mode d`emploi - Thermo Fisher Scientific
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1. 4 N importe quel thermalcycler brevet peut tre utilis avec ce produit condition que les sp cifications de l instrument soient quivalentes celles d un Syst me PCR Perkin Elmer GeneAmp 9600 ou 9700 5 S assurer que tous les instruments et l quipement sont talonn s conform ment aux recommandations du fabricant VALEURS THEORIQUES Contr le de la qualit Le contr le de la qualit et la mise jour des produits pour typage tissulaire partir d ADN sont tr s importants Il est imp ratif de tester les oligonucl otides synth tis s extensivement en les comparant des ADN de lign es cellulaires connues Les solutions d amorces doivent tre test es par comparaison avec des ADN positifs et des ADN n gatifs haute s quence analogue La proc dure pour contr le de la qualit est la suivante e Test de la synth se des amorces par comparaison avec un panel d ADN de lign es cellulaires bien caract ris es e Test de solutions d une amorce sp cifique par comparaison avec un panel d ADN n gatifs et d ADN positifs e Test d un ensemble complet d amorces sp cifiques de s quences SSP e Test du produit final Etalon PCR interne positif La couple d amorces t moin est incluse pour v rifier l efficacit de la reaction PCR Sa pr sence confirme que s il ne s est pas produit d amplification sp cifique dans toute r action donn e cela est v ritablement d l absence de ce polymorphisme dans l2. chantillon d ADN et non a un chec de l amplification PCR En raison des diff rentes concentrations et des temp ratures d hybidation des couples d amorces sp cifiques par comparaison au couple d amorces talon interne L intensit de la bande t moin diminue souvent en pr sence d une amplification sp cifique et Les amorces talons internes sont plus sensibles aux conditions PCR non optimales et elles peuvent tre utilis es pour contr ler l efficacit de la PCR Une amplification non r ussie des fragments de l talon interne dans un puit couloirs sans amplifications sp cifiques doit tre consid r e comme un signe de performance sous optimale du syst me Se r f rer la section Tableau diagnostiqueur des anomalies pour voir quelle pourrait en tre la cause et savoir que faire pour y rem dier Des informations sp cifiques concernant l Etalon interne positif sont donn es dans le Manuel d Informations sur le Produit sp cifiques du Lot fourni avec chaque kit Page 10 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL INTERPRETATION DES RESULTATS Les all les sont identifi s par la pr sence d un produit PCR sp cifique Une amplification sp cifique dans un puit indique que l chantillon d ADN contient l all le ou un groupe d all les d fini par le couple d amorces dans cette r action de PCR Le tableau d interpr tation fourni avec chaq
3. lange d amorces plac dans la cupule num ro un qui est aussi identifi e par l usage d un colorant bleu le num ro de lot tant imprim sur le c t Ee e e pe Fofi etete fefie ao a 2a aa ae es fs for a ao oo ae a fs as Lu ar sf 00 oo Es Fees Las Las as ee IGNORER TOUS LES AUTRES NUMEROS MOULES DANS LE PLATEAU EN PLASTIQUE PAR EXEMPLE 1 2 3 pe a D x I X PREPARATION POUR L AMPLIFICATION PCR effectu e dans la zone pour post PCR 1 Placer le plateau Al Set ou CombiSe MSSP dans le thermalcycler Programmer le le thermalcycler en utilisant les param tres suivants Etapes Temp rature Dur e Action c sec Une tape de 96 120 D naturation d naturation 10 cycles 96 15 D naturation 65 60 Hybridation Elongation 20 cycles 96 10 D naturation 61 50 Hybridation 72 30 Elongation 2 Pour des informations sp cifiques au sujet du thermalcycler se r f rer au manuel du fabricant 3 Faire d marrer le programme 4 D s que le programme est termin retirer les chantillons du thermalcycler REMARQUE ne pas amener de l ADN amplifi dans la zone pour pr amplification PCR Page 8 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL DETECTION PCR EN UTILISANT L ELECTROPHORESE SUR GEL D AGAROSE Remarque il est recommand d utiliser le m me tampon pour faire le gel ainsi que pour servir
