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grundpraktikum physiologie teil

1. 1 1 00 2 41 6 31 12 7 31 82 63 7 318 3 637 0 2 816 1 60 2 92 4 30 6 97 9 92 22 33 31 6 3 765 1 42 2 35 3 18 4 54 5 84 10 22 12 9 4 741 1 34 2 13 2 78 3 75 4 60 7 17 8 61 5 727 1 30 2 01 2 57 3 37 4 03 5 89 6 86 6 718 1 27 1 94 2 45 3 14 3 71 5 21 5 96 7 711 1 25 1 89 2 36 3 00 3 50 4 79 5 40 8 706 1 24 1 86 2 31 2 90 3 36 4 50 5 04 9 703 1 23 1 83 2 26 2 82 3 25 4 30 4 78 10 700 1 22 1 81 2 23 2 76 3 17 4 14 4 59 11 697 1 21 1 80 2 20 2 72 3 11 4 03 4 44 12 695 1 21 1 78 2 18 2 68 3 05 3 93 4 32 13 694 1 20 1 77 2 16 2 65 3 01 3 85 4 22 14 692 1 20 1 76 2 14 2 62 2 98 3 79 4 14 15 691 1 20 1 75 2 13 2 60 2 95 3 73 4 07 16 690 1 19 1 75 2 12 2 58 2 92 3 69 4 01 17 689 1 19 1 74 2 11 2 57 2 90 3 65 3 96 18 688 1 19 1 73 2 10 2 55 2 88 3 61 3 92 19 688 1 19 1 73 2 09 2 54 2 86 3 58 3 88 20 687 1 18 1 73 2 09 2 53 2 85 3 55 3 85 21 686 1 18 1 72 2 08 2 52 2 83 3 53 3 82 22 686 1 18 1 72 2 07 2 51 2 82 3 51 3 79 23 685 1 18 1 71 2 07 2 50 2 81 3 49 3 77 24 685 1 18 1 71 2 06 2 49 2 80 3 47 3 74 25 684 1 18 1 71 2 06 2 49 2 79 3 45 3 72 26 684 1 18 1 71 2 06 2 48 2 78 3 44 3 71 27 684 1 18 1 71 2 05 2 47 2 77 3 42 3 69 28 683 1 17 1 70 2 05 2 47 2 76 3 41 3 67 29 683 1 17 1 70 2 05 2 46 2 76 3 40 3 66 30 683 1 17 1 70 2 04 2 46 2 75 3 39 3 65 40 681 1 17 1 68 2 2 2 42 2 70 3 31 3 55 60 679 1 16 1 67 2 00 2 39 2 66 3 23 3 46 120 677 1 16 1 66 1 98 2
2. Pflanzenmaterial mehrere Tage alte Pflanzenkeimlinge auf steriler Platte mit Pflanzenmedium sind bereits angezogen p35S GUS Pflanzen transgen Wurzelpromoter GUS Pflanzen transgen Wildtyp nicht transgen Die drei Linien werden im Kurs als A B und C bezeichnet und sollen von Ihnen zugeordnet werden ACHTUNG TRANSGENE PFLANZEN IN AUTOKLAVIERM LL ENTSORGEN tt 59 Histochemischer GUS Test Je 300 ul GUS L sung werden in drei Eppendorfgef e gegeben f r die drei Pflanzenlinien A B C Gekeimte Pflanzen werden mit einer Pinzette in die GUS L sung gegeben Die Inkubation erfolgt bei 37 C im Dunkeln bis Blauf rbung klar zu erkennen ist Anschlie end wird die GUS Inkubationsl sung mit einer Pasteurpipette entfernt und durch Wasser ersetzt Die Keimlinge werden zur ck auf die Platte mit Medium gegeben ausgebreitet oder in einem Wassertropfen aufbewahrt um Austrocknen zu verhindern Unter dem Binokular werden die Pflanzen untersucht Die Organe und Gewebe mit Blauf rbung werden bei gr tm glicher Vergr erung betrachtet Die Blauf rbungen werden in Zeichnungen detailliert festgehalten Es kann auch photografiert werden Auswertung Die histochemischen GUS Befunde werden aufgezeichnet und verglichen Welche Transgene enthalten die Linien A Bund C Diskutieren Sie ob der 35S Promoter konstitutiv in Arabidopsis Keimlingen exprimiert wird In welchen Geweben sind die Promotoren aktiv Weshalb k
3. ENTWICKLUNGSPROZESSEN a Theoretische Grundlagen und Ziel Die f r jede Pflanzenspezies typische Morphologie anhand der wir die Spezies bestimmen k nnen entwickelt sich gem eines genetischen Programms So entwickeln die verschiedenen Pflanzenspezies und familien die f r sie charakteristischen Blattformen Blattstellungen Bl tenst nde und Bl tenformen sowie Farben In der Entwicklungsphysiologie wird das Entwicklungsprogramm der verschiedenen Organe und Zellen von der Initiation der Determinierung bis zur vollst ndigen Ausdifferenzierung untersucht Heute interessiert man sich insbesondere f r die Gene und Proteine und deren Wirkungsweise bei Entwicklungsprozessen In Pflanzen kann dies durchaus kommerzielle Interessen haben Gerade in der Pflanzenz chtung Gem se Zierpflanzen kommen st ndig Variet ten mit ver nderten morphologischen Merkmalen auf den Markt die vermutlich zum Teil nur durch Ver nderungen in einzelnen Genen hervorgerufen wurden Interessanterweise hat sich gezeigt dass gerade bei der Initiation und der Determinierung von Zellen und Organen sequenz hnliche also verwandte Gene Homologe in evolution r verschiedenen Pflanzenpezies und familien agieren Bei der Herausbildung spezifischer Bl ten und Blattformen kann es sich um die Anreicherung von Ver nderungen in der DNA Sequenz von wenigen Schl sselgenen handeln denen eine grundlegende Funktion bei dem betreffenden Prozess zukommt Um Verwandtschaf
4. Elektroden vorhandene Spannung ist ein Ma f r den pH Wert der Au enl sung und wird mit einem Voltmeter gemessen Mit der Glaselektrode kann kein absoluter pH 62 Wert bestimmt werden Das Ger t wird daher vor der Messung mit Eichpuffern eingestellt b Praktische Durchf hrung 1 Eichung des pH Meters Die Eichung des pH Meters Eichpuffer pH 7 0 und pH 4 0 und die anschlie ende pH Messung erfolgen nach der am Arbeitsplatz aush ngenden Bedienungsanleitung Zus tzlich sind folgende Punkte zu beachten Die Eichpufferl sungen werden zur besseren Handhabung vor der Eichung in 25 ml Bechergl ser eingef llt danach wieder in die Vorratsgef e zur ck gegossen Die Glaselektrode leicht zerbrechlich und teuer wird vor jeder Benutzung mit H O deion abgesp lt und anschlie end vorsichtig mit weichem Papiertuch getrocknet Beim Eich und Messvorgang ist darauf zu achten dass die Elektrode gen gend tief in die Eich bzw Messl sung eintaucht Der pH Wert wird abgelesen nachdem sich die Anzeige stabilisiert hat kann mehrere Minuten dauern Der Vorgang l sst sich durch leichtes Bewegen des Probegef es beschleunigen und stabilisieren Zwischen den Messungen ist die Elektrode stets in H20 deion eingetaucht aufzubewahren Die Eichung wird vor dem Praktikum vom Kursleiter in durchgef hrt 2 Ansetzen der Algensuspension und pH Messungen Die in einem Klimaschrank bei Licht und 27 C angezogenen Algen werd
5. T Die Identifizierung der an D nnschichten getrennten Carotinoide gr ner Bl tter und Algen Planta Berl 76 149 168 1967 Schopfer P amp Brennicke A Pflanzenphysiologie 5 Aufl Springer 1999 22 Versuch 1 3 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER CHLOROPHYLLE A UND BUNDDER GESAMTCAROTINOIDE IN GR NEN BL TTERN a Theoretische Grundlagen Der Gehalt der Chloroplastenpigmente in den Bl ttern einzelner Pflanzen variiert in Abh ngigkeit von u eren und inneren Faktoren Im Verlauf der Blattentwicklung einer Pflanze steigt er zun chst an erreicht allm hlich ein Maximum und nimmt bei Eintritt von Seneszenzerscheinungen wieder ab Von den Umweltfaktoren ben vor allem das Licht und die N hrstoffversorgung einen ma geblichen Einfluss auf den Chlorophyligehalt aus Bezogen auf das Trockengewicht sind Schattenbl tter chlorophyllreicher und carotinoid rmer als Lichtbl tter der gleichen Pflanze Allgemein gilt dass der Chlorophyligehalt mit steigender Beleuchtungsst rke abnimmt Gut mit Stickstoff ern hrte Pflanzen enthalten in der Regel mehr Chlorophyll als mangelhaft versorgte Pflanzen Bekannt ist auch dass saure und photooxidativ wirkende Immissionen der Luft den Pigmentgehalt der Pflanzen ver ndern nderungen im Pigmentgehalt betreffen meist auch das Verh ltnis der Pigmente zueinander Auf Unterschiede in der Beleuchtungsst rke reagieren viele Pflanzen mit deutlichen Verschiebungen im Mengenverh ltnis der bei
6. Wilder Wein b amphistomatische Bl tter von Bergenia crassifolia bzw B stracheyi Saxifragaceae Bergenie Sonstige Materialien und Ger te 2 Glaspl ttchen 50x50 mm mit aufgeklebten Dichtungsringen 40 mm siehe Abb 2 Klammern Schere Pr parierbesteck Trockenschrank Mikroskop Chemikalien Kobaltpapier Herstellung runde Scheibchen 40 mm aus Filterpapier ausschneiden in Kobaltchloridl sung CoCh 5 ig legen und anschlie end bei 90 C im Trockenschrank trocknen bis sie tiefblau geworden sind trocken aufbewahren Durchf hrung Die Kobaltpapierscheibchen werden in Dichtungsringen bedeckt mit Glaspl ttchen auf der Blattober und unterseite befestigt siehe Abb Mit Hilfe von Klammern werden sie soweit zusammengedr ckt dass die Kobaltpapierscheibchen ohne Quetschen der Bl tter luftdicht eingeschlossen sind Nach 20 min 1 h je nach Temperatur und Sonnenlicht kann man eine Rosaf rbung des Kobaltpapiers bei Prunus laurocerasus bzw bei Parthenocissus tricuspidata auf der Blattunterseite beobachten w hrend das Papier auf der Blattoberseite zum gleichen Zeitpunkt noch deutlich blau ist Dagegen f rbt sich das Kobaltpapier bei Bergenia sowohl auf der Blattunterseite als auch auf der Blattoberseite rosa Zur Veranschaulichung werden von beiden Blatttypen jeweils Fl chenschnitte von der Blattober und der Blattunterseite angefertigt und im Mikroskop betrachtet Die 78 Beobachtungen werden i
7. d h mRNA gebildet wird Diese Aktivit ten sind charakteristisch f r alle Gene Die Gesamtheit der Aktivit ten eines Gens bezeichnet man auch als Genexpressionsmuster Das Genexpressionsmuster wird vom regulatorischen Bereich des Gens bestimmt insbesondere des Promoters Bei der Untersuchung der Funktionsweise von Genen in einem biologischen Prozess ist es sinnvoll das Genexpressionsmuster w hrend des biologischen Prozesses zu bestimmen Im Allgemeinen geht man von der Annahme aus dass Gene dann exprimiert werden wenn sie auch eine Funktion erf llen sollen Neben der direkten Untersuchung von isolierter RNA beruht eine alternative Methode auf der Verwendung eines Promoter Reportergentests Als Reportergen bezeichnet man ein Gen dessen Proteinprodukt direkt oder indirekt durch einen enzymatischen Test in den Zellen leicht nachzuweisen ist Die Aktivit t des Reportergens h ngt dabei von der Regulation des Promoters ab d h die Reporteraktivit t soll die Expressionsaktivit t des eigentlich zu untersuchenden Genpromoters wiederspiegeln Dabei wird die Promoterregion des zu untersuchenden Gens mit einem Reportergen fusioniert durch entsprechende Klonierung in bin ren Vektoren die sowohl in Escherichia coli als auch Agrobacterium tumefaciens repliziert werden k nnen Durch Agrobakterien vermittelte Transformation wird die Promoter Reportergenfusion als Transgen in Pflanzen eingebracht Pflanzentransformation Die Aktivit t des Promoters b
8. der beweglichen oder mobilen Phase an einem festen oder fl ssigen Stoff mit gro er Oberfl che der ruhenden oder station ren Phase vorbeigef hrt wird Eine Trennung der einzelnen Substanzen des Gemischs tritt dadurch ein dass diese in verschiedenem Ausma zur ckgehalten werden und so verschieden schnell durch das zweiphasige System wandern Entsprechend ihrer Eigenschaften k nnen verschiedenartige Substanzen in kleinsten Mengen aus Geweben isoliert mit fluoreszierenden Stoffen ggf gekoppelt und durch Hochdruck Fl ssigkeitschromatographie HPLC verbunden mit entsprechenden Fluoreszenz Detektoren aufgetrennt werden anwendbar f r Metabolite Peptide DNA Im Anschluss kann eine Identifizierung durch massenspektrometische Methoden 10 erfolgen Bei automatisierten Verfahren wie sie heute h ufig angewendet werden ist der Durchsatz enorm Nach Art der Kr fte die w hrend des chromatographischen Prozesses zur Trennung der Substanzen f hren unterscheidet man zwischen a Adsorptionschromatographie b Verteilungschromatographie c Ionenaustauschchromatographie d Ausschlusschromatographie Die meisten chromatographischen Verfahren beruhen auf den beiden Prinzipien Adsorption und Verteilung Diese werden im Folgenden n her beschrieben Adsorption nennt man allgemein die Anreicherung eines Stoffes an die Oberfl che eines anderen meist festen Stoffes der auch als Adsorptionsmittel oder Sorbens bezeichnet wird Die Stoff
