einheiten Siehe KALIBRIERUNG Messdaten Cholesterin mmol l und HDL mmol l Verteilung von oxidiertem LDL
85. nze chimiche pericolose e T utti i pazienti presi come campione potrebbero essere trattati come capaci di trasmetter infezioni Avvertimenti Questo kit contiene reagenti che possono essere infettivi Questo Kit contiene reagenti prodotti da componenti con sangue umano L origine dei materiali stata analizzata da analisi di immunit per l epatite B della superficie dell antigene anticorpi per il virus dell epatite C virus e per anticorpi per il virus dell HIV e sono stati trovati negativi Tuttavia tutte le precauzioni raccomandate per la manipolazione per i derivati del sangue devono essere osservati Si veda il riferimento alla Pubblicazione HHS no CDC 88 8395 o le guide corrispondenti a ciascuna nazione localit sulle procedure di sicurezza in laboratorio 56 MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI e Pipette for 25ul 50 100 200 e 1000 pl riutilizza le pipette in dotazione per l aggiunta il tampone per l enzima coniugato Substrate TMB e Stop Solution Beakers e cilindri per la preparazione di reagenti Acqua ridistillata Tubi per test con tappi 3 5 ml Lettore micro piastra 450nm filtro Piastra dello shaker La velocit raccomandata amp di 700 900 giri minuto movimento orbitale Micro piastra piano di lavaggio Apropriate dispositivo di miscelazione E 5 57 REAGENTI Ogni kit Mercodia Oxidized LDL ELISA contiene reagenti per 96 prove sufficienti per 40 campioni e una calibratura
86. nzyme Conjugate Buffer en suivant les indications du table ci dessous Lors de la pr paration solution d Enzyme Conjugate 1X pour une plaque enti re transf rer tout le tampon d Enzyme Conjugate Buffer dans le flacon d Enzyme Conjugate 11X M langez sans agiter Nobre de bandes Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 bandes 1 fiole 1 fiole 8 bandes 700 pl 7 0 ml 6 bandes 500 ul 5 0 ml 4 bandes 350 ul 3 5 ml Stockage apr s dilution temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant un mois COLLECTE ET MANIPULATION DES SP CIMENS Nous recommandons l utilisation de plasma EDTA frais avec le kit de test Mercodia Oxidized LDL ELISA Vous pouvez galement utiliser du plasma h parin ou du s rum Plasma Collectez le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l EDTA ou de l heparine comme anticoagulant et isolez le plasma Les chantillons peuvent tre stock s jusqu pedant au moins six mois une temp rature 80 C Evitez de les congeler et de les d congeler plusieurs fois S rum Collectez le sang par ponction veineuse attendez la coagulation puis isolez le s rum par centrifugation Les chantillons peuvent tre stock s jusqu pedant au moins six mois une temp rature 80 C Evitez de les congeler et de les d congeler plusieurs fois DILUTION DES CHANTILLONS Pr parez deux tubes pour chaque patient Chacun des chantillons doit tre dilu en deux tapes de mani
87. on the direct sandwich technique in which two monoclonal antibodies are directed against separate antigenic determinants on the oxidized apolipoprotein B molecule During incubation oxidized LDL in the sample reacts with anti oxidized LDL antibodies bound to microtitration well After washing which removes non reactive plasma components a peroxidase conjugated anti human apolipoprotein B antibody recognizes the oxidized LDL bound to the solid phase After a se cond incubation and a simple washing step that removes unbound enzyme labeled antibody the bound conjugate is detected by reaction with 3 3 5 5 tetramethylbenzidine TMB The reaction is stopped by adding acid to give a colorimetric endpoint then read spectrophotometrically WARNINGS AND PRECAUTIONS e For in vitro diagnostic use Not for internal or external use in humans or animals The content of this kit and their residues must not be allowed to come into contact with ruminating animals or swine e The Stop Solution in this kit contains 0 5 M H SO Follow routine precautions for handling hazardous chemicals e All patient samples should be handled as capable of transmitting infections Warning This kit contains reagents that may be infectious This kit contains reagents manufactured from human blood components The source of material have been tested by immunoassay for Hepatitis B surface antigen antibodies for Hepatitis C virus and for antibodies for HIV virus and found to
