proColon - Epigenomics AG
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1. Epi proColon Bis Reagent B 1 tube 860 ul Epi proColon Purification 1 1 bouteille 39 ml Epi proColon Purification 2 1 bouteille 16 ml Epi proColon Purification 3 1 bouteille 8 ml Epi proColon Purification 4 1 tube 1 6 ml 6 Instruments consommables et r actifs n cessaires mais non fournis Tubes Vacutainer EDTA Becton Dickinson N de r f rence 367525 S Monovette H matologie K EDTA 9 0 ml Sarstedt N de r f rence catalogue 02 1066 001 S Monovette 8 5 ml CPDA Sarstedt N de r f rence catalogue 01 1610 001 Eau pour la biologie mol culaire Tubes centrifuger de 50 ml en polypropyl ne base conique par ex Sarstedt N de r f rence 62 547 254 ou quivalent Tubes r action Safe Lock 0 5 ml par ex Eppendorf AG N de r f rence 0030 121 023 ou quivalent Page 5 sur 16 SR Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma pro colon Tubes r action Safe Lock 1 5 ml par ex Eppendorf AG N de r f rence 0030 120 086 ou quivalent Tubes r action Safe Lock 2 ml par ex Eppendorf AG N de r f rence 0030 120 094 ou quivalent Pointes filtre pour pipettes par ex VWR International GmbH 612 1430 KOEHK 0518 613 2658 ou quivalent Portoir pour tubes centrifuger de 50 ml et pour tubes centrifuger de 2 ml VWR International GmbH 50 mi N de r f rence 211 0200 2 mi N de r f rence 211 0213 ou quivalent Gan2. epr Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Avant d utiliser ce kit veuillez lire attentivement la notice et suivre pr cisement les instructions afin de garantir la fiabilit et la pertinence des r sultats des tests CF IFU 0002FR r v 6 tous droits r serv s mars 2011 Epigenomics AG M5 01 001 V 24 sal D a a e P g c n O m C SR j Pro colon Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Contenu 1 Informations importantes 2 Usage pr vu 3 Description du test 4 Principes technologiques fondamentaux 5 R actifs 6 Instruments consommables et r actifs n cessaires mais non fournis 7 Pr cautions 8 Stockage et stabilit des r actifs 9 R actifs du test et leur pr paration avant utilisation 9 1 Pr paration des r actifs du test 2 151 Pr paration de la solution Epi proColon Proteinase 9 1 2 Pr paration de la solution Epi proColon Carrier 9 1 3 Pr paration de la solution Epi proColon Bis Reagent A 9 2 Prise de sang 9 3 Pr paration du plasma 10 Protocole exp rimental 10 1 Lyse et extraction 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 10 1 1 D cong lation des chantillons de plasma 2 Lyse 3 Liaison de l ADN 4 Lavage de l ADN S Elution 6 Stockage de l ADN extrait 10 2 Conversion au bisulfite 10 2 1 Purification de l ADN bisulfit 10 2 2 Phase de liaison chimique 10 2 3 Premier lavage 10 2 4 Deuxi me lavage 10
3. soit compl tement dissous L Epi proColon Extraction 1 doit tre revenu temp rature ambiante avant de pouvoir tre utilis entre 18 et 25 C La couleur brune de la solution Bis Reagent Epi proColon est normale et n affecte en rien son efficacit 9 R actifs du test et leur pr paration avant utilisation 9 1 Pr paration des r actifs du test 9 1 1 Pr paration de la solution Epi proColon Proteinase Ajouter 860 ul d eau pour la biologie mol culaire dans le tube contenant Epi proColon Proteinase 2 M langer vigoureusement pendant 1 minute l aide du vortex Page 8 sur 16 SP pro cn PS CO on Pa e colon Notice d utilisation it de pr paration pour extraction d ADN de plasma M langer sur le vortex jusqu ce que tout le r actif soit dissous 9 1 2 Pr paration de la solution Epi proColon Carrier Ajouter 205 ul d Epi proColon Carrier Diluent dans le tube contenant l Epi proColon Carrier M langer vigoureusement l aide du vortex pendant au moins 2 minutes 9 1 3 Pr paration de la solution Epi proColon Bis Reagent A Ajouter 800 ul d eau dans le tube contenant l Epi proColon Bis Reagent A M langer vigoureusement l aide du vortex jusqu ce que le r actif soit partiellement dissous Ajouter de nouveau 800 ul d eau M langer vigoureusement pendant 3 min l aide du vortex M langer jusqu ce que tout le r actif soit dissous Remarque le r acti