9. nnte der CaMV einen konstitutiv in Pflanzen exprimierten Promoter ben tigen Was k nnte die Funktion eines wurzelspezifisch exprimierten Gens sein LITERATUR Jefferson R A Kavanagh T A and Bevan M W GUS fusions beta glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants EMBO J 6 3901 3907 1987 60 Versuch IV IONENAUFNAHME VON PFLANZEN UND PUFFERKAPAZIT T DES BODENS Zur Thematik des Versuchs siehe Campbell S 895 904 919 925 L ttge et al S 372 373 467 482 Mengel S 183 250 Nultsch S 273 280 Richter S 31 62 Versuch IV 1 SELEKTIVE IONENAUFNAHME a Theoretische Grundlagen Zellen k nnen sowohl Ionen als auch ungeladene Molek le selektiv aus dem umgebenden Medium aufnehmen Bei Pflanzen kann die selektive Ionenaufnahme durch pH Verschiebungen im N hrmedium verfolgt werden berwiegt die Kationenaufnahme so werden zum Ladungsausgleich Protonen abgegeben Das Medium wird dadurch sauer Umgekehrt wird bei bevorzugter Anionenaufnahme das N hrmedium durch die Abgabe von Hydrogencarbonat Ionen HCO basisch Derart induzierte pH Ver nderungen lassen sich besonders drastisch am Beispiel des stickstoffhaltigen Ionenpaars NH und NO zeigen Beide Ionen werden von Pflanzen besonders leicht aufgenommen Ammoniumern hrung wirkt auf das Au enmedium pH erniedrigend Nitratern hrung dagegen pH erh hend Ammoniumsalze NH CI NH4 gt SO4 werden deshalb auch als ph
10. notyps aus in Anwesenheit des Wildtyp Allels In der Regel beruhen rezessive Allele auf einer Mutation welche die Funktion des Gens zerst rt Funktionsverlust zum Beispiel kein Protein defektes Protein Hingegen beruhen dominante Allele h ufig auf Mutationen welche neue Funktionen f r das Gen gewinnen Funktionsgewinn zum Beispiel durch Aminos ureaustausche die eine Funktions nderung bewirken oder durch ver nderte Mengen an produziertem Protein Um rezessive oder dominante Auspr gung von mutanten Allelen zu berpr fen kann eine R ckkreuzung hilfreich sein Dabei wird die Mutante mit dem elterlichen Wildtyp gekreuzt Jetzt gelten die Mendelschen Regeln Ist der Ph notyp bei den Nachkommen Fl sichtbar ist die Mutation dominant ansonsten voraussichtlich rezessiv In der zweiten Generation F2 spaltet der Ph notyp auf Segregation Bei einer rezessiven Mutation liegt das Verh ltnis von Mutante Wildtyp bei 1 3 1 2 1 homo mut het homo wt Bei einer dominanten Mutation liegt das Verh ltnis von Mutante Wildtypph notyp bei 3 1 1 2 1 homo mut het homo wt Manche Mutanten k nnen im homozygoten Zustand vermehrt werden d h die Mutation verhindert die Samenbildung nicht Mutanten mit schweren Entwicklungsst rungen oder sterile Mutanten k nnen ber heterozygote Pflanzen vermehrt werden vorausgesetzt die Mutation ist rezessiv Im Praktikum werden Ihnen vier Mutanten vorgestellt Eine Mutation betrifft die Spezifikation
11. zellen Mit steigendem Turgor werden die R ckenwand und ein kleiner Teil der Vorderwand als einzige nicht verdickte Wandbereiche der Schlie zelle gedehnt Da die dem Spalt zugekehrten W nde wegen ihrer Verdickungsleisten der Dehnung nicht folgen k nnen kr mmen sich die Schlie zellen nach ihrer R ckenseite und es ffnet sich ein Spalt Umgekehrt f hrt eine Turgorabnahme zu einer Entspannung der R ckenw nde und somit zur Entkr mmung der Schlie zellen folglich zum Spaltenschluss Die Verteilung der Stomata h ngt von den jeweiligen Blatttypen ab Vorwiegend befinden sie sich in der Epidermis der Blattunterseite hypostomatisch weniger h ufig in der Epidermis beider Blattseiten amphistomatisch bei Schwimmbl ttern nur auf der Blattoberseite epistomatisch Die Anzahl der Spalt ffnungen kann zwischen 100 und 1000 mm Blattfl che betragen Dadurch erreicht die stomat re Transpiration Werte von 80 90 der Evaporation Mit folgendem Versuch kann die stomat re Transpiration auf einfache Weise veranschaulicht werden Er basiert auf einer einfachen Farbreaktion eines Indikators in diesem Fall Kobaltchlorid CoCh der sich bei zunehmender Feuchtigkeit von blau nach rosa verf rbt 77 Reaktionsgleichung Co 6 HO gt ColEb0 trocken gt feucht blau gt rosa Pflanzenmaterial a hypostomatische Bl tter von Prunus laurocerasus Rosaceae Kirschlorbeer oder Parthenocissus tricuspidata Vitaceae
12. 0 5 mol l pipettiert in ein siebtes 10 ml H20 deion zur Kontrolle Aus einer Kartoffel werden ca 130 s u Zylinder mit 5 mm Durchmesser gestanzt Korkbohrer und in 5 mm lange Abschnitte geschnitten Diese werden in eine kleine Petrischale gelegt die ihrerseits in eine gro e mit angefeuchtetem Filterpapier ausgelegte Schale gestellt wird feuchte Kammer WVerdunstungsschutz Zu Versuchsbeginn werden Kartoffelst ckchen entnommen vorsichtig mit weichen 71 Zellstofft chern abgetupft und zu 7 Proben 2 g 15 20 St ck abgewogen das exakte Gewicht notieren 6 Proben werden in die Saccharose L sungen 1 Probe in die Wasserkontrolle gebracht und w hrend des Versuchs mehrmals durchmischt Nach 2 h werden die Kartoffelst ckchen herausgenommen nochmals zwischen Zellstofft chern vorsichtig ohne Druck abgetupft und erneut gewogen c Auswertung In einem Diagramm ist die Differenz der Gewichtszu bzw abnahme der Kartoffelst ckchen Ordinate in Abh ngigkeit von der Molarit t der Zuckerl sungen Abszisse darzustellen Die Kurve die durch die Messpunkte gezeichnet wird schneidet die Abszisse bei jener Konzentration bei der keine Gewichtsver nderung eingetreten w re ihre Saugkraft also der des Kartoffelparenchyms entspricht Die Saugkraft ist der Sog mit dem Wasser osmotisch in die Vakuole einstr mt Aus der beigef gten Tabelle kann anhand der im Versuch ermittelten molaren Konzentration der entsprechende Druck
13. 36 2 62 3 17 3 37 o 674 1 15 1 64 1 96 2 33 2 58 3 09 3 29 a 25 12 5 5 2 5 1 0 5 0 1 0 05 a Irrtumswahrscheinlichkeit f r einseitige Fragestellung in Versuch W 2 NACHWEIS DER AMYLASE AKTIVIT T UND INDUKTION DER a AMYLASE IN GERSTENKARYOPSEN DURCH GIBBERELLINS URE a Theoretische Grundlagen Gibberelline z hlen zu den wachstumsf rdernden Pflanzenhormonen Sie wurden benannt nach dem Pilz Gibberella fujikuroi eine imperfekte Form von Fusarium moniliforme der z B fr hzeitige starke Internodienverl ngerung in Reispflanzen verursacht was zu einer Schw chung der Pflanzen f hrt Heute wei man dass Gibberelline zun chst bei der Keimung wichtig sind und dort in den Samen gespeicherte N hrstoffe mobilisieren Gibberelline verursachen auch das Streckungswachstum beim bergang der vegetativen zur reproduktiven Phase z B in Gr sern Salat oder Kohlpflanzen Schie en Zudem sind Gibberelline auch beim Fruchtwachstum und anderen morphologischen Prozessen beteiligt Bei der Keimung stellen die Reservestoffe f r die Keimpflanze zun chst die einzige Quelle organischer N hrstoffe dar Ihre Verwertung durch die Jungpflanze kann allerdings nicht direkt erfolgen denn es handelt sich um unl sliche oder kolloidl sliche makromolekulare Substanzen die zun chst mobilisiert also f r die Jungpflanze verwertbar gemacht werden m ssen Sie werden in l sliche niedermolekulare Einheiten zerlegt die dann zu den
14. Kieselgur G Merck Nr 8129 3 g Kieselgel 60 7729 3 g CaCO 2066 und 0 022 g Ca OH zur Neutralisation der Ascorbins ure in 55 ml 8x10 mol l Ascorbins ure Oxidationsschutz f r zu trennende Pigmente benutzt Nach dem Ausstreichen Streichdicke 0 25 mm werden die Platten bei 60 C 90 min lang getrocknet und im Exsikkator im Dunkeln aufbewahrt dadurch soll eine Photooxidation der Ascorbins ure verhindert werden Die D nnschichtplatten werden vom Betreuer des Versuchs vorbereitet und stehen bei Kursbeginn zur Verf gung Flie mittel ml Petroleumbenzin Kp 100 140 C Isopropanol H20 deion 50 6 0 125 Zuerst 6 ml Isopropanol und 0 125 ml H gt O deion 0 2 ml Pipette in Erlenmeyerkolben mischen 50 ml Petroleumbenzin zugeben und mischen Flie mittel in DC Kammer geben und diese verschlie en Deckelrand vorher nicht zu dick fetten Auftragen des Extraktes DC Platte nur am oberen Rand anfassen unterer Rand der Sorptionsschicht darf nicht besch digt werden Auftrageschablone mit Graduierung 1 5 cm vom unteren Plattenrand entfernt auflegen und mit 5 ul Mikrokapillare 200 250 ul Extrakt in einer 16 cm langen Startbande durch dicht nebeneinander gesetzte Punkte gleichm ig auftragen dabei Sorptionsschicht m glichst nicht besch digen Die u ersten Punkte der Startlinie 14 sollen etwa 2 cm vom linken und rechten seitlichen Plattenrand entfernt sein Zum Auftragen von 200 250 ul Extrakt wird di
15. Praktikum berechnen In einem 100 ml Messkolben wird eine 0 5 molare Saccharose Stamml sung angesetzt M 342 30 g mol Welche Menge an Saccharose muss eingewogen werden Als Hilfe kann man das u a Mischungskreuz oder die Formel V c2 x V2 c benutzen Aus dieser Stamml sung werden die folgenden Konzentrationen durch Verd nnen in 25 ml Messkolben hergestellt ml berechnen Endkonzentration ml Stamml sung ml H20 deion mol l 0 5 M kann auf 25 ml Endvolumen 25 ml aufgef llt werden 0 10 M E 0 20 M B 0 25 M z 0 30 M 7 0 35 M s 0 40 M 2 70 Als Hilfe Ca X Va c1 oder Mischungskreuz Ergebnisse Konzentration L sung 1 hier Stamml sung Oi sb 9 Konz 0 5 a Konzentration L sung 2 hier L sungsmittel Konz 0 Es werden 0 2 mi der 0 5 molaren Lsg und 0 3 mi der O molaren Lsg ben tigt um eine 0 2 molare L sung herzustellen Die jeweils ben tigte Menge der Stamml sung wird mit 5 bzw 10 ml Messpipetten in die Messkolben bertragen und diese bis zur Markierung mit H2O deion aufgef llt Messkolben verschlie en und L sungen gut durchmischen L sungen zur Verwendung in Versuch V 2 aufbewahren Versuch Vor dem Praktikum Tabelle f r die Gewichtsermittlung der Kartoffelst cke erstellen In 6 Reagenzgl ser werden mit Hilfe einer Vollpipette je 10 ml folgender Saccharosel sungen 0 2 0 25 0 3 0 35 0 4
16. Theoretische Grundlagen Hormone kommen in der Pflanze definitionsgem nur in sehr kleinen Mengen vor so enth lt z B eine Haferkoleoptile nur etwa 10 Mol des Hormons Auxin Indol 3 essigs ure abgek rzt IES oder engl IAA Strukturformel Campbell S 968 F r den Nachweis dieses Phytohormons und vor allem f r seine quantitative Bestimmung sind deshalb chemische Methoden meist zu wenig empfindlich oder nicht spezifisch genug Zur quantitativen Bestimmung verwendet man daher biologische Tests deren Prinzip darin besteht dass man an lebenden auf das Hormon ansprechenden Objekten eine spezifische Reaktion misst Die St rke der Reaktion wird dann mit einer sog Eichkurve Reaktion auf das entsprechende Hormon in bekannter Konzentration verglichen Ein solcher Biotest bietet auch noch eine weitere Untersuchungsm glichkeit man kann damit pr fen ob synthetisch hergestellte Stoffe die gleiche Reaktion hervorrufen wie das pflanzeneigene Hormon und weiterhin von welchen Faktoren die untersuchte Reaktion abh ngt Als Testobjekt verwendet man verst ndlicherweise solche Pflanzenteile die auf das zu untersuchende Hormon mit einer signifikanten Reaktion ansprechen Beim Auxin ist das klassische Objekt die etiolierte d h im Dunkeln angezogene Koleoptile Keimscheide koleo kole s gr Scheide koleo ptile ptilon gr Fl gel Feder Scheide am Sprossvegetationspunkt bei Poaceen von Gr sern vor allem Avena Hafer im Vers
17. Wassers an Wenn Wasser sich bewegt kann es Arbeit leisten Der Wortbestandteil Potential lat potens kr ftig im Begriff Wasserpotential bezieht sich auf diese potentielle Energie also auf die F higkeit Arbeit zu leisten wenn sich Wasser von einer Region mit hohem Y in eine Region mit niedrigem Y bewegt Bei reinem Wasser ist die Wasser Konzentration also die Konzentration der H20 Molek le hoch dies entspricht hohem Wasserpotential bei Wasser in L sungen ist die Wasser Konzentration niedrig dies entspricht niedrigem Wasserpotential Das Potential reinen Wassers in einem der Atmosph re ausgesetzten offenen Beh lter wird 0 gesetzt 0 MPa Das Wasserpotential einer Pflanzenzelle setzt sich aus 3 Komponenten zusammen Yr in Campbell Ys Potential gel ster Substanzen an osmotisch wirksame Teilchen in der Zellvakuole gebundenes Wasser Steigt die Konzentration gel ster Substanzen im Zellsaft so nimmt die Saugkraft der Zelle zu gleichzeitig wird ihr Wasserpotential erniedrigt Yp Druckpotential oder Turgorpotential ein hydrostatisches Potential Es ist ein Wasserpotential das durch Druck erzeugt wurde wie Wasser in einer Pipette das durch Druck auf das Gummih tchen herausgespritzt werden kann erh ht man den Druck wird auch p erh ht Yt Matrixpotential oberfl chengebundenes Wasser Hier handelt es sich um Wasser das an Zellwandbestandteile an Zelloberfl chen an Proteine u a geb