88. pu s de diluir 2 8 C durante 4 semanas agua bidestilada para preparar la soluci n de wash buffer 1X Substrate TMB vial 22 ml Listo para usar Soluci n incolora Atenci n Es sensible a la luz Stop Solution vial 7 ml Listo para usar 0 5 MH SO 44 Preparaci n de soluci n de la enzyme conjugate 1X Preparar el volumen necessario de soluci n de la enzyme conjugate 1X por diluci n del Enzyme Conjugate 11X 1 10 en Enzyme Conjugate Buffer seg n la siguinte tabla Si se usa toda la placa verter completamente el tamp n Enzyme Conjugate Buffer al vial Enzyme Conjugate 11X Mezclar suavemente N mero de tiras Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 tiras 1 vial 1 vial 8 tiras 700 ul 7 0 ml 6 tiras 500 ul 5 0 ml 4 tiras 350 ul 3 5 ml Conservaci n despu s de la diluti n 2 8 C durante un mes OBTENCI N Y MANIPULACI N DE MUESTRAS Se recomienda utilizar plasma fresco con EDTA como muestra para el Mercodia Oxidized LDL ELISA Tambi n puede utilizarse plasma con heparina y suero Plasma Recoger la sangre por venipunci n en tubos que contienen EDTA o heparina como anticoagulante y separar la fracci n de plasma Las muestras pueden conservarse a 80 C durante al menos seis meses Evitar la congelaci n y descongelaci n de forma repetida Suero Recoger la sangre por venipunci n dejar coagular y separar el suero por centrifugaci n Las muestras pueden conservarse a 80 C durante al menos seis
89. r 1 03 interval 0 94 1 13 79 80 Kalibrering Der findes p nuv rende tidspunkt ingen international reference Mercodia Oxidized LDL ELISA er kalibreret i relative arbitr rer enheder overfor en intern reference pr paration GARANTI De angivne ydeevnedata blev opn et ved af den angivne fremgangsm de Alle ndringer af remgangsm den der ikke anbefales af Mercodia AB kan p virke resultaterne og i dette tilf lde oph ver Mercodia AB alle garantier det v re sig udtrykkelige stiltiende eller lovbefalede herunder den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt form l I et s dant tilf lde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distribut rer ikke drages til ansvar or indirekte skader eller falgeskader ANV NDNING Mercodia Oxidized LDL ELISA r ett in vitro test f r kvantitativ best mning av humant oxiderat njursjukdomar SAMMANFATTNING OCH F RKLARING AV TESTET Idag anses omvandlingen av LDL till oxiderat LDL vara ett centralt steg i initieringen och utvecklingen av ateroskleros ett flertal arbeten har man visat att nativt LDL omvandlas till oxiderat LDL och att oxiderat LDL r den aterogena formen av LDL 1 5 Oxiderat L i monocytderiverade makrofager i aterosklerotiska plack men inte i friska art rer 6 LDL tas inte upp av makrofager via den klassiska Brown Goldstein LDL receptorn 7 LDL Low Density Lipoprotein i serum och plasma Lipoproteinbest mningar anv nds vid diag
90. r er bundet til mikrotitersbranden Efter vaskning tilsaettes de peroxidase konjugerede anti human apolipoprotein B antistoffer og efter den an den inkubation og en enkel vaskning der fjerner ubundet enzym maerket antistof registreres det bundne konjugat ved reaktion med 3 3 5 5 tetramethylbenzidin TMB Reaktionen stoppes ved at tils tte syre for at give et kolorimetrisk endepunkt der afl ses spektrofotometrisk ADVARSLER 0G FORHOLDSREGLER e Til in vitro diagnosticering Ikke til intern eller ekstern brug for mennesker eller dyr Indholdet af dette kit samt rester deraf m ikke komme i kontakt med dravtyggende dyr eller svin e Stop Solution i dette kit indeholder 0 5 M H SO Overhold almindelige forholdsregler for h ndtering af farlige kemikalier e Alle patientpraver skal h ndteres som potentielt smittefarlige Advarsel Kittet indeholder potentielt smittefarlige reagenser Kittet indeholder reagenser der er fremstillet af humane blodkomponenter Kildematerialet er blevet testet ved immunanalyse for hepatitis B overfladeantigen antistoffer mod hepatitis C virus og antistoffer mod HIV virus og er fundet negativt Men alle anbefalede forholdsregler for h ndtering af blodderivater skal overholdes Se HHS Publication no CDC 88 8395 eller tilsvarende lokale nationale retningslinjer for sikkerhedsprocedurer for laboratorier N DVENDIGE MEN IKKE MEDF LGENDE MATERIALER e Pipetter til 25ul 50 100 200 og 1000 ul rep