4. 14 BREVETS UTILISES DANS CE DOCUMENT PRODUIT 14 COORDONNEES POUR CONTACT cs ccccceeseeeceeseeseneeeeeeseeneeeeeesseneeesessseneeesensaees 15 Page 2 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet TM SSP par DYNAL R serv l usage diagnostique in vitro USAGE PREVU ADN typage HLA all lique Classe ou Classe Il RESOLUTION DU TYPAGE Kits a faible r solution les all les seront r solus au niveau g n rique ou au niveau du groupe all lique il y aura en g n ral concordance avec les sp cificit s d finies s rologiquement Kits a haute r solution galement appel s kits de sous typage ces kits apportent une haute r solution ou un g notypage all lique RESUME ET EXPLICATION Presque toutes les techniques de typage tissulaire partir d ADN utilisent la technique PCR pour amplifier le locus HLA a examiner Dans la plupart des m thodes de typage tissulaire a partir d ADN la technique PCR sert d tape d amplification pr typage visant a accro tre la quantit d ADN cible Le proc d de typage HLA n cessite ensuite une tape de post amplification pour faire la distinction entre les divers all les Contrairement aux autres m thodes de PCR la M thodologie SSP employ e par Dynal Biotech Ltd dans les Kits A Set M et CombiSet SSP est en mesure de faire la distinction entre les diff rents all les durant le proc
5. codon correspondant l extr mit 3 des amorces est indiqu e Si la s quence d un nouvel all le ne figurant pas dans le tableau d interpr tation est disponible les informations relatives la s quence des amorces peut servir trouver le mod le d amplification du nouvel all le Dans un tel cas se mettre en rapport avec les Services Techniques par courrier lectronique hla dynalbiotech com ou bien par fax 44 151 346 1228 Interpr tation en utilisant l outil SSPToo de Dynal L outil SSPToo de Dynal est un logiciel qui a t sp cialement con u pour aider interpr ter les r sultats Chaque tableau d interpr tation sp cifique de lot de kits Al Set et CombiSet SSP est entr dans la base de donn es du logiciel Cette derni re est constamment mise jour d s que de nouveaux lots de produits sont mis sur le march Pour assistance et informations au sujet de la saisie des r sultats et de l utilisation du logiciel consulter la section d aide du SSPToo Pour commander une copie gratuide du SSPToo de Dynal r f rence produit 990 80 veuillez contacter votre repr sentant local de Dynal Biotech Page 11 de 15 QDYNAL Be Oe TAE CEH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL TABLEAU DIAGNOSTIQUEUR DES ANOMALIES SOLUTIONS PROBLEME RAISON SOLUTION Aucune amplification ni amplification des fragments de l talon interne ni amplification
6. d agarose La technique PCR SSP offre un haut degr de r solution parce que chaque couple d amorces identifie deux sites polymorphes cis localis s li s La m thode est tr s sensible sp cifique et reproductible Page 3 de 15 MODE D EMPLOI QDYNAL B O TECH Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL REACTIFS R actifs fournis dans tous les Kits AllSet SSP ou CombiSet SSP de Dynal Article Description 1 Plateaux PCR avec m langes d amorces SSP pr aliquot s et d shydrat s Chaque cupule du plateau PCR contient une solution d amorces SSP d shydrat es contenant des amorces sp cifiques d all les et ou de groupe d all les ainsi qu une paire d amorces t moin appari e a des s quences non all liques Le couple d amorces t moin amplifie un fragment d un g ne conserv pr sent dans tous les chantillons 2 Capuchons PCR Capuchons pour sceller les plateaux pour PCR 3 M lange principal le nombre de flacons inclus dans le kit d pend du nombre de r actions PCR par test voir tableau adjacent Nbre de Nbre de flacons de r actions PCR m lange principal par test inclus dans le kit chacun contenant 1 8 ml 1 9 1 10 20 2 21 40 3 41 95 4 96 5 Concentration pr te l emploi Le m lange principal a t optimis pour tre utilis avec l ADN polym rase AmpliTaq Roche Molecular Systems Inc Des info
