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Elucigene CF
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1. tabli chez les personnes pr sentant un ou plusieurs signes ph notypiques caract ristiques de la MV avec la preuve d une anomalie de fonctionnement du CFTR bas e sur l un des l ments suivants pr sence de deux mutations pathog nes sur le g ne CFTR ou de deux valeurs quantitatives anormales de chlorure dans la sueur mesur es par ionophor se dans le test la pilocarpine gt 60 mEg ljou de mesures de diff rence de potentiel nasal trans pith lial caract ristiques de la MV La fr quence de d tection de la mutation du g ne CFTR d pend de la m thode d analyse et du contexte ethnique Chez certaines personnes Symptomatiques une seule ou aucune mutation pathog ne n est d tectable Chez certains porteurs la mutation pathog ne n est pas d tectable CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 3 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Les troubles li s au CFTR sont h r ditaires d une mani re autosomique r cessive Les fr res et s urs d un proposant atteint de mucoviscidose ont 25 de probabilit d tre touch s 50 de probabilit d tre porteurs asymptomatiques et 25 de probabilit de n tre nitouch s ni porteurs L analyse en g n tique mol culaire de la ou des mutations pathog nes dans le g ne CFTR est utilis e pour la d tection des porteurs lors des programmes de d pistage dans la population Il est possible de proc der une analyse pr natale pour les grossesses pr sentant un risque accru de troubles li s au
2. Analysis Science 1989 245 4922 1073 8 6 Cystic Fibrosis Mutation Database www genet sickkids on ca cftr app 7 Joshua D Groman et al Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign Am J Hum Genet 2004 74 1 176 179 8 Newton CR et al Analysis of any point mutation in DNA The Amplification Refractory Mutation System ARMS Nucleic Acid Res 17 2503 2516 1989 9 Satsangi J et al Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 343 1509 1510 1994 10 PCR Primer A Laboratory Manual 2 edition ColdSpring Harbour Laboratory Press Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics UK Ltd ARMS est une marque commerciale de AstraZeneca UK Ltd QIAAMP est une marque commerciale de Qiagen GmbH PICOGREEN est une marque commerciale de Molecular Probes Inc GENEMARKER est une marque commerciale de SoftGenetics Corporation GENEMAPPER NED VIC PET POP 7 LIZ et HI DI sont des marques commerciales de Life Technologies Corporation REMARQUE L ATTENTION DE L ACHETEUR LICENCE RESTREINTE Les polynucl otides marqu s par les fluorochromes VIC NED et PET et ou leur utilisation peuvent tre prot g s par un ou plusieurs brevets appartenant Life Technologies Corp Le prix d achat de ce produit comprend des droits limit s non transf rables conform ment certaines demandes de brevets a
3. Prefix Name Delimiter _ Ka Format E Sur le 3500 la convention de d nomination des fichiers doit tre d finie pour que le nom de l chantillon soit inclus dans le nom du fichier fsa par ex CFEU2 JJMMAAAA_1234 5_A_A01 E pra Creme Dire File tiwi Caern Satup Fie Namo Corvrantion J Q Musee H roma tell Prorede 1nmene vehos o P lorro obe Sii ah t Hir tene Athirar Preen A bhe hiwr sSsej r Hase dette Eitidestr mb tet ADA tr Argus ver gere E rate lipne Andes Pista ai lanre Anisy Hante apii l har re uier Tadj utter Tazi Jam Tagi v L ftmiter whe hrbreda Upebtcare i j diet tritare hds Add corne sgh bo peradi atirina japtonmtdi Interpr tation des r sultats Au cours de la collecte des donn es les fragments PCR seront observ s sous forme de pics bleus mutants ou verts type sauvage sur l lectrovh rogramme des donn es brutes Une personne a deux copies du g ne CFTR Quand ces copies ont la m me s quence pour un all le donn la personne est d crite comme tant homozygote pour ce site Quand les copies ont une s quence diff rente pour un site donn la personne est d crite comme tant h t rozygote Une fois la collecte des donn es termin e les fragments PCR CF EU2v1 doivent tre mesur s par rapport au marqueur de taille GS600v2 LIZ size standard l aide du logiciel d analyse de fragment CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page
4. tre mises en place avant de tester les chantillons cliniques Proc dure d amplification Remarque Afin de minimiser le risque de contamination les tapes 3 5 doivent tre effectu es dans une zone exempte de produit PCR de pr f rence dans un cabinet flux laminaire 1 Programmer le thermocycleur pour un cycle tape unique pour activer la HotStart Tag 94 pendant 20 minutes reli un programme de thermocyclage d amplification de 1 minute 94 d naturation 2 minutes 58 renaturation et 1 minute 72 extension pendant 30 cycles Cela peut tre associ un fichier retard de 20 minutes 72 extension pendant le cycle final Un contr le n gatif doit tre inclus dans chaque s rie PCR 3 D congeler les m langes d amorce et le m lange principal PCR et centrifuger bri vement pour recueillir le contenu au fond des flacons M langer doucement en agitant au vortexeur et en centrifugeant bri vement les flacons une nouvelle fois Pr parer assez de m lange r actif pour la quantit d chantillons et de contr les tester tableau 1 Remarque Le m lange principal PCR est visqueux et il est important d assurer que les volumes corrects sont manipul s Il est recommand d ajouter le m lange principal PCR aux m langes d amorce distribu s auparavant pour assurer que tout le liquide est distribu de la pipette dans le m lange d amorce Remarque Ne pas utiliser de m lang
5. 0 1 15 Entre 0 et 15 kVolts 7 Injection Time Dur e d injection 12 07 1 600 entre 1 et 1 000 s 8 Voltage Number Of_Steps 20 Entre 1 et 100 nk Nombre d tapes de tension 9 Voltage Step _Interval 15 1 60 entre 1 et 1 000 s Intervalle d tape de tension 10 Data Delay Time D lai d attente des donn es 60 Entre 1 et 3 600 s 11 Run _ Voltage Tension de s rie 15 0 Entre 0 et 15 kVolts 12 Run _Time Dur e de la s rie 1200 300 14 000 entre 1 et 1 000 s Augmenter la dur e d injection 36 secondes pour l analyse de l ADN extrait partir de sang s ch sur papier filtre Remarque La dur e de s rie requise variera selon la temp rature ambiante du lieu d installation de lanalyseur g n tique Pour des informations suppl mentaires sur la cr ation de modules de s rie consulter le Manuel d utilisation de l analyseur g n tique Applied Biosystems 3130 Cr er le protocole CF EU2 dans le Protocol Manager gestionnaire de protocole en s assurant que les param tres suivants sont s lectionn s Type Regular Normal e Run Module Module de s rie CF EU2 voir module de s rie ci dessus e Dye Set Ensemble de fluorochromes G5 Pour traiter les chantillons cr er une fiche d chantillon l aide du Plate Manager gestionnaire de plaque s assurer que le protocole d instrument s lectionn convient pour CF EU2v1 voir ci dessus Remarque Pour des informations suppl mentair
