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Mise au point d`une technique de diagnostic sérologique par

1. ere usines necks 74 2 M thodes dites indirectes s rologie ss 74 a Immunofluorescence indirecte nn 74 b Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay ELISA 75 C Western Blot ec tee Men Ptol e eet ra 77 d R action 4 1 trt ise open epa UAE P UH EXER VE oS E XE eee 79 VT MOYENS DE LUTTE ive ess oben ive cete to iei tee eset Tio tes degere to doge 80 Outils th rapeutiques o ne tmt tte DR bats 80 T Re ea eel SU de 80 2 Les sulfamides m mes mol cules mais une posologie qui volue 80 RSR ood e So canteen SM DIT ade a AE uto 81 B Mesures de pr vention 81 I Prophylaxie medieale iei ei rete 8l 2 Prophylaxie Sanitaire one ee EI II De IE e EAR D died Ie eure 0 82 TES principes de DAS C coto c etit 82 b Le contr le dans les cheptels infect s ss 83 c Le contr le et la protection en cheptels indemnes essen 83 CHAPITRE 2 MISE AU POINT D UNE TECHNIQUE DE DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE PAR IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE DE LA BESNOITIOSE BOVINE A BESNOITIA BESNOITI ses 85 I OBJECTIFS DE L ETUDE 87 MATERIELS ET METHODES get Ri aere ule nage site tra 88 Banque de S rums bovis aio
2. esses 29 Tableau 2 Classification des sympt mes au stade f brile de la maladie en fonction de WPA abe Ree cn te ne dE 56 Tableau 3 Ensemble des l sions macroscopiques observables lors des diff rentes phases de gcn c nn te ann ne hands En e ee 64 Tableau 4 Ensemble des l sions microscopiques observables lors de la phase de selerodermie de la DespnolflOSe us deae deest to eee n Re E oaa a 68 Tableau 5 Comparaison des r sultats de l ELISA et du WB pour les 342 s rums pr sentant un r sultat ELISA groupes standards et douteux sse 98 Tableau 6 Sensibilit sp cificit et accord de l ELISA par rapport au WB Gold standard en consid rant les 342 s rums pr sentant un r sultat ELISA groupes standards et doute x 5 nne ee isien ns stehe 99 Tableau 7 R sultats de l IFI la dilution 1 200 des diff rents groupes de s rums tudi s 99 Tableau 8 R sultats du WB et de l IFI pour la totalit des 100 Tableau 9 Sensibilit sp cificit et accord de l IFI par rapport au WB en consid rant la totalit des s rUMS test s Les Ricette oe beet pet ne sn et ne ced cde oce ue 100 Tableau 10 Comparaison des performances de l IFI 1 200 et de ELISA DO 20 103 20 LISTE DES PHOTOS Photo 1 a Tachyzoites dans une cellule Vero infect e b Tachyz
3. 62 Photo 28 Phase de scl rodermie kystes sur le limbe scl ro corn en et la conjontive pal pre lara i e pP ES 63 Photo 29 Phase f brile aspect congestivo h morragique de la carcasse 65 Photo 30 Phase de scl rodermie nombreux kystes a bradyzoites dans le tissu conjonctif SOUS SUL ANIC eC P C EI rrr 66 Photo 31 Phase de scl rodermie kystes bradyzoites dans la muqueuse trach ale d une vache infect e chroniquement issues 66 Photo 32 Phase de scl rodermie kystes bradyzo tes de la taille d une t te d pingle sur la SCTE TONG Sci cess odi ius CE 2 24 E T FE E ae LS ui ac ME 67 Photo 33 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif la dilution 1 200 au prOSSISSement X LOO ote is laser a c en ue IUD Faral QR 90 Photo 34 Pr paration des dilutions au 1 100 1 200 1 400 1 800 des diff rents s rums tester ainsi que des t moins positifs et n gatifs 90 Photo 35 D p t des pr parations dans les puits pour les s rums n 91 et n 105 91 Photo 36 Incubation en chambre humide 45 min 37 C 91 Photo 37 des lames dans de l eau distill e see 91 Photo 38 Pr paration de Bleu Evans 0 05 ss 92 22 Photo 39 D p t des pr parations Conjugu Bleu Evans dans les puits 92 Photo 40 D p t
4. de pr pa A Frankie pour tous les bons moments qu on a pu tirer des ann es pr pa A Kama et Emilie pour m avoir fait passer une ann e de cube des plus m morables entre les soir es films dans le 5m de Kama les fous rires en cours avec cette vieille Zobinette et les r seaux wow organis s la one again and bis to fly en attendant les r sultats A Vincent et Robert pour toutes ces soir es pass es perch s dans les arbres ou d ambuler dans la clairi re des agros A Anais Julie et Sophie de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse A Philippe pour cette vie de buiatres qui nous attend pour toutes ces pr chauffes b timent A ces t tes phalliques et autres expressions directement descendues de Corr ze par ce bon vieux Thomas A Tibor pour notre amiti qui a su voluer depuis l cole maternelle pour les bou hons les tsao balanc s tout va tes chopes de booms tes faut trois conditions pour un r teau ta premi re cuite au voyage g ol A Laf pour cet inoubliable voyage au bout du monde o nous avons su chasser le kiwi sauvage o nous nous sommes baign s dans les sources d eau chaude o nous avons su nous remonter le moral gr ce de grandes pintes de Kilkenny de Guinness et de bi res homemade o nous avons vadrouill travers les plus beaux paysages de la Terre du Milieu gr ce notre voiture de compet A Tiffany pour ta g n
5. 90 4 95 IC 83 8 94 996 alors que la sp cificit augmente 85 3 95 IC 79 8 89 7 ce qui est due respectivement l augmentation des faux n gatifs n 12 et la diminution du nombre de faux positifs n 32 La VPP est de 77 9 95 IC 70 3 84 4 et la VPN est de 93 9 95 IC 89 6 96 8 Western Blot Densit Optique R sultats 121 171 10 0 50 121 110 2 0 111 20 113 32 12 185 Tableau 5 Comparaison des r sultats de ELISA et du WB pour les 342 s rums pr sentant un r sultat ELISA groupes standards et douteux Le degr d accord entre le test de r f rence WB et l ELISA est tr s mauvais lorsque la DO est fix e 10 avec 0 171 95 IC 0 122 0 221 devient moyen pour une DO de 15 avec 0 417 95 IC 0 344 0 490 Enfin il est bon pour une DO de 20 avec 0 732 95 IC 0 658 0 805 Le meilleur accord est atteint pour un seuil fix une DO de 20 tableau 6 98 Densit Se Sp VPP VPN K Optique 95 IC 95 IC 95 IC 95 IC 95 IC Total 22 6 41 4 0 171 n 342 10 100 17 3 28 7 35 7 47 3 100 0 122 0 221 50 2 52 4 0 417 5 H9 43 4 57 0 45 7 59 0 100 0 344 0 490 20 90 4 85 3 77 9 93 9 0 732 83 8 94 9 79 8 89 7 70 3 84 4 89 6 96 8 0 658 0 805 Tableau 6 Sensibilit sp cificit et accord d
6. 300 pl Pipette tips as recommended by pipette manufacturer Solution reservoirs Vortex Sample preparation Appropriate blood collection tubes for serum plasma collection Analysis of Results Plate Reader e g Multiscan EX or equivalent The reader has to have an appropriate filter set to read the plates at 450 nm Optional Plate washer e g Tecan HydroFlex 96 Plate Washer or equivalent Test Procedure Precautions National guidelines for working with animal samples must be strictly followed The PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 must be performed in laboratories suited for this purpose should be considered as potentially infectious and all items which contact the samples as potentially contaminated Chemical hazard data are available in section Safety Regulations and R amp S Statements Appendix IV PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 Equipement optionnel Laveur de plaques Tecan HydroFlex 96 Plate Washer ou quivalent Mode op ratoire Pr cautions Les recommandations nationales pour la manipulation d chantillons animaux doivent tre suivies de fa on stricte Le test PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 ne doit fet Les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux Tout mat riel en contact avec ces chantillons doit tre consid r comme ment contamin Les informations sur les risques chimiques sont donn es dans le pa
7. A Monsieur le Professeur Michel FRANC Professeur de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Parasitologie et Maladies parasitaires Qui nous a fait l honneur de prendre part notre jury et son soutien cette tude Sinc res remerciements A Monsieur le Docteur Jean Pierre ALZIEU Docteur v t rinaire au Laboratoire V t rinaire D partementale de l Ari ge Qui nous fait l honneur d accepter d assister cette th se Pour sa contribution ce travail Hommages respectueux Aux personnes ayant aid l aboutissement de cette th se Monsieur le Professeur Philippe JACQUIET Professeur de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Parasitologie et Maladies parasitaires Qui m a confi ce sujet Pour son coute ses conseils Qu il re oive mes sinc res remerciements Au Service de Parasitologie Et plus particuli rement Christelle GRISET et Fran oise PREVOT Pour leur aide pr cieuse durant ce travail de th se Je crois que vous vous trompez si vous pensez que le bonheur dans la vie r side principalement dans les relations humaines Le bonheur se trouve tout autour de nous il est partout il est dans tout ce que nous pouvons exp rimenter Et pour le savoir il faut changer le regard que nous portons sur les choses Chris McCandless A ma famille A mes parents pour votre soutien durant ces longues ann es studieuses malgr la distance qui nous s pare Vous m avez donn tous les moyens pou
8. 94 RESULTATS A Photographies au microscope ultra violets T moin positif Au grossissement x400 les tachyzoites observables sur une lame de t moin positif photos 41 44 pr sentent un liserai fluorescent ininterrompu sur toute leur p riph rie Cette fluorescence tend diminuer lorsque la dilution augmente 4 Photos Observation de tachyzo tes sur une lame t moin positif au microscope UV x400 41 dilution 1 100 42 dilution 1 200 43 dilution 1 400 44 dilution 1 800 artefact fl che F Lenfant 95 2 T moin n gatif Au grossissement x400 les tachyzoites observables sur une lame de t moin n gatif photos 45 48 ne pr sentent pas de fluorescence sur la totalit de leur p riph rie voire aucune ce qui laisse apparaitre la couleur rouge tre que prennent les parasites lorsqu ils sont observ s par microscopie optique ultraviolets Photos Observation de tachyzoites sur une lame t moin n gatif au microscope UV x400 45 dilution 1 100 46 dilution 1 200 47 dilution 1 400 48 dilution 1 800 F Lenfant 3 S rums probl matiques Au grossissement x400 les tachyzoites peuvent pr senter une diminution rapide de leur fluorescence d une dilution la suivante photos 49 et 50 ce qui peut parfois tre g nant pour d cider du statut s rologique de l chantillon examin Dans l exemple pris pour les photographies 49 et 50
9. corps ciliaires rares kystes corn e avasculaire choro de r tine absence de kystes piderme jamais de kystes Peau derme stratum papillosum kystes et zones fibreuse autour Tissusous cutan kystes nombreux kystes F d g n rescence cireuse Muscles fascias g tendons 1 couche cellules granulomateuse couche cellules en fuseau couche zone n crotique Syst me n uds lymphatiques hyperplasie lympho de kystes sous la capsule lymphatique 68 testicules calcifications focales ou multiples de taille et d opacit variables Giancamillo et coll l sions vasculaires tubes s minif res zones de n crose de coagulation r action interstitielle lymphocytaire Appareil g nital vagin muqueuse kystes endom tre kystes parois des veines kystes ut rus granulome parasitaire autour des kystes Appareil cardio parois des vaisseaux intima m dia adventice kystes souvent vasculaire protub rants dans la lumi re vaisseaux faisceaux musculaires du pourtour des narines kystes Appareil mufle stratum papillosum glandes sudoripares kystes adh rents respiratoire septum nasal et thmo de muqueuse kystes larynx trach e pith lium kystes Tableau 4 Ensemble des l sions microscopiques observables lors de la phase de scl rodermie de la besnoitiose 69 V DIAGNOSTIC A pid mio clinique La co
10. il nu Les kystes peuvent mesurer jusqu 1 5 mm mais sont g n ralement aux alentours de 250 400 um Frenkel et al 2003 Macroscopiquement on observe de petits points en reliefs punctiformes en t te d pingle Microscopiquement les kystes sont entour s de cellules inflammatoires mononucl es et de fibroblastes puis de mani re centrip te on retrouve figure 5 photo 3 une membrane externe ou capsule kystique zone hyaline form e de collag ne qui conf re sa forme au kyste A une membrane interm diaire qui correspond en fait la membrane de la cellule h te parasit e une membrane interne correspondant la vacuole parasitophore de la cellule h te 4 une multitude de bradyzoites coalescents 36 zone hyaline ou anhiste 1 capsule Ate p cy membrane interm diaire d A cellule h te LA ud T ahs 1 Te membrane interne A B L vacuole 9 WA PRE NN 74 couche externe A fibrocellulaire Figure 5 R pr sentation sch matique d un kyste bradyzoite Franc et al 1987 LP LE w 1 Photo 3 Coupe histologique de peau montrant de tr s nombreux kystes de Besnoitia besnoiti dans le derme a chelle 300 um b vue rapproch e sur un kyste chelle 40 um Alzieu et al 2009 37 4 Les bradyzoites D crits pour la premi re fois en 1912 par Besnoit et Robin les bradyzoites prennent
11. Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Prionics AG Wagistrasse 27a CH 8952 Schlieren Zurich Switzerland Tel 41 44 200 2000 Fax 41 44 200 2010 www prionics com info prionics com Cedi Diagnostics B V Box 2271 8203 AG Lelystad The Netherlands Tel 31 320 238320 Fax 31 320 214379 For our distribution network please refer to www prionics com 122 ANNEXE 4 Mode d emploi PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 ELISA for in vitro detection of antibodies against Besnoitia besnoiti in bovine serum and plasma samples 5 plate kit for 450 samples Prionics AG Version 1 0 e Introduction Bovine besnoitiosis is caused by infection with Bes noitia besnoiti an apicomplexan protozoan parasite The transmission of the disease and the life cycle of this parasite are to date not fully understood There might be a mechanical transfer of the disease by biting flies such as Tabanus and Stomoxys All cattle breeds independent of sex and age can be infected Affected cattle undergo different stages of disease with a range of symptoms including skin thickening swell ing hair loss and skin necrosis Infection in bulls can lead to infertility In severe cases the disease leads to the animal s death Cysts of Besnoitia besnoiti 200 600 um in diameter are found in the conjunctival sclera of the eyes subcutaneous tissue fascia and mucosa of the in
12. Mouche ts ts R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 7 Dipt res brachyc res cyclorrhaphes calypt res 2009 Photo 9 Aedes sp Moustique R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 3 Dipt res pr sentation g n rale les n matoc res 2009 Photo 10 Culico des sp Moucheron piqueur R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 3 Dipt res pr sentation g n rale les n matoc res 2009 51 Photo 11 Photo 12 Simulium sp Mouche noire Hippobosca sp Mouche plate R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 5 Dipt res brachyc res cyclorrhaphes pupipares 2009 R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 3 Dipt res pr sentation g n rale les n matoc res 2009 Photo 13 Musca domestica Mouche domestique R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 7 Dipt res brachyc res cyclorrhaphes calypt res 2009 52 2 Le comportement de l insecte type de vol et localisations des piq res Selon une tude men e par Barros et Foil 2007 aux Etats Unis certaines esp ces de Tabanid s cherchent compl ter un repas de sang interrompu sur un h te proximit imm diate de l animal qui les a chass s La distance maximale que ces insectes feraient dans la plupart des cas pour gagner un nouvel h te n exc derait pas dix m tr
13. PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 follows a four step protocol consisting of Sample Preparation Sample Incubation Conjugate Incubation and Detection One plate with 90 prepared samples can be analyzed within 120 minutes Kit Components Store kit at 5 3 C until expiry date See kit label for actual expiry date The shelf life of diluted opened or reconstituted components is noted below where appropriate Chemical hazard data are available in section Safety Regulations and R amp S Statements Appendix IV Component 1 Test Plate Strip Plate Five Test Plates are delivered in vacuum bags con taining a desiccant bag Component 2 Sample Diluent Ready to use Two bottles containing 60 ml of Sample Diluent Color of solution yellow Component 3 Washing Fluid 20x 20x concentrated dilute before use Two bottles containing 60 ml Washing Fluid Prepara tion of Washing Fluid working solution see Appendix II Stability of Washing Fluid working solution 2 weeks at 22 3 Component 4 Washing Fluid Additive One vial containing 5 Washing Fluid Additive Remark viscous liquid Component 5 Conjugate Diluent Ready to use One bottle containing 60 ml Conjugate Diluent Color of solution red Component 6 Conjugate 30x 30x concentrated dilute before use One vial containing 2 ml of Conjugate Preparation of Conjugate working solution see Appendix II Dilute just before use Com nt7 Chromogen
14. TMB Substrate Ready to use One bottle containing 60 ml of Chromogen substrate Component 8 Stop Solution Ready to use One bottle containing 60 ml Stop Solution Component 9 Demineralized Water One vial containing 10 ml Demineralized Water 123 For in vitro veterinary diagnostic use only Store at 5 3 C Product No 7610530 Component 10 Positive Control Lyophilized Two vials containing 150 pl lyophilized Positive Con trol Store at 20 to 80 C after reconstitution Can be aliquoted or may be freeze thawed up to five times Component 11 Weak Positive Control Lyophilized Two vials containing 150 pl lyophilized Weak Positive Control Store at 20 to 80 C after reconstitution Can be aliquoted or may be freeze thawed up to five times Component 12 Negative Control Lyophilized Two vials containing 150 pl lyophilized Negative Control Store at 20 to 80 C after reconstitution Can be aliquoted or may be freeze thawed up to five times Additional Kit Contents Package Insert Additional Material Required General Laboratory equipment according to national safety regulations Demineralized water or water of equal quality must be used Dummy plate used for sample dilution e g clear colorless round bottom 96 well plate or equivalent Single channel pipette 10 100 yl Single channel pipette 20 200 pl Multichannel pipette 5 50 yl Multichannel pipette 50
15. antig nes de surface et antig nes cach s de tachyzoites mais aussi de bradyzoites Apr s broyage par passage dans une aiguille fine du parasite les prot ines antig niques sont s par es par lectrophor se puis transf r es sur membrane La membrane r v le des zones plus sombres lorsqu il y a r action entre le complexe immun anticorps antig ne recherch et un anticorps secondaire coupl une peroxydase Cortes et al 2006a ont adapt une technique d crite pour N caninum par Staubli en 2006 La sensibilit de leur m thode est de 91 3 et la sp cificit de 97 5 Comparativement la sp cificit est meilleure que l ELISA donc elle est utile pour trancher lorsque l ELISA donne des r sultats trop proches du seuil de positivit ou pour liminer les r actions crois es possibles avec l ELISA donc elle permet de voir si un bovin n est pas doublement infect besnoitiose et n osporose ou besnoitiose et toxoplasmose En 2010 Schares et son quipe ont mis au point deux nouveaux tests WB utilisant un nouveau syst me de notation diff rent de celui instaur par Cortes et al 2006a Le profil type d un s rum positif en WB selon Cortes et al 2006a pour la besnoitiose est la pr sence de bandes r parties dans trois domaines les prot ines de faible poids mol culaire entre 12 et 20 kDa souvent la plus difficile voir les prot ines de 23 38 kDa et enfin les prot ines de haut poids mol culaire 60 90 kD
16. s Toutes leurs exp riences ont t r alis es sans t moins sans tests s rologiques permettant de confirmer une infection ou bien de diff rencier les protozoaires proches tel que T gondii ou H hammondi Le r le d h te d finitif n a pas pu tre confirm ult rieurement malgr les recherches de Diesing et al en 1988 r alis es sur 12 esp ces de mammif res carnivores incluant le chat domestique six esp ces de reptiles et une esp ce d oiseau charognard Aucun de ces animaux n a excr t d ookystes apr s l ingestion de tissus contenant des kystes bradyzoites isol s dans deux endroits diff rents Isra l et Afrique du sud Face ce myst re Cortes et al 2006 ont r essay les exp rimentations mais celles ci n ont donn aucun r sultat probant De m me pour l quipe de Basso et al en 2011 qui a inocul B besnoiti provenant de bovins infect s en Allemagne des animaux domestiques chat chien lapin rongeurs Les r sultats diagnostiques et s rologiques montrent que les isolements de B besnoiti peuvent infecter les chats les lapins et les rongeurs cependant une persistance du parasite est d montr e uniquement chez le campagnol Bien que des efforts consid rables aient t d ploy s pour lucider le cycle biologique de B besnoiti aucune tude d infection exp rimentale n a t men e en faisant ing rer des esp ces de petits mammif res infect s comme des lapins ou des rongeurs des
17. sion macroscopique kystes absence de l sion macroscopique kystes kystes orchite bilat rale pididymite bilat rale vagin muqueuse kystes endom tre kystes Appareil cardio eae veines intima kystes endocarde p t chies vasculaire cceur droit endocarde kystes poumons et trach e congestion muqueuses kystes App DEAN larynx pharynx p t chies parenchyme pulmonaire kystes r gions pr f rentielles partie inf rieure des membres t te encolure paules volets costaux croupe et r gion p rin ale en particulier de l extr mit des membres veines saph nes de la t te de la queue ainsi que les jugulaires pituitaire conjonctivale sinusale du pharynx de la trach e des bronches Tableau 3 Ensemble des l sions macroscopiques observables lors des diff rentes phases de la besnoitiose Photo 29 Phase f brile aspect congestivo h morragique de la carcasse JP Alzieu 65 Photos 30 Phase de scl rodermie nombreux kystes bradyzo tes dans le tissu conjonctif sous cutan JP Alzieu 31 Phase de scl rodermie kystes bradyzo tes dans la muqueuse trach ale d une vache infect e chroniquement JP Alzieu 66 Photo 32 Phase de scl rodermie kystes bradyzoites de la taille d une t te d pingle sur la scl rotique Pathologie des Ruminants ENVT 267 E L sions microscopiques Franc et al 1
18. sp Remo The diagnostic assay for the detection of antibodies directed against Besnoitia besnoiti in bovine serum is based on ELISA technology Besnoitia antigen is coated on the ELISA plate Serum samples are incu bated on the plate A peroxidase POD labeled anti pig antibody is used for the detection of antibodies bound to the antigen Color development using TMB substrate measured optically at a wavelength of 450 nm shows the presence of antibodies directed against Besnoitia besnoiti The PrioCHECK Besnoitia Ab follows a four step protocol consisting of Sample Preparation Sample Incubation Conjugate Incuba tion and Detection One plate with 90 prepared sam ples can be analyzed within 150 minutes Kit Components Shelf life of all un opened components is 1 year after manufacturing See kit label for actual expiry date The shelf life of diluted opened or reconstituted compo nents is noted below where appropriate Chemical hazard data are available in section Safety Regula tions and R amp S Statements Appendix IV Component 1 Test Plate Strip Plate Five Test Plates are delivered in vacuum bags containing a desiccant bag Component 2 Sample Diluent Ready to use Three bottles containing 60 ml of Sample Diluent The Sample Diluent is used to dilute the samples Color of solution yellow Component 3 Washing Fluid 20x 20x concentrated dilute before use Two bottles containing 60 ml Washing Fluid
19. tude g ographique de la besnoitiose bovine ainsi que la recherche d une corr lation entre taux d anticorps et pr sence de kystes Tous les s rums ont t test s au pr alable par WB dans le laboratoire de Parasitologie de l ENV Toulouse et par ELISA dont les r sultats nous ont t fournis par le Laboratoire V t rinaire D partementale de l Ari ge La valeur seuil de Densit optique DO de l ELISA a t fix e 15 par le fabricant Cependant nous avons analys nos r sultats avec deux autres seuils 10 et 20 de DO dans le but d estimer la possibilit d une optimisation concernant la banque des s rums tudi s ici Le panel comprend les groupes d chantillons suivants 1 S rums standards n 232 Les s rums r ellement positifs n 121 ont t obtenus partir d animaux naturellement infect s B besnoiti La s ropositivit a t doublement mise en vidence par la pr sence d anticorps anti B besnoiti par Western Blot d apr s la m thode d crite par Cortes et al 2006a ainsi que par ELISA kit commercial PRIONICS Les s rums vrais n gatifs n 111 ont t obtenus partir de bovins ayant t confirm s n gatifs galement par WB et ELISA 2 S rums douteux n 110 Parmi l ensemble d chantillons de s rums dits douteux un seul cas de figure a t observ Il s agit des s rums ayant r agi n gativement au WB et positivement l ELISA 3 S rums de
20. Armelle Pathologie m dicale des Equid s et des Carnivores M JOUGLAR Jean Yves Pathologie m dicale du B tail et des Animaux de Basse cour Mme LETRON RAYMOND Isabelle Anatomie pathologique M LYAZRHI Faouzi Statistiques biologiques et Math matiques M MATHON Didier Pathologie chirurgicale Mme PRIYMENKO Nathalie Alimentation M ASIMUS Erik Pathologie chirurgicale Mme BENNIS BRET Lydie Physique et Chimie biologiques et m dicales Mlle BIBBAL Delphine Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale Mme BOUCLAINVILLE CAMUS Christelle Biologie cellulaire et mol culaire Mlle CADIERGUES Marie Christine Dermatologie M _ CONCHOU Fabrice Imagerie m dicale M CORBIERE Fabien Pathologie des ruminants M CUEVAS RAMOS Gabriel Chirurgie Equine Mme DANIELS H l ne Microbiologie Pathologie infectieuse M DOSSIN Olivier Pathologie m dicale des Equid s et des Carnivores Mile FERRAN Aude Physiologie M GUERIN Jean Luc Elevage et Sant avicoles et cunicoles M Jean Philippe Pharmacie et Toxicologie Mlle LACROUX Caroline Anatomie Pathologique des animaux de rente M LIENARD Emmanuel Parasitologie et maladies parasitaires M MAILLARD Renaud Pathologie des Ruminants Mme MEYNAUD COLLARD Patricia Pathologie Chirurgicale M MOGICATO Giovanni Anatomie Imagerie m dicale M NOUVEL Laurent Pathologie de la reproduction Mile PALIERNE Sophie Chirurgie des animaux de compagnie Mlle PAUL Mat
