Biochimie I,2,a - Science on Stage
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1. Rf distance parcourue par le pigment distance parcourue par l luant Pour un luant donn et une esp ce chimique donn e le Rf est caract ristique de l esp ce Fiche technique Echelle de polarit des solvants organiques Table de miscibilit des solvants 0 01 Ether de p trole hexane 0 04 Cyclohexane 0 18 T trachlorure de carbone acide ac tique NX Table de miscibilit des solvants Apolaires ac tone z t N uiscilte Tolu ne 0 29 N E abutan N 0 38 Ether tyique cniorotorme N H non miscibie 042 Chlorure de m thyi ne cycionexane 8 IN dim thylsulfoxyde Chloroforme 0 40 Polarit interm diaire 0 50 0 49 Dichloro thane 0 56 Ac tone dioxane butanol Ac tate d thyle 0 58 CCE 0 65 Ac tonitrile ther thylique gear i iso octane 0 75 Dim thylsulfoxyde 0 82 Isopropanol gt 2 0 88 Ethanol S o 2 5 9 Elo EIE 2 2 S 2121217F 0 95 M thanol eau acide ac tique 2 5 5 8161412 9 e gt S 0 5 4 G o 9 5 9 85 elo Infographie B Lourtie Source www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html Source www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html Bernadette Lourtie 2008 NSC So2. aucun moment elles n y p netrent Chromatographie sur couche mince Chromatographie sur colonne CCL couche mince de adsorption luant silice hydratee ph nom ne de surface front de l luant s parer pigment apalaire sable grossier sable de Fontainebleau oH lution Z w pigment polaire lt s elution pigment tr s polaire L luant monte par luant capillarit dans la apolaire couche mince plaque aluminium L gende HIH OH groupement silanal liaisons faibles adsorption lt r versible B Lourtie B Lourtie 4 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a e Adsorption et adsorbants On appelle adsorption la fixation plus ou moins forte d un liquide d un solut ou d un gaz sur une surface solide silice alumine par des liaisons faibles de surface ponts hydrog ne interactions lectrostatiques dip le ion dip le dip le liaison Van der Waals En technique chromatographique l adsorption doit tre r versible afin de permettre le m canisme d lution sans quoi le compos reste fix sur la ligne de d p t Les adsorbants doivent tre insolubles dans l luant et chimiquement inertes pH neutre en pr sence de l luant et des compos s s parer lls pr sentent une granulom trie sp cifique 5 100 um et une surface sp cifique 50 1000
3. N lt H VW Ke Z E lk un A Ga ni E A 1 Qu ff x edi 7 7 gt D EE SAR ha 2 un aime Ph ophytine Pyrochlorophylle Pyroph ophytine OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be 2 Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Question remue m ninges Avec l aide du logiciel Mesurim un scanner peut il servir de colorim tre et la m thode de mesure du logiciel peut elle tre rendue quantitative El ments de r ponse L acquisition de l image avec un scanner permet d acqu rir toutes les images dans des conditions identiques source lumineuse distance et angle de prise de vue r solution etc ce qui est plus compliqu avec un appareil photo Le r glage du scanner est r alis lors de son installation et l appareil effectue de temps autre un talonnage pour son bon fonctionnement Essai de mod lisation pour l exploitation des r sultats par la m thode colorim trique l s agit d essayer de mettre au point un mod le satisfaisant qui permettrait de d terminer la concentration en chlorophylle a en chlorophylle b ou tout autre pigment pr sent dans un extrait sans passer par la loi de Beer Lambert 1 M thode de la droite d talonnage La m thode de la droite d talonnage n cessite de disposer d une solution m re S de pigment par exemple chlorophylle a de concentration connue exemple c 10 mg dans un solvant d termin exemple l ac tone
4. A partir de cette solution lt m re gt on r alise un certain nombre de solutions dilu es de concentration connue S1 c 75 de S S2 50 de S S3 25 de S La plus grande difficult sera sans aucun doute de disposer de cette solution m re de pigment de concentration connue car il faudra avoir acc s un spectrophotom tre 2 Effectuer l talonnage du logiciel avec une image scann e 2 1 Premiere possibilit la concentration c et le volume V sont d termin s au d part Sur une plaque CCM talon pr par e pour la chromatographie on effectue avec une pipette de pr cision les d p ts pour chacune des solutions S S1 S2 S3 afin d obtenir un volume V identique pour chaque tache On proc de la chromatographie de la plaque talon avec le solvant que l on utilise pr f rentiellement pour la chromatographie des pigments v g taux et on laisse migrer le solvant jusqu une hauteur d termin e exemple 4 cm de la ligne de d p t Lorsque l luant a atteint la hauteur d termin e on scanne imm diatement la plaque talon On obtient des bandes caract ristiques pour chaque ligne de d p t Avec le logiciel de mesure sur l image e Mesure de type 1 on choisit la largeur de la bande de mesure que l on utilise habituellement par exemple 11 pixels et on mesure la surface int grale sous le pic dans le tout RVB en D O ou en absorbance Le volume est connu la co