6. 282 288 289 295 5 297 303 5 308 314 315 321 323 326 332 338 341 5 347 5 349 355 357 360 360 366 5 367 373 377 383 384 390 391 397 398 5 404 5 406 411 413 418 423 429 433 439 439 5 445 5 446 450 5 453 5 460 5 461 465 5 470 476 485 5 491 5 Page 17 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Marqueur n Marqueur Plage de taille du produit pb donn es 3130 POP7 496 503 506 512 516 5 524 5 110 130 140 160 175 195 S549R T gt G Le pic 20 est pr sent uniquement dans le m lange A Tailles de l all le 5T Plage de taille du Marqueur produit pb donn es 3130 POP7 5T 9 117 25 118 75 REMARQUE Les tailles de marqueur peuvent varier selon l instrument et le polym re utilis Exemples d interpr tation 1507del En raison de l emplacement de la d l tion 1507del sur le g ne CFTR il est possible de d tecter la pr sence de ce marqueur par un changement de 3 pb de la taille du pic F508del et par un pic sp cifique du mutant I507del Si un seul all le mutant 1507del est pr sent le pic I507del mutant sera observ sous forme d un pic bleu environ 159 pb Un pic F508 de type sauvage sera observ comme tant pr sent mais environ la moiti de la hauteur du pic normalement associ un g notype homozygote de type sauvage Celui ci est observ sous forme d un pic vert environ 167 pb Un pic vert suppl mentaire sera galement observ environ 164 pb chantil
7. assurer des performances optimales Collecte et conservation des chantillons Des chantillons de sang total EDTA et des spots de sang s ch ont t valu s pour assurer qu ils sont compatibles avec ce test Il a parfois t signal que les dispositifs de collecte d chantillon nuisent l int grit de certains analytes et qu ils pourraient interf rer avec les technologies de certaines m thodes 9 II est recommand chaque utilisateur de s assurer que le dispositif choisi est utilis conform ment aux instructions du fabricant et que les dispositifs de collecte d chantillon sont compatibles avec ce test Les chantillons de sang doivent tre conserv s 20 C avant la pr paration de l ADN Eviter les cong lations et d cong lations r p t es Pr paration de l ADN partir d chantillons de sang total EDTA Les r sultats obtenus sont r guliers avec de l ADN extrait l aide du kit QIAamp 96 DNA Blood Kit ou du kit QlAamp DNA Mini Kit avec de la prot inase K en respectant le protocole d crit dans le manuel QlAamp en partant de 200 ul de sang total liquide et en luant dans 200 ul d eau grade biologie mol culaire Pr paration d ADN partir de spots de sang s ch Les r sultats obtenus sont r guliers avec de ADN extrait l aide du kit QlAamp DNA Mini Kit en respectant le protocole d crit dans le manuel QlAamp mais en partant de 2 disques de 3 mm d un spot de sang s ch
8. avec Elucigene CF EU2v1 Cing chantillons taient invalides apr s la PCR en raison d une faible concentration en ADN moins de 1 5 ng ul Parmi les chantillons ayant donn des r sultats interpr tables 96 taient normaux 5 taient h t rozygotes pour F508del 1 tait h t rozygote pour 1717 1G gt A 1 tait h t rozygote pour G551D 1 tait h t rozygote pour 621 1G gt T 1 tait h t rozygote pour G542X et 1 tait h t rozygote composite pour G542X F508del Quatre vingt onze chantillons d ADN extraits partir de spots de sang s ch ont t test s en aveugle avec Elucigene CF EU2vi L amplification a chou pour cinq chantillons Sur les chantillons dont l amplification a r ussi 20 n ont pas satisfait les crit res d analyse pour l interpr tation apr s une deuxi me injection de 12 secondes sur un analyseur g n tique 3 500 tous les chantillons invalides l taient en raison d une faible concentration en ADN moins de 1 5 ng ul Les 20 chantillons invalides ont t CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 23 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi r inject s pendant 36 secondes sur l analyseur g n tique 3 500 et analys s 7 chantillons n ont pas satisfait les crit res d analyse pour l interpr tation Parmi les 79 chantillons ayant donn des r sultats interpr tables 38 taient normaux 5 taient h t rozygotes pour F508del 3 taient h t rozygotes pour G551D 3 taient h t rozygot
9. de pics de refoulement de fond Pics sans tiquette Pics FAM mutants faibles Profil d s quilibr du m lange A Profil d s quilibr du m lange B Pics divis s dans le profil du m lange B Pour obtenir un exemplaire du Guide de d pannage Elucigene CF EU2vi consulter notre service technique T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiries elucigene com E techsupport elucigene com Limites de la proc dure 1 Les r sultats obtenus par ce test de diagnostic ou tout autre test de diagnostic doivent tre utilis s et interpr t s uniquement dans le contexte du tableau clinique global Elucigene Diagnostics ne pourra tre tenu responsable des d cisions cliniques prises 2 L absence de d tection de mutations par ce kit ne garantit pas l absence d autres mutations du g ne CFTR Il existe d autres mutations qui ne sont pas d tect es par ce kit 3 La fr quence des mutations varie selon les populations Les donn es de fr quence de mutation dans les populations sont disponibles aupr s du Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium 6 L utilisateur de ce kit doit insister sur ces points au moment de rendre compte des r sultats au clinicien ou au conseiller g n tique demandant le diagnostic CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 24 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Exon ration de responsabilit Les r sultats de ce test et d autres tests diagnostics doivent tre interpr t s en ass
10. et en luant dans 100 ul d eau grade biologie mol culaire Il est recommand d valuer minutieusement les autres m thodes d extraction de l ADN et types d chantillon avec le test Elucigene CF EU2v1 avant d utiliser les r sultats des fins de diagnostic Consid rations importantes Quantit d ADN Avec des conditions PCR optimales et en utilisant les param tres recommand s pour l injection des chantillons voir la remarque dans la section Electrophor se capillaire indiqu s dans les modules de s rie de la colonne capillaire des r sultats acceptables ont t r guli rement obtenus avec l ADN extrait en utilisant les m thodes indiqu es ci dessus des concentrations entre 1 5 ng ul et 25 ng ul La quantification de l ADN est tr s importante la concentration de chaque chantillon d ADN tester doit tre mesur e CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 8 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi pour assurer des r sultats optimaux Des techniques comme la fluorescence PicoGreen ou l absorbance UV sont acceptables cause de la variation dans les techniques de quantification l utilisateur doit tenir compte des directives suivantes L ajout de tr s grandes quantit s d ADN augmentera la probabilit que les pics de fond soient tiquet s par le logiciel d analyse Les tapes suivantes peuvent tre r alis es pour r duire la probabilit que les pics de fond soient tiquet s e Diluer l chantillon d ADN e