21. Component 8 Stop Solution Ready to use One bottle containing 60 ml Stop Solution The Stop Solution is used to stop the color development Component 9 Demineralized Water One vial containing 10 ml Demineralized Water Demineralized Water is used to reconstitute the lyophilized control samples Component 10 Positive Control Lyophilized One vial containing the lyophilized Positive Control The Positive Control is reconstituted by adding 150 of Demineralized Water supplied with the kit Mix by vortexing thoroughly and inverting the vial several times Store at 20 to 80 C after reconstitution Can be aliquoted or may be frees thawed up to 5 times Component 11 Weak Positive Control Lyophilized One vial containing lyophilized Weak Positive Control The Weak Positive Control is reconstituted by adding 150 ul of Demineralized Water supplied with the kit Mix by vortexing thoroughly and inverting the vial several times Store at 20 to 80 C after reconstitution Can be aliquoted or may be frees thawed up to 5 times Component 12 Negative Control Lyophilized One vial containing lyophilized Negative Control The Negative Control Sample is reconstituted by adding 150 ul of Demineralized Water supplied with the kit Mix by vortexing thoroughly and inverting the vial several times Store at 20 to 80 C after reconstitution Can be aliquoted or may be frees thawed up to 5 times Additional Kit Contents
22. Depuis 1817 les termes employ s pour d signer cette maladie ont chang de nombreuses fois pour aboutir la besnoitiose bovine adopt e depuis 1980 Tous les synonymes utilis s font r f rence aux aspects cliniques et l sionnels de la maladie tableau 1 Synonymes Pays R f rence El phantiasis du b uf Frangais Santin 1817 Rouge des Bovid s Fran ais Taiche 1831 Fi vre angiot nique Fran ais Gell 1840 L pre Fran ais Gell 1840 L pre l phantiasique Fran ais Gell 1840 Enbouffounadis Fran ais occitan Causse 1857 Maladie rouge Fran ais Festal 1859 Anasarque des bovins Fran ais Cadeac 1884 Sarcosporidiose cutan e bovine Fran ais Besnoit amp Robin 1912 Chimurra rides Fran ais basque Bourde 1928 Globidiose cutan e du b uf Fran ais Cuill 1937 Lipoa Fran ais basque Berthelon et al 1938 Lortista Fran ais basque Berthelon et al 1938 Sarcosporidiosis cutanea de los bovinos Espagnol Vogelsand et al 1941 Dermatosis verrugosa por Besnoitia globidium Espagnol Vogelsand et al 1941 Globidiosis of cattle Anglais Hofmeyr 1945 Anasarca bovina Portugais Leitao 1949 Besnoitiose bovino por Globidium besnoiti Portugais Leitao 1949 Dermite verrugosa parasitaria Portugais Leitao 1949 Sarcospordiose bovina Portugais Leitao 1949 Globidiose bovino por Globidium besnoiti Portugais Leitao 1949 29 Akanyaga Rwandais Herin 1952 Globidiose cutan e Fran ais Herin 1952 Runderglobidiosis N erlan
23. Gallego M L pez Bernad F Qu lez J S nchez Acedo C 2000 Immunohistochemical study of the cyst of Besnoitia besnoiti Vet Parasitol 91 1 6 Jacquiet P Boucher C Lienard E et coll 2009 La besnoitiose bovine enqu tes s rologiques dans le sud ouest de la France Recueil conf rences Journ es nationales GTV Nantes 1213 1217 Jacquiet P Li nard E and Franc M 2010 Bovine besnoitiosis epidemiological and clinical aspects Vet Parasitol 174 30 36 Janitschke K De Vos AJ Bigalke RD 1984 Serodiagnosis of bovine besnoitiosis by ELISA and immunofluorescence tests Onderstepoort J Vet Res 51 239 243 Jeuland S 2010 S ropr valence de la besnoitiose bovine dans deux foyers du Maine et Loire Th se de doctorat v t rinaire Nantes 129p Landis JR Koch GG 1977 The measurement of observer agreement for categorical data Biometrics 33 159 174 Lee HS Bak UB Moon MH Shin JU 1970 Studies on bovine besnoitiosis in Korea A survey on incidence in the enzootic region Kisaengch unghak chapchi Korean J Parasitol 8 76 80 Legrand P 2003 La besnoitiose bovine en Ari ge Th se de doctorat v t rinaire Toulouse 87p Lehmann T Marcet PL Graham DH Dahl ER Dubey JP 2006 Globalization and the population structure of Toxoplasma gondii Proc Natl Acad Sci USA 103 11423 11428 111 Lesser M Braun U Deplazes P Gottstein B Hilbe M et Basso W 2012 First cases of besnoitiosi
24. carnivores L hypoth se d un cycle h t rox ne typique des coccidies demande donc tre v rifi e On ne sait pas pour le moment si des isolements de B besnoiti provenant de r gions g ographiquement diff rentes proviennent d h tes d esp ces diff rentes Cependant aucun h te naturel interm diaire autre que le bovin n a t d crit pour B besnoiti Jacquiet et al 2010 Il a t montr que les lapins peuvent tre infect s exp rimentalement mais aucune tude n a jamais confirm de cas naturel sauvage Par contre deux cas de besnoitiose naturelle ont pu tre d crits chez des lapins domestiques Basson et al 1970 et Bigalke 1967 1968 ont pu reproduire les phases cliniques de la besnoitiose chez des lapins en inoculant B besnoiti 39 Des tudes exp rimentales sur des ongul s et sur des animaux de laboratoire ont permis d tablir que la transmission directe des bradyzoites et tachyzoites entre h tes interm diaires se ferait par l interm diaire d insectes piqueurs vecteurs m caniques Basso et al 2011 Bigalke 1967 1968 1981 Li nard et al 2012 Ce cycle monox ne de bovin bovin serait d importance capitale Alzieu et al 2000 2 Les oiseaux migrateurs comme h tes interm diaires et d finitifs En examinant les foyers enzootiques de la besnoitiose bovine par exemple les Pyr n es en France et en Espagne le sud du Portugal l Isra l le Nigeria le Soudan le Kenya et l Afrique du S
25. ciis p re Cun dT nn CRUS VE CV 101 B NESI I E dat arnaud siens 101 C Conclusion partielle rer ania e e ri eft diee aer dnce nt 103 CONCLUSION ET PERSPECTIVES 105 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 107 ANNEXES toas de te te dac Dott nn elite 115 17 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 Protocole du kyste bradyzoites aux tachyzoites 116 Annexe 2 Protocole culture des cellules Vero et mise en culture des tachyzoites de B NET 118 Annexe 3 Mode d emploi PrioCHECK Besnoitia Ab 120 Annexe 4 Mode d emploi PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 123 18 LISTE DES FIGURES Figure 1 Place de Besnoitia besnoiti dans la classification 32 Figure 2 Arbre phylog n tique construit partir des s quences de l ADNr de la petite sous M 33 Figure 3 Arbre phylog n tique construit partir de la r gion ITS 1 des diff rentes esp ces du genre tn en 34 Figure 4 Repr sentation sch matique d ookystes de coccidies retrouv es dans les f ces d un Chater octo ano 0 3 35 Figure 5 Repr sentation sch matique d un kyste bradyzo tes 37 Figure 6 Les deux cycles possibles dans la besnoitiose bovine 41 Fig
26. de Fluoprep dans chaque puits puis mise en place d une lamelle par lame DR dc UMP SA cu LA em E AE 93 Photo 41 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif au microscope UV 400 la dilution 1 100 ui eise iter ei ita gea arin eter acta en dei ede 95 Photo 42 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif au microscope UV x400 la dilution 1 200 inedite dete e nee ad espe one Rd de Pu eda ade 95 Photo 43 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif au microscope UV x400 ala dilution 1 400 ene etre Ret sat trio ree tne aue eo n Rea sa iege baat on Latio A 95 Photo 44 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif au microscope UV 0 198 OO E 95 Photo 45 Observation de tachyzo tes sur une lame t moin n gatif au microscope UV HAO a ei hom M se tnt ROMANE tn nt E 96 Photo 46 Observation de tachyzo tes sur une lame t moin positif au microscope UV 3400 S DU o bold OU oet aide ae ry PEN vr din 96 Photo 47 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif au microscope UV X400 Ja dil tion D Me E R E SAS APE ee deu de 96 Photo 48 Observation de tachyzo tes sur une lame t moin positif au microscope UV ro UL DEMENS UO Pm 96 Photo 49 Observation de tachyzoites sur une lame de s rum dout
27. de compl ter le kit de diagnostic actuellement disponible pour la besnoitiose bovine qui se compose de l ELISA kit commercial PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 du laboratoire PRIONICS et du Western Blot utilisant les tachyzoites en condition non r duit Le laboratoire de Parasitologie a souhait estimer les caract ristiques propres de son IFI et de disposer ainsi d un troisi me test permettant de lever les incertitudes concernant le statut s rologique d un animal dans les situations suivantes WB n gatif et ELISA positif fr quent ou WB positif et ELISA n gatif rare L objectif de mon travail de th se a t de d finir les sp cificit s propres de l IFI partir d une banque de 403 s rums de bovins pour lesquels le statut immunologique vis vis de la besnoitiose a t estim par WB et pour la plupart par ELISA et d envisager les possibilit s d optimisation 87 MATERIELS ET METHODES A Banque de s rums bovins Durant cette tude 403 s rums ont t analys s Ils proviennent pour la quasi totalit de diff rents d partements fran ais du sud du pays dont entre autre l Ari ge l Aude le Tarn le Gers l Ard che la Dr me et fournis par des v t rinaires praticiens ou des Groupes de D fense Sanitaire Le statut clinique des animaux et leur historique levage de naissance et d placements ult rieurs n ont pas t fournis avec l envoi des s rums L absence de ces donn es emp che notamment une
28. deae OH RD SU La DII Eb 88 1 S rums standards n 232 88 2 S ruimis douteux n S E10 oe rei ertet edocet Poe ve RT ER BEAT 88 3 S rums de bovins s ropositifs Neospora caninum ou Toxoplasma gondii par ELISA G S utet aatem RN ten A ianua ie toa INI ES 88 4 Autres s r ms tese tet eet evite Wasi ates ooh Pete ree seite 89 B Production de Besnoitia besnoiti sss 89 C Fixation sur lame de l antig ne 89 D Tests des s rums par Immunofluorescence Indirecte 90 E D termination de la dilution optimale de la solution de tachyzoites 93 F Analyse des donnees ood e n ie tad peril bete p NE e las IN ERE 93 LIT IRESUETA TS ere i REF e 95 A Photographies au microscope ultra violets 95 l TEMON DOSIUT sen nn D Eden dec detto Done oido Ub oe anii debe uta a doutes 95 25 ESI a E E ES EEE 96 3 S rums probl matiques s i icsasinisdaiasaiae jaca ais asia auiedanaudais 96 B Optimisation de PIFI inuito N en net he ns ciel essen UC Caco 97 C Comparaison des r sultats ELISA et WB 97 D Performances de PIEL eise tn 99 EV DISCUSSION 2 eese Uere E EOD De 101 Mat riels et m thodes
29. es salle Diop A Arthur pour nos vir es Bisca pour l organisation et les soir es montages de la Revue pour les bou hons pr s des boites aux lettres ou au Connexion A Aur lien pour ta bonne humeur nos parties de tennis tes ce soir c est caniveau pour tout le monde Isabelle et Am lie pour nos projections priv es au cin club pour nos soir es karaok ou pas A Maxime pour ta force tranquille nos fous rires nos jeux de booms A Sol ne pour nos soir es un d ner presque parfait nos boomettes de poulots les presque quelques soir es Mont de Marsan l t et pour le r veillon A Katy pour nos sorties derri re le terrain de tennis avec les ienchs nos soir es chez m m pour le monument pour ta gentillesse Marl ne pour ta bonne humeur ta g n rosit lorsque tu as su h berger un vieil ermite deux semaines chez toi A Anne lise L a Jos phine Laure et Marion A mes poulots plus particuli rement Marie L a Ezhvin Julia sans qui je n aurai jamais perdu toutes mes affaires sur la plage la Faute sur mer et sans qui on n aurait pas pass de si parfaites soir es mais aussi Maxime Fabien Guillaume Fanny Guilhem Ad le Renaud Marie Lou pour votre simplicitit et les bons moments pass s en votre compagnie A ceux que j oublie Et pour finir A Aur line pour ces cinq ann es tes c t s d j pour tout tous les jours
30. fanon On peut galement observer une distension des veines jugulaires et plus rarement une distension abdominale ascite Une attention toute particuli re est privil gier par rapport l volution et la localisation pr cise des ced mes ainsi que des modifications cutan es 3 Pendant la phase de scl rodermie et de d pilations Franc et al 1987 Legrand 2003 Les gales qu elles soient sarcoptique chorioptique ou psoroptique sont des parasitoses externes extr mement prurigineuses et entrainant une hyperk ratinisation de la peau Par contre elles n entrainent ni fi vre ni ced mes Les phtirioses sont caract ris es par un prurit important responsable de d pilations de cro tes et d paississement cutan autour des yeux sur l encolure et sous la queue On les diff rencie gr ce leur caract re saisonnier frappant surtout l hiver et aussi par son absence de r percussion sur l tat g n ral de l animal et par l observation macroscopique des parasites dans le pelage La dermatophilose Dermatophilus congolensis est peu contagieuse et touche aussi bien les petits ruminants que les chevaux de pr f rence lorsqu il fait chaud et humide D un point de vue l sionnel on observe des petits nodules fermes et secs dans les zones o la peau est paissie et rugueuse notamment sur la croupe le dos l encolure le garrot les c tes et parfois la t te Concomitamment on observe un h rissement de
31. galement une forme de banane au cours de la maturation du kyste Ils mesurent environ 1 9 x 8 4 um Ferri 1984 Photo 4 gt Vs Photo 4 Bradyzoites par observation au microscope lectronique transmission PVM membrane vacuolaire parasitophore GL couche granuleuse MN micron mes R rhoptries N noyau AG granules d amylopectines HC cellule h te Dubey e al 2003a 38 C Cycle volutif 1 Actualit s autour du cycle volutif de Besnoitia besnoiti Bien que les esp ces de Besnoitia des grands mammif res soient tudi es depuis un si cle maintenant Besnoit et Robin 1912 les h tes d finitifs d un cycle volutif suppos h t rox ne ne sont toujours pas bien d finis Parmi le genre Besnoitia seulement B darlingi wallacei B oryctofelisi et B neotomofelis ont un cycle biologique connu et o le chat est l h te d finitif Dubey et al 2003a Dubey et Yabsley 2010 Frenkel 1977 Smith et Frenkel 1977 Pour les autres esp ces de Besnoitia B bennetti B jellisoni B caprae B tarandi B akodoni incluant B besnoiti l h te d finitif est toujours inconnu Dubey et al 2003a b Des cas d infections exp rimentales r alis es par Rommel 1975 en Uganda et Peteshev et al 1974 au Kazakhstan sugg rent que l h te d finitif soit le chat Cependant leurs r sultats ont uniquement montr la pr sence dans les f ces des f lid s d ookystes non sporul s et non identifi
32. hirsuta S buffalonis S cruzi S tenella S capracanis S arieticanis 81 E 3l 55 49 l felis B jellisoni B besnoiti H hammondi T gondii N caninum E TL Um E E m OR UK E E CE Isospora gt Besnoitia L Hammondia E toxoplasma D Neospora Figure 2 Arbre phylog n tique construit partir des s quences de l ADNr de la petite sous unit ribosomale Ellis et al 2000 33 pefinitive hosts _ E hosts ec i S So TY Be RM ean v 4 E O pesnolt Bp 00 B saca south A B yao ta ra vsn 2 x g Figure 3 Arbre phylog n tique construit partir de la r gion ITS 1 des diff rentes esp ces du genre Besnoitia Huit Besnoitia sur dix sont pr sent s avec leurs h tes naturels connus La barre d chelle indique la distance g n tique Olias et al 2011 En plus de B besnoiti neuf autres esp ces de Besnoitia ont t signal es chez les grands mammif res domestiques et sauvages ch vres nes chevaux rennes et caribous ainsi que chez les lagomorphes les marsupiaux et les l zards On retrouve donc quatre esp ces infectant des grands mammif res B besnoiti B caprae B tarandi et B bennetti et six infectant les petits mammif res B darlingi B jellisoni B wallacei B oryctofelisi B akodoni et B neotomofelis Les relations volutives entre ces esp ces ont t peu tudi es
33. la VPN de 82 7 95 IC 78 2 86 596 Western Blot Dilution R sultats 115 15 1 100 7 266 Q 8 112 0 3 3 1200 10 281 92 0 1 400 E 30 281 63 0 1 t 59 281 Tableau 7 R sultats du WB et de l IFI pour la totalit des s rums 99 Globalement le degr d accord entre le test de r f rence WB et est quasiment parfait pour les dilutions 1 100 1 200 et 1 400 avec respectivement 0 873 95 IC 0 822 0 925 0 940 95 IC 0 903 0 977 et x 0 811 95 IC 0 746 0 875 Il devient moyen la dilution 1 800 avec 0 598 95 IC 0 512 0 685 Le meilleur accord est atteint la dilution 1 200 tableau 8 on Se Sp VPP VPN K Dilution 9591 5 10 95 IC 95 IC To 94 3 94 7 88 5 97 4 0 873 n2403 88 5 97 7 914 970 8177 934 94 8 99 0 0 822 0 925 91 8 96 6 0 940 1 200 54 96 0 00 190 93 8 98 3 0 903 0 977 75 4 90 4 0 811 1 400 66882 8 100 100 86 5 93 4 0 746 0 875 51 6 82 7 0 598 1 800 424608 109 En 78 2 86 5 0 512 0 685 Tableau 8 Sensibilit sp cificit et accord de l IFI par rapport au WB en consid rant la totalit des s rums test s Les r sultats d taill s de l IFI la dilution seuil choisie de 1 200 sont pr sent s ci dessous tableau 9 S rums S rums S rums Aut
34. of Besnoitia besnoiti from a chronically infected cow in Spain J Parasitol 95 474 476 Fern ndez Garc a A Alvarez Garc a G Risco Castillo V Aguado Mart nez A Marc n J M Rojo Montejo S Castillo J A and Ortega Mora L M 2010 Development and Use of an Indirect ELISA in an Outbreak of Bovine Besnoitiosis in Spain Vet Rec 166 818 822 Ferri 1984 La besnoitiose bovine revue bibliographique et observations personnelles Th se de doctorat v t rinaire Toulouse Fonclara E 2011 Infection exp rimentale de g nisses par Besnoitia besnoiti Th se de doctorat v t rinaire Toulouse 129p Franc M Cadiergues MC 1999 La besnoitiose bovine attitude diagnostique et th rapeutique Bulletin Groupement Technique V t rinaire 2 119 124 Frenkel JK 1977 Besnoitia wallacei of cats and rodents with a reclassification of other cyst forming isosporoid coccidia J Parasitol 63 611 628 Frenkel JK and Smith DD 2003 Determination of the genera of cyst forming coccidian Parasitol Res 91 384 389 Freudiger I 2008 La besnoitiose bovine tude pid miologique de l pizootie des Alpes de Haute Provence et des Hautes Alpes Th se de doctorat v t rinaire Lyon 84p Friedhoff K T and Soul C 1996 An Account on Equine Babesioses Rev Sci Tech Oie 15 1191 1201 Fulton JD and Turk JL 1959 Direct agglutination test for Toxoplasma gondii Lancet 1068 1069 Furuta PI Mineo TW Carr
35. par les kystes voquant la peau d un l phant hyperk ratose On retrouve ces zones au niveau de l encolure des faces lat rales de la t te de la face interne des cuisses du scrotum et de la mamelle Au niveau de l extr mit des membres et des articulations du carpe du boulet et du jarret on peut retrouver des crevasses et ou des escarres surinfect es ou non Chez la vache la mamelle est d form e du fait d excroissances ou d hypertrophie des trayons rendant la traite t t e difficile Au niveau locomoteur la d marche est de plus en plus raide les d placements de plus en plus difficiles Les bovins qui arrivent jusqu ce stade de la maladie d p rissent petit petit Ils sont alors envoy s l abattoir ou bien euthanasi s dans les deux cas dans un souci de bien tre animal et parce qu ils deviennent des non valeurs conomiques Malgr tout certains animaux survivent dans cet tat et dans de rares cas on peut assister la r gression partielle voire totale des sympt mes cutan s en 3 4 mois Jacquiet et al 2010 Alzieu et al 2011 59 Seulement 25 des animaux infect s pr sentent au bout de la 6 7 semaine apr s la phase f brile des kystes oculaires pathognomoniques de la besnoitiose Ils sont de la taille d une t te d pingle et on peut les rep rer le plus simplement au niveau du limbe scl ro corn en Les kystes peuvent tre galement observ s sur la muqueuse vaginale Dans les d
36. pour tre l pour tre toi TABLES DES MATIERES LISTE DES ANNEXES mm nn nan aie 18 LISTE DES FIGURES item 19 LISTE DES TABLEAUX siennes 20 LISTE DES PHOTOS horn ee aoe 21 LISTE DES ABREVIATIONS ioi pde e QU entdve is tee 24 INTRODUCTION ss d 25 CHAPITRE 1 LA BESNOITIOSE BOVINE ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 2 I PRESENTATION GENERALE eee sese stent teresa nnne eren eene 29 Av D finition 29 B SNON VAE SEA NT nee Lee ee ere ee 29 C BC 01 01 ce L E 30 D HBDOFTSHC a 31 LE ETIOLOGIE uiis eee Ne G CLP CO E ane 32 A SVSIC M AQUE 272520 B BEG MED MM E E A ann 32 B Morphologie des diff rents stades parasitaires 35 EN E ous SUES erp ans Se 35 2 Les tachyzoites P nine 35 3 ESS LIDTAA ZONES nes nan nd dat Rye aera ui nap ste ug 36 4 Lgs Btadyzoles ases Dai Ue Re EH D ED Did eI 38 C Cycle evolutivo ODER tot RU Pt oic otiose 39 1 Actualit s autour du cycle volutif de Besnoitia besnoiti sss 39 2 Les oiseaux migrateurs comme h tes interm diaires et d finitifs 40 3 lt Evolation du Parasite en ah edat dq eM Dec d
37. quelques touffes de poils A la suite de ces l sions on observe l apparition de zones alop ciques et de parak ratose associ es une ad nopathie La photosensibilisation se manifeste par l apparition de l sions congestives ryth mateuses et extr mement prurigineuses au niveau des zones d pigment es et ou d pil es mufle paupi res mamelle vulve scrotum oreilles ligne du dos bourrelet coronaire des onglons face interne des cuisses D autres sympt mes sont associ s jetage larmoiement photophobie Il s en suit la formation d d mes puis de zones alop ciques o la peau se fissure se d tache et se gangr ne Gourreau 2000 La d mod cie donne des l sions la plupart du temps discr tes repr sent es par quelques petits nodules dans les follicules pileux de l encolure et du garrot 71 Les parak ratoses se caract risent par des plaques dures paisses et douloureuses la base des cornes sur le mufle au niveau des articulations des membres et dans les r gions vulvaire et p ri anale Elles sont soit primaires soit secondaires une carence en zinc et affecte g n ralement l tat g n ral L ichtyose cong nitale se d finit par la pr sence de l sions de type hyperk ratose puis exfoliation au niveau du rev tement cutan du dos du garrot des faces lat rales de l encolure et du mufle Les l sions laissent apparaitre des zones alop ciques qui se fissurent puis s ulc rent Pa
38. rosit ta bonne humeur tes cochons ta t te de tifanu s nos boomettes de poulots notre recueil d expressions mais pas plu hein poulus d saffectus non et toi regarde le lui l bas qui parle de vignoble bordel de cul de merde tsao enfoir gueux fait pas haud h tu le sais hein d pit ah ca etc A Nicolas pour notre p riple en Normandie au pays des chevaux 1 million pour tes M amp M s tes c est pas un PC c est un mac tes Bonjour un filet o fish et une boite de nuggets svp tes Fausty il l arme le produit tes merveilleuses imitations A Matatias pour notre go t commun la musique au tennis et au dessin nan je rigole et la bi re bien s r Toi seul maitrise la plume A Alex pour ton accent et tes expressions inimitables tu m as cass de rire pour ton envie de profiter de la vie fond pour nos vacances Arcachon notre vir e Barcelone chez les pakistanais cerveza beer my friends A Valentine pour ta personnalit hors du commun nos moments de gal re et de joie durant notre ann e mois de bovine pour ta g n rosit pour Attila qui sait embrigader F ro pour tout et n importe quoi qui parle de manger du raticide A Olivier pour tes olaolaoO sortis de nulle part pour nos parties de tennis nos nombreuses corrections ron o nos soir es cin club improvis
39. 00 20 10 www prionics com Prionics Lelystad B V P O Box 2271 8203 AG Lelystad The Netherlands Tel 31 320 714 000 Fax 31 320 714 029 For our distribution network please refer to 125 Toulouse 2013 NOM LENFANT PR NOM FRAN OIS TITRE Mise au point d une technique de diagnostic s rologique par immunofluorescence indirecte de la Besnoitiose bovine Besnoitia besnoiti R SUM La Besnoitiose bovine est une maladie des bovins reconnue mergente en Europe EFSA 2010 et qui engendre de lourdes pertes conomiques La plupart des animaux atteints sont asymptomatiques et forment un r servoir qu il est indispensable d identifier au plus vite Ce travail pr sente la mise au point d une technique de diagnostic s rologique par immunofluorescence indirecte IFI au laboratoire de parasitologie de l ENV de Toulouse Cette tude a permis d valuer les performances de l IFI par comparaison au Western Blot Gold Standard et l ELISA gr ce l analyse de 403 s rums et en utilisant quatre dilutions 1 100 1 200 1 400 1 800 En consid rant un seuil de positivit la dilution 1 200 l IFI a montr un accord quasi parfait avec le Western Blot 0 940 avec une sensibilit de 91 8 et une sp cificit de 100 Il s agit d une technique assez lourde mettre en uvre mais permettant de confirmer le statut s rologique des chantillons lors de discordances entre les r sultats obtenus par ELISA et Western Blo
40. 1 Exploring the life cycle of Besnoitia besnoiti experimental infection of putative definitive and intermediate host species Vet Parasitol 178 223 234 Basson PA McCully RM et Bigalke RD 1970 Observations on the Pathogenesis of Bovine and Antelope Strains of Besnoitia besnoiti Marotel 1912 Infection in Cattle and Rabbits Onderstepoort J Vet Res 37 105 126 107 Berhault 2008 La Besnoitiose Besnoitia besnoiti tude de r servoirs sauvages potentiels dans un foyer en Maine et Loire Th se doctorat v t rinaire Toulouse 96p Besnoit C et Robin V 1912 Sarcosporidiose cutan e chez une vache Revue V t rinaire 37 649 663 Bigalke RD 1960 Preliminary observation on the mechanical transmission of cyst organisms of Besnoitia besnoiti Marotel 1912 from a chronically infected bull to rabbits by Glossina brevipalpis J S Afr Vet Assoc 31 37 44 Bigalke RD 1967 The Artificial Transmission of Besnoitia Besnoiti Marotel 1912 from chronically infected to susceptible cattle and rabbits Onderstepoort J Vet Res 34 303 316 Bigalke RD 1968 New Concepts on the epidemiological features of bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field investigations Onderstepoort J Vet Res 35 133 137 Bigalke RD 1981 Besnoitiosis and globidiosis Curr Top Vet Med Anim Sci 6 429 442 Br ning A 1996 Equine Piroplasmosis an Update on Diagnosis Treatment and Prevention Brit Vet J 15
41. 2 139 151 Cortes HC Leit o A Vidal R Vila Vicosa MJ Ferreira ML Caeiro V Hjerpe CA 2005 Besnoitiosis in bulls in Portugal Vet Rec 157 262 264 Cortes HC Nunes S Reis Y Staubli D Vidal R Sager H Leit o A Gottstein B 20062 Immunodiagnosis of Besnoitia besnoiti infection by ELISA and Western Blot Vet Parasitol 141 216 225 Cortes HC Reis Y Waap H Vidal R Soares H Marques I Pereira da Fonseca I Fazendeiro I Ferreira ML Caeiro V Shkap V Hemphill A Leit o A 2006b Isolation of Besnoitia besnoiti from infected cattle in Portugal Vet Parasitol 141 226 233 Cortes HC Reis Y Gottstein B Hemphill A Leit o A M ller N 20072 Application of conventional and real time fluorescent ITS1 rDNA PCR for detection of Besnoitia besnoiti infections in bovine skin biopsies Vet Parasitol 146 352 356 Cortes HC Mueller N Esposito M Leit o A Naguleswaran A et Hemphill A 2007b In vitro efficacy of nitro and bromo thiazolyl salicylamide compounds thiazolides against Besnoitia besnoiti infection in vero cells Parasitol 134 975 985 Costa KS Santos SL Uz da RS Pinheiro AM Almeida MA Ara jo FR McAllister MM Gondim LF 2008 Chickens Gallus domesticus are natural intermediate hosts of Neospora caninum Int J Parasitol 38 157 159 Cuill J Chelle PL Berlureau F 1936 Transmission exp rimentale de la maladie d nomm e Sarcosporidiose cutan e du boeuf Besnoit et Robin e