4. un nombre identique de particules magn tiques dans chaque ADN extrait I M langer vigoureusement au vortex pendant 10 secondes les tubes Safe Lock PCR de 0 5 ml contenant la r action au bisulfite Centrifuger bri vement les tubes afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Transf rer l ensemble de la r action de d part dans un tube Safe Lock PCR de 2 0 ml Ajouter 1 ul de solution Epi proColon Carrier Ajouter 1 5 ml d Epi proColon Purification 1 Page 12 sur 16 SP pro colon TT colon Notice d utilisation it de pr paration pour extraction d ADN de plasma Remarque La solution Epi proColon Carrier peut tre avant son utilisation m lang e avec de l Epi proColon Purification 1 pour permettre de manipuler de plus grands volumes Ce m lange peut tre conserv jusqu 12 h temp rature ambiante Ajouter avec pr caution 10 ul de particules magn tiques Epi proColon resuspendues Remarque Une suspension homog ne des billes dans la suspension Epi proColon Magnetic Beads est indispensable pour une performance optimale Toute variation de la quantit de billes sp cifi e peut donner lieu des r sultats erron s N Fermer le couvercle du tube et m langer pendant 10 secondes vigoureusement l aide du vortex Mettre les tubes dans un thermomixer et laisser incuber pendant 60 min temp rature ambiante tout en agitant 1400 tr m Enlever les tubes du thermomixer et r gler la temp
5. 2 5 Troisi me lavage 10 2 6 S chage 10 2 7 lution 10 2 8 Stockage de l ADN trait au bisulfite 11 12 13 14 15 Contr le Qualit Limites du proc d Caract ristiques techniques R f rences Pour nous contacter O O O O0 O0 O0 O0 JO Ur Un ER HR W i Ni ni Si ii ni ni nn D D nn ni D ni ni l ON Cr Un Ur RO RE HE R D NN ON O Page 2 sur 16 Notice d utilisation ep Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma 1 Informations importantes Important avant d utiliser le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon les utilisateurs doivent se familiariser avec les composants du kit et lire attentivement les instructions Signification des symboles utilis s Veuillez suivre les instructions R f rence du Kit HERS Destin aux examens diagnostiques in vitro g g Num ro de lot Date de p remption Fabricant Temp rature de stockage Nombre de tests q EKE ls gt A conserver dans l obscurit prot ger du soleil Page 3 sur 16 CDI colon Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma 2 Usage pr vu Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon comprend des r actifs servant la pr paration d ADN provenant de plasma EDTA humain converti par un traitement au bisulfite et analys par PCR en temps r el des fins de diagnostic in vitro Les r
6. dans un tube Safe Lock PCR de 0 5 ml Le volume d lution est d environ 100 ul 10 1 6 Stockage de l ADN extrait L ADN ainsi extrait peut tre conserv une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant un maximum de 24 heures ou jusqu 3 jours une temp rature comprise entre 15 et 25 C 10 2 Conversion au bisulfite Remarque Ajouter toujours les r actifs dans l ordre donn Ne jamais m langer la solution Epi proColon Bis Reagent A avec la solution Epi proColon Bis Reagent B avant que celles ci ne soient ajout es l ADN Ne pas mettre les solutions Epi proColon Bis Reagent dissoutes dans la glace Ne pas transf rer de billes magn tiques dans la r action de bisulfite Pr parer la r action chimique au bisulfite dans un tube Safe Lock Eppendorf PCR de 0 5 ml Ajouter les composants suivants l ADN extrait en respectant l ordre donn I Ajouter 190 pl de la solution d Epi proColon Bisulfite Reagent A 2 Ajouter 30 pl de la solution d Epi proColon Bisulfite Reagent B Remarque Le volume total est d environ 320 pl Page 11 sur 16 SR ol 10n Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Fermer les tubes PCR de 0 5 ml et bien m langer l aide du vortex pendant 20 secondes Les tubes PCR de 0 5ml sont ensuite bri vement centrifug s afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Placer les tubes PCR sur la plaque chauffante du Mastercycler dans les gands