18. b und 470 Gesamtcarotinoide nm gemessen Das Extraktionsmittel Aceton dient als Vergleichsl sung mit der vor Beginn der Messungen ein Nullabgleich vorzunehmen ist vgl hierzu in Versuch V 2 die notwendigen Einstellungen am Spektralphotometer c Auswertung Die Konzentrationen der Pigmente werden nach den in den Theoretischen Grundlagen angegebenen Gleichungen a b und c berechnet F r den jeweiligen Pigmentgehalt pro g Frischgewicht des Blattmaterials gilt 28 Pigmentgehalt mg x g Extraktionsmittel ml x Pigmentkonzentration Extrakt ug x ml Blatteinwaage mg Aus den Ergebnissen sollen dar ber hinaus der Gesamtchlorophyligehalt und die Verh ltnisse zwischen den beiden Chlorophyllen sowie zwischen Chlorophyllen Gesamtchlorophyll und Carotinoiden bestimmt werden Die erhaltenen Werte sind bersichtlich in einer Tabelle darzustellen und zusammen mit den in den beiden ausgeteilten Literaturstellen angegebenen Werten zu diskutieren Literatur Lichtenthaler H K amp Wellburn A R Determination of the total carotinoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents Biochem Soc Transactions 603 591 592 1983 29 Versuch II PHYTOHORMONE Zur Thematik des Versuchs siehe Campbell S 949 951 961 994 L ttge et al S 522 530 Mengel S 250 257 Nultsch S 460 470 Taiz amp Zaiger S 423 492 539 558 Versuch IV ZYLINDERTEST AUF AUXIN a
19. chlich mit Kieselgur und Kieselgel hergestellt Seit 1962 haben sich die Herstellungsweise und folglich auch die Herstellungsnummern bei der Firma Merck f r Kieselgur und Kieselgel ge ndert Dies kann eine ver nderte Teilchengr e der beiden Sorbentien und damit eine unterschiedliche Schichtdichte auf der DC Platte verursachen Daraus resultieren insbesondere bei den 3 Xanthophyllen deutliche Rf Wert Unterschiede zwischen den eigenen Platten und dem bei HAGER und BERTENRATH 1962 abgebildeten Chromatogramm Vergleichswerte f r die Tageslichtfarben der Pigmente sowie das Fluoreszenzverhalten der Chlorophylie sind der Fachliteratur zu entnehmen Literatur Hager A amp Bertenrath T Verteilungschromatographische Trennung von Chlorophyllen und Carotinoiden gr ner Pflanzen an D nnschichten Planta 58 564 568 1962 16 Vergleichschromatogramm zu Versuch V 1 Abb 2 D nnschichtchromatogramme 20x20 cm und 20x5 cm Schichtdicke 0 25 mm eines Blattextraktes von Hedera helix 30 min nach Beendigung der Trennung links D nnschicht a mit Ascorbins urebeimischung welche weitgehenden Schutz gegen ein oxidatives Verblassen der Farbstoffe bewirkt 1 Carotin an der Front 2 Chlorophyll a 3 Chlorophyll b 4 Lutein 5 Lutein 5 6 epoxid 6 Violaxanthin 7 Neoxanthin 8 Startlinie Aus Hager amp Bertenrath 1962 Hinweis Lutein 5 6 epoxid Zone 5 kann bei der Extraktion als Artefakt in Spuren entstehen und ist deshalb im Chro
20. der Einzelwerte ist Will man unterscheiden ob der Mittelwert des Zuwachses bei der Kontrolle von dem bei 10 molarer Auxinl sung wirklich verschieden ist dann muss die Wahrscheinlichkeit f r den Unterschied mit Hilfe einer statistischen Methode berechnet werden Eine Pr fung dieser Wahrscheinlichkeit oder des Grades der Signifikanz ist mit Hilfe der Pr ffunktion t m glich die nach folgender Formel berechnet wird t Test oder Student Test X17X2 t Sp wobei sp der mittlere Fehler der Differenz der beiden Mittelwerte ist und sich nach der a 9 a 1 1 n n 2 n n berechnet Die verwendeten Symbole wurden bereits definiert die Indizes bzw 2 Formel beziehen sich auf die beiden betrachteten Messreihen Die statistische Sicherheit f r den Unterschied der beiden Mittelwerte ist umso gr er je gr er der Wert t ist Aus der beigef gten Tafel zur t Verteilung kann entnommen werden welchen Wert t bei einer entsprechenden Zahl von Freiheitsgraden f n n2 2 und bei bestimmten Sicherungsgrenzen mindestens haben muss Liegt der errechnete t Wert numerisch ber dem theoretischen dann ist der Unterschied mit der entsprechenden Sicherheit wahrscheinlich Der Grad der Wahrscheinlichkeit wird durch den p Wert ausgedr ckt er ist gleich a wird aber meist nicht in angegeben z B a 0 25 p 0 0025 33 34 Tafel t Verteilung
21. in bar abgelesen werden Um die Saugkraft als Wasserpotential zu kennzeichnen ist der errechnete Druck nur mit negativem Vorzeichen zu versehen 72 Tabelle zu den Versuchen V 1 und V 2 Osmotischer Druck von Saccharose L sungen aus Metzner 1982 mol l 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 0 0 00 0 26 0 54 0 80 1 07 1 34 1 61 1 87 2 14 2 41 0 1 2 67 2 95 3 21 3 48 3 75 4 01 4 28 4 54 4 81 5 08 0 2 5 36 5 64 5 94 6 22 6 51 6 79 7 07 7 37 7 65 7 94 0 3 8 24 8 53 8 83 9 12 9 41 9 71 10 00 10 30 10 62 10 94 0 4 11 26 11 58 11 90 12 22 12 53 12 86 13 18 13 51 13 84 14 18 0 5 14 50 14 83 15 16 15 49 15 85 16 20 16 57 16 93 17 29 17 65 0 6 18 01 18 37 18 75 19 11 19 49 19 86 20 24 20 61 20 99 21 37 0 7 21 77 22 16 22 56 22 95 23 35 23 74 24 15 24 59 25 01 25 44 0 8 25 87 26 30 26 72 27 15 27 55 27 96 28 36 28 77 29 17 29 68 0 9 30 09 30 59 31 10 31 50 32 01 32 52 33 02 33 53 34 04 34 54 1 0 35 05 35 56 36 16 36 67 37 18 37 68 38 19 38 70 39 30 39 81 1 1 40 32 40 93 41 43 42 04 42 55 43 05 43 66 44 27 44 77 45 38 1 2 45 99 46 60 47 21 47 81 48 42 49 03 49 64 50 24 50 95 51 56 13 52 27 52 88 53 59 54 30 55 01 55 61 56 32 57 03 57 74 58 45 14 59 16 59 87 60 68 61 39 62 10 62 91 63 62 64 43 65 14 65 85 1 5 68 66 67 36 68 17 68 99 69 80 70 61 71 52 72 43 73 44 74 05 1 6 74 86 75 77 76 68 77 49 78 41 79 32 80 23 81 24 82 26 83 17 1 7 84 08 85 09 86 11 87 12 88 13 89 14 90 16 91 27 92 28 93 40 18 94 41 95 53 96 64 97 75 98 87 99 98 101 20 102 31 103 53 104 64 1
22. man zu lange wartet Hierzu Platte vertikal auf glattes Papier stellen jeweilige Pigmentzone mit Schabespachtel sorgf ltig ausschaben und ausgeschabte Schicht vom Papier durch Pulvertrichter in Zentrifugenglas ungraduiert sch tten Pulver der Chlorophyll a und Chlorophyll b Zonen mit jeweils ca 1 ml Aceton Pasteurpipette Pulver der Luteinzone mit ca 1 ml 19 Ethanol EtOH Pasteurpipette bergie en und bis zur Weiterverarbeitung mit Stopfen verschlossen in K hlschrank stellen 2 Elution der Pigmente aus der DC Schicht Zentrifugenglas mit Stopfen auf Whirl Mix kurz durchsch tteln Suspension auf Glasfilternutsche G4 geben und Pigmentl sung in graduiertes Zentrifugenglas saugen Zentrifugenglas steht in einem Saugfinger der an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen ist auf Filternutsche und evtl im Zentrifugenglas zur ckbleibendes Sorptionsmaterial mehrfach mit wenig Aceton Chlorophyll a und b bzw EtOH Lutein bis zur Farblosigkeit nachwaschen Endvolumen des Eluats etwa 3 ml genaues Volumen im Protokoll notieren L sungen bis zur Aufnahme der Spektren mit Stopfen verschlossen in K hlschrank stellen 3 Aufnahme der Absorptionsspektren Das Messger t ist ein automatisch registrierendes Zweistrahl Spektralphotometer der Firma Shimadzu Modell UV 260 mit Bildschirm und Schreiber Messung der Chlorophyll a L sung a Allgemeiner Messvorgang das Absorptionsspektrum wird gegen Aceton als Blindl sun
23. mobilen Phase l slich sind Als Beispiel einer Verteilungschromatographie dient die im vorliegenden Versuch vorzunehmende d nnschichtchromatographische Trennung der Blattfarbstoffe nach einem Verfahren von HAGER und BERTENRATH 1962 Die Sorptionsschicht der Platte ist ein Gemisch aus Kieselgel Kieselgur und CaCO Das Flie mittel besteht berwiegend aus Petroleumbenzin mit einem Zusatz von Isopropanol und einer Spur Wasser Bei dieser Kombination bildet w ssriges Isopropanol durch Adsorption an das Schichtmaterial Tr ger die station re das Petroleumbenzin die mobile Phase Einer polaren station ren w ssrigen Alkoholphase steht somit eine apolare mobile Petroleumbenzinphase gegen ber Die Laufh he der Blattpigmente h ngt nun von ihrem L slichkeitsverhalten in diesen beiden Phasen ab Das apolare sauerstofffreie B Carotin ist am besten in Petroleumbenzin l slich und wandert deshalb mit der Flie mittelfront durch die Schicht Die schwach polaren sauerstoffhaltigen Xanthophylle Lutein Violaxanthin Neoxanthin wandern langsamer und lassen eine Trennfolge erkennen die der Zahl und der Polarit t ihrer sauerstoffhaltigen Gruppen entspricht Die beiden Chlorophylle l sen sich aufgrund ihres apolaren Phytolrestes relativ gut in der mobilen Phase Chlorophyll a wandert jedoch wegen der apolaren CH3 Gruppe im Pyrrolring B etwas weiter als Chlorophyll b das an der genannten Position eine polare Aldehydgruppe CHO tr gt Chromatographis
24. und dann mit Hilfe eines durchbohrten Gummistopfens im Potometer luftdicht und luftblasenfrei befestigt gegebenenfalls mit Vakuumfett abdichten Der Stand des Wassermeniskus in der Kapillare wird markiert und sein R ckgang unter verschiedenen Bedingungen jeweils 40 min lang im 10 Minuten Abstand an der Millimeter Skala abgelesen Bedingungen ruhende Luft und Wind der mit einem Ventilator erzeugt wird Aus der gemessenen Wegstrecke des Wassermeniskus l sst sich mit Hilfe des Eichwertes der Kapillare die von der Pflanze jeweils aufgenommene Wassermenge in ul angeben errechnen Gleichzeitig werden relative Luftfeuchtigkeit und Temperatur Thermohygrometer sowie die Windgeschwindigkeit Schalenkreuz Windmesser gemessen und notiert c Auswertung In einem Diagramm soll die Wasseraufnahme in ul als Ma f r die transpirierte Wassermenge Ordinate f r ruhende Luft und Wind gegen die Zeit in min Abszisse auftragen werden 82 Teilversuch Wie schnell der Wassertransport Transpirationsstrom in den Blattadern erfolgen kann l sst sich durch folgenden einfachen Versuch ermitteln Versuchspflanzen Wei bl hende Pflanzen z B im Fr hjahr Stiefm tterchen Viola tricolor Hornveilchen Viola spec oder Buschwindr schen Anemone nemorosa im Herbst Japan Anemone Anemone japonica oder eine andere Art die im Zeitraum der Versuchsdurchf hrung gerade bl ht Durchf hrung Eine Bl te mit Bl tenstiel wird fr
25. zum Beispiel indem man ein Gen in allen Zellen oder st ndig stark beraktiviert Konstitutive Genexpression oder berexpression Durch konstitutive oder berexpression kann ein beliebiges Gen pflanzeneigenes oder auch ein fremdes Gen aus einem anderen Organismus also in allen Zellen unabh ngig von seinem normalen Expressionsmuster aktiviert werden Mit berexpressionsstudien untersucht man zum Beispiel was passiert wenn ein Gen nicht mehr nur in bestimmten Zellen exprimiert wird sondern auf einmal in allen Zellen Dies kann helfen die Genfunktionen n her zu charakterisieren Man kann durch konstitutive Expression auch erreichen dass Pflanzen fremde Gene aus eigentlich anderen Organismen st ndig aktivieren zum Beispiel Resistenzfaktoren gegen Pathogene Um 57 einen berexpressionseffekt zu erreichen mu das gew nschte Gen zun chst mit einem konstitutiven Promoter fusioniert Klonierung hnlich wie oben und in Pflanzen als Transgen eingef hrt werden In Pflanzen verwendet man im Labor im allgemeinen den 35S Promoter des Blumenkohl Mosaikvirus Cauliflower Mosaic Virus CaMV Der 35S Promoter wurde vor zwanzig Jahren als quasi konstitutiv in fast allen getesteten dikotyledonen Pflanzen beschrieben Seither ist der CaMV 35S Promoter in vielen transgenen Laborans tzen zur Routine berexpression verwendet worden In transgenen Pflanzen die f r kommerzielle Anwendungen in der Landwirtschaft bestimmt sind wird der 35S Promot
26. 9 105 86 107 07 108 29 109 51 110 62 111 73 112 95 114 17 115 48 116 70 Alle Angaben f r 20 C in bar Beispiel f r die Benutzung der Tabelle Der osmotische Druck einer 0 22 molaren Saccharoselsg entspricht einem osmotischen Wert von 5 94 bar bzw einem Wasserpotential Yz von 5 94 bar 73 Versuch V 2 MESSUNG DES OSMOTISCHEN WERTES DURCH GRENZPLASMOLYSE a Theoretische Grundlagen Der osmotische Wert einer L sung h ngt von der Zahl der darin gel sten Teilchen ab Die Messung des osmotischen Werts ist durch die physikalische Methode der Kryoskopie Messung der Gefrierpunktserniedrigung m glich dazu braucht man jedoch einige ml Zellsaft die man durch Auspressen von sehr vielen Zellen also eines gr eren Gewebest cks gewinnen kann Will man den osmotischen Wert von wenigen bestimmten Zellen messen so bedient man sich der Methode der Grenzplasmolyse die auf folgenden berlegungen beruht Die Netto Saugkraft der Zelle ist gleich 0 wenn keine Wandspannung kein Turgordruck mehr vorhanden ist Dies ist dann sicher der Fall wenn sich der Protoplast gerade von der Wand abhebt also bei Grenzplasmolyse Legt man Gewebest ckchen in verschieden konzentrierte L sungen und pr ft nach einer gen gend langen Zeit in welcher der L sungen gerade Grenzplasmolyse eingetreten ist dann gilt bei dieser Konzentration Saugkraft der Au enl sung Saugkraft der Zelle Osmotischer Wert Der osmotische Wert des