7. soci t autre que Dynal Biotech ou des produits ayant t mal utilis s ou manipul s TOUTES LES AUTRES GARANTIES EXPRESSES TACITES OU STATUTAIRES SONT SPECIFIQUEMENT EXCLUES PAR CE DOCUMENT Y COMPRIS ENTRE AUTRES LES GARANTIES DE BONNE VALEUR MARCHANDE OU D ADEQUATION POUR UN USAGE PARTICULIER En toutes circonstances la responsabilit maximale de Dynal Biotech se limite au prix des produits vendus par Dynal Biotech EN AUCUN CAS DYNAL BIOTECH NE POURRA ETRE TENUE RESPONSIBLE POUR TOUT DEGAT SPECIAL FORTUIT OU INDIRECT Certains tats n acceptent pas que les garanties ou que les rem des pour violation de certaines transactions aient des limites Dans de tels tats il est possible que les limites d taill es ci dessus ne soient pas pertinentes Ce produit ne peut tre r emball reformul ou revendu sous quelle forme que ce soit sans l autorisation crite de Dynal Biotech Ltd Royaume Uni MARQUES DE FABRIQUE UTILISEES DANS CE DOCUMENT PRODUIT Dynal est une marque d pos e de DYNAL BIOTECH A S A Oslo Norv ge AllSet et AllSet sont des marques de fabrique de DYNAL BIOTECH A S A Oslo Norv ge DynaMix est une marque de fabrique de DYNAL BIOTECH Lid Royaume Uni CombiSet et CombiSet sont des marques de fabrique de DYNAL BIOTECH Royaume Uni SSPTool est une marque de fabrique de DYNAL BIOTECH A S A Oslo Norvage AmpliTaq est une marque d pos e de Roche Molecular Systems Inc USA Ele
8. QDYNAL B T E CH Mode d emploi Famille de Kits AlISet TM et CombiSet M SSP par Dynal QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet TM SSP par DYNAL TABLE DES MATIERES Page USAGE aes tig seas a at de malins 3 RESUME ET EXPLICATION and enatienesnn nnoanententeinnte 3 PRINCIPE DU TEST 5eme on 3 Mat riel fourni dans le kit de typage a eaten renee eens 4 Conditions de conservation ssrumattendeen dant itesneubiendeise 4 MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS 5 MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI PAR DYNAL 5 MODE OP RATOIRE essais scenic 6 Pr l vement et pr paration des chantillons 6 Pr paration pour la PCR oe ee Cie ce O Amplification en cha ne par polym rase PCR D in 8 D tection par PCR en utilisant l lectrophor se sur gel d agarose 9 VALEURS THEGRIQUES 22 ane sans she ee ati ent 10 Contr le de la qualit 10 Etalon IN ISABEL nee eo diese ile 10 Interpr tation des r sultats eee sees eeeeeeeeeneees 11 Interpr tation en utilisant le SSPTooM de Dynal 11 TABLEAU DIAGNOSTIQUEUR DES ANOMALIES SOLUTIONS 12 GARANTIE casi cect ts es chose ee cute dues 14 MARQUES DE FABRIQUE UTILISEES DANS CE DOCUMENT PRODUIT
9. ctro Fast est une marque d pos e de Advanced Biotechnologies Ltd ABgene GeneAmp est une marque de fabrique de Roche Molecular Systems Inc USA BREVETS UTILISES DANS CE DOCUMENT PRODUIT Les produits SSP de Dynal sont vendus sous licence conc d e par ZENECA Ltd ARMS dans le cadre du Brevet Europ en No 0332435 et de la propri t de brevets internationaux correspondants ARMS est une marque de fabrique de ZENECA Ltd Ce produit est optimis pour usage dans le Proc d d amplification en cha ne par polym rase PCR qui est couvert par des brevets appartenant a Roche Molecular Systems Inc et a F Hoffmann La Roche Ltd Roche Aucune licence relevant de ces brevets pour utiliser le proc d PCR n est transmise express ment ou par implication l acheteur par l achat de ce produit Il est possible de se procurer d autres informations sur les licences pour utiliser le Proc d PCR aux Etats Unis aupr s du Directeur de la concession de licences de Roche Molecular Systems Inc 1145 Atlantic Avenue Alameda Californie 94501 et hors des Etats Unis aupr s du Directeur de la concession de licences pour PCR de F Hoffman La Roche Ltd Grenzacherstr 124 DH 4070 Bale Suisse Fabriqu par Dynal Biotech Ltd Royaume Uni Mis au point par Dynal Biotech Ltd Royaume Uni Page 14 de 15 MODE D EMPLOI QDYNAL B O TECH Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL COORDONNEES D
