Les ions de metaux lourds et le probleme de la
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1. lev es la fixation s tend aux autres groupes Il est n anmoins possible de distinguer une affinit particuli re pour certains groupes Le zinc pr sente une affinit lev e pour les r sidus histidine Gurd amp Goodman 1952 Les recherches sur les diff rents types de complexes m tal liques ont montr que le nickel et le cobalt l tat divalent pr sentent tous deux une affinit pour les compos s azot s et oxyg n s du type acides amin s Le fer divalent pr sente en outre une affinit pour les groupes carboxyles L affinit pour les groupes carboxyles pr domine dans le mangan se Nous avons abord l tude de la d termination des groupes responsables de Ja fixation des ions zinc et l emploi de substances pr sentant pour les prot ines une affinit sup rieure a celle des ions zinc s est ainsi montr utile Nous basant sur le fait que les prot ines forment avec l ion mercurique des complexes plus stables qu avec le zinc nous avons examin l effet de cet ion sur la r partition du zinc dans l embryon Nous avons observ que le mercure d place le zinc de ses combinaisons organiques dans l embryon Cette constata tion nous indique que le mercure et le zinc ont des points de fixation communs Il est int ressant de rappeler ici que Lindahl 1936 a montr qu un tr s court passage de l uf de l oursin dans une solution de HgCl 1 90 000 est suffisant pour provoquer l animalisation2. t choisis En fonctionnant la valence 2 ces m taux pr sentent de nombreux caract res communs avec le zinc La r partition du zinc fix sur les embryons est examin e divers stades du d veloppement et dans des conditions exp rimentales vari es Le m tal est mis en vidence par la formation d un complexe color avec la dithizone L addition de substances sp cifiques de groupes chimiques d termin s des cultures faites en pr sence de sels m talliques a permis d aborder le probl me de la fixation des ions m talliques L acide p chloromercuribenzo que est utilis en raison de son affinit pour les groupes sulfhydriles MAT RIEL ET M THODES Ces exp riences sont faites sur les ufs de l oursin Paracentrotus lividus Les ufs sont utilis s 4 heure apr s la f condation Le volume de chaque culture est 1 Author s address Institut de Biologie Physico Chimique 13 rue Pierre Curie Paris 5e France J Embryol exp Morph Vol 4 Part 3 pp 265 278 September 1956 266 R LALLIER LES M TAUX LOURDS ET de 100 cc La temp rature est de 21 23 C Des cultures de contr le sont faites en bloquant pr alablement l ion m tallique par un agent complexant l acide thyl nediamino t tra ac tique Complexone utilis la concentration de 0 05 100 sous forme de sel t trasodique Les sels m talliques chimiquement purs RhG ne Poulenc sont utilis s pour la pr paration des solutions stocks
3. les mesures en u des diam tres de diff rents embryons dans une culture de 5 jours 128 106 96 85 75 54 43 et 32 Les plus petits de ces embryons sont compacts et opaques La survie relativement prolong e de ces embryons con traste avec leur faible viabilit lorsqu ils sont transf r s dans l eau de mer apr s 23 heures seulement de culture dans les solutions de NiCl Ils se lysent en effet sans se d velopper quelques heures apr s leur report dans l eau de mer Dans les solutions a 1 10 000 les embryons apr s 48 heures ressemblent a ceux d velopp s dans les solutions 1 5 000 Ils en diff rent par leur archen t ron mieux d velopp et la pr sence de spicules pairs pineux Reportes dans l eau de mer apr s 23 heures de s jour dans la solution de NiCP ils conservent cet aspect g n ral et leur archent ron se diff rencie en trois segments Ils se lysent d ailleurs rapidement apr s ce transfert Dans les cultures de contr le en pr sence de Complexone NiCI 17 5 000 et Complexone 0 05 100 le d veloppement est normal Dans les solutions plus dilu es 1 50 000 et 1 100 000 le retard du d veloppe ment est peu sensible Les pluteus ont un lobe oral tr s d velopp bord d un ectoderme pais recouvert de longs cils Les bras anaux manquent 1 50 000 ou sont rejet s lat ralement de part et d autre du lobe oral 1 100 000 La r gion sommitale peu d velopp e est arrondie Les trois segments de
4. les structures ento dermiques d riv es du mat riel initialement le plus v g tatif sont galement les plus sensibles aux effets toxiques du zinc elles sont toujours l s es les premi res Un s jour prolong dans la solution de ZnCl entra ne l extension de la fixa tion du zinc tout l embryon et ce ph nom ne va de pair avec la g n ralisation de l effet toxique du m tal Le zinc pr sente donc une grande affinit pour les r gions v g tatives et ce ph nom ne est susceptible de rendre compte de l orien tation de leur d veloppement en direction animale Une situation analogue se pr sente dans le cas du nickel Bien que les recherches aient t plus limit es nous avons pu remarquer dans les blastulas la haute affinit du m tal pour le m senchyme Il n a pas t possible de mettre en vidence de r action color e dans les parois ectodermiques Ces r sultats indiquent une affinit assez faible du nickel pour les tissus embryonnaires et s accordent avec les effets morphog nes moins marqu s et la toxicit moins lev e de ce m tal La fixation des ions m talliques sur les structures embryonnaires apparaissant ainsi responsable de leurs effets sur le d veloppement nous examinerons main tenant les diff rents supports chimiques pr sentant une affinit pour ces ions Malgr les nombreux travaux consacr s ce sujet nos connaissances sur la nature et la stabilit des complexes form s avec les ion