27. ABC Genkonstellationen ben tigen F llt ein Gen aus ergeben sich die jeweils anderen Konstellationen die dann zu den hom otischen Ver nderungen f hren aus Schopfer amp Brennicke Se Sepalen Kelchbl tter A Pe Petalen Kronbl tter AB St Stamina Staubbl tter BC Ka Karpelle Fruchtbl tter 0 Ziel ist hier die entwicklungsspezifischen Ph notypen von vier Mutanten zu erkennen und zu beschreiben glabral agamous apetala2 apetala3 sich die zugeh rige Genetik zu berlegen und Erkl rungen f r die Ph notypen herzuleiten 53 b Praktische Durchf hrung Sie erhalten T pfe mit bl henden Arabidopsispflanzen Es handelt sich dabei jeweils um unterschiedliche Linien Nachkommen derselben Mutterpflanze Diese sollen Sie anhand der Fragen der Auswertung n her charakterisieren und die entsprechenden Zeichnungen anfertigen c Auswertung 54 1 2 3 4 5 6 Bei welchen T pfen handelt es sich um Wildtyp glabral agamous apetala2 und apetala3 Zeichnen sie die charakteristischen Ph notypen verglichen mit dem Wildtyp auf Woran haben Sie die Mutanten erkannt Erarbeiten Sie Bl tendiagramme f r die analysierten Bl tenmutanten vergleichen Sie mit dem Wildtyp und diskutieren Sie das ABC Modell Sind die Linien homozygot keine Segregation oder heterozygot Segregation Wenn Sie eine Segregation feststellen wie ist das Segregationsverh ltnis Was leiten Sie daraus ab
28. Aufgabenstellung kritisch interpretieren M gliche Fehlerquellen sind aufzuzeigen und die Ergebnisse in den Rahmen des etablierten Wissens einzuordnen d h mit Erwartungs und Literaturwerten zu vergleichen Formal zweizeilig 5 cm breiter rechter Rand einseitig bedruckt Computer erstellt Graphiken k nnen auch per Hand auf Millimeterpapier gezeichnet werden Der in Ver ffentlichungen bliche Material und Methodenteil kann wegfallen B VERSUCHE Versuch I PHOTOSYNTHESEPIGMENTE Zur Thematik des Versuchs siehe Campbell S 209 231 L ttge et al S 119 143 Mengel S 64 85 Nultsch S 281 311 Richter S 67 199 Versuch V 1 D NNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE TRENNUNG DER CHLOROPLASTENFARBSTOFFE AUS FRISCHEN EFEUBL TTERN a Theoretische Grundlagen Eine Auftrennung der photosynthetisch aktiven Blattfarbstoffe in die Einzelpigmente ist mit chromatographischen Methoden zu erreichen Hierzu m ssen sie zun chst mit organischen L sungsmitteln wie Aceton Alkohol u aus dem Blattmaterial extrahiert werden Nach Abtrennung von unl slichen Bestandteilen Filtration oder Zentrifugation liegt eine gr ne L sung vor die die verschiedensten Blattinhaltsstoffe enth lt Dieser Rohextrakt kann direkt der Chromatographie unterworfen werden Unter Chromatographie versteht man physikalische Verfahren zur Stofftrennung bei denen das zu untersuchende Stoffgemisch mit Hilfe einer Fl ssigkeit oder eines Gases
29. GRUNDPRAKTIKUM PHYSIOLOGIE TEIL PFLANZENPHYSIOLOGIE BIOLOGIE Universit t des Saarlandes Sommersemester 2008 TITELBILD Arabidopsis thaliana ist eine kleine Bl tenpflanze und ein viel genutzter Modellorganismus in der Pflanzenbiologie Arabidopsis z hlt zur Familie der Brassicaceen Kreuzbl tler Senfgew chse welcher auch Kulturpflanzen wie Kohl und Raps angeh ren Arabidopsis hat zwar keine agronomische Bedeutung aber bietet wichtige Vorteile f r die Genetik und Molekularbiologie in der Grundlagenforschung Weitere Informationen unter http www arabidopsis org info aboutarabidopsis jsp INHALTSVERZEICHNIS AsAllsemeines asien nein nee Termine Sicherheitsregeln Vorbereitung und Protokollierung Weiterf hrende Literatur zur Kursthematik Auswertung und Versuchsbericht BVEersuche rennen I Photosynthesepigmente sosssosssnnnssonnsnnnnnnnnnnnnennnnnnnnenn V 1 D nnschichtchromatographische Trennung der Chloroplastenfarbstoffe V 2 Absorptionsspektren der Chlorophylle und Carotinoide V 3 Quantitative Bestimmung der Chlorophylle und Carotinoide I Phytoh rmonei sauna an 1 1 Zylindertest auf Auxin 1 2 Induktion der a Amylase in Gerstenkaryopsen durch Gibberellins ure 1 3 Induktion der Dormanz durch Abscisins ure III Entwicklungsbiologie am Modellsystem Arabidopsis thaltana u nnenn nenn IV I Steuerung des Hypokotyl L ngenwachstums durch Licht mittels Phytochrom IIV 2 Arabidopsis Genetik zu
30. Leitungswasser gelegt a lebende und b 72 h in 70 EtOH und anschlie end 8 h bei 120 C erhitzte und dadurch abget tete Karyopsen Zahl siehe unten Nach Abk hlen des St rkeagars ca 10 min werden die Petrischalen mit Hilfe einer beigelegten Schablone folgenderma en beschickt I Petrischalen mit GA3 Petrischale 1 lebende gequollene Karyopsen quer halb durchgeschnitten warum mit Embryo warum Petrischale 2 lebende trockene Karyopsen quer halb durchgeschnitten mit Embryo Petrischale 3 abget tete gequollene Karyopsen quer halb durchgeschnitten mit Embryo II Petrischalen ohne GA wie oben Vorsicht vor dem Schnitt eines jeden Korntyps Rasierklingen Brettchen und Pinzetten gr ndlich reinigen Je 8 Gerstenkaryopsen werden mit der Schnittfl che nach unten nach vorherigem Abtupfen auf Zellstofftuch vorsichtig mit einer Pinzette auf den Agar gelegt und leicht angedr ckt 39 Man l sst die abgedeckten Petrischalen 24 h bei Zimmertemperatur auf dem Labortisch stehen Die a Amylase diffundiert aus dem Gerstenkorn gleichm ig in alle Richtungen in den Agar und baut die St rke rund um die Auflagefl che der jeweiligen Kornh lfte ab Man muss ferner davon ausgehen dass die der einen Petrischale zugesetzte GA3 ebenfalls und zus tzlich ber die Schnittfl che in die Kornh lfte diffundieren kann Folgerung Nach 24 h wird zun chst von jeder Petrischale mit den Karyopsenh lften ein Digitalfoto gemacht D
31. Protokollierung der Versuchsabl ufe im _Laborheft AHREND _ DES PRAKTIKUMS Zu jedem Versuch ist w hrend des Praktikums ein Protokoll im Laborheft zu f hren Dieses Protokoll soll Ihnen sp ter helfen die Versuchsabl ufe nochmals zu rekonstruieren und die Ergebnisse auszuwerten Wichtig ist dass Sie alle wesentlichen Arbeitsschritte Ergebnisse Beobachtungen und m gliche Abweichungen von der Anleitung schriftlich festhalten Daher sollte das Protokoll in chronologischer Reihenfolge die Arbeitsschritte und Ergebnisse enthalten Ein ordentlich gef hrtes Protokoll in gebundenem Laborbuch dient in der Forschung nicht nur als Hilfe f r die sp tere Dokumentation sondern kann auch ein wichtiger Beweis sein um die eigene Arbeitsleistung und die eigenen Ergebnisse an bestimmten Arbeitstagen nachweisen zu k nnen Das Laborheft sollte mindestens folgende Informationen enthalten Vorbereitung vor dem Praktikum Stichworte und Skizzen Datum Versuchstitel Titel der Teilversuche mit grober Skizze zu Ziel und Durchf hrung Zeitplan Vorabberechnungen Verd nnungsschemen etc Notizen zur Darstellung der sp teren Ergebnisse Protokoll w hrend des Praktikums Beschreibung der Arbeitsschritte und wesentlichen Details mit Angabe der Nummer der Teilversuche in chronologischer Reihenfolge ggf mit Uhrzeit Abweichungen von der Praktikumsanleitung unbedingt notieren Informationen der Betreuer innen zur Vorberei
32. Wie m ssen die Linien vermehrt werden f rs Praktikum im n chsten Jahr und wie kann man die korrekten Linien ausw hlen und berpr fen glabral und ap2 Mutanten k nnen homozygot vermehrt werden ag und ap3 nicht Weshalb Angenommen Sie wollten Samen von einer segregierenden und einer nicht segregierenden Linie von glabral erhalten Wie w rden Sie vorgehen ausgehend von einer homozygot vorliegenden glabra Pflanze Arabidopsis kann durch Selbstung vermehrt werden keine manuelle Operation notwendig Wird genetisch gearbeitet m ssen die Organismen jedoch h ufig gekreuzt werden Bei Arabidopsis werden daf r zun chst geschlossene Bl ten mit hervorstehendem Karpell gew hlt Die Bl ten werden mit einer Pinzette vorsichtig ge ffnet und Staubbl tter entfernt Kelch und Kronbl tter k nnen stehen bleiben Wichtig ist das zentrale Karpell Mit der Pinzette werden von einer reifen Bl te Staubbl tter abgezupft und der Pollenstaub auf das behaarte Stigma getupft Den Vorgang unbedingt unter dem Binokular verfolgen Falls verschiedene Linien miteinander gekreuzt werden mu die Pinzette st ndig in Alkohol sterilisiert werden um Fremdpollenbest ubung zu verhindern Konventionen f r die Bezeichnung von Arabidopsis Allelen Genen Proteinen a das Gen Wildtypallel GLABRAI b das Protein GLABRAI c die rezessive Mutante glabral LITERATUR Oppenheimer D G Herman P L Sivakumaran S Esch J Marks M D A myb gene required for l
33. Zellinhalts ist also gleich dem der Au enl sung Zellinhalt und Au enl sung sind isotonisch Grenzplasmolyse kann man bei Geweben deren Zellen eine gef rbte Vakuole z B durch Anthocyane besitzen leicht erkennen Bei Anwendung des Wasserpotentialkonzepts auf die osmotischen Verh ltnisse der Zelle tritt an die Stelle des osmotischen Werts bzw des dazu proportionalen potentiellen osmotischen Drucks das Potential gel ster Teilchen Yr Dessen Wert ist numerisch gleich demjenigen des osmotischen Drucks hat aber im Unterschied zu diesem ein negatives Vorzeichen Im Zustand der Grenzplasmolyse wird das Wasserpotential der Zelle ausschlie lich durch das Potential gel ster Teilchen Yr und das Matrixpotential Yt bestimmt Pz Yr Yr 74 Die mit dem Wasseraustritt verbundene Volumenabnahme f hrt zun chst zu einer Entspannung der gedehnten Zellwand p 0 Ist diese ganz entspannt dann l st sich der Protoplast bei weiterer Vakuolenverkleinerung von der Zellwand ab Dieser Vorgang wird als Plasmolyse bezeichnet Den Zustand in dem der Protoplast gerade beginnt sich von der Zellwand abzuheben bezeichnet man als Grenzplasmolyse Hypertonische Au enl sung PT Au enl sung lt PT Zeiisany Plasmolyse Hypotonische Au enl sung PT Au enl sung gt PT Zeisaty Deplasmolyse Wird das hypertonische Au enmedium durch ein hypotonisches ersetzt dann nehmen Protoplast und Vakuole wieder osmotisch Wass
34. am pH Meter auf pH 5 eingestellt warum L sung 2 reine Phosphatpufferl sung pH 5 0 als Kontrolle IES Konz 0 Beide L sungen wegen Lichtempfindlichkeit der IES m glichst wenig dem Licht aussetzen also sofort unter den Dunkelsturz stellen Versuch Gerade gewachsene etiolierte 4 Tage im Dunkeln mit 4x5 Rotlichtphasen angezogene 30 40 mm lange Weizen Koleoptilen Triticum aestivum werden mit einer Korkpinzette direkt ber der Basis vorsichtig abgezupft Anschlie end werden pro Versuchsl sung 14 Koleoptilen mit einer Dekapitierungspinzette etwa 15 20 mm unterhalb der Spitze von der Schmalseite Weizenkoleoptilen haben einen ovalen Querschnitt her eingeritzt durch vorsichtiges Biegen gebrochen der apikale Teil ohne 31 Quetschen von dem eingeschlossenen Prim rblatt abgezogen und mit einer Uhrfederpinzette vor bergehend in einer Schale mit Pufferl sung unter Dunkelsturz aufbewahrt um Trockenstress zu vermeiden Danach werden sie der Pufferl sung entnommen kurz auf einem Zellstofftuch abgetrocknet und dann mit der Spitze gegen den Anschlag des Schneideapparates Dekapitierungsl nge 3 mm gelegt um die Spitzen zu dekapitieren 2 x 14 Koleoptilen werden auf 5 mm L nge geschnitten und die erhaltenen Zylinder in die beiden jeweils mit 10 ml IES bzw Pufferl sung versehenen Glasschalen gegeben Uhrzeit notieren Protokoll Wichtig ist dass die Koleoptilen nicht zu lange dem Licht ausgesetzt sind warum Deshalb w