7. ml Centrifuger le plasma dans le tube centrifuger de 15 ml pendant 12 min 1350 150 g Au moyen d une nouvelle pipette Pasteur usage unique transf rer 3 5 ml de plasma du tube centrifuger de 15 ml dans un tube centrifuger en polypropyl ne de 50 ml base conique A la fin de cette proc dure commencez l extraction de l ADN avec le kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon Le plasma peut tre conserv jusqu 18 heures une temp rature comprise entre 2 et 8 C ou jusqu 7 jours une temp rature comprise entre 15 et 25 C Page 9 sur 16 SR Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma j Pro colon 10 Protocole exp rimental 10 1 Lyse et extraction 10 1 1 D cong lation des chantillons de plasma uniquement en cas d utilisation d chantillons pr alablement congel s Laisser revenir le plasma congel temp rature ambiante pendant 30 min 10 1 2 Lyse Ajouter dans un tube de 50 ml les l ments suivants 3 5 ml de plasma sanguin ou d Epi proColon Positive Control ou d Epi proColon Negative Control 3 5 ml d Epi proColon Extraction 1 5 ul de la solution d Epi proColon Carrier 20 yul de la solution d Epi proColon Proteinase Le volume total est d environ 7 ml Remarque Agiter bri vement le tube de solution Epi proColon Extraction 1 avant utilisation pour v rifier la pr sence de pr cipit s En pr sence de pr cipit s suivre les in
8. rature du thermomixer sur 55 C Centrifuger bri vement les tubes afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Placer les tubes dans un portoir magn tique et attendre 2 min jusqu ce que les particules magn tiques aient form un culot 2 A Vaide d une nouvelle pipette pr lever autant de surnageant que possible 10 2 3 Premier lavage Retirer les tubes de 2 ml du portoir magn tique et les placer dans un portoir non magn tique Ajouter 300 ul d Epi proColon Purification 2 Fermer le couvercle du tube et m langer bri vement au vortex afin de resuspendre les particules magn tiques Centrifuger bri vement les tubes afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Placer les tubes dans un portoir magn tique et attendre 2 min jusqu ce que les particules magn tiques aient form un culot Enlever tout le surnageant l aide d une pipette 10 2 4 Deuxi me lavage R p ter les tapes 1 6 d crites dans le paragraphe 10 2 3 10 2 5 Troisi me lavage Enlever les tubes de 2 mil du portoir magn tique et les placer dans un portoir non magn tique Ajouter 300 ul d Epi proColon Purification 3 Fermer le couvercle du tube et m langer bri vement l aide du vortex afin de resuspendre les particules magn tiques Centrifuger bri vement les tubes afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Placer les tubes dans un portoir magn tique et attendre 2 min jusqu ce que les particule
9. suspension avec les particules magn tiques dans un tube Safe Lock de 2 0 ml avec une pipette Pasteur usage unique Centrifuger l g rement les tubes de 2 ml afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle du tube Placer les tubes dans un portoir magn tique Attendre 2 min pour permettre aux particules magn tiques de former un culot A l aide d une pipette liminer autant que possible le surnageant Prendre soin de ne pas enlever des particules magn tiques Centrifuger pendant 10 secondes 1000 150 g Placer les tubes dans un portoir magn tique Attendre 2 min pour permettre aux particules magn tiques de former un culot et liminer les r sidus de solution de lavage 10 1 5 Elution Transf rer les tubes dans un portoir non magn tique Ajouter 100 ul d Epi proColon Extraction 4 dans chacun des tubes et m langer vigoureusement l aide du vortex jusqu ce que toutes les particules magn tiques soient compl tement en suspension Placer les tubes dans un thermomixer et incuber pendant 15 min une temp rature de 65 2 C tout en agitant 1400 tr m 4 Centifuger l g rement les tubes afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Placer les tubes dans un portoir magn tique Attendre 2 min pour permettre aux particules magn tiques de former un culot Au cas o des particules magn tiques se trouveraient encore dans le surnageant prolonger le temps d attente Transf rer tout le surnageant