5. au dessus de la ligne de d p t Cela prend une dizaine de min Il ne faut en aucun cas d placer le dispositif pendant la migration Photo 18 4 5 Chronom trer le temps de migration de l luant pour atteindre le niveau 4 ou 5 cm que l on s est fix Une autre solution int ressante est de filmer le d veloppement si l on dispose de l quipement appropri cam ra appareil photo num rique 4 6 Lorsque l luant est mont au niveau que l on s est fix sortir la plaque de la cuve et tracer au crayon quelques rep res indiquant le front de l luant Eviter de tracer au crayon sur la bande de pigment mont e avec le front de l luant 4 Photographier imm diatement la plaque CCM avec un appareil photo num rique et ou scanner la plaque avec un scanner plat 4 8 Identifier les bandes spots laiss s par les pigments s par s et mesurer la distance de migration de l luant front de l luant et les distances de migration de chaque bande Photo 19 15 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Mesurer et calculer Calculer le rapport frontal Rf pour chaque pigment s par e Mesurer la hauteur de migration de l luant distance entre la ligne de d p t et le front de l luant e Mesurer la distance parcourue par chaque pigment distance entre la ligne de d p t et le centre de la tache e Calculer pour chaque pigment le rapport frontal
6. broyat press dans la passoire Photo 4 3 Filtration 3 1 Filtrer le contenu du cristallisoir dans l erlenmeyer l aide de l entonnoir et du filtre en papier Rien ne doit d border du filtre Presser le d p t contre le filtre avec une cuill re en plastique afin d extraire un maximum de solution de pigments Photo 5 12 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Le premier filtrat est de couleur rouge bordeaux Photo 6 3 2 Verser le filtrat obtenu 5 ml dans un petit r cipient en verre d une contenance proche de 5 ml afin de le remplir avec le filtrat et d viter l oxydation des pigments et fermer avec un bouchon 4 1 R cup rer avec une spatule ou une cuill re en plastique le d p t accumul sur le papier filtre ainsi que le broyat press dans la passoire et les placer dans le mortier Broyer nouveau en rajoutant 3 4 ml d thanol 4 2 R p ter la filtration grossi re comme expliqu e au point 2 3 4 3 R p ter la filtration sur papier comme expliqu au point 3 1 Utiliser un nouveau filtre et le second erlenmeyer Rincer le mortier avec un peu d thanol et verser dans le filtre La couleur du second filtrat doit tre verte a 020628 JPG Lourtie 24 06 08 Photo 7 4 Question sp ciale concernant la filtration Bien que le contenu du cristallisoir filtration grossi re soit de couleur verte il arri
7. dans certaines circonstances il n y a pas de r gle fixe Dans un m lange de plus de deux solvants le dernier solvant sera pr sent en faible quantit Ce qu il faut retenir La chromatographie d adsorption est une chromatographie liquide solide bas e sur la r partition des solut s entre l adsorbant phase stationnaire solide et l luant phase mobile liquide Chaque solut est soumis une force de r tention par adsorption et une force d entrainement par lution L quilibre entre ces forces d termine la migration diff rentielle des solut s du m lange et donc leur s paration OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Un document utile la structure chimique des pigments v g taux La famille des Structure des chlorophylles a b et d chlorophylles Num rotation selon IUPAC IUB 1987 Ri R2 R3 CH a CH CH CH CH CH Chl b CH CH C H CH CH d K EN CH CH O Phytol hydrophobe alcool esterifiant longue chaine Structure des ph ophytines a et b Num rotation selon IUPAC IUB 1987 R Phytol hydrophobe alcool est rifiant longue chaine C Infographie B Lourtie Structure des chlorophyllides a et b EE CHLOROPHYLL DE OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a La famille des carot
8. de solutions S S1 S2 S3 Sx ou de solution Sx seule et on proc dera la chromatographie comme d crit ci dessus e Sil on choisit la mesure de type 1 avec le logiciel Mesurim on mesurera l intensit de couleur sur une ligne en absorbance ou en DO pour une largeur de bande identique celle utilis e lors de l talonnage 11 pixels et ensuite on mesurera la surface sous le pic qui est la valeur de Ix e valeur de lx port e sur le graphique d talonnage permet de d terminer cx e La m thode est la m me si l on choisit la mesure de type 2 mesure de lumi re sous la surface color e NB L exp rience nous porte pr f rer la mesure de type 1 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be ET Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Sources Bibliographie e 1 G Coutouly amp col Travaux dirig s de biochimie biologie mol culaire et bioinformatique 3 dition Collection Biosciences et techniques diteur doin 2006 m thodes chromatographiques 254 284 e 2 D Voet J G Voet Biochimie traduction fran aise de la 3 dition am ricaine De Boeck Universit 2005 repr sentation d taill e du sch ma en Z de la photosynth se 24 2 886 e 3 M Vanbelle Biochimie descriptive 1 di partie Introduction la biochimie moderne pour agronomes Facult des Sciences Agronomiques de l UCL 1970 les techniques de chromatographie 2 34 35 e 4 Raven amp col Biologie v g tale t
9. noides e Les carot nes p Carotene e Les XANTHOPHYLLES xanthophylles H CH H ttl d F Ka JP E PK Zeaxanthinc CH A CH H H H H C d d gt 3 e e Da s k ia S A bd EL MM HO A H H CH Violaxantine H H H d P R P P PSI Edi K De e 1 1 H H CH H N oxanthine La famille des flavonoides pelargonidine R R H cyanidine R OH R H peonidine R OCH R H delphinidine R R OH p tunidine R OCH R OH malvidine R R OCH Anthocyanidines Bernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Qu est ce que la ph ophytine Lorsque la chlorophylle perd son ion magn sium Ma lau profit de 2 protons H il en r sulte la formation d un pigment vert olive jaun tre appel ph ophytine chlorophyll ph ophytin pdb La ph ophytine existe naturellement dans les chloroplastes en faible quantit C est un accepteur pr coce d lectrons du photosyst me Il En effet dans les photosyst mes ll et l la chlorophylle a la chlorophylle b et des carot no des fonctionnent comme une antenne collectrice de lumi re Par r sonance une mol cule excit e transf re son nergie une mol cule voisine canalisant ainsi l nergie jusqu une mol cule de chlorophylle a particuli re la chlorophylle du centre r actionnel On