35. ann werden sie mit einer Pinzette entfernt und der Agar vorsichtig mit KII L sung Lugolsche L sung 300 ml Wasser 2 g KI 0 2 g h2 bergossen inklusive Kontrollpetrischale Man l sst die L sung etwa 20 Sekunden einwirken und gie t dann das KII ab Mit einem Digitalfoto eigene Kamera mitbringen werden die entstandenen wei en Flecken dokumentiert Anschlie end werden die Petrischalen mit ihrem Deckel umgekehrt auf einen Lichtkasten gelegt die der Flecken mit Hilfe eines Lineals abgelesen und notiert Der gesamte brige St rkeagar ist nun blau gef rbt Die Messtabelle hierzu entwerfen Sie bitte vorher c Auswertung Der Durchmesser der erkennbaren wei en Flecken als Ausma der a Amylaseaktivit t ist graphisch darzustellen Wie interpretieren Sie die Ergebnisse mit den unterschiedlich behandelten Gerstenk rnern Kurze schriftliche Zusammenfassung 40 Versuch W 3 INDUKTION DER DORMANZ DURCH ABSCISINS URE a Theoretische Grundlagen Neben anderen Wirkungen kann Abscisins ure ABA Strukturformel Campbell S 968 in der pflanzlichen Entwicklung Ruhezust nde einleiten und aufrechterhalten Sie verhindert w hrend der fr hen Reifungsphase des Embryos dessen spontane Auskeimung in der befruchteten Samenanlage Viviparie und erzwingt die Weiterentwicklung zum austrocknungstoleranten Samen unter Speicherstoffeinlagerungen Mutanten von Mais und Tomate welche die F higkeit zur ABA Synthese verloren haben zeig
36. ante hy Chromophormutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht b Praktische Durchf hrung Pflanzenmaterial Wildtyp Ler Landsberg erecta 90 Samen hyl 90 Samen 47 Wei licht Rotlicht Dunkel 75 ml Wasser mit 0 6 g Pflanzenagar werden autoklaviert Festgewordene Agarl sung p gt kann in der Mikrowelle aufgekocht werden 3 Petrischalen werden mit Agarl sung bef llt Sterilisierte Samen werden auf das Agarmedium pipettiert und mit einem Spatel vorher mit EtOH gereinigt abgefl mmt und luftgetrocknet vorsichtig verteilt jeweils auf der einen H lfte 30 Ler Samen und auf der anderen H lfte 30 hy Samen Anschlie end werden die Platten f r 1 4 Tage bei 4 C gut verschlossen und dunkel aufbewahrt Stratifizierung zur gleichm igeren Auskeimung Terminabsprache beachten Dann werden die Platten 1 Stunde lang mit Wei licht bestrahlt um die Keimung zu induzieren Arabidopsis ben tigt Licht zum Keimen Anschlie end werden die Platten entweder in eine Verdunklungsbox gegeben Dunkel in eine dunkle Box mit Rotlichtfilterdeckel Rotlicht oder in eine Box ohne Deckel Wei licht Die drei Boxen werden bei 21 C f r drei Tage in einen Pflanzenschrank mit kontinuierlichem Wei licht gestellt Am Montag der darauf folgenden Woche werden die Platten aus dem Lichtschrank genommen Sterilisierte Samen werden von Betreuern zur Verf gung gestellt Die winzigen Samen werden im Eppendorfgef mit 6 iger Na Hy
37. ar bei 50 rel Luftfeuchte das hohe Wasserpotential des Bodens zwischen 0 und 1 bar Bemerkenswert ist weiterhin dass das Wasserpotential innerhalb der Pflanze von den Wurzeln bis zu den Bl ttern von 2 bis 4 bar auf 5 bis 25 bar absinkt wobei die Werte in der Tracheenfl ssigkeit der Sprossachse von Angiospermen zwischen 5 und 15 bar liegen Die Messung der Transpiration erfolgt entweder durch Bestimmung der Wasserabgabe mit Hilfe einer W gung oder wie im vorliegenden Versuch durch Messung der Wasseraufnahme mit Hilfe eines Potometers Im letzteren Fall wird die am Potometer volumetrisch gemessene Wasseraufnahme gleich der Wasserdampfabgabe durch Transpiration gesetzt Erlaubt ist dieses Vorgehen weil sich bei Wasserbilanzmessungen gezeigt hat dass die Werte f r Wasseraufnahme und abgabe im Allgemeinen gleich sind 81 b Praktische Durchf hrung Vor dem Praktikum Tabelle vorbereiten zur Messung des Meniskusstandes in Abh ngigkeit von der Zeit Das Potometer lat potare trinken gr metron das Ma Ger t zur Messung der Wasseraufnahme von Pflanzen wird mit abgestandenem Leitungswasser bis zum Gef rand so gef llt dass auch die seitliche Kapillare luftblasenfrei ist Der zu verwendende Kirschlorbeerzweig Prunus laurocerasus wird einige Stunden vor Versuchsbeginn abgeschnitten und am Arbeitsplatz in Leitungswasser gestellt Etwa 1 Stunde vor Versuchsbeginn wird der Zweig unter Wasser noch einmal gek rzt
38. ationsgradienten zu einer Ionenanreicherung im Zellinnern f hrt siehe dazu auch Campbell S 896 898 Die selektive Ionenaufnahme bei Scenedesmus erfolgt ber den aktiven Transport Das hierzu ben tigte ATP wird durch Veratmung von Glukose aus St rke gewonnen sind die Zellen durch eine vorangegangene Dunkelperiode st rkeverarmt oder frei so kann im Au enmedium angebotene Glukose aufgenommen und veratmet werden Diese Zellen k nnen dann im Vergleich zu Zellen ohne Glukoseangebot mehr Ionen aufnehmen Wenn die Aufnahmegeschwindigkeit von Ionen durch Zugabe von Glukose ins N hrmedium erh ht wird so ist dies ein Hinweis f r die Beteiligung von aktivem Transport bei der selektiven Ionenaufnahme pH Messung Die Messung des pH Wertes erfolgt in der Regel mit Farbindikatoren oder mit einer Glaselektrode Mit der Glaselektrode Einstabmesskette wird eine Potentialdifferenz gemessen die sich zwischen einer L sung bekannter Wasserstoffionenkonzentration F llung der Glaselektrode und der zu messenden Au enl sung einstellt Die Ausbildung des Potentials beruht auf einem H Na Ionenaustauschvorgang zwischen der gequollenen Schicht eines Spezialglases Zapfen am unteren Ende der Elektrode Glaselektrode stets w ssern und den beiden angrenzenden L sungen Diese Glaselektrode steht mit einer Vergleichselektrode ges ttigte Kalomelelektrode in Verbindung deren Potential konstant und pH unabh ngig ist Die zwischen den beiden
39. che Methoden sind in erster Linie Trennmethoden dienen dar ber hinaus aber auch der Isolierung und Identifizierung von Substanzen Eine d nnschichtchromatographisch getrennte Substanz l sst sich vor allem anhand folgender Kriterien identifizieren Rf Wert Rf Retentionsfaktor bzw Rf Wert Reihenfolge Tageslicht und Fluoreszenzfarbe Reaktionen nach Behandlung mit spezifischen Spr hreagenzien Gr ere Sicherheit bei der Identit tsbestimmung ist zu erreichen wenn die abgetrennte Substanz aus der Schicht eluiert und spektroskopisch weiter untersucht wird vgl hierzu Versuch 1 2 Pr parative D nnschichtchromatographie 13 b Praktische Durchf hrung 1 Extraktion Efeubl tter Hedera helix ohne Stiele in kleine St cke rei en und 4 g auf Feinwaage abwiegen genaues Gewicht mit 2 3 Stellen hinter dem Komma protokollieren und in ein Kunststoff Becherglas geben Nach Zusatz zweier geh ufter Spatelspitzen CaCO3 soll Pheophytinbildung durch sauren Zellsaft verhindern und 12 ml Aceton werden die Blattst cke im Becherglas mit einem Schnitzelwerk gr ndlich zerkleinert Der berstand des Extraktionsgemischs wird anschlie end so vollst ndig wie m glich durch einen Rundfilter in ein Pillengl schen abfiltriert das Pillengl schen verschlossen und dunkel z B in der Labortischschublade aufbewahrt 2 D nnschichtchromatographie Schicht Als Masse zum Streichen von 5 D nnschichtplatten wird eine Suspension aus 12 g
40. dass Tomaten oder andere Samen innerhalb der Frucht selbst wenn sie ausgereift sind nie keimen nach Entfernen aus der Frucht aber hohe Keimraten aufweisen Die keimungshemmende Wirkung des 41 Fruchtfleisches bei Beeren l sst sich neben m glichen weiteren Stoffen auch auf das Vorkommen von ABA zur ckf hren 42 b Praktische Durchf hrung und Auswertung L sungen ABA 4 umol l aus dieser Stamml sung wird durch Verd nnen mit H20 deion folgende Konzentrationsreihe hergestellt 2 umol l 1 umol l 0 5 umol l 0 25 umol l wie Ansatz jeweils in einem 20 ml Messkolben 10 ml Pipetten gt H 0 deion als Kontrolle gt Tomatensaft f r 2 Gruppen wird 1 Tomate Solanum lycopersicum zerkleinert und der Saft durch Gaze in eine Glasschale gepresst Tomatensaft unverd nnt Zus tzlich wird pro Gruppe 1 ml davon in einem 10 ml Messzylinder mit H O deion 1 10 verd nnt gt Maracujasaft f r 2 Gruppen werden 2 Maracujas Passiflora edulis aufgeschnitten die Samen mit dem verschleimenden Arillus und der Pulpa aus den Fr chten ausgekratzt und der Saft durch Gaze gepresst Maracujasaft unverd nnt Zus tzlich wird pro Gruppe 1 ml davon in einem 10 ml Messzylinder mit H20 deion 1 10 verd nnt siehe Tomatensaft Versuch Je 30 Senfsamen Sinapis alba werden in 10 Petrischalen quidistant auf 3 Lagen Filterpapier 70 mm ausgelegt welches zuvor mit jeweils 5 ml ABA L sung 0 25 0 5 1 2 4 umol l siehe ob
41. den Chlorophylle Beim photooxidativen Ausbleichen von Nadeln und Bl ttern erfolgt der Abbau von Chlorophyll a und Carotin rascher als derjenige des Chlorophyll b und der Xanthophylle Jede nderung im Gehalt an photosynthetisch aktiven Pigmenten wird stets auch eine nderung in der Photosyntheserate und damit in der Energiebilanz der Pflanze nach sich ziehen Der quantitativen Pigmentbestimmung insbesondere der Chlorophyll Analyse kommt somit besondere Bedeutung zu Eine quantitative Bestimmung von Chlorophyll ist auch dann notwendig wenn der Chlorophyligehalt als Bezugsgr e f r Versuchsdaten verwendet werden soll Dies ist bei Photosynthesemessungen h ufig der Fall In neuerer Zeit sind Chlorophyll und Carotinoidmessungen auch als biochemische Indikationsm glichkeit f r die Einwirkung von Luftverunreinigungen benutzt worden Die quantitative Bestimmung der Pigmente erfolgt spektralphotometrisch Zuvor m ssen sie allerdings aus dem Untersuchungsmaterial extrahiert eventuell sogar 23 chromatographiert werden Als Messgr e im Spektralphotometer dient die Extinktion E Sie gibt die Schw chung der Lichtintensit t durch Absorption im Spektralphotometer an und ist der dekadische Logarithmus des Verh ltnisses der Intensit t des eingestrahlten Lichtes Io zur Intensit t des die Messprobe wieder verlassenden Lichtstrahls T Io E log I Das Photometer zeigt den Wert E log Iv I dimensionslos an die Extinktion i
42. e A Bei Kenntnis des Extinktionskoeffizienten e a er kann in vielen F llen der Literatur entnommen werden errechnet sich die Konzentration der zu bestimmenden Substanz aus der gemessenen Extinktion Ex wie folgt Ex Cx e a xd Zu Methode B Bei unbekanntem Extinktionskoeffizienten kann die Gehaltsbestimmung mit Hilfe einer Vergleichsl sung von bekannter Konzentration cy der zu bestimmenden Substanz durchgef hrt werden Bei gleicher Schichtdicke d gemessen gilt f r die Extinktion der Vergleichsl sung E amp E A xc xd und f r die Extinktion der Probel sung Ex E A xcxxd Die Extinktionswerte beider L sungen verhalten sich wie ihre Konzentrationen Ex C E ic Durch Umformen ergibt sich die unbekannte Konzentration cx Zu Methode C Zum Erstellen einer Eichkurve dienen mehrere L sungen mit bekannter aber unterschiedlicher Konzentration der zu bestimmenden Substanz Eichl sungen Die gemessenen Extinktionen dieser L sungen werden in einem Diagramm als Funktion der jeweiligen Konzentration aufgetragen Aus der so erhaltenen Eichkurve kann mit der gemessenen Extinktion der unbekannten Probe deren Konzentration graphisch ermittelt werden 25 Mehrkomponentenanalyse Nach Methode A k nnen Substanzen die gemeinsam in einer L sung vorliegen und deren Absorptionskurven sich teilweise berdecken dennoch einzeln bestimmt werden Beispielsweise werden die beiden Chlorophylle im Gemisch eines Blattextrakte
43. e Startbande etwa 2x durchlaufen Entwicklung des Chromatogramms Platte in DC Kammer stellen diese verschlie en und mit Dunkelschutz versehen Uhrzeit notieren Wenn Flie mittelfront ca 10 cm Steigh he erreicht hat i d Regel nach 20 30 min Platte aus der Kammer nehmen mit eigener Digitalkamera photographieren und dann noch auf der feuchten Platte die Front direkt oberhalb der B Carotin Zone sofort mit Pr pariernadel nachziehen Laufzeit notieren Danach zun chst die DC Platte unter einer UV Lampe bei 366 nm in einer Dunkelkammer betrachten siehe n chsten Abschnitt Anschlie end bis auf Chlorophyll a b und Lutein alle brigen Pigmentbanden mit Pr pariernadel markieren Danach Chlorophyll a Chlorophyll b und Lutein Zonen siehe Musterchromatogramm sofort wie in Versuch V 2 angegeben ausschaben Chlorophyll a blaugr n Chlorophyll b gelbgr n Lutein gelb Detektion der Pigmente und Dokumentation Bei der Betrachtung der DC Platte im kurzwelligen Blaulicht UV Lampe 366 nm Schutzbrille fluoreszieren die Chlorophylle a und b rot die Carotinoide zeigen keine Fluoreszenz Photo Digitalkamera auch der Gesamtextrakt im Pillengl schen soll auf Fluoreszenz untersucht werden Anhand der Rotfluoreszenz auf dem Chromatogramm k nnen m gliche Chlorophyll Abbauprodukte erkannt werden z B Pheophytin auf dem Chromatogramm etwas oberhalb von Chlorophyll a Zur Dokumentation Chromatogramm mit d nner Glasplatte abdecke