10. d de PCR Ainsi le traitement post amplification se limite a une simple tape de d tection par lectrophor se sur gel PRINCIPE DU TEST La m thode SSP de Dynal est une technique faisant appel la PCR qui utilise des Amorces Sp cifiques de S quence ou Sequence Specific Primers SSP pour le typage tissulaire partir d ADN Les produits SSP de Dynal se composent de panels de m langes d amorces chacun de ces m langes contenant une ou plusieurs paires d amorces sp cifiques on entend par l des amorces sp cifiques d all le et ou de groupes d all les ainsi qu un couple d amorces t moin appari aux s quences non all liques dans les chantillons Le couple d amorces t moin fonctionne comme un talon PCR interne servant v rifier si les amplifications en cha ne par polym rase PCR sont efficaces La m thode SSP de Dynal repose sur le principe qu une amorce parfaitement appari e sera utilis e avec une plus grande efficacit dans la r action PCR qu une amorce ayant un ou plusieurs mauvais appariements son extr mit 3 La sp cificit du syst me de typage fait partie de l tape d amplification PCR et de ce fait le traitement post amplification des chantillons est r duit au minimum L attribution des all les se borne tout simplement d terminer s il y a eu amplification ou non autrement dit il suffit de visualiser et de d tecter l amplification par lectrophor se sur gel
11. de tampon pour analyse autrement dit si vous utilisez du TBE 0 5 dans le gel utiliser aussi du TBE 0 5 en tant que tampon pour traitement 1 Pr parer un gel 2 p v d agarose ABgene MultiABgarose AG 0100c dans du tampon TBE 0 5 a Faire dissoudre l agarose 2 g 100 ml 0 5 x tampon TBE en le faisant bouillir dans un four micro ondes jusqu ce qu il soit compl tement dissous e Laisser refroidir jusqu ce qu il soit 60 C e Ajouter le bromure d thidium jusqu obtention d une concentration finale de 0 5 ug ml de gel b Couler le gel sur 3 4 mm d paisseur avec des puits de 3 mm de large e Le laisser se solidifier pendant au moins 15 minutes 2 Transf rer le gel d agarose dans une unit a lectrophor se sur gels submerg s Le gel doit tre couvert de l 2mm de TBE 0 5x e Retirer le peigne avec grand soin e Charger tout le produit PCR s quentiellement directement et minutieusement sur le gel 3 Analyser les gels dans le tampon TBE 0 5 Analyser les minigels un gel de moins de 10 cm entre les lectrodes pendant 10 minutes 15V cm et les gels plus larges pendant 15 minutes 10V cm Pour calculer la tension mesurer la distance en centim tres entre les ELECTRODES dans la cuve lectrophor se la longueur du gel N A PAS D IMPORTANCE 4 Examiner le gel sous illumination UV et documenter sous forme de photographie a Le m me tampon TBE 0 5 peut tre utilis plusieurs
12. ent de protection Mise en garde relative au danger de contamination utiliser les tubes a capuchon a vis pour pr parer les sp cimens avant d viter qu il y ait des claboussures et le cas ch ant une contamination Mise en garde relative au danger de contamination manipuler tous les sp cimens comme potentiellement infectieux suivant les proc dures de s curit suivre en laboratoire telles que celles d taill es dans Biosafety in Microbiological ADN Biomedical Laboratories et dans le Document M29 T de la NCCLS Commission nationale de normes de laboratoire d analyses m dicales Bien nettoyer et d sinfecter tous les plans de travail avec de l eau de Javel 1 NaCIO Passer l autoclave tout quipement ou mat riau tant entr en contact avec des sp cimens cliniques avant de les jeter Mise en garde relative au danger de contamination le bromure d thidium utilis pour colorer l ADN est un agent potentiellement canc rig ne Toujours porter des gants en nitrile pour manipuler les gels color s et le bromure d thidium Avertissement porter des lunettes bloquant les rayons UV et ne pas diriger directement le regard vers une source de lumi re UV sans prot ger les yeux lorsqu on examine ou prend des photos des gels Avertissement ne pas utiliser les m mes pipettes pour les manipulations post PCR et pr PCR Avertissement contamination Eviter la contamination microbienne des r actifs lor