10. types de chromatographie repose sur le fait que l on a privil gi l effet de l un des facteurs ci dessus cependant aucune m thode ne repose exclusivement sur un seul de ces facteurs OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Ce quil faut comprendre La chromatographie d adsorption sur couche mince CCM ou sur colonne CLC fait partie des diff rents modes de chromatographie en phase liquide La phase mobile l luant est liquide tandis que la phase stationnaire est solide Les compos s s parer sont plus ou moins solubles dans l luant en fonction de leur nature L luant peut tre polaire eau alcool ou apolaire solvants organiques e La m thode La phase stationnaire est solide chromatographie liquide solide Le facteur intervenant dans le m canisme de s paration la polarit Dans ce m canisme les compos s s parer sont d une part plus ou moins adsorb s sur la phase stationnaire solide et d autre part plus ou moins lu s par la phase mobile liquide L quilibre qui r sulte entre les deux forces force de r tention et force d entrainement aboutit une migration diff rentielle des solut s de l chantillon analyser et donc leur s paration L adsorption est un ph nom ne de surface sous l effet de la force d entrainement de l luant les mol cules s parer migrent en glissant la surface de la phase stationnaire et
11. 8 NSC SonS Be x Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Chromatogramme n 4 ther de p trole white spirit 3 ac tone 1 dichlorom tane 1 ther thylique 0 5 ml Produit d grad Chloro b 00 Chloro Lut ine J Phyllide Chloro Violaxanthine 80 N oxanthine B carot ne ph ophytine 3 5 40 P1020930 JPG B Lourtie 30 Graphique 4 Intensit de couleur sur une ligne 11 pixels mesure lin aire en absorption Produit Canal 3 d grad Rouge L luant n 4 L adjonction d ther thylique avec le dichlorom thane donne des r sultats spectaculaires Tous les pigments et produits de d gradation sont bien s par s Toutes les photos r alis es en ext rieur un jour de fort ensoleillement sont bleues Ce ph nom ne est d sans aucun doute la pr sence de l indicateur fluorescent 254 nm sur la plaque Cet indicateur permet de r v ler les chromatogrammes sous UV 254 nm gr ce la fluorescence bleue de la plaque 366 nm et l inhibition de fluorescence par les bandes pigment es L image du scanner source lumineuse DEL RVB montre de la fluorescence pour les 3 bandes correspondant aux xanthophylles PhotoJPG Image scanner chlorophylle a absorbe beaucoup plus dans le rouge que dans le bleu C est la premi re fois que cela se pr sente cela provient sans doute de l adaptation des param tres de la cellule de l appareil photo aux c
12. GIE La structure chimique des pigments v g taux La photosynth se CHIMIE techniques de chromatographie en phase liquide Mat riel Pour l extraction des pigments V Du mat riel biologique au choix feuilles d pinard feuilles de laitue feuilles d arbres algues V Mortier pilon V Un peu de sable fin propre PRODUITS CHIMIQUES Ethanol d natur 95 C2H60 R 11 et S 7 16 iM OBernadette Lourtie 2008 Pour la filtration simple lent V Une petite passoire V 1 cristallisoir V 2 erlenmeyers V 1 entonnoir filtres en papier 1 spatule ou 1 cuill re en plastique Pour la filtration sous vide rapide V B chner et fiole vide reli e une trompe eau Pour la chromatographie d adsorption 4 cuves de d veloppement avec couvercle un bocal en verre fond plat et son couvercle convient y Plaques CCM 40 x 80 mm sur feuille d aluminium avec indicateur UV 254 nm incorpor V 4 petites prouvettes gradu es V 4 pipettes gradu es 10 ml 1 pipette gradu e 1 ml V 1 Poire propipettes V 1 petit capillaire pour effectuer les d p ts V 1 r gle en plastique transparent V 1 crayon papier ou 1 porte mine V Papier absorbant PRODUITS CHIMIQUES Ether de p trole essence G R 11 45 65 S 9 16 29 53 45 Ac tone Propanone CsH O R 11 36 66 67 S 9 16 26 Dichlorom thane pur CH Cb H 40 S 23c 24 25 36 37 Ether thylique di thyle oxyde p
13. R CH 3 Les r actions de d gradation in vitro sche _ j N Fe r actions de type l DEN ASP 2 Chlorophylle b R CHO lj Rest n P Rr SA RP T Hydrolyse de la fonction Oxydation enzyme COOMe ester enzyme endog ne fermentation chlorophyllase in vivo milieu basique in vitro Milieu acide chaleur in vitro Milieu acide Chlorophyllase in vivo Oxydation enzyme chaleur in vitro milieu basique in vitro fermentation B Oxydation enzyme h a fermentation phytol Milieu acide chaleur in vitro Chlorophyllase in vivo milieu basique in vitro OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be 19 Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a 4 Modification chimique IN VITRO sans ouverture du noyau t trapyrrolique e Extrusion du magn sium Au laboratoire les ph ophytines a et b sont consid r es comme des produits d grad s des chlorophylles a et b car elles se forment rapidement lorsque les chlorophylles sont extraites en milieu acide cas de v g taux contenant certains acides dans les vacuoles L action d acide min ral dilu ou d acides organiques sur la chlorophylle provoque une extrusion rapide du Mg En solution eau ac tone acidifi e la transformation des chlorophylles a et b en ph ophytines a et b ob it une loi cin tique du premier ordre La transformation de la chlorophylle a en ph ophytine a est 20 30 fois plus rapide que la tran
14. Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a BIOCHIMIE Tester de nouvelles exp riences BIOCH I 2 a Techniques de chromatographie en phase liquide e Chromatographie d adsorption sur couche mince CCM d un extrait total de pigments v g taux 4 a ta e D gradation in vitro des be ai chlorophylles Re pny e Exp rience assist e par ordinateur Ph ophorbide P1020930 JPG B Lourtie 30 Exp riences r alisables en T P de Biologie avec des l ves du 3 degr OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be BIOLOGIE VEGETALE BIOCHIMIE e Chromatographies d adsorption sur couche mince d un extrait total de pigments v g taux BIOCHI 2 a Science on Stage Belgium e Importance du choix de l luant e D gradation in vitro de la chlorophylle e EXAO Cette manipulation consiste r aliser 4 chromatographies afin de tester 4 luants de composition diff rente AVERTISSEMENT La chromatographie des pigments v g taux n cessite imp rativement d tre r alis e sous hotte aspirante vu la toxicit des solvants organiques S curit Les consignes de s curit d usage en laboratoire de chimie doivent tre appliqu es la lettre Protection de l environnement Les solvants organiques doivent imp rativement tre jet s avec les d chets de laboratoire et d pos s dans une collecte de produits chimiques Connaissances BIOLO
15. appelle P680 P comme pigment et 680 la longueur d onde du maximum d absorption la mol cule de chlorophylle a du centre r actionnel du Photosyst me ll et P700 celle du Photosyst me l P680 et P700 sont des dim res de la chlorophylle a Lorsque l nergie d excitation atteint le P680 du centre r actionnel celui ci est excit La forme excit e P680 est alors photooxyd e et transf re un lectron la ph ophytine premier accepteur d lectrons du PSII La formation de P680 et de Ph o s paration de charge repr sente la conversion de l nergie lumineuse en nergie chimique Photosynth se transport non cyclique d lectrons sch ma en 7 Ees LS Chloro a modifi e Ph ophytine H Phylloquinone Prot ine fer soufre 2e Pie 2e f r doxine H O plastgquinones NADP 2e H NADPH cytb6f Complexe de cytochromes Plastocyanine F ADP Pi synth se d nergie chimique T A 8 Photosyst me PSI lumi re P lumiere Photosyst me 11 PSII OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be BIOLOGIE VEGETALE 2 La ph ophytine est aussi un des produits de d gradation in vivo ou in vitro de la chlorophylle Extrait de Catabolisme de la chlorophylle b structures m canismes et synth se auteur P Folly http ethesis unifr ch theses downloads php file FollyP pdf Science on Stage Belgium 1 Les causes de la d gradation de la chlorophylle Le
16. e la chlorophylle b elles apparaissent de fa on significative dans le graphique Il s agit vraisemblablement de produits d grad s de la chlorophylle Une bande d un produit tr s polaire se situe juste au dessus de la tache de d p t chlorophyllide OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Chromatogramme n 3 ther de p trole white spirit 3 ac tone 1 chloroforme 1 Chloro b xanthophylle Chloro xanthophylle Xanthophylle 3 C a m n Td Ph ophytine b ta carot ne Produits d grad s 10 mm P1030206 JPS B Lourtie 30 07 03 Graphique 3 Intensit de couleur sur une ligne 11 pixels mesure lin aire en absorption L luant n 3 le chloroforme provoque la d gradation de la chlorophylle Le chloroforme est connu pour produire rapidement du HCI Le milieu doit donc tre acide Cet luant ne donne pas de bons r sultats Les xanthophylles se superposent sur les chlorophylles Juste au dessus de la chlorophylle a se trouve une bande pour laquelle l absorbance dans le bleu laisse penser qu il s agit d un pigment de couleur jaune ph ophytine pr sente un pic relativement important Deux bandes situ es entre la ph ophytine et le pigment de couleur jaune cit ci dessus sont nettement signal es dans le graphique peut tre la pyrochlorophylle et la pyroph ophytine OBernadette Lourtie 200
17. hydroxy Purpurines Chlorophylle a m thoxy Me P LX C00 Bernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be B Science on Stage Belgium Protocole A Extraction d une solution totale de pigments de laitue rouge 1 Calculer le taux d hydratation de l chantillon v g tal 1 1 S lectionner 2 3 belles feuilles propres de laitue Lactuca sativa encore appel e Lolo rosso et les peser Noter le poids frais Pf P1030166 JPG B Lourtie 30 07 08 Photo 1 2 2 D shydrater totalement cet chantillon sans le r duire en cendre et le peser Noter le poids sec Ps 2 3 Calculer le taux d hydratation de l chantillon H 96 Pf Ps Pf x 100 2 Extraction d une solution totale de pigments 2 1 Pr lever sur la m me laitue une quantit de feuille propre quivalente celle du premier chantillon Peser ajuster et noter le poids frais Pf P1030166 JPG B Lourtie 30 07 08 Photo 2 OBernadette Lourtie 2008 BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I Zo 2 2 D couper les feuilles en petits morceaux dans le mortier ajouter une petite pinc e de sable et broyer en additionnant 3 ml d thanol Photo 3 2 Lorsque les feuilles sont bien broy es filtrer grossi rement dans un cristallisoir l aide de la petite passoire Rincer le mortier avec 1 ml d thanol et verser dans la petite passoire Presser sur le broyat l aide du pilon Conserver le