42. 20x Prepare Washing Fluid working solution by mixing 1 part Washing Fluid 20x with 19 parts demineralized water or water of equal quality and 0 2 parts of Wash ing Fluid Additive equals 196 Mix until a clear solu tion is obtained Remark If the Washing Fluid 20x shows a precipi tate warm the bottle up in a 30 C water bath until the precipitate is completely redissolved See Appendix II Stability of Wash Fluid working solution 2 weeks at 22 3 C Component 4 Washing Fluid Additive One bottle contains 30 ml Washing Fluid Additive 1 Washing Fluid Additive has to be added to the diluted washing fluid Mix until a clear solution is obtained Remark viscous liquid See Appendix II Component 5 Conjugate Diluent Ready to use One bottle contains 60 ml Conjugate Diluent The Conjugate Diluent is used to dilute the Conjugate Color of solution red Component 6 Conjugate 30x 30x concentrated dilute before use One bottle containing 2 ml of Conjugate Prepare 1x Conjugate by mixing 1 part of Conjugate with 29 parts of Conju 120 For in vitro veterinary diagnostic use only Store at 5 3 C Product No 7610490 gate Diluent Dilute the amount of Conjugate neces sary to run the test just prior to use See Appendix II Component 7 Chromogen TMB Substrate Ready to use One bottle containing 60 ml of Chromogen TMB substrate The Chromogen TMB substrate is the substrate for the color reaction
43. 61 868 Mullen GR Durden LA 2009 Medical and veterinary entomology Acad Press San Diego 637p Mutinelli F Schiavon E Ceglie L Fasolato M Natale A Rampin F and Carminato A 2011 Bovine Besnoitiosis in Imported Cattle in Italy Vet Parasitol 178 198 Olias P Schade B Mehlhorn H 2011 Molecular pathology taxonomy and epidemiology of Besnoitia species protozoa Sarcocystidae Infect Genet Evol J Mol Epidemiol Evol Genet Infect Dis 11 1564 1576 Packham AE Sverlow KW Conrad PA Loomis EF Rowe JD Anderson ML Marsh AE Cray C Barr BC 1998 A modified agglutination test for Neospora caninum development optimization and comparison to the indirect fluorescent antibody test and enzyme linked immunosorbent assay Clin Diagn Lab Immunol 5 467 473 Peteshev VM Galuzo IG Polomoshnov AP 1974 Cats definitive hosts of Besnoitia Besnoitia besnoiti Izvest Akad Nauk Kazakh Ser Biol 1 33 38 Pipano E 1997 Vaccines against hemoparasitic diseases in Israel with special reference to quality assurance Trop Anim Health Pro 29 865 905 112 Pols JW 1954 The artificial transmission of Globidium besnoiti Marotel 1912 to cats and rabbits J S Afr Vet Med Assoc 25 37 44 Pols JW 1960 Studies on bovine besnoitiosis with special reference to the aetiology Onderstepoort J Vet Res 28 265 356 Romand S Thulliez P Dubey JP 1997 Direct agglutination test for serologic diagnosis of N
44. 7 a TRYPSINATION et MISE EN CULTURE EN FLASK Passage d un tapis confluent Eliminer le surnageant Rincer 1 fois avec du PBS st rile pour liminer le SVF qui inhiberait la Trypsine D poser de la trypsine 1X 2 ml pour une F75 3 ml pour une F175 et mettre la boite de culture l tuve 37 C 5 minutes maximum Arr t de l action de la trypsine avec du milieu complet pour volume final de 10ml Ensemencer dans F75 2 ml pour 20 ml de milieu complet Noter sur la flask Cellules VERO le N de Passage la date Incuber 37 C sous 5 de CO2 Ne pas Manipuler les Flasks dans les 4 heures qui suivent laisser les cellules se fixer PASSAGE DE BESNOITI Additionner 2 3 ml de B besnoiti Bb du surnageant de la Flask de culture Cellule VERO Bb Puis en 7 noter sur la flask VERO Bb et aussi le N de Passage la date Ne SURTOUT pas Manipuler les Flasks dans les 4 H qui suivent laisser les cellules se fixer et les Bb rentrer dans les cellules 119 ANNEXE 3 Mode d emploi PrioCHECK Besnoitia Ab PrioCHECK Besnoitia Ab ELISA for in vitro detection Of antibodies against Besnoilia besnoiti bovine serum samples 2 5 plate kit for 450 samples Prionics AG Version 0 9e Introduction Bovine besnoitiosis is caused by infection with Bes noitia besnoiti a protozoan parasite which belongs to the family Sarcocystidae All cattle breeds independ ent of sex and age can
45. 987 Legrand 2003 1 Phase f brile et d oed mes Les l sions des deux premi res phases de la maladie sont pour la plupart de type vasculaire Elles touchent les petites veines puis les plus grandes jusqu un diam tre de 4 mm Les tachyzo tes sont l origine des l sions On retrouve les tachyzoites dans les histiocytes p rivasculaires cr ant une inflammation osinophiles et cellules mononucl es Puis les parasites colonisent l endoth lium vasculaire ce qui est l origine de son paississement et de celui du tissu conjonctif adjacent On a donc formation de thrombi qui se n crosent Secondairement on observe des l sions de thrombophl bite qui augmentent le risque de thrombo embolie et d h morragie On peut retrouver ce type de l sions dans tout l organisme du bovin mais pr f rentiellement au niveau de la peau des muqueuses vaginales des voies a riennes sup rieures et de la conjonctive En ce qui concerne l appareil locomoteur on peut observer des l sions musculaires d g n ratives de type n crose d g n rescence cireuse de Zenker avec parfois des zones de min ralisation Enfin le parenchyme h patique peut pr senter des foyers de d g n rescence hyaline des h patocytes avec vacuolisation des cellules 2 Phase de scl rodermie Les l sions microscopiques sont d crites pour certains tissus seulement Phase de scl rodermie scl re conjonctivale iris nombreux kystes
46. BS V rifier la pr sence des bradyzoites D Recommencer l lution autant de fois que n cessaire pour obtenir les Bradyzoites Comptage la cellule de Malassez apr s avoir dilu au 1 100 D poser les Bradyzoites sur Cellules VERO pr par es la veille Changement du milieu BB Changement du milieu BB Changement du milieu BB 116 O Passage sur nouvelles cellules VERO pr par es la veille D Apr s avoir v rifi qu il n y ait pas de BB libres vider le surnageant 2 Additionner 8 ml de milieu simple et scrapper avec le racloir 5 R cup rer les 8 ml de scrapping dans Falcon 15 et Compl ter 13 ml cela lave mieux 4 Centrifuger a 1200 rpm 10 minutes a 4 C 5 Jeter le Surnageant Re suspendre le culot dans 3 ml de milieu BB et tout d poser dans la flasque de cellules VERO pr par es la veille et contenant 27 ml de milieu BB D Changement du milieu BB D Changement du milieu BB ED Passage sur nouvelle flasque de cellules VERO pr par e la veille ED Visualisation des tachyzoites 117 ANNEXE 2 PROTOCOLE CULTURE DES CELLULES VERO ET MISE EN CULTURE DES TACHYZOITES DE B BESNOITI CD Objet et domaine d application Les cellules VERO sont des cellules r nales de singe Documents de r f rence Fiche de description ATCC ref CCL 23 Principe de la m thode Cette lign e est constitu e de cellules adh rentes et donc soumise l action de la trypsine La croissance c
47. EU regulations Hazard Code Xn Harmful N Dangerous for the environment 26 In case of contact with eyes rinse immedi ately with plenty of water and seek medical advice S36 39 Wear suitable protective clothing and eye face protection S61 Avoid release to the environment Refer to special instructions safety data sheet Component 4 Washing Fluid Additive Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 5 Conjugate Diluent Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 6 Conjugate 30x Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 7 Chromogen TMB Substrate Ready to use Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 8 ES Stop Solution C Corrosive Hazard Code R35 Causes severe burns 526 In case of contact with eyes rinse immediately with plenty of water and seek medical advice 836 37 39 Wear suitable protective clothing gloves and eye face protection 545 In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show the label where possible Component 10 Positive Control Lyophilized Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 11 Weak Positive Control Lyophilized Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 12 Negative Control Lyophilized
48. Les r gions tudi es de l ARNr ITS 1 sont disponibles partir d une banque de g nes pour huit esp ces de Besnoitia Cette courte s quence g n tique environ 250 270 paires de bases permet de distinguer clairement les esp ces de Besnoitia des petits mammif res de celles des grands mammif res figure 3 Les r gions g nomiques de l ARN ribosomique de plusieurs nouveaux isolements de B besnoiti provenant du Portugal d Espagne d Isra l et d Allemagne ont t s quenc es Cortes et al 2006b Fern ndez Garc a et al 2009b Schares et al 2009 et ont montr quasiment 100 de similitude entre elles tout comme avec les esp ces de Besnoitia sp cifiques des ch vres B caprae des chevaux et nes B bennetti et des caribous et rennes B tarandi L analyse de la r gion g nomique de l ARNr a donc une utilit limit e pour la diff renciation des esp ces de Besnoitia Schares et al 2009 En outre trois nouvelles esp ces de Besnoitia ont t d crites chez les petits mammif res et le cycle volutif de deux d entre elles a t clarifi Dubey et al 2003b c Dubey et Yabsley 2010 Cependant les voies de transmission et le cycle volutif de la besnoitiose des grands mammif res demeurent encore nigmatiques 34 B Morphologie des diff rents stades parasitaires 1 Les ookystes Peteshev et son quipe furent les seuls donner une description morphologique en 1974 Non sporul s ils sont de forme ell
49. OATAO Open Archive Toulouse Archive Ouverte Open Archive TOULOUSE Archive Ouverte OATAO is an open access repository that collects the work of Toulouse researchers and makes it freely available over the web where possible This is an author deposited version published in http oatao univ toulouse fr Eprints ID 10732 To cite this version Lenfant Frangois Mise au point d une technique de diagnostic s rologique par immunofluorescence indirecte de la Besnoitiose bovine Besnoitia besnoiti Th se d exercice M decine v t rinaire Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse ENVT 2013 125 p Any correspondance concerning this service should be sent to the repository administrator staff oatao inp toulouse fr 35 ECOLES 7 NATIONALE VETERINAIRE Universit de Toulouse ANNEE 2013 THESE 2013 TOU 3 4060 MISE AU POINT D UNE TECHNIQUE DE DIAGNOSTIC PAR IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE DE LA BESNOITIOSE BOVINE A BESNOITIA BESNOITI THESE pour obtenir le grade de DOCTEUR VETERINAIRE DIPLOME D ETAT pr sent e et soutenue publiquement devant l Universit Paul Sabatier de Toulouse par LENFANT Francois N le 21 avril 1987 POITIERS 86 Directeur de th se M Emmanuel LIENARD JURY PRESIDENT M Alexis VALENTIN Professeur l Universit Paul Sabatier de TOULOUSE ASSESSEURS M Emmanuel LIENARD Maitre de Conf rences l Ecole Nationale V t rinai
50. Package Insert Additional Material Required General Laboratory equipment according to national safety regulations Demineralized water or water of equal quality must be used Dummy plate used for sample dilution e g clear colorless round bottom 96 well plate or equivalent Single channel pipette 10 100 pl Single channel pipette 20 200 Multichannel pipette 5 50 pl Multichannel pipette 50 300 yl Pipette tips as recommended by pipette manufacturer Solution reservoirs Vortex Sample preparation Appropriate blood collection Tubes for serum collection Analysis of Results Plate Reader e g Tecan Sunrise or equivalent The reader has to have an appropriate filter set to read the plates at 450 nm Optional Plate washer e g Tecan Tray Washer or equivalent Test Procedure Precautions National guidelines for working with animal samples must be strictly followed The PrioCHECK Besnoitia Ab must be performed in laboratories suited for this purpose Samples should be considered as potentially infectious and all items which contact the samples as potentially contaminated Chemical hazard data are available in section Safety Regulations and R amp S Statements Appendix IV Notes To achieve optimal results with the PrioCHECK Besnoitia Ab the following aspects must be consid ered The Test Procedure protocol must be strictly followed Pi
51. a 77 gt Au lieu de prendre en compte ces trois domaines figure 14 o se r partissent les bandes du WB Schares et al 2010 consid rent 10 bandes diff rentes figure 15 aussi bien pour les tachyzoites 45 40 37 34 30 27 22 17 16 et 15 kDa que pour les bradyzoites 41 36 33 28 26 24 23 22 20 et 18 kDa Ces 10 bandes se r partissent dans les domaines II et III cit s pr c demment le domaine I n est plus exploit car trop de r actions crois es avec d autres parasites en proviennent La sensibilit est de 90 et la sensibilit de 100 Avec une sp cificit de 10096 on carte tous les faux positifs possibles entre autre les r actions crois es avec des protozoaires proches telles que N caninum et T gondii Lors des ces tudes quelques animaux ont t diagnostiqu s cliniquement positifs mais s ron gatifs il pourrait s agir d immunotol rance Schares et al 2010 Garcia Lunar et al 2012 ont compar diff rents WB utilis s en Allemagne en Espagne et en France Les m thodes allemandes et espagnoles utilisant aussi bien les tachyzoites que les bradyzoites en condition non r duit ont donn les meilleurs r sultats avec quasiment 100 de sensibilit et de sp cificit Le test WB employ l ENV Toulouse utilisant des tachyzoites en condition r duit a donn 90 9 de sensibilit et 98 5 de sp cificit Les diff rences observ es peuvent tre expliqu es par les diff rents protocole
52. ains auteurs Cortes et al 2007a Schares et al 2011 ont d j mis au point des tests PCR et RT PCR sur biopsies de peau de bovin qui permettent la d tection de B besnoiti m me dans des chantillons qui ont t recueillis partir d animaux s ropositifs mais asymptomatiques Un kit commercial est d j disponible en France Adiavet Besnoitia AES Adiagene Saint Brieuc France Fonclara 2011 a essay lors de ses travaux de th se de reproduire exp rimentalement les diff rentes phases de la maladie sur deux g nisses avec ce kit sur des pr l vements sanguins durant la phase f brile Ses r sultats n ont pas t concluants et elle pr cise qu il serait souhaitable de refaire les exp rimentations sur des cas d infection naturelle car le mod le d infection exp rimentale n est pas maitris Aussi le diagnostic pr coce i e dans la premi re phase clinique de la maladie ne repose encore aujourd hui que sur l exp rience du clinicien vis vis de la besnoitiose bovine Avec les outils actuels la confirmation s rologique ne survient au plus t t que 7 8 jours apr s l pisode f brile Schares et al 2013 l heure actuelle l enjeu majeur est de prot ger les levages et les r gions indemnes La strat gie globale est fond e sur l analyse du danger et du risque Le parasite Besnoitia besnoiti est identifi en tant que danger majeur En ce qui concerne le risque il comprend diff rents l ments 1 la distan
53. ainsi que des histiocytes affluent en tr s grand nombre sur les sites inflammatoires ce qui se traduit par la formation des Kystes Ces kystes se localisent pr f rentiellement au niveau de la peau des muqueuses des voies a riennes sup rieures de la conjonctive Ferri 1984 Les kystes deviennent m tures de 30 70 jours post infection et se stabilisent vers le 15 jour B Immunit Alzieu et al 2011 Le pouvoir immunog ne de Besnoitia besnoiti est encore tr s mal connu Seules quelques donn es scientifiques provenant d exp rimentations r alis es sur rongeurs prouvent l existence et l importance de la r ponse immunitaire m diation cellulaire Celle ci d pend en partie de l activation des macrophages partir de l interf ron gamma Cependant les kystes permettent au parasite d chapper au syst me immunitaire Leur devenir est variable soit les parasites survivent dans les kystes durant plusieurs ann es soit les parasites se multiplient la suite d une r activation Celle ci peut survenir suite une baisse de l immunit ou suite une maladie intercurrente Par contre l limination totale des kystes est peu probable 55 C Symptomatologie Il est observ que seule une petite proportion des animaux infect s d veloppe tout le cort ge des sympt mes La plupart des sujets contamin s 28046 deviennent porteurs latents asymptomatiques Les raisons de cette variation individuelle ne sont pas encore co
54. amples on the Test Plate for 60 1 minutes at room temperature 22 C 3 C Wash the Test Plate four times with 300 ul 1x Wash Fluid working solution see Appendix II Remark If you use a plate washer be sure that no needles are clogged CONJUGATE INCUBATION Preparatory Steps 5 Dilute the needed amount of Conjugate 30x 30 fold in Conjugate Diluent e g add 400 xl Conju gate to 11 6 ml Conjugate Diluent for one full plate see Appendix 11 Conjugate incubation Add 100 ul of the diluted Conjugate to each well of the Test Plate Incubate the Test Plate for 60 1 minutes at 22 C 3 C Wash the Test Plate four times with 300 ul 1x Wash Fluid working solution see Appendix II DINE GRUPOS DETECTION RAS AR igi Substrate reaction Add 100 of the Chromogen TMB substrate to each well of the Test Plate Incubate the Test Plate for 15 1 minutes at 22 C 3 C Add 100 of the Stop Solution to each well of the Test Plate Remark Start the addition of stop solution 15 1 minutes after the first well was filled with Chro mogen TMB Substrate solution Add the Stop Solution in the same order as the Chromogen TMB Substrate solution was dispensed Note The color of the Positive Controls will change from blue to yellow Detection Shake the Test Plate shortly 5 10 s either on an orbital shaker 300 rpm or manually on the working bench Read the Test Plate in the ELISA reader at 450 n
55. ant la mise l herbe mais en quantit moins importante Duvallet et Jacquiet observations personnelles Au contraire l activit des tabanid s est plus courte centr e sur les mois de juin juillet ao t Si on compare ces r sultats avec ceux cit s pr c demment comme quoi les taons poss dent un volume de pi ces buccales 32 fois sup rieur celui des stomoxes et que la taille de l inoculum parasitaire a une importance dans le d clenchement des signes cliniques alors on pourrait admettre que la saisonnalit des populations de taons juin juillet ao t pourrait expliquer le nombre important de cas cliniques estivaux de besnoitiose dans les r gions d enzootie comme dans les zones d pizootie Les stomoxes quant eux auraient une action prolong e expliquant des contaminations de faible intensit Alzieu et al 2011 b Via le mat riel d injection Si l on compare l insecte piqueur avec du mat riel v t rinaire l insecte interviendrait alors comme une simple seringue souill e transportant l agent pathog ne d un h te l autre On comprend alors qu une simple piqure utilisant la m me aiguille permettrait la transmission du parasite d un bovin un autre Moyen simple de prophylaxie qui d passe le cadre de cette i53 tude sur la besnoitiose il est donc primordial d utiliser des aiguilles usage unique dans des troupeaux reconnus infect s 2 Autres modes de transmission non clarifi s a Contamination
56. asco AO Godoy GS Pinto AA Machado RZ 2007 Neospora caninum infection in birds experimental infections in chicken and embryonated eggs Parasitol 134 1931 1939 Garc a Lunar P Ortega Mora L M Schares G Gollnick N S Jacquiet P Grisez C Prevot F Frey C F Gottstein B et Alvarez Garc a G 2013 An Inter laboratory Comparative study of serological tools employed in the diagnosis of Besnoitia besnoiti infection in bovines Transboundary Emer Dis 60 59 68 110 Genest C 2008 La besnoitiose bovine Besnoitia besnoiti enqu te s rologique et cologique dans un foyer d mergence du Maine et Loire Th se de doctorat v t rinaire Nantes 133p Goldman M and Pipano E 1983 Serological studies on bovine besnoitiosis in Israel Trop Anim Health Pro 15 32 38 Gollnick NS Gentile A Schares G 2010 Diagnosis of bovine besnoitiosis in a bull born in Italy Vet Rec 166 599 Gondim LS Abe Sandes K Uz da RS Silva MS Santos SL Mota RA Vilela SM Gondim LF 2010 Toxoplasma gondii and Neospora caninum in sparrows Passer domesticus in the Northeast of Brazil Vet Parasitol 168 121 124 Gottstein B Hentrich B Wyss R Th r B Bruckner L M ller N Kaufmann H Waldvogel A 1999 Molecular and immunodiagnostic studies of bovine neosporosis in Switzerland Schweiz Arch Tierheilkd 141 59 68 Gourreau JM Les photosensibilisations Maladies des bovins 3 dition 380 385 Irigoien M Del Cacho E
57. au moment de leur publication Prionics AG ne peut en aucun cas tre tenu pour responsable des dommages fortuits ou indirects li s l utilisation de ce document ou en r sultant Responsabilit Prionics AG garantit que ses produits sont conformes aux caract ristiques d crites sous r serve qu ils soient utilis s selon les instructions fournies et dans les d lais de conservation indiqu s Prionics AG exclut toute autre garantie explicite ou implicite y compris la garantie d aptitude la vente ou de conformit pour une utilisation particuli re La garantie mentionn e ici ainsi que les informations sp cifications et descrip tions des produits commercialis s par Prionics AG figurant dans les catalogues Prionics AG ou dans tout autre document ne peuvent pas tre modifi es sauf consentement crit express de Prionics AG Les pr sentations orales ou crites ou les publications non conformes cette garantie ne sont pas autoris es et sont sujettes caution En cas de rupture de la garantie l obligation de Prio nics AG se limite la r paration ou l change sa discr tion du produit ou d une partie du produit sous r serve que le client informe rapidement Prionics AG de cette rupture de garantie Au cas o la soci t Prionics AG ne pourrait pas r parer ou remplacer le produit ou une partie du produit elle devra rembourser au client l int gralit des sommes per ues pour ce produit ou pour partie de
58. au point de cette technique permettra de poser un diagnostic pr coce d s les premiers signes cliniques un moment o toute autre technique usuelle ne peut actuellement d celer une concentration encore insuffisante en anticorps Cela permettra de mettre en place une d marche th rapeutique encore plus t t c Immunofluorescence directe A la diff rence de l immunofluorescence indirecte IFI cette technique consiste mettre en vidence le parasite dans le sang et non la pr sence d anticorps anti B besnoiti Elle a t d velopp e par Li nard et al 2012 mais n est pour le moment pas utilis e en routine car il faut se trouver durant la phase f brile ou des d mes de la maladie D un point de vue technique le principe est quasiment le m me que pour l IFI il consiste extraire le parasite du sang du bovin contamin et de le fixer sur lame apr s h molyse et le mettre en contact avec du s rum de bovin contenant des anticorps anti B besnoiti La pr sence d un agent fluorescent permet la visualisation du parasite sous microscope au grossissement x400 2 M thodes dites indirectes s rologie L identification s rologique des bovins infect s asymptomatiques est importante pour emp cher l introduction de bovins infect s dans des troupeaux n ayant jamais rencontr le pathog ne a Immunofluorescence indirecte L immunofluorescence indirecte repose sur une r action sp cifique entre l antig ne
59. aux r alis s sur gerbilles par Shkap et son quipe ont montr l efficacit des t tracyclines 100 mg kg PV mais ces posologies restent non utilisables sur bovin Alzieu et al 2011 Des tudes in vitro ont d montr l efficacit du thiazolide nitazoxanide et de diff rents d riv s de ce produit contre besnoiti cultiv dans des cellules Vero Cortes et al 2007b mais d autres tudes sont n cessaires pour rechercher le traitement in vivo des infections B besnoiti L utilisation du toltrazuril est une piste en cours d exploration mais extr mement on reuse la posologie recommand e de 40 mg kg per os chez des bovins adultes et hors A M M B Mesures de pr vention Prophylaxie m dicale L utilisation d antibiotique par mesure pr ventive est inconcevable La vaccination quant elle est discutable mais pour le moment elle est indisponible en Europe Jacquiet et al 2010 En Afrique du Sud les mesures de prophylaxie m dicale font appel un vaccin vivant att nu celui ci pr par partir de tachyzoites r colt s sur une souche de Besnoitia besnoiti provenant du Gnou bleu L immunit m diation cellulaire mise en place dure 4 ans Euz by 1987 et pr vient l apparition des sympt mes Cependant les animaux restent porteurs asymptomatiques En Isra l la pratique vaccinale mise en place depuis 1986 sur les taureaux reproducteurs donne de tr s bons r sultats Pipano et al 1997 Les vaccins vi
60. be infected Affected animals undergo different stages of disease including skin thickening swelling hair loss and skin necrosis bulls can get infertile In severe cases the disease can lead to death of the animal Subclinically infected animals play an important role in the epidemiology of the disease The parasite might be transmitted to other animals by insect vectors namely biting flies like Tabanus and Stomoxys but probably also mosquitoes can function as a vector The cysts 200 600 um in diameter are found in subcutaneous tissue fascia and mucosa of the infected animals and can survive for over ten years in the host Besnoitia besnoiti can cause substantial economic losses and therefore it is crucial to identify infected animals The PrioCHECK Besnoitia Ab is an ELISA which can be used for the detection of antibodies against this parasite in infected cattle The PrioCHECK Besnoitia Ab is an excellent tool to screen cattle herds in order to identify infected animals Identifying infected ani mals is important to avoid spreading of the disease and also to avoid introducing infected animals into a new herd Test Principle 3 SAMPLE PREPARATION sun E Deren Pr 2 gaupe ineusation FI Derim Pine tea Pure lt ster a Piae waster 3 CONJUGATE INCUBATION 0 min wasn sree Hee Vistas pereetion 15 ran o Le IME bestrate o