91. rminaciones de lipoprote nas se utilizan en el diagn stico y tratamiento de trastornos lip dicos como diabetes mellitus aterosclerosis y diversas enfermedades hep ticas y renales RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA Actualmente se considera que la conversi n oxidativa de las lipoprote nas de baja densidad LDL en lipoprote nas de baja densidad oxidadas LDL oxidadas es un acontecimiento clave en el proceso biol gico que inicia y acelera el desarrollo de la lesi n ateroscler tica temprana la estr a grasa 1 5 Estudios experimentales han demostrado que la LDL nativa se vuelve aterog nica cuando se transforma en LDL oxidada y que sta es m s aterog nica que la LDL nativa 1 5 La LDL oxidada se encuentra en macr fagos derivados de monocitos en lesiones ateroscler ticas pero no en arterias normales 6 La incorporaci n de LDL en los macr fagos no se produce a trav s del receptor cl sico de LDL de Brown Goldstein 7 Numerosos estudios 1 5 8 han establecido que la LDL el mayor portador de colesterol en la sangre primero debe transformarse en LDL oxidada para que pueda ser reconocida por los receptores scavenger o de LDL oxidada en macr fagos derivados de monocitos La uni n de LDL oxidada a los macr fagos es un paso necesario por el que la LDL oxidada induce la acumulaci n de colesterol en los macr fagos y por tanto los transforma en c lulas espumosas cargadas de l pidos 8 Holvoet y colaboradores 9
92. s Dun pau Note To prevent contamination between the conjugate and substrate separate pipettes are recommended INTERNAL QUALITY CONTROL Commercial controls and or internal plasma serum pools with low intermediate and high oxi dized LDL concentrations should routinely be assayed as samples and results charted from day to day It is good laboratory practice to record the following data for each assay kit lot number reconstitution dates of kit components OD values for the blank Calibrators and Controls CALCULATION OF RESULTS Computerized calculation The concentration of oxidized LDL is obtained by computerized data reduction of the absorbance for the Calibrators except for Calibrator O versus the concentration using cubic spline regression Multiply the concentration of the samples with the dilution factor e g x 6561 Manual calculation 1 Plot the absorbance values obtained for the Calibrators except Calibrator 0 against the Oxidized LDL concentration on a lin log paper and construct a calibrator curve 2 Read the concentration of the Controls and unknown samples from the calibrator curve 3 Multiply the concentration of the Controls and the samples with the dilution factor e g x 6561 Example of results Wells Identity A450 nm Conc mU l UI 1A B Calibrator 0 0 072 1C D Calibrator 1 0 185 1E F Calibrator 2 0 369 1G H Calibrator 3 0 664 2A B Calibrator 4 1 405 2C D Calibrator 5 2 469 2E F Control
93. serar sig p sandwich teknik d r oxiderat LDL i provet reagerar med den specifika antikroppen 4E6 bunden till mikrotiterplattans fasta fas Mercodia Oxidized LDL ELISA har anv nts av kliniska forskare i en rad uppm rksammade studier Hulthe och Fagerberg 14 fastst llde f rh llandet mellan subklinisk ateroskleros och cirkulerande niv er av oxiderat LDL genom att visa ett samband mellan niv erna av oxiderat LDL och intima media tjockleken och f rekomsten av plack i karotis och femoralis art rerna Sigurdardottir Fagerberg och Hulthe 15 hittade f rh jda niv er av oxiderat LDL hos pa med metaboliskt syndrom De fann dessutom att f rh jda niv er av oxiderat LDL hos pa rom korrelerade med liten LDL partikelstorlek Kopprasch et al 16 fann med metaboliskt synd f rh jda niv er av cirkulerande oxiderat LDL hos patienter med nedsatt glukostolerans Duntas Mantzou och Koutras 17 fann avsev rt f rh jda plasmaniv er av oxiderat LDL obehandlade patienter med hypotyreos Vid American Heart Association Scientific Sessions 2002 rapporterade Johnston et al ienter ienter GT hos 18 att plasmaniv er av oxiderat LDL var betydligt h gre hos patienter med instabil kransk rlssjukdom n hos friska kontrollpersoner En mycket viktig samtidig uppt ckt i denna studie var att inte fann n gon signi ikant skillnad mellan kolesterolniv erna hos patienter med instabi kransk rlssjukdom och