18. igne de d p t OBernadette Lourtie 2008 0 0721 0 0862 0 133 0 312 0 331 0 0632 0 0273 0 117 0 152 0 227 0 272 0 2 Exploiter les r sultats 0 426 0 86 2 19 1 24 0 317 0 0979 0 127 0 179 0 256 0 351 0 444 0 278 0 0772 0 0683 N oxanthine Violaxanthine Lut ine Chlorophylle b Chlorophylle a Ph ophytine B carot ne Front de l luant NSC SonS Be 3 2371 3 1961 7 0327 5 9688 3 5617 0 366 0 405 0 463 0 504 0 553 0 83653 0 684 0 53563 1 1245 t2 cm 4 35 t3 om 8 16 t4 om 12 41 t 12 51 26 Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Qui Z Essai de classement des produits de d gradation in vitro de la chlorophylle selon une chelle de polarit d croissante polaire apolaire prenant la chlorophylle amphiphile comme point de rep re Les produits de d gradation de la chlorophylle ont t plac s dans le tableau ci dessous avec un d sordre relatif Il reste une case vide qui permet de d placer les mol cules pour les mettre dans l ordre 22 11 diis S Se 19 77 B ei LT d N LA E 28 g EM d d N N V N Axe J l gt r MeOOC Pyrochlorophyllide va eh e Le 1 Chlorophylle a R CH 2 Chlorophylle b R CHO w gt RIN Pi ARS Chlorophylle Ge R C gt iE we a s R Ki M SE Ki ar e fa NH KA N
19. it se trouver en dessous des taches de d p t de l extrait total 1 3 Fermer herm tiquement la cuve de d veloppement et mouiller les parois en effectuant un mouvement de rotation Laisser saturer 2 Pr paration de la plaque CCM Attention Les plaques CCM doivent tre manipul es avec beaucoup de soins Elles ne doivent pas tre touch es mains nues afin de ne pas graisser les faces Travailler avec des gants de protection propres 2 1 D poser la plaque CCM sur une feuille de papier propre la face blanche vers le haut 2 2 Avecune r gle et un porte mine 0 5 tracer d licatement sans griffer la surface un petit trait tous les cm le long de l un des grands c t s de la plaque A 2 cm du bord inf rieur tracer toujours tr s d licatement et sans griffer la surface une ligne en travers de la plaque Cette ligne sera la ligne de d p t 2 3 Avec une paire de ciseaux couper les coins inf rieurs de la plaque de fa on similaire des deux c t s Faites des mesures si n cessaire Marquer chaque cm sur les bords de la plaque L om de d p t 2 cm du bord inf rieur 1 12 13 R gle transparente Plaque CCM Bord inf rieur Figure 1 Pr paration d une plaque pour CCM Photo 16 droite Une plaque CCM pr te pour effectuer les d p ts Photo 16 14 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a 3 Effectuer les d p ts de l extrait t
20. la http www unige ch sciences chiam williams tp Pharmacie 09 Colorimetrie pdf e Spectrophotom trie d absorption document de travaux pratiques Principe de l absorptiom trie d esp ces chimiques en solution http formation etud u psud fr chimie experiences tp 101a documents TP c3absorption e YBET le cours informatique PC et p riph riques 18 Acquisition image appareil photo num rique et scanner http www ybet be hard1ch18 hard1 ch18 htm e LMPC Informatique Monthey le scanner http www Ilmpc ch e Num riseur de document http fr wikipedia org wiki Num C3 A9riseur de document e Cnam ELE 101 Composants lectroniques dispositifs opto lectroniques http www cnam fr elau publi algani images ELE101 CNAM 7 2008 pdf e Diodes lectroluminescentes http www rqmp ca medias Projets e20de20recherche Projet aimez LEDS fr pdf e Diodes lectroluminescentes http fr wikipedia org wiki Diode_ C3 A9lectroluminescente OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be 2n
21. m g La nature et la teneur en eau qui d pend du degr hygrom trique ambiant de l adsorbant influent sur son activit Capacit d adsorption et polarit Capacit d adsorption Carbonate de Ca carbonate de sodium talc Silice Silice hydrat e sous forme de gel Alumine pr sentant des fonctions silanol Si OH charbon Alumine HO Sur couche mince le gel adsorbant cellulose silice est coul sur une plaque verre aluminium plastique m lang un liant Sur colonne ouverte pression ambiante le gel adsorbant est tass dans la colonne En laboratoire de recherche la chromatographie d adsorption est r alis e sur colonne en flash chromatographie moyenne pression ou haute pression HPLC e Elution et luant L lution ph nom ne inverse de l adsorption d sorption extrait et entraine le solut adsorb l aide d un solvant appel luant L luant est rarement un solvant pur mais un m lange de solvants ex m lange de solvants organiques Les solvants qui composent l luant auront d une part une polarit voisine de celle des solut s s parer car ces derniers doivent tre solubles dans l luant et d autre part seront miscibles entre eux En fonction des compos s s parer l luant devra faire l objet de tests afin d am liorer les r sultats car bien qu il existe quelques m langes dont l efficacit est connue
22. nS Be To Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Exemples de r sultat Chromatographies sur couche mince CCM Lactuca sativa Avertissement Les 4 chromatographies pr sent es ci dessous n ont pas t r alis es le m me jour partir d un m me extrait white spiri total Les luants ont t compos s partir de produits chimiques du commerce droguerie pharmacie seul le chloroforme est un produit de laboratoire Le dichlorom thane utilis n est sans doute pas pur car on a utilis un d tachant textile contenant du dichlorom thane D tach Tout pour colle et latex et dont la composition exacte n est pas sp cifi e sur l tiquette P Acetone Eluant n 1 white spirit 3 ac tone 1 d tach tout Eluant n 2 white spirit 4 ac tone 1 ther colle latex 1 Date 24 06 08 thylique pharmaceutique 1 Date 21 06 08 Eluant n 3 white spirit 3 ac tone 1 chloroforme 1 Date 30 07 08 Eluant n 4 white spirit 3 ac tone 1 D tach Tout colle latex 1 ther pharmaceutique 0 5 ml Date 28 07 08 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be b Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Pr sentation des r sultats Chromatogramme n 1 ther de p trole 3 vol ac tone 1 vol dichlorom thane w e RE EE SUR lt Uo A Sua t LU M PT 124126 Ka O 8 17 d D PRES e FE x H _ ZA Ph