61. bovins s ropositifs Neospora caninum ou Toxopasma gondii par ELISA n 57 Une tude parall le a t r alis e pour valuer la sp cificit de l Immunofluorescence indirecte IFI en recherchant d ventuelles r actions crois es avec les anticorps dirig s contre N caninum et T gondii des parasites proches appartenant au phylum des Apicomplexa et Dep tir 88 32 proviennent de bovins lev s en Ari ge et nous ont t transmis par le Dr Jean Pierre Alzieu du Laboratoire V t rinaire D partemental de l Ari ge Les s rums utilis s pour tudier l Ecole Nationale V t rinaire de Maisons Alfort La s ropositivit N caninum avait t mise en vidence par ELISA et celle de 7 gondii avait t mise en vidence par Agglutination Directe Haute Sensibilit ADHS Tous les s rums se sont r v l s n gatifs vis vis de B besnoiti lors de leur examen par WB 4 Autres s rums n 4 Quatre s rums n ont pas t test s par ELISA d o l impossibilit de les faire appartenir un des groupes pr sent s ci dessus Trois sont WB n gatifs et un WB positif Ils ont toutefois t int gr s pour la comparaison entre l IFI et le WB B Production de Besnoitia besnoiti Les parasites B besnoiti utilis s pour la pr paration des lames d IFI ont t obtenus partir d une vache de race Aubrac naturellement infect e au dernier stade de la maladie et autopsi e l ENV de Toulouse Le protoc
62. ce g ographique entre un levage ou une r gion infect e et un levage ou une r gion indemne 2 l achat d un bovin potentiellement infect dont le statut de l levage d origine n est pas connu cas le plus fr quent 3 le syst me d levage o on peut observer un m lange de bovins provenant de diff rents cheptels cas de la transhumance Au niveau national cette strat gie globale de contr le en cours d laboration vise harmoniser les connaissances cliniques pid miologiques et la conduite diagnostique afin d am liorer les pratiques d levage Cela passe entre autre par un contr le s rologique individuel lors d achat de bovin provenant de r gions infect es Ainsi la standardisation et la validation des tests s rologiques est la premi re tape vers le contr le de la maladie car cela permettrait d obtenir des r sultats comparables dans des pays diff rents Ainsi id alement chaque pays pourrait adopter des proc dures de diagnostic communes pour le contr le de la maladie 105 N Universit ECOLE NN NATIONALE lt Paul Sabatier VETERINAIRE NEA AGREMENT SCIENTIFIQUE En vue de l obtention du permis d imprimer de la th se de doctorat v t rinaire Je soussign LIENARD Emmanuel Enseignant chercheur de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse directeur de th se certifie avoir examin la th se de Fran ois LENFANT intitul e Mise au point d une techn
63. ce produit Prionics AG ne peut tre tenu pour responsable des fortuits particuliers ou indirects y compris ceux r sultant d une perte ique ou d un dom mage mat riel subis par un client suite l utilisation de ses produits Prionics AG est une entreprise certifi e ISO 9001 2000 Annexe Il Pr paration de la solution de travail de lavage et du conjugu Solution de travail de lavage M langer les volumes indiqu s d Eau d min ralis e et de Solution de lavage 20x Composant 3 Ajouter 0 196 d Additif pour solution de lavage Composant 4 la solution et m langer correctement pour obtenir le volume d sir de solution de travail de lavage Transf rer 50 ml de Solution de lavage 20x Composant 3 dans un flacon de 2 I Ajouter 950 mi d eau d min ralis e et m langer Ajouter 1 ml d Additif pour solution de lavage Composant 4 m langer correctement jusqu tes PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 Appendix IV Safety Regulations and R amp S Statements National Safety Regulations must be strictly fol lowed R amp S Statements Component 1 Test Plate Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 2 Sample Diluent Ready to use Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 3 Irritant Washing Fluid 20x R43 May cause sensitization by skin contact 24 Avoid contact with skin S37 Wear s
64. d 2003 Cortes et al 2006b Alzieu et al 2007b Apr s contamination par B besnoiti on peut d finir trois formes de clinique diff rentes une petite proportion des animaux d veloppe les signes cliniques typiques de la maladie une plus grande proportion compte des individus s ropositifs pr sentant des kystes scl ro conjonctivaux et la plus grande partie est repr sent e par les animaux s ropositifs asymptomatiques Pols 1960 Bigalke 1968 Goldman et Pipano 1983 Ferri 1984 Freudiger 2008 Dans les zones enzootiques comme le sud ouest de la France la pr valence de cas cliniques se situe entre 1 et 10 par an et l incidence se situe entre 2 et 5 Legrand 2003 Dans les zones pizootiques o la maladie merge comme dans l est de la France plus de 15 2096 des animaux nouvellement contamin s pr sentent les signes typiques de la maladie Jacquiet et al 2009 Dans l ouest de la France les cas cliniques restent tr s sporadiques mais la proportion d individus s ropositifs est lev e voire souvent tr s lev e gt 50 Berhault 2008 Genest 2008 48 B Epid miologie analytique Le caract re contagieux de la besnoitiose bovine est illustr par l allure pizootique qu elle peut prendre dans certaines r gions Une fois install e dans un levage l infection B besnoiti se r pand au sein du troupeau comme cela pu tre observ dans une tude s rologique long terme d une c
65. dais Herin 1952 Bovine cutaneous globidiosis Anglais Pols 1954 Elephant skin disease Anglais Schulz 1960 Bovins besnoitiosis Anglais Pols 1960 Bovine cutaneous sarcosporidiosis Anglais Pols 1960 Besnoitiose bovine Fran ais Euzeby 1980 Tableau 1 Synonymie chronologique de la besnoitiose bovine d apr s Jeuland 2010 C Historique Ferri J 1984 Franc M 1987 Legrand P 2003 Jacquiet et al 2010 lvarez Garc a et al 2013 Depuis l Antiquit la besnoitiose bovine intrigue et fascine Les premi res descriptions datent de la fin du IVe si cle lorsque VEGECE nonce les sympt mes de la phase terminale de la maladie qu il d nomme alors l phantiasis En 1817 SANTIN v t rinaire dans le Tarn d crit d une mani re tr s imag e les phases d oed mes et de scl rodermie en ces endroits o il existe des engorgements le dess chement de la peau prend l apparence d un cuir tann elle tombe en lambeaux et s exfolie comme l corce d un platane En 1840 GELLE apr s avoir tudi quelques cas chroniques s v res de la maladie la d finit comme une l pre une l pre l phantiasique ou bien encore d l phantiasis tuberculeux En 1843 LAFORE fait la distinction entre une phase aigu et une phase chronique de la maladie En 1858 LAFOSSE distingue 3 phases d but tat et d clin En 1869 CRUZEL nous expose les premiers l ments pid miologiques l l phantiasis pourrait tr
66. dans un levage auparavant indemne Alzieu et al 2010 82 b Le contr le dans les cheptels infect s Il consiste en l limination des animaux malades porteurs latents du parasite m me cliniquement gu ris ainsi que des animaux pr sentant des kystes oculaires Il s agit l de la population haut risque de transmission du parasite En plus il est n cessaire de tester la s ropr valence par ELISA dans le reste du troupeau Si la s ropr valence est faible 10 l limination des animaux s ropositifs est envisageable si les cheptels voisins sont a priori sains test s n gativement par ELISA De plus il est absolument primordial d instaurer un contr le s rologique l achat de tout nouvel individu dans le cheptel Si la s ropr valence est lev e gt 3096 l limination des animaux s ropositifs est conomiquement difficilement envisageable manque gagner co t de renouvellement L leveur doit vivre avec la maladie et d apr s des observations de terrain il semble qu un relatif tat de stabilit end mique se mette en place progressivement avec terme peu de cas cliniques Il est tout de m me important de ne pas n gliger le contr le des insectes vecteurs pour limiter les transmissions et l apparition de nouveaux cas cliniques c Lecontr le et la protection en cheptels indemnes Il consiste en plusieurs principes de protection un contr le s rologique obligat
67. des anticorps dirig s contre les produits d excr tion s cr tion par exemple et tre en quantit encore insuffisante au moment de l analyse Ainsi un s rum d tect positif en WB pourrait tre d tect positif au 1 100 mais n gatif au 1 200 en IFI et devenir pleinement positif en IFI la dilution seuil de 1 200 une deux semaines plus tard L Immunofluorescence indirecte mise au point dans cette tude a d montr la complexit de l interpr tation de la fluorescence qui ne se fait en pratique que par un seul manipulateur On souligne ici une des principales difficult s de ce test qui demande tre r alis toujours par la m me personne car l interpr tation des r sultats est tr s subjective ce qui fait de l IFI un test difficile standardiser Cependant pour am liorer la fiabilit chaque lecture une lame pr sentant un s rum t moin positif et un t moin n gatif tait parcourue en premier Par ailleurs l IFI est une m thode assez lourde mettre en place mais pouvant tre utilis en routine car les lames peuvent tre pr par es l avance et congel es 80 C En raison de son excellente sp cificit l IFI peut tre utilis e pour confirmer les r sultats obtenus par d autres tests i e ELISA ou r soudre les ambiguit s lors de r sultats discordants entre le WB et l ELISA Un test s rologique pr tendant tre Gold standard doit tre 1 assez sensible pour d tecter une infection du
68. e D Importance La besnoitiose bovine a suscit peu d int r t jusqu la fin du 20 si cle En France la maladie tait jusque l seulement rencontr e dans le Sud Ouest Des cas cliniques sont maintenant r guli rement rapport s dans les Alpes frangaises le Massif Central et occasionnellement dans la r gion de la Loire Alzieu et al 2007a Aujourd hui on la consid re comme une maladie vectorielle mergente en France et en Europe et en forte extension g ographique EFSA 2010 C est une maladie tr s pr occupante d un point de vue m dical et zootechnique qui risque d affecter les changes nationaux et internationaux La besnoitiose bovine s ach te et doit donc tre syst matiquement d pist e lors de nouvelles transactions Alzieu et al 2011 31 II ETIOLOGIE A Syst matique Domaine Phylum Classe Sous classe Ordre Sous ordre Famille Sous famille Genre Esp ce Eukaryota Chatton 1925 Apicomplexa Levine 1970 Conoidasida Levine 1988 Coccidia Leuckart 1879 Eucoccidiorida L ger amp Duboscq 1910 Eimeriorina L ger 1911 Sarcocystidae Poche 1913 Toxoplasmatinae Biocca 1957 Sarcocystinae Poche 1913 Hammondia Frenkel 1974 Besnoitia Henry 1913 Neospora Dubey et al 1988 Toxoplasma Nicolle amp Ma
69. e 96 8 Leurs travaux ont clairement montr que les animaux dont les r sultats sont non interpr tables par le Prio CHECK Besnoitia Ab i e animaux avec des valeurs entre 10 et 20 devraient tre consid r s comme infect s En consid rant un seuil d cisionnel 10 la sp cificit du diagnostic a t calcul e en dessous de 95 donc les r sultats positifs obtenus avec le PrioCHECK 9 Besnoitia Ab doivent tre confirm s par d autres tests s rologiques A ce m me seuil de positivit de 10 la sensibilit a t grandement am lior e 91 8 L abaissement du seuil d cisionnel en dessous de 1096 ne permettrait pas d obtenir des r sultats satisfaisants puisque le nombre de faux positifs augmenterait de facon spectaculaire A la diff rence des observations faites par Cortes et al 20062 il a t observ durant cette valuation des r actions crois es avec N caninum Des retours de terrain sur l utilisation du test ProCHECK 9 Besnoitia Ab ont permis de mettre en vidence plusieurs points int ressants 0 il existe souvent une faible proportion d animaux dont les r sultats sont proches du seuil de positivit Il s agit sans doute des quelques r actions crois es avec N caninum Ces animaux sont tester de nouveau avec un WB Alzieu et al 2011 2 la pr sence de kystes bradyzoites dans la peau ou la scl re assure une stimulation antig nique permanente g n ratrice d une r ponse anticorp
70. e PELISA par rapport au WB Gold standard en consid rant les 342 s rums pr sentant un r sultat ELISA groupes standards et douteux D Performances de l IFI Lorsque l on applique un seuil de positivit la dilution 1 100 PIFI montre sept faux n gatifs et quinze faux positifs tableau 7 traduisant une sensibilit tableau 8 de 94 3 95 IC 88 5 97 7 et une sp cificit de 94 7 95 IC 91 4 97 0 ce m me seuil la VPP est de 88 5 95 IC 81 7 93 4 et la VPN est de 97 4 95 IC 94 8 99 0 Avec un seuil appliqu la dilution 1 200 la sensibilit a l g rement diminu 91 8 95 IC 86 9 96 7 alors que la sp cificit a augment 100 Ceci est d respectivement l augmentation des faux n gatifs n 10 et la disparition des faux positifs A ce m me seuil la VPP est de 100 et la VPN est de 96 6 95 IC 93 8 98 3 Pour les deux derniers seuils correspondant aux dilutions 1 400 et 1 800 on a observ une importante diminution de la sensibilit avec respectivement 75 4 95 IC 66 8 82 8 et 51 6 95 IC 42 4 60 8 et une constance de la sp cificit 100 L importante diminution de la sensibilit est due l augmentation des faux n gatifs 30 la dilution 1 400 et 59 la dilution 1 800 A la dilution 1 400 la VPP est de 100 et la VPN de 90 4 95 IC 86 5 93 4 Enfin la dilution 1 800 la VPP est de 100 et
71. e and stable flies Med Vet Entomol 16 177 185 Shkap V Ungar Waron H Pipano E et Greenblatt C 1984 Enzyme linked immunosorbent assay for detection of antibodies against Besnoitia besnoiti in cattle Trop Anim Health Pro 16 233 238 Shkap V De Waal DT Potgieter FT 1985 Chemotherapy of experimental Besnoitia besnoiti infection in rabbits Onderstepoort J Vet Res 52 289 Shkap V Pipano E Marcus S Krigel Y 1994 Bovine besnoitiosis transfer of colostral antibodies with observations possibly relating to natural transmission of the infection Onderstepoort J Vet Res 61 273 275 Shkap V Reske A Pipano E Fish L Baszler T 2002 Immunological relationship between Neospora caninum and Besnoitia besnoiti Vet Parasitol 106 35 43 113 Smith D D and Frenkel J 1977 Besnoitia darlingi protozoa toxoplasmatinae cyclic transmission by cats J Parasitol 63 1066 1071 Staubli D 2006 Neospora caninum immunoblotting improves serodiagnosis of bovine neosporosis Parasitol Res 99 648 658 Tenter AM and Johnson AM 1997 Phylogeny of the tissue cyst forming coccidia Adv Parasit 39 69 139 Tenter Astrid M Barta J R Beveridge I Duszynski D W Mehlhorn H Morrison D A Andrew Thompson R C et Conrad P A 2002 The conceptual basis for a new classification of the coccidia Int J Parasitol 32 595 616 Waap H Cardoso R Marcelino E Malta J Cortes H et Leit o A 2011 A modified agglut
72. e sont pas franchement clarifi s Diesing et al 1988 Schares 2011 Olias et al 2011 La transmission horizontale entre bovins via des contaminations transcutan es par les insectes h matophages est probablement la plus r pandue Il a t d montr que Stomoxys calcitrans et les esp ces de Tabanid s peuvent agir comme des vecteurs m caniques de B besnoiti Bigalke 1968 Ainsi un pic saisonnier de populations d insectes h matophages influence grandement le nombre de bovins nouvellement infect s dans les levages Li nard et al 2011 L avenir d un cheptel d pend souvent de la pr cocit du diagnostic Il existe de nombreuses m thodes s rologiques pour confirmer les suspicions cliniques ou pour d tecter les animaux infect s y compris les asymptomatiques Celles ci ont t am lior es il s agit de l Immunofluorescence indirecte de l ELISA du Western Blot et de la PCR Goldman et Pipano 1983 Shkap et al 1984 Cortes et al 2006a b 2007 Fern ndez Garc a et al 2009b Schares et al 2010 A la diff rence du Portugal de l Espagne et de l Allemagne en France l immunofluorescence indirecte n est pas encore utilis e en routine pour le diagnostic de la besnoitiose B besnoiti L objet de cette tude a t la mise au point de cette technique afin qu elle puisse tre utilis e quotidiennement au service de parasitologie de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse 25 Le premier chapitre est u
73. e une de ces affections que l on attribue la pr sence d insectes ou de zoophytes microscopiques En 1912 BESNOIT et ROBIN professeurs l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse isolent le parasite partir de l sions cutan es et prouvent ainsi l tiologie parasitaire de la besnoitiose En 1936 CUILLE arrive transmettre la maladie des bovins sains partir d injection intraveineuse de sang de bovins contamin s en phase f brile 30 En 1954 POLS r alise une tude approfondie sur la maladie et permet l isolement du protozoaire dans le sang de bovins contamin s en phase f brile En 1968 BIGALKE expose l aspect contagieux de la maladie entre bovins et d montre l importance de vecteurs m caniques dans la transmission En 1974 PETESHEV propose un cycle pid miologique avec pour h te d finitif le chat le bovin tant l h te interm diaire Cependant ses r sultats n ont pas t d montr s par des tudes ult rieures L h te d finitif demeure encore inconnu Le mode de transmission majoritaire de bovin bovin se r aliserait par la piq re d insectes h matophages Aujourd hui cela fait un si cle que l tiologie parasitaire t d montr e De nombreux pays europ ens Allemagne Portugal Espagne France Suisse etc continuent les recherches sur la maladie ax es essentiellement sur les techniques diagnostiques permettant de d celer la maladie le plus t t possibl
74. ellulaire est rapide et la confluence est atteinte en 48 72 h Les cellules VERO sont repiqu es par trypsinisation puis cultiv es en tuve 37 C et 5 de CO2 en MEM complet constitu de DMEM 1X d acides amin s non essentiels 1X de p nicilline et de streptomycine Nystatine et SVF d compl ment 56 C pendant 30 minutes e Mat riel n cessaire Flacon de culture cellulaire 25 75 ou 175 cm2 Plaque de culture cellulaire P6 P24 ou P96 Pipettes st riles de 25 ml 10 ml 5 ml et 1 ml Tubes coniques Falcon de 50 ml Multipette Pipet aid R actifs Trypsine EDTA Invitrogen Ref 25200 056 DMEM glutamax Invitrogen Ref 31965 023 Acides Amin s Non Essentiels 100X Invitrogen Ref 11140 035 P nicilline et Streptomycine 10000 U ml et 10000 Og ml Invitrogen Ref 15140 122 S rum de Veau Foetal SVF test pour la culture cellulaire et indemne de mycoplasme et de BVDV Eurobio ref CVFSVFO0O 01 Nystatine SIGMA Ref N 1638 100ml PBS Invitrogen Ref 18912 014 118 Q Milieu complet pour la culture de cellules VERO Milieu VERO MEM IX 435 ml AANE 100X 5ml Nystatine 5ml P nicilline et Streptomycine 5ml 10 de s rum de veau foetal d sactiv 50 ml E Mode op ratoire Tous les produits milieu complet trypsine milieu MEM seul doivent tre temp rature ambiante pour manipuler sortis du frigo laisser minimum 1 H sur la paillasse
75. en Ne 41 a Cycle pid miologique de Besnoitia besnoiti sch matisation 41 b Cycle h t rox ne de chat bovin d importance mineure 41 c Cycle homox ne de bovin bovin d importance capitale 43 ITI EPIDEMIOLOGIE naenin nno E Doe rU bier edd 44 A Epid miologie descriptive 44 1 R partition g ographique SSSR Gne 44 a Distribution l chelle mondiale 44 b Distribution l echelle nationalen tannins 45 2 Facteurs de sensibilit et de 46 dE AGC nent Oaae tases 46 DET S c 46 sante A D 47 d Lemod 47 ONES SAISON MET 47 Soy Prevalence et Incidente oos telo petat mute eati idus sapie nt ne cete dus 48 B Epid miologie analytique 49 1 Transmission pat vole transcutan e 49 a Via les arthropodes 49 b Via de mat riel d injection ssec eti qe s Puts nette tiens 53 2 Autres modes de transmission non clarifi s 54 a Contamination par voie orale et par contact direct 54 b Transmis
76. ent au sein de cette esp ce parasitaire Les tests s rologiques actuels utilisent des conjugu s anti IgG totaux et ne donnent pas acc s ainsi une discrimination des isolats en fonction de leur origine g ographique suivant leur profil antig nique Waap et al 2011 Garcia Lunar et al 2012 Toutefois deux publications soutiennent l hypoth se de diversit la fois g n tique et de virulence concernant B besnoiti sugg rant la possibilit de souches diff rentes Des variations de taille des microsatellites entre des isolats d Italie deux isolats identiques d Allemagne et d Isra l corr l e la distance g ographique entre ces isolats ont t mises en vidence Madubata et al 2012 En outre en Afrique du Sud la virulence semble diff rente entre une souche isol e partir de bovins domestiques virulence marqu e et celle isol e du Gnou bleu Connochaetes taurinusi de virulence moindre Shkap et al 1985 Cette souche sauvage a t exploit e dans le d veloppement et la commercialisation d un vaccin vivant att nu en Afrique du Sud La concentration de tachyzoites permettant une lecture optimale des r sultats sans perte de sensibilit ni sp cificit a t trouv 2 10f mI Cette concentration est la m me que celle fix e par Shkap et al 2002 mais inf rieure l IFI d velopp e par Schares et al 2010 qui tait de 5 10 ml L optimisation de cette tape a permis d am liorer la
77. eospora caninum infection Parasitol Res 80 50 53 Rommel M 1975 New knowledge on the biology of Coccidia Toxoplasma Sarcosporidia and Besnoitia Berl Munch Tierarztl Wochenschr 88 112 117 Sannusi A 1991 A simple field diagnostic smear test for bovine besnoitiosis Vet Parasitol 39 185 188 Schares G Basso W Majzoub M Cortes HC Rostaher A Selmair J Hermanns W Conraths FJ Gollnick NS 2009 First in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from chronically infected cattle in Germany Vet Parasitol 163 315 322 Schares G Basso W Majzoub M Rostaher A Scharr J C Langenmayer M C Selmair J et al 2010 Comparative evaluation of immunofluorescent antibody and new immunoblot tests for the specific detection of antibodies against Besnoitia besnoiti tachyzoites and bradyzoites in bovine sera Vet Parasitol 171 32 40 Schares G Basso W Majzoub M Rostaher A Scharr JC Langenmayer MC Selmair J Dubey JP Cortes HC Conraths FJ Haupt T P rro M Raeber A Buholzer P Gollnick NS 2011 Evaluation of a commercial ELISA for the specific detection of antibodies against Besnoitia besnoiti Vet Parasitol 175 52 59 Schares G Langenmayer M C Scharr J C Minke L Maksimov P Maksimov A Schares S et al 2013 Novel tools for the diagnosis and differentiation of acute and chronic bovine besnoitiosis J Parasitol 43 143 154 Schofield S and Torr S J 2002 A comparison of the feeding behaviour of tsets
78. es Ce comportement pourrait favoriser la transmission intra troupeau et freinerait la transmission inter troupeau m me si celle ci n est pas exclue pour autant De la m me mani re d apr s Schofield et Torr 2002 et Doyle et al 2011 Stomoxys calcitrans poss de des pi ces buccales de grande taille et une piq re douloureuse comme les tabanid s ce qui provoque des r actions de d fense de la part des bovins qui interrompent les repas de sang Les mouches d table vont alors achever leur repas sur les animaux proches et assureraient ainsi une transmission m canique du parasite La probabilit pour un insecte d tre d rang durant son repas d pend de la douleur de la piq re Au niveau de la localisation des piq res les mouches ts ts piquent plut t sur les membres et l abdomen les mouches plates sur la r gion p rin ale les stomoxes sur les parties basses des membres les taons au niveau du poitrail ou des paules les esp ces Siphona sur le bas du dos et les simulies plut t sur la t te les membres et l abdomen Lapage 1962 3 La dynamique saisonni re Les tudes r centes men es par Li nard et al 2011 montrent que les stomoxes adultes ont une activit tal e dans le temps On en retrouve en p tures de mai octobre pic de population dans le Sud Ouest fran ais certaines fois jusqu mi d cembre et l int rieur des tables en fin d hiver d but de printemps soit av
79. es d couvertes d abattoir entrainant parfois des saisies totales Ces parasites de part leur proximit phylog n tique avec Besnoitia spp sont susceptibles d entrainer des r actions crois es mais cette piste n a pas encore pu tre explor e Il n a pas t possible enfin de d terminer si les animaux cliniquement atteints taient d tect s par l IFI du fait du mode de recrutement des chantillons s rologiques Les r sultats la dilution 1 200 ont t facilement interpr tables par microscopie optique ultraviolets les r actions positives ont pr sent une fluorescence distincte et ininterrompue sur la p riph rie des tachyzoites et les r actions n gatives ont pr sent une absence nette de fluorescence sur la totalit ou par portion de la p riph rie du parasite En consid rant la totalit des s rums test s par ELISA n 342 le meilleur accord entre l ELISA et le Western Blot a t observ la DO de 20 avec un coefficient de kappa gal 0 732 95 IC 0 658 0 805 correspondant une sensibilit de 90 4 95 IC 83 8 94 9 et une sp cificit de 85 3 95 IC 79 8 89 7 Un seuil d cisionnel correspondant la DO de 20 n est pas en accord avec le fabricant qui a fix un seuil une DO de 15 pour la version 2 0 utilis e Par contre la version 1 0 avait fix un seuil une DO de 20 En utilisant un seuil d cisionnel une DO inf rieure e g 10 et 15 on augmente la sensib
80. es en Suisse Lesser et al 2012 en Italie Gollnick et al 2010 Mutinelli et al 2010 et en Allemagne Mehlhorn et al 2009 C est en France qu elle fut pour la premi re fois d crite l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse au d but du 20 si cle par Besnoit et Robin 1912 La maladie se compose de trois phases f brile ced mes scl rodermie De lourdes pertes conomiques sont observ es dans les levages atteints dues une st rilit transitoire ou d finitive chez les taureaux des avortements des diminutions de la production laiti re des mortalit s et des diminutions de la condition corporelle entrainant des non valeurs conomiques Pols 1960 Cortes et al 2005 Toutefois les animaux malades ne constituent qu une petite partie des animaux infect s Alzieu et al 2011 En effet plusieurs enqu tes pid miologiques europ ennes ont r v l la proportion plus importante d animaux infect s asymptomatiques s ropositifs et porteurs de la maladie Alzieu et al 2012 La besnoitiose circule en Europe la suite d changes commerciaux comme en t moigne les pizooties r centes dans le massif Central les Alpes fran aises et occasionnellement dans la r gion de la Loire Alzieu et al 20072 Un si cle apr s sa premi re description la maladie reste toujours myst rieuse sur de nombreux points En particulier le cycle volutif de B besnoiti et les voies de contamination qui n