13. fois mais la performance sera sans doute meilleure avec un tampon frais MISE EN GARDE Le bromure d thidium est un agent mutag ne puissant Porter des gants en nitrile et des lunettes de protection pour manipuler des gels ou des solutions contenant du bromure d thidium Page 9 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL LIMITES DE LA PROCEDURE 1 En raison de la grande sensibiit de la PCR faire preuve d une grande vigilance pour pr server la puret des r actifs du kit ou les m langes pour amplification S assurer que le d roulement des manipulations effectuer dans le laboratoire se fait d une mani re unidirectionnelle et que amplicon PCR ne soit pas amen dans la zone de pr paration de la PCR La puret des r actifs n est maintenue qu en respectant les bonnes pratiques de laboratoire de m me la performance du test ne peut tre garantie qu en adh rant rigoureusement aux proc dures sp cifi es dans la notice 2 Les Kits A Sef M et CombiSet de Dynal ont t mis au point en utilisant uniquement des sp cimens de sang entier non h parin ou d ADN purifi La performance n a pas t valu e avec d autres sp cimens 3 L chantillon d ADN sert de matrice pour le proc d d amplification PCR sa qualit en ce qui concerne la puret et la concentration ne doit pas d passer les limites indiqu es dans cette proc dure
14. iTaq 12 Agarose pour lectrophor se 13 Bromure d thidium D O1 e D Page 5 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet TM SSP par DYNAL MODE OPERATOIRE REMARQUE cette proc dure doit se d rouler dans deux zones diff rentes du laboratoire Amplification pr PCR et Amplification post PCR comme l indiquent les instructions suivantes PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Attention manipuler tous les sp cimens comme des produits potentiellement infectieux a b IL EST RECOMMANDE DE NE PAS UTILISER DU SANG HEPARINE L ADN peut tre extrait de cellules nucl es humaines par la m thode que l on pr f re quelle qu elle soit Pour obtenir une amplification PCR SSP et des r sultats de typage optimaux utiliser de l ADN ultra pur DO 260 280 rapport 1 6 1 8 La concentration finale de l ADN avant la PCR SSP doit tre de l ordre de 50 ng ul Diluer l ADN extrait dans de l eau H20 On peut conserver l ADN 20 C ou une temp rature plus froide pendant des p riodes prolong es gt 1 an sans qu il ne se produise d effet ind sirable L ADN conserv 4 pendant de longues p riodes se d gradera d o un plus grand nombre d art facts par exemple des amplifications non sp cifiques PREPARATION POUR L AMPLIFICATION PCR effectu e dans la zone pour pr PCR Pour effectuer un simple typage pr parer le m lange PCR suivant C
15. its AllSet et CombiSet SSP par DYNAL BIBLIOGRAPHIE 1 Saiki RK Scharf S Faloona F Mullis KB Horn GT Erlich HA Arnheim N Enzymatic amplification of beta globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 1985 Dec 20 230 4732 1350 4 Wu D Y Ugozzoli L Pal B K amp Wallace R B 1989 Allele specific enzymatic amplification of beta globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia Proc Natl Acad Sci U S A 86 8 2757 60 Newton C R Graham A Heptinstall L E Powell S J Summers C Kalsheker N Smith J C amp Markham A F 1989 Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system ARMS Nucleic Acids Res 17 7 2503 16 Olerup O amp Zetterquist H 1992 HLA DR typing by PCR amplification with sequence specific primers PCR SSP in 2 hours an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor recipient matching in cadaveric transplantation see comments Tissue Antigens 39 5 225 35 Bunce M O Neill C M Barnardo M C N M Krausa P Browning M J Morris P J amp Welsh K I 1995b Phototyping Comprehensive DNA typing for HLA A B C DRB1 DRB3 DRB4 DRB5 amp DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence specific primers PCR SSP Tissue Antigens 46 5 355 367 Richmond Y ADN McKinney W eds 1993 Biosafety in microbiological a
16. m rase Taq ou les pr m langes pour PCR n ont pas t bien m lang s avant de les utiliser M langer bri vement en faisant tourbillonner avant d utiliser Les fragments d talon interne sont faibles ADN impur Mesurer la qualit de l ADN R p ter l extraction de l ADN avec des solutions fra chement pr par es Quantit insuffisante d ADN Mesurer la concentration de l ADN et l ajuster 50 ng l La temp rature d hybridation est trop lev e le thermalcycler n est pas talonn Etalonner le thermalcycler et v rifier le programme de PCR Un thermalcycler utilis pour PCR SSP de routine doit tre talonn tous les 6 mois La quantit d ADN polym rase thermostable est insuffisante Utiliser une plus grande quantit d enzyme dans les r actions PCR L ADN polym rase thermostable est de qualit m diocre Utiliser Amplitad fabriqu par Perkin Elmer Amplification non sp cifique chelles ou tra n es ADN impur Certains m langes d amorces ont une forte tendance produire une amplification non sp cifique se r f rer aux notes de bas de page de chaque tableau de sp cificit Tous les fragments de taille sup rieure celle du fragment de l talon interne peuvent tre limin s V rifier la qualit de l ADN R p ter l extraction de l ADN L absence d ADN peut aussi causer des train es Les signaux d amplification deviennent de