11. les r actifs sont fournis pr ts l emploi Conserver les r actifs non ouverts et ouverts 20 C Les r actifs ouverts peuvent tre conserv s pendant une dur e maximum de 3 mois La quantit fournie est suffisante pour r aliser 50 10 tests 2 flacons de 120ul 50ul de m lange d amorce CF EU2v1 A contenant des amorces pour amplifier les all les mutants suivants R347H R347P 2789 5G gt A 3120 1G gt A 711 1G gt T R334W 1507del F508del 3849 10kbC gt T 1677delTA 1078delT V520F L206W W1282X R560T 2347delG Q890X R553X G551D S549N M1101K G542X 3905insT Y1092X C gt A Si251N 444delA 1811 1 6kbA gt G 1717 1G gt A R117H R117C N1303K Y122X 394delTT G85E R1066C 1898 1G gt A W846X 2184delA D1152H CFTRdele2 3 P67L 2143delT E60X 3659delC 3272 26A gt G 621 1G gt T A455E R1162X et R1158X Ce m lange contient galement des amorces de type sauvage pour la d tection de all le F508del normal des amorces pour la d tection des variants de la polythymidine IVS8 5T IVS8 7T IVS8 9T et des amorces pour l identification de 2 marqueurs de s quences courtes r p t es en tandem short tandem repeats STR hypervariables 404473 450043 2 flacons de 120ul 50ul de m lange d amorce CF EU2vi B contenant des amorces de type sauvage pour amplifier les all les normaux des mutants amplifi s par le m lange d amorce A l exception de l all le F508del normal qui est amplifi par les amorce
12. s assurer que l quipement d lectrophor se capillaire choisi est utilis conform ment aux instructions du fabricant et qu il est compatible avec ce test Dans cette situation les param tres cl s sont le polym re et la rang e de capillaires Les conditions d lectrophor se capillaire suivantes permettent d obtenir des r sultats optimaux 1 M langer 6 8 ul de marqueur de taille GS600v2 LIZ size standard 250 ul de formamide Hi Di et agiter vigoureusement m lange suffisant pour 16 puits Distribuer 15 ul du m lange dans chaque puits d une plaque pour PCR de 96 puits Ajouter 3 ul de produit PCR provenant de chacune des amplifications des m langes A et B pour s parer les puits contenant le m lange de marqueur de taille fornamide de l tape 1 d j distribu dans la plaque D naturer le produit PCR distribu dans la plaque pour PCR sur un thermocycleur avec les param tres suivants 94 pendant 3 minutes puis 4 pendant 30 secondes Centrifuger bri vement la plaque pour recueillir le contenu au fond des flacons et pour liminer toute bulle des puits puis charger imm diatement sur l analyseur g n tique Remarque Les param tres d injection des chantillons peuvent tre modifi s pour s adapter la quantit d amplicon produite au cours de la PCR qui peut varier en fonction de la quantit d ADN g nomique ajout e Une quantit moindre d amplicon peut tre ajout e la colonne pour
13. valid s et optimis s pour une utilisation avec CF EU2v1 Remarque Voir le Guide de d pannage Elucigene CF EU2v1 pour des informations suppl mentaires CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 9 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Protocole de test Contr le de la contamination par PCR Le processus PCR g n re un grand nombre de produits amplifi s amplicons et comporte un risque lev de contamination susceptible d entra ner des r sultats faux La contamination peut provenir de deux sources Contamination crois e contamination de l chantillon avec du mat riel non amplifi provenant de l environnement ou d autres chantillons qui contiennent la s quence cible Contamination du produit final contamination de l chantillon avec des amplicons provenant de PCR ant rieures menant l amplification des amplicons cible et des amplicons contaminants Les laboratoires r alisant la PCR doivent tenir compte de ces sources de contamination et avoir en place des proc dures qui r duisent consid rablement le risque de contamination Les m thodes destin es contr ler la contamination sont bien document es 10 et comprennent la conception physique des laboratoires le d roulement des op rations les proc dures de manipulation des chantillons et des approches chimiques et enzymatiques De bonnes proc dures de laboratoire bien d finies sont essentielles pour contr ler la contamination par PCR et doivent
14. 15 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Le document Elucigene CF EU2v1 Guide du logiciel d analyse fournit des recommandations d taill es suppl mentaires sur les param tres du logiciel l analyse et l interpr tation Les proc dures du Guide du logiciel d analyse sont disponibles pour les logiciels GeneMapper et GeneMarker sur le site Internet Elucigene Diagnostics www elucigene com products Les r sultats du m lange mutant d terminent si une personne porte une mutation indiqu e par la pr sence d un pic bleu Le m lange mutant contient galement des amorces de l all le normal F508 ce m lange peut donc d terminer si une personne est normale pour F508 pic vert uniquement homozygote pour l all le mutant F508del pic bleu uniquement ou h t rozygote pour F508del pics bleu et vert Si une autre mutation est observ e les r sultats du m lange B type sauvage peuvent tre analys s pour d terminer le statut homozygote ou h t rozygote La pr sence d un pic vert pour lall le donn du m lange de type sauvage indique que la personne est h t rozygote et l absence du pic vert indique que la personne est homozygote pour cette mutation particuli re Les marqueurs STR hypervariables rouges sont pr sents dans les deux m langes Ceci permet la comparaison entre l chantillon amplifi avec le m lange mutant et l chantillon amplifi avec le m lange de type sauvage et r duit la possibilit de
15. Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Elucigene Diagnostics Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Code cat CF2EUB2 50tests CF2EUBX 10 tests Dispositif de diagnostic in vitro th iu par Elucigene Diagnostics Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Pour joindre le service des ventes le service la client le et le service technique T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiries elucigene com E techsupport elucigene com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics UK Limited a company registered in England and Wales registration number 8696299 CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 1 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Elucigene CF EU2v1 Usage pr vu D tection qualitative simultan e in vitro des mutations suivantes du g ne du r gulateur de la perm abilit transmembranaire de la fibrose kystique Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator CFTR dans de l ADN extrait partir d chantillons de sang total pr serv par EDTA et de spots de sang s ch Traditionnel Selon les recommandations du HGVS CDNA name Protein name CFTRdelez 3 GIL60X 3 Pro67Le ee oane J4delTT 3 Leu88llefsx22 aaadelA c3t3del c 313de ole105Serisxa R117 Arai 17 R117H 350G gt A D Ara117Hi A8 GG O Y122X gt Tvr122X 521 1G gt T 711 1G gt T 206W 3 Leu206Trr 1078delT 48delT o Phe316Leu
16. analyse en r duisant soit la dur e soit la tension d injection A l inverse une quantit plus lev e d amplicon peut tre ajout e la colonne pour analyse en augmentant soit la dur e soit la tension d injection Les chantillons amplifi s auparavant peuvent tre r inject s de nombreuses fois pour une nouvelle analyse voir le Guide de d pannage Elucigene CF EU2v1 pour des informations suppl mentaires CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 12 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Instruments ABI 3130 Un module de s rie CF EU2 et un protocole doivent tre cr s et pourront ensuite tre r utilis s pour chaque s rie CF EU2 Cr er le module de s rie CF EU2 dans le Module Manager gestionnaire de module du logiciel de collecte de donn es du 3130 S assurer que les options suivantes sont s lectionn es Type Regular Normal e Template Matrice FragmentAnalysis36 POP7 e Saisir les param tres d taill s dans le tableau ci dessous Module de capillaires de 36 cm Nom du param tre Valeur Fourchette 1 Oven Temperature Temp rature de l tuve 60 Entre 18 et 65 entier 2 Poly_Fill_ Vol Volume de remplissage poly 6500 Entre 6 500 et 38 000 tapes 3 Current Stability Stabilit du courant 5 0 Entre 0 et 2 000 uAmps entier 4 PreRun_ Voltage Tension avant s rie 15 0 Entre 0 et 15 kVolts 5 Pre Run Time Dur e avant s rie 180 Entre 1 et 1 000 s 6 Injection Voltage Tension d injection 3
17. ant la position de 1078delT 4 L amorce du mutant R347P dans le m lange A r agira de mani re crois e avec la s quence ADN du mutant R347H et r sultera en un pic mutant la position de R347P d une hauteur r duite par rapport au pic R347P r el 5 La pr sence du polymorphisme F508C 1655T gt G r sultera en un pic I507del de hauteur r duite dans le m lange B CF EU2v1 6 La pr sence de R11 7H r sultera en un picR117C de hauteur r duite dans le m lange B CF EU2v1 Dans un chantillon homozygote pour R117H le pic R117C sera absent 7 La pr sence de G85E r sultera en un pic 394deiTT de hauteur r duite dans le m lange B CF EU2v1 Dans un chantillon homozygote pour G85E le pic 394delTT sera absent 8 Un tr s petit pic art fact la position de 1507del peut parfois tre observ dans les r sultats d un h t rozygote F508del et en particulier dans un chantillon homozygote F508del 9 La possibilit de r activit crois e des mutations suivantes n a pas t v rifi e en raison de l absence de disponibilit d chantillons pertinents Celles ci pourraient interf rer avec le fonctionnement du test R117P R117L 1717 2A gt G 621 2T gt C 621 21 gt G R553G R553Q R347L I506T 15068 1506V et l association rare de I507del avec le polymorphisme 1651A G Caract ristiques des performances Cent dix chantillons d ADN extraits partir de sang total liquide EDTA ont t test s en aveugle
18. confusion d chantillon Un profil STR diff rent dans chacun des deux m langes est le signe d une confusion d chantillon L absence de ces marqueurs STR indique un chantillon invalide La pr sence des marqueurs STR tr s faible rfu indique un chantillon faible devant tre analys avec pr caution Remarque Voir le guide de d pannage pour des informations suppl mentaires CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 16 de 26 Marqueurs d tect s Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Le tableau ci dessous r sume les marqueurs d tect s par le m lange CF EU2v1 Les marqueurs sont num r s selon la plage de taille du produit PCR observ Marqueur CF2EUBYFR 002 Marqueurs d tect s Marqueur R347H R347P 2789 5G gt A 3120 1G gt A 711 1G gt T R334W 507del F508del 3849 10KbC gt T 167 delTA 1078delT V520F L206W W1282X R560T 2347delG Q890X R553X G551D S549R T gt G S549N M1101K G542X 3905insT Y1092X C gt A S1251N 444delA 1811 1 6kbA gt G 1717 1G gt A R117H R117C N1303K Y122X 394delTT G85E R1066C 1898 1G gt A W846X 2184delA D1152H CFTRdel2 3 P67L 2143delT E60X 3659delC 3272 26A gt G 621 1G gt T Sep 2014 Plage de taille du produit pb donn es 3130 POP7 110 5 116 5 117 123 124 130 132 5 138 5 141 5 147 5 147 5 154 156 162 5 163 169 172 178 180 188 5 193 199 206 211 5 215 220 224 5 230 5 234 5 240 5 242 246 250 252 255 5 261 5 265 267 267 5 269 5 2 5 280
19. es diff rents ou de composants provenant de lots diff rents du kit CF EU2v1 CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 10 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Activation R p tition des Extension finale enzymatique cycles Temp rature ambiante Tableau 1 Formulation du m lange r actif tester LMI a foes ul 45 45 112 5 225 RE La Lan Taslan PCR ul 7 5 75 1875 375 Total ul 12 120 300 600 4 Distribuer 10 ul de chaque m lange r actif au fond de flacons PCR de 0 2 ml ou de plaques correctement tiquet s 5 l aide d embouts de pipette distincts ajouter 2 5 ul d chantillon d ADN tester chaque flacon et fermer les bouchons Ne pas ajouter d ADN au flacon de contr le n gatif remplacer par 2 5 ul d eau d sionis e st rile 6 Centrifuger bri vement les flacons PCR pour recueillir le contenu au fond des flacons 7 Placer fermement les flacons dans le bloc du thermocycleur Lancer le cycle tape unique 94 suivi par le programme de cycles d amplification 8 la fin du programme de cycles d amplification les chantillons peuvent tre conserv s temp rature ambiante jusqu au lendemain ou 2 8 pendant une dur e maximum de 7 jours l obscurit avant leur analyse par lectrophor se capillaire CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 11 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi lectrophor se capillaire Il est recommand chaque utilisateur de
