VWF & Propeptide Assay
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1. 403569 Micropuits barrettes de micropuits noirs fond plat rev tus d anticorps sp cifiques du VWF code couleur jaune ou du propeptide code couleur vert Contiennent du mat riel d origine murine et bovine Pr t 403567 l emploi Les barrettes de micropuits sont enferm es dans des sachets alu refermables Conserver entre 2et8 C 403583 Solution de lavage concentr e 5X solut tampon de phosphate contenant du Tween 20 et du ProClin 300 0 05 96 Diluer l eau d sionis e ou distill e avant usage Conserver entre 2 et 8 C 403607 Peroxydase de raifort marqu e la streptavidine 200X peroxydase de raifort marqu e la streptavidine dans un stabilisant Dilution obligatoire dans le diluant avant usage Conserver entre 2 et 8 C 403589 Diluant solut tampon de phosphate contenant de l albumine de s rum bovin et ProClin 300 0 05 96 Pr t l emploi Conserver entre 2 et 8 C 403582 talon pool de plasma humain normal Exclusivement usage unique Les valeurs assign es se trouvent dans le Analysis Software Diluer dans le diluant avant usage Conserver x 15 C 403615 Anticorps de d tection du VWF 200X anticorps monoclonal murin biotinyl avec ProClin 300 0 05 96 Diluer dans le diluant avant usage Conserver entre 2 et 8 C 403599 Anticorps de d tection du propeptide 200X anticorps monoclonal murin biotinyl avec ProClin 300 0 05 Diluer dans le diluant avant usage Conserver en2. rents en bonne sant non fumeurs et non m dicament s dont l ge est compris entre 18 et 36 ans La solution talon m re est affect e d une valeur VWF et propeptide par dosage selon SSC ISTH Secondary Coagulation Standard Lot 3 Le SSC ISTH Secondary Coagulation Standard Lot 3 a t affect d un niveau d antig ne VWF de 106 Ul dl Le SSC ISTH Secondary Coagulation Standard Lot 3 n a pas t affect d un niveau de propeptide Comme il n existe aucune norme reconnue sur le plan international pour la mesure des propeptides et comme il a t prouv que le rapport propeptide VWF moyen chez les donneurs normaux est proche de 1 0 GTI Diagnostics a affect en interne le SSC ISTH Secondary Coagulation Standard Lot 3 d un niveau de propeptide de 106 U dl gal son niveau VWF Les valeurs de VWF et propeptide affect es la solution talon m re sont sp cifiques des lots et apparaissent dans l Analysis Software fourni CONTR LE QUALIT Tous les talons les contr les et les chantillons sont dos s en double Les unit s de fluorescence relative RFU de chaque puits doivent tre similaires Le 96 de diff rence entre les r plicats des talons A D des contr les et des chantillons doit tre 2096 Le dosage VWF amp Propeptide Assay utilise deux contr les positifs contr le positif haut et contr le positif bas Le contr le positif haut est dilu de mani re ce que les unit s de fluorescence relative se sit
3. 2ml 6 ml Diluer l anticorps de d tection de propeptide PDA dans le diluant VPD comme indiqu dans le tableau suivant Le PDA sera ajout dans tous les micropuits propeptide Barrettes 2 1x8 4 1x8 12 1x8 PDA Gu 10 ul 30 ul VPD 1 2 ml 2 ml 6 ml 303292 IFUFR REV C 17 TAPE DE LAVAGE a Aspirer ou d canter le contenu de chaque puits et absorber avec du papier absorbant b Ajouter 300 yl de solution de lavage de travail C Aspirer ou d canter d Reprendre les tapes b c pour 3 lavages au total e D canter vigoureusement pour liminer toute la solution de lavage r siduelle Retourner sur du papier absorbant pour viter le dess chement REMARQUE Il est important de retirer compl tement toute la solution de lavage apr s le lavage final 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Barrettes 4 1x8 8 1x8 24 1x8 Ajouter 50 ul d anticorps de d tection de VWF VDA dans chaque puits de la plaque VWF code couleur jaune Ajouter 50 ul d anticorps de d tection de propeptide PDA dans chaque puits de la plaque Propeptide code couleur vert Fermer herm tiquement les micropuits avec un scellant pour plaques et incuber pendant 15 minutes dans un bain marie ou un incubateur 37 C Diluer la peroxydase de raifort marqu e la streptavidine VPC dans le diluant VPD comme indiqu dans le tableau suivant Utiliser un r cipient en po