44. eaf trichome differentiation in Arabidopsis is expressed in stipules Cell 67 483 493 1991 Bowman J L Smyth D R Meyerowitz E M Genes directing flower development in Arabidopsis Plant Cell 1 37 52 1989 Abb Reife Arabidopsis Bl te im Schema Sepalen und Petalen werden mit einer Pinzette abgetrennt Die Staubbl tter zur Best ubung k nnen dann mit einer Pinzette an der unteren Basis abgezupft werden Reife Staubbl tter sind tiefgelb und tragen Pollenk rner die unter dem Binokular erkennbar sein sollten Abb Unreife Arabidopsisbl te zur Befruchtung Sepalen und Petalen umschlie en Staub und Fruchtbl tter Das behaarte Stigma steht hervor Sepalen und Petalen werden mit einer Pinzette entfernt oder nach unten geknickt Die unreifen Staubbl tter die gr nlich und etwa nur halb so lang wie Petalen sein sollen werden mit einer Pinzette abgetrennt Dadurch wird das Stigma freigelegt und kann best ubt werden 55 Versuch IIV 3 NACHWEIS DER _AKTIVIT T EINES TRANSGENS IN GENETISCH VER NDERTEN ARABIDOPSIS PFLANZEN a Theoretische Grundlagen und Ziel 1 Bestimmung des Genexpressionsmusters mittels Reportergentests Die Funktionsweise von Genen wird heute in der Regel durch Standardexperimente zun chst bestimmt Hierzu bestimmt man h ufig zuerst wann in welchem Stadium der Entwicklung oder einer physiologischen Behandlung wo in welchen Zellen Geweben Organen und wie stark ein Gen aktiv ist
45. en H2O deion Kontrolle sowie Tomaten und Maracujasaft jeweils unverd nnt und 1 10 verd nnt gleichm ig getr nkt worden war Die Petrischalen werden abgedeckt und bei Raumtemperatur im Kursraum bei Tageslicht zum Keimen aufgestellt Nach etwa 48 Stunden wird die Keimrate bestimmt und der Entwicklungszustand der Keimlinge protokolliert Mit Hilfe von Millimeterpapier wird die L nge jeder Keimpflanze von der Wurzelspitze bis zur Insertion der Kotyledonen vermessen und die L nge in einer Tabelle notiert Tabelle bitte vor dem Praktikum entwerfen 43 c Auswertung Die Mittelwerte der Keimpflanzenl ngen in den unterschiedlichen Versuchsgef en Ordinate werden gegen die ABA Konzentrationen 0 4 umol Abszisse aufgetragen Die Ergebnisse der Versuche mit Tomaten und Maracujasaft sind in die gleiche Graphik als Balken einzutragen Kurze schriftliche Zusammenfassung der Ergebnisse 44 ENTWICKLUNGSPHYSIOLOGIE AM MODELLSYSTEM ARABIDOPSIS THALIANA Zur Thematik des Versuchs siehe Campbell S 493 495 890 891 977 980 Taiz amp Zaiger S 375 402 559 566 Schopfer amp Brennecke S 423 448 465 482 Versuch IV STEUERUNG DES HYPOKOTYL L NGENWACHSTUM DURCH LICHT MITTELS PHYTOCHROM a Theoretische Grundlagen und Ziel Pflanzen ben tigen Licht f r die Photosynthese und m ssen daher ihr Wachstum zur optimalen Ausnutzung der Lichtquelle hin steuern Licht ist bei Pflanzen als Umweltfaktor auch ein Signal zu
46. en Versetzt man sie mit S ure oder Lauge so ndert sich ihr pH Wert sehr viel langsamer als der einer ungepufferten L sung Besondere Bedeutung f r die Bodenreaktion hat die Pufferung gegen H Ionen Im Boden werden durch zahlreiche biologische Prozesse Protonen freigesetzt z B auch bei der Stoffaufnahme durch die Pflanzenwurzel vgl Versuch IV l Hinzu kommt der anthropogen bedingte Eintrag saurer Immissionen zu denen der saure Regen geh rt Zunehmende Bodenversauerung f hrt zu verst rkter N hrstoffauswaschung und Freisetzung toxischer Ionen 65 Wichtige Puffersysteme im Boden sind die mineralischen und organischen Bodenkolloide wozu in erster Linie Tonminerale und Humins uren bzw Humate z hlen Sie binden ankommende H bzw OH Ionen im Austausch gegen vorher sorbierte Kationen bzw Anionen Je h her die Austauschkapazit t f r Ionen ist desto h her ist auch die Pufferung der B den Weitere Puffersysteme im Boden sind Gemische schwacher S uren mit ihren Salzen Hierzu geh ren der Carbonatpuffer sowie in phosphatreichen B den zus tzlich der Phosphatpuffer Fehlen freie Carbonate im Boden dann bernehmen die genannten Kolloide die Pufferung Im vorliegenden Versuch wird die Pufferkapazit t von drei verschiedenen B den untersucht Hierzu werden w ssrige Ausz ge hergestellt steigende Mengen an S ure bzw Lauge zugegeben und die jeweilige pH nderung gemessen Aus dem Verlauf der so ermittelten Tit
47. en der Wasserdampfgehalt der Atmosph re die Temperatur der umgebenden Luft die Temperatur des Wasser abgebenden K rpers Sonneneinstrahlung welche die Temperatur beider ndert und nicht zuletzt die herrschenden Windgeschwindigkeiten die die Transpiration durch das Wegblasen der Dampfhauben von den untersuchten Organen beschleunigen Zur Bestimmung der physiologischen Komponente bedarf es der Untersuchung der Pflanzen unter verschiedenen u eren Bedingungen und physiologischen Zust nden Hier ist besonders das Verhalten der Stomata auf Licht Wassergehalt und Temperatur der Umgebung die Saugkraft sowie Bau und Alter der Pflanzen von Bedeutung Die Wasseraufnahme der Pflanzen die u a von der Temperatur des Bodens abh ngig ist reguliert indirekt ebenfalls die Wasserabgabe Die insgesamt messbare Transpiration setzt sich aus zwei Anteilen zusammen der cuticul ren Transpiration durch Epidermis Haare und deren Cuticula und der stomat ren Transpiration mit Hilfe der Spalt ffnungen Erstere h ngt in ihrer H he weitgehend von der Ausbildung der Epidermis und der Cuticula ab Wanddicke Cutineinlagerung cutinisierte Schicht Behaarung Wachsschicht und ist somit nur von den unterschiedlichen u eren physikalischen Bedingungen abh ngig Die stomat re 80 Transpiration ist dagegen von der Pflanze durch ffnen und Schlie en der Spalt ffnungen regulierbar sie macht bei den meisten einheimischen Pflanzen bis ca 80 90 der Gesamtt
48. en Viviparie Diese l sst sich durch Bespr hen mit ABA L sung verhindern Der ausgereifte dormante Samen enth lt im Allgemeinen keine nennenswerten Mengen an ABA so dass die nat rliche Keimhemmung nicht direkt mit diesem Hormon in Zusammenhang gebracht werden kann Reife Samen aber reagieren hnlich wie junge Embryonen auf u ere Zufuhr von ABA mit Entwicklungsruhe Bei der Aussaat keimf higer Samen auf einem ABA haltigen Keimsubstrat findet zun chst eine normale Quellung statt die Wachstumsphase jedoch w hrend der der Embryo unter weiterer Wasseraufnahme zum aktiven Streckungswachstum bergeht wird je nach ABA Konzentration v llig unterdr ckt Das keimungshemmende Hormon ABA hemmt spezifisch den bergang von der Quellungsphase zur Wachstumsphase Der w hrend der Quellungsphase eintretende Aufbruch der Samenschale bleibt durch ABA unbeeintr chtigt der zu Beginn der Wachstumsphase zu beobachtende Wurzelaustritt z B bei Rapssamen etwa 12 h nach Quellungsbeginn dagegen wird durch ABA vollst ndig gehemmt ABA behandelte Samen k nnen so in gequollener Form selbst unter optimalen Keimungsbedingungen Wasser Temperatur f r viele Tage in erzwungener Dormanz gehalten werden Dieser Zustand kann durch Auswaschen des Hormons sehr rasch aufgehoben werden Die Keimungshemmung durch ABA ist also reversibel Auch unter nat rlichen Bedingungen kann ABA in der eben geschilderten Weise als Keimungshemmstoff fungieren Es ist bekannt
49. en in Mutanten Screening Verfahren gefunden d h Tausende Nachkommen von mutagenisierten Pflanzen wurden nach Individuen mit ver nderten Lichtantworten durchsucht Solche mutagenisierten Populationen werden k nstlich durch Mutageneseverfahren erhalten z B durch chemische Mutagenese mit DNA ver ndernden Chemikalien Statistisch ist es dabei m glich aus Tausenden Pflanzen mit DNA Mutationen solche zu identifizieren bei denen ein wichtiges Gen f r den gew nschten physiologischen Prozess durch eine Mutation betroffen oder zerst rt ist F r solche genetischen Methoden und insbesondere die anschlie ende Identifizierung des betroffenen Gens eignen sich Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana am besten s Vorlesung 1 Stunde Mutanten der Rotlichtwahrnehmung zeigen im kontinuierlichen Rotlicht einen Ph notyp Statt der blichen De Etiolierung bei Wildtyppflanzen im Rotlicht fand man etiolierte Mutanten welche nicht auf das Rotlicht reagieren konnten Hierzu z hlt die Arabidopsis Hypokotylelongationsmutante hyl welche einen Defekt in einem Gen der Phytochromobilin Synthese aufweist hy Mutanten k nnen kein intaktes Phytochrom aufgrund des fehlenden Chromophors produzieren Im Folgenden sollen die Lichtantworten von Arabidopsis Keimlingen getestet werden Hierzu wird das Pflanzenwachstum im Dunkeln verglichen mit dem im kontinuierlichen Wei licht und kontinuierlichen Rotlicht Die Beteiligung von Phytochromen wird dabei anhand der Mut
50. en vom Betreuer in am Vorabend des Versuchstages dem Klimaschrank entnommen 100 ml Suspension pro Gruppe und ber Nacht im Kursraum in einem mit Alufolie verdunkelten Erlenmeyerkolben bel ftet auf einen Sch ttler gestellt warum Am Morgen wird die Algensuspension vom Kursleiter in 2 min lang bei 600 x g 2200 U min zentrifugiert Die zentrifugierten Algen werden in 55 ml HO deion resuspendiert in einen 100 ml Erlenmeyerkolben gegeben und mit Alufolie verdunkelt bis zum Versuchsbeginn bel ftet auf den Sch ttler gestellt Anschlie end werden 4 Erlenmeyer Kolben 100 ml mit folgenden L sungen beschickt 1 4 ml NH4 SO4 L sung 4 ml H20 deion 2 4 ml NH gt SO L sung 4 ml Glukose L sung 3 4 ml KNO L sung 4 ml H gt 0O deion 4 4 ml KNO L sung 4 ml Glukose L sung Die Konzentrationen der L sungen sind jeweils 2 ig 63 Anschlie end werden nach Sch tteln 12 ml der Algen Vorratssuspension mit einer 10 ml Messpipette in den Erlenmeyer 1 gegeben und davon sofort der Anfangs pH Wert bestimmt auf 2 Dezimalstellen genau Zur pH Einstellung und Messung werden die Proben zwecks besserer Handhabung der pH Messelektrode in 25 mil Bechergl ser beschriftet mit der Nummer der jeweiligen Algensuspension gegossen Die pH Wert Messungen werden durch vorsichtiges Sch tteln des Becherglases durchgef hrt der End pH Wert muss dabei mindestens 30 sek stabil sein Unmittelbar nach der ersten pH Messung wird der Erlenmey
51. enso verf hrt man mit der Zugabe der 0 05 mol l NaOH zur 66 Parallelprobe Als Kontrolle zu den Bodensuspensionen dienen zwei Ans tze ohne Boden nur mit 100 ml 0 1 mol l KCI die in der beschriebenen Weise bearbeitet werden Vor dem Praktikum Erstellen Sie zu diesem Versuch eine Ergebnistabelle c Auswertung Die gemessenen pH nderungen sind gem dem Anfangs pH Wert und in Abh ngigkeit von zugegebener Menge an HCl bzw NaOH f r die drei B den graphisch darzustellen Eine gute bersicht ergibt sich wenn die verschiedenen Titrationskurven einschlie lich derjenigen f r die reinen KClI L sungen zusammen in einem Diagramm aufgetragen werden Ordinate pH nderung Abszisse Menge HCl bzw NaOH 1 Graphik 67 Versuch V TRANSPIRATION UND OSMOTISCHE VORG NGE Zur Thematik des Versuchs siehe Campbell S 163 181 895 917 Kutschera S 33 59 L ttge et al S 67 76 372 373 410 418 448 465 Mengel S 218 250 Nultsch S 54 60 259 280 Richter S 31 66 Versuch V 1 MESSUNG DER SAUGKRAFT VON KARTOFFELPARENCHYM a Theoretische Grundlagen Die Kraft mit der eine Pflanzenzelle Wasser aus ihrer Umgebung ansaugt nennt man Saugkraft Eine Pflanzenzelle weist nur so lange eine positive Saugkraft auf wie der osmotische Wert des Zellsaftes nicht vollst ndig durch den Wanddruck kompensiert ist Ist letzteres der Fall z B durch l ngeres Einlegen in Wasser so wird die Saugkraft Null und die Zel