17. nd biomedical laboratories HHS Publication Number CDC 93 8395 National Committee for Clinical Laboratory Standards Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline NCCLS Document M29 T Villanova PA NCCLS 1989 Satsangi J Jewell DP Welsh K Bunce M Bell JI Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 1994 Jun 11 343 8911 1509 10 Bein G Glaser R Kirchner H Rapid HLA DRB1 genotyping by nested PCR amplification Tissue Antigens 1992 Feb 39 2 68 73 Page 13 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL GARANTIE La garantie donn e au premier acheteur stipule que les produits ne sont conformes qu la quantit et au contenu indiqu s sur le flacon et sur les tiquettes externes pour la dur e de conservation indiqu e La responsabilit de Dynal Biotech et le recourt exclusif de l acheteur dans le cadre de cette garantie se limite soit au remplacement aux frais de Dynal Biotech de tout produit pr sentant un d faut de fabrication et qui sera renvoy a Dynal Biotech afranchissement pr pay ou bien suivant le choix de Dynal Biotech au remboursement jusqu a concurrence du prix d achat Les revendications pour des marchandises endommag es en cours de transport doivent tre soumises au transporteur Cette garantie ne couvrira pas des produits ayant t modifi s par une
18. onsulter le tableau ci dessous pour conna tre les volumes requis en fonction du nombre de r actions PCR par test M lange principal ADN chantillon 50 ng ul ADN polym rase AmpliTaq 5 u i ul Bien m langer Placer 10 ul du m lange PCR ci dessus dans chaque cupule du plateau du Kit A Set ou CombiSet SSP de Dynal Mettre les capuchons PCR en place et bien les visser pour s assurer que les tubes sont enti rement scell s On peut se servir d un outil d operculage On peut aussi utiliser des feuilles adh sives compatibles avec la PCR Les chantillons sont alors pr ts pour l amplification PCR Conserver le reste des r actifs du kit 2 8 C Page 6 de 15 QDYNAL B OTE CH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL Tableau des volumes calcul s pour les m langes PCR Nombre de r actions Solution AmpliTaq PCR par MP WI ul test REMARQUE pour les nombres impairs de r actions PCR par test non indiqu s dans le tableau ci dessus se rendre au prochain num ro pair par exemple s il s agit de 13 r actions PCR par test regarder les calculs correspondant 14 r actions PCR par test Page 7 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet SSP par DYNAL DISPOSITION DU PLATEAU L orientation appropri e du plateau est assur e par le m
19. plus en plus faibles dans le temps La solution de coloration du gel d agarose au bromure d thidium est trop vieille Pr parer une solution de bromure d thidium fra che pour que le gel soit mieux color Amplifications faussement n gatives La temp rature d hybridation est trop lev e le thermalcycler n est pas talonn Une des lampes UV est cass e V rifier l quipement produisant la lumi re UV Etalonner le thermalcycler et v rifier le programme de PCR Un thermalcycler utilis pour la PCR SSP de routine doit tre talonn tous les 6 mois Amplifications faussement positives Pourrait d couler d une contamination Utiliser des gants des embouts de pipette munis de bouchons filtrants et utiliser des zones s par es pour pr PCR et post PCR Manipuler les chantillons avec pr cision chaque tape V rifier l absence de contamination en utilisant les amorces t moins de contamination de Dynal r f rence produit 990 05 ADN impur Mesurer la qualit de l ADN R p ter l extraction de l ADN avec des solutions fra chement pr par es La temp rature d hybridation est trop lev e le thermalcycler n est pas talonn Etalonner le thermalcycler et v rifier le programme d PCR Un thermalcycler utilis pour la PCR SSP de routine doit tre talonn tous les 6 mois Profils d amplification bizarres On n utilise pas le tableau d interpr tation a
