Pneumocystis - Myconostica
Contents
1. Pneumocystis jirovecii non d tect R sultat 2 Pneumocystis jirovecii d tect R sultat positif Indiquer la valeur de Ct gt R sultat 3 chec du test pr sence d inhibiteurs ou d une autre substance inconnue Plus la valeur de Ct est faible plus la probabilit de la maladie est lev e Les valeurs de Ct proches de la valeur limite de 39 0 traduisent plut t une colonisation qu une infection Toutefois certains malades peuvent pr senter un taux de P jirovecii tr s faible en raison de la mauvaise qualit de l chantillon ou du traitement pr alable ou en raison de la nature de la charge fongique chez ces patients Limites du mode op ratoire La principale limite de ce mode op ratoire est li e la qualit de l chantillon primaire Si l chantillon est tr s petit ou n a pas t pr lev dans la zone affect e du poumon le test peut se r v ler moins sensible et donner un r sultat faussement n gatif Fran ais 11 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Pour diagnostic in vitro s rie Stratagene Mx3000 Echantillons Respiratoires Il convient de centrifuger les chantillons de LBA avant extraction de ADN du culot Les donn es ont galement montr qu une diminution lors de l tape de centrifugation du volume de surnageant utilis pour l extraction r duit la proportion d inhibiteurs p n trant dans le syst me L valuation clinique des performances n2. a pas t confirm e sur l automate MX3005P Bien que le proc d d extraction d ADN fongique MycXtraT soit con u pour liminer les inhibiteurs de la PCR tous les m dicaments et toutes les populations de patients n ont pas t valu s Ce mode op ratoire n a pas t valu de mani re approfondie sur les expectorations et n a pas non plus t valu sur les chantillons provoqu s dans le s rum physiologique ni sur des chantillons pr lev s sur des enfants Des r sultats faussement positifs peuvent tre obtenus en cas de contamination externe de l chantillon initial ou du test par exemple par de l air contenant P jirovecii par une mauvaise technique de manipulation du t moin positif ou par contamination externe en particulier de la pipette par l ADN de P jirovecii Dans la mesure o un r sultat vraiment positif peut tre obtenu avec des chantillons de patients colonis s temporairement ou en permanence par P jirovecii le r sultat du test doit tre interpr t cliniquement LICENCE TopTaq Hot Start est fourni par QIAGEN QIAGEN est une marque d pos e de Qiagen GmbH Hilden Allemagne SmartCycler est une marque d pos e de Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale Californie 94089 tats Unis Ce produit est vendu sous licence par le Public Health Research Institute PHRI Newark New Jersey tats Unis et il est sous protection de la propri t intellectuelle du PHRI Son
3. cautions Ce kit est r serv au diagnostic in vitro L utilisation du kit est r serv e aux professionnels de laboratoire Les modes op ratoires doivent tre suivis de mani re viter la production d a rosols lors de la manipulation des chantillons Il convient d observer les pr cautions habituelles et les recommandations en vigueur dans l tablissement lors de la manipulation des chantillons Une fiche de donn es de s curit est disponible aupr s de Myconostica Ltd Ce test est compatible uniquement avec les automates de la s rie Stratagene Mx3000 et le logiciel MxPro version 4 10 Au cours des tudes de validation les observations suivantes sp cifiques cet automate ont t faites o Si l automate vient d tre utilis laisser la lampe refroidir pendant au moins 1 h avant de lancer un nouveau test MycAssay Pneumocystis Dans le cas contraire il existe un risque de perte de sensibilit pouvant entra ner des r sultats faussement n gatifs o Par rapport aux autres automates test s cet automate pr sente une pr cision inf rieure faible concentration et autour de la valeur limite clinique Ne pas utiliser les r actifs ni les t moins si les sachets protecteurs sont ouverts ou endommag s la livraison Les r actifs et les t moins ne sont pas interchangeables d un lot un autre Ne jamais m langer les r actifs ou les t moins provenant de diff rents tubes m me s ils sont du m