5. en d autres r gions Chlorure de zinc et acide p chloromercuribenzoique Dans les cultures contenant ZnCl 1 10 000 et de l acide p chloromercuri benzoique 0 5 x 10 5 M la quasi totalit des embryons est bloqu e aux stades 32 et 64 blastom res On trouve en outre quelques rares blastulas parois paisses Transf r es dans l eau de mer normale elles se lysent sans se d velop per davantage En pr sence de ZnCl la concentration 1 10 000 tous les embryons sont des blastulas hypercili es Dans les solutions d acide p chloromercuribenzo que 0 5 x 10 M les embryons sont petits et globuleux Le d veloppement des bras est inhib L archent ron est form mais la bouche manque DISCUSSION Les sels m talliques tudi s exercent des effets diff rents sur le d veloppement de l uf de Paracentrotus lividus Le d veloppement est inhib de fa on peu caract ristique en pr sence de MnCl et de SO Fe CoC se montre plus toxique A la concentration 1 5 000 la gastrulation est notablement perturb e Les effets du chlorure de nickel apparaissent plus caract ristiques Dans les solutions 1 1 000 l archent ron ne se forme pas et l entoderme s int gre aux 272 R LALLIER LES M TAUX LOURDS ET parois de l embryon par un processus d ectodermisation d j signal par Waterman 1937 Il ne s agit toutefois pas d une animalisation typique puisque l on n observe ni accroissemen
6. l ments du milieu Apr s l puisement de leurs r serves vitellines 1 Dans un travail paru depuis l envoi de ce m moire Rulon Biol Bull Wood s Hole 1955 109 pp 316 27 a observ la radialisation des larves de Sand Dollar trait es par le chlorure de zinc LA D TERMINATION EMBRYONNAIRE 273 l attaque de certaines structures par les enzymes cellulaires appara t n cessaire pour fournir l nergie indispensable leur survie Ce ph nom ne rendrait compte de la r gression g n rale de la taille de ces embryons Ces consid rations impliquent que chez ces embryons animalis s certaines structures restent acces sibles l attaque des enzymes cellulaires et que celles ci conservent leur pleine activit L tude de ces ph nom nes est susceptible d apporter des indications int ressantes sur le m tabolisme et la structure de ces embryons Les ions de m taux lourds constituant les agents responsables des transforma tions morphologiques observ es l analyse de leur mode d action implique l tude de leur r partition dans l embryon et la d termination de la nature du support chimique responsable de leur fixation Nous avons examin la r partition du zinc divers stades du d veloppement embryonnaire et dans des conditions vari es La m thode utilis e pour la d ter mination du zinc est bas e sur la coloration pourpre qu il donne avec la dithi zone Cette m thode a permis Fujii 1954 de d tecter
7. le Zn Chez les blastulas rondes munies de leur m senchyme primaire une colora tion rose se d veloppe au niveau de ce m senchyme et dans une troite zone au p le v g tatif apr s 30 minutes de s jour dans la solution de ZnCl Cette r partition de la coloration est conserv e chez les embryons trait s pendant 2 heures Apr s un s jour de 4 heures ou plus la coloration s tend tout l em bryon elle reste n anmoins plus intense au niveau du m senchyme Chez la gastrula avanc e un s jour de 10 minutes est suffisant pour que la coloration se d veloppe au niveau du m senchyme secondaire Apr s 2 heures de traitement la coloration s tend au m senchyme primaire et avec moins d intensit toutefois aux parois de l archent ron et la p riph rie du blastopore Apr s 4 30 heures la coloration s tend tout l embryon Elle reste plus marqu e dans les m senchymes et dans l archent ron La prolongation du traitement entra ne l extension de la coloration tout l embryon La r partition de la coloration est semblable chez les jeunes stades prisma tiques Chez les pluteus apr s un s jour de 10 minutes 2 heures la coloration n ap para t que dans les cellules pigmentaires l exclusion de toute autre r gion La r partition du zinc chez des embryons pr alablement v g tativis s par le chlorure de lithium est galement examin e Les embryons v g tativis s sont obtenus en traitant
8. le zinc dans le nucl ole de l oocyte d oursin R cemment Meier amp Kaunat 1954 Pont utilis e pour la mise en vidence du zinc dans le pancr as L emploi de cette m thode appelle toutefois quelques remarques Il appara t en effet peu probable que la totalit du zinc puisse tre mise en vidence dans ces conditions Nous avons pu remarquer notamment que le complexe form in vitro entre le zinc et le Complexone ne donne pas la coloration avec la dithizone Des essais pr liminaires nous ont montr qu en pr sence de certains acides amin s la coloration est plus ou moins att nu e L histidine la glycine la pro line la s rine l isoleucine la thr onine l asparagine et l acide aspartique se sont montr s particuli rement actifs cet gard Or le zinc forme des complexes assez stables avec l histidine ainsi d ailleurs qu avec d autres acides amin s Tanford 1952 Albert 1952 Perkins 1953 Il appara t donc que le zinc engag dans certaines formations complexes ne peut tre mis en vidence par la dithizone Nous ferons remarquer en outre que l addition de la solution alcoolique de dithizone provoquant des ph nom nes de d naturation prot iques ceux ci peuvent influer leur tour sur la fixation des ions zinc soit dans le sens d une lib ration soit au contraire dans le sens d un accroissement de fixation du m tal Cette seconde ventualit est plausible et nous avons pu v rifier i