20. es pour W1282X 2 taient h t rozygotes pour D1152H et 2 taient h t rozygotes pour G542X Quatre h t rozygotes composites 3120 1G gt A F508del R11 7H F508del R1162X F508del et R553X F508del ont galement t d termin s De plus chacun des chantillons h t rozygotes suivants a t observ une seule fois E60X G85E 394delTT Y122X 621 1G gt T 10 78delT R334W R347P A455 1507del 1717 1G gt A R553X 1811 1 6kbA gt G 1898 1G gt A 2184delA W846X 3272 26A gt G Y1092X 3659delC 3849 10kKbC gt T S1251N et N1303K Quarante six chantillons d ADN repr sentant les 50 mutations d tect es par le kit CF EU2v1 ont t amplifi s cinq occasions distinctes Tous les chantillons ont donn les r sultats attendus avec aucun r sultat faux n gatif ou faux positif ce qui d montre une sp cificit et une sensibilit cliniques de 100 D pannage Ce mode d emploi est fourni pour assurer des performances optimales du test Les utilisateurs ne doivent pas s carter des proc dures fournies Tout cart risque d entra ner des performances sous optimales et de produire des donn es de qualit m diocre Un guide de d pannage est disponible la demande aupr s de Elucigene Diagnostics et fournit des exemples et des solutions certaines des observations les plus fr quentes concernant Elucigene CF EU2v1 elles comprennent notamment Pas de pics de diagnostic ou STR Pics de diagnostic ou STR faibles Exc s
21. es sur la configuration le fonctionnement et le d pannage de l instrument consulter le Manuel d utilisation de l analyseur g n tique Applied Biosystems 3130 CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 13 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Instruments ABI 3500 Un Instrument Protocol protocole d instrument CF EU2 doit tre cr et pourra ensuite tre r utilis pour chaque s rie CF EU2v1 Cr er le Instrument Protocol protocole d instrument CF EU2 l aide de la biblioth que de protocoles du 3500 S assurer que les options suivantes sont s lectionn es e Run Module Module de s rie FragmentAnalysis50 POP7 e Saisir les param tres indiqu s sur l image ci dessous E f r butiument Protocol CEU Setup en instrument Protocol K hpphcaton Type Fragment capter Length 56 cm Padma POP gt ys St Li Instraunent Protocol f operties bu Module Fesgment natsn58 POPI Protocol Hare CFEUZ Diese nprtan Over Te npestne l FL Blum i itage Ayant 155 Piefiim Voltige A Volh i5 h c toc Y itaje A Volts Run Tene hec 1700 Prefun Time e Lao Dripection Taie he U Data Deliv r Advanced pinna Augmenter la dur e d injection 36 secondes pour l analyse de l ADN extrait partir de sang s ch sur papier filtre Pour traiter les chantillons cr er une plaque d chantillons en cliquant sur Create Plate from Template cr er plaque partir de la matrice sur le Dashboard
22. fsX12 4 R334W D Ara334Trn R347P D Ara347Prc R347H D Ara347His A455E D Alad I507del 18507 del F508del Phe508del 1677delTA 1546del c 1545 1546delTA D Tvr515X VS20F L0 1558G gt T ovaiszophe 1717 1G gt G542X c 1624G gt T D GIv542X ar549Ar er549Asn C z 0 gt A 49N X J Q OQ D D D 1811 1 6kbA gt 1898 1G gt A c 1766 1G gt A 2143delT 2012del c 2012delT o Leu671X 2184delA 2del c 2052delA o Lvs684AsnfsX38 Q 2347del 3 Val739TvrfsX16 W846X LG 2588GA oo O 2189 5G gt A 2890X 120 1G gt A 2988 1G gt A CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Ara558X R560T c 1679G gt C o Ara560Thr o Tro846X 8del c 9 154 1558G gt T 1585 1G gt 16 20 2538G gt A 2657 gt GIn890X U Q Q D N Q D N O Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Traditionnel Selon les recommandations du HGVS 2 coNaname e Y1092X C gt A D Tur1092X M1101K 3 Met1101L D11524 Asn1152H R1158X D Ara1 158X R1162X Ara1 162X 2659deC 0 3528del te 3528de Lvs1177SetsX1 849 10kbC gt T 3 718 2477C gt T 1251N o Ser1251Asn 905insT 3 73dup c 3773dupT o Leu1258PhefsX7 W1282X 3846G gt A o Iroi282X N1303K gt Asn1308L with reference to Mutation Nomenclature in Practice Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme Berwouts S Morris M Girodon G Schwarz M Stuhrmann M and Dequeker E Human Mutation Vol 00 No 0 1 7 2011 CF EU2vi peut dist
23. g ne CFTR si des mutations pathog nes sont connues dans la famille Depuis la d couverte du g ne CFTR en 1989 5 plus de 1 700 mutations et variants du g ne ont t d crits 6 Beaucoup de ces mutations sont priv es et ont t d crites chez un seul patient et ou dans une seule famille L analyse de routine de toutes les mutations possibles n est ni r alisable ni rentable et elle est donc restreinte aux mutations les plus fr quentes CF EU2v1 est un kit d analyse de la mucoviscidose con u sp cialement pour tudier les mutations les plus fr quentes retrouv es dans les populations d origine europ enne Le test identifie un total de 50 mutations et analyse galement le tractus de poly T dans l intron 9 par une mesure pr cise des r p titions TG adjacentes Le tractus polymorphe de thymidine la jonction de l intron 9 et de lexon 10 influence la transcription Le nombre de r sidus thymidine 5T 7T ou 9T influence l efficacit de l pissage de lexon 10 En pr sence de l all le 5T une partie de transcrits de l exon 10 sera absente r sultant en une prot ine non fonctionnelle et des sympt mes variables de MV Il est rapport que le nombre de r p titions TG l extr mit 5 du tractus polythymidine peut galement influencer l pissage de lexon 10 7 Si celles ci sont pr sentes sur le m me all le que le variant 5T plus le nombre de r p titions TG est lev plus la proportion de transcrit
24. gote pour la mutation V520F et le polymorphisme 1584G gt A sur le m me all le un r sultat de ce type n a pas t observ jusqu ce jour et il est probable qu il s agit d une association rare CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 22 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi R activit crois e Tous les efforts possibles ont t faits au cours du d veloppement pour viter que la pr sence d autres polymorphismes et mutations rapport s dans le g ne CFTR interf re sur la fonction du test La r activit crois e a t tudi e sur la mutation rare R1283M qui n a pas t d tect e par le kit Elucigene CF EU2vi En outre les polymorphismes suivants n ont pas t d tect s par le test 1655T G F508C 1651A G L valuation des mutations et polymorphismes connus sur le g ne CFTR a soulign les effets suivants sur les r sultats du kit Elucigene CF EU2v1 1 L amorce du mutant G551D dans le m lange d tecte galement la mutation S549RT gt G Le logiciel d analyse tiquettera celle ci en tant que pic n 20 Il n y aura pas de pic correspondant de type sauvage dans le m lange B 2 L amorce du mutant 2184delA dans le m lange A r agira de mani re crois e avec la s quence ADN du mutant 2183AA gt G et r sultera en un pic mutant la position de 2184delA 3 L amorce du mutant 1078delT dans le m lange A r agira de mani re crois e avec la s quence ADN du mutant F316L et r sultera en un pic mut