10. une substitution sp cifique de chaque cytosine non m thyl e Les bloqueurs et les sondes utilis s lors d une PCR ult rieure reconnaissent ces modifications de base et font la distinction entre les s quences m thyl es et non m thyl es 4 Principes technologiques fondamentaux L extraction de l ADN g nomique du plasma d un patient consiste lier l ADN g nomique circulant des petites particules magn tiques qui seront ensuite s par es du plasma l aide d un aimant Pour liminer les impuret s restantes sur les particules magn tiques plusieurs lavages seront effectu s Durant la phase d lution l ADN purifi sera s par des particules magn tiques par l utilistion d un tampon d lution L ADN g nomique lu est ensuite trait au bisulfite Lors de ce traitement chimique les cytosines non m thyl es de l ADN seront modifi es de mani re sp cifique Le traitement au bisulfite de l ADN est la m thode de r f rence pour analyser l ADN m thyl Etant donn que la s quence de l ADN est pr serv e cette m thode permet d effectuer diverses applications pour analyser cette matrice La transformation est bas e sur l addition nucl ophile d un ion bisulfite une cytosine et sur la r action de d samination r sultante lors de laquelle se forme du sulfonate d uracile tandis que la cytosine m thyl e la 5 m thyl cytosine n est pas d samin e et reste donc identique Une transformation tot
11. ADN de plasma Epi proColon a t tablie en combinaison avec le kit de PCR en temps r el Epi proColon M5 01 002 Pour de plus amples informations veuillez lire le mode d emploi du kit de PCR en temps r el Epi proColon 14 R f rences l De Vos T et al Circulating methylated SEPT9 DNA in Plasma is a Biomarker for Colorectal Cancer Clinical Chemistry 55 7 1337 46 2009 2 Lofton Day C et al DNA methylation biomarkers for blood based colorectal cancer screening Clinical Chemistry 54 2 414 423 2008 Gruetzmann R et al Sensitive Detection of Colorectal Cancer in Peripheral Blood by Septin 9 DNA Methylation Assay PLoS ONE Volume 3 Issue 11 e3759 2008 4 Model F et al Identification and validation of colorectal neoplasia specific methylation markers for accurate classification of disease Mol Cancer Res 5 153 163 2007 Page 15 sur 16 ep colon Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma 15 Pour nous contacter Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon est fabriqu par Epigenomics AG Kleine Pr sidentenstrasse 1 10178 Berlin Allemagne Avec l utilisation des composants de Chemagen Biopolymer Technologie AG Arnold Sommerfeld Ring 52499 Baesweiler Allemagne Pour obtenir de plus amples informations et pour toute assistance veuillez envoyer un courriel support proauets epigenomics com ou appelez au num ro suivant 49 30 243 45 222 Page 16
12. actifs du Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon permettent l extraction de l ADN la conversion de l ADN par le bisulfite et la purification de ce m me ADN bisulfit Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon a t valid pour une utilisation avec le Kit de PCR en temps r el Epi proColon M5 01 002 3 Description du test Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon est utilis pour l extraction d ADN partir de 3 5 ml de plasma et pour convertir ensuite cet ADN purifi au moyen de bisulfite Apr s un dernier lavage l ADN est pr t tre utilis pour l analyse du pattern de m thylation par PCR en temps r el Le principe de d tection de l ADN m thyl comprend trois grandes