4. au fond du tube Conservation des chantillons 1 Le plasma doit tre conserv temp rature ambiante et dos dans les 4 heures qui suivent OU divis en aliquotes et congel 15 C ou moins jusqu utilisation 2 Le plasma ou l talon congel devra tre d gel 37 puis incub 37 C pendant 10 minutes de plus avant usage pour permettre la solubilisation ad quate des antig nes Un bain marie de 37 C ou un incubateur sec 37 C pourra tre utilis Le plasma d congel devra tre conserv temp rature ambiante et dos dans les 4 heures qui suivent MODE OP RATOIRE Mat riel fourni Il est possible que les tubes contiennent plus de r actif que ce qui est indiqu sur l tiquette Veiller mesurer le r actif avec un dispositif appropri en effectuant les dilutions Bo te A 303296 1 6 x tubes d talon de 100 ul VWF amp Propeptide Assay 4 303292 IFUFR REV C Bo te B 303297 12 1x8 barrettes de micropuits noirs pour la d tection de VWF code couleur jaune avec son support 12 1 x 8 barrettes de micropuits noirs pour la d tection de propeptide code couleur vert avec son support 3 x 50 ml de diluant 1 x 125 ml de solution de lavage concentr e 5X 1 x 40 yl d anticorps de d tection de VWF 1 x 40 ul d anticorps de d tection de propeptide 1x75 yl de peroxydase de raifort marqu e la streptavidine 1 x 14 ml de substrat A 1x2mlde substrat B 10 1x14 ml de soluti
5. 0 4 10 0 1 0 25 0 1 0 25 0 Limite de d tection et intervalle de dosage La limite de d tection est de 0 021 Ul dl pour le VWF et de 0 021 U dl pour les propeptides et elle est confirm e sur chaque lot de trousses Si un chantillon est dos une dilution 1 200 la limite inf rieure de l intervalle de dosage est de 4 Ul dl VWF ou 4 de U dl propeptide Il est sugg r que pour tout chantillon avec des valeurs d antig ne lt 6 Ul dl de VWF ou lt 6 U dl de propeptide le dosage soit r p t en utilisant une dilution d chantillon de 1 20 Lorsqu un chantillon est dos une dilution de 1 20 la limite inf rieure de l intervalle de dosage est de 0 42 Ul dl VWF ou de 0 42 U dl propeptide mais le manuel Analysis Software signalera ces r sultats sous la forme 1 Ul dl VWF ou 1 U dl propeptide Il n y a aucun sens clinique signaler des valeurs d antig ne 1 Ul dl VWF ou 1 U dl propeptide La limite sup rieure de l intervalle de dosage d pend du lot sp cifique de la solution talon m re utilis e dans le dosage mais est au moins de 273 Ul dl VWF ou de 273 U dl propeptide Comparaison des m thodes comparaison du dosage VWF amp Propeptide Assay au dosage ASSERACHROM VWF Ag de Diagnostica Stago Trois tudes s par es ont t effectu es dans ces tudes les valeurs d antig ne obtenues l aide du dosage VWF amp Propeptide Assay ont t compar es celles d un do
6. 19 U dl pour tous les groupes sanguins Chaque laboratoire devra d terminer son propre intervalle normal pour le propeptide SEUIL DE COUPURE CLINIQUE Les chantillons issus des populations suivantes ont t valu s l aide du dosage VWF amp Propeptide Assay dans le cadre de deux tudes cliniques 115 patients VWD de type 1 diagnostiqu s sur la base du taux de VWF antig ne de l activit du cofacteur de la ristoc tine et des ant c dents h morragiques ont t test s et 23 patients VWD de type 1 avec une clairance augment e du VWF Type 1c diagnostiqu s sur la base du taux de VWF antig ne de l activit du cofacteur de la ristoc tine des ant c dents h morragiques et de la pr sence d une mutation ponctuelle ayant pr c demment montr une augmentation de la clairance de VWF L analyse de la courbe ROC Receiver operator characteristics a permis de d terminer le seuil de coupure diagnostique pour la clairance augment e de VWF en fonction des valeurs pour le rapport Propeptide VWF A partir de l analyse ROC un seuil de coupure de PP VWF gt 3 0 a t s lectionn pour fournir une sensibilit et une sp cificit cliniques optimums pour faire la distinction entre la VWD de type 1 et la VWD de type 1 avec clairrance de VWF augment e Type 1c L utilisation d un rapport 3 0 a donn une sensibilit de 100 96 caract risant correctement tous les patients de type 1c et une sp cificit de 95 7 96 o 5 patients d
7. MODE D EMPLO IMMUCOR VWF amp Propeptide Assay v Ce M Boite A 303296 I Boite B 303297 2 C TABLE DES MATI RES N S ATIONS PR VUES none Eaa i 2 RESUME ET EXPLICATION a ae ane me een 2 PRINCIPES 52 50 nn ni nn dl ser nanreenann mens tard ann ne sans ere E dant trente T 2 eel dexpepmileelijium 2 PR CAUTIONS A LS nn ui ua nu 3 MISES EN GARDE sosaren E 4 CHANTILLONS a 4 Pr l vement et pr paration des chantillons se 4 EE lee Ee El A eet de MN NND 4 Mat riel fOUrnic a oct Hee EU le e n OE EM oa eM e us 4 Mat riel suppl mentaire n cessaire enne enne nnne nennen innen terere nnne 5 dio me 5 D TAILS Ee 8 CONTR LE QUALIT RD 8 INTERPR TATION DES R SULTATS DU TEST 8 LIMITES DE LA wilelllel2 8 VALEURS a a EEEEEEe EENS SEENEN deer eeg 9 SEUIL DE COUPURE CLINIQUE rire etica ia onn toe ars au saca aces trck am kso cua Snare eau a SaaS En san eR ane asiain 9 PERFORMANCES SP CIFIQUES aciacstt anne tanus natat uu nac nudae son E MAL HU nna eu E A D URL e RAE tiens 9 PT CISIOME E eege 9 Limite de d tection et intervalle de dosage nennen nennen nennen enne 10 Comparaison des m thodes c