9. zinc et du nickel La r partition du zinc est examin e au cours de l animalisation et dif f rents stades du d veloppement normal La fixation du zinc sur des embryons pr alablement v g tativis s par le chlorure de lithium et les effets du Com plexone et des ions mercuriques sur la r partition du m tal sont galement tudi s Les ufs vierges laiss s de 12 heures dans une solution de ZnCl 1 10 000 d veloppent une coloration rose en pr sence de dithizone De l g res diff rences sont observ es entre les ufs d une m me ponte Elles disparaissent avec la prolongation du traitement sans que celle ci s accompagne d un accroisse ment marqu de la coloration Des ufs mis d s la f condation dans une solution de ZnCl 1 10 000 sont pr lev s au cours de leur d veloppement et trait s 4 la dithizone Au stade 2 blastom res la coloration rose peu intense est galement r partie entre les 2 blastom res L intensit de la coloration s accroit aux stades 32 et 64 blasto m res tout en restant uniform ment r partie Ces embryons report s dans l eau de mer normale s y d veloppent Au stade prismatique la coloration est rep r e dans le m senchyme primaire et secondaire et un moindre degr dans les parois de l archent ron La coloration n a pu tre d tect e dans les pluteus Les embryons laiss s dans la solution de ZnCl jusqu au stade blastula sont fortement animalis s L
10. Dans les solutions 1 5 000 le d veloppement est tr s l g rement ralenti Dans les cultures de 48 heures le d veloppement des bras anaux et de la partie sommitale est inhib Chez 50 pour cent des embryons la bouche n est pas form e Les autres sont des pluteus de structure normale plus petits que les t moins Dans les solutions 1 10 000 les embryons ne se distinguent gu re des t moins Seuls quelques uns pr sentent une l g re inhibition du d veloppement de la partie sommitale et des bras anaux LA D TERMINATION EMBRYONNAIRE 269 Sulfate ferreux Trois cultures ont t faites avec le sulfate ferreux Une partie appr ciable du fer pr cipite l tat d hydroxyde diminuant ainsi la con centration effective des ions Fe En outre l oxydation de la solution par l oxyg ne de l air provoque la transformation rapide des ions ferreux en ions ferriques En raison de ces consid rations les r sultats indiqu s ne pr sentent qu un int r t d orientation Avec une concentration de 1 1 000 le d veloppement est ralenti et la plupart des embryons ne d passent pas le stade morula Quelques rares pluteus se d veloppent Ils sont petits et ne d passent pas les ou m me la de la taille des t moins L abondance des cellules m senchymateuses leur donne un aspect opaque Dans les solutions 1 100 000 la gastrulation est retard e mais les pluteus sont de taille et de structure normales D termination du
11. Il appara t donc probable qu en raison de la courte dur e de ce traitement et de la faible concentration utilis e la fixation de l ion mercurique est rest e limit e certains groupes fonctionnels Un traite ment prolong entra nant la fixation du mercure tous les groupes fonctionnels disponibles emp che tout d veloppement Afin de d terminer si la fixation du zinc sur les groupes sulfhydriles joue un r le dans l animalisation nous avons utilis l acide p chloromercuribenzo que en raison de son affinit lective pour ces groupes Hellerman Chinard amp Deitz 1943 Les embryons cultiv s en pr sence de chlorure de zinc sont tr s sensibles l acide p chloromercuribenzo que et le d veloppement est bloqu au cours de la segmentation Il y a donc addition des effets toxiques et l embryon n est pas prot g contre les effets toxiques du zinc par l acide p chloromercuribenzo que Celui ci utilis seul ne provoque d ailleurs aucune animalisation Nous ferons galement remarquer que le chlorure de zinc tr s faible concentration pro voque seulement la radialisation L affinit du m tal pour les groupes sulfhydriles tant plus grande que pour les autres groupes il apparait ainsi que la fixation du zine sur les groupes sulfhydriles pr domine dans ces conditions Nous avons d autre part remarqu que le cadmium bien que formant des complexes plus stables que le zinc avec les groupes sulfhydriles es
12. Les ions de m taux lourds et le probl me de la d termination embryonnaire chez les Echinodermes by R LALLIER Institut de Biologie Physico Chimique Paris INTRODUCTION LES recherches sur l action des ions lithium et sulfocyanure sur le d veloppe ment de l uf d oursin forment une importante contribution au progr s de nos connaissances dans le domaine de la d termination embryonnaire Les effets v g tativisants du lithium d couverts par Herbst 1892 conf rent ce m tal une situation assez exceptionnelle parmi les autres m taux alcalins et alcalino terreux En contraste les m taux lourds pr sentent une toxicit g n ralement lev e Leurs effets sur le d veloppement ne sont toutefois pas uniformes et certains de ces m taux exercent une action diff rentielle sur les territoires embryonnaires C est ainsi que Waterman 1937 a observ que l inhibition de la gastrulation s accompagne d un processus d ectodermisation chez les em bryons d oursins cultiv s en pr sence de sels de m taux lourds Nous avons montr d autre part les effets animalisants tr s puissants des sels de zinc et de cadmium sur l uf de l oursin Paracentrotus lividus Lallier 1955a Dans ce travail nous abordons l tude de l action animalisante du zinc Dans ce but nous comparons les effets du zinc avec ceux d autres m taux pr sentant des propri t s voisines Le nickel le cobalt le mangan se et le fer ont