tapes tout d abord un chantillon de plasma est recueilli partir de sang total en utilisant les m thodes standards La m thylation de l ADN se produit principalement au niveau de dinucl otides CpG un nucl otide de cytosine suivi par un nucl otide de guanine L ADN plasmatique est extrait en isolant les acides nucl iques au moyen de particules magn tiques L ADN ainsi extrait est ensuite chimiquement modifi au moyen de bisulfite de sodium afin de d tecter la m thylation de l ADN Au cours de ce traitement chimique la cytosine non m thyl e d un dinucl otide CpG est transform e en uracile alors que la cytosine m thyl e reste inchang e Ceci conduit
13. ale de la cytosine non m thyl e ainsi qu un faible taux de d gradation de l ADN apr s le traitement sont des param tres essentiels pour permettre une mesure sensible de la m thylation de l ADN Une d naturation incompl te avant traitement ainsi que des conditions chimiques trop rigoureuses durant la r action ont t identifi es comme les principales sources d erreurs de cette m thode Page 4 sur 16 Notice d utilisation e DI En it de pr paration pour extraction d ADN de plasma Les diff rentes tapes du protocole maintiennent l ADN sous forme simple brin et r unissent les conditions chimiques id ales afin de permettre une conversion compl te par le bisulfite un rendement d ADN important et une faible d gradation de l ADN modifi Apr s purification de l ADN par liaison aux particules magn tiques et limination des impuret s r siduelles par lavage l ADN est pr t tre utilis pour les analyses ult rieures 5 R actifs Le kit contient des r actifs permettant 24 pr parations d ADN plasmatique Composants R cipients Volumes Epi proColon Extraction 1 1 bouteille 90 ml Epi proColon Extraction 2 2 bouteilles chacune 130 ml Epi proColon Extraction 3 1 bouteille 39 ml Epi proColon Extraction 4 2 tubes chacun 1300 ul Epi proColon Magnetic Beads 2 tubes 1100 ul Epi proColon Carrier 1 tube Epi proColon Carrier Diluent 1 tube 210 pl Epi proColon Proteinase 1 tube Epi proColon Bis Reagent A 3 tubes
14. e 14 sur 16 CDI colon Notice d utilisation Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma 12 Limites du proc d Ce produit est valid pour une utilisation avec du plasma EDTA humain Toute utilisation de ce produit avec d autres chantillons biologiques n est ni valid e ni conseill e Ce produit est valid pour une utilisation avec le kit de PCR en temps r el Epi proColon M5 01 002 D autres applications n ont pas t d montr Afin d viter toute contamination entre les chantillons des patients nous vous conseillons d utiliser des pipettes usage unique et ou des pointes de pipettes usage unique Les chantillons h molys s ne peuvent pas tre utilis s car l effet de l h molyse sur le test est inconnu 13 Caract ristiques techniques Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon a t test en combinaison avec le kit de PCR en temps r el Epi proColon M5 01 002 avec des r actifs de contr le provenant du kit de contr le de proc dure Epi proColon M5 01 003 avec des chantillons techniques constitu s d ADN tamponn avec des m langes de plasma EDTA humain et avec des chantillons de plasma individuels Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon permet d obtenir de l ADN converti par bisulfite qui dans plus de 99 des cas convient l analyse par PCR en temps r el La performance du Kit de pr paration pour extraction d