23. ncentration est connue et la surface sous le pic qui est la mesure de l intensit sous le pic est mesur e On trace la droite d talonnage 1 f c e Mesure de type 2 pour chaque bande de chlorophylle a obtenue on choisit mesure de lumi re dans un rectangle et apr s avoir fait le blanc on effectue la mesure en D O Ensuite on s lectionne mesure de lumi re sous la surface color e Le volume est connu la concentration est connue et la D O en fonction de la surface color e est mesur e On trace la droite d talonnage D O f c OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be EE Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a Plaque CCM talon 4 cm Z y dilution ligne de S solution de chlorophylle a 51 52 d p t 10 mg L S 75 5 50 5 25 Solution m re 100 ac tone 25 ac tone 50 ac tone 75 chlarophylle a Plaque CCM talon saus le pic front de l luant 4 cm DO sous la surface Mesures color e ligne de d p t Pour estimer la concentration cx de chlorophylle a ou tout autre pigment d un extrait e ilfaudra proc der la s paration des pigments de l extrait par la m thode de la solubilit diff rentielle ou par la chromatographie sur colonne CCL afin d obtenir une solution Sx de chlorophylle a ou de tout autre pigment partir de cet extrait e Sur une plaque CCM on d posera un volume V identique au volume utilis pour l talonnage
24. onditions dans lesquelles la photo a t r alis e OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be i Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a 3 Rapport frontal vitesse d lution intensit sous les pics e Editer un tableau de r sultats document Word ci dessous e Effectuer la mesure d intensit de couleur sur une ligne 11 pixels en lt mesure logarithmique d absorption gt pour obtenir la Densit Optique D O e S lectionner et copier dans le tableau de tous les r sultats des valeurs choisies des r sultats les pics de D O pour chaque bande Echer giten gutis Fep re moe Cen gde Dis g n 068 X9 Tout eur en pixels de m sj la wh _ Mesurer surer Mesurerles intensit s dans le Bieu surface Mesure en mission Mesure lin aire Mesure en absorption Mesure logaritmique 0 0902 0 0262 0 0291 0 0303 d marrer n Ecran 2 Mesure d intensit de couleur sur une ligne Mesure logarithmique en absorption D O e Mesurer la surface dans le canal lt Tout RVB mesure logarithmique correspondant l int grale sous le pic et noter les valeurs de l intensit dans le tableau des donn es ci dessous ES MESURIM Fichier Edition Outils Fen tre Image Choix Aide EUR gei Mesure d intensit de couleur sur une ligne Front de Fichier Copier Graphique Tableau xanthophylles chlo
25. orbance permet n anmoins de d tecter sa pr sence sous forme de trace fl che sur le graphique La chlorophylle a absorbe de fa on similaire dans le canal rouge et dans le canal bleu Ceci montre bien que l on mesure l absorbance dans les 3 canaux R V et B d une image en couleur et non l absorbance par la mol cule dans les diff rentes longueurs d onde f carot ne pigment totalement apolaire a migr avec le front du solvant OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be 2 Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Chromatogramme n 2 ther de p trole white spirit 4 ac tone 1 ther thylique 1 Chloro b xanthophylles 4 Chloro B carot ne Graphique 2 Intensit de couleur sur une ligne 11 pixels mesure lin aire en absorption L luant n 2 l ther di thyle oxyde est susceptible de provoquer la d gradation de la chlorophylle par oxydation Les couleurs du chromatogramme sont de faible intensit et la mesure avec le logiciel traduit cette faiblesse La bande du B carot ne est d port e sur le c t par rapport la tache de d p t la ligne de mesure est trac e de facon oblique afin de passer au centre de chaque bande Les xanthophylles se situent entre la chlorophylle a et la chlorophylle D La bande grise situ e en dessous du carot ne est un produit d grad de la chlorophylle peut tre la pyrochlorophylle Deux bandes se devinent en dessous d
26. otal 3 1 Pr lever l extrait total l aide de la micropipette capillaire talonn e ou d un capillaire simple en effleurant simplement l extrait Le liquide entrera par capillarit 3 2 Tenir le capillaire verticalement et effectuer sur la ligne de d p t une premi re tache gauche ainsi qu une seconde droite comme illustr sur la photo 17 Prendre garde de ne pas griffer le gel de silice avec le capillaire 3 3 Laisser s cher les taches Acc l rer le s chage avec un thermo ventilateur s che cheveux 3 4 Recharger les taches en extrait plusieurs fois jusqu ce qu elles soient tr s fonc es Compter le nombre de d p ts effectu s sur chaque tache Il est capital de laisser s cher les taches entre chaque d p t 3 5 Travailler tr s soigneusement avec des gants et ne pas clabousser la Photo 17 plaque avec l extrait Le volume d extrait d pos sur chaque tache est connu si vous travailler avec une micropipette talonn e 1 S paration des pigments 4 1 Lorsque la plaque est pr te effectuer le d veloppement sous la hotte aspirante 4 2 Placer la plaque CCM dans la cuve de d veloppement avec si possible le bord inf rieur de la plaque d pos au milieu de la cuve et le bord sup rieur de la plaque appuy sur la paroi arri re du bocal 4 3 Fermer le bocal avec beaucoup de pr cautions afin de ne faire bouger ni la plaque ni l luant Laisser migrer l luant jusqu 4 ou 5 cm
