FACSCAN MODE D`EMPLOI MISE EN ROUTE
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1. Acquire acquistion amp storage gt 5000 ou 10 000 si on a d finit une r gion d int r t on peut d finir l acquisition sur RI au lieu de all s lectionner GI R1 Acquire counters Acquire Parameter description Folder s lectionner ou cr er le fichier correspondant la manip les acquisitions y seront enregistr es date par ex File v rifier qu on est sur sample ID et remettre le compteur 1 file count puis OK dans sample ID identifier le tube ex contr le 1 J1 25 01 Cytometer Detectors Cytometer Threshold Cytometer Compensation Cytometer Status Disposer chacune de ces fen tres droite de l cran c t de la page de travail Ces fen tres vont permettre d effectuer les r glages pr liminaires Lors d utilisations ult rieures il est possible de rappeler des r glages d une pr c dente manip et de se mettre ainsi dans des conditions exp rimentales similaires Cytometer Instrument Settings Open fichier concern puis set puis done ETEINDRE LA LUMI RE Sur le FACS mettre position RUN Fluid Control sur LO Vortexer le tube de cellules non marqu es le placer sous la buse Sur l ordi dans la fen tre acquisition control v rifier que le setup est coch puis touche acquire l acquisition se fera en continu jusqu ce que l on clique sur pause ou abort il faut donc surveiller le ni2. pertoire Utiliser la barre d outils pour cr er les quadrants dot plots ou histogrammes n cessaires pour l acquisition Une fen tre quadrant inspector s ouvre pour chaque quadrant et permet de d finir les param tres souhait s en abscisse ordonn e nbre d v nements repr sent s couleur Il faut pour chacun Plot type acquisition to analysis Show dots 5000 cocher multicolor dating 1 quadrant en X choisir FSC Forward Scatter ou pl estimation de la taille en Y choisir SSC Side Scatter ou p2 estimation de la granularit L chelle doit tre lin aire ce n est pas le cas sur cette figure T Acquisition Dot Flot ee Tu O CR Lu E D wf 10 to 10 101 FSC H Ce quadrant permet d ajuster les gains des photomultiplicateurs PMT de fa on visualiser une population cellulaire sous forme d un nuage de points homog ne Il sera possible de tracer une r gion d int r t autour de ce nuage de points de fa on liminer les agr gats ou d bris distincts de la population homog ne et que l on ne souhaite pas analyser Pour mettre l chelle en lin aire Acquire connect to cytometer Cytometer Detectors amps mode mettre FSC SSC en lin les autres en log 2 quadrant en X FSC toujours en lin aire en Y FL1 H en chelle Log FL1 H ou p3 correspond au PMT associ au filtre de fluorescence dans le vert voir sch ma dans le class
3. FACSCAN MODE D EMPLOI MISE EN ROUTE Allumer le FACScan et l imprimante avant l ordinateur Ouvrir devant volet du bas e V rifier que la valve de pression est baiss e e Vider la poubelle r servoir de droite normalement c est fait par l utilisateur pr c dent d cliper la sonde et les 2 tuyaux e Ajuster le niveau de liquide de veine au 2 3 FACS Flow r servoir de gauche idem d cliper les tuyaux pour soirtir le r servoir e Remonter la valve l indication Standby doit s afficher Remarque les fils lectriques sont sensibles attention aux faux contacts sinon l appareil indique Not Ready Purger le circuit Fluid control sur Lo Run Valve sous pression Purger le circuit en tant au dessus d un b cher le bouton blanc du tuyau de purge et le remettre ausit t La chambre d analyse D gager le support du tube enlever le tube Ouvrir le volet du haut Faire Fill puis Drain plusieurs fois jusqu ce qu il n y ait plus de bulles dans la chambre d analyse Remettre le tube d eau Acquisitions utilisation du logiciel CellQuest Pro O Cell QuestPro Un fichier untitled s affiche ainsi qu une barre d outils Lors de la premi re utilisation ce fichier servira de page de travail pour les acquisitions File setup format A4 et 90 puis OK Sinon il est possible de la retrouver en faisant File Open et la retrouver dans son r