8. WF et Propeptide VWF amp Propeptide Assay 5 303292 IFUFR REV C Niveau d talon Volume de plasma Volume de diluant talon A 20 ul de solution talon m re 1 080 ul de VPD talon B 200 ul d talon A 80 ul de VPD talon C 200 ul d talon A 260 ul de VPD talon D 200 ul d talon A 1000 ul de VPD talon E 300 ul de VPD 8 Utiliser le tableau suivant pour cr er les contr les positifs en ajoutant le volume de plasma sp cifi au volume appropri de diluant VPD Cette dilution procure assez de produit pour doser l chantillon en double sur les barrettes VWF et Propeptide Niveau de contr le Volume de plasma Volume de diluant Contr le positif haut 5 ul de solution talon m re 495 ul de VPD Contr le positif bas 5 ul de solution talon m re 995 ul de VPD 9 Pour chaque chantillon patient doser cr er une dilution conform ment au tableau suivant Une dilution 1 200 suffit pour la plupart des chantillons et permet un niveau inf rieur de d tection 6 Ul dl ou 6 U dl Pour confirmer un chantillon bas niveau ou d ficient une dilution de 1 20 est recommand e L utilisation d une dilution 1 20 dilution permet un niveau inf rieur de d tection 1 Ul dl ou 1 U dl Des dilutions comprises entre 1 300 et 1 20 sont appropri es pour ce dosage Dilution d chantillon Volume de plasma patient Volume de diluant 1 200 5 yl 995 ul d
9. aient une diminution de la demi vie du VWF Sur le plan clinique il est important de reconna tre ce ph notype clairance augment e dans la mesure o la clairance augment e du VWF peut r duire l efficacit du traitement par la desmopressine chez ces patients Le rapport propeptide VWF est galement utilis dans le diagnostic de l AVWS dans la mesure o le taux de propeptide est g n ralement normal ou sup rieur et o le taux de VWF est r duit causant un rapport propeptide VWF sup rieur En outre les taux de propeptide et le rapport propeptide VWF dans le plasma peuvent servir valuer l tendue de l activation des cellules endoth liales PRINCIPES Des talons contr les et chantillons de plasma dilu s sont ajout s aux micropuits dans lesquels des anticorps monoclonaux sp cifiques du VWF ou du propeptide ont t immobilis s L incubation des talons et des chantillons dans les micropuits permet la liaison du VWF ou du propeptide aux anticorps immobilis s Une tape de lavage limine toutes les prot ines de plasma non li es des micropuits Les micropuits sont ensuite incub s avec un anticorps monoclonal biotinyl sp cifique du VWF ou du propeptide qui a t captur dans les puits Une tape de lavage limine ensuite tous les anticorps non li s Ensuite les micropuits sont incub s avec de la peroxydase de raifort marqu e la streptavidine Suite une tape de lavage qui limine toute peroxydase
10. compl te dans le plasma 1 Ul dl Le syndrome de von Willebrand acquis AVWS est un trouble sanguin rare associ des affections lympho et my loprolif ratives des tumeurs solides et des troubles immunologiques et cardiovasculaires L AVWS est similaire la VWD au niveau des analyses de laboratoire et des manifestations cliniques Le diagnostic et le sous typage de la VWD et de l AVWS sont bas s sur plusieurs r sultats d analyse tels que l activit du facteur VIII les taux de VWF antig ne l activit VWF l analyse multim rique de VWF de m me que les ant c dents d h morragie du patient Le propeptide du VWF est synth tis dans le cadre d une prot ine pro VWF puis coup stock et s cr t selon un rapport quimolaire avec le VWF mature DP Le taux de propeptide VWF dans la circulation peut servir de marqueur de la synth se de VWF Chez les personnes pr sentant une faible synth se de VWF le taux de propeptide est diminu de mani re similaire donnant un rapport propeptide VWF proche de 1 0 Chez les personnes pr sentant des taux normaux de synth se de VWF et une survie diminu e du VWF en circulation un rapport propeptide VWF sup rieur est observ La carence quantitative observ e dans le VWD de type 1 peut tre caus e par une synth se et un stockage inefficaces ou par une diminution de la demi vie du VWF dans la circulation A ce jour plusieurs mutations ponctuelles dans le VWF ont montr qu elles caus
11. de raifort marqu e la streptavidine non li e du micropuits un substrat fluorescent est ajout et incub Apr s incubation la r action est arr t e en ajoutant une solution d arr t La fluorescence est mesur e dans un lecteur de plaque fluorescente avec une longueur d onde d excitation comprise entre 315 et 340 nm et une longueur d onde d mission comprise entre 370 et 470 nm Les valeurs moyennes des talons permettent de tracer une courbe d talonnage Les valeurs moyennes pour les contr les positifs et les chantillons patient sont d termin es partir de cette courbe standard Les r sultats sont exprim s en Ul dl pour le VWF et en U dl pour le propeptide Cette trousse contient deux contr les positifs Les contr les positifs permettent de confirmer que les talons ont t correctement dilu s et que les chantillons avec des taux d antig ne provenant de r gions diff rentes de la courbe d talonnage indiquent un recouvrement correct Les valeurs escompt es pour les deux contr les sont sp cifiques des lots et se trouvent dans l Analysis Software Les valeurs de contr le situ es en dehors des intervalles acceptables indiquent un dosage non valide COMPOSITION DU COFFRET Nombre maximal de tests par coffret VWF amp P 41 en double Tous les r actifs devront tre stock s comme indiqu sur l tiquette VWF amp Propeptide Assay 2 303292 IFUFR REV C MSVW 5XCW VPC VPD VCAL VDA REF