94. sured data Cholesterol mmol l and HDL mmol l Distribution of Oxidized LDL and Cholesterol HDL ratio Oxidized LDL Cholesterol HDL Patient Total un Ratio Quartile 1 Q1 26 49 1 68 3 13 22 149 14 8 Q2 50 59 1 68 3 13 10 149 6 7 Q3 60 69 1 68 3 13 5 49 3 4 Q4 70 117 1 68 3 13 0 149 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 3 21 3 86 71149 4 7 Q2 50 59 3 21 3 86 7 49 114 Q3 60 69 3 21 3 86 0 149 6 7 Q4 70 117 3 21 3 86 3 149 2 0 Quartile 3 Q1 26 49 3 87 4 79 71149 4 7 Q2 50 59 3 87 4 79 1149 74 Q3 60 69 3 87 4 79 1149 74 Q4 70 117 3 87 4 79 9 149 6 0 Quartile 4 Q1 26 49 4 80 7 89 1149 0 7 Q2 50 59 4 80 7 89 4149 2 7 Q3 60 69 4 80 7 89 71149 4 7 Q4 70 117 4 80 7 89 25 149 16 8 12 The following results were obtained from 147 ambulatory randomly selected individuals in the Stockholm area Sweden Mean Median Range OxLDL U I 61 59 26 117 LDL HDL ratio 251 2 36 0 55 5 56 Arbitrary units See CALIBRATION Measured data LDL mmol l and HDL mmol l Distribution of Oxidized LDL and LDL HDL ratio Oxidized LDL LDL HDL Patient Total U I Ratio Quartile 1 Q1 26 49 0 55 1 79 19 147 13 0 Q2 50 59 0 55 1 79 12 147 8 2 Q3 60 69 0 55 1 79 6 147 4 1 Q4 70 117 0 55 1 79 0 147 0 0 Quartile 2 Q1 26 49 1 79 2 33 10 147 6 8 Q2 50 59 1 79 2 33 13 147 8 8 Q3 60 69 1 79 2 33 10 147 6 8 Q4 70 117 1 79 2 33 3 147 2 0
95. t Association Scientific Sessions 2002 berichteten Johnston et al 18 dass die Plasmawerte von oxidiertem LDL bei Patienten mit instabilen Herzkranzgef erkran kungen im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen substantiell h her waren Am wichtigsten war dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Cholesterinwerten der Patienten mit instabilen Erkrankungen der Herzkranzgef arterien und den gesunden Kontrollpersonen gab Referenzen seite 93 DAS TESTPRINZIP Mercodia Oxidized LDL ELISA Assay ist ein enzymatischer zweiseitiger Immunoassay mit einer Festphase Er basiert auf der direkten Sandwich Technik bei der zwei monoklonale Antik rper gegen ein bestimmtes Antigen auf dem oxidierten Apolipoproteinmolek l B ausgerichtet werden W hrend der Inkubation reagiert oxidiertes LDL in der Probe mit anti oxidierten LDL Antik rper die an die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte gebunden sind Nach dem Waschen wobei die nicht reaktiven Plasmabestandteile entfernt werden erkennt ein peroxidase konjugierter Antihumanapolipoprotein B Antik rper das an der festen Phase gebundene oxidiertes LDL Nach einer zweiten Inkubation und einem einfachen Waschvorgang der die mit dem ungebundenen Enzym markierten Antik per entfernt wird das gebundene Konjugat durch Reaktion mi 3 3 5 5 Tetramethylbenzidin TMB nachgewiesen Die Reaktion wird durch Zugabe von S ure gestoppt um einen kolorimetrischen Endpunkt zu liefern der spektrophotometrisch abge
96. the P Ann Mertens Peter Verhamme Kris Bogaerts Guy Beyens Raymond Verhaeghe D sir Collen Erik Muls Frans de Werf 2001 Circulating Oxidized LDL Is Marker for Identifying Patients With Coronary Artery Disease Arterioscler Vasc Biol 21 844 848 P Satssen J M Van Cleemput J Collen D Vanhaecke J 1998 Oxidized low den sity lipoproteins in patients with transplant associated coronary artery disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 18 100 107 P Donck J Landeloos M Brouwers E Luijtens K Arnout J Lesaffre E Van renterghem Y Collen D 1996 Correlation between oxidized low density lipoproteins and ebrand factor in chronic renal failure Thromb Haemost 76 663 669 P