20. ppropri V rifier que le num ro du lot du produit utilis correspond celui du tableau d interpr tation utilis Le profil d amplification contient un faux positif Bandes non distinctes et brouill es w Nouvel all le qui n est pas inclus dans le tableau d interpr tation Il est possible que le tampon pour l lectrophor se soit ti de Le peigne utilis a des fentes trop paisses V rifier que toutes les amplifications sp cifiques sont d une taille correcte ou bien si un art fact report dim re d amorce pourrait avoir t interpr t tort comme une amplification R p ter le typage Si le nouveau profil de l amplification est reproductible contacter le repr sentant local de Dynal Biotech pour lui demander des informations au sujet du profil d amplificaiton des all les recemment d crits Utiliser le tampon TBE recommand Faire le test avec une tension inf rieure Utiliser des peignes plus fins 4 x 1 mm L amplicon ne se charge pas comme il faut Concentration diff rente entre le tampon de migration et le tampon de pr paration du gel Tampon de migration op rationnel incompatible avec l amplicon PCR Pr sence de bulles d air dans la pipette Utiliser le m me tampon pour le gel et en tant que tampon de migration Le tampon TBE 0 5 est recommand Pipeter comme il faut Page 12 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI K
21. rmations sur la formulation sont disponibles en contactant l adresse hla dynalbiotech com 4 Mode d emploi du produit Notice du produit sp cifique de lot 5 Fiche d interpr tation Mode d emploi et Notice sur le produit sp cifique de lot en anglais BSPI Fiche permettant de d terminer quel est l all le ou le groupe d all les que les m langes d amorces respectifs sont en mesure d identifier Conservation 1 Conserver les plateaux pour PCR et le m lange principal entre 2 et 8 C 2 Ne pas congeler les r actifs 3 Si conserv s comme il est indiqu ces r actifs et m langes d amorces resteront stables jusqu la date limite d utilisation indiqu e dans la notice d information sur le produit sp cifique de lot Page 4 de 15 QDYNAL B O TECH MODE D EMPLOI Kits AllSet et CombiSet TM SSP par DYNAL MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS 1 2 10 11 R serv l usage diagnostique in vitro Toutes les manipulations avec les produits AlISet M et CombiSet SSP de Dynal doivent tre effectu s en accord avec les Bonnes Pratiques de Laboratoire et avec les directives locales telles que les normes EFI et les directives CPA Mise en garde relative au danger de contamination manipuler tous les chantillons comme s ils pr sentaient un danger de contamination Toutes les manipulations doivent tre effectu es en portant des gants et des v tements de l quipem
22. s du pr l vement de parties aliquotes dans les flacons de r actifs Toujours porter des gants pour viter de contaminer les chantillons Il est recommand d utiliser des pipettes st riles et des embouts de pipette filtre st riles jeter Ne pas utiliser des r actifs pr sentant des signes de turbidit ou de contamination microbienne Avertissement relatif l limination liminer les r actifs inutilis s et les d chets conform ment la r glementation nationale f d rale tatique locale Fiche technique du produit MSDS on peut se la procurer l adresse email www tissue typing com ou sur demande aupr s du bureau r gional de Dynal Biotech voir liste d taill e des adresses pertinentes la derni re page de cette notice MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI PAR DYNAL BIOTECH Appareils de pipetage manuel par ex Eppendorf Gilson Embouts de pipette filtre jeter pour articles ci dessus Agitateur m langeur Microcentrifugeuse Support de rangement de microtubes de plateau PCR Syst me de la PCR Perkin Elmer GeneAmp 9600 ou 9700 ou tout autre thermalcycler de sp cification analogue 7 Plaque chauffante micro ondes pour r chauffer les solutions d agarose 8 Appareil pour lectrophor se par ex ABgene Electro Fast Stretch 108 Complete AB 0708 9 Transilluminateur UV 10 Syst me a gel de documentation photographique par images 11 Polym rase Tag recombinante Dynal recommande Ampl