12. di de VWF ou 6 U dl de propeptides l chantillon doivent tre dos une dilution de 1 20 Avec une dilution 1 20 la limite inf rieure de l intervalle de dosage est de 1 Ul dl ou 1 U dl Des dilutions d chantillon comprises entre 1 300 et 1 20 sont appropri es pour ce dosage LIMITES DE LA TECHNIQUE Comme le dosage VWF A Propeptide Assay utilise des anticorps monoclonaux de souris pour la capture et la d tection des antig nes la pr sence d anticorps humains anti souris dans un chantillon pourra fausser les r sultats De mani re similaire la pr sence de facteur rhumato de dans un chantillon risque de fausser les r sultats du dosage Les r sultats de ce dosage ne doivent pas servir de seule base une d cision clinique VWF amp Propeptide Assay 8 303292 IFUFR REV C VALEURS ATTENDUES L intervalle normal pour le VWF antig ne varie en fonction du groupe sanguin le plasma de patients de groupe sanguin O pr sentant des niveaux r duits par rapport aux autres types de groupe sanguin L intervalle normal publi pour le VWF antig ne est de 50 150 U dl chez les patients de groupe sanguin O et de 90 200 U dl chez les autres groupes sanguins Chaque laboratoire devra d terminer ses propres intervalles normaux sp cifiques des groupes sanguins pour le VWF antig ne L intervalle normal du propeptide n est pas affect par le groupe sanguin du donneur L intervalle normal publi pour le propeptide est de 55 2
13. drini R Pagnan A Casonato A Von Willebrand factor propeptide makes it easy to identify the shorter Von Willebrand factor survival in patients with type 1 and type Vicenza von Willebrand disease British Journal of Haematology 2008 143 107 114 11 van Genderen PJ Boertjes RC van Mourik JA Quantitative analysis of von Willebrand factor and its propeptide in plasma in acquired von Willebrand syndrome Thromb Haemost 1998 80 495 498 12 Scott JP Vokac E Foster PA Kassay K Montgomery RR The von Willebrand factor propolypeptide VW Agll as a marker of acquired von Willebrand syndrome Blood 1993 82 150a 13 van Mourik JA Boertjes R Huisveld IA et al von Willebrand factor propeptide in vascular disorders A tool to distinguish between acute and chronic endothelial cell perturbation Blood 1999 94 179 185 ud EcTREP Immucor GTI Diagnostics Inc Immucor Medizinische Diagnostik GmbH 20925 Crossroads Circle Adam Opel Strasse 26A Waukesha WI 53186 USA Rodermark 63322 Germany US and International Contact Information Technical Support waukeshatechsupport immucor com wWww immucor com 2007 2015 Immucor GTI Diagnostics Inc 303292 IFUFR Rev C 2015 05 29 Warning Attention H317 Peut provoquer une allergie cutan e P261 viter de respirer les poussi res fum es gaz brouillards vapeurs a rosols P272 Les v tements de travail contamin s ne devraient pas sortir du lieu de travail P280 P
14. e VPD 1 20 13 ul 247 ul de VPD 10 Ajouter 50 ul d talon A E en double aux micropuits assign s sur les barrettes VWF jaune et propeptide verte 11 Ajouter 50 ul de contr le positif haut en double aux micropuits assign s aux barrettes VWF et propeptide 12 Ajouter 50 ul de contr le positif bas en double aux micropuits assign s aux barrettes VWF et propeptide 13 Ajouter 50 ul de solution d chantillon de plasma dilu pr par l tape 9 en double aux micropuits assign s sur les barrettes VWF et propeptide REMARQUE Un jeu d talons et de contr les est requis sur chaque type de barrette de micropuits utilis e chaque fois qu un dosage a lieu REMARQUE Pour viter les erreurs tiqueter chaque barrette 14 Fermer herm tiquement les micropuits avec un scellant pour plaques et incuber pendant 15 minutes dans un bain marie ou un incubateur 37 C REMARQUE Comme le temps d incubation est de 15 minutes seulement il est important d ajouter tous les chantillons aux 15 16 VWF amp Propeptide Assay 6 barrettes le plus vite possible en commen ant par le m me puits chaque fois Tous les ajouts d chantillon doivent tre effectu s dans les 5 minutes Diluer l anticorps de d tection de VWF VDA dans le diluant VPD comme indiqu dans le tableau suivant Le VDA sera ajout dans tous les micropuits VWF Barrettes 2 1x8 4 1x8 12 1x8 VDA Gu 10 ul 30 ul VPD 1 2 ml