15. e Epi proColon M5 01 003 Page 6 sur 16 pro col In NILEN I LS Ion Notice d utilisation SP it de pr paration pour extraction d ADN de plasma 7 Pr cautions Toujours porter une blouse de laboratoire et des gants usage unique Pour le lavage des surfaces contamin es utiliser de l eau Epi proColon Extraction 1 contient de l isothiocyanate de guanidine x R20 21 22 32 52 53 S13 36 37 S61 Epi proColon Extraction 2 contient du sesquiol ate de sorbitan du FA x perchlorate de sodium et de l thanol R9 11 22 S13 S16 Epi proColon Extraction 3 contient du sesquiol ate de sorbitan du FA E4 perchlorate de sodium et de l thanol R9 11 22 S13 16 Epi proColon Purification 1 contient du sesquiol ate de sorbitan du FA x perchlorate de sodium et de l thanol R9 11 22 S7 16 Epi proColon Purification 2 contient de l thanol R11 S7 16 Epi proColon Purification 3 contient de l thanol R11 S7 16 Epi proColon Proteinase R36 3 7 38 42 43 S22 24 25 37 45 Epi proColon Carrier Diluant contient de l isothiocyanate de guanidine R20 21 22 32 52 53 S13 36 37 61 Epi proColon Bis Reagent A contient du sulfite de sodium et du bisulfite de sodium R22 31 41 S26 39 Epi proColon Bis Reagent B contient du trolox de l alcool t trahydrofurfurylique R36 S39 Epi proColon Extraction 4 Epi proColon Purification 4 Epi proColon Magnetic Beads et Epi proColon Carrier ne con
16. e protection des yeux du visage appropri S 45 En cas d accident ou de malaise appeler directement le m decin si possible montrer cette tiquette S 61 viter tout rejet dans l environnement Avant emploi se r f rer aux instructions sp cifiques et consulter les fiches de donn es de s curit 8 Stockage et stabilit des r actifs AN d ADN de plasma Epi proColon dans l obscurit une temp rature 250 er Entreposer tous les r actifs du Kit de pr paration pour extraction 18 C ambiante situ e entre 18 et 25 C En cas d entreposage plus long jusqu 3 mois conserver le 15 C Carrier dissous la Proteinase ainsi que le Bis Reagent A sous forme d aliquots une temp rature comprise entre 25 C 15 et 25 C Eviter d alterner les cycles de cong lation et de d cong lation Le Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Epi proColon reste stable jusqu la date de p remption indiqu e condition qu il soit entrepos et manipul conform ment aux indications Ne pas utiliser les consommables au del de cette date Ne pas m langer les composants provenant de Kit de diff rents lots Remarque au cas o l Epi proColon Extraction 1 contient des pr cipit s proc dez de la mani re suivante Faire chauffer l Epi proColon Extraction 1 dans un bain marie 50 5 C pendant 10 min et agiter doucement R p ter l tape pr c dente et agiter nouveau jusqu ce que le pr cipit
17. f Epi proColon Bis Reagent A n est pas tr s soluble Il peut donc tre chauff doucement 45 55 C 9 2 Prise de sang Pour effectuer la prise de sang utiliser les tubes Vacutainer EDTA S Monovette H matologie 9 0 ml K EDTA ou S Monovette 8 5 ml CPDA Ne pas congeler les chantillons de sang La pr paration du plasma peut tre r alis e jusqu 24 heures apr s la prise de sang si l chantillon sanguin a t conserv de fa on continue une temp rature comprise entre 2 et 8 C Si les tubes S Monovette 8 5 ml CPDA sont utlis s les chantillons de sang peuvent tre conserv jusqu 48 heures une temp rature comprise entre 2 et 25 C 9 3 Pr paration du plasma Enlever le frein de la centrifugeuse pour viter la rupture des couches cellulaires Centrifuger le sang dans les tubes Vacutainer ou S Monovette 1350 150 g pendant 12 min Au cas o la centrifugeuse indiquerait la vitesse de rotation en tour par minute tr min la valeur correspondante en g doit tre v rifi e dans le tableau de conversion situ dans le mode d emploi de la centrifugeuse fourni par le fabricant Retirer le tube de la centrifugeuse Tout chantillon fortement h molytique plasma de couleur rouge brillant ne doit pas tre utilis Dans ce cas il faut refaire une nouvelle prise de sang Utiliser une pipette Pasteur usage unique pour transf rer le plasma du tube de pr l vement dans un tube centrifuger de 15