13. ans ce paragraphe nous l examinerons maintenant L ion mercurique a t utilis en raison de la grande stabilit de ses complexes avec les prot ines cet effet des embryons ayant s journ s dans une solution de ZnCl 1 10 000 sont lav s et mis pendant 10 20 minutes dans une solution de HgCl 1 20 000 Apr s lavage la coloration d velopp e en pr sence de dithi zone est orange tr s faible Par contre le mercure est facilement mis en vidence gr ce la coloration lie de vin qu il d veloppe en pr sence de diph nylcarba zone Cette exp rience peut tre faite tous les stades mais les jeunes stades en cours de segmentation s y pr tent tout particuli rement en raison de leur sensi bilit plus faible l action lytique de l ion mercurique Pour la d termination du nickel les conditions sont moins favorables les r actifs l a furil dioxime surtout entra nant une opacification rapide des em bryons Aussi nous avons limit nos essais aux embryons sph riques d velopp s dans les solutions de NiCP 1 1 000 En pr sence de dim thylglyoxime une coloration rose assez faible est rep r e au niveau des cellules m senchymateuses L a furil dioxime donne le m me r sultat La d tection du nickel est peu ais e dans ces conditions Jusqu ici seule la r action au niveau des cellules m senchymateuses se montre nettement posi tive Il ne peut encore tre d cid avec certitude s il se fixe
14. dans l eau de mer ZnCl 1 1 000 NiC 6H O 1 1 000 CoCl 6H O 1 1 000 MnCl 4H O 1 1 000 Des solutions de SO Fe 7H O 1 100 et 1 1 000 dans l eau distill e sont pr par es au moment de l emploi Nous rappellerons qu en ce qui concerne la solution de ZnCl dans l eau de mer 60 pour cent du Zn pr cipite sous forme d hydroxyde insoluble La con centration r elle de la solution ne repr sente que 40 pour cent de la concen tration th orique Par mesure d homog n it les valeurs des concentrations sont indiqu es en fonction de la dilution de la solution 1 1 000 Pour la d tection des m taux dans les embryons nous utilisons des r actifs organiques donnant une r action color e caract ristique Les indications d tail l es sur ces r actifs et leur mode d emploi figurent dans l ouvrage de Bernot 1947 La d termination des m taux est faite sur lame creuse en m langeant 3 gouttes d une suspension d embryons avec 1 goutte de r actif correspondant au m tal recherch Les r actifs suivants pr par s au moment de l emploi sont utilis s Zinc solution satur e de dithizone dans l alcool 70 Nickel solution alcoolique de dim thylglyoxime 1 pour cent solution alcoolique de furil dioxime 2 pour cent Mercure solution satur e de diph nylcarbazone dans l alcool 90 R SULTATS EXP RIMENTAUX Sels m talliques et d veloppement Tous les m taux sont utilis s
15. extension de la touffe cili e apicale correspond au type 3 selon la terminologie de H rstadius 1935 La coloration est intense au niveau des cellules m senchymateuses La coloration des parois ectodermiques est plus faible et appara t uniform ment r partie Ces blastulas animalis es peuvent survivre quelques jours apr s leur transfert dans l eau de mer normale On observe alors une att nuation de la coloration par la dithizone mais sa r parti tion n est pas modifi e Des concentrations plus faibles ont t utilis es Dans les solutions 1 100 000 la coloration reste tr s faible pendant toute la segmentation Le d veloppement 5584 3 T 270 R LALLIER LES M TAUX LOURDS ET ne d passe pas le stade gastrula Celles ci portent au p le v g tatif de nom breuses expansions cili es de la paroi La coloration g n rale ce stade est plus accentu e au niveau de ces expansions Dans une seconde s rie d essais les embryons choisis un stade d termin sont mis dans une solution de chlorure de zinc 1 10 000 puis lav s et trait s par la dithizone La dur e du s jour dans les solutions est vari e Elle est toute fois limit e avec les s jours trop prolong s par la g n ralisation de la coloration et par la toxicit plus forte du Zn pour les stades avanc s Les s jours relative ment courts nous ont donn les indications les plus suggestives sur l aptitude des diverses parties de l embryon fixer