Van Cleemput J Collen D Vanhaecke J 2000 Oxodized low density ein is a prognostik c marker of transplant associated coronary artery disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 20 698 702 Fagerberg B 2002 Circulating oxidized LDL is associated with subclinical ather osclerosis development and inflammatory cytokines AIR Study Arterioscler Thromb Vasc Biol 22 1162 1167 15 Sigurdardottir V Fagerberg B Hulthe J 2002 Circulating oxidized low density lipopro ein LDL is associated with risk factors of the metabolic syndrome and LDL size in clinically healthy 58 year old men AIR study Journal of internal Medicine 252 440 447 93 16 Kopprash S Pietzsch J Kuhlisch E Fuecker K Temelkova Kurktschiev T Hanefeld M
97. tion angivet p h tteglasets etiket Tills t 1000 ul Opbevaring efter rekonstituering 2 8 C for 1 uge redestilleret vand Opbevaring af rekonstitueret Calibrator i mere end en uge pr h tteglas bor ske ved 20 C Enzyme Conjugate11X Th tteglas 1 2 ml Klarg ring Peroxidas konjugeret fra mus monoklonalt anti apoB se nedenfor Enzyme Conjugate Buffer 1 heetteglas 12 ml Klar til brug Farvekodet bl Assay Buffer 1 heetteglas 12 ml Klar til brug Farvekodet r d Sample Buffer 4X 1 flaske 50 ml Fortynd med 150 Farvakodet gul ml redestilleret Bem rk De kan forekomme bundfald n r det opbevares ved vand for at lave 2 8 C Lad Sample Buffer 4X n stuetemperatur Omryst eller sample buffer 1X bland med votex blander intil bundfaldet er opl st opl sning Opbevaring efter fortyndning 2 8 C for 4 uger Wash Buffer 21X 1 flaske 50 ml Fortynd med 1000 Opbevaring efter fortyndning 2 8 C for 4 uger ml redestilleret vand for at lave wash buffer 1X opl sning Substrate TMB 1 heetteglas 22 ml Klar til brug Farvel s opl sning Bem rk Lysfolsom Stop Solution 1 heetteglas 7 ml Klar til brug 0 5MH SO 71 Forberedelse af enzyme conjugate 1X oplosning Forbered den p kr vede m ngde enzyme conjugate 1X opl sning ved at fortynde Enzyme Conjugate 11X 1 10 i Enzyme Conjugate Buffer i henhold til tabellen nedenfor Hvis der forberedes enzyme conjugate 1X opl sning til en hel plade h ld hele indeholdet af Enzyme Conjug
98. to ensure mixing 50 ul und 5 Sek gr ndlich sch tteln 50 ul Secouer pendant 5 secondes pour bien m langer 50 ul Agitar durante 5 segun dos para asegurar el mezclado 50 ul Scuotere per 5 secondi per assi curarsi che sia tutto mescolato 50 pl Ryst i 5 sekunder for sikre blanding 50 pl Skaka i 5 sekunder f r att se till att l sningen blandas Measure Auen Messung Auen Mesure de A450 Medir A4so Misura A450 Aflaes A450 Mat vid A450 31 3136 Revised 2009 06 17 X O Graf Tryckeri AB
99. uvieron usando el procedimiento indicado Cualquier cambio o modificaci n en el procedimiento no recomendado por Mercodia AB puede afectar los resultados en cuyo caso Mercodia AB declina cualquier responsabilidad y garant a acordada impl cita o expl cita incluso la garant a impl cita sobre la comerciabilidad e idoneidad para su uso Mercodia AB y sus distribuidores autorizados en tal caso no asumir n responsabilidades por dafios y perjuicios indirectos o consiguientes 53 54 USO PROPOSTO Mercodia Oxidized LDL ELISA kit inteso per essere usato per la misurazione quantitativa in vitro di lipoproteine ossidata a bassa densit L DL ossidato nel siero o nel plasma del sangue umano Le misurazioni della lipoproteina sono usate nelle diagnosi e nel trattamento di disordini lipidici come nel diabete melito atereosc RELAZIONE E SPIEGAZIONE DEL La conversione ossidativa di bassa densit delle lipoproteine LDL ossidato attualm biologico che comincia e accelera lo svilup adiposa 1 5 lerosi e varie malattie del fegato e renali TEST della lipoproteina LDL alla bassa densit ossidata ente considerata essere un evento chiave nel processo po della precoce lesione atereosclerotica la riga Studi sperimentali hanno dimostrato che LDL diventa aterogeno quando amp convertito al LDL ossidato e I LDL ossidato pi aterogeno del LDL nativo 1 5 L LDL ossidato si trova nei macrofagi non ac

Mercodia Oxidized LDL ELISA

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