81. escription of Besnoitia tarandi Protozoa Apicomplexa from the reindeer Rangifer tarandus Int J Parasitol 34 1273 1287 Dubey JP Schares G Ortega Mora LM 2007 Epidemiology and control of neosporosis and Neospora caninum Clin Microbiol Rev 20 323 367 Dubey J P and Yabsley M J 2010 Besnoitia Neotomofelis N Sp Protozoa Apicomplexa from the Southern Plains Woodrat Neotoma Micropus Parasitol 137 1731 1747 Ellis J T Holmdahl O J Ryce C Njenga J M Harper P A et Morrison D A 2000 Molecular phylogeny of Besnoitia and the genetic relationships among Besnoitia of cattle wildebeest and goats Protist 151 329 336 Elphick J 2007 The Atlas of Bird Migration Struik Publish 176 European Food Safety Authority 2010 Bovine besnoitiosis an emerging disease in Europe EFSA Journal 8 1499 Euzeby J 1987 Protozoologie m dicale compare Les protozooses des animaux et leurs relations avec les protozooses de l Homme avec tudes des arthorpodes h matophages 109 vecteurs de protozoaires Volume II Myxozoa Microspora Acetospora Apicomplexa 1 Coccidioses sensus lato Fondation Marcel M rieux Everitt BS 1989 Statistical methods for medical investigations Oxford Univ Press London United Kingdom Fern ndez Garc a A Risco Castillo V Pedraza D az S Aguado Mart nez A Alvarez Garc a G G mez Bautista M Collantes Fern ndez E Ortega Mora LM 2009b First isolation
82. et l anticorps recherch anti B besnoiti Un deuxi me anticorps marqu par un fluorochrome et poss dant une haute affinit pour l anticorps primaire r v le le complexe antig ne anticorps On mesure la fluorescence au microscope ultraviolets la dilution 1 200 Une lame est positive si on observe une fluorescence sur tout le contour des tachyzoites L IFI permet la d tection des anticorps anti B besnoiti d s 10 jours apr s une injection intraveineuse et d s 22 jours apr s une injection sous cutan e de parasites Cette diff rence peut probablement tre due la diff rence de voie d administration de la dose et de la souche Janitschke et al 1984 74 En 2002 les travaux de Shkap ont montr qu il n existait pas de protection crois e entre B besnoiti et N caninum En revanche il a montr qu il existait des r actions crois es avec les anticorps anti N caninum lorsque le seuil de dilution pour la lecture tait fix en dessous de 1 200 Les r cents travaux de Schares 2010 ont galement mis en vidence des r actions crois es entre les anticorps de N caninum et les antig nes de B besnoiti De possibles r actions crois es ont t mises en vidence avec les anticorps anti T gondii Goldman et Pipano 1983 Schares et son quipe 2010 ont montr qu au seuil de dilution 1 100 la sensibilit et la sp cificit taient respectivement de 97 et 98 et qu au seuil de dilution 1 200 elle
83. et al 2011 Jacquiet et al 2010 La seule prophylaxie efficace reste donc sanitaire Les diff rentes mesures de contr les rel vent donc de principes de bases et sont adapter selon le type de cheptel rencontr a Les principes de base Une conduite tenir rigoureuse est la cl d une bonne gestion de la maladie En cas de mise en vidence de besnoitiose dans un troupeau auparavant indemne il est conseill de suivre 3 tapes la premi re indique comment g rer l animal malade d un point de vue sanitaire la seconde d taille la gestion du reste du troupeau et la derni re la gestion des insectes vecteurs figure 16 En fonction de l tat sanitaire du troupeau et apr s calcul de la s ropr valence on est en mesure de choisir une strat gie de gestion sanitaire adapt e CAS DE BESNOITIOSE ETAPE 1 ETAPE 2 ETAPE 3 Isolement et traitement du Contr le s rologique Strat gie insecticide bovin malade individuel imm diat sur la rigoureuse et p renne totalit du cheptel BV gt 6 mois et contr le d achat ELISA Western Blot sur les s rologies positives en ELISA Confirmation diagnostique obligatoire S ropr valence d finie par classes d ge Elimination syst matique Elimination possible des du malade abattoir s ropositifs euthanasie si conomiquement supportable Figure 16 Proposition de conduite tenir au cas de d pistage positif de besnoitiose
84. eux au microscope UV la dilution 1 200 a x400 b x1600 us 97 Photo 50 Observation de tachyzoites sur une lame de s rum douteux au microscope UV la dilution 1 400 a x400 b x 1000 deerat tete tereti dtr tte 97 23 LISTE DES ABREVIATIONS AANE Acides amin s non essentiels ADNr Acide d soxyribonucl ique ribosomal AMM Autorisation de mise sur le march DO Densit optique EFSA European food safety authority ELISA Enzyme linked immunosorbant assay ENV Ecole Nationale V t rinaire IC Intervalle de confiance IFI Immunofluorescence indirecte IgG Inmunoglobuline G ITS 1 Internal transcribed spacer 1 kDa kilodalton MEM Minimum essential medium PCR Polymerase chain reaction PV Poids vif RT PCR Real time polymerase chain reaction Sp Esp ce species Spp Esp ces species pluralis TTC Toutes taxes comprises VPN Valeur pr dictive positive VPP Valeur pr dictive n gative WB Western Blot coefficient kappa de cohen 24 INTRODUCTION La Besnoitiose bovine due au protozoaire Besnoitia besnoiti Marotel 1912 est une maladie vectorielle r pandu en Afrique en Asie et dans le sud ouest de l Europe Jacquiet et al 2010 Depuis 2010 la besnoitiose t d clar e comme tr s fortement mergente en Europe par l European Food Safety Authority EFSA Elle est responsable de r centes pizooti
85. eux cas le rep rage de ces kystes comme unique m thode diagnostique n est plus concevable car elle manque de sensibilit Photos 20 Phase de scl rodermie hyperk ratose et plis cutan s la phase interne des cuisses JP Alzieu 21 Phase de scl rodermie plis d hyperk ratose sur les membres et d pilations diffuses JP Alzieu 22 Phase de scl rodermie d formation intense des trayons et hyperk ratose t gumentaire P Jacquiet 60 CE Se IAN A CR me T der LOY Photos 23 Phase terminale maciation hyperk ratose d formations articulaires m lanose des muqueuses et de leur pourtour JP Alzieu 24 Phase terminale hyperk ratose d formations articulaires P Jacquiet 61 Photos 25 Phase terminale hyperk ratose d pilation l phantiasis P Jacquiet 26 Phase terminale hyperk ratose et m lanose du pourtour du mufle JP Alzieu 27 Phase de scl rodermie kystes sur le limbe scl ro corn en et la conjonctive Hyperk ratose cutan e p rioculaire avec formation de plis et d pilations JP Alzieu 62 d 4 dU NET dau F z Photo 28 Phase de scl rodermie kystes sur le limbe scl ro corn en et la conjontive palp brale P Jacquiet 63 D L sions macroscopiques Franc et al 1987 Legrand 2003 Durant les 2 premi res phases de la maladie les l sions dominante congestivo h morragique voquent un tableau septic m
86. fected animals and remain in the animal for years Besnoitia besnoiti infections are likely to cause sub stantial economic losses and bovine health impair ment Therefore the identification of infected animals and of subclinical infected animals is crucial The PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 has been designed to detect antibodies specific for Besnoitia besnoiti in serum and plasma of bovines The PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 is an excellent tool to screen cattle herds in order to identify infected animals Identifying infected animals is important to avoid spreading of the disease and also to avoid introducing infected animals into a new herd Test Principle 1 SAMPLE PR PARATION Smin t w 4 1 Ux Wee ie meas 2 SAMPLE INCUBATION o min gt 2 de E x itio per 3 CONJUGATE INCUBATION 30 min p de D ses pee deu aus L B ch j IMB Searas E The diagnostic assay for detection of antibodies directed against Besnoitia besnoiti in bovine serum and plasma is based on ELISA technology Besnoitia antigen is coated on the ELISA plate Serum or plasma samples are incubated on the plate A peroxi dase POD labeled anti pig antibody is used for the detection of antibodies bound to the antigen Color using TMB substrate measured optically at a wavelength of 450 nm shows the presence of antibodies directed against Besnoitia besnoiti The
87. ganda Kenya Tanzanie Congo Angola Namibie Botswana et Afrique du Sud Pols 1960 Bigalke et al 1967 Franc 1987 au Moyen Orient Isra l et Kazakhstan en Asie Chine et Cor e du Sud Lee et al 1970 Peteshev et al 1974 Wang et Liu 1987 et en Am rique latine V n zuela Olias et al 2011 En Europe la besnoitiose bovine est enzootique dans trois pays du bassin m diterran en Portugal Cortes et al 2005 Espagne Irigoien et al 2000 et le sud de la France Besnoit et Robin 1912 Alzieu et al 2007a Ce n est que r cemment que la maladie chez les bovins a t reconnue comme mergente en Europe par l European Food Safety Authority EFSA 2010 depuis que plusieurs cas sporadiques ont t signal s en Italie Agosti et al 1994 Gollnick et al 2010 en Allemagne Mehlhorn et al 2009 Schares et al 2009 et pour la premi re fois en Suisse Lesser et al 2012 La besnoitiose B tarandi se retrouve pr f rentiellement au Canada en Alaska Etats Unis en Su de en Finlande et en Russie Olias et al 2011 La besnoitiose B caprae est quant elle r partie entre le Nigeria le Kenya et l Iran Olias et al 2011 Enfin la besnoitiose B bennetti est pr sente aux Etats Unis au Soudan en Afrique du Sud et a t signal e historiquement en France Olias et al 2011 Key Q 8 besnoiti 8 tarandi Bcaprae B bennetti Figure 9 R partitio
88. giter la microplaque rapidement 5 10 s soit en utilisant un agitateur orbital 300 rpm ou manuellement sur le plan de travail 52 Lire la microplaque dans un lecteur ELISA 450 nm dans les 15 minutes qui suivent l ajout de la solution stop 5 3 Calculer la moyenne des valeurs de DO s des contr les Puits A1 et B1 moyenne des contr les positifs Puits C1 et D1 moyenne des contr les positifs faibles Puits E1 et F1 moyenne des contr les n gatifs Recommandation Utiliser un filtre de r f rence 620 nm Calcul des r sultats OD so de l chantillon tM OD so du s rum de l contr le positif X de positivit Validation des crit res 61 La DO moyenne des s rums de contr le 124 positifs doit tre gt 1 2 6 2 Le pourcentage moyen PP positifs faibles doit tre gt 35 6 3 La DO moyenne des s rums de contr le n gatifs doit tre lt 0 15 Si ces crit res ne sont pas valid s les r sultats de la s rie de tests sont ininterpr tables et les chantillons devront tre test s nouveau Interpr tation des r sultats PP 2 15 positif Si les r sultats obtenus sont sup rieurs ou gaux au seuil de 15 le PP est consid r comme positif PP 15 n gatif Si les r sultats obtenus sont inf rieurs au seuil de 15 le PP est consid r comme n gatif Annexe Avertissement Les informations contenues dans cette notice sont consid r es comme tant compl tes et exactes
89. hase des ced mes plissements et hyperk ratose au niveau des bourses EME 58 Photo 18 Phase d ced mes zones violac es la base des 58 Photo 19 Fin de la phase des ced mes complications de crevasses avec exsudats s ro h morragiques l extr mit des Membres imitant 59 Photo 20 Phase de scl rodermie hyperk ratose et plis cutan s la phase interne des cuisses 21 Photo 21 Phase de scl rodermie plis d hyperk ratose sur les membres et d pilations ami LE tue 60 Photo 22 Phase de scl rodermie d formation intense des trayons et hyperk ratose t SUMENTAITE Loses teni eae ne ds 60 Photo 23 Phase terminale maciation hyperk ratose d formations articulaires m lanose des muqueuses et de leur pourtour Liane thu ves nn rade ten dti TEM ANA 61 Photo 24 Phase terminale hyperk ratose d formations articulaires 61 Photo 25 Phase terminale hyperk ratose d pilation 62 Photo 26 Phase terminale hyperk ratose et m lanose du pourtour du mufle 62 Photo 27 Phase de scl rodermie kystes sur le limbe scl ro corn en et la conjonctive Hyperk ratose cutan e p rioculaire avec formation de plis et d pilations
90. hilde Epid miologie gestion de la sant des levages avicoles et porcins Mme PRADIER Sophie M decine interne des quid s M RABOISSON Didier Productions animales ruminants Mme TROEGELER MEYNADIER Annabelle Alimentation M VOLMER Romain Microbiologie et Infectiologie disponibilit cpt du 01 09 10 M VERWAERDE Patrick Anesth sie R animation Mme WARET SZKUTA Agn s Production et pathologie porcine MAITRES DE CONFERENCES et AGENTS CONTRACTUELS M BOURRET Vincent Microbiologie et infectiologie Mme FERNANDEZ Laura Pathologie de la reproduction ASSISTANTS D ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE CONTRACTUELS Mile DEVIERS Alexandra Anatomie Imagerie M DOUET Jean Yves Ophtalmologie Mlle LAVOUE Rachel M decine Interne Mlle PASTOR M lanie M decine Interne M VERSET Micha l Chirurgie des animaux de compagnie Remerciements Aux membres du jury de th se A Monsieur le Professeur Alexis VALENTIN Professeur des Universit s Praticien Hospitalier Zoologie et Parasitologie Qui nous fait l honneur d accepter de pr sider notre jury de th se Hommages respectueux Monsieur le Docteur Emmanuel LIENARD Ma tre de Conf rences l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Parasitologie et Maladies parasitaires Qui nous a fait l honneur d accepter la direction de notre th se Pour sa disponibilit son coute ses conseils Qu il re oive ma profonde reconnaissance Et mes sinc res remerciements
91. ia besnoiti ainsi que de la sous famille des Toxoplasmatinae Tenter et al 2002 Ils ont mis au point deux tests une PCR conventionnelle ainsi qu une PCR en temps r el RT PCR Tous deux sp cifiques et sensibles bas s sur l amplification de s quences d ADNr sp cifiques du parasite permettant la d tection de B besnoiti dans les biopsies de peau de bovin Dans le but de d terminer la sensibilit de la PCR conventionnelle et de la RT PCR des mesures ont t r alis es avec des quantit s variables de bradyzoites 10 000 1 000 100 10 et 1 figure 13 La sensibilit des r actions d amplification est tr s lev e car elle a permis la d tection d un seul parasite dans une biopsie cutan e de 200 ug Fonclara 2011 Fluorescence F 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 Cycle Number Figure 13 Sensibilit de la PCR en temps r el d ITS1 ADNr Cortes et al 2007a 73 La RT PCR est une am lioration utile par rapport aux autres proc dures disponibles car elle permet la d tection de B besnoiti m me dans les chantillons de peau qui ont t recueillis partir d animaux s ropositifs mais asymptomatiques Avec une approche quantitative la RT PCR est un outil utilis essentiellement pour des tudes pid miologiques Une piste actuellement explor e est le d veloppement d une PCR quantitative permettant le d pistage de tachyzoites dans le sang La mise
92. ie orale Les posologies sont difficiles respecter sur le terrain puisque la majorit des sulfamides sont pr sent s en association avec du trim thoprime et par cons quent les doses appliqu es par le dossier A M M ne sont pas celles permettant la gu rison d un animal atteint de besnoitiose On se retrouve donc en sous dosage ce qui ne permet bien videmment pas la gu rison Malgr tout m me si le traitement est administr rapidement et correctement il ne faut pas oublier que l utilisation des sulfamides ne permet pas la gu rison compl te du bovin et les rechutes ne sont pas rares Jacquiet et al 2010 Les bovins infect s le sont vie ce qui signifie que m me gu ris ils sont porteurs de nombreux kystes bradyzoites forme de survie de l esp ce parasite par cons quent ils peuvent tre tout moment de nouveau cliniques et source d infection pour les autre bovins La r forme de ces animaux reste un choix judicieux 80 3 Autres solutions L efficacit des t tracyclines est aujourd hui encore discut e Malgr le fait que beaucoup de v t rinaires continuent l utiliser en premi re intention son efficacit apparente serait sans doute li e l utilisation conjointe d anti inflammatoire d o une apparente gu rison des bovins trait s Dans la zone d end mie historique la t tracycline fut test e 1 dose de 10 mg kg PV mais sans r sultats cliniques satisfaisants De r cents trav
93. ilit par diminution du nombre de faux n gatifs qui est nul pour les DO de 10 et 15 Cependant cela diminue la sp cificit en augmentant le nombre de faux positifs Si l on compare les techniques ELISA et IFI respectivement la DO de 20 et la dilution 1 200 tableau 10 on s aper oit que l IFI pr sente une sensibilit l g rement sup rieure qui assure une VPN sup rieure pour l IFI La sp cificit de l IFI est galement bien meilleure et assure une VPP de 100 Enfin le degr d accord entre les deux tests et le WB est quasi parfait pour l IFI et est bon pour l ELISA Cela montre que IFI poss de de meilleures performances que l ELISA Cependant il s agit d une technique plus co teuse et plus fastidieuse 102 Se Sp VPP VPN 95 1 95 1 95 1 95 1 95 1 90 4 85 3 77 9 93 9 0 732 POSODOSM 83 8 94 9 79 8 89 7 70 3 84 4 89 6 96 8 0 658 0 805 91 8 96 6 0 940 85 4 96 0 100 100 93 8 98 3 0 903 0 977 Tableau 10 Comparaison des performances de l IFI 1 200 et de P ELISA DO 20 C Conclusion partielle La cin tique d apparition des anticorps varie en fonction du test s rologique utilis et peut tre l origine des diff rences de performances observ es entre l IFI l ELISA et le WB Les tests s rologiques d velopp s utilisent des conjugu s anti IgG totaux de bovins Chez les bovins la classe de
94. ination test for the diagnosis of Besnoitia besnoiti infection Vet Parasitol 178 217 222 Wang XS and Liu WD 1987 Preparation of antigen from Besnoitia besnoiti bovine and study on diagnosis of bovine besnoitiosis using the indirect haemagglutination test Acta Vet Zootech Sin 18 55 61 114 ANNEXES 115 ANNEXE 1 PROTOCOLE DU KYSTE A BRADYZOITES AUX TACHYZOITES O Du pr l vement de peau jusqu la mise en culture des bradyzoites D Pr l vement d un morceau de peau kystique transport dans du PBS p ni strepto 500ml 12ml 12ml 2 Diss quer le pr l vement dans boite de P trie avec scalpel 5 Filtrer sur BD Falcon 40 um 2 Passer sur Colonne de Purification Pr parer un tampon d lution PBS et laver les colonnes avec 15 ml de PBS Attention jeter ces premiers 15 ml la suspension de parasites est dilu e avec 15 ml de PBS afin d avoir 16 ml de volume final Distribuer 2 ml par colonne Laisser la suspension parasitaire p n trer dans la colonne on peut la suivre par la couleur ros e du milieu Eluer les parasites avec 15 ml de PBS Quand le volume au fond du Falcon est de 15 ml stopper l lution les parasites sont alors lu s et se retrouvent au fond du Falcon de 50 ml Regrouper les diff rents volumes de 15 ml dans 3 Falcons de 50 ml 5 Centrifuger 1200 rpm 10 minutes 4 C 6 Retirer le surnageant reprendre les parasites dans 1 ml de P
95. iptique et mesurent 11 6 14 2 x 14 2 16 pm Les ookystes de Besnoitia sont tr s semblables ceux du genre Toxoplasma et du genre Hammondia figure 4 Ils n ont pas t depuis observ s nouveau 1 sospora felis 2 Isospora rivolta 3 Besnoitia besnoiti 4 Besnoitia wallacei 5 Hammondia hammondi 6 Toxoplasma 7 Sarcocystis porcifelis 8 Sarcocystis hirsuta 9 Sarcocystis tenella 10 Sarcocystis muris 11 Sarcocystis sp Gazella granti Figure 4 Repr sentation sch matique d ookystes de coccidies retrouv es dans les f ces d un chat chelle 10 um Dubey et al 1976 2 Les tachyzo tes Par comparaison aux ookystes les tachyzo tes furent d crits initialement 20 ans plus t t en 1954 par Pols et son quipe Ils sont en forme de banane ou de croissant libre dans le sang ou la lymphe photo 1 et prennent une forme ovo de lorsqu ils sont situ s dans les pseudo kystes photo 2 Ils mesurent environ 2 x 7 um Pols 1960 Photo 1 a Tachyzo tes dans une cellule Vero infect e observ s au microscope lectronique balayage chelle 12 um Cortes et al 2006b b Tachyzo tes libres dans le sang chelle 7 um Shkap 35 Photo 2 Tachyzo tes dans une cellule Vero infect e observ s au microscope lectronique transmission chelle 0 3 um Cortes et al 2006b 3 Les kystes bradyzoites Il s agit de la seule forme parasitaire visible l
96. ique Ce n est qu la troisi me et derni re phase que l on voit appara tre les l sions les plus caract ristiques pathognomoniques de la besnoitiose savoir la pr sence de nombreux kystes bradyzoites visibles l il nu dans diff rents tissus de l organisme du bovin Le tableau 3 ci dessous pr sente les principales l sions observables m me si elles ne sont pas toujours pr sentes Phase f brile et d ced mes Phase de scl rodermie Carcasse Peau Tissu sous cutan Muscles fascias tendons Articulations Os Syst me lymphatique Cavit abdominale Cavit thoracique Syst me digestif Foie V sicule biliaire Rate Reins Appareil g nital congestion g n ralis e congestion ced mes des parties d clives foyers de d g n rescence boulets arthrite s ro fibrineuse p t chies aucune l sion macroscopique n uds hypertrophie mod r e p ritonite fibrineuse pleur sie fibrineuse congestion muqueuse p t chies foyers de d g n rescence aspect marbr p t chies l g re spl nom galie p t chies ut rus p t chies 64 hydrocachexie kystes hyperk ratose d pilation kystes kystes marbrures blanch tres kystes capsules articulaires kystes p rioste des os distaux kystes n uds p riph riques hypertrophie mod r e p ritonite fibreuse pleur sie fibreuse absence de l
97. ique de diagnostic par immunofluorescence indirecte de la besnoitiose bovine Besnoitia besnoiti et que cette derni re peut tre imprim e en vue de sa soutenance Fait Toulouse le 7 octobre 2013 Vu Docteur Emmanuel LIENARD Le Directeur de l Ecole Nationale Enseignant chercheur V t rinaire de Toulouse de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse E lie nend i Une Vu Vu et autorisation de l impression Le Pr side t du jury Le Pr sident de l Universit Professeur Alexis VALENTIN Paul Sabatier Professeur Bertrand MONTHUBERT M LENFANT Fran ois a t admis e sur concours en 2008 a obtenu son dipl me d tudes fondamentales v t rinaires le 21 06 2012 a valid son ann e d approfondissement le 27 06 2013 n a plus aucun stage ni enseignement optionnel valider Universit de Toulouse Ecole nationale V t rinaire 23 chemin des capelles 31076 Toulouse Cedex 3 France 106 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Agosti M Belloni Morini M Vacirca 1994 Segnalazione di unfocolaio di Besnoitiosi in bovini da carne importati Praxis Vet 15 5 6 Alvarez Garc a Frey CF Mora LM et Schares G 2013 A Century of bovine besnoitiosis an unknown disease re emerging in Europe Trends Parasitol 29 407 415 Alzieu JP 2000 La besnoitiose ou anasarque des bovins une parasitose en extension bien diagnostiquer Recueil conf rences Journ es nationa
98. isation FOUCRAS Gilles Pathologie des ruminants LEFEBVRE Herv Physiologie et Th rapeutique PROFESSEURS 2 CLASSE Mme BENARD Genevi ve Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale M BERTAGNOLI St phane Pathologie infectieuse Mme CHASTANT MAILLARD Sylvie Pathologie de la Reproduction M DUCOS Alain Zootechnie M DUCOS DE LAHITTE Jacques Parasitologie et Maladies parasitaires Mme GAYRARD TROY V ronique Physiologie de la Reproduction Endocrinologie M GUERRE Philippe Pharmacie et Toxicologie Mme HAGEN PICARD Nicole Pathologie de la Reproduction M JACQUIET Philippe Parasitologie et Maladies Parasitaires M LIGNEREUX Yves Anatomie M M M amp amp lt lt lt MEYER Gilles Pathologie des ruminants PICAVET Dominique Pathologie infectieuse SANS Pierre Productions animales Mme TRUMEL Catherine Pathologie m dicale des Equid s et Carnivores PROFESSEURS CERTIFIES DE L ENSEIGNEMENT AGRICOLE Mme MICHAUD Fran oise Professeur d Anglais M SEVERAC Beno t Professeur d Anglais MAITRES DE CONFERENCES HORS CLASSE M BAILLY Jean Denis Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale M Dominique Pathologie de la Reproduction Mile BOULLIER S verine Immunologie g n rale et m dicale Mme BOURGES ABELLA Nathalie Histologie Anatomie pathologique M BRUGERE Hubert Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale Mlle DIQUELOU
99. la fluorescence diminue grandement entre la dilution 1 200 et 1 400 malgr tout une fluorescence est pr sente sur la p riph rie des tachyzoites la dilution 1 400 mais celle ci est distribu e de mani re plus h t rog ne et sa luminosit est plus faible Ceci pose un probl me pour le lecteur qui observe la lame au grossissement x400 seulement Le probl me se pr sente v ritablement lorsque l on se trouve dans cette configuration entre les dilutions 1 100 et 1 200 puisque cette derni re a t fix e comme seuil d cisionnel Cette difficult souligne une limite importante de l IFI dont l interpr tation de la fluorescence 96 repose alors dans cette situation sur l exp rience du diagnosticien introduisant de fa on sensible une part de subjectivit 49b 50b Photos Observation de tachyzoites sur une lame de s rum douteux au microscope UV 49 dilution 1 200 a x400 b x1600 fluorescence sur la totalit de la p riph rie des parasites 50 dilution 1 400 a x400 b x1600 fluorescence h t rog ne et clairsem e sur la p riph rie des parasites F Lenfant B Optimisation de PIFI Seule la dilution 2 10 ml a donn un beau tapis uniforme de tachyzoites sur toute la lame Avec une dilution de 5 10 mI on obtenait un tapis surpeupl de tachyzoites et la lecture n tait pas claire A la dilution de 1 10 ml le tapis de tachyzoites n tait pas uniforme et trop peu de tachyz
100. le une r action n gative se caract rise par un point noir form au fond de la cupule s dimentation de l antig ne La m thode r sulte de celle pr sent e par Fulton et Turk en 1959 pour le diagnostic de la Toxoplasmose humaine Toxoplasma gondii Puis elle a t adapt e pour la d tection d anticorps contre d autres protozoaires proches tels que Neospora caninum Romand et al 1997 Packham et al 1998 et Sarcocystis neurona Linday et Dubey 2001 Elle pr sente plusieurs avantages une haute sensibilit ainsi qu une haute sp cificit un faible co t et utilisable sur de nombreuses esp ces d o un int r t tout particulier pour l tude pid miologique du cycle volutif Durant les travaux de Waap 2011 le meilleur accord entre le test d agglutination modifi et l immunofluorescence indirecte a t observ la dilution 1 160 coefficient de Cohen 0 968 La sensibilit est de 97 296 et la sp cificit de 99 396 79 VI MOYENS DE LUTTE A Outils th rapeutiques 1 Historique Au d but du 20 si cle les premiers traitements faisaient appel aux diur tiques et la saign e Puis en 1938 Berthelon et Labeyrie eurent de bons r sultats avec l utilisation de formol en intraveineux Mais ce traitement fut abandonn par la suite au profit des sulfamides La posologie recommand e l poque tait de 9 mg kg de PV de sulfam thazine injectable renouvelable 48h associ e un trai