4. moin R p ter toute positif l analyse Patient 39 0 ou non d tect e Entre 29 3 et 33 3 N gatif pour R sultat Pneumocystis mentionner dans le rapport R sultat 1 Patient lt 39 0 Sans objet Positif pour R sultat Pneumocystis mentionner dans le rapport R sultat 2 Patient 39 0 ou non d tect e lt 29 3 ou gt 33 3 chec de l IAC dans R p ter l analyse de l chantillon l chantillon R sultat 3 Pour en savoir plus sur les R sultats 1 2 et 3 voir la section Rapport clinique 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran ais 7 MycAssay Pneumocystis Pour diagnostic in vitro s rie Stratagene Mx3000 Echantillons Respiratoires 4 2 4 3 D pannage Le t moin n gatif a mis un signal positif dans la voie FAM gt Une contamination s est produite pendant la pr paration Aucun des r sultats de l analyse n est fiable R p ter toute l analyse en faisant preuve de pr caution lors de l ajout des matrices en particulier du t moin positif Tube 4 pour viter toute contamination crois e Veiller ce que le plan de travail et l quipement soient bien d contamin s avant et apr s utilisation Le t moin n gatif a t mal positionn sur l automate Veiller correctement nommer toutes les r actions dans le logiciel et bien orienter les barrettes de tubes sur l automate Des tubes ou plaques autres que ceux recommand s ont t utilis s Les s
5. munis de bouchons Agilent Technologies r f 401428 et 401425 L utilisation d autres sources ou types de plastique est susceptible d invalider les seuils et par cons quent les revendications du mode d emploi En cas d utilisation d une source alternative il est recommand de mener une validation locale avec les r actions des contr les positif et n gatif Contenu du kit Description Le kit est constitu de 5 sachets en aluminium 3 compartiments scell s utilisables individuellement Chaque sachet contient les quantit s n cessaires de r actifs pour r aliser 8 r actions Volume Tube 1 dNTP 66 uL bouchon orange MgCl2 Solution tamponn e de complexe d ADN polym rases Tube 2 lt 0 01 d amorces 66 uL bouchon bleu lt 0 01 de balises mol culaires lt 0 0001 d IAC L IAC est un plasmide recombinant contenant une s quence non infectieuse et sans relation avec les s quences cibles Pneumocystis Tampon Tris HCI Tube 3 T moin n gatif 25 uL bouchon Eau transparent Tube 4 T moin positif 25 uL bouchon noir lt 0 0001 d ADN t moin positif La mol cule du t moin positif est un plasmide recombinant contenant les s quences cibles de Pneumocystis Tampon Tris HCI 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran ais 2 Pour diagnostic in vitro MycAssay Pneumocystis Echantillons Respiratoires s rie Stratagene Mx3000 Autres l ments contenus dans le kit CD ROM du mode op ratoire du test MycA
6. utilisation se limite au diagnostic humain in vitro Mx3000P et Mx3005P sont des marques d pos es de Stratagene MxPro est une marque de commerce de Stratagene Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupport lab21 com 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran ais 12
7. 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 Pour les puits vides il est recommand de renseigner le champ Well Type par la mention lt blank gt s lectionner dans la liste d roulante Well Type afin d viter les interf rences dues la r fraction de la lumi re par le plastique avec le signal des puits contenant un m lange r actionnel R p ter l importation dans l onglet Thermal Profile Setup pour le programme de PCR de ce test Pour ce faire d finir le champ Thermal Profile Design sur Custom puis importer partir du m me fichier qu en 2 4 l issue de cette tape l onglet Thermal Plate Setup doit se pr senter comme dans l exemple suivant Pas Soup CT PE SD Thermal Profile Alpas Endpoime Egi Parier FA Sam Prate Dans l onglet Plate Setup nommer les puits ou tubes de mani re adapt e Cliquer avec le bouton droit de la souris sur l un des puits en surbrillance ou groupe de puits en cas de r plicats et s lectionner Well Information dans la liste d options Saisir le nom de l chantillon contenu dans ce puits dans le champ Name Apr s avoir nomm tous les puits enregistrer l analyse sous un nom de fichier pertinent comprenant la date et les initiales de l op rateur Lancer l analyse en s lectionnant le bouton Run en haut droite de l cran de l onglet Instrument puis en cliquant sur le bouton Start dans le coin inf rieur droit Rappel L instrument doit refroidir pendant au moins 1 heu