15. e de sodium tamponn 3 8 96 ou 3 2 REMARQUE Les tubes de pr l vement partiel sont INTERDITS Comme les tubes sont pr talonn s pour aspirer le volume sp cifi de sang l chantillon r sultant n affichera pas le rapport sang anticoagulant de 9 1 ad quat si un chantillon complet n est pas pr lev 2 Apr s pr l vement stocker le tube la verticale temp rature ambiante jusqu centrifugation REMARQUE Pour les meilleurs r sultats les chantillons sanguins devront tre centrifug s dans les 15 minutes qui suivent le pr l vement mais pas au del de deux heures 3 Re m langer le pr l vement sanguin juste apr s centrifugation par inversion douce du tube 8 10 fois 4 Centrifuger le pr l vement sanguin temp rature ambiante dans un rotor horizontal pendant 15 20 minutes entre 1500 et 1800 FCR force centrifuge relative AVERTISSEMENT Une vitesse centrifuge excessive sup rieure 2000 FCR risque de causer la casse des tubes une exposition au sang et des blessures 5 Apr s centrifugation recueillir les 2 3 sup rieurs de la couche de plasma en pipetant le plasma dans un tube en polypropyl ne propre 6 Re centrifuger le plasma collect entre 1500 et 1800 FCR pendant 15 20 minutes pour liminer les globules rouges ou plaquettes r siduels 7 Transf rer les 2 3 sup rieurs de la couche de plasma dans un tube de polypropyl ne propre en veillant ne pas troubler les cellules
16. e type 1 ont t caract ris s comme tant de type 1c Trois des 5 patients mal caract ris s taient de groupe sanguin O et un de groupe sanguin A quant au cinqui me son groupe sanguin tait inconnu Comme il a t d montr que les patients de groupe sanguin O pr sentent g n ralement un taux de VWF inf rieur et un rapport propeptide VWF sup rieur nous sugg rons l utilisation de la zone floue suivante Les rapports propeptide VWF de 3 0 4 1 pourront tre dus une clairance augment e du VWF ou r sulter d un patient VWD de type 1 et de groupe sanguin O Les rapports 4 1 indiquent une VWD de type 1c quel que soit le groupe sanguin PERFORMANCES SP CIFIQUES Pour garantir une r activit et une sp cificit adapt es chaque lot de dosage VWF amp Propeptide Assay est test avant commercialisation avec des chantillons contenant des taux normaux et r duits de VWF et de propeptide Pr cision L impr cision intra dosage inter dosages et totale du dosage VWF amp Propeptide Assay a t d termin e Cing chantillons avec diff rents niveaux de VWF et de propeptide ont t test s dans le dosage VWF amp Propeptide Assay en double avec 20 dosages s par s Pour obtenir l impr cision des r sultats communicables les donn es ont t analys es par ANOVA selon le document EP5 A2 du CLSI intitul Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods Approved Guidelines Ces r sultats appa
17. l Analysis Software fourni Une courbe d talonnage pour chaque type de plaque doit tre produite chaque dosage Les instructions d utilisation d taill es du manuel Analysis Software se trouvent la premi re page du manuel Le manuel Analysis Software calcule les valeurs de fluorescence moyenne issues des puits en double pour tous les niveaux d talon les contr les et les chantillons dos s D terminer la concentration de VWF et de propeptide dans les contr les et les chantillons de plasma patient l aide du manuel Analysis Software Le manuel Analysis Software trace un graphe des donn es et r sout l quation de meilleur ajustement pour obtenir les Ul dl de VWF ou les U dl de propeptide pour les contr les et les chantillons de plasma patient Le manuel Analysis Software calcule galement un rapport propeptide VWF pour chaque chantillon dos Si les chantillons de plasma donnent des valeurs de fluorescence relative sup rieures celles obtenues pour l talon de plus haut niveau le r sultat communicable sera ORR Les valeurs moyennes de fluorescence d passent la valeur moyenne du calibrant le plus lev et l chantillon devra tre test une dilution sup rieure pour obtenir un r sultat dans l intervalle d talonnage Si un chantillon est dos une dilution 1 200 la limite inf rieure de l intervalle de dosage est de 6 Ul dl ou 6 U dl Si le r sultat pour un chantillon de plasma est inf rieur 6 Ul
18. lebrand Factor Acquired von Willebrand syndrome data from an international registry Thromb Haemost 2000 84 345 349 4 Assays of von Willebrand Factor Antigen and Ristocetin Cofactor Acrivity Approved Guideline CLS Guideline H51 A 2002 Vol 22 No 20 5 FayPJ Kawai Y Wagner DD Ginsburg D Bontron D Ohlsson Wilhelm BM Chavin SI Abraham GN Handin RI Orkin SH Montgomery RR Marder VJ Propolypeptide of von Willebrand factor circulates in blood and is identical to von Willebrand antigen Il Science1986 232 995 6 Wagner DD Fay PJ Sporn LA Sinha S Lawrence SO Marder VJ Divergent fates of von Willebrand factor and its propolypeptide von Willebrand antigen II after secretion from endothelial cells Proc Natl Acad Sci USA 1987 84 1955 7 Haberichter SL Balistreri M Christopherson P Morateck P Gavazova S Bellissimo DB Manco Johnson MJ Cox Gill J Motgomery RR Assay of the von Willebrand factor VWF propeptide to identify patients with type 1 von Willebrand disease with decreased VWF survival Blood 2206 108 3344 3351 8 Schooten CJ Tjernberg P Westein E et al Cysteine mutations in von Willebrand factor associated with increased clearance J Thromb Haemost 2005 3 2228 2237 9 Casonato A Pontara E Sartorello F et al Reduced von Willebrand factor survival in type Vicenza con Willebrand disease Blood 2002 99 180 184 10 Sztukowska M Gallinaro L Cattini MG Pontara E Sartorello F Daidone V Pa