101. les GTV Dijon 343 345 Alzieu JP Cortes H Gottstein B Jacquiet P Dorchies P Schelcher F L hostis M 2007 La besnoitiose bovine actualit s pid miologiques et diagnostiques Bull GTV Hors s rie parasitisme des bovins 41 49 Alzieu JP Dorchies P Schelcher et Gottstein B 20072 L extension de la besnoitiose bovine en France une probl matique complexe Recueil conf rences Journ es nationales GTV Nantes 837 845 Alzieu JP Dorchies P Schelcher F et Gottstein B 2007b L extension de la besnoitiose bovine en France Point V t rinaire 276 37 43 Alzieu JP Jacquiet P 2009 Actualit s sur la transmission et le diagnostic de la besnoitiose bovine Point V t rinaire 301 16 19 Alzieu JP Jacquiet P 2010 La besnoitiose bovine une mergence av r e en France et en Europe moyens de diagnostic et de contr le Recueil XX me Rencontres GTV Rh ne Alpes 1 13 Alzieu JP Jacquiet P Li nard E Grisez C Prevot F Malavieille R Desclaux X Nussbaum S Bergeaud JP Franc M Schelcher F Corboz N Bastien F Guerrier Ch telet MC Gavet L Schneider V Boulon 2011 R mergence de la besnoitiose bovine d marche diagnostique et possibilit s de contr le Bull GTV 58 71 86 Barros ATM and Foil LD 2007 The influence of distance on movement of tabanids Diptera Tabanidae between horses Vet Parasitol 144 380 384 Basso W Schares G Gollnick NS R tten M et Deplazes P 201
102. lisibilit des lames et ainsi la fiabilit du test B R sultats Notre s roth que a t class e en fonction des r sultats pr alablement obtenus par les tests WB et ELISA lors de la recherche s rologique d anticorps anti B besnoiti quatre groupes ont ainsi t form s Les r sultats obtenus l IFI tableau 9 permettent de mettre en vidence trois points 1 les r sultats de la quasi totalit des s rums except 10 s rums concordent avec ceux du WB 2 l IFI a permis de confirmer la s ropositivit des s rums valu s douteux 3 une excellente sp cificit a t mise en vidence gr ce l analyse de s rums s ropositifs N caninum ou T gondii tous s ron gatifs B besnoiti En consid rant la totalit des s rums analys s le meilleur accord entre l Inmunofluorescence Indirecte et le Western Blot a t observ la dilution 1 200 avec un coefficient de kappa gal 0 940 95 IC 0 903 0 977 correspondant une sensibilit de 91 8 95 IC 85 4 96 0 et une sp cificit de 100 Un seuil d cisionnel correspondant la dilution 1 200 est en accord avec les pr c dentes tudes utilisant l IFI 101 comme m thode diagnostique Shkap et al 2002 Schares et al 2010 et est similaire au seuil de 1 256 utilis par Cortes et al 2006 En utilisant un seuil d cisionnel une dilution plus faible on augmente la sensibilit par diminution du nomb
103. ls sont ensuite lib r s dans la circulation sanguine apr s clatement de la cellule h te Les tachyzo tes infectent diverses cellules cellules endoth liales fibroblastes et histiocytes du tissu conjonctif Ferri 1984 Franc et al 1987 Les parasites voluent en bradyzo tes division lente contenu dans des kystes intracellulaires du fait de la pression du syst me immunitaire Ces kystes deviennent matures en dix semaines environ et persisteraient une dizaine d ann es Alzieu et al 2007b 42 c Cycle homox ne de bovin bovin d importance capitale Les bradyzo tes des kystes cutan s peuvent tre transmis m caniquement d un bovin infect un bovin sain par l interm diaire d insectes piqueurs Tabanid s ou Stomoxyin s Bigalke 1968 tout comme par une aiguille souill e lors d injections en s rie th rapies ou vaccinations de groupe ou par contact direct Ce cycle monox ne appara t d sormais comme dominant figure 8 tachyzoites bradyzoites Derme Muqueuses qna bradvzo tes 4 amp tachyzoites Figure 8 Cycle homox ne Bovin Bovin Genest 2008 43 EPIDEMIOLOGIE A Epid miologie descriptive 1 R partition g ographique a Distribution l chelle mondiale La besnoitiose bovine B besnoiti est r partie dans de nombreux pays d Afrique sub saharienne figure 9 Nigeria Cameroun Tchad Soudan Ou
104. ltered except by express written agreement signed by an officer of Prionics AG Representation oral or written which are inconsistent with this warranty or such publications are not authorized and if given should not be relied upon In the event of a breach of the foregoing warranty Prionics AG s sole obligation shall be to repair or replace at its option the applicable product or part thereof provided the customer notifies Prionics AG promptly of any such breach If after exercising rea sonable efforts Prionics AG is unable to repair or replace the product or part then Prionics AG shall refund to the customer all monies paid for such appli cable product or part Prionics AG shall not be liable for consequential incidental special or any other indirect damages resulting from economic loss or property damage sustained by any customer from the use of its prod ucts Prionics AG is an ISO 9001 2000 certified company Appendix ll Preparation of Washing Fluid working solution and Conjugate Solution Washing Fluid working solution Mix indicated volumes of demineralized water and Washing Fluid 20x Add 1 6 of Washing Fluid Addi tive to the solution and mix properly to obtain the desired volume of Washing Fluid working solution Transfer 50 ml Washing fluid 20x to a 2 bottle Add 940 ml of demineralized water and mix Add 10 ml of Washing Fluid Additive mix prop erly until a clear solution is obtained appro
105. m within 15 minutes Recommendation Use a reference filter at 620 nm RESULT INTERPRETATION Calculation of results OD 450 nm Sample 100 X positivi OD 450 nm Positive Control IE Validation criteria The mean ODaso of the Positive Controls must be gt 1 0 The mean percentage of positivity PP of the Weak Positive Controls must be gt 35 The mean ODaso of the Negative Controls must be 0 2 If these criteria are not met the results are invalid and the samples have to be retested Interpretation of results Results obtained above or equal the cut off of 20 PP are considered as positive Results obtained below the cut off of 20 PP are negative 121 Appendix Notice This manual is believed to be complete and accurate at the time of publication In no event shall Prionics AG be liable for incidental or consequential damage in connection with or arising from the use of this manual Liability Prionics AG warrants its products will meet their applicable published specification when used in accordance with their applicable instructions and within the declared products life time Prionics AG makes no other warranty expressed or implied There is no warranty of merchantability or fitness for a par ticular purpose The warranty provided herein and the data specifications and descriptions of Prionics AG products appearing in Prionics AG published cata logues and product literature may not be a
106. mmun form La r action enzymatique produite cr e une coloration quantifiable par spectrophotom trie La technique d crite par Cortes 2006a a t adapt e de celle mise au point par Gottstein 1999 pour la N osporose N caninum Elle poss de une bonne sensibilit 87 quelque soit le stade clinique de l animal test et une tr s bonne sp cificit 97 5 Malgr tout la sensibilit n est pas aussi bonne que pour l IFI ou le WB Aucune r action crois e n a t observ avec N caninum et peu avec T gondii Cortes et al 2006a Elle a les avantages de ne demander que peu de r actifs d tre peu co teuse et de pouvoir tester des centaines de s rums en une journ e Janitschke et al 1984 L ELISA est recommand e en tant que test de d pistage de masse de la besnoitiose par exemple pour connaitre la pr valence dans un troupeau ou une r gion Par contre du fait de sa tr s faible valeur pr dictive positive il est important de confirmer les cas positifs par une autre technique telle que le WB Cortes et al 20062 275 Plusieurs tests ELISA sont actuellement commercialis s en Europe PrioCheck Besnoitia Ab V2 0 ID Screen Besnoitia indirect INGEZIM BES 12 BES K1 INGENASA Le test PrioCHECK Besnoitia Ab V2 0 annexe 4 est une version am lior e Sa version originale annexe 3 a fait l objet d une valuation en 2010 par l quipe de Schares donnant une sensibilit de 75 5 et une sp cificit d
107. montr exp rimentalement que les tabanid s Tabanus sp photo 5 les moustiques Culex sp Aedes sp photo 9 les mouches ts ts Glossina sp photo 8 et les mouches d table Stomoxys calcitrans photo 6 peuvent transmettre m caniquement besnoiti entre les bovins mais aussi entre les bovins et les lapins Bigalke 1960 1968 Le parasite est rapidement d truit l int rieur de l intestin moyen du vecteur interdisant toute persistance long terme de l agent pathog ne En revanche B besnoiti peut survivre dans les pi ces buccales du vecteur pendant 24 heures environ chez certains tabanid s mais pas plus de quelques heures chez les stomoxes D autres arthropodes tels que les moustiques les mouches plates Hippobosca sp photo 12 les tiques et des esp ces non piqueuses comme les mouches domestiques Musca domestica photo 13 ont t sugg r s comme vecteurs mais cette hypoth se n a pas encore t d montr e Bigalke 1968 Pols 1960 Des investigations pourraient tre galement requises concernant Culicoides sp photo 10 et les simulies Simulium sp photo 11 car ces deux groupes d esp ces sont des vecteurs 49 comp tents biologiques et m caniques de plusieurs autres maladies virales et parasitaires d importance v t rinaire Mullen et Durden 2009 Les tabanid s semblent tre plus comp tents que les mouches d tables En effet le volume des pi ces buccales de Stomo
108. ms de contr le de la Micoroplaque Comp sant 1 non sensibilis e vers la microplaque et m langer en pipetant 5 fois 21 Incuber les chantillons sur une microplaque pendant 60 1 minutes T ambiante 22 3 22 Laver la microplaque quatre fois avec 300 ul de la solution de travail de lavage voir Annexe II Remarque si vous utilisez un laveur de plaque assurez vous qu aucune aiguille n est obstru e 3 1 Ajouter 100 ul de conjugu dilu dans chacun des puits de la microplaque 3 2 Incuber la microplaque pendant 30 1 minutes entre 22 3 C 3 3 Laver la microplaque quatre fois avec 300 ul de solution de travail de lavage voir Annexe II 34 Enlever le liquide r siduel en tapotant fermement les plaques sur du papier absorbant apr s le dernier cycle de lavage Remarque La solution de lavage peut perturber le substrat lors de l tape de d tection Incubation avec le Substrat chromog ne TMB 4 1 Ajouter 100 l de Substrat chromog ne Composant 7 dans chacun des puits de la microplaque 4 2 Incuber la microplaque pendant 15 1 minutes entre 22 3 C 43 Ajouter 100 ul de Solution d arr t Composant 8 dans chacun des puits de la microplaque Remarque commencer ajouter la solution d arr t 15 1 minutes apr s avoir rempli le premier puits avec le Substrat chromog ne TMB Ajouter la solution d arr t en gardant le m me ordre de distribution que pour le Substrat chromog ne TMB 5 1 A
109. n a test diff rentes dilutions de tachyzoites 5 109 2 109 1 10 1 107 1 10f 1 10 100 50 25 10 5 1 ml F Analyse des donn es Les r sultats ELISA et WB pr alablement obtenus ont t compar s pour calculer les performances de l ELISA en consid rant le WB comme test de r f rence Ces valeurs ont permis d avoir une approche comparative similaire entre l IFI et l ELISA Les performances de l IFI ont t valu es en utilisant galement le Western Blot comme test de r f rence Gold standard Les calculs ont t effectu s l aide d un tableur Excel et du add on DAG_ Stat Mackinnon 2000 La sensibilit la sp cificit les valeurs pr dictives positives et n gatives de l ELISA et de l IFI ont t d termin es respectivement pour chacune des trois DO 10 15 et 20 et des quatre dilutions de s rums 1 100 1 200 1 400 et 1 800 Les concordances entre 93 les r sultats observ s chaque DO et chaque dilution ont t calcul es en utilisant des tableaux de contingence et ont t d finies comme tant la proportion d accord global entre les r sultats des deux tests compar s Le coefficient Kappa de Cohen a t utilis pour calculer ce degr d accord Landis amp Koch 1977 Il t valu selon les crit res suivants 0 00 tr s mauvais 0 01 0 20 mauvais 0 21 0 40 m diocre 0 41 0 60 moyen 0 61 0 80 bon 0 81 1 00 accord quasi parfait Everitt 1989
110. n mondiale des diff rentes esp ces de Besnoitia Rouge Besnoitia besnoiti bleu Besnoitia tarandi jaune Besnoitia bennetti gris Besnoitia caprae Agrandissement Expansion chronologique de B besnoiti en Europe Croix avant 1900 triangles 1991 2000 cercles 2001 2012 lvarez Garc a et al 2013 44 b Distribution l chelle nationale Alzieu et al 2007a Jacquiet et al 2010 Entre 1800 et 1960 la besnoitiose tait end mique dans de nombreuses zones du Sud ouest de la France bordure sud du Massif central hautes vall es de l Aude et de l Ari ge Gers Hautes Pyr n es Adour Ouest Gironde Dans les ann es 1970 1980 elle est rest e limit e aux hautes vall es pyr n ennes de l Aude et de l Ari ge A partir des ann es 90 elle s est tendue aux r gions voisines D s la fin du 20 si cle et le d but du 21 on observe une augmentation du nombre de foyers en Pi mont pyr n en une mergence de cas au nord du Massif Central en Pays de la Loire et dans le Massif Alpin o la maladie est end mique dans sa partie centrale et m ridionale Plus r cemment la besnoitiose a touch la bordure Sud Sud est et Est du Massif Central En 2010 il a t observ des cas dans le Nord du Massif Central dans la Bresse et dans le Nord des Alpes Aujourd hui apr s avoir longtemps t install e au Sud d une ligne Nantes Lyon la besnoitiose progresse selon la direction Nord e
111. nceaux 1909 Sarcocystis Lankester 1882 Frenkelia Biocca 1968 B tarandi B besnoiti Marotel 1913 Henry 1913 B bennetti B jellisoni B oryctofelisi B derlingi B akodoni 32 Figure 1 Place de Besnoitia besnoiti dans la classification Euzeby 1987 Dubey et al 2004 Besnoitia deux sous famille les Sarcocystinae d une part o l on retrouve les genres Sarcocystis et Frenkelia les Toxoplasmatinae d autre part o l on retrouve les genres Hammondia besnoiti est un protozoaire parasite l embranchement des Apicomplexa et la famille des Sarcocystidae De cette famille r sulte obligatoire appartenant Neospora Toxoplasma et Besnoitia Frenkel 1977 Tenter et Johnson 1997 figure 1 Les tudes sur la phylog nie mol culaire partir de l analyse g n tique de s quences d ARNr ont permis de montrer que Besnoitia Hammondia quelques Isospora Neospora et Toxoplasma formaient un groupe monophyl tique figure 2 et que les esp ces de Besnoitia formaient un taxon voisin avec d autres parasites protozoaires d importance v t rinaire tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum Dubey et al 2007 Ellis et al 2000 100 51 l robini S muris S dispersa F microti F glareoli S mucosa S neurona Sarcocystis sp S aucheniae S gigantea S moulei 51 S fusiformis 10 S
112. ncentration de tachyzoites voir plus bas Enfin cette solution est d pos e dans chacun des 8 puits pr sents sur chaque lame d immunofluorescence et est s ch e une heure 37 C Les tachyzoites sont d finitivement fix s l aide d ac tone conserv e 20 C Les lames sont s ch es et enroul es dans du papier Whatman entour es de papier en aluminium Elles sont conserv es 70 C pour une utilisation ult rieure 89 D Tests des s rums par Immunofluorescence Indirecte Les s rums ont t test s quatre dilutions diff rentes 1 100 1 200 1 400 1 800 auxquelles sont jointes deux solutions t moins une positive et une n gative photo 34 Les solutions sont d pos es dans chacun des puits photo 35 et les lames sont plac es en chambre humide 37 C pendant 45 minutes photo 36 Elles sont ensuite lav es trois fois dans de l eau distill e photo 37 puis s ch es L tape suivante consiste d poser dans les puits le conjugu anti IgG bovines marqu es la fluoresc ine FITC dilu au 1 300 ainsi que le Bleu Evans dilu au 1 20 photos 38 et 39 La derni re tape d incubation est r alis e en chambre humide Les lames sensibilis es sont lav es puis s ch es Juste avant la lecture on d pose le milieu de montage Fluoprep dans chaque puits photo 40 Ce gel permet la fixation de la lamelle sur la pr paration microscopique destination d un examen d immunofluorescence On termine en mettan
113. ne tude bibliographique dans lequel est r alis un bilan sur les connaissances actuelles sur la besnoitiose en insistant notamment sur les techniques diagnostiques Le second chapitre pr sente les r sultats de nos travaux effectu s pendant trois mois au service de parasitologie de l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse 26 CHAPITRE 1 LA BESNOITIOSE BOVINE ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 28 I PRESENTATION GENERALE A D finition La besnoitiose bovine est une maladie parasitaire due un protozoaire Besnoitia besnoiti appartenant l embranchement des Apicomplexa et la famille des Sarcocystidae Jacquiet et al 2010 Euzeby 1987 Elle touche essentiellement les jeunes bovins de deux quatre ans Alzieu et al 2007a D un point de vue clinique on distingue trois phases une premi re qui se traduit par une pouss e de fi vre que l on nommera la phase f brile une seconde d finie par l apparition d d mes et une derni re caract ris e par une dermatose d voilant des d pilations et des scl rodermies Franc 1987 La morbidit est souvent importante proche des 90 en zone d enzootie Ferri 1984 Par contre la mortalit est plut t faible avoisinant les 10 EFSA 2010 Il s agit d une maladie difficile diagnostiquer durant la phase initiale puisqu ce moment l la besnoitiose correspond un syndrome f brile intense difficilement diff rentiable d autres maladies B Synonymie
114. nitaire 1 M thodes dites directes mise en vidence du parasite d Histologie Les kystes bradyzoites sont facilement observables au niveau de la scl re ou de la muqueuse vulvaire chez une petite proportion d animaux infect s moins de 1 sur 4 car la grande majorit est repr sent e par les bovins infect s asymptomatiques Alzieu et al 2009 Jacquiet et al 2010 Li nard et al 2011 Une biopsie r alis e sous anesth sie locale sur un lambeau de peau cartonn permet la mise en vidence de kystes bradyzoites apr s analyse histologique Cependant cet 2J2 examen ne permet la d tection des kystes que 5 6 semaines apr s le d but de la phase f brile Le simple grattage du derme ou le raclage scl ral suivi de l crasement du pr l vement entre lame et lamelle permet un diagnostic de certitude apr s r v lation de la structure caract ristique des kystes bradyzo tes de Besnoitia Alzieu et et al 2011 Jacquiet et al 2010 Cette technique ne demande pas de coloration elle est rapide et peu co teuse Franc et al 1987 b Polymerase Chain Reaction PCR Avant 2007 la d tection du parasite tait exclusivement bas e sur la visualisation des kystes bradyzoites et sur l histopathologie Cortes et al 2007a Depuis les travaux de Cortes et al 20072 il a t montr que le segment ITS1 Internal Transcribed Spacer 1 tait un marqueur sp cifique de l esp ce Besnoit
115. nnaissance du tableau clinique de la maladie est essentielle pour un diagnostic efficace et le plus pr coce possible Il s agit de la connaissance des sympt mes ainsi que des l sions macroscopiques associ es L volution en trois phases distinctes et pathognomonique pour la derni re en fait un atout suppl mentaire pour une meilleure d tection clinique Le syndrome f brile initial n est pas sp cifique cette maladie ce qui en fait une phase difficile diagnostiquer A l apparition des d mes le diagnostic est alors sans quivoque Lors de la derni re phase la clinique est univoque et permet un diagnostic de quasi certitude En ce qui concerne les animaux infect s latents leur d pistage est capital et repose sur la d tection des kystes bradyzoites pr sents au niveau de la scl rotique Il s agit d un diagnostic clinique fiable et sp cifique Franc et al 1987 Malheureusement si l on s appuie uniquement sur la clinique le diagnostic est souvent tardif L pid miologie de base est conna tre pour am liorer le diagnostic Une suspicion pr coce repose sur un contexte pid miologique bas sur l ge des animaux le mode d levage la saison Ferri 1984 La localisation g ographique est quant elle interpr ter de mani re prudente car le nombre de foyers augmente en France et on retrouve des cas sporadiques de plus en plus loin de la r gion end mique historique Alzieu et al 2007 B Diff ren
116. nnues mais pourraient tre dues une combinaison de diff rents facteurs sensibilit individuelle fond g n tique notamment diff rences de virulence parmi les souches parasitaires in gale transmission parasitaire selon les vecteurs exposition r p t e ou simple caract res immunosuppresseurs de la salive des vecteurs stade parasitaire tachyzoite ou bradyzoite Les animaux atteints d veloppent dans un d lai variable de deux semaines jusqu plusieurs mois un tableau clinique et l sionnel typique et inchang d intensit croissante au cours du temps Alzieu et al 2007a et 2011 Franc et al 1999 Jacquiet et al 2010 Une courte p riode d incubation 6 10 jours pr c de trois phases cliniques successives 0 Phase aigu et f brile Le syndrome f brile qui dure de 3 10 jours est caract ris par une hyperthermie marqu e fr quemment entre 41 et 42 C et un abattement Il est associ une parasit mie importante et une intense multiplication des tachyzo tes dans les macrophages les fibroblastes et dans les cellules endoth liales des vaisseaux sanguins Le bovin est ensuite atteint d un cort ge de sympt mes d crits dans le tableau 2 Appareil Sympt mes Peau et muqueuses congestion chauffement douleur hyperesth sie Poils h rissement Oculaire photophobie piphora constant et abondant Naso pharyng jetage s reux Cardio respiratoire tachycardie tachypn e d
117. ocyte par un 41 microgam tocyte aboutirait un uf entour d une paroi que l on appelle ookyste Apr s 6 8 jours p riode pr patente les ufs seraient limin s par les f ces Une fois dans le milieu ext rieur les ookystes devraient acqu rir leur pouvoir infectant par sporulation Cette phase de maturation se r aliserait temp rature ambiante et n cessiterait 2 4 jours au terme desquels les ookystes deviendraient 2 sporocystes renfermant chacun 4 sporozoites Ferri 1984 Franc et al 1987 m rozoite schizonte NY schizogonie gam tocyte vam togonie trophozoite Pe micro tacro INTESTIN 4 in gametocyte 6 8 jours sporozolte HEB INGESTION bradvzo tes ookyste MILIEU EXTERIEUR ookyste non 2 4 jours sporul Derme Muqueuses INGESTION sporogonie Ookyste sporul Vaisseaux sanguins tachyzoites Figure 7 Cycle h t rox ne Chat Bovin Genest 2008 Enfin le bovin se contaminerait par ingestion d ookystes sporul s suivant l excr tion f cale par le chat figure 7 Une fois dans la lumi re digestive les ookystes lys s lib reraient les sporozoites Ces derniers envahissent les cellules endoth liales des vaisseaux sanguins s y multiplient et s accumulent On a alors formation de pseudo kystes renfermant de nombreux tachyzo tes qui se divisent rapidement I
118. ohorte de 57 animaux suivie pendant plus d un an Li nard et al 2011 La s ropr valence au sein de cette cohorte a augment de 30 89 596 Les modes de transmission du parasite sont tudi s depuis de nombreuses ann es Historiquement des tachyzoites sanguins ou des bradyzoites cutan s ont t transmis avec succ s d un animal infect un autre animal receveur respectivement par transfusion de grands volumes de sang bovin contamin ou par transmission m canique par piq res de tabanid s et de Stomoxys calcitrans plus commun ment appel e la mouche d table Cuill et al 1936 Pols 1960 Bigalke 1968 Transmission par voie transcutan e a Via les arthropodes piqueurs Les arthropodes h matophages ou non ont longtemps t tudi s comme vecteurs de transmission potentiels des esp ces de Besnoitia Cuill et al 1936 Pols 1960 Bigalke 1968 En effet la localisation de kystes bradyzoites de Besnoitia directement sous la peau et dans les r gions anatomiques comme la scl re la conjonctive le vestibule du vagin et la vulve la mamelle les parties basses des membres et les cavit s nasales sont facilement accessibles aux pi ces buccales d une grande partie des arthropodes h matophages Bigalke 1968 Mehlhorn et al 2009 Plusieurs facteurs importent dans l efficacit de transmission m canique du parasite 0 d insecte h matophage et le nombre d insectes Il a t d
119. oire l achat de tout bovin de plus de 5 6 mois d ge notamment ceux provenant de zones d end mie y compris les jeunes bovins futurs taurillons en vue d engraissement par exemple Bt si possible il serait sage de refaire un second contr le 6 semaines afin de d pister les animaux faussement s ron gatifs contamination tardive et en cours de s roconversion au moment du premier test Enfin il est absolument indispensable de mettre en place un plan de lutte contre les insectes vecteurs dont les modalit s se r fl chissent levage par levage 83 84 CHAPITRE 2 MISE AU POINT D UNE TECHNIQUE DE DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE PAR IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE DE LA BESNOITIOSE BOVINE A BESNOITIA BESNOITI 86 Il OBJECTIFS DE L ETUDE La Besnoitiose bovine Besnoitia besnoiti est une maladie reconnue mergente en Europe en 2010 par l Agence Europ enne de S curit des Aliments EFSA Seulement quelques bovins atteints d veloppent les signes typiques de la maladie et sont facilement identifiables quand apparaissent les kystes parasitaires au niveau de la scl re ou de la conjonctive Certains de ces animaux constituent des non valeurs conomiques tandis que d autres sont porteurs de kystes sans que cela ne freine leur production e g lait La plupart des bovins demeurent asymptomatiques porteurs sains et forment un r servoir du parasite qu il est essentiel d identifier au plus vite A ce
120. oites taient pr sents Pour les dilutions suivantes de 1 10 1 ml l observation ne donnait que peu de tachyzoites voire aucun C Comparaison des r sultats ELISA et WB Trois cent quarante deux s rums ont t analys s pour calculer les performances de l ELISA tableau 6 97 Lorsque l on applique un seuil de positivit une DO 10 l ELISA montre 171 faux positifs et aucun faux n gatif tableau 5 traduisant une sensibilit tableau 6 de 10096 et une sp cificit de 22 696 9596 IC 17 3 28 796 A ce m me seuil la valeur pr dictive positive VPP est de 41 4 95 IC 35 7 47 3 et la valeur pr dictive n gative VPN est de 100 ce qui repr sente respectivement la probabilit qu un test soit positif au WB s il est positif l ELISA autrement dit qu un bovin soit malade si l ELISA est positif et la probabilit qu un test soit n gatif au WB s il est n gatif l ELISA autrement dit qu un bovin ne soit pas malade si l ELISA est n gatif Avec un seuil fix une DO 15 valeur donn par le fabricant la sensibilit est galement de 100 alors que la sp cificit est de 50 2 95 IC 43 4 57 0 Ceci est d respectivement l absence de faux n gatifs et la diminution du nombre de faux positifs n 2 110 A ce m me seuil la VPP est de 52 496 95 IC 45 7 59 0 et la VPN est de 100 Enfin si le seuil est fix une DO de 20 on observe une diminution de la sensibilit