16. in the embryos could be displaced by mercury ions With the addition of p chloro mercuribenzoic acid the development of em bryos in zinc chloride was blocked The sulfhydryl groups do not appear to be essential for animalization by zinc ions The role of zinc in the animalization of sea urchin eggs 1s discussed as a func tion of the formation of complexes between metal and proteins Ce travail a t effectu au Laboratoire Arago Banyuls sur Mer P O J adresse mes remerciements au Directeur Monsieur le Professeur G Petit au 278 R LALLIER LES M TAUX LOURDS sous Directeur Monsieur le Docteur C Delamare Debouteville et Monsieur le Docteur P Bougis pour les facilit s de travail qu ils m ont procur es pendant mon s jour L acide p chloromercuribenzo que m a t fourni par Monsieur le Professeur J Brachet et je lui exprime ici tous mes remerciements TRAVAUX CITES ALBERT A 1952 Quantitative studies of the avidity of naturally occurring substances for trace metals II Amino acids having three ionizing groups Biochem J 50 690 7 BERNOT J 1947 R actifs organiques en analyse min rale par l quipe du laboratoire de recherches de Hopkin et Williams Ltd Paris Dunod FREY WyYSSLING A 1948 Submicroscopic Morphology of Protoplasm and its derivatives London Elsevier Fusi T 1954 Notes on presence of zinc in nucleoli and in the sperm middle piece in some marine forms Annot zoo
17. l tat bivalent Ce sont les chlorures de nickel de cobalt de mangan se et le sulfate ferreux Chlorure de nickel 11 s ries exp rimentales compl tes ont t effectu es avec des r sultats constants d une s rie l autre Dans les solutions 1 1 000 le d veloppement est retard Apr s 23 heures les embryons sont au stade blastula 50 pour cent sont closes L paississement apical est peu marqu et recouvert de cils courts Apr s 48 heures tous ces embryons sont clos Ils sont sph riques avec des parois tr s minces L archen t ron les spicules et les cellules pigmentaires manquent Deux groupes cellu laires opacifi s tal s la face interne de l embryon l un au p le animal l autre au p le v g tatif sont tant t isol s tant t r unis par une trav e cellulaire opaque On trouve en outre quelques rares gastrulas munies d une petite v sicule archent rique Celle ci se d sint gre le jour suivant et est remplac e par un groupe de cellules opacifi es Ces embryons laiss s 5 ou 6 jours dans la solution ne s y d veloppent pas et leur taille diminue sensiblement Report s dans l eau LA D TERMINATION EMBRYONNAIRE 267 de mer apr s un s jour de 23 heures seulement ils prennent l aspect que nous venons de d crire Ils sont tous lys s le lendemain de leur transfert Dans les solutions 1 5 000 le ralentissement du d veloppement est moins accentu Dans les cultures de 23 he
18. l jap 3 115 17 GurD F R N amp Goopman D S 1952 Preparation and properties of serum and plasma proteins XXXII The interaction of human serum albumin with Zn ions J Amer chem soc 74 670 5 GUSTAFSON T amp SAVHAGEN R 1950 Studies on the determination of the oral side of the sea urchin egg I The effects of some detergents on the development Ark Zool A 42 10 1 6 HELLERMAN L CHINARD F P amp DeiTz V R 1943 Proteins sulfhydryl groups and the reversible inactivation of the enzyme urease The reducing groups of egg albumin and of urease J biol Chem 147 443 62 HERBST C 1892 Experimentelle Untersuchungen ber den Einfluss der ver nderten chemischen Zusammensetzung des umgebenden Mediums auf die Entwicklung der Tiere I Versuche an Seeigeleiern Z wiss Zool 55 446 518 Horstaptius S 1935 ber die Determination im Verlaufe der Eiachse bei Seeigeln Pubbl Staz zool Napoli 14 251 429 amp GUSTAFSON T 1954 The effect of three antimetabolites on sea urchin development J Embryol exp Morph 2 216 26 LALLIER R 1955a Effets des ions zinc et cadmium sur le d veloppement de l uf de l oursin Paracentrotus lividus Archives de Biologie Li ge et Paris 66 75 102 1955b Animalisation de l uf d oursin par les colorants azoiques et les bleus d aniline sulfon s Exp Cell Res 9 232 40 1955c Recherches sur la d termination emb
19. larchen t ron sont form s La bouche est pr sente la base du lobe oral moins fr quemment toutefois dans les solutions 1 50 000 A cette concentration les spicules au nombre de 3 ou 4 en g n ral tr s pineux enchev tr s forment une 268 R LALLIER LES METAUX LOURDS ET couronne entourant la base de l archent ron Les embryons restent viables plus longtemps dans les solutions 4 1 100 000 mais ils r gressent progressivement atteignant apr s une semaine le tiers ou la moiti de leur taille initiale Chlorure de Cobalt Cinq s ries d exp riences ont t faites Peu de dif f rences ont t observ es entre chaque s rie Dans les solutions 4 1 5 000 le d veloppement est ralenti Apr s 24 heures ces cultures ne contiennent encore que de jeunes gastrulas pour la plupart en voie d closion tandis que les t moins sont d j de petits pluteus Des embryons restent bloqu s aux stades morula et blastula Leur pourcentage varie selon les pontes mais il ne d passe gu re 10 pour cent du total Dans les cultures de 48 heures toutes les gastrulas sont closes Elles portent au p le v g tatif de nombreuses expansions en forme de bourgeons pais recou verts de cils courts Partout ailleurs les parois sont minces et recouvertes de cils courts m me au p le animal L archent ron est r duit une petite v sicule Les cellules pigmentaires sont tass es la base de cet archent ron Les spicules man