25. inguer les personnes h t rozygotes des homozygotes pour l ensemble des mutations et des variants ci dessus l exception de S549R T gt G voir la section R activit crois e de ce document R sum et explication La mucoviscidose MV est la maladie autosomique r cessive limitant la dur e de vie la plus fr quente dans la population caucasienne L incidence de la maladie est de 1 3 200 naissances vivantes chez les Caucasiens 1 Dans la population caucasienne la fr quence h t rozygote est d environ 1 25 La mucoviscidose affecte l pith lium de plusieurs organes et r sulte en une pathologie multisyst me complexe impliquant le pancr as exocrine l intestin les voies respiratoires les voies g nitales masculines le syst me h patobiliaire et les glandes sudoripares exocrines L expression de la maladie varie selon la s v rit des mutations du g ne CFTR 2 les modificateurs g n tiques 3 et les facteurs environnementaux 4 Elle s tend du d c s dans la petite enfance en cons quence d une pneumopathie obstructive volutive avec bronchectasie une insuffisance pancr atique avec une pneumopa hie obstructive graduellement volutive au cours de l adolescence et une augmentation de la fr quence d hospitalisation en raison d une pneumopathie chez l adulte jeune la sinusite et la bronchite r currente ou l infertilit masculine au d but de l ge adulte Le diagnostic de la mucoviscidose est le plus souvent
26. l IR il CUIR J LOUE Mi er 21 1 3 rTPA pu y r r B Ki 4 2 Le ti i De PR dl de he oder le Ge Le om at 2347delG Deux pics s par s de 1 pb aux positions 39 2184delA WT et 43 2143delT WT seront observ s dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation 234 delG Le pic 16 sera absent et les pics 39 et 43 auront la hauteur attendue mais leur taille sera r duite de 1 pb par rapport la taille attendue dans les r sultats d une personne homozygote pour la mutation 2347delG INIH AT peab J E L HA RUDI AAAA aa aaam _ e o p F pt o li y ss ER w p a L 20 ad Le eji A i gt Cad 3905insT Deux pics s par s de 1 pb en position 26 S1251N WT seront observ s dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation 3905insT Le pic 24 sera absent et le pic 26 aura la hauteur attendue mais sa taille sera augment e de 1 pb par rapport la taille attendue dans les r sultats d une personne homozygote pour la mutation 3905insT CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 21 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi R1158X Une hauteur de pic r duite en position 49 R1162X WT sera observ e dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation R1158X Le pic 49 sera absent des r sultats d une personne homozygote pour la mutation R1158X li n
27. le m lange B et sont visualis es sous forme de pics d amplicon verts Le m lange d tecte galement la s quence normale pour la mutation la plus fr quemment observ e l origine de la mucoviscidose chez les populations caucasiennes appel e F508del et visualis e sous forme de pic d amplicon vert De plus les s quences r p t es de polyT sont d tect es dans le m lange A et visualis es sous forme de pics d amplicon noirs Les marqueurs du contr le d amplification interne non mucoviscidose sont inclus dans les m langes A et B pour surveiller l efficacit de l amplification des chantillons et sont visualis s sous forme de pics d amplicon rouges CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 4 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Avertissements et precautions Le contr le ADN fourni avec ce kit est d origine humaine Il a t test de mani re ind pendante par une m thode bas e sur la PCR et trouv n gatif pour le virus de l h patite B VHB le virus de l h patite C VHC et le virus de l immunod ficience humaine 1 VIH Il est important de manipuler le mat riel d origine humaine avec pr caution Tous les chantillons doivent tre consid r s comme repr sentant un risque possible d infection Aucune m thode d analyse ne peut garantir totalement l absence du VHB du VHC du VIH ou autres agents infectieux La manipulation des chantillons et des composants du test leur utilisation leur stockage et leu
28. lon h t rozygote 1507del Un chantillon 1507del F508del comportera un pic vert F508del de type sauvage d plac environ 164 pb 3 pb de moins que la normale un pic bleu F508del mutant 166 pb et un pic bleu 1507del mutant environ 159 pb CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 18 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Un chantillon 1507del I507del comportera un pic bleu environ 159 pb et un seul pic vert environ 164 pb 3 pb plus petit que le pic F508 normal observ en l absence de I507del F508del La pr sence d une mutation F508del emp che le fonctionnement de l amorce 1507del de type sauvage Une personne homozygote pour F508del ne pr sentera donc pas de pic I50 7del de type sauvage dans le m lange de type sauvage voir ci dessous si hall ms em oh um 20 PR en mn sy 4 d s mam p na u PET aaa a aM re RS ns ee N tp PCT i 7 r ei talr n f 1 Une hauteur r duite du pic 1507del de type sauvage et 2 pics s par s de 3 pb en positions 10 et 12 dans le m lange de type sauvage voir ci dessous sera observ e dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour F508del din Lil nn a LL a qe ge eeM egr r tpt pe eo 0 mm Ut ee o ome 7 o i Insertions et d l tions cause de la nature de la conception du kit CF EU2v1 la pr sence d insertions ou de d l tions entre deu
29. n null nel f ml s Kj R N S T OO Gt 1 ADO Go mg S h mt R 4 i A 4 ti E pP z ii j T p p a Tan i 4 gt se i e Polymorphisme rs4148721 delAT dans l intron 22 Deux pics s par s de 2 pb aux positions 45 3659delC WT 49 R1162X WT et 50 R1158X WT seront observ s dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour le polymorphisme rs4148721 d l tion de AT dans l intron 22 Les pics 45 49 et 50 auront la hauteur attendue mais leur taille sera r duite de 2 pb par rapport la taille attendue dans les r sultats d une personne homozygote pour le polymorphisme rs4148721 Autres observations V520F Polymorphisme 1584G gt A dans l exon 12 Le polymorphisme 1584G gt A a t identifi comme interf rant avec l amplification de la s quence V520F de type mutant et sauvage Une hauteur de pic r duite en position 12 V520F sera observ e dans le m lange B d une personne h t rozygote pour le polymorphisme 1584G gt A Le pic 12 sera absent du m lange B d une personne homozygote pour le polymorphisme 1584G gt A Une personne qui est h t rozygote pour la mutation F508del et galement h t rozygote pour la mutation 1584G gt A pr sentera un seul pic 12 dans le m lange B plut t que les deux pics attendus en position 12 observ s normalement dans un h t rozygote F508del voir exemple ci dessous Le pic 12 sera absent du m lange A d une personne h t rozy