121. oites libres dans le sang a dil ei Balada Sa ble A eae EE D Badin 771222 cts AO ake Tle SAN 35 Photo 2 Tachyzoites dans une cellule Vero infect e observ s au microscope lectronique a WANSMUSSION SR E 36 Photo 3 Coupes histologiques de peau montrant de tr s nombreux kystes de Besnoitia dans Te derme z56 Race tud obi et rase ed 37 Photo 4 Bradyzoites par observation au microscope lectronique transmission 38 Photo 5 Tabanus sp Laon iu esee n sinc simarre cnd ae 50 Photo 6 Stomoxys calcitrans Mouche d table 50 Photo 7 Haematobia irritans Mouche des cornes 51 Photo 8 Glossina sp Mouche 186 SE decessit een eg Yes aine tence PARES nent tite 51 9 Aedes sp C MOUSBQUE ss SR 51 Photo 10 Culicoides sp Moucheron piqueur 51 Photo 11 Simulium sp Mouche 1 52 Photo 12 Hippobosca sp Mouche plate esse 52 Photo 13 Musca domestica Mouche domestique 52 Photo 14 Phase f brile piphora photophobie et jetage s reux 57 Photo 15 Phase febrile j tage sereux vie 57 Photo 16 Phase des d mes d mes d clives sur les membres plis d ced mes sonflement des DOUlets Set ees act peace eas se nn al PA ERR 58 Photo 17 P
122. ole crit par le service de Parasitologie annexes 1 et 2 est inspir de l article publi par Cortes et al 2006b A partir de kystes pr lev s dans la peau du bovin les bradyzoites ont t mis en culture par passage dans des cellules Vero cellules r nales de singe jusqu leur transformation en tachyzoites au bout de 20 jours Les tachyzoites sont maintenus dans les cellules Vero avec des repiquages hebdomadaires jusqu leur utilisation pour l tape suivante Ces cellules Vero ont t cultiv es dans des flasques l aide d un milieu de culture complet base de MEM 1X Minimum Essential Medium AANE 100X Acides Amin s Non Essentiels nystatine p nicilline streptomycine et 10 de s rum de veau foetal inactiv C Fixation sur lame de l antig ne Les lames d IFI ont t pr par es partir des flasques de culture pr sent es ci dessus et le protocole a t adapt de Shkap et al 2002 Le surnageant des flasques qui contient les tachyzoites en suspension est collect Apr s quelques lavages et centrifugations on r cup re ml de tachyzoites en suspension dans du PBS Ce volume est additionn 1 ml de formald hyde 36 pour la pr servation des parasites Apr s trois lavages et centrifugations le culot de parasites est conserv dans 1 ml de PBS L tape suivante vise ajuster la concentration de 2 10 tachyzoites ml Cette valeur a t d termin e par diff rents tests de dilution de la co
123. ologiques de r f rence soit 7 8 jours apr s le d but des signes cliniques Enfin par RT PCR ils sont d cel s d s 1 3 jours apr s le d but du stade f brile Schares et al 2013 Par comparaison la cin tique d apparition des anticorps chez des chevaux atteints de bab siose quine Babesia caballi les anticorps anti Babesia caballi sont d tect s 7 11 jours apr s inoculation d rythrocytes infect s des poneys Friedhoff et Soul 1996 Le test de fixation du compl ment d c le les anticorps d s 8 jours post infection l IFI d s 3 20 jours post infection chez des chevaux infect s exp rimentalement l ELISA d s 2 jours post infection Br ning et al 1996 L ELISA permet une d tection des anticorps anti Babesia caballi plus pr coce que IFI De telles comparaisons n ont pu tre effectu es ici faute de donn es suffisantes concernant l historique des animaux recrut s pour cette tude Enfin les diff rences de sensibilit s observ es entre le WB et l IFI peuvent tre expliqu es par les anticorps recherch s mis en jeu Le WB repose sur des extraits totaux de tachyzoites y compris les produits d excr tion s cr tion alors que l IFI ne d tecte que les anticorps dirig s contre les antig nes de surface du parasite Ainsi le WB d tecte des s rums faussement n gatifs en IFI En effet 103 les anticorps d tect s par pourraient avoir une cin tique d apparition plus tardive que
124. par voie orale et par contact direct Actuellement la voie de contamination orale semble minoritaire si elle se produit avec l ingestion d oocystes sporul s d origine digestive mis par un h te d finitif non encore d couvert Cependant lors de formes chroniques les kystes bradyzoites pr sents au niveau des naseaux du mufle des orbites laissent envisager une auto contamination par l chage entre bovins si toutefois les zones l ch es taient l g rement l s es Si les microl sions sont pr sentes au niveau de la muqueuse nasale on pourrait avoir contamination apr s simple flairage entre bovins Enfin on peut retrouver de nombreux kystes au niveau de la mamelle et particuli rement dans les acini la rupture de ces kystes au moment de la t t e par le veau serait alors possible Bigalke 1968 Alzieu 2007b b Transmission par contact indirect D Via les arthropodes non piqueurs Cortes et son quipe 2005 ont r ussi isoler des tachyzo tes au niveau des s cr tions lacrymales ce qui laisse envisager que certaines esp ces de mouches l cheuses telles que Musca automnalis et Musca domestica puissent transmettre le parasite des bovins sains 2 Via les manchons trayeurs Dans l hypoth se o les vaches pr senteraient des microl sions au niveau des trayons avec lib ration de parasites on pourrait supposer une transmission par l interm diaire des manchons trayeurs lors de la traite Ce qui pourrait conco
125. partir de 2004 un certain nombre de cas ont t recens s d s le d but du printemps alors que les bovins taient encore en stabulation On tait face un pic de printemps et un pic d t automne Les contaminations pr coces de printemps sont sans nul doute li es l abondance des populations de Stomoxys calcitrans en b timent Les contaminations d t avec cas cliniques sont li es l augmentation massive des populations de stomoxes d Haematobia irritans et de Tabanid s Jacquiet et al 2009 Les taons seraient des vecteurs plus efficaces pour transmettre la maladie que les stomoxes Bigalke 1968 Seuls les mois d hiver pr sentent tr s peu de cas cliniques L extension de la saisonnalit va avoir pour cons quence un changement de strat gie de contr le des insectes vecteurs Alzieu et al 2011 47 Nombre de bovins d clar s malades 10 5 T JFMAMJJASOND JFMAMJJASOND JFMAMJJASOND JFMAMJJASOND 2005 I 2006 l 2007 2008 H Champsaur H Entrevaux B Gapen ais La Faurie Bi Principale H Saint Jeannet V suble Seyne Embrun Figure 12 Saisonnalit tendue des cas cliniques en r gion Provence Alpes C te d Azur de 2005 2008 FRGDS PACA 2008 3 Pr valence et incidence En zone d enzootie l infection est r pandue dans les populations de bovins mais la population de b tes infect es qui d veloppent la maladie est beaucoup moins importante Pols 1960 Bigalke 1968 Legran
126. pette tips have to be changed for every pipet ting step Separate solution reservoirs must be used for each reagent Kit components must not be used after their expiry date or if changes in their appearance are observed Kit components of different kit lot numbers must not be used together Demineralized water or equal must be used for the test X SAMPLE PREPARATIONE 11 Serum can be obtained using standard methods SAMPLE DILUTION Preparatory Steps Reconstitute the control sample by adding 150 yl of Demineralized Water delivered with the kit Mix by vortexing thoroughly and inverting the vial several times or use already reconstituted con trol samples that have been stored at 20 to 80 C Sample dilution Use Dummy Plate or equivalent for first sample dilution Add 10 ul of Positive Control to wells A1 and B1 of the Dummy Plate Add 10 of Weak Positive Control to wells C1 and D1 of the Dummy Plate Add 10 ul of Negative Control to wells E1 and F1 of the Dummy Plate Add 10 ul of serum samples to the remaining wells of the Dummy Plate Add 190 ul of Sample Diluent to each well of the Dummy Plate and mix by pipetting up and down 5 times Add 90 ul of Sample Diluent to each well of the Test Plate Transfer 10 yl of the diluted samples and con trols from the Dummy Plate to the Test Plate and mix by pipetting up and down 5 times SAMPLE INCUBATION Incubate the s
127. r arriver au bout je vous dois cette r ussite Merci infiniment A ma S ur pour ta bonne humeur et ton optimisme inconditionnels Tu as su r ussir ta vie je suis tr s fier d avoir une s ur comme toi A ma mamie Simonne parce que tu as toujours cru en ma r ussite je sais que tu as beaucoup pri pour moi merci du fond du coeur Je suis tellement fier d avoir une super mamie comme toi A ma mamie Jeannette et mon papy Jacques pour votre gentillesse pour tous les p g p bons moments pass s en votre compagnie chez vous chez Jean Pierre aux Etats Unis et pour tout l amour que vous t moignez envers vos petits enfants A mes amis de longues dates A Antoine Nicolas et Quentin les comp res les mousquetaires pour notre amiti sans faille depuis plus de 20 ans pour tous ces beaux moments qu ils nous restent vivre ensemble de lyc e A Ryadh pour ton amiti vieux fr re pour nos sketchs ta grande gueule nos vacances Saint Georges de Didonne nos moments de gal riens A Arnaud pour ton humour nos fous rires en cours nos sketchs nos soir es un peu trop arros es Limoges qui parle de Ti punch A Coraline pour ta bonne humeur caract ristique ta fraise ta g n rosit et pour nos futures aventures australiennes Sydney A Maxime K vin Martial pour tous les bons moments pass s ensemble au lyc e et depuis et tous ceux venir en commen ant par l hiver prochain
128. r contre aucun nodule n est d tectable et une hyperthermie n est d celable que lors de surinfections bact riennes Le syndrome de dermatite prurigineuse de la vache laiti re est caract ris par des l sions d hyperk ratose une hyperthermie et des h morragies internes diffuses Il s agit d une intoxication alimentaire au formol et l acide sulfurique tout deux contenus dans l ensilage de mais Les intoxications aux l gumineuses tr fle vesce lupin se retrouvent surtout en mai juin et donnent une dermite papuleuse au niveau de la t te du cou de la mamelle des trayons du scrotum du p rin e Des sympt mes affectant la face sont associ s conjonctivite congestion et ced me des paupi res jetage ptyalisme Une diarrh e s v re peut d grader l tat g n ral de l animal La dermatite nodulaire d origine virale se caract rise par de volumineux nodules cutan s localis s au niveau de l encolure et des flancs On trouve galement associ s une polyad nom galie superficielle et des d mes des membres On ne la retrouve pas en France C Exp rimental Le diagnostic exp rimental de certitude est primordial dans les deux premi res phases de la maladie la troisi me phase poss dant un tableau clinique d j tr s vocateur Pour cela plusieurs m thodes sont disponibles celles qui permettent la mise en vidence du parasite ou de son ADN et celles permettant la mise en vidence de la r action immu
129. ragraphe Normes de S curit Risque et S curit Annexe IV Remarques Pour obtenir des r sultats optimums avec le test PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 les pr cautions sui vantes doivent tre prises Le mode op ratoire doit tre rigoureusement suivi Tous les r actifs du coffret doivent tre ramen s T ambiante 22 3 C avant utilisation L embout des pipettes doit tre chang chaque fois qu un nouvel chantillon ou r actif est pr lev Des r servoirs s par s doivent tre utilis s pour chaque r actif Les du coffret ne doivent pas tre utilis s apr s la date de p remption ou si un chan Les composants provenant num ros de lots diff rents ne doivent pas tre as soci s dans une m me s rie de tests Letest doit tre r alis avec de l eau d min ralis e ou une eau quivalente Contr les Les s rums de contr le sont reconstitu s en ajoutant 150 d Eau d min ralis e Composant 9 M langer par vortex et retourner plusieurs fois les flacons Les s rums de contr le doivent tre reconstitu s 30 minutes avant l usage and laiss s temp rature ambiante Solution de lavage Pr parer la solution de travail de lavage en m lan geant 1 dose de Solution de lavage 20x Composant 3 avec 19 doses d eau d min ralis e ou une eau de m me qualit ainsi que 0 02 dose d Additif pour solu tion de lavage soit 0 1 Composant 4 M langer jusqu l obtention d
130. rant la phase f brile ou latente 2 sp cifique pour diff rencier des parasites proches tels que N caninum ou T gondii 3 conomique en mat riel et en temps L IFI n est pas loin d tre un test consid r en tant que tel au vu de sa sensibilit et de sa sp cificit Cependant on ne peut pas le consid rer comme un test conomique lors d analyses de routine 104 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Ce travail a permis de conna tre les sp cificit s propres de l IFI du laboratoire de Parasitologie de l ENV Toulouse ce qui permet de disposer d sormais d un troisi me test diagnostic afin de lever les incertitudes dans certaines situations o le WB et l ELISA ne suffisent pas Les moyens diagnostiques se sont consid rablement d velopp s ces derni res ann es avec le d veloppement de nouvelles techniques telle que le test d agglutination Waap et al 2011 et l am lioration de techniques existantes WB et ELISA Schares et al 2010 2011 2013 Actuellement aucun test s rologique ne permet de d tecter des animaux infect s au cours de la phase aigu de la maladie Ainsi le d veloppement de nouveaux tests comme une PCR permettant de d tecter la pr sence d ADN parasitaire dans le sang au cours des premiers stades de l infection par B besnoiti serait une des options possibles La parasit mie a jusqu ici t rapport e uniquement chez les animaux qui sont tout juste infect s Bigalke 1968 En effet cert
131. rder avec l allure pizootique observ e dans les troupeaux laitiers Alzieu et al 2007a c Transmission par voie verticale La transmission de vache veau est peu probable car de nombreuses observations convergentes au Portugal en Allemagne et en France ont montr que les veaux n s de vaches infect es ayant pr sent des signes cliniques ou non ont des anticorps d origine colostrale pendant 5 6 mois puis redeviennent compl tement s ron gatifs Li nard et al 2011 54 IV ETUDE CLINIQUE A Pathog nie La l sion pathognomonique de la besnoitiose bovine est le kystes bradyzoites Franc et al 1987 Environ quatre jours apr s inoculation du parasite une inflammation p rivasculaire s installe Une semaine post infection les tachyzoites se multiplient dans les cellules endoth liales des veines du tissu conjonctif sous cutan remontant ainsi jusqu aux vaisseaux d un diam tre de 4 mm Cette invasion provoque petit petit l paississement de l endoth lium vasculaire et la formation de thrombi emp chant une bonne circulation sanguine Il s en suit un infarcissement des territoires en aval et l apparition d ced mes Les l sions de thrombophl bite g n rent une n crose vasculaire l origine de foyers h morragiques Franc et al 1987 L intense r action inflammatoire p rivasculaire et la parasit mie sont responsables du syndrome f brile initial Des granulocytes osinophiles
132. re de TOULOUSE M Michel FRANC Professeur l Ecole Nationale V t rinaire de TOULOUSE MEMBRE INVIT M Jean Pierre ALZIEU Docteur v t rinaire au Laboratoire V t rinaire D partementale de l Ari ge Libert galit Fraternit R PUBLIQUE FRANCAISE e e ECOLE 4 K 5 Libert galit Fraternit R PUBLIQUE FRAN AISE NATIONALE VETERINAIRE MINIST RE DE L AGRICULTURE DE L AGROALIMENTAIRE ET DE LA FOR T Minist re de l Agriculture de l Agroalimentaire et de la F ret ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE M A MILON PROFESSEURS CLASSE EXCEPTIONNELLE AUTEFAGE Andr Pathologie chirurgicale CORPET Denis Science de l Aliment et Technologies dans les Industries agro alimentaires DELVERDIER Maxence Anatomie Pathologique ENJALBERT Francis Alimentation EUZEBY Jean Pathologie g n rale Microbiologie Immunologie FRANC Michel Parasitologie et Maladies parasitaires MARTINEAU Guy Pathologie m dicale du B tail et des Animaux de Basse cour PETIT Claude Pharmacie et Toxicologie REGNIER Alain Physiopathologie oculaire SAUTET Jean Anatomie SCHELCHER Francois Pathologie m dicale du B tail et des Animaux de Basse cour EKEEEXEEEZEEEE PROFESSEURS 1 CLASSE BERTHELOT Xavier Pathologie de la Reproduction BOUSQUET MELOU Alain Physiologie et Th rapeutique me CLAUW Martine Pharmacie Toxicologie CONCORDET Didier Math matiques Statistiques Mod l
133. re de faux n gatifs mais en contrepartie on diminue la sp cificit en augmentant le nombre de faux positifs Le cas inverse est observ pour des dilutions plus importantes que 1 200 e g 1 400 ou 1 800 Cependant les seuls faux positifs n 15 observ s durant l tude la dilution 1 100 ne correspondent pas des r actions crois es avec N caninum ou T gondii En effet comme on l a vu pr c demment les s rums s ropositifs caninum n 32 et T gondii n 25 sont tous s ron gatifs B besnoiti apr s analyse par IFI ind pendamment de la dilution ce qui tait en accord parfait avec les r sultats n gatifs obtenus par WB Aucune r action crois e n a donc t observ e avec l un ou l autre de ces parasites proches Ces r sultats ne sont pas en accord avec de pr c dentes tudes qui ont montr l existence de r actions crois es entre les anticorps de N caninum et les antig nes de B besnoiti aux dilutions en dessous de 1 200 e g 1 100 Shkap et al 2002 Schares et al 2010 et l existence de r actions crois es entre les anticorps de T gondii et les antig nes de B besnoiti Goldman et Pipano 1983 L hypoth se de r actions crois es y compris avec les esp ces du genre Sarcocystis aurait demand e tre v rifi e avec un nombre plus important de s rums En effet les infections Sarcocystis spp sont tr s r pandues parmi les bovins infections inapparentes et sont le plus souvent d
134. res standards douteux s ropositifs s rums 232 n 110 57 4 N caninum gondii Positifs N gatifs WB ELISA WB ELISA WB ELISA WB WB WB WB n 121 n 111 110 32 n 25 3 n 1 2 111 0 0 0 0 0 1 e 10 111 110 32 25 3 0 Tableau 9 R sultats de l IFI la dilution 1 200 des diff rents groupes de s rums tudi s Parmi les s rums standards positifs 111 sont positifs l IFI seuil fix 1 200 soit quasiment 9246 contre 10 n gatifs La totalit des s rums standards n gatifs sont n gatifs l IFI La totalit des s rums douteux sont galement n gatifs l IFI La totalit des s rums s ropositifs N caninum et T gondii sont n gatifs l IFI quelque soit la dilution 1 100 1 200 1 400 1 800 Enfin parmi les autres s rums les r sultats de l IFI coincident avec ceux du WB soit 3 n gatifs et 1 positif 100 IV DISCUSSION A Mat riels et m thodes Dans cette tude nous d crivons une technique d immunofluorescence indirecte pour le diagnostic de la besnoitiose B besnoiti Le protocole propos a t adapt de celui d crit par Shkap et al 2002 et la souche de parasite a t isol e localement La notion de souche n a pas encore fait l objet de travaux avanc s concernant B besnoiti En particulier les variations antig niques n ont pas encore t tudi es finem
135. s taient respectivement de 92 et 100 En 2012 Garcia Lunar et al au sein d un consortium europ en ont r alis une tude comparative des diff rentes techniques s rologiques utilis es pour le diagnostic de la besnoitiose B besnoiti Deux diff rentes m thodes d IFI ont t compar es la m thode allemande a donn de meilleurs r sultats que la m thode espagnole avec une sensibilit de 100 et une sp cificit de 95 4 seuil fix 1 200 Les diff rences peuvent tre attribu es la qualit des r actifs employ s et de la valeur du seuil d cisionnel utilis C est une technique de diagnostic individuel car elle est assez lourde mettre en place et plus co teuse que l ELISA En effet au laboratoire de Parasitologie de l ENV Toulouse un test ELISA est estim 10 euros TTC contre 15 euros TTC pour l IFI Par rapport au Western Blot WB selon Schares 2010 l immunofluorescence indirecte pourrait tre plus sensible Il serait int ressant de mettre en place cette technique de diagnostic afin d arbitrer le statut d un bovin lors de r sultats discordants entre l ELISA et le WB b Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay ELISA Il s agit d une technique immuno enzymatique qui permet la d tection des anticorps anti B besnoiti dans un chantillon de s rum La r action fait appel aux anticorps sp cifiques de l antig ne ceux recherch s et des anticorps coupl s une enzyme sp cifiques du complexe i
136. s r actifs syst me de notation etc kDa 100 75 50 37 25 3 Figure 14 Comparaison entre le Western Blot d animaux infect s par Besnoitia besnoiti et d animaux non infect s 1 contr le du conjugu absence de s rum ajout 2 contr le n gatif s rum d animal non infect 3 contr le positif 4 7 s rums d animaux non infect s 8 16 s rums d animaux pr sentants des kystes dans la peau r v l par histologie I II et III 3 domaines Cortes et al 2006a 4 5 B 7 0 9 10 11 12 13 14 15 16 78 lt ILE lt 14 ALLIE LEE BILL Figure 15 Immunoblot de bovins infect s exp rimentalement par diff rentes esp ces de Sarcocystis par Toxoplasma gondii par Neospora caninum et par Besnoitia besnoiti utilisant des antig nes non r duit de tachyzoites A et de bradyzoites B de Besnoitia besnoiti N g control t moin n gatif lt 10 antig nes s l ctionn s pour le scoring de Immunoblot Mr poids mol culaire relatif Schares et al 2010 d R action d agglutination Cette m thode d taill e par Waap 2011 permet de d tecter les anticorps anti B besnoiti dans les s rums bovins Le principe des r actions d agglutination est de co incuber des dilutions de s rum avec des suspensions de tachyzoites Apr s incubation l agglutination est lue l il nu une r action positive se caract rise par un voile form au fond de la cupu
137. s rologiques de r f rence WB mais 7 ou 8 jours apr s le d but de la fi vre Cependant l infection est d tect e plus t t par RT PCR partir de 1 3 jours apr s le d but du stade f brile de la maladie Schares et al 2013 Cette m thode demeure tester grande chelle Les nouveaux outils d velopp s pour le diagnostic s rologique sont importants pour le contr le de la besnoitiose bovine car ils permettent aux leveurs de mieux d tecter B besnoiti ind pendamment du stade de l infection et ils permettent d viter la transmission de la besnoitiose aux bovins indemnes par s paration des animaux infect s du reste du troupeau Des tests avec une excellente sp cificit comme l APure BbELISA sont n cessaires pour viter les faux positifs ainsi que de longues et co teuses analyses de confirmation non n cessaires Schares et al 2013 c Western Blot WB Le Western Blot galement appel Immunoblot est la m thode de r f rence gold standard alliant tr s bonnes sensibilit et sp cificit Cependant elle ne peut tre utilis e pour du d pistage de masse car elle est trop co teuse et tr s lourde mettre en uvre En effet au laboratoire de Parasitologie de l ENV Toulouse le test WB est estim 20 euros TTC soit mod r ment plus cher que l IFI 15 euros TTC et bien plus cher que l ELISA 10 euros TTC Les m thodes disponibles utilisent d sormais des antig nes totaux
138. s cliniques les plus s v res touchent pr f rentiellement les taureaux avec un taux de l talit sup rieur au reste de la population Alzieu et al 2007a Ferri 1984 Legrand 2003 Le parasite atteint fr quemment les testicules o il y engendre des l sions souvent irr versibles foyers de n crose fibrose et calcification Plus de la moiti des taureaux atteints cliniquement deviennent st riles m me avec un traitement adapt Alors que les taureaux atteints de mani re subclinique restent fertiles Chez les femelles des kystes bradyzoites ont pu tre retrouv s dans les muqueuses de l appareil g nital femelle vulve vagin ut rus mais cela n affecterait pas la f condit Ferri 1984 Legrand 2003 300 250 200 150 100 nombre de cas cliniques 50 Moins de 2 ans Entre 2 et 4 ans 4 ans et plus Figure 11 R partition des cas de besnoitiose en fonction de l ge des bovins Legrand 2003 46 c La race Alzieu et al 2010 Legrand 2003 Aucune pr disposition raciale n a t jusqu ici d montr e Les sensibilit s soup onn es seraient plut t li es au mode d levage d Le mode d levage Jacquiet et al 2010 Legrand 2003 Legrand 2003 distingue trois modes d levage risque pour la contamination La transhumance est un facteur de risque majeur dans la r ceptivit des bovins En effet il s agit du regroupement d animaux provenant de divers cheptels dont le
139. s entretenue et importante Li nard et al 2011 Schares et al 2011 Si le rapport entre la r ponse anticorps mesur e par ELISA et la richesse en kystes de la peau est proportionnel cela nous donne donc un aper u de la capacit d un bovin transf rer le parasite un animal sain L limination s lective de ces bovins poss dant des concentrations lev s en anticorps pourrait diminuer la pression de transmission de la besnoitiose dans un troupeau infect Alzieu et al 2011 5 un r sultat positif n a pas t observ avant 3 semaines apr s le d but des signes cliniques D apr s Garcia Lunar et al 2012 les deux meilleurs tests ELISA actuellement commercialis s en Europe sont les tests ID Screen Besnoitia indirect IDVET et PHoCHECK Besnoitia Ab V2 0 avec respectivement 97 2 et 100 de sensibilit 100 et 98 8 de sp cificit Le test INGEZIM BES 12 BES K1 INGENASA a montr de moins bons r sultats avec 97 2 de sensibilit et 93 de sp cificit Cependant tous ces tests sont assez performants pour les utiliser lors de d pistage de masse R cemment un test ELISA t labor par l quipe allemande de Schares en 2013 Le nouveau test Apure BbELISA poss de une sensibilit revendiqu e de 100 et une sp cificit de 99 8 Il est capable de d tecter l infection un stade tr s pr coce de la maladie c est 76 dire au m me moment l g rement avant ou 1 jour apr s les autres tests
140. s immunoglobulines G se divise en sous classes IgG1 et IgG2 dont les cin tiques d apparition et profils de reconnaissance sp cifique respectifs sont diff rents Des infections exp rimentales de veaux par des oocystes de N caninum ont montr une apparition plus pr coce des IgG1 par rapport aux IgG2 De Marez et al 1999 Malheureusement aucun l ment n est actuellement disponible concernant les r ponses IgG1 et IgG2 des bovins face B besnoiti Cependant la cin tique d apparition des anticorps a d j t valu e Par IFI les anticorps sont d tect s d s 10 jours post injection intraveineuse et d s 22 jours post injection sous cutan e de parasites Janitschke et al 1984 aucune information compl mentaire n est disponible en revanche lors d infestations naturelles Par ELISA PrioCHECK Besnoitia Ab 2 0 ils sont d tect s une semaine apr s l injection exp rimentale de tachyzoites et 15 jours apr s par WB Fonclara 2011 En conditions naturelles ils ne sont pas d tect s respectivement avant 3 et 4 semaines apr s la d tection des premiers signes cliniques Li nard et al 2011 et persistent au moins pendant une p riode de deux ans des niveaux qui fluctuent dans l ann e mais toujours largement au dessus des seuils de positivit Alzieu et al 2011 Avec le nouveau test APure Bb ELISA d velopp par l quipe allemande de Schares 2013 les anticorps sont d tect s dans les m mes d lais que les tests s r