19. lypropyl ne La peroxydase de raifort marqu e la streptavidine dilu e sera ajout e dans tous les puits utilis s sur les deux types de barrettes de micropuits VPC 10 ul 20 ul 60 ul VPD 2 ml 4 ml 12 ml Barrettes 4 1x8 8 1x8 24 1x8 TAPE DE LAVAGE a Aspirer ou d canter le contenu de chaque puits et absorber avec du papier absorbant b Ajouter 300 yl de solution de lavage de travail C Aspirer ou d canter d Reprendre les tapes b c pour 3 lavages au total e D canter vigoureusement pour liminer toute la solution de lavage r siduelle Retourner sur du papier absorbant pour viter le dess chement Ajouter 50 ul de peroxydase de raifort marqu e la streptavidine dilu e dans tous les micropuits Propeptide Fermer herm tiquement les micropuits avec un scellant pour plaques et incuber pendant 15 minutes dans un bain marie ou un incubateur 37 C Pr parer une solution de substrat en ajoutant 9 volumes de substrat A QA 1 volume de substrat B QB Utiliser un r cipient en polypropyl ne Bien m langer Ce produit n est pas photosensible Ce produit sera ajout dans tous les puits utilis s sur les deux types de barrettes de micropuits Solution de substrat A QA 1 8 ml 3 6 ml 10 8 ml Solution de substrat B QB 200 ul 400 pl 1 2ml TAPE DE LAVAGE a Aspirer ou d canter le contenu de chaque puits et absorber avec du papier absorbant b Ajo
20. omparaison du dosage VWF amp Propeptide Assay au dosage ASSERACHROM VWF Ag d Diagnostica Eet REP N 10 elle GE ll 10 R F RENCES Ree EU 11 VWF amp Propeptide Assay 1 303292 IFUFR REV C UTILISATIONS PR VUES Le dosage VWF amp Propeptide Assay est un dosage immunoenzymatique ELISA en phase solide quantitatif utilis pour la mesure du facteur von Willebrand Factor VWF et de son propeptide dans le plasma et pour le calcul du rapport propeptide VWF Un rapport propeptide VWF lev chez les patients VWF de type 1 indique une demi vie r duite du VWF en circulation R SUM ET EXPLICATION Le facteur Von Willebrand VWF est une prot ine multim rique de poids mol culaire lev pr sente dans le plasma qui joue un r le crucial dans le recrutement et l activation des plaquettes au niveau des l sions vasculaires Par ailleurs le VWF sert de prot ine de transport au facteur de coagulation facteur VIII prot geant le facteur VIII d une d gradation La maladie de von Willebrand VWD est caus e par une carence en VWF La VWD de type 1 correspond une carence quantitative caract ris e par la d tection de taux r duits de VWF fonctionnel dans le plasma La VWD de type 2 correspond une carence qualitative caract ris e par la d tection de taux normaux ou r duits de VWF fonctionnellement d ficient dans le plasma La VWD de type 3 correspond une carence de VWF quantitative
21. on d arr t 11 12 scellants pour plaques 12 Analysis Software sur CD NO ER WN Mat riel suppl mentaire n cessaire 1 Tubes essai ou tubes de microtubes centrifuger pour les dilutions d chantillons patient et de contr les et les dilutions de r actifs 2 Pipettes de transfert 3 Micropipettes r glables pour administrer 1 10 ul 10 100 ul et 100 1 000 ul et embouts jetables 4 Chronom tre 5 Lecteur de plaque fluorescente capable de mesurer la fluorescence une longueur d excitation comprise entre 315 et 340 et une longueur d mission comprise entre 370 et 470 nm 6 Eau d sionis e ou distill e 7 Papier absorbant 8 Laveur de microplaque 9 Centrifugeuse 10 Bain marie de 37 C ou incubateur sec 37 C 11 Ordinateur avec Microsoft Excel version 2003 ou 2007 Proc dure 1 Porter tous les r actifs de dosage de la boite B temp rature ambiante 22 25 C REMARQUE Une fois tous les r actifs de la boite B temp rature ambiante 22 25 C tous les r actifs peuvent tre dilu s et conserv s temp rature ambiante pendant toute la dur e du dosage Aucun r actif n est photosensible 2 D terminer le nombre d chantillons patient tester l aide de la feuille d annotations assigner chaque chantillon une position comprenant deux puits dosage en double Noter l identit de chaque chantillon sur la feuille d annotations 3 Fabriquer la solution de lavage de t
22. orter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage P302 4 P352 EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU Laver abondamment l eau et au savon P333 P313 En cas d irritation ou d ruption cutan e consulter un m decin P501 liminer le contenu r cipient dans une installation d limination des d chets agr e VWF amp Propeptide Assay 11 303292 IFUFR REV C