18. puits Programmer le Mastercycler conform ment au tableau 1 Remarque Afin d viter une vaporation des r actifs il est important de faire chauffer le couvercle du Mastercycler 105 C pendant l ensemble du programme du thermocycleur L ADN modifi peut rester dans le Mastercycler durant la nuit sans pertes d efficacit Ne pas congeler le contenu des tubes PCR Tableau 1 Programme du thermocycleur pour la conversion au bisulfite tape n tape Temps Temp rature 1 D naturation initiale 5 min 96 C 2 Incubation 25 min 50 C 3 D naturation 5 min 96 C Incubation 85 min 1h 25 min 50 C 5 D naturation 5 min 96 C 6 Incubation 295 min 4h 55 min 50 C 7 Conservation lt 14h 20 C 10 2 1 Purification de l ADN bisulfit Pr parer les tubes suivants pour chaque chantillon Un tube Safe Lock PCR de 2 ml par chantillon pour les diff rents lavages Un tube Safe Lock PCR de 1 5 ml par chantillon pour l lution 10 2 2 Phase de liaison chimique Remarque Le rendement de l ADN obtenu apr s le lavage d pend en tr s grande partie de la quantit ad quate de particules magn tiques ajout e aux r actifs de d part M langer vigoureusement l aide du vortex pendant 30 secondes pour resuspendre les particules magn tiques Epi proColon R p ter cette derni re tape resuspension des particules magn tiques Epi proColon apr s chaque sixi me chantillon afin de garantir la pr sence d
19. s magn tiques aient form un culot Enlever tout le surnageant au moyen d une pipette bN Centrifuger les tubes 1 000 150 g pendant 30 secondes pour faire tomber les gouttelettes du couvercle Page 13 sur 16 ep colon Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Placer les tubes dans un portoir magn tique et attendre 2 min jusqu ce que les particules magn tiques aient form un culot Enlever le reste du surnageant l aide d une pipette 10 2 6 S chage l Placer les tubes couvercles ouverts dans le thermomixer pr chauff 55 2 C et laisser incuber cette temp rature pendant 5 min Attention Ne pas laisser s cher trop longtemps Un temps d incubation plus long peut provoquer une perte de rendement de l ADN obtenu 2 Enlever les tubes de 2 ml du thermomixer et les placer dans un portoir non magn tique 10 2 7 lution l Ajouter 55 ul d Epi proColon Purification 4 et m langer bri vement sur le vortex afin d obtenir une resuspension des particules magn tiques 2 Placer les tubes dans le thermomixer et laisser incuber 55 2 C tout en agitant 1400 tr m pendant 15 min Centrifuger bri vement les tubes afin de faire tomber les gouttelettes du couvercle Placer les tubes dans un portoir magn tique et attendre 2 min jusqu ce que les particules magn tiques aient form un culot Au cas o des particules magn tiques se trouveraient encore dans le s
20. structions de la Remarque de la Section 8 s M langer le tube l aide du vortex pendant 10 secondes et mettre le tube pendant 10 min au bain marie une temp rature de 56 2 C 10 1 3 Liaison de l ADN Sortir les tubes de 50 ml du bain marie et ajouter les l ments suivants dans l ordre indiqu 70 ul d Epi proColon Magnetic Beads resuspendu juste avant en m langeant pendant 30 secondes au vortex 10 ml d Epi proColon Extraction 2 M langer vigoureusement pendant 10 secondes au vortex b Incuber temp rature ambiante les tubes de 50 ml en homog n isant au moyen d un agitateur rotatif pendant 60 5 min Remarque Une suspension homog ne de billes dans la suspension Epi proColon Magnetic Beads est indispensable pour une performance optimale Toute variation de la quantit de billes sp cifi e peut donner lieu des r sultats erron s 10 1 4 Lavage de l ADN Placer les tubes de 50 ml dans le portoir magn tique et attendre 5 min pour permettre aux particules magn tiques de former un culot Eliminer le surnageant Assurez vous que le surnageant soit compl tement enlev Ajouter 1 5 ml d Epi proColon Extraction 3 et m langer vigoureusement pendant 10 secondes au vortex Veiller ce que les particules magn tiques soient nouveau compl tement en suspension Page 10 sur 16 Notice d utilisation pro colon Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma Transf rer la
21. sur 16