20. les ufs f cond s pendant 16 heures dans la solution suivante eau de mer 95 cc LiCI 0 65 M 5 cc Ces embryons sont form s d une petite v sicule ectodermique parois minces et contours anguleux contenant deux spicules ramifi s des cellules pigmentaires et m senchymateuses et d un entoderme volumineux Celui ci compl tement vagin est form de trois seg ments parois paisses correspondant respectivement l intestin ant rieur moyen et post rieur Apr s un s jour de 10 minutes dans ZnCl 1 10 000 la coloration ne se d veloppe qu au niveau des cellules m senchymateuses Apr s 1 heure de s jour les parois de l entoderme apparaissent color es la coloration est plus accentu e au niveau du segment correspondant l intestin ant rieur et plus faible dans le segment interm diaire Le segment post rieur ou anal n est pas color Le s jour des embryons dans la solution de ZnCl ne peut gu re tre prolong davantage car ils ne tardent pas se lyser Dans ces recherches les embryons sont lav s plusieurs fois l eau de mer LA D TERMINATION EMBRYONNAIRE 271 avant d tre trait s par la dithizone Nous avons galement fait des lavages avec une solution de Complexone 1 pour cent dans l eau de mer Ces deux m thodes de lavage donnent des r sultats identiques Le probl me du d placement du zinc par certains m taux lourds tant li par son aspect technique aux questions tudi es d
21. lle pour l tude du d terminisme de l animalisation R SUM Les effets animalisants du zinc sur le d veloppement de l uf d oursin Para centrotus lividus sont tudi s et compar s avec les effets d autres m taux pr sentant des propri t s voisines Ni Co Mn et Fe Avec le chlorure de nickel 1 1 000 la formation de l archent ron est sup prim e Les blastulas sont couvertes de cils courts La touffe cili e apicale n est pas form e Avec le chlorure de nickel 1 5 000 et 1 10 000 les embryons pr sentent une organisation sym trie radiale LA D TERMINATION EMBRYONNAIRE 277 Avec le chlorure de cobalt la gastrulation est perturb e et le d veloppement est inhib Le zinc est mis en vidence dans les embryons trait s diff rents stades du d veloppement par la coloration rouge qu il d veloppe en pr sence de dithizone Le m tal est r parti dans le m senchyme et dans l entoderme chez les jeunes stades Dans les pluteus le zinc appara t fix dans les cellules pigmentaires Le nickel est d tect par les r actions color es qu il donne avec la dim thyl glyoxime et avec l furil dioxime Le nickel est mis en vidence dans le m sen chyme de la jeune blastula La r action color e donn e par la dithizone en pr sence du zinc n est pas modifi e par des lavages pr alables avec une solution de Complexone Le zinc fix sur les embryons peut tre d plac par les ions mercuriq
22. n vitro que le chauffage de l ovalbumine en pr sence de traces de zinc entra ne une forte diminution de la coloration par la dithizone Le renforcement de l affinit de la prot ine d natur e pour le m tal et accroissement de la stabilit des complexes form s apparaissent responsables de ce ph nom ne Ces remarques tout en restreignant la possibilit de mettre en vidence par cette m thode la totalit du zinc fix ne touchent toutefois en rien la possibilit de d tecter le m tal engag dans certaines combinaisons Sans pr juger de la nature de ces combinaisons nous ferons remarquer qu un lavage pr alable l eau ou avec une solution de Complexone n emp che pas le d veloppement de la coloration Nous avons rendu compte de l augmentation de l intensit de la 274 R LALLIER LES M TAUX LOURDS ET coloration au cours du d veloppement Ce ph nom ne indique une fixation croissante de zinc et le stade blastula marque cet gard un maximum L tude de la r partition de la coloration diverses tapes du d veloppement ainsi que chez les embryons v g tativis s indique d une part une affinit plus grande du m tal pour les r gions v g tatives et d autre part la diminution progressive de la fixation du m tal avec les progr s de la diff renciation Nous avons vu que chez les pluteus seules les cellules pigmentaires donnent une r action color e la dithizone Aux stades avanc s du d veloppement
23. pe d organisation sym trie radiale analogue celui des embryons d velopp s dans les solutions de NiCP 1 5 000 et 1 10 000 L existence d une telle similitude malgr la diff rence norme des concentrations en sels m tal liques met en vidence l activit plus lev e du zinc sur le d veloppement Cette tendance la radialisation des embryons a galement t observ e avec d autres substances d tergents Gustafson amp S vhagen 1950 8 chloroxanthine Horstadius amp Gustafson 1954 colorants sulfoniques Lallier 1955b persul fate de sodium Lallier 1955c Avec ces colorants et le persulfate notamment nous avons pu obtenir un effet animalisant avec des concentrations relativement lev es et un effet radialisant avec des concentrations plus faibles Il appara t donc que ces agents peuvent exercer une action animalisante ou radialisante selon la concentration utilis e Le nickel et le zinc en sont un autre exemple Nous avons galement signal que les embryons cultiv s de fa on permanente dans les solutions de NiC subissent une diminution progressive de taille Ce ph nom ne se pr sente galement avec le persulfate de sodium et un moindre degr avec ZnCl et les colorants sulfoniques La diminution de taille appara t li e la survie relativement longue des embryons dans ces conditions Diff rents des pluteus ces embryons en raison de leur structure ne peuvent se nourrir aux d pens des