23. our l ajout des r actifs La r action du substrat enzymatique est sensible la temp rature et doit avoir lieu un endroit o la temp rature ambiante est maintenue entre 22 et 25 C Les r actifs pourront contenir plus que le volume indiqu sur le r cipient VWF amp Propeptide Assay 3 303292 IFUFR REV C Le plasma humain utilis comme talon pour ce produit a t test et s est av r n gatif pour les anticorps dirig s contre le VIH le VHC et le HBsAg par des m thodes approuv es par la FDA Toutefois aucune m thode de test ne peut offrir l assurance compl te de l absence du VIH du virus de l h patite C du virus de l h patite B ou d autres agents infectieux Par cons quent ces mat riels doivent tre manipul s comme s ils taient potentiellement infectieux Jeter tous les composants une fois la proc dure termin e en suivant les r glementations locales CHANTILLONS Pr l vement et pr paration des chantillons REMARQUE Seul du plasma pauvre en plaquettes pr lev dans du citrate de sodium pourra tre utilis pour ce dosage Pour des d tails se reporter au document intitul Collection Transport and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assay Approved Guideline CLSI H21 A5 Volume 28 Number 5 December 2008 Le pr l vement de plasma pauvre en plaquettes doit tre effectu comme suit 1 Pr lever le sang dans des tubes de citrat
24. raissent dans le tableau ci dessous Pour la mesure du VWF antig ne le CV 96 total pour tous les chantillons tait lt 11 5 96 Un chantillon d ficient en VWF a galement t test et d termin comme ayant 1 Ul dl de VWF dans les 20 s ries de dosage Pour la mesure des propeptides le CV 96 total pour les chantillons 1 3 tait lt 6 96 L chantillon 4 a affich un CV 96 total de 25 96 mais les valeurs ont uniquement oscill entre 1 et 6 U dl de propeptide sur les 20 s ries de dosage Un chantillon d ficient en propeptide a galement t test et d termin comme ayant 1 U dl de propeptide dans les 20 s ries de dosage Ecart type CV 96 Ecart type CV 96 H Echantillon ed setas id intra intra inter inter in type CV 96 total y dosage dosage dosages dosages Echantillon 1 Normal 93 3 4 3 7 5 5 5 9 6 1 6 6 Echantillon 2 444 3 0 2 6 12 8 11 2 13 0 11 4 Normal Echantillon 3 Moyen 53 2 0 3 8 4 1 7 7 4 4 8 3 SE EET 0 9 5 0 14 78 1 6 8 9 as VWF amp Propeptide Assay 9 303292 IFUFR REV C U dL de Ecart type CV 96 Ecart type CV 96 cart type Echantillon propeptide intra intra inter inter total yP CV total en moyenne dosage dosage dosages dosages Echantillon 1 Normal 89 2 7 3 0 4 8 5 4 5 1 5 7 Echantillon 2 Normal 105 1 8 1 7 4 7 4 5 4 9 4 7 Echantillom d does 1 8 8 5 2 5 4 8 2 8 5 4 Moyen Echantillon 4 Bas 4
25. ravail en diluant la solution de lavage concentr e 5XCW Ajouter 1 volume de solution de lavage concentr e 4 volumes d eau d sionis e ou distill e Bien m langer La solution de lavage de travail peut tre conserv e entre 2 et 8 pendant 2 semaines Barrettes 4 1x8 12 1x8 24 1x8 Solution de lavage concentr e 20 ml 60 ml 120 ml Eau d sionis e 80 ml 240 ml 480 ml 4 Retirer le nombre appropri de barrettes VWF et propeptide comme identifi sur la feuille d annotations Refermer herm tiquement et rapidement les barrettes inutiles dans le sachet de protection REMARQUE Deux cadres seulement sont fournis dans la trousse Ne les jeter pas avant d avoir utilis toutes les barrettes 5 D geler une aliquote de solution talon m re de la boite A de m me que tous les chantillons de plasma doser gel s pour les porter 37 C 6 Une fois d gel s la solution talon m re et les chantillons devront tre incub s 37 C pendant 10 minutes suppl mentaires pour permettre la solubilisation ad quate du VWF avant dilution REMARQUE La solution talon m re doit tre d gel e et utilis e une seule fois par flacon Ne pas recongeler 7 Utiliser le tableau suivant pour cr er les talons A E en ajoutant le volume de plasma sp cifi au volume appropri de diluant VPD Cette dilution procure assez de produit pour doser les talons et les contr les en double sur les plaques V
26. sage ayant d j obtenu son autorisation de mise sur le march de la FDA le dosage ASSERACHROM VWF Ag de Diagnostica Stago En combinant les r sultats des trois tudes 298 chantillons de plasma ont t dos s Le graphe suivant montre les r sultats de l analyse de r gression lin aire pour le VWF o la pente de la courbe tait de 1 13 avec un intervalle de confiance 95 96 de 1 08 1 18 et le point d intersection tait de 4 16 avec un intervalle de confiance 95 96 de 6 72 1 61 Comparaison des m thodes de VWF antig ne y 1 1278x 4 1649 R 0 8772 e x y donn es Lin aire donn es KA D Hd ao lt D o Le D o LL gt ASSERACHROM VWF Ag Ul dl Substances Interf rente Les substances suivantes n ont montr aucune interf rence avec le dosage VWF amp Propeptide Assayaux concentrations indiqu es H moglobine 500 mg dl Bilirubine 20 mg dl Intralipide 500 mg dl VWF amp Propeptide Assay 10 303292 IFUFR REV C R F RENCES 1 Sadler JE Blinder M von Willebrand disease Diagnosis classification and treatment In Colman et al eds Hemostasis and Thrombosis 2000 825 837 2 Montgomery RR Structure and function of von Willebrand factor In Colman et al eds Hemostasis and Thrombosis 2000 825 837 3 Federici AB Rand JH Bucciarelli P Budde U van Genderen PJ Mohori H Meyer D Rodighiero F Sadler JE Subcommittee on von Wil