52. er auf die Plasmolyse wird r ckg ngig gemacht Deplasmolyse Plasmolysierbar sind nur lebende Zellen da nur sie selektiv permeable Membranen besitzen Die Plasmolysierbarkeit ist deshalb ein Test f r die Lebensf higkeit einer Zelle Mit Hilfe der Plasmolyse kann das Potential Yr des Zellsaftes bestimmt werden Dazu ermittelt man die Au enl sungskonzentration die gerade noch bei 50 der Zellen des untersuchten Gewebes Grenzplasmolyse herbeif hrt b Praktische Durchf hrung Vor dem Praktikum Tabelle f r die Anzahl der plasmolysierten Zellen vorbereiten Versuchspflanze Rhoeo discolor Commelinaceae In 8 kleine Petrischalen werden je 5 ml Saccharosel sungen der Konzentrationen 0 1 0 2 0 25 0 3 0 35 0 4 0 5 mol l Herstellung der L sungen siehe Versuch V 1 bzw 5 ml H2O deion Kontrolle gef llt Von der Blattunterseite nicht Blattrippe von Rhoeo discolor werden mit einer scharfen Rasierklinge Fl chenschnitte mit mindestens 50 intakten Epidermiszellen angefertigt bei Kontrolle unter dem Mikroskop daran erkennbar dass die Vakuolen noch durch Anthocyane gef rbt also unverletzt sind Zu Versuchsbeginn werden jeweils 5 geeignete Schnitte mittels einer Pinzette mit der Schnittfl che nach unten in die verschiedenen L sungen gelegt beginnend mit der 75 niedrigsten Konzentration jeweils in 10 min tigen Abst nden Die Petrischalen werden verschlossen und der Zeitpunkt protokolliert Nach 30 min werde
53. er jedoch nicht verwendet Hier werden Ihnen eine nicht transgene Linie und zwei verschiedene transgene Arabidopsis Linien vorgestellt Einmal ist das GUS Gen hinter dem 35S Promoter exprimiert das andere Mal hinter einem wurzelspezifischen Promoter Sie sollen durch GUS Tests die GUS F rbungen beobachten bestimmen wie stark und in welchen Pflanzenteilen die Promoteren aktiv sind und die Linien entsprechend des Muster zuordnen GUS Reportergen CaMV35S Promoter Wurzelspezifi GUS scher Promoter Reportergen u b Praktische Durchf hrung Vorbereitung der L sungen Berechnung vor dem Praktikum Der GUS Aktivit tstest wird in einer GUS Pufferl sung durchgef hrt von der Sie insgesamt 1 ml ben tigen Die GUS Pufferl sung wird durch Mischung mehrerer konzentrierter Ausgangsl sungen und Verd nnung in w ssriger L sung hergestellt berlegen Sie sich wozu das gut sein k nnte Berechnen Sie im folgenden welche Mengen an Stamml sung und an dest Wasser Sie zusetzen m ssen damit Sie am Ende 1 ml GUS Pufferl sung haben 58 Stamml sungen und deren Gew nschte zu pipettierendes Konzentrationen Endkonzentrationen Volumen f r 1 ml GUS in GUS Pufferl sung Pufferl sung 1 M NaHPO 100 mM Puffer 57 ul 1 M NaH gt PO pH 7 0 43 ul 100 mM 2 mM K4 Fe CN s Fe 100 mM 2 mM K Fe CN Fe M 20 Triton X Detergenz 0 2 GUS Substrat x Gluc 100 mM 2 mM
54. erden die beiden Glasschalen mit den Koleoptilen bei Raumtemperatur unter einen Dunkelsturz gestellt Die Versuchsdauer betr gt ca 4h Danach werden die Zuwachsl ngen der Zylinder mikroskopisch vermessen Hierzu werden sie mit der Uhrfederpinzette aus der L sung entnommen wieder kurz auf einem Zellstofftuch getrocknet und dann auf einen speziell dazu hergerichteten Objekttr ger jeweils mit einer Schnittfl che gegen einen Anschlag gelegt Die ber die 5 mm Markierung des Objekttr gers hinausreichenden Endst cke der Zylinder werden mit Hilfe eines geeichten Messokulars bei 32x Vergr erung z B 10 Okular x 3 2 Objektiv gemessen Die gez hlten Skalenteile werden notiert und mit dem Faktor 0 03 multipliziert Daraus ergibt sich ein auf maximal 0 03 mm ein Teilstrich im Messokular entspricht 30u genauer Zylinderzuwachs Die Messtabelle hierzu entwerfen Sie bitte vor dem Versuchstag c Auswertung Um eine statistisch gesicherte Aussage ber die wachstumsstimulierende Wirkung von IES machen zu k nnen sind die Ergebnisse der Zuwachsmessung mit IES dem sogenannten t Test zu unterziehen Verglichen werden soll hierbei das Ergebnis der Kontrolll sung mit dem Ergebnis der IES L sung Die Streuungsbreite der Messwerte um x wird durch die Standardabweichung s gekennzeichnet Sie wird nach folgender Formel berechnet za n 1 A 32 wobei a die Abweichung des jeweiligen Messwertes vom Mittelwert und n die Zahl
55. erkolben nummeriert und mit Alufolie verdunkelt Auch die Alufolie wird au en mit der gleichen Nummer beschriftet Dann wird er auf einen Sch ttler gestellt und bei Stufe 100 min gesch ttelt Zeitwert Null Anfangs pH Wert Falls dieser Wert gt 6 3 oder lt 5 8 ist wird er mit 0 01 oder 0 0025 mol l HCl oder NaOH auf pH 6 0 eingestellt Ebenso wird mit Suspension 2 verfahren Auch von den Proben 3 und 4 werden gleich nach Zugabe der 12 ml Algensuspension die pH Werte bestimmt und durch Zugabe von 3 4 Tropfen 0 01 mol l HCI auf pH 4 5 eingestellt F r jede pH Messung werden die Suspensionen in die jeweiligen Bechergl ser berf hrt und danach in den Erlenmeyer Kolben zur ck gegossen Dieser wird wieder mit der Alufolie verdunkelt und auf den Sch ttler zur ckgestellt In Abst nden von 30 min wird der pH Wert der Proben dann noch vier f nfmal gemessen Der Messvorgang dauert also mindestens 2 2 h Vor dem Praktikum Erstellen Sie bitte eine Tabelle f r die pH Messergebnisse entsprechend den Inkubationsbedingungen und in Abh ngigkeit von der Zeit c Auswertung Die gemessenen Ver nderungen der pH Werte Ordinate sind in Abh ngigkeit von der Zeit Abszisse graphisch darzustellen In einer kurzen Zusammenfassung sind die Versuchsergebnisse zu interpretieren 64 Versuch IV 2 PUFFERKAPAZIT T DES BODENS a Theoretische Grundlagen Der pH Wert des Bodens beeinflusst die chemischen physikalischen u
56. estimmt wann wo und wie stark das Reportergen in diesen genetisch ver nderten Pflanzen exprimiert wird Einfach und preisg nstig ist der Reportertest mittels des Reportergens f r die Glucuronidase abgek rzt GUS welches vorwiegend in Pflanzen zur Anwendung kommt In Bakterien Hefe und S ugerzellen ist der Reporter mittels Galactosidase gel ufiger Das GUS Gen stammt urspr nglich aus E coli Pflanzen haben in der Regel keine vergleichbare interne GUS Aktivit t GUS spaltet B Glucuronide durch Hydrolyse Im GUS Test werden spezielle 56 k ufliche Substrate Glucuronide gespalten deren Produkte kolorimetrisch nachweisbar sind wie das x Glucuronid x Gluc Dabei entsteht ein Indoxylderivat das nach unspezifischer Oxidation als blauer Farbstoff pr zipitiert I Ci Br Or Gluc Br Pa N B Glucuronidase ir H H amp bromo 4 chloro 3 indolyl bromo 4 chloro B D glucuronide indoxyl tautomerism H Q C i Cl ol op Ri 4 m j Br Y N RB ao H indigo blue Abb GUS Reaktion mit x Gluc Der erste Schritt erfolgt spezifisch und wird vom GUS Enzym katalysiert Die Zwischenstufe kann in den Zellen diffundieren Der zweite Schritt erfolgt spontan durch Oxidation und wird durch Hexacyanoferrat III beschleunigt Es entsteht ein blaues Pr zipitat 2 Verst rkte und konstitutive Expression von Genen in transgenen Pflanzen berexpression Das Genexpressionsmuster kann k nstlich beeinflusst werden
57. ette aus Glukose Sechsecke sind Iodmolek le gestrichelt eingelagert aus Kretowitsch Grundz ge der Biochemie der Pflanzen 1965 Daraus resultiert eine ver nderte Lichtabsorption der Iodmolek le die je nach Kettenl nge eine tiefe Blauf rbung oder bei k rzeren Ketten nur eine Violett Rot oder Rotbraunf rbung bewirkt Amylopektin besteht aus 2000 22000 Glukosemolek len bei denen es neben den 1 4 a D Glykosidbindungen immer wieder zu 1 gt 6 a D Glykosidbindungen kommt Etwa jedes 25igste Glukosemolek l zeigt eine 1 6 Bindung Auf diese Weise kann Amylopektin als verzweigte St rke angesehen werden F o E CH cs E cron N w e N Ho Lo GR Au Ab toan Verzweigungsstelle Diogromm des Amylopektins on Abb 7 Struktur des Amylopektin am Diagramm schwarz ein reduzierendes Kettenende He Pflanzenphysiologie 1991 Die Schraubenstruktur im Amylopektin besteht insgesamt aus k rzeren Teileinheiten wie die der Amylose woraus eine violette bis rote F rbung mit KII entsteht Werden St rkek rner mit hei em Wasser behandelt so geht Amylose kolloidal in L sung Amylopektin ist in hei em Wasser unl slich oberhalb 60 C quillt es auf St rkekleister Der enzymatische Abbau der St rke erfolgt entweder durch Phosphorylasen oder durch Hydrolasen Beim Abbau durch Phosphorylasen werden die Glykosidbindungen durch Phosphors ure gespalten also phosphoryliert als Spaltprodukt en
58. g im Wellenl ngenbereich zwischen 700 und 390 nm aufgenommen durch Eingabe der Peak Pick Funktion s u werden neben der automatischen Aufzeichnung des Spektrums auch die Wellenl ngen aller Haupt und Nebenmaxima sowie deren Extinktionswerte automatisch ausgedruckt b Parameter P am Ger t wie folgt einstellen Messmodus P Null ABS Extinktion Scangeschwindigkeit P 1 FAST Wellenl ngenvorschub P 2 20 nm cm Extinktionsbereich P 5 0 1 0 sp ter bei Aufnahme des Spektrums Extinktionsbereich dem h chsten Absorptionsmaximum anpassen Wellenl ngenbereich P 6 700 390 nm Spaltbreite P 10 1 nm evtl Datum P 11 einstellen c Funktionen F am Ger t wie folgt einstellen Kommentar F 1 Chlorophyll a in Aceton als berschrift f r aufzunehmendes Spektrum Peak Pick Funktion F 4 PEAK Lage der Maxima und jeweiliger Extinktionswert werden erfasst 20 d Nullabgleich Zwei K vetten mit je etwa 3 ml Aceton f llen K vetten mit Deckel verschlie en Die K vetten m ssen peinlich sauber sein sie d rfen insbesondere keine Kratzer au en anhaftende Fl ssigkeitsreste oder Fingerspuren aufweisen Eine K vette in Referenzstrahl Referenzk vette die andere in Probenstrahl Probenk vette stellen Bei geschlossenem K vettenraum Extinktion auf Null einstellen Taste ABS 0 der Monochromator muss dabei innerhalb des oben angegebenen Wellenl ngenbereichs stehen e Extinktionskontrolle Proben
59. gilt zur Identifizierung der Substanzen herangezogen werden Eine exakte Identifizierung ist beispielsweise unerl sslich wenn es um die m gliche photosynthetische Wirksamkeit eines der Pigmente geht Voraussetzung f r die Aufnahme eines hierf r brauchbaren Spektrums ist dass die Substanz rein und in klarer L sung vorliegt Mit Einschr nkungen bietet sich diese M glichkeit wenn die Pigmente durch die im vorangehenden Versuch beschriebene D nnschichtchromatographie getrennt werden Die nach der Trennung vorliegenden Farbzonen werden hierzu einzeln aus der Sorptionsschicht ausgeschabt das jeweilige Pigment mit einem geeigneten L sungsmittel aus dem Schichtmaterial eluiert und vom Eluat ein Absorptionsspektrum aufgenommen Zur Identifizierung der Pigmente werden die gewonnenen Absorptionsmaxima mit denjenigen der authentischen Verbindungen verglichen vgl S 24 Als zus tzliche Identifizierungshilfe wird noch das Verh ltnis der Extinktionen der beiden Hauptmaxima ermittelt und dem entsprechenden Literaturwert gegen bergestellt Eine so vorgenommene Identifizierung dient gleichzeitig der Untermauerung der im d nnschichtchromatographischen Versuch gemachten Identit tsaussage f r ein Pigment b Praktische Durchf hrung 1 Ausschaben der Chlorophyll a Chlorophyll b und Luteinzonen Fortsetzung von Versuch V Pigmentzonen unmittelbar nach Betrachten der DC Platte im UV Licht ausschaben Gefahr photooxidativer Zerst rung wenn
60. in L sung Wie bei der Chlorophyli Messung Blindl sung EtOH Nullabgleich mit EtOH Wellenl ngenbereich P 6 550 390 nm Extinktionskontrolle bei 446 nm Kommentar F 1 Lutein in Ethanol 21 4 Auswertung Zur Identifizierung der Pigmente sind die Haupt und Nebenmaxima die sog Amax Werte den Aufzeichnungen zu entnehmen Der sog E430 E663 Wert also das Verh ltnis der Extinktionen der beiden Hauptmaxima von Chlorophyll a wird errechnet und alle Daten tabellarisch mit Literaturangaben verglichen Nach MACKINNEY 1940 besitzt Chlorophyll a in Aceton gel st folgende A max Werte 410 430 535 580 615 663 nm der E430 Eses Wert betr gt 1 26 Quotient der beiden Extinktionskoeffizienten bei 430 und 663 nm Die A max Werte f r Chlorophyll b gel st in Aceton liegen nach MACKINNEY 1940 bei 455 595 645 nm der E4ss Esas Wert betr gt 2 8 F r Lutein in EtOH gel st werden von HAGER und MEYER BERTENRATH 1967 folgende max Werte angegeben 422 Schulter 446 475 nm der E445 473 gt Wert betr gt nach Schopfer Brennicke 1999 1 07 Zu beachten das zur Absorptionsmessung verwendete L sungsmittel ist stets mitanzugeben da von seiner Natur Brechungsindex Polarit t sowohl die Lage als auch die H he eines Absorptionsmaximums abh ngig ist Literatur Mackinney 1940 aus Paech K amp Tracey M V Moderne Methoden der Pflanzenanalyse Bd 4 Springer Berlin 1955 Hager A amp Meyer Bertenrath