24. quent Chez quelques rares gastrulas l ectoderme apical est pliss L archen t ron plus d velopp s tend jusqu au p le animal Ces embryons sont peu mobiles et leur viabilit est faible Ils sont tous lys s apr s 3 jours de culture Leur transfert dans l eau de mer apr s un s jour limit 23 heures am liore leur d veloppement Les embryons prennent alors une structure prismatique plus ou moins marqu e Le tube digestif se diff rencie en trois segments Les spicules au nombre de 3 ou 4 sont petits et pineux On rencontre en outre de rares formes plut iques avec un lobe oral hyperd velopp et des bras anaux r duits Tous ces embryons sont peu viables et ils ne peuvent tre cultiv s plus longtemps que ceux laiss s dans la solution de CoCl Dans les cultures de contr le en pr sence de Complexone CoCl 1 5 000 Complexone 0 05 100 le d veloppement est normal Aux concentrations 1 10 000 et 1 50 000 le retard du d veloppement est peu sensible Ces pluteus de petite taille ont une forme g n rale globuleuse Les bras anaux et le lobe oral sont peu d velopp s La bouche manque 1 10 000 Les spicules sont pineux Report s dans l eau de mer apr s un s jour de 23 heures ces embryons se d veloppent en pluteus avec des bras anaux irr guli rement orient s Les spicules sont pineux La bouche est pr sente Chlorure de mangan se Trois cultures ont t faites avec le chlorure de mangan se
25. ryonnaire chez les Echinodermes L action des oxydants et de l acide p chloromercuribenzoique sur le d veloppement de l uf de l oursin Paracentrotus lividus sous presse LEHNINGER A L 1950 Role of metal ions in enzyme systems Physiol Rev 30 393 429 LInDAHL P E 1936 Zur Kenntnis der physiologischen Grundlagen der Determination im Seeigelkeim Acta zool Stockh 17 179 365 MARTELL A E amp CALVIN M 1952 Chemistry of metal chelate compounds New York Prentice Hall Meier K E amp Kaunat H 1954 Histochemische Untersuchungen ber das Inselzink Natur wissenschaften 11 261 PERKINS D J 1953 A study of the effect of amino acid structure on the stabilities of the complexes formed with metals of group II of the periodic classification Biochem J 55 649 52 TANFORD C 1952 The effect of pH on the combination of serum albumin with metals J Amer chem Soc 74 211 15 WATERMAN A J 1937 Effect of salts of heavy metals on development of the sea urchin Arbacia punctulata Biol Bull Wood s Hole 73 401 20 WILLIAMS R J P 1953 Metal ions in biological systems Biol Rev 28 381 415 Manuscript received 12 xi 55
26. s m talliques sont encore tr s restreintes Ces probl mes ont fait l objet de revues d ensemble o le r le physiologique de ces complexes est particuli rement examin Lehninger 1950 Williams 1953 L ouvrage de Martell amp Calvin 1952 traite des diff rents aspects de la chimie des complexes Dans les conditions physiologiques les ions forment des complexes avec de nombreuses substances jouant un r le physio logique important prot ines acides amin s peptides acides organiques et divers compos s phosphoryl s Cette num ration n est d ailleurs pas exclusive Nous ne consid rerons ici que les complexes form s avec les prot ines En con traste avec les ions de m taux alcalins et alcalino terreux les ions de m taux lourds forment avec les prot ines des complexes de stabilit lev e dans les conditions physiologiques normales En g n ral l ordre de stabilit de ces com plexes est pour les m taux tudi s ici Mnt lt Fet lt Co lt Nit lt Cut lt Znt La nature des groupes fonctionnels des prot ines responsables de la fixation varie selon la nature de ces ions Pour le zinc la fixation est possible avec tous les groupes fonctionnels Elle d pend toutefois de la concentration et de l af finit relative du m tal pour chaque groupe fonctionnel C est ainsi qu faible LA DETERMINATION EMBRYONNAIRE 275 concentration le zinc se lierait essentiellement aux groupes SH Aux concentra tions plus
27. sociation des prot ines entre elles et avec d autres l ments cellulaires tant largement conditionn es par la nature le nombre et la position de ces groupes leur blocage entra ne d importantes cons quences sur ces ph no m nes d association Ceux ci jouant sans aucun doute un r le important au cours du d veloppement Frey Wyssling 1948 on con oit ainsi l efficacit de certains m taux lourds sur les processus de la d termination embryonnaire La position des ions l gard des probl mes de structure appara t d ailleurs remarquable D une part les ions de m taux alcalins et alcalino terreux au r le physiologique essentiel peu aptes former des complexes avec les prot ines dynamisent les structures gr ce leur haute capacit d change D autre part les ions de m taux lourds en formant des complexes stabilit lev e avec les prot ines introduisent un facteur d inertie dans la vie cellulaire interf rant ainsi dans l dification et le renouvellement permanent des structures au cours du d veloppement L tude du mode d action des ions de m taux lourds offre ainsi une voie d acc s l analyse de la d termination embryonnaire L analyse du mode d action du zinc et du nickel notamment par la comparaison de leurs effets et de leur aptitude intrins que former des complexes jointe l tude de leur r parti tion dans les diff rentes structures cellulaires appara t comme une voie nouve