4. en wf q0 jo 10 10 Pour chacun de ces quadrants il est possible d afficher des statistiques S lectionner le quadrant ou l histogramme puis dans la barre de menu choisir Stats quadrant stats ou Histogram stats Les valeurs s afficheront en direct au fur et mesure de l acquisition Dans Stats edit on peut choisir plusieurs l ments acquisition date Gate Quad label sample ID X parameters File Y parameters Gated Total Quand la feuille de travail est pr te elle peut tre enregistr e Lors d une prochaine utilisation elle pourra tre rappel e par le menu File Open settingsC cile par ex Exemple d une page de travail sans les stats apr s une premi re acquisition les r glages ne sont ici pas optimaux annd40 002 T anhexind0 P Eer E re cn cu LE u2 as A x E E F m E 200 400 600 800 10 1000 F amp Height FSc Height annd0 002 m S annd jgz m m rm T D rm z 5 m 1 f Z LEE CE Z R SE Mi T 10 101 10 10 104 100 q0 jo 10 101 annexine Y FITE annesine Y FITE T annd O0 ae Fai P I LL E Los 0f qjol 10 19 101 annee Y FITE R GLAGES POUR L ACQUISITION Acquire gt Connect to cytometer si cen est pas d j fait si ce n est pas possible c est que l ordre d allumage n a pas t respect le cytom tre doit avoir t allum avant l ordi sinon faire Restart
5. eur On verra donc un nuage de points selon les param tres de fluorescence verte en fonction de la taille A l aide de la barre d outils tracer une ligne au niveau de la valeur 10 Ceci permettra d ajuster les gains des PMT de FLI de fa on r gler l auto fluorescence des cellules non marqu es entre les valeurs O et 10 Lors de l acquisition des cellules marqu es leur fluorescence appara tra au del de ce seuil Acquisition Dot Flat FL1 H 10 10 104 101 107 a0 10 107 107 FSC H 3 quadrant histogramme de la fluorescence verte en X FLI H en log en donne le nbre d v nements counts Acquisition Histogram Plat 120 160 200 Courts d 0 100 ol 0f 10 101 FL1 H Le curseur R1 permet de rep rer l autofluorescence 4 quadrant m Acquisition Dot Plot refaire la m me chose que le quadrant 2 mais avec FL2 H rouge La a Feu Um 2 I m LL 7 S me quadrant histogramme de la fluorescence rouge 100 gol 10 19 101 FSC H Acquisition Histogram Flot 120 160 200 Courts d ka bi 1f got jo 10 101 FL3 H 6 me quadrant fluorescence rouge en fonction de la fluorescence verte en X FLI H en FL2 H Permet de v rifier les bons r glages d autofluorescence dans les 2 couleurs C est partir de ce quadrant que l on pourra compenser FL2 par rapport FLI lorsque le vert bave dans le rouge T Acquisition Dot Flot Ti Ti m LL E
6. s des cellules en conditions exp rimentales Conseil faire des triplicates 3 tubes diff rents pour chaque condition 3 contr les 3 trait s etc PROC DURE D EXTINCTION Logiciel Acquire puis Disconnect from Cytometer Mettre du FACS Clean 2 ml dans un tube Run Laisser pendant 10 20 minutes Mettre un tube de FACS Rinse Run Laisser pendant 10 20 minutes Mettre un tube d eau distill e Standby Baisser la Valve Vider la poubelle dans l vier Remettre 200 ml d eau de javel dilu e Remettre en place Eteindre l ordinateur puis le FACS Remarque la buse embout gris ne doit jamais tre immerg e dans du liquide ne pas trop remplir les tubes mais veiller ce que le syst me n aspire pas de l air ne pas laisser aspirer la totalit du contenu du tube
7. veau de suspension cellulaire dans le tube Lors de la vraie acquisition on ne cochera plus le setup et l acquisition s arr tera lorsque le nombre d v nements d finit aura t acquis 5000 ou 10 000 si l acquisition est normale on commence voir le nuage de points et l histogramme dans counters si le nbre d v nements analys s reste 0 et qu on ne voit pas les points la buse est peut tre bouch e stopper l acquisition et faire fill puis drain plusieurs fois puis relancer l acquisition Attention v rifier que p1 FSC et p2 SSC soient en chelle lin aire les autres en log R GLAGES DES D TECTEURS Pour ajuster les r glages on fera quelques acquisitions pr alables 1 cellules non marqu es pour ajuster l autofluorescence Dans la fen tre detectors amp ajuster les voltages gains des PMT pour p1 et p2 de fa on voir une population homog ne en FSC SSC 2 cellules 100 marqu es pour suivre la fluorescence et si besoin ajuster les compensations entre les diff rents PMT On aura donc autant de tubes 100 marqu s que de fluorochromes analyser Normalement les cellules fluorescentes apparaissent au dessus des valeurs 10 de l autofluorescence sans avoir modifier les r glages Si ce n est pas le cas observer au microscope fluorescence quelques cellules pour v rifier la sp cificit du marquage Ensuite lorsque les r glages seront tablis on pourra passer les tube
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