22. tiennent aucune substance dangereuse pour la sant Phrases de risque R Explications R 9 Peut exploser si m lang avec des mati res combustibles R 10 Inflammable R 11 Facilement inflammable R 20 21 22 Nocif par inhalation par contact avec la peau et en cas d ingestion R22 Toxique en cas d ingestion R 31 Au contact d un acide d gage un gaz toxique R 32 Au contact d un acide d gage un gaz tr s toxique R 36 Irritant pour les yeux R 36 37 38 irritant pour les yeux les voies respiratoires et la peau R 41 risques de l sions oculaires graves R 42 43 Peut entra ner une sensibilisation par inhalation et par contact avec la peau R 52 53 Nocif pour les organismes aquatiques Peut entra ner des effets n fastes long terme pour l environnement aquatique Page 7 sur 16 CDI colon Kit de pr paration pour extraction d ADN de plasma S Explications Phrases de s curit S 7 Conserver le r cipient soigneusement ferm S 13 Conserver l cart des aliments et boissons y compris ceux pour animaux S 16 Conserver l cart de toute flamme ou source d tincelles Ne pas fumer S 22 Ne pas respirer les poussi res S 24 25 viter le contact avec la peau et les yeux S 26 En cas de contact avec les yeux laver imm diatement l eau courante et consulter un ophtalmologiste S 36 37 Porter un v tement de protection et des gants appropri s S 37 Porter des gants appropri s S 39 Porter un appareil d
23. ts usage unique S parateur magn tique chemagic Stand 50 k type B Chemagen N de r f rence 303 S parateur magn tique chemagic Stand 2 x 12 Chemagen N de r f rence 300 Agitateur SB 2 Carl Roth GmbH Y549 1 avec plaque de rotation Carl Roth GmbH Y553 1 ou quivalent Bain marie Gesellschaft f r Labortechnik GmbH GFL Type 1002 N de r f rence 163 9905902 ou quivalent Vortex VWR International GmbH N de r f rence 444 1372 ou quivalent Thermomixer comfort N de r f rence 5355 000 011 avec bloc chauffant pour s chage pour tube r action 2 ml Eppendorf AG N de r f rence 5362 000 019 ou quivalent Portoir flottant Rotilabo pour tubes centrifuger de 50 ml Carl Roth GmbH N de r f rence P201 1 ou quivalent Jeu de pipettes Eppendorf R f rence 0 1 2 5 ul 0 5 10 ul 10 100 ul 100 1000 y Eppendorf AG ou quivalent Pipette Pasteur usage unique de 2 3 ml Carl Roth GmbH N de r f rence FAS56 1 ou quivalent Pipette Pasteur usage unique 6 ml VWR International GmbH N de r f rence 612 4464 ou quivalent Multipette Plus Eppendorf AG N de r f rence 4981 000 019 ou quivalent Mastercycler Eppendorf AG N de r f rence 5331 000 018 avec bloc chauffant pour Tubes r action de 0 5 ml ou quivalent Centrifugeuse 5417 R Eppendorf AG N de r f rence 5407 000 317 ou quivalent Kit de contr le de proc dur
24. urnageant prolonger le temps d attente Transf rer l ensemble de l luat dans une plaque multi puits Alternativement on pourra utiliser une rang e de 8 tubes ou des tubes r actions pour PCR ou encore des tubes Safe Lock de 1 5ml 10 2 8 Stockage de l ADN trait au bisulfite Lorsque l ADN extrait et trait au bisulfite n est pas utilis imm diatement il peut tre conserv jusqu 3 jours une temp rature comprise entre 15 et 25 C ou une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant un maximum de 24 heures 11 Contr le Qualit Le kit de contr le de proc dure Epi proColon M5 01 003 comprend des contr les Epi proColon Positive et Negative Control Ces contr les doivent tre ffectu s lors de chaque test afin de controler le bon d roulement du processus et de garantir la validit des r sultats Les valeurs obtenues pour le test de contr le Epi proColon Positive N gative Control doivent tre dans les limites de validit sp cifi es dans la Notice d utilisation du kit de PCR en temps r el Epi proColon M5 01 002 Si un des contr les se situe en dehors des limites de validit les r sultats du test aff rent ne sont pas valid s et ne peuvent pas tre pris en compte Tous les patients concern s par ce test devront tre test s une nouvelle fois Si les proc dures de Contr le Qualit au sein de votre laboratoire exigent des v rifications plus fr quentes respectez ces instructions Pag
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