141. s in cattle in Switzerland Schweizer Archiv f r Tierheilkunde 154 469 474 Li nard E Salem A Grisez C Pr vot F Bergeaud JP Franc M Gottstein B Alzieu JP Lagalisse Y Jacquiet P 2011 A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France Vet Parasitol 177 20 27 Li nard E Salem A Jacquiet P Grisez C Pr vot F Blanchard B Bouhsira E et Franc M 2012 Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans Linnaeus 1758 Diptera Muscidae to transmit Besnoitia besnoiti Henry 1913 Apicomplexa Sarcocystidae Parasitol Res 112 479 486 Lindsay DS and Dubey JP 2001 Direct agglutination test for the detection of antibodies to Sarcocystis neurona in experimentally infected animals Vet Parasitol 95 179 186 Mackinnon A 2000 A spreadsheet for the calculation of comprehensive statistics for the assessment of diagnostic tests and inter rater agreement Comput Biol Med 30 127 134 Madubata C Dunams Morel DB Elkin B Oksanen A Rosenthal BM 2012 Evidence for a recent population bottleneck in an Apicomplexan parasite of caribou and reindeer Besnoitia tarandi Infect Genet Evol 12 1605 1613 Mehlhorn H Klimpel S Schein E Heydorn AO Al Quraishy S Selmair J 2009 Another african disease in central Europa besnoitiosis of cattle I Light and electron microscopical study Parasitol Res 104 8
142. sion par voie indirecte sense 54 c Transmission par voie verticale sn rein na 54 ETUDE CEINIOUE 577 S 22 MR a 55 AY Pathos ni s oec en uta tu I m 55 DS NEUEN CE a E T en PNE 55 C Symptomatologie ope pee odd ue s cat esu BRE 56 V PhascecarBue et Te DEB RSS Ses ha ange te ene y Ee 56 Dis Phase deste Cie AVES ND AR tes Dn vse Bota wa die St d a a 51 35 Phase de Scl rodermie sionis pies devas as eta dh dev 59 D L sions macroscopiques pai tete ee S abi 64 E L sions microscopIQUes oor teer teret ie vesti ter as eese NUS E ve eet dod eo Eu eed aute 68 Te Phase febre et d ir Hn p ea E ERU DE BiU 68 2 Phase de SCI TOURN ane A Rupee S tte 68 MV DIAGNOSTIC aci n e ena BRINDA V eere 70 Epid mio clinique seite su ceperit d ek suas least as 70 B Duif rentiel d RD atat te aes 70 Pendant phase Tebtile ane 70 2 Pendant la phase des cedefties ota eiie idle at vea e uad ues 70 3 Pendant la phase de scl rodermie et de d pilations sess 71 C Expe rimelitabs c ecce pm tena mette ee Me NS 12 1 M thodes dites directes mise en vidence du T2 qu NURSE en SPON 72 b Polymerase Chain Reaction PORTE eae 73 c Immunofluorescence 4
143. st figure 10 X e Suspicion clinique sans 7 N a confirmation s rologique Lane e PA Emergence f A JJ 77 V CE 9 Cas sporadiques Enzootie historique o y pa 5 6 at X Y N f Q R cemment y es f 2 A partir de 2005 NA AR lt 05 A partir de 2003 h t j es 3 e lt n ot e C Q A partir de 2001 r t v A partir de 1990 4 m se P E Avant 1990 AL o se 2s M ye 1 Figure 10 R partition g ographique des cas cliniques de besnoitiose bovine d apr s Alzieu et al 2007b 2011 45 2 Facteurs de sensibilit et de r ceptivit La besnoitiose bovine B besnoiti n affecte que les bovins qui sont r ceptifs et sensibles a L ge La pr sence de kystes bradyzoites dans les tissus de jeunes veaux g s de 4 5 mois montre que tous les bovins quel que soit leur ge sont r ceptifs Par contre ils ne sont pas forc ment sensibles c est le cas des jeunes bovins jusqu l ge d un an La plupart du temps il faut attendre au del d un an pour que la maladie au sens clinique du terme survienne mais cela reste assez variable figure 11 Aussi bien en zone end mique qu en zone d mergence r cente des enqu tes ont permis de confirmer l expression clinique pr f rentiellement chez les bovins g s de 1 4 ans Alzieu et al 2007b 2009 2010 Legrand 2003 b Lesexe Les forme
144. statut sanitaire diff re auquel s ajoute une abondance d insectes piqueurs et vecteurs de la besnoitiose L levage allaitant dit s dentaire non transhumant o la transmission du parasite se r alise par l achat de bovins porteurs ou bien par le biais d insectes vecteurs qui se propagent distance d levage en levage L levage laitier s dentaire o les contaminations prennent des allures pizootiques quelques animaux atteints sans aucune explication satisfaisante Ce dernier mode d levage serait m me assez rarement touch Toutefois comme pour l levage allaitant s dentaire l introduction d un animal infect est un facteur de risque non n gligeable e La saison Il tait commun ment admis jusqu la fin du 20 si cle que le nombre de cas cliniques de besnoitiose tait concomitant aux pullulations estivales des insectes vecteurs L expression saisonni re de la maladie prenait parfois des allures pseudo pizootiques avec un maximum d incidence de juillet septembre 80 des cas cliniques On observait tout de m me quelques cas cliniques en hiver Legrand 2003 Les formes inapparentes n taient pas possibles d celer comme actuellement A partir des ann es 2000 les travaux du FRGDS PACA dans le Sud du Massif Alpin ont permis de relever un changement important de cette saisonnalit figure 12 au d part elle tait proche de celle des zones traditionnelles d enzootie puis
145. t MOTS CL S BESNOITIOSE BESNOITIA BESNOITI DIAGNOSTIC SEROLOGIE IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE WESTERN BLOT ELISA ENGLISH TITLE Development of an indirect immunofluorescence antibody test IFAT for the diagnosis of bovine besnoitiosis Besnoitia besnoiti ABSTRACT Bovine besnoitiosis is an emergent disease in Europe EFSA 2010 and is responsible for heavy economic losses Most affected animals are asymptomatic and constitute a group that is essential to identify as quickly as possible This work presents the development of an indirect immunofluorescence antibody test IFAT at the Laboratory of Parasitology in ENV Toulouse In this study we evaluated the performance of the IPAT compared to Western Blot Gold Standard and to ELISA through the analysis of 403 serum and using four dilutions 1 100 1 200 1 400 1 800 Considering the positive cut off at 1 200 serum dilution the IFAT showed an almost perfect test agreement with the Western Blot 0 940 showing a relative sensitivity of 91 896 and a relative specificity of 100 It is quite a difficult technique to set up However it remains very useful to confirm the serological status of samples when discrepancy of results occurs between ELISA and WB KEYWORDS BESNOITIOSIS BESNOITIA BESNOITI DIAGNOSIS SEROLOGY INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE ANTIBODY TEST WESTERN BLOT ELISA
146. t d termin e par Globidium besnoiti Acad Med 161 163 108 De Marez T Liddell S Dubey J P Jenkins M C and Gasbarre L 1999 Oral Infection of Calves with Neospora Caninum Oocysts from Dogs Humoral and Cellular Immune Responses Int J Parasitol 29 1647 1657 Diesing L Heydorn AO Matuschka FR Bauer C Pipano E de Waal DT Potgieter FT 1988 Besnoitia Besnoiti studies on the definitive host and experimental infections in cattle Parasitol Res 75 114 117 Doyle MS Swope BN Hogsette JA Burkhalter KL Savage HM Nasci RS 2011 Vector competence of the stable fly Diptera Muscidae for West Nile Virus J Med Entomol 48 656 668 Dubey JP 2002 A review of toxoplasmosis in wild birds Vet Parasitol 106 121 153 Dubey JP Shkap V Pipano E Fish L Fritz DL 2003a Ultrastructure of Besnoitia besnoiti tissue cysts and bradyzoites J Eukaryot Microbiol 50 240 244 Dubey JP Sreekumar C Lindsay DS Hill D Rosenthal BM Venturini L Venturini MC Greiner EC 2003b Besnoitia oryctofelisi n sp Protozoa Apicomplexa from domestic rabbits Parasitol 126 526 539 Dubey JP Sreekumar C Rosenthal BM Lindsay DS Grisard EC Vitor RW 2003c Biological and molecular characterization of Besnoitia akodoni n sp Protozoa Apicomplexa from the rodent Akodon montensis in Brazil Parassitologia 45 61 70 Dubey JP Sreekumar C Rosenthal BM Vianna MC Nylund M Nikander S Oksanen A 2004 Red
147. t effet les outils diagnostiques ont besoin d tre standardis s Garcia Lunar et al 2012 Actuellement les techniques diagnostiques incluent l histophatologie Basson et al 1970 la cytologie partir de conjonctive Sannusi 1991 ou de muqueuse vaginale la Polymerase Chain Reaction Cortes et al 20072 et plusieurs techniques s rologiques bas es sur l ELISA Janitschke et al 1984 Shkap et al 1984 Fern ndez Garc a et al 2010 Schares et al 2011 le Western Blot Cortes et al 2006b Schares et al 2010 le test d agglutination Waap et al 2011 et l immunofluorescence indirecte Janitschke et al 1984 Shkap et al 2002 Schares et al 2010 Garc a Lunar et al 2012 L IFI a t mise au point dans diff rents laboratoires europ ens Portugal Espagne Allemagne A l Institut Friedrich Loeffler Allemagne Schares et al 2010 ont montr une meilleure sensibilit de l immunofluorescence indirecte par rapport au Western Blot revendiquant une sensibilit de 92 et une sp cificit de 100 au seuil de 1 200 Malgr ces excellents r sultats ces derniers ne peuvent tre transpos s directement d autres quipes de recherche Des variations de sensibilit et de sp cificit peuvent survenir du fait par exemple de la souche de B besnoiti utilis e et de l exp rience du lecteur La mise au point de l immunofluorescence indirecte au laboratoire de parasitologie de l ENV Toulouse permettrait
148. t en place une lamelle couvrant l ensemble des puits afin de limiter le contact avec l air La lecture des r sultats a t r alis e au microscope ultraviolets au grossissement x400 par un seul et m me observateur Une fluorescence ininterrompue sur tout le contour du tachyzoite la dilution 1 200 photo 33 a t consid r e comme seuil de positivit en accord avec Shkap et al 2002 Photos 33 Observation de tachyzoites sur une lame t moin positif la dilution 1 200 au grossissement x1600 F Lenfant 34 Pr paration des dilutions au 1 100 1 200 1 400 1 800 des diff rents s rums tester ainsi que des t moins positifs et n gatifs F Lenfant 90 Photos 35 D p t des pr parations dans les puits pour les s rums n 91 et n 105 F Lenfant 36 Incubation en chambre humide 45 min 37 C F Lenfant 37 Rincage des lames dans de l eau distill e F Lenfant 91 Photos 38a b Pr paration de Bleu Evans 0 05 F Lenfant 39 D p t des pr parations Conjugu Bleu Evans dans les puits F Lenfant 92 Photo 40 D p t de Fluoprep dans chaque puits puis mise en place d une lamelle par lame F Lenfant E D termination de la dilution optimale de la solution de tachyzoites Pour d terminer la concentration optimale de tachyzoites sur la lame une des tapes de la fixation de l antig ne sur lame a t optimis e Pour cela o
149. t violac e la base des trayons La production laiti re est en forte diminution un taureau pr sentant de s v res orchites accompagn es de testicules douloureux la palpation et d une infertilit transitoire ou d finitive Cortes et al 2005 Des cas d avortements et de diarrh e ont t d crits Ferri 1984 57 Photos 16 Phase des d mes d mes d clives sur les membres plis d d mes gonflement des boulets JP Alzieu 17 Phase des d mes plissements et hyperk ratose au niveau des bourses testiculaires Pathologie des Ruminants ENVT 18 Phase d d mes zones violac es la base des trayons JP Alzieu 58 Photo 19 Fin de la phase des d mes complications de crevasses avec exsudats s ro h morragiques l extr mit des membres JP Alzieu P Jacquiet 3 Phase de scl rodermie La phase chronique qui s en suit d marre donc environ 6 semaines apr s le d but des sympt mes et peut durer plusieurs mois Elle est caract ris e par la r gression des d mes et la formation de nombreux kystes bradyzo tes Ces kystes sont retrouv s dans la peau le tractus respiratoire haut le tissu conjonctif la scl re conjonctivale les muscles la muqueuse vaginale et parfois dans la rate le foie et le muscle cardiaque La peau s paissie fortement phase de scl rodermie se plisse et pr sente des zones d alop cie li es l crasement du follicule pileux
150. tement par voie orale de sulfathiazol Thiazomide ND la dose de 20 g par jour pendant 2 5 jours En 1979 Ubaliev et Baigaziev au Kazakhstan ont leur tour propos un traitement celui ci base de chlorophos en topique et de lugol en injection intraveineuse Ce dernier traitement long 45 50 jours et contraignant donnait de bons r sultats avec disparition de la plupart des kystes cutan s une peau redevenant souple et les poils repoussant en trois semaines Franc et al 1987 2 Les sulfamides m mes mol cules mais une posologie qui volue Actuellement il est recommand d utiliser en association un anti infectieux sulfamides un anti inflammatoire non st roidien et des diur tiques furos mide puis thiazidique afin de limiter les effets secondaires de la besnoitiose L efficacit du traitement repose sur la pr cocit de sa mise en place Pour bien faire il doit imp rativement tre commenc en phase f brile ou au plus tard en phase des oed mes Alzieu et al 2010 L utilisation des sulfamides est encore d actualit malgr l avanc e des recherches effectu es sur la maladie Par contre la posologie est diff rente En premi re intention on recommande l utilisation de la sulfadim razine la dose de 150 200 mg kg PV ou de la sulfadim thoxine la dose de 80 mg kg PV Le traitement ne doit pas tre inf rieur 7 jours dont les 2 3 premiers jours par voie intraveineuse lente et la suite par vo
151. ti sch matisation Le cycle pid miologique de B besnoiti fait appel un cycle historique h t rox ne de chat bovin d importance mineure et un cycle homox ne de bovin bovin d importance majeure figure 6 F lid s ES Pa oU ON JE YN LU N a NL Oocystes non sporul s Kystes tissulaires k Kystes tissulaires Oocystes sporul s Figure 6 Les deux cycles possibles dans la besnoitiose bovine Alzieu et al 2010 b Cycle h t rox ne de chat bovin d importance mineure Le parasite Besnoitia besnoiti est un protozoaire voluant selon un cycle de type coccidien Ferri 1984 Chez l h te d finitif apr s ingestion de kystes bradyzoites la paroi des kystes se lyserait lib rant ainsi les bradyzoites dans la lumi re intestinale Ils se transformeraient alors en sporozoites qui volueraient de mani re asexu e par schizogonie Ils p n treraient ensuite les ent rocytes puis continueraient leur transformation en passant par les stades trophozoites schizontes et m rozoites Ces derniers seraient alors lib r s dans la lumi re digestive Ferri 1984 Franc et al 1987 Commencerait alors la phase de reproduction sexu e ou gam togonie les m rozoites infecteraient de nouveaux les cellules pith liales et donneraient des gam tocytes voluant leur tour soit en macrogam tocytes forme femelle soit en microgam tocyte forme m le La f condation d un macrogam t
152. tiel Pendant la phase f brile Franc et al 1987 Fonclara 2011 Le syndrome f brile initial peu sp cifique peut tre retrouv lors de bronchopneumonies de coryza gangr neux ou lors de fi vre catarrhale ovine Les bronchopneumonies infectieuses enzootiques BPIE se manifestent en plus du syndrome f brile par un jetage bilat ral une anorexie une arumination La diff rence se fait donc au niveau pulmonaire o l auscultation est d une grande importance Le coryza gangr neux ou maladie des trois fontaines entraine comme son nom l indique du jetage du ptyalisme et un larmoiement Elle se retrouve plut t dans les levages mixtes bovin ovin puisqu il s agit d un herp s virus ovin qui contamine les bovins A la diff rence de la besnoitiose on a une k ratite bleue bilat rale et une poly ad nom galie 2 Pendant la phase des d mes Alzieu et al 2007b L ehrlichiose Anaplasma phagocytophilum est diff rencier de la besnoitiose par ses ced mes de l extr mit des membres ou des parties d clives en g n ral 70 La fi vre catarrhale ovine forme sub aigu est quant elle diff rencier de la besnoitiose par ses ulc res au niveau de la muqueuse buccale et par son absence de modification du rev tement de la peau malgr une hyperesth sie cutan e Des d mes d origine cardiaque sont situ s pr f rentiellement au niveau de l auge signe de la bouteille et ou du
153. ud il est curieux que certaines de ces zones correspondent des points de rassemblement importants des oiseaux migrateurs durant leur migration d Afrique jusqu en Eurasie Elphick 2007 Il reste d montrer que les oiseaux peuvent tre infect s par des esp ces de Besnoitia en tant qu h tes interm diaires et d finitifs et joueraient un r le de vecteurs sur longues distances de mani re comparable gondii Lehmann et al 2006 Cependant les travaux de Rommel 1975 d une part et de Diesing 1988 d autre part n ont pas permis l infection du Marabout d Afrique Leptoptilos crumeniferus et du Vautour africain Gyps africanus oiseaux charognards et s dentaires africains Les rapaces migrateurs cependant n ont pas t tudi s Des kystes morphologiquement tr s similaires sont induits par d autres parasites apicomplexes chez les oiseaux Cependant aucune preuve g n tique n a t fournie quant l tiologie parasitaire et ces cas doivent donc tre consid r s prudemment Olias et al 2011 D autres protozoaires tr s proches des Besnoitia tels que T gondii et N caninum peuvent infecter une grande vari t d esp ces aviaires Costa et al 2008 Dubey 2002 Furuta et al 2007 Gondim et al 2010 Par cons quent un cycle biologique impliquant les oiseaux comme h tes interm diaires pourrait tre envisag Olias et al 2011 40 3 Evolution du parasite a Cycle pid miologique de Besnoitia besnoi
154. uitable gloves Component 4 Washing Fluid Additive Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 5 Conjugate Diluent Ready to use Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 6 Conjugate 30x Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 7 Chromogen TMB Substrate Ready to use Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 8 E Corrostve Stop Solution Ready to use Hazard Code R35 Causes severe burns S26 In case of contact with eyes rinse immediately with plenty of water and seek medical advice 5836 37 39 Wear suitable protective clothing gloves and eye face protection 545 In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show the label where possible Component 9 Demineralized Water Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 10 Positive Control Lyophilized Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 11 Weak Positive Control Lyophilized Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 12 Negative Control Lyophilized Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Prionics AG Wagistrasse 27a CH 8952 Schlieren Zurich Switzerland Tel 41 44 200 20 00 Fax 41 44 2
155. une solution claire Voir la table de dilution Annexe 11 Remarque si la solution de lavage 20x fait apparai tre un pr cipit r chauffer le flacon 30 C dans un bain d eau chaude jusqu ce que le pr cipit se dissolve enti rement Conjugu Pr parer le Conjugu 30x Composant 6 en m lan geant 1 dose de conjugu avec 29 doses de Diluant conjugu Composant 5 Remarque La solution de travail du conjugu doit tre pr par juste avant utilisation 1 1 Utiliser une plaque non sensibilis e ou un qui valent pour la premi re phase de dilution de l chantillon comme indiqu au point quip ment n cessaire 1 2 Ajouter 10 ul de S rum de contr le positif Composant 10 dans les puits A1 et B1 de la Sots ton serena 1 3 Ajouter 10 ul de S rum de contr le positif faible Composant 11 dans les puits C1 et D1 de la plaque non sensibilis e 14 Ajouter 10 ul de S rum de contr le n gatif Composant 12 dans les puits E1 et F1 de la plaque non sensibilis e 1 5 Ajouter 10 d chantillon de s rum ou plasma dans les autres puits de la plaque non sensibili s e 16 Ajouter 90 ul de Tampon de dilution chantillon Composant 2 dans chacun des puits de la pla que non sensibilis e et m langer en pipetant 5 fois 17 Ajouter 90 ul de Tampon de dilution chantillon Composant 2 dans chacun des puits de la Mi croplaque Composant 1 18 Transf rer 10 ul des chantillons dilu s et s ru
156. ure 7 Cycle h t rox ne Chat lens 42 Figure 8 Cycle homox ne Bovin Bovin s 43 Figure 9 R partition mondiale des diff rentes esp ces de Besnoitia Agrandissement Expansion chronologique de B besnoiti en Europe ss 44 Figure 10 R partition g ographique des cas cliniques de besnoitiose bovine 45 Figure 11 R partition des cas de besnoitiose en fonction de l ge des bovins 46 Figure 12 Saisonnalit tendue des cas cliniques en r gion Provence Alpes C te d Azur de 2005 42008 PE 48 Figure 13 Sensibilit de la PCR en temps r el d ITSI ADNT eee 73 Figure 14 Comparaison entre le Western Blot d animaux infect s par Besnoitia besnoiti et d animaux Non infect s caos oc inque pea tos Dina fuae nds i od 78 Figure 15 Immunoblot de bovins infect s exp rimentalement par diff rentes esp ces de Sarcocystis par Toxoplasma gondii par Neospora caninum et par Besnoitia besnoiti utilisant des antig nes non r duit de tachyzoites A et de bradyzoites B de Besnoitia besnoiti 79 Figure 16 Proposition de conduite tenir au cas de d pistage positif de besnoitiose dans un levage auparavant indemne te Vade acad ilH Declan 82 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 Synonymie chronologique de la besnoitiose bovine
157. vants att nu s utilis s sont galement produits partir de tachyzoites En Europe si la situation d enzootie persiste dans certaines r gions il n est pas exclu que la vaccination apparaisse du moins pour prot ger les animaux sensibles taureaux reproducteurs Alzieu et al 2011 En appui ces mesures vaccinales il est important de ne pas n gliger le contr le des insectes vecteurs de la maladie Pour cela la lutte fait appel aux pyr thrinoides de synth se le plus souvent appliqu s en pour on sur le dos des bovins Un des avantages de ces mol cules est sans nul doute son pouvoir r manent de plusieurs semaines Les pyr thrinoides de synth se agissent contre les mouches des cornes Haematobia irritans les Hippoboscidae et les mouches l cheuses Musca autumnalis et M domestica Par contre son activit d pend entre autre du temps de contact des mouches avec le bovin Par cons quent la protection apport e n est pas similaire selon les esp ces de mouches A priori elle est m me diminu e pour les taons et les stomoxes qui passent en g n ral moins de temps que les mouches des cornes sur les bovins Il parait donc difficile de proposer un plan de lutte efficace contre ces deux esp ces vectrices de B besnoiti puisque le but serait de pr venir toute piq re ou tout risque de transmission m canique La lutte future pourrait s int resser aux stades plus pr coces de ces vecteurs 81 2 Prophylaxie sanitaire Alzieu
158. x 30 minutes Volume Washing Fui of Washing amount of amount ot Washing CET 127 dar r water Fasa Addi E gt w Remark If the Washing Fluid 20x shows precipita tions warm the bottle up in a warm water bath ap proximately 30 C until all salts are completely redis solved Conjugate working solution Mix indicated volumes of Conjugate 30x with the appropriate amount of Conjugate Diluent supplied with the kit to obtain the desired amount of Conjugate of mi of Conjugate Plates needed mi of Se Oooo o gt T A m mi m 7 Appendix lll Pipetting Schemes Recommended pipetting scheme for Dummy Plate and Test Plate DEA CA CN CI CA ESSE cu ecl ecd te ele Tele E Ed EE Ecol Ecol cad Ec te sd cd Ed Ed Ec E ERE cad Eco cad cd Ec d cad ad cn c d CEE tete ele A ddd DS EE Cartel d cad ecd d a d CEE FEE EB ete Te ET CEE ETS Appendix IV Safety Regulations and R amp S Statements National Safety Regulations must be strictly fol lowed R amp S Statements Component 1 Test Plate Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 2 Sample Diluent Ready to use Hazard Code This product is not classified according to EU regulations Component 3 x Harmful Washing Fluid 20 x conc Hazard Code This product is not classified according to
159. xys calcitrans est 32 fois plus petit que celui des tabanid s respectivement 0 4 ml et 12 5 ml Li nard et al 2012 Plus de 52 000 piq res de Stomoxys calcitrans sont n cessaires pour provoquer l infection alors que seulement 3 piq res de taons suffisent Bigalke 1968 De plus les risques de contamination des pi ces buccales de l insecte d pendent de la profondeur de p n tration et du type de plaie produite encore une fois les tabanid s ont l avantage par rapport aux stomoxes Bigalke 1968 R cemment une tude men e en laboratoire utilisant la PCR quantitative et l immunofluorescence directe par Li nard et al 2012 a permis de confirmer la capacit de transfert m canique du parasite par S calcitrans depuis une g nisse en phase chronique de besnoitiose et pr sentant de nombreux kystes cutan s bradyzoites un nourrisseur artificiel sur membrane et puisse transmettre m caniquement ce parasite Photo 5 Photo 6 Tabanus sp Taon Stomoxys calcitrans Mouche d table R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 4 Dipt res brachyc res orthorrhaphes m dicale Fiche 7 Dipt res brachyc res cyclorrhaphes 2009 calypt res 2009 50 Photo 7 Haematobia irritans Mouche des cornes R f Service de Parasitologie ENVT Entomologie m dicale Fiche 7 Dipt res brachyc res cyclorrhaphes calypt res 2009 Photo 8 Glossina sp
160. yspn e Digestif arumination anorexie G nital avortement rare Locomoteur pi tinement r pugne se d placer et se coucher encolure face interne des cuisses r gion p rin ale oreilles chanfrein Tableau 2 Classification des sympt mes au stade f brile de la maladie en fonction de l appareil atteint Alzieu et al 2011 Franc et al 1987 56 Photos 14 Phase f brile piphora photophobie et jetage s reux JP Alzieu 15 Phase f brile jetage s reux filant JP Alzieu 14 2 Phase des d mes Cette seconde phase appara t la suite de la phase f brile et correspond une forme subaigu de la maladie Elle dure 1 2 semaines et se caract rise par une diminution de la temp rature rectale simulant une gu rison avec att nuation des signes g n raux D un point de vue clinique on observe un animal douloureux la palpation sa peau reste chaude et paisse sans scl rodermie et perd de son lasticit en particulier au niveau de l encolure et de la r gion thoracique un animal r ticent se d placer et anorexique avec apparition de nombreux d mes sous cutan s au niveau de la face du fanon et des r gions d clives en particulier des membres des boulets parfois jusqu aux canons Les articulations sont douloureuses et les n uds lymphatiques superficiels sont hypertrophi s une vache pr sentant une mamelle congestionn e douloureuse e

Mise au point d`une technique de diagnostic sérologique par

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