8. Pour diagnostic in vitro MycAssay Pneumocystis SL s rie Stratagene Mx3000 my conosjica chantillons Respiratoires MycAssay Pneumocystis s rie Stratagene Mx3000 chantillons Respiratoires REF 080 035 Usage pr vu L utilisation de MycAssay Pneumocystis r serv e au personnel de laboratoire qualifi est indiqu e pour la d tection qualitative d ADN g nomique de Pneumocystis jirovecii extrait d chantillons respiratoires des voies respiratoires inf rieures par exemple chantillons bronchiques comme aide au diagnostic chez les patients adultes suspects de pneumonie P jirovecii Le test MycAssay Pneumocystis a t valid pour une utilisation sur les automates de la s rie Stratagene Mx3000 Mx3000P et Mx3005P avec le logiciel MxPro version 4 10 R sum et explication La pneumonie Pneumocystis jirovecii anciennement carini PPC est une pneumonie opportuniste commune chez les patients immunod prim s en particulier ceux atteints d une infection VIH un stade avanc ou du SIDA Il s agit g n ralement d une infection extra hospitali re subaigu qui provoque une insuffisance respiratoire progressive pouvant entra ner la mort en l absence de traitement Un traitement pr ventif par le trim thoprime sulfam thoxazole Bactrim ou Septrin est syst matiquement administr la plupart des patients risque une pratique qui a permis de consid rablement r duire le nombre de cas de PPC m
9. ais 4 Pour diagnostic in vitro MycAssay Pneumocystis Echantillons Respiratoires s rie Stratagene Mx3000 2 1 2 2 2 3 2 4 proc der une nouvelle centrifugation pour recueillir le reste du contenu dans le fond du tube avant de tenter de pr lever les derni res parties aliquotes Utiliser un embout de pipette neuf pour chaque transfert de liquide Apr s utilisation reboucher chaque tube r actionnel et jeter imm diatement le tube et le contenu restant dans un conteneur d chets cliniques scellable Il est impossible de conserver les r actifs inutilis s pour un usage ult rieur Faire preuve d une extr me pr caution lors du pr l vement la pipette dans le Tube 4 ADN t moin positif afin de ne pas contaminer d autres tubes r actionnels Le bouchage des autres tubes r actionnels avant ouverture du Tube 4 peut r duire le risque de contamination crois e V rifier que tous les tubes r actionnels sont bien bouch s Noter la position de chaque chantillon sur la barrette de tubes En cas d utilisation de plusieurs barrettes tiqueter le premier tube de chaque barrette Centrifuger les tubes r actionnels pendant 10 s dans la minicentrifugeuse munie de l adaptateur pour tubes de PCR de 0 2 mL V rifier par un contr le visuel l absence de bulles dans le m lange r actionnel Passer aussit t la Section 2 Les r actions du test MycAssay Pneumocystis restent stables temp rature ambiante pendant un maximum
10. ais des perc es ont toutefois lieu et les individus qui ne connaissent pas leur s ropositivit peuvent d couvrir qu ils sont atteints du SIDA au moment du diagnostic de la PPC La PPC touche galement d autres cat gories de patients immunod prim s tels que les receveurs d une greffe d organe plein et les patients atteints d hypogammaglobulin mie ou de leuc mie chronique l heure actuelle le diagnostic de la PPC repose sur des m thodes de microscopie car il est impossible de r aliser des cultures de routine de P jirovecii en laboratoire de microbiologie Le lavage broncho alv olaire LBA est le mode de pr l vement le plus courant Les m thodes courantes de diagnostic comprennent notamment l immunofluorescence ou immunofluorescence directe et la coloration histologique des chantillons S MycAssay Pneumocystis est un kit de diagnostic mol culaire pour la d tection de P jirovecii qui repose sur la technologie de la PCR balises mol culaires Le mode op ratoire complet extraction d ADN de l chantillon clinique comprise peut tre r alis en 4 heures voire 2 heures si l ADN extrait est disponible imm diatement Ce test offre l avantage direct d une am lioration de l efficacit du laboratoire associ e une rapidit d analyse pour des b n fices cliniques probables L exactitude de diagnostic du test d pend en grande partie de la qualit de l chantillon Principes du test Apr s m lange des r acti