30. nt requis quipement de laboratoire Pipettes de pr cision 2 ensembles 1 pour la manipulation pr alable lamplification et 1 pour la manipulation post rieure l amplification v tements de protection vortexeur micro centrifugeuse centrifugeuse plaque de microtitration de 96 puits Amplification PCR Thermocycleur adapt pour des plaques de microtitration de 96 puits ou des flacons de 0 2 ml avec une exactitude de temp rature minimum de 1 C dans la plage 33 100 C et une uniformit statique de temp rature de 1 C Remarque L quipement du thermocycleur doit tre r guli rement entretenu conform ment aux instructions du fabricant et talonn de mani re assurer un cyclage par PCR pr cis et des performances optimales Le test Elucigene CF EU2v1 a t labor sur des thermocycleurs Applied Biosystems 9700 D autres marques et mod les doivent tre enti rement test s et valu s pour assurer des performances optimales par l utilisateur avant de signaler des r sultats avec le CF EU2v1 lectrophor se capillaire Analyseur g n tique ABI 3130 3500 avec le logiciel d analyse fragmentaire GeneMapper rang e de capillaires de 36 cm ou 50 cm ABI3500 plaques optiques de 96 puits septas pour 96 puits cassettes de 96 puits Remarque L quipement d lectrophor se capillaire doit tre r guli rement entretenu conform ment aux instructions du fabricant et talonn de mani re
31. ociation avec d autres donn es de laboratoire et cliniques la disposition du clinicien Ces r actifs Elucigene sont fournis pour des tests de diagnostic in vitro Des d tails suppl mentaires concernant l interpr tation des donn es sont disponibles dans les proc dures du Guide du logiciel d analyse Elucigene CF EU2vi www elucigene com products CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 25 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Bibliographie 1 Rosenstein BJ Cutting GR The diagnosis of cystic fibrosis a consensus statement Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel J Pediatr 1998 132 589 95 2 De Braekeleer M Allard C Leblanc JP Simard F Aubin G Genotype phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation Hum Genet 1997 101 208 11 3 Drumm ML Konstan MW Schluchter MD Handler Pace R Zou F Zariwala M Fargo D Xu A Dunn JM Darrah RJ Dorfman R Sandford AJ Corey M Zielenski J Durie P Goddard K Yankaskas JR Wright FA Knowles MR Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis N Engl J Med 2005 353 1443 53 4 Goss CH Newsom SA Schildcrout JS Sheppard L Kaufman JD Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis Am J Respir Crit Care Med 2004 169 816 21 5 Kerem B Rommens JM Buchanan JA Markiewicz D Cox TK Chakravarti A Buchwald M and Tsui LC Identification of the Cystic Fibrosis Gene Genetic
32. ont observ s dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation 394delTT Le pic 34 sera absent et la hauteur des pics 35 42 et 44 sera celle attendue mais leur taille sera r duite de 2 pb par rapport la taille attendue dans les r sultats d une personne homozygote pour la mutation 394delTT 24e iTT WT pe NE l l j i bayas ANLI S LL d ENS SES CAVER not TANA de LL 25 Satan Dz j 1 ii ot M TE 1 Il e A N p a a In Mi OU w Lun MON F508del CFTRdele2 3 Des hauteurs de pic r duites aux positions 34 394delTT 35 G85E WT 41 CF TRdele2 3 WT 42 P67L WT et 44 E60X WT seront observ es dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation CFTRdele2 5 Les pics 34 35 41 42 et 44 seront absents des r sultats d une personne homozygote pour la mutation CFTRdele2 3 44e iTT OT pe xt CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 20 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi 444delA Deux pics s par s de 1 pb aux positions 30 R117H WT 31 R117C WT 33 Y122X WT et 47 621 1 WT seront observ s dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation 444delA Le pic 27 sera absent et les pics 30 31 33 et 47 auront la hauteur attendue mais leur taille sera r duite de 1 pb par rapport la taille attendue dans les r sultats d une personne homozygote pour la mutation 444delA Atena VIT pea a RNNBIE A
33. ppartenant Life Technologies Corp pour l utilisation de cette quantit de produit destin e uniquement aux activit s de d tection des cibles de l acheteur dans le cadre d un diagnostic humain Aucun autre droit n est octroy De plus amples informations sur les licences d achat concernant les fluorochromes mentionn s plus haut peuvent tre obtenues en contactant le Directeur des licences outlicensing lifetech com Copyright 2014 Delta Diagnostics UK Ltd CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 26 de 26
34. r limination doivent respecter les proc dures d finies par les recommandations ou les r glementations nationales appropri es de s curit biologique Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire actuelles les laboratoires doivent traiter leurs propres chantillons internes de CQ de g notype connu avec chaque analyse de mani re valuer la validit de la proc dure Si le carton du kit est endommag le contenu risque de l tre aussi ne pas utiliser le kit et contacter le service la client le CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 5 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Symboles utilis s sur les tiquettes Les symboles utilis s sur l ensemble des tiquettes et conditionnements respectent la norme harmonis e 1S015223 Fabricant Nombre de tests lt E Voir le mode d emploi y Conserver en dessous de la temp rature indiqu e x Utiliser avant la date indiqu e REF Code du catalogue LOT Num ro de lot ou de s rie Dispositif m dical de diagnostic in vitro CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 6 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi Mat riel fourni Conserver tous les composants l obscurit une temp rature n exc dant pas 20 C Les fluorochromes utilis s dans ce produit sont photosensibles r duire au minimum leur exposition la lumi re Eliminer 3 mois apr s l ouverture Les r actifs doivent tre stock s dans une zone exempte d ADN contaminant ou de produit de PCR Tous