27. oto JPG ph ophytine peli bereeden I 4 4 I Lourtie 24 06 08 Image scanner Chromatogramme n 2 ther de p trole 4 vol ac tone 1 vol ther thylique 1 vol Photo JPG Image scanner OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be i Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Chromatogramme n 3 ther de p trole 3 vol ac tone 1 vol chloroforme 1 vol Photo JPG b Image scanner Chromatogramme n 4 ther de p trole 12mL ac tone 4 mL dichlorom thane 4 mL ther thylique 0 5 mL Lactuca sativa Ligne de d p t 2 cm Front de l luant chlorophylle b chlorophylle a anthocyanes b ta carot ne violaxanthine ph ophytines n oxanthine B Lourtie JPEG20933 w Li Photo JPG Image scanner OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be e Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Exp rience Assist e par Ordinateur utiliser un logiciel de mesure sur l image Les outils de mesure sur l image du logiciel MESURIM PRO auteur J F Madre Acad mie d Amiens France permettent d aborder des mesures de photom trie classique partir d objets photographi s ou scann s Ces outils travaillent sur les images telles qu elles sont repr sent es dans la m moire de l ordinateur les r sultats d pendent de la qualit de la num risation et d indications correctes d chelle Ces o
28. raduction de la 7 dition am ricaine De Boeck Universit 2007 photosynth se p 124 e Hopkins Physiologie v g tale traduction de la 2 dition am ricaine De Boeck Universit 2003 les photor cepteurs 7 133 140 e 6 Hopkins Physiologie v g tale traduction de 2 dition am ricaine De Boeck Universit 2003 Bio nerg tique et r actions photochimiques de la photosynth se 9 163 186 Sites Web e M thodes physiques de s paration et d analyse et m thodes de dosage des biomol cules Techniques chromatographiques la chromatographie liquide m canismes et modalit s http www snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html e Biologie et Recherche les diff rentes techniques de chromatographie http www 123bio net cours chromato introchromato html e Catabolisme de la chlorophylle b structures m canismes et synth se auteur P Folly http ethesis unifr ch theses downloads php file FollyP pdf e Propri t s sensorielles des denr es alimentaires et leurs modifications les chlorophylles et leur produits de d gradation http www epsic ch Branches chimie denrees 30senso pdf e Les pigments chloroplastiques extraction s paration purification d termination des spectres d absorption http www univ orleans fr sciences BIOLOGIE ressources TPPV TPdoc Pigments chloroplastiques htm e Spectrophotom trie colorim trie dosage de l acide phosphorique dans le coca co
29. rophyllea s l luant EF i Tout geur en pixels de n a PS la bande de mesure PE s Mesurer o 4 Mesurer les intensit s dans le Bleu iv surface Mesure lin aire Mesure logaritmique C Mesure en mission Mesure en absorption xd X e L x L 10 mm ss anthocyanidines chlorophylle b e b ta carot ne WM 7 Ge 7 ses d X v x e Ca de UN AA A P EE x AA A A 7 tete AA 4 EE Ge X d 2 L x X Cie LS Se A XD dee o n 2 M on v OK 25 30 35 40 mm S 9 surface dans le canal intensit 5 3688 d marrer Ecran Mesure d intensit de couleur sur une ligne Int grale de surface sous le pic intensit OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be 2 BIOLOGIE VEGETALE Science on Stage Belgium BIOCHTI 2 a e Calculer le Rf e Indiquer le temps chronom tr ou film par cm parcouru par l luant depuis la ligne de d p t to jusqu la fin de la chromatographie t ay SE Fichier Modifier Pr sentation Fen tre Aide LAJ n P1020614 L rcrr MOVIE aawww R sultats Chromatogramme n 1 ther de p trole 3 ac tone 1 dichlorom thane 1 Position mm D O R D O V D O B D O Pigments Isousle Rf pic 0 0 19 0 31 0 705 0 356 L
30. s causes de d gradation de la chlorophylle Changement du cycle turn over de vie Mort pr matur e due Remplacement continuel e e Adaptation dans les chloroplastes un nouveau milieu Maladie Pollution Digestion e S nescence Processus endog nes 2 Les r actions de d gradation de type l et de type Il Deux types de r actions de d gradation R actions de type I R actions de type II e Conservation du noyau t trapyrrolique e Ouverture oxydative du noyau t trapyrrolique e Extrusion du Mg e Extrusion du Mg e Hydrolyse de l ester phytilique e Hydrolyse de l ester phytilique e Modifications des chaines secondaires e Modification des chaines secondaires Processus exog nes IN VIVO tissus faible concentration en IN VIVO photooxydation n cessitant et des oxyg ne ou soumis une faible intensit lumineuse EX VIVO D gradation exog ne par les organismes IN VITRO d gradation chimique dans le solvant d extraction thanol m thanol expos O d gradation chimique en pr sence de solution d acide min ral ou de base dilu e d acides organiques de chaleur OBernadette Lourtie 2008 enzymes D gradation de la chlorophylle en automne EX VIVO r action enzymatique ph ophorbide a oxyg nase NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a PME d oso E d ran d ues Hj i H hs y UN M vii VW Im 1 Chiorophylle a
31. sformation de la chlorophylle b en ph ophytine b e Hydrolyse de l ester phytilique La chlorophyllide peut tre obtenue partir de la chlorophylle par l hydrolyse de l ester phytilique en solution basique dilu e La ph ophorbide s obtient par l emploi simultan de solutions acide et basique dilu es e R action d pim risation sur la position C21 L isocycle de la chlorophylle est un site tr s r actif L pim risation de la position C21 s observe lors de son isolation L quilibre entre l pim re 21 R Chl a et l pim re 21 S Chla s tablit dans une fraction d environ 85 15 par la formation d un interm diaire nol 8 11 AE ZZ mur v Y ES ON ON M TI N AN AS 719 Ld EN Y d MeOOC MeOOC O o phytyl o o phytyi 02 iphytyl Chlorophylle interm diaire nol Chlorophylle a e R action d allom risation sur la position C21 Lorsque les solutions de chlorophylles sont extraites dans le m thanol ou l thanol et expos es l air l oxydation de la position C 21 forme des d riv s hydroxy et m thoxy de la chlorophylle a ainsi que des purpurines EJ ran 13 LA E d se d a Ss Wim A IN V UN d we 24 26 Na d e SN eh N N E N N 7 3 Y T f a s N S AT 3 Du ih d 3 1 19 O 24 Ra On 20 NN COO Me Lows d o o4phytyl id X COOMe d riv