11. ant la pr paration du test car un exc s de solution nettoyante peut inhiber la PCR 1 3 Un sachet contient un Tube 1 un Tube 2 un Tube 3 et un Tube 4 Chaque sachet contient les quantit s n cessaires de r actifs pour r aliser 8 r actions Pour chaque passage au moins une r action avec un t moin positif et une r action avec un t moin n gatif doivent tre r alis es avec les r actifs d un m me lot du kit Un sachet permet ainsi d analyser 6 chantillons S il y a plus de 6 chantillons de patient analyser plusieurs sachets peuvent tre utilis s condition que ceux ci proviennent du m me lot du kit Les 5 sachets du kit permettent d analyser un maximum de 38 chantillons de patient 1 4 Calculer le nombre de r actions requises en se reportant au tableau ci dessous Nombre de Nombre maximum sachets d chantillons de patient 6 r 2 3 4 5 1 5 Sortir le nombre adapt de sachets du cong lateur Ne pas utiliser un sachet non scell En cas de cong lation des chantillons de patient apr s extraction sortir galement ceux ci du cong lateur 1 6 Ouvrir le nombre n cessaire de sachets en les d chirant et en extraire les tubes En cas d utilisation de plusieurs sachets mais d analyse d un seul jeu de t moins positif et n gatif les Tubes 3 et 4 ne doivent tre retir s que d un seul sachet Manipuler le Tube 4 avec pr caution Il contient un t moin positif base d ADN qui en cas de contamin
12. ation risque de donner des r sultats faussement positifs 1 7 Laisser le contenu des tubes d congeler temp rature ambiante pendant 5 10 minutes V rifier que le contenu de chaque tube est enti rement d congel avant utilisation Agiter les tubes et les chantillons de patient au vortex pour en m langer le contenu puis centrifuger bri vement dans une microcentrifugeuse pour s assurer qu il ne reste pas de d p t au fond des tubes avant utilisation 1 8 Placer le nombre requis de tubes de PCR sur le portoir 1 9 Pr parer toujours le t moin n gatif en premier suivi des chantillons Il convient de toujours pr parer le t moin positif en dernier 1 10 Les volumes de r actifs et d ADN sont indiqu s dans le tableau ci dessous R action R actif T moin n gatif chantillon de T moin positif patient Tube 1 bouchon orange 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL Tube 2 bouchon bleu 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL Tube 3 bouchon transparent 10 uL chantillon de patient 10 uL Tube 4 bouchon noir y Volume total 25 uL 1 11 Ajouter les r actifs dans l ordre indiqu dans le tableau ci dessus Tube 1 suivi du Tube 2 puis de la matrice t moin n gatif chantillon ou t moin positif Faire preuve de pr caution lors du pr l vement des parties aliquotes du Tube 1 le liquide est l g rement visqueux et peut adh rer la paroi interne du tube Si c est le cas 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran
13. de 60 minutes Apr s pr paration de la PCR nettoyer soigneusement le plan de travail l aide d un agent de d contamination de l ADN R alisation de l analyse D marrer le logiciel MxPro version 4 10 Introduire le CD ROM du mode op ratoire du test MycAssay Pneumocystis Myconostica Dans le menu New Options s lectionner la premi re option Real Time Quantitative PCR Multiple Standards puis cliquer sur OK comme indiqu New Options Select experiment 4 project type Real time Quantitative PCR Multiple Standards Cancel Comparative Quantitation Calibrator C SYBR Green with Dissociation Curve C EvaGreen with Dissociation Curve C Allele Discrimination Z SNP s Real Time C Molecular Beacon Melting Curve Plate read C Quantitative Plate Read C Plate Read Allele Discrimination Project type C Multiple Experiment Analysis F np on for warm up I Don t show this again Dans l onglet Plate Setup cliquer sur le bouton Import droite Dans le menu d roulant Look in s lectionner MycAssay PNE Myconostica Protocol CD ROM puis importer le fichier nomm MycAssay Pneumocystis v3_1 mxp Cliquer sur Finish l issue de cette tape l onglet Plate Setup doit se pr senter comme dans l exemple suivant Fran ais 5 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Pour diagnostic in vitro s rie Stratagene Mx3000 Echantillons Respiratoires 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 1 3
14. de sodium cromoglicate de sodium terbutaline tobramycine valuation des performances La valeur limite clinique de 39 0 a t d termin e apr s analyse d un ensemble d chantillons cliniques provenant de plusieurs populations de patients Des chantillons cliniques pr lev s par LBA dans deux h pitaux dont l ADN a t extrait avec le kit MycXtra puis qui ont t congel s ont servi valuer les performances du kit MycAssay Pneumocystis Les r sultats obtenus par PCR ont t compar s ceux obtenus par immunofluorescence Comparaison entre la PCR et le diagnostic microscopique Microscopie positive Microscopie n gative PCR positive 45 8 0 85 VPP PCR n gative 2 33 0 94 VPN 0 96 0 80 Sensibilit Sp cificit Tableau 1 Sp cificit et sensibilit du diagnostic par le kit MycAssay Pneumocystis compar es celles de l immunofluorescence 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran ais 10 Pour diagnostic in vitro MycAssay Pneumocystis Echantillons Respiratoires s rie Stratagene Mx3000 Le Tableau 1 pr sente des donn es obtenues pour des patients infect s par le VIH des patients non infect s par le VIH et des patients dont l infection par le VIH est ind termin e Chez les patients atteints de pneumonie Pneumocystis la quantit d organismes d tectables est tr s variable Plus la valeur de Ct est faible plus la probabilit de la maladie est lev e Le nombre d organism