27. tre 2 et 8 C 403608 Substrat A dilution obligatoire de 9 volumes de substrat A pour 1 volume de substrat B avant usage Conserver entre 2 et 8 C 403610 Substrat B dilution obligatoire de 9 volumes de substrat A pour 1 volume de substrat B avant usage Conserver entre 2 et 8 C 403604 Solution d arr t pr te l emploi Conserver entre 2 et 8 C 503019 Scellants pour plaques 503009 VWF amp Propeptide Analysis Software Analysis Software sur CD PR CAUTIONS Ne pas utiliser les r actifs qui sont troubles ou contamin s Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date de p remption Les micropuits et les r actifs inclus dans ce coffret ne doivent pas tre utilis s conjointement avec d autre trousse Le remplacement des composants fournis dans cette trousse par d autres risque de fausser les r sultats Jeter tout talon d gel et barrettes de micropuits utilis es apr s chaque dosage Jeter tout talon dilu inutilis les anticorps de d tection dilu s la peroxydase de raifort marqu e la streptavidine dilu e et la solution de substrat Lors de dilutions suivre les techniques de distribution et de rin age pr conis es par le fabricant de la pipette Lors de dilutions ne pas pipeter moins de 5 ul de r actif ou d chantillon L utilisation de volumes inf rieurs 5 ul pour la dilution augmentera l impr cision dilutionnelle Des pipettes pr cis ment talonn es devront tre utilis es p
28. uent dans le milieu de la r gion haute de la courbe d talonnage Le contr le positif bas est dilu de mani re ce que les unit s de fluorescence relative se situent dans le milieu de la r gion basse de la courbe d talonnage L Analysis Software calcule les r sultats communicables d finitifs pour les contr les en multipliant les niveaux d antig ne obtenus partir de la courbe d talonnage par la dilution d chantillon utilis e Comme les deux contr les sont des dilutions du m me mat riel les r sultats communicables d finitifs obtenus devront tre similaires et les valeurs pour les deux contr les doivent se situer dans les intervalles de contr le acceptables indiqu s dans Analysis Software Si les valeurs de contr le se situent en dehors des intervalles acceptables le dosage devra tre r p t Si les valeurs de contr le se situent en dehors de l intervalle acceptable pour un antig ne par ex VWF mais sont acceptables pour le second antig ne par ex Propeptide seule la d termination d antig ne correspondant au contr le ayant chou devra tre recommenc e INTERPR TATION DES R SULTATS DU TEST Construire une courbe d talonnage en tra ant la valeur de fluorescence moyenne n 2 pour chaque courbe d talonnage par rapport sa valeur assign e de VWF ou propeptide l aide d Analysis Software figurant sur le CD fourni Les valeurs assign es sp cifiques des lots pour VWF et propeptide se trouvent dans
29. uter 300 yl de solution de lavage de travail C Aspirer ou d canter d Reprendre les tapes b c pour 3 lavages au total e D canter vigoureusement pour liminer toute la solution de lavage r siduelle Retourner sur du papier absorbant pour viter le dess chement REMARQUE Il est important de retirer compl tement toute la solution de lavage apr s le lavage final 27 28 Ajouter 50 ul de solution de substrat m lang e l tape 25 dans chaque puits utilis sur les deux types de barrettes de micropuits Fermer herm tiquement les micropuits avec un scellant pour plaques et incuber pendant 15 minutes TEMP RATURE AMBIANTE 22 25 C Il est inutile d abriter la r action de la lumi re VWF amp Propeptide Assay 7 303292 IFUFR REV C 29 Arr ter la r action en ajoutant 50 ul de solution d arr t QSS dans chaque puits dans le m me ordre que pour l addition du substrat La plaque devra tre lue dans un lecteur de plaque fluorescente dans les 60 minutes qui suivent l ajout de solution d arr t 30 Lire la plaque dans un lecteur de plaque fluorescente avec longueurs d onde d excitation entre 315 et 340 nm et longueurs d onde d mission entre 370 et 470 nm temp rature ambiante 22 25 C D TAILS D TALONNAGE La solution talon m re fournie dans le dosage VWF amp Propeptide Assay est du plasma humain normal congel en pool Le pool est constitu de 35 donneurs masculins et f minins diff
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