28. t de l paississement apical n1 extension de la touffe cili e apicale Celle ci est d ailleurs form e de cils courts Dans les solu tions plus dilu es les embryons pr sentent les caract res d une organisation sym trie radiale Les ions des m taux lourds sont responsables de l action de ces sels m tal liques sur le d veloppement Cette constatation d coule des exp riences mon trant que le Complexone supprime les effets des sels de nickel et de cobalt Nous avons galement observ ce ph nom ne avec le chlorure de zinc Lallier 1955a Les embryons sont soustraits l action de l ion m tallique celui ci tant masqu dans le complexe form avec le Complexone Si l on compare les effets du nickel avec ceux du zinc on remarque des dif f rences importantes Le zinc est plus toxique que le nickel pour l uf d oursin En effet la concentration 1 1 000 la segmentation est normale avec NiCP elle est bloqu e aux stades 16 et 32 avec ZnCP Le zinc est un agent animalisant tr s efficace Avec ZnCl la concentration 1 10 000 tous les embryons sont des blastulas hypercili es L extension de la touffe cili e apicale correspond au type selon la terminologie de H rstadius Dans les solutions de NiCl 1 10 000 aucune blastula ne pr sente d hyper d veloppement de la plaque et de la touffe cili e apicales Enfin les embryons cultiv s dans les solutions de ZnCl 1 500 000 pr sen tent un ty
29. t un agent animalisant moins efficace que Je zinc Lallier 1955a Il apparait donc peu probable que la fixation du zinc sur les groupes sulfhydriles joue un r le d terminant dans l animalisation L analyse de l action de divers oxydants et de l acide p chloromercuriben zoique sur le d veloppement de l uf d oursin nous a d ailleurs conduit une conclusion analogue Lallier 1955c 276 R LALLIER LES M TAUX LOURDS ET La fixation du zinc sur les groupes sulfhydriles n apparaissant pas jouer un r le d terminant dans l animalisation il reste n anmoins d autres groupes nombreux et vari s capables de fixer le zinc et de se trouver ainsi l origine de son action sur la d termination embryonnaire A cet gard les groupes basiques amin s notamment pr sentent un int r t particulier Ils sont en effet tr s r pandus et ils forment facilement des complexes avec certains m taux lourds Nous ferons remarquer ici que des colorants sul foniques sont d actifs agents animalisants Lallier 1955b Or ces colorants pos s dant gr ce leurs groupes sulfoniques acides une affinit particuli re pour les groupes basiques cellulaires le r le de ces groupes dans ces ph nom nes d ani malisation appara t fort probable Le blocage des groupes fonctionnels des cha nes lat rales est l origine d im portants changements dans les propri t s et la structure des prot ines En effet les relations d as
30. ues L acide p chloromercuribenzoique bloque le d veloppement des embryons cultiv s en pr sence de chlorure de zinc Les groupes sulfhydriles n apparaissent pas jouer un r le essentiel dans l animalisation par le zinc Le r le du zinc dans l animalisation de l uf d oursin est discut en fonction de la formation de complexes entre le m tal et les prot ines SUMMARY The animalizing effects of zinc on the development of eggs of the sea urchin Paracentrotus lividus were studied and compared with the effects of other closely related metals nickel cobalt manganese and iron Nickel chloride 1 1 000 suppressed the formation of an archenteron The blastulae were covered with short cilia The apical tuft was not formed Nickel chloride 1 5 000 and 1 10 000 induced the formation of radial larvae Cobalt chloride disturbed gastrulation and inhibited development Zinc was detected in the embryos at various stages of development by the formation of a deep red colour with dithizone Zinc appeared to be distributed in the mesenchyme and entoderm of the young stages In the pluteus it appeared to be fixed in the pigment cells Nickel was located by the colour reactions with dimethylglyoxime and furil dioxime The colour was developed in the mesenchyme of the young blastula The colour reaction with dithizone was not modified by previous washings with Complexone ethylene diamine tetra acetic acid solution Zinc fixed
31. ures toutes les blastulas sont closes Elles sont l g rement allong es selon leur axe animal v g tatif et leurs contours sont pliss s L paississement ectodermique apical est peu marqu et recouvert de cils courts Une petite bauche archent rique est form e chez de nombreux embryons Les spicules manquent Observ s 24 heures plus tard ces embryons se signalent par une l g re extension en forme de lobe de la zone apicale L ectoderme est paissi ce niveau et recouvert de cils courts Le p le anal est entour par une bande d ectoderme paissie recouverte de cils courts L archen t ron est encore r duit une petite v sicule Les cellules m senchymateuses sont rares et opacifi es Les spicules et les cellules pigmentaires manquent Ces em bryons peuvent tre laiss s dans la solution pendant plusieurs jours souvent une semaine tout en restant parfaitement viables mais ils pr sentent alors une r gres sion caract ristique Les parois et les zones cili es s amincissent progressivement L archent ron se d sint gre et il est remplac par un groupe de cellules opaci fi es L embryon tend devenir sph rique ses parois s amincissent consid rable ment C est peine si l on remarque un l ger paississement au p le apical et au niveau de la bande cili e anale Ces ph nom nes s accompagnent d une diminu tion souvent consid rable et d ailleurs variable de la taille de l embryon Voici
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