15. e diverses esp ces fongiques et non fongiques Les esp ces suivantes n ont pas donn de r sultat positif Alternaria alternata Aspergillus flavus A fumigatus A niger A terreus Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Les esp ces bact riennes suivantes n ont pas donn de r sultat positif Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius L ADN du g nome humain ne donne pas de r sultat positif avec ce test Substances interf rentes contre indications Les compos s suivants ont t analys s des concentrations pertinentes du point de vue clinique et d termin s comme non inhibiteurs du test ac tylcyst ine amphot ricine dipropionate de b clom tasone bud sonide colistim thate sodique propionate de fluticasone fumarate de formot rol dihydrat bromure d ipratropium lidoca ne mannitol sulfate de salbutamol salm t rol Septrin trim thoprime sulfam thoxazole chlorure
16. es r f 401428 et 401425 4 4 Les chantillons de patient donnent le r sultat chec de PIAC 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran ais 8 Pour diagnostic in vitro MycAssay Pneumocystis Echantillons Respiratoires s rie Stratagene Mx3000 est probable que les chantillons extraits contiennent des inhibiteurs de la PCR gt Il est recommand d extraire l ADN l aide du kit d extraction d ADN fongique MycXtra 4 5 Aucune voie ne donne de r sultat pour aucun des chantillons ni des t moins Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration gt V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable automate ne fonctionne pas de fa on optimale gt V rifier que l entretien et l talonnage de l automate de PCR en temps r el sont jour conform ment aux instructions du guide d installation et de maintenance La configuration du logiciel a t faite avec un fichier de mode op ratoire incorrect gt Se reporter la Section 2 et s lectionner le fichier de mode op ratoire correct sur le CD ROM de mode op ratoire Myconostica tel qu indiqu pour chaque version du logiciel Seul le fichier compatible avec
17. es d tectables tend tre plus lev chez les patients infect s par le VIH qui souffrent de pneumonie Pneumocystis que chez les patients non infect s par le virus bien que ces deux cat gories pr sentent un chevauchement consid rable Ce chevauchement est visible sur le diagramme de dispersion de la Figure 3 ci dessous Pour des r sultats complets dans la mesure o le jeu de donn es du Tableau 1 inclut des patients dont l infection par le VIH est ind termin e le diagramme de dispersion de ce groupe est donn la colonne 3 de la Figure 1 39 ee SE MTS Se n 37 2 35 33 e s 31 sd e e 8 2 29 s 3 H gt re O 27 8 e 25 23 s 21 2 19 e 17 0 1 2 3 4 Cat gorie 1 VIH microscopie 2 VIH microscopie 3 VIH ind termin microscopie 4 microscopie Figure 1 Diagramme de dispersion des valeurs de Ct obtenues partir d ADN extrait d chantillons respiratoires de patients Quatre groupes sont d crits Rapport clinique Le kit MycAssay Pneumocystis est destin servir d aide au diagnostic de la pneumonie Pneumocystis Les r sultats doivent tre consid r s dans le contexte de l tat clinique du patient et en association avec les r sultats d autres tests de diagnostic Il est recommand d employer la phras ologie suivante dans le rapport en fonction de l interpr tation des r sultats du test R sultat 1
18. euils sont valables uniquement avec les barrettes de tubes et de bouchons de PCR recommand s Agilent Technologies r f 401428 et 401425 La valeur Ct de IAC du t moin n gatif ne se trouve pas dans la plage acceptable gt La PCR a t inhib e V rifier que le plan de travail et l quipement soient compl tement secs apr s nettoyage avec un agent de d contamination et avant pr paration de la PCR Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable Le r actif du Tube 1 ou du Tube 2 n a pas t ajout au m lange r actionnel pour PCR ou deux fois trop de r actif du Tube 2 a t ajout R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide d un tube r actionnel est plus lev ou plus bas que celui des autres tubes Des tubes ou plaques autres que ceux recommand s ont t utilis s Les seuils sont valables uniquement avec les barrettes de tubes et de bouchons de PCR Agilent Technologies r f 401428 et 401425 Le t moin positif donne un r sultat n gatif ou en dehors de