23. sp cifique ne se produit Quantit insuffisante d ADN V rifier que le volume et la concentration de l ADN ajout taient corrects L ADN contient des inhibiteurs de la PCR tels que des prot ines ou de l thanol provenant des tapes de la pr cipitation Mesurer la qualit de l ADN Suivre la m thode d extraction de l ADN du fabricant la lettre Essayer avec une autre m thode d extraction de l ADN R extraire l ADN L ADN a t extrait de sang h parin Utiliser du sang non h parin ou bien essayer le traitement l h parinase voir R f rence 8 L ADN est dissous dans un tampon contenant de l EDTA Refaire l extraction de l ADN et dissoudre l ADN dans de l eau st rile Echec al atoire de Pamplification Si les capuchons des tubes pour PCR ne sont pas bien viss s il y aura vaporation et l amplification chouera Erreurs commises lors de la coul e du gel S assurer que tous les capuchons sont bien ferm s Utiliser un outil d operculage V rifier que l on a rempli un nombre suffisant de puits et qu ils contiennent tous approximativement le m me volume de m lange pour PCR Utilisation de pipettes non talonn es Proc der l talonnage syst matique de toutes les pipettes conform ment aux recommandations du fabricant Erreurs commises durant le pipetage Effectuer le pipetage en tant plus vigilant L ADN chantillon la poly
24. ue lot peut servir d terminer quel est l all le ou le groupe d all les que les solutions d amorces respectives sont en mesure d identifier Dans de nombreux Kits SSP Al Set ou CombiSef de Dynal mais pas tous chaque all le ou groupe d all les est amplifi par plus d une solution d amorces Il est important de v rifier que toutes les autres solutions d amorces qui devraient tre positives pour porter cet all le ou groupe d all les sont en fait r ellement positives Bien que les all les soient attribu s par la pr sence du produit PCR les tailles relatives des produits PCR peuvent tre utiles au niveau de l interpr tation des typages SSP Les tailles approximatives des produits PCR sp cifiques peuvent tre utilis es pour faire la distinction entre une vraie amplification positive et art fact de primer oligom re primer dimers un report provenant des cupules adjacentes des amplifications non sp cifiques Dans le tableau d interpr tation fourni avec chaque Kit Al Set Met CombiSet M SSP de Dynal la s quence est donn e pour les trois nucl otides les plus terminaux qui d terminent la sp cificit a l extr mit 3 de l amorce avant ainsi que de l amorce r verse e Pour les produits HLA Classe la position du nucl otide dans le 2 me 3 me ou 4 me exon appari l extr mit 3 des amorces est indiqu e e Pour les Kits SSP AllSet HLA Classe II la position du
25. ynal Biotech Ltd 11 Bassendale Road Croft Business Park Bromborough Wirral CH62 3QL Royaume Uni Dynal Biotech A S A PO Box 114 Smestad N 0309 Oslo Norvege T l 47 2206 1000 Fax 47 22 50 70 15 E mail dynal dynalbiotech com Internet http www dynalbiotech com Dynal Biotech Inc HLA Diagnostics Division 555 ADNorra Glen Court Suite 5 Lafayette Hill PA 19444 USA Toll Free 1 1866 DYNAL TT 396 2588 T l 1 610 940 1511 Fax 1 610 940 3606 E mail hla us cust serv dynalbiotech com Dynal Biotech Pty PO Box 204 Carlton South Victoria 3053 Australia Tel 1 800 623 453 Tel 61 3 9663 5777 Fax 61 3 9663 6660 NZ Freecall 0800 448 246 Email techserv dynal com au Pour les informations relatives aux distributeurs de Dynal dans le monde veuillez contacter T l 44 151 346 1234 Fax 44 151 346 1223 E mail hla dynalbiotech com Internet http Awww tissue typing com DYNAL BIOTECH GmbH Bramfelder Chaussee 41 22177 Hambourg Allemagne T l 49 40 36 15 73 0 Fax 49 40 36 15 73 30 E mail info dynal smartnet de Dynal Biotech S A Centre de Transfert de l U T C 66 Avenue de LADNshut 60200 Compi gne France T l 33 3 44 23 45 95 Fax 33 3 44 23 16 14 E mail dynal france wanadoo fr Dynal Biotech Ltd Copyright 2003 Dynal Biotech Ltd U K All rights reserved Printed 12 03 Rev 000 Page 15 de 15
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