32. sies 20 OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a 1 Acquisition d une image num rique voir BLOCH I 1 a 2 Les mesures de photom trie classique partir d objets photographi s ou scann s 2 1 Mesure d intensit de couleur sur une ligne mesure lin aire en absorption dans l ensemble des 3 canaux RVB courbe noire dans le canal bleu courbe bleue dans le canal rouge courbe rouge et dans le canal vert courbe verte Chromatogramme n 1 ther de p trole white spirit 3 ac tone 1 dichlorom thane 1 Lut ine TA Chloro b Violaxanthine ca N oxanthine ut Chloro a Trace de ph ophytine absorption Vie Bea Dale Ka Le d b dro eebe W 10 mm Graphique 1 Intensit de couleur sur une ligne 11 pixels mesure lin aire en absorption L luant n 1 aucun des solvants ne provoque la d gradation significative de la chlorophylle les xanthophylles se r v lent tre les pigments les plus polaires Ils sont distinctement situ s sous la chlorophylle b avec une bande plus fonc e suivie d une traine qui ne permet pas de les diff rencier sur le chromatogramme Cependant le graphique de la mesure de l absorbance montre distinctement un pic pour 3 xanthophylles lut ine violaxanthine et n oxanthine La ph ophytine n est pas discernable l oeil nu La mesure de l abs
33. ur C4H100 R 12 19 22 66 67 S 9 16 29 33 Chloroforme pur trichlorom thane CH Cl R 22 38 40 48 20 22 S 36 37 NSC SonS Be Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCH I 2 a Ce quil faut savoir faire Choisir le type de chromatographie en fonction des compos s s parer Compos s s parer PM gt 2000 PM 2000 Chromatographie d exclusion Polaires solubles dans l eau Chromatographie d affinit Chromatographie pour la s paration d nantiom res d affinit Chromatographie de partage en phase inverse Chromatographie d affinit Chromatographie de partage en phase Chromatographie Chromatographie directe de partage en d change d ions phase inverse de paires d ions Chromatographie Chromatographie de partage en pour la s paration Infographie inspir e de phase directe d nantiom res Wwww snv jussieu fr bmedia lafont chromato A62 html Facteurs intervenant dans le partage des mol cules en fonction des m canismes de s paration la solubilit dans un solvant liquide chromatographie de partage la taille la forme des mol cules chromatographie d exclusion la polarit chromatographie d adsorption chromatographie d adsorption en phase invers e la charge lectrique chromatographie par change d ions la pr sence de groupe d atomes formant des sites particuliers chromatographie d affinit La classification des diff rents
34. utils demandent d tre utilis s avec circonspection voir avertissement de l auteur concernant l interpr tation des r sultats Annuaire des logiciels de SVT gratuits et disponibles sur internet en t l chargement SVT Edu net http perso wanadoo fr joudan eric logiciel htm Acad mie Nantes http www ac nantes fr 8080 peda disc svt tice htm Apr s t l chargement du logiciel on peut utilement se constituer un mode d emploi partir des explications propos es dans le Sommaire et les exemples d utilisation Exemple mesure d intensit de lumi re avec le logiciel MESURIM PRO On peut mesurer la variation d intensit de couleur dans un canal de couleur ou dans l ensemble des canaux le long d un segment suivant une bande plus ou moins large Les r sultats sont donn s sous la forme d une courbe qui peut tre donn e en mission intensit en absorption oppos de l intensit si la mesure est lin aire ou en D O estim e si la mesure est logarithmique Mesure d intensit de couleur sur une ligne Fichier Copier Graphique Tableau des couleurs C Tout Largeur en pixels de 1 E la bande de mesure n Mesurer surface Mesure en mission e Mesure lin aire e Mesure en absorption Mesure logaritmique d marrer e 2 a MESE RES Ecran 1 Mesure d intensit de couleur sur une ligne tableau des r sultats pour des valeurs choi
35. ve souvent que le premier filtrat avec le filtre en papier soit de couleur rouge bordeaux Photo 12 Photo 13 Photo 14 4 4 M langer les 2 filtrats pour obtenir l extrait total 4 5 Conserver dans un petit flacon muni d un bouchon Photo 8 4 6 QUESTION Comment expliquer cette premi re s paration des pigments lors de la filtration Chromatographie de partage descendante OBernadette Lourtie 2008 NSC SonS Be e Science on Stage Belgium BIOLOGIE VEGETALE BIOCHI 2 a B Chromatographie d adsorption 1 Pr paration des luants 1 1 Sous la hotte aspirante pr lever chaque solvant avec une pipette munie d une propipette Utiliser une pipette par solvant Composer les m langes de solvant dans une petite prouvette gradu e Attention l ther thylique est tr s volatil Eluant n 1 Ether de p trole ac tone dichlorom thane dans les proportions en volume 3 1 1 Eluant n 2 Ether de p trole ac tone ther thylique dans les proportions en volume 4 1 1 Eluant n 3 Ether de p trole ac tone chloroforme dans les proportions en volume 3 1 1 Eluant n 4 Ether de p trole ac tone dichlorom thane dans les proportions en volume 3 1 1 Ajouter 0 5 ml d ther thylique 1 2 Verser rapidement chaque luant dans une cuve de d veloppement bocal fond plat jusqu une hauteur d environ 1 cm et certainement pas plus de 1 5 cm Le niveau de l luant do
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