19. fs Toujours porter des gants Tous les tubes doivent tre bouch s apr s utilisation et avant mise au rebut En cas de traitement simultan de plusieurs chantillons noter pr cis ment la position des chantillons Afin d viter les r sultats faussement n gatifs laisser la lampe refroidir pendant au moins 1 h apr s l analyse avant de lancer un nouveau test MycAssay Pneumocystis Suite cette p riode de refroidissement la lampe doit subir un pr chauffage d une dur e de 20 minutes comme indiqu en 1 1 ci dessous Voir par exemple Miffin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA Fran ais 3 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Pour diagnostic in vitro s rie Stratagene Mx3000 Echantillons Respiratoires Mode op ratoire 1 Pr paration de la PCR en temps r el 1 1 Pour commencer mettre en marche le syst me de PCR en temps r el Stratagene de s rie Mx3000 automate et ordinateur reli et lancer le logiciel MxPro 4 10 Saisir le nom d utilisateur et le mot de passe si n cessaire La dur e de pr chauffage de la lampe est de 20 minutes Ne pas lancer l analyse avant que la lampe ne soit pr te 1 2 V rifier que le plan de travail a t nettoy l aide d un agent de d contamination de l ADN et qu il est sec viter cependant l utilisation de tels agents pend
20. fs du kit MycAssay Pneumocystis avec un chantillon contenant la s quence cible d ADN de Pneumocystis une partie de la grande sous unit ribosomale mitochondriale de Pneumocystis un cycle thermique entra ne l amplification de l ADN Le test utilise galement un contr le interne d amplification IAC pour Internal Amplification Control un fragment d ADN non pr sent dans le g nome de Pneumocystis d autres champignons des bact ries ni de l homme pour d tecter les substances inhibitrices de la PCR et confirmer la fonctionnalit des r actifs Les cibles d ADN amplifi es sont d tect es par des balises mol culaires Il s agit de sondes d hybridation oligonucl otidiques monobrins qui forment une structure tige boucle La boucle contient une s quence de la sonde compl mentaire la s quence de la cible tandis que la tige est form e par annelage de s quences lat rales compl mentaires de part et d autre de la s quence de la sonde Un fluorophore qui met de la fluorescence lorsqu il est excit par une lumi re de longueur d onde adapt e est fix par liaison covalente une extr mit d un bras et un extincteur de fluorescence qui inhibe la fluorescence du fluorophore lorsqu il en est physiquement proche est fix par liaison covalente l extr mit de l autre bras Libres en solution les balises mol culaires ne sont pas fluorescentes Par contre lors de l hybridation avec un brin d acide nucl ique contenant une s que
21. la plage acceptable gt Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable Une erreur s est produite lors de la pr paration et la matrice du t moin positif Tube 4 a t plac e dans le mauvais tube r actionnel R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide d un tube r actionnel est plus lev que celui d un autre Le r actif du Tube 1 ou du Tube 2 n a pas t ajout au m lange r actionnel R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide de ce tube r actionnel est plus bas que celui des autres tubes Le t moin positif a t mal positionn sur l automate Veiller correctement nommer toutes les r actions dans le logiciel et bien orienter les barrettes de tubes sur l automate Des tubes ou plaques autres que ceux recommand s ont t utilis s Les seuils sont valables uniquement avec les barrettes de tubes et de bouchons de PCR Agilent Technologi
22. le logiciel peut tre charg R p ter l analyse avec le fichier de mode op ratoire correct Pour toute question ou en cas de probl me contacter le Service d assistance technique productsupport lab21 com Fran ais 9 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Pour diagnostic in vitro s rie Stratagene Mx3000 Echantillons Respiratoires Caract ristiques de performance et limites Performances analytiques des automates de la s rie Mx3000 Le kit a initialement t valid l aide de l automate Cepheid SmartCycler Certaines revendications de performances du test ont t valid es nouveau sur l automate Mx3005P l aide de barrettes de tubes de PCR de qualit optique munis de bouchons Agilent Technologies r f 401428 et 401425 comme indiqu ci dessous Sensibilit analytique partir du mode op ratoire d crit ci dessus et d une mol cule d ADN recombinant de Pneumocystis g n r e par Myconostica le seuil de d tection de Pneumocystis d termin est lt 50 copies Cette valeur a t d termin e l aide d un plasmide recombinant contenant la s quence cible Dans la mesure o la s quence cible de Pneumocystis est une cible mitochondriale il y a de nombreuses copies par cellule mais le nombre exact est inconnu Performances tablies l aide de l automate Cepheid SmartCycler S lectivit analytique La s lectivit analytique a t valu e l aide d ADN extrait d
23. lidation du test Kit d extraction d ADN fongique MycXtra R F 080 005 disponible aupr s de Myconostica __ Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York Etats Unis Adaptateur vortex R F 080 015 disponible aupr s de Myconostica Remarques sur le mode op ratoire Lire le protocole dans son int gralit avant de commencer La dur e totale du mode op ratoire du test MycAssay Pneumocystis extraction d ADN exclue est d environ 2 heures selon le nombre d chantillons analys s convient de pr parer le test sur un poste de travail pour PCR ou dans un laboratoire pr PCR Si aucun poste de travail pour PCR n est disponible il convient de pr parer le test dans une zone d di e du laboratoire nettoy e r guli rement avec un agent de d contamination de l ADN Toutefois les agents de d contamination de l ADN sont susceptibles d inhiber la r action Il faut donc viter leur utilisation lors de la pr paration de la PCR en temps r el Transvaser les liquides au moyen de micropipettes Il convient d utiliser des micropipettes d di es la pr paration des r actions et de les d contaminer r guli rement est recommand d utiliser des embouts filtres faible r tention afin d viter toute perte d ADN pendant la phase de pr paration Manipuler le Tube 4 avec pr caution Il contient une matrice d ADN qui en cas de contamination risque de donner des r sultats faussement positi
24. lvse La valeur de Ct PNE est elle de 39 0 ou non chec de l analyse ACTION R p ter l analyse chec de l analyse ACTION R p ter l analyse Positif pour l ADN de Pneumocystis N gatif pour l ADN de Pneumocystis V rifier le t moin n gatif d tect e NON OUI V rifier le t moin n gatif La valeur de Ct IAC est elle comprise entre 29 3 V rifier le t moin positif La valeur de Ct PNE MycAssay est elle comprise antra DNNN RNA V rifier l chantillon de patient La valeur de Ct PNE est elle lt 39 0 V rifier l chantillon de patient La valeur de Ct IAC est elle comprise entre 29 3 et 2229 chec de l IAC ACTION R p ter l analyse de l chantillon En cas d obtention du m me r sultat suspicion de pr sence d inhibiteur dans l chanti lon chantillon Ct PNE MycAssay Ct IAC MycAssay Interpr tation Action n cessaire T moin n gatif 39 0 ou non d tect e Entre 29 3 et 33 3 T moin n gatif Les r sultats patient acceptable sont valides T moin n gatif 39 0 ou non d tect e lt 29 3 ou gt 33 3 chec du t moin R p ter toute n gatif l analyse T moin n gatif lt 39 0 Entre 29 3 et 33 3 Contamination R p ter toute l analyse T moin positif Entre 20 0 et 25 0 Sans objet T moin positif Les r sultats patient acceptable sont valides T moin positif lt 20 0 ou gt 25 0 Sans objet chec du t
25. me lot Ne jamais utiliser les r actifs ni les t moins au del de la date d expiration convient de ne pas recongeler ni r utiliser les r actifs et les t moins apr s ouverture Porter des v tements de protection et des gants usage unique pour manipuler les r actifs du kit viter la contamination des r actifs par les microbes et la d soxyribonucl ase DNAse lors du pr l vement des parties aliquotes des tubes est recommand d utiliser des embouts pour pipettes st riles exempts de DNAse et usage unique de type filtres faible r tention ou d placement direct Utiliser un embout neuf pour chaque chantillon et chaque r actif Mettre au rebut les r actifs inutilis s et les d chets conform ment la r glementation nationale r gionale et locale en vigueur Afin d viter la contamination par les amplicons de Pneumocystis et de l IAC ne pas ouvrir les tubes de r action apr s amplification Ne pas manger boire ni fumer proximit des zones de manipulation des chantillons et des r actifs L ADN faible concentration peut tre instable s il n est pas conserv correctement Il est recommand de conserver l ADN extrait 80 C afin d en pr server l int grit Dans la mesure du possible il convient galement d viter la d cong lation et la recong lation r p t es Ce kit a t valid l aide de barrettes de 8 tubes de PCR de qualit optique de 0 2 mL
26. nce cible elles subissent un changement de conformation qui les rend fluorescentes L intensit de la fluorescence pendant un cycle donn ou apr s un cycle 1 Morris A Lundgren JD Masur H Walzer PD Hanson DL Frederick T Huang L Beard CB Kaplan JE 2004 Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia Emerg Infect Dis 10 1713 20 Miller RF Allen E Copas A Singer M Edwards SG Miller RF Allen E Copas A Singer M Edwards SG Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii pneumonia is independent of highly active antiretroviral therapy Thorax 2006 61 716 21 3 Kovacs JA Gill VJ Meshnick S Masur H 2001 New insights into transmission diagnosis and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia JAMA 286 2450 60 t Huang L Morris A Limper AH Beck JM ATS Pneumocystis Workshop Participants An Official ATS Workshop Summary Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia PCP Proc Am Thorac Soc 2006 3 655 64 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Fran ais 1 030 163 Version 1 2 24FEB12 MycAssay Pneumocystis Pour diagnostic in vitro s rie Stratagene Mx3000 Echantillons Respiratoires d pend de la quantit d amplicons sp cifiques pr sents ce moment L automate de PCR en temps r el Stratagene surveille simultan ment la fluorescence mise par toutes les balises Pr
27. re avant de reprendre l tape 1 1 Analyse et interpr tation des donn es la fin de l analyse les r sultats peuvent tre affich s en s lectionnant le bouton Analysis en haut droite de l cran puis l onglet Results Apr s avoir s lectionn Amplification Plots analysis area d finir les seuils de chaque voie comme suit et verrouiller les valeurs en cliquant sur le verrou PNE 500 IAC 100 Le param tre Adaptive Baseline doit galement tre s lectionn ce qui est g n ralement le cas par d faut pour ce logiciel Enregistrer les modifications Chaque voie peut tre affich e s par ment en activant ou d sactivant les cases de la section Assays Shown en bas gauche de l cran Il est possible d exporter les donn es dans Excel pour un traitement suppl mentaire en s lectionnant File Export Text Report Export Text Report to Excel Seuls les puits ou colorants mis en surbrillance sont export s donc veiller s lectionner tous les l ments n cessaires Ouvrir le fichier csv avec Excel ou un autre tableur quivalent Analyser chaque chantillon en commen ant par les t moins comme indiqu dans l organigramme ci dessous plus d informations sont fournies dans le tableau situ en dessous de l organigramme 030 163 Version 1 2 24FEB12 Fran ais 6 Pour diagnostic in vitro Echantillons Respiratoires MycAssay Pneumocystis s rie Stratagene Mx3000 Contamination ACTION R p ter l ana
28. ssay Pneumocystis Myconostica Mode d emploi Certificat d analyse Conservation Il convient de conserver le kit au cong lateur de 15 25 C jusqu la date d expiration indiqu e sur l tiquette de la bo te du kit date au del de laquelle il convient de mettre le kit au rebut conform ment la r glementation locale en vigueur Le contenu d un sachet doit tre utilis imm diatement apr s ouverture Ne pas le recongeler ni le r utiliser quipement et mat riel n cessaires et non fournis Automate de PCR en temps r el de la s rie Stratagene Mx3000 avec manuel d utilisation ordinateur reli et logiciel MxPro version 4 10 Barrettes de tubes de PCR de qualit optique Agilent Technologies r f 401428 Barrettes de bouchons de PCR de qualit optique Agilent Technologies r f 401425 Microcentrifugeuse avec adaptateur pour tube de PCR de 0 2 mL Agitateur vortex Portoir pour tubes de PCR Micropipettes volumes de 7 5 uL 20 uL Embouts filtres st riles faible r tention Gants usage unique non poudr s Solution de d contamination de l ADN exclusive Marqueur permanent Kit d isolement d ADN voir ci dessous chantillon L chantillon soumettre au test MycAssay Pneumocystis est l ADN total extrait des chantillons cliniques de LBA cette fin il est recommand d utiliser le kit d isolement de l ADN et l quipement suivants fournis par Myconostica Ltd et employ s pour la va
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