61. isch gek rzt die L nge des Bl tenstiels vermessen und notiert und dann in ein Gef mit 10 iger saurer Fuchsin L sung gestellt Nach einiger Zeit f rben sich vom Bl tenstiel her die Adern der Bl tenkron bzw Perigonbl tter rot Die Geschwindigkeit des Farbstofftransports soll im Bl tenstiel und im Kron bzw Perigonblatt ermittelt und in Meter pro Stunde angegeben werden 83
62. k vette entleeren mit Chlorophyll L sung f llen und in Probenstrahl zur ckbringen Monochromator auf 430 nm h chstes Extinktionsmaximum von Chlorophyll a einstellen und bei geschlossenem K vettenraum Extinktion pr fen Diese sollte nicht ber 1 0 liegen da sonst das Lambert Beer sche Gesetz d h die Linearit t der Beziehung Extinktion Konzentration nicht erf llt sein kann Falls bei vorliegender Probenl sung die Extinktion gr er als 1 0 ist ihren Wert genau ermitteln und Chlorophyll L sung nach Zur ckgie en in graduiertes Zentrifugenglas mit Aceton entsprechend verd nnen L sung danach wieder in Probenk vette berf hren Extinktion erneut messen und Extinktionsbereich P 5 dem neuen Messwert anpassen f Automatische Aufzeichnung der spektralanalytischen Daten zur Aufnahme aller Daten am Schreiber bzw Bildschirm werden nacheinander folgende Tasten gedr ckt FORMAT Taste Ausdrucken der Messbedingungen ENTER Taste FRAME Taste Aufzeichnen des Rahmens mit Skaleneinteilung f r Wellenl nge und Extinktion START Taste Aufzeichnen der Absorptionskurve und Ausdrucken der Wellenl ngen und Extinktionswerte der Absorptionspeaks Messung der Chlorophyll b L sung Wie mit Chlorophyll a Nullabgleich entf llt da gleiches L sungsmittel wie bei der Chlorophyll a Messung Wellenl ngenbereich P 6 700 400 nm Extinktionskontrolle bei 456 nm Kommentar F 1 Chlorophyll b in Aceton Messung der Lute
63. le kann kein weiteres Wasser mehr aufnehmen sie ist dann voll turgeszent Andererseits wird die maximale Saugkraft dann erreicht wenn die Zellwand vollst ndig entspannt ist Die Saugkraft ist also eine aktuelle Gr e die vom jeweiligen S ttigungszustand der Zelle bzw des Gewebes und Organs mit Wasser abh ngt Zur Messung der Saugkraft lebender Gewebe wendet man eine Kompensationsmethode an d h man bestimmt ob ein Gewebe aus verschiedenen L sungen bekannter Saugkraft bei L sungen ist die Saugkraft gleich dem osmotischen Wert Wasser aufnehmen kann oder Wasser abgibt Diejenige L sung in der Wasser weder aufgenommen noch abgegeben wird hat die Saugkraft die der des Gewebes entspricht Das Saugverm gen pflanzlicher Gewebe wird heute meist als Wasserpotential Y Psi oder Yz bestimmt Diese thermodynamische Kenngr e ist ein Ma f r den Energieinhalt des Wassers in einem System Zelle Gewebe Boden Atmosph re und hat die Dimension eines Drucks bar oder Pascal bzw Megapascal 1 MPa 10 bar Das Wasserpotential Yz der Zelle ist der negative Wert der Saugkraft Wasser wird angesaugt positiver Wert Wasser wird ausgepresst Je niedriger je st rker negativ also das Wasserpotential der Zelle umso h her positiver ihre Saugkraft 68 Das Wasserpotential stellt analog dem elektrischen Potential die potentielle Energie des Wassers dar Die Wasserpotentialdifferenz gibt die Unterschiede in der potentiellen Energie des
64. m Protokoll notiert von diesen 4 Schnitten eine schematische Skizze angefertigt und dem Protokoll sowie sp ter dem Bericht beigelegt Versuchsaufbau Stativklemme mit Muffe Blatt Stativ Gef mit Wasser Seitenansicht Kobaltpapier Dichtungsring Glaspl ttchen Klammer Blatt Abb 10 Aufbau zu Versuch V 3 79 Versuch V 4 MESSUNG DER TRANSPIRATION IM POTOMETER a Theoretische Grundlagen Ein feuchter K rper gibt infolge der Saugkraft der Luft Y un lt feuchter K rper Wasserdampf an die Umgebung ab Das Gleiche gilt f r Pflanzen aus deren wasserdampfges ttigten Interzellularen Wasserdampf in die umgebende nicht dampfges ttigte Luft diffundiertt Diese als Transpiration bezeichnete Wasserdampfabgabe der Pflanzen wird der Evaporation d h der Wasserdampfabgabe einer freien Wasserfl che gegen bergestellt Bei gleicher Verdunstungsfl che kann die Transpiration bis zu 80 90 der Evaporation erreichen Die H he der pflanzlichen Transpiration wird bestimmt durch eine physikalische Komponente bei der die Wasserabgabe nach den gleichen Gesetzm igkeiten erfolgt wie die eines physikalischen Systems und durch eine physiologische Komponente die dem physikalischen Teil der Transpiration berlagert ist Die physikalische Komponente kann mit einfachen Mitteln an Modellversuchen untersucht werden Gipspilz F r sie sind alle Faktoren von Bedeutung die das S ttigungsdefizit Pflanze Luft bestimm
65. matogramm wenn berhaupt nur als schwachgelbe Bande erkennbar 17 Versuch 1 2 ABSORPTIONSSPEKTREN DER CHLOROPHYLLE A UND B UND DES LUTEINS ISOLIERT AUS FRISCHEN EFEUBL TTERN a Theoretische Grundlagen Die spezifische Absorption einer Substanz l sst sich mit Hilfe eines Spektralphotometers bestimmen Dazu wird die Substanz in L sung gebracht und ihre F higkeit zur Lichtabsorption in Abh ngigkeit von der Wellenl nge ermittelt Die am h ufigsten verwendete Messgr e f r die Lichtabsorption ist die Extinktion E vgl Versuch 1 3 Stellt man die gemessenen Absorptions bzw Extinktionswerte Ordinate ber der zugeh rigen Wellenl nge Abszisse in einem Kurvendiagramm dar so erh lt man das Absorptionsspektrtum der Substanz Die Kurvenmaxima Ama geben den Wellenl ngenbereich an in dem die Substanz das Licht am st rksten absorbiert Lage und Intensit t der Maxima charakterisieren eine Substanz und erlauben R ckschl sse auf ihre chemische Struktur Die Absorptionsspektren der Chlorophylle sind typische Porphyrinspektren wie sie auch von den Cytochromen und vom H m erhalten werden Die Haupt Absorptionsmaxima liegen im blauen 430 470 nm und hellroten 640 675 nm Spektralbereich Gr nes Licht 470 560 nm wird nur in geringem Ma e dunkelrotes 700 760 nm gar nicht absorbiert Wegen der geringen Absorption des gr nen Lichtes erscheinen verd nnte Chlorophyll L sungen in der Durchsicht gr n Bei sta
66. n auf Transparentpapier durchzeichnen Start und Frontlinie nicht vergessen Substanzen durch Tageslicht und Fluoreszenzfarben sowie Rf Werte kennzeichnen au erdem Datum Schicht Flie mittel aufgetragenes Extraktionsgemisch und Laufzeit auf dem Dokument vermerken Der Rf Wert ist durch folgenden Quotienten definiert Abstand Mitte der Startlinie Schwerpunkt der Substanzbande Rf Abstand Mitte der Startlinie Flie mittelfront Rf Werte liegen zwischen 0 und 1 und werden mit 2 Stellen hinter dem Komma angegeben hRf Werte sind Rf Werte x 100 und liegen demnach zwischen 0 und 100 15 c Auswertung Die Identifizierung der getrennten Substanzen erfolgt durch vergleichende Methode d h alle zur Charakterisierung der Einzelpigmente erhobenen Daten werden m glichst in tabellarischer bersicht auf bereinstimmung mit Literaturangaben berpr ft Folgende Identifizierungshilfen sind hierbei zu ber cksichtigen Tageslicht und Fluoreszenzfarben Rf Werte bzw Rf Wert Reihenfolge Anzahl der getrennten Pigmente sowie deren chemische Natur Chlorophylle Carotine Xanthophylle Hinsichtlich der Rf Wert Reihenfolge wird das eigene Chromatogramm mit einem in einem hnlichen chromatographischen System Schicht Flie mittel erstellten und dieser Anleitung in Kopie beigef gten Musterchromatogramm HAGER und BERTENRATH 1962 verglichen Sowohl die eigene Schicht als auch die Schicht bei HAGER und BERTENRATH 1962 werden haupts
67. n die Schnitte wiederum mit der Schnittfl che nach unten in einem Tropfen der jeweiligen Saccharosel sung bzw die 8 Probe in H2O deion zwischen Objekttr ger und Deckglas gebracht Unter dem Mikroskop wird durch Ausz hlen von jeweils 50 Zellen ermittelt wie hoch der Prozentsatz der plasmolysierten Zellen ist Am Schnittrand liegende Zellen d rfen nicht mitgez hlt werden da sie durch den Wundreiz pathologisch beeinflusst sind c Auswertung Der Prozentsatz plasmolysierter Zellen Ordinate wird in ein Diagramm gegen die Konzentration der Rohrzuckerl sungen Abszisse aufgetragen Der Schnittpunkt der Kurve mit der 50 Linie stellt den gesuchten Grenzplasmolysewert dar Er entspricht dem durchschnittlichen osmotischen Wert der Zellen Anhand der beigef gten Tabelle siehe Versuch V l kann die ermittelte molare Konzentration in den zugeh rigen osmotischen Druck und in das entsprechende Potential gel ster Teilchen Pr Vorzeichen beachten beide mit der Einheit bar umgerechnet werden 76 Versuch V 3 NACHWEIS DER WASSERDAMPFABGABE DURCH SPALT FFNUNGEN Theoretische Grundlagen der stomat ren Transpiration Wasserdampfabgabe und Gasaustausch sind durch die Spalt ffnungen aktiv regulierbar Abb 9 Ge ffnete bzw geschlossene Spalt ffnung schematisch Querschnitt a bzw Aufsicht b nach Hess Pflanzenphysiologie 10 Auflage Die Funktion der Spalt ffnungen ergibt sich durch den Aufbau der Schlie
68. nd Das dieser Kette zugrunde liegende Disaccharid ist die Maltose eine 1 gt 4 a D Diglukose os n TEA H c 0o t CHOH H C OH ot cmon CHOH E CH0 ni H 0H H OH HO o OH a Y CA P ET ray aJo on R OH n N N Re no Na Or H C on g l H OH CHOH on a Glucose Glucose u on Ringform offenkettige Form Rack Amylose unverzweigte Kette aus 1 4 verkn pften a Glucose Monomeren a SA Abb 5 a b Raven et al Biologie der Pflanzen 2000 c Raumstruktur der Amylose Karlson et al Biochemie 1994 Im Amylose Polysaccharid stellt das Glukose Molek l dessen HO Gruppe am anomeren C 1 Atom mit dem n chsten Glukose Molek l glykosidisch verkn pft ist das sog nicht reduzierende Ende dar Das Glukose Molek l am anderen Ende des Polymers dessen C 4 OH Gruppe mit der C 1 HO Gruppe des vorhergehenden Glukose Molek ls verkn pft ist bildet das sog reduzierende Ende da es noch seine reaktionsf hige C 1 HO Gruppe besitzt Wegen der sterischen Anordnung der 1 4 Glykosidbindungen kommt es im Amylose Polymer zu einer spiraligen Aufwindung Schraube oder Helix Bei der zum Nachweis von St rke verwendeten lodst rkereaktion werden Iodmolek le aus der KII L sung Lugol sche L sung in den Hohlraum der Amyloseschraube eingelagert wodurch eine Einschlussverbindung entsteht 36 RRARZ AO ar Abb 6 Aufbau des Amylose Iod Komplexes in die Zwischenr ume der schraubig gewundenen K
69. nd biologischen Bodeneigenschaften und damit das Pflanzenwachstum Erheblichen Einfluss hat diese durch Azidit t bzw Basizit t bewirkte Bodenreaktion auf die Verf gbarkeit einiger N hrstoffe So geht die Verf gbarkeit der meisten Spurenelemente B Mn Co Zn mit zunehmendem pH Wert zur ck Bei K Ca und Mg f hrt dagegen abnehmender pH Wert zu einem Mangel an diesen Elementen Unter den N hrstoffanionen geht das pflanzenverf gbare H PO4 mit steigendem pH Wert zunehmend in HPO und PO ber die wegen ihrer geringen L slichkeit weniger HPO bzw nicht PO verf gbar sind Die Anspr che der Pflanzen an den pH Wert des Bodens variieren Hafer und Kartoffel sind Beispiele f r Pflanzen die schwach saure B den bevorzugen w hrend Gerste und Luzerne auf basischen B den besser gedeihen Die meisten unserer Kulturpflanzen erreichen ihre beste Entwicklung auf neutralen B den pH 6 5 7 5 Wegen der Wirkungen auf die N hrstoffverf gbarkeit reagieren Pflanzen und Bodenorganismen sehr empfindlich gegen ber pl tzlichen und starken pH nderungen Die F higkeit des Bodens solche pH nderungen abzupuffern ist daher f r die Pflanzenern hrung von gro er Wichtigkeit Unter Pufferung versteht man die F higkeit des Bodens einer nderung der Wasserstoffionen oder Hydroxidionenkonzentration Widerstand zu leisten W ssrige Bodenausz ge sind in dieser Hinsicht vergleichbar mit den aus der Chemie bekannten Pufferl sung
70. nenten m ssen Extinktionswerte bei drei verschiedenen Wellenl ngen gemessen werden Dies ist der Fall wenn im Rohextrakt eines Blattes neben den beiden Chlorophyllen auch die Gesamtcarotinoide Carotine und Xanthophylie erfasst werden sollen Es wird dann zus tzlich im Blaubereich bei 470 nm dem Maximum im l ngerwelligen Bereich der Absorptionskurve aller Carotinoide gemessen Die dritte Bestimmungsgleichung lautet 3 E470 227 X Ccar 2 27 X Cchia 81 36 X Cchib wobei die Konzentration der Gesamtcarotinoide mit Ccar angegeben ist F r die Konzentration der Gesamtcarotinoide Ccar ergibt sich folgende Gleichung c 1000 x E470 2 27 X Cchla 81 4 X Cchlb c CCar ug x ml 227 Die