35. s CFTR manquants d exon 10 sera lev e Le nombre de r p titions TG peut tre d termin l aide du kit CF EU2vi en mesurant les pics de l amplicon 5T Principes de la proc dure La m thode utilis e par le kit Elucigene CF EU2vi utilise la technologie fluorescente d amplification sp cifique d all le ARMS syst me de mutation r fractaire l amplification Amplification Refractory Mutation System qui d tecte les mutations ponctuelles les insertions ou les d l tions sur l acide d soxyribonucl ique ADN 8 Le principe de ARMS est que les oligonucl otides avec un r sidu discordant en 3 ne fonctionneront pas comme amorces de PCR Polymerase Chain Reaction dans des conditions particuli res La s lection d oligonucl otides appropri s permet d amplifier et de d tecter des s quences d ADN mutantes ou normales sp cifiques Les s quences amplifi es amplicons sont s par es par lectrophor se capillaire en utilisant un analyseur g n tique Applied Biosystems Le logiciel d analyse permet d identifier et d tiqueter les amplicons en fonction de leur taille et couleur de fluorochrome Elucigene CF EU2vi est un test fortement multiplex comportant deux r actions par PCR A et B Cinquante s quences mutantes au sein du g ne CFTR sont d tect es dans le m lange A et sont visualis es sous forme de pics d amplicon bleus Les s quences normales non mutantes correspondantes type sauvage sont d tect es dans
36. s incluses dans le m lange d amorce A Ce m lange contient galement des amorces pour l identification de 2 marqueurs STR hypervariables 404474 450044 2 flacons de 400ul 75ul de m lange principal PCR contenant de la HotStart Taq DNA Polymerase et des d soxynucl otides triphosphates dans du tampon 404480 450045 1 flacon de 50 ul de contr le ADN 6 ng l normal pour les mutations d tect es par Elucigene CF EU2v1 404489 Mat riel requis mais non fourni Consommables de laboratoire gants tubes de micro centrifugation avec bouchon vis flacons de PCR de 0 2 ml ou plaques de microtitration recommand s par le fabricant du thermocycleur utilis embouts de pipette Pr paration de l ADN QIAamp DNA Mini Kit Qiagen GmbH r f rence 51304 51306 ou quivalent lectrophor se capillaire marqueur de taille GeneScan 600 LIZ size standard ABI N de cat 4366589 GeneScan 600v2 LIZ size standard ABI N de cat 4408399 syst me multicapillaire DS 33 ensemble de fluorochromes G5 matrice standard ABI N de cat 4345833 polym re POP 7 ABI N de cat 4352759 tampon d analyseur g n tique concentr 10x ABI N de cat 402824 et formamide Hi Di ABI N de cat 4311320 Remarque S assurer que tout le mat riel utilis se trouve dans les limites des dates de stabilit indiqu es par le fabricant CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 7 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi quipeme
37. t recommencer l amplification e R duire la dur e d injection voir la section lectrophor se capillaire e Augmenter le seuil d amplitude du pic minimum voir le document Guide du logiciel d analyse Elucigene CF EU2vi L aout de faibles quantit s d ADN augmentera la probabilit que les pics de diagnostic soient faibles et ne soient pas tiquet s par le logiciel d analyse Les tapes suivantes peuvent tre r alis es pour augmenter le signal e Augmenter la dur e d injection 36 secondes fortement recommand pour les extractions partir de sang s ch sur papier filtre voir la section Electrophor se capillaire e Extraire de nouveau un chantillon partir de sang s ch sur papier filtre et luer dans un volume r duit d eau 50 ul e Augmenter le nombre de spots de sang s ch pour extraction 4 disques de 3 mm Consid rations importantes Qualit de l ADN CF EU2vi est un test fortement multiplex et n cessite une amplification PCR efficace pour fonctionner de mani re optimale La qualit de l ADN peut d terminer l efficacit du processus PCR Les inhibiteurs extraits ensemble avec l chantillon d ADN peuvent entra ner une amplification sous optimale menant des pics faibles et mal quilibr s Elucigene Diagnostics a valid l utilisation du QlAamp 96 DNA Blood Kit et du QlAamp DNA Mini Kit QIAGEN GmbH avec le kit CF EU2v1 D autres kits ou m thodes d extraction de l ADN doivent tre
38. tableau de bord s assurer que le protocole ad quat pour CF EU2v1 a t affect voir ci dessus Pr paration de la fiche d chantillon pour GeneMarker Le logiciel GeneMarker permet la comparaison directe entre les donn es A et B d une m me personne Pour faciliter ceci il est important que la d nomination du fichier de sortie de donn es brutes fsa soit coh rente entre tous les chantillons et les m langes La fiche d chantillon doit contenir l identifiant unique de l chantillon pour chaque chantillon test avec le suffixe _ A ou _B selon le m lange test Si l identifiant de plaque doit tre inclus dans le nom fsa un format identique doit tre utilis chaque fois par ex CFEU2 JJMMAAAA Sur le 3130 les param tres Results Destination destination des r sultats doivent tre d finis pour que le nom de l chantillon soit inclus dans le nom du fichier fsa par ex CFEU2 JJMMAAAA 1234 5 A AO CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 14 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi MApesults Gronpieditor Sample File Name Format Example 123456789 _Sample3_A12 lt ext Filename is greater than 13 characters Prefix 5 Name Delimiter EI z Plate ID E Sample Name Well Position E lt none gt Sufix File Extension None gt Run Folder Name Format Example P Diagnostics DevelopmentiDiag Dev 3100 ProjectsiCF HNCF UK3130 runsi lt instr
39. x amorces oppos es entra nera des changements de la taille de tout lamplicon produit entre ces deux amorces Par cons quent en plus des 50 mutations d tect es par le kit CF EU2v1 toutes les insertions et d l tions dans les s quences cibles amplifi es peuvent tre d tect es par le changement de la taille d amplicon attendue dans le m lange de type sauvage B Celles ci ont t pr sent es sous forme de tableau et sont disponibles dans un document distinct sur le site Internet de Elucigene Diagnostics www elucigene com products Des exemples d insertions et de d l tions d tect es par le kit et l impact qu elles ont sur le profil du m lange B sont montr s ci dessous F508del 1677delTA Deux pics s par s de 1 pb en position 12 V520F WT seront observ s dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour les mutations F508del 1677delTA 1677 delta WT peab ii atini NE CF2EUBYFR 002 Sep 2014 Page 19 de 26 Elucigene CF EU2v1 Mode d emploi V520F Un pic de type sauvage de hauteur r duite en position 10 167 delTA WT sera observ dans les r sultats du m lange B d une personne h t rozygote pour la mutation V520F car celle ci emp che l amorce 1677delTA de type sauvage de fonctionner Les pics 10 et 12 seront absents des r sultats d une personne homozygote pour la mutation V520F 394delTT Deux pics s par s de 2 pb aux positions 35 G85E WT 42 P67L WT et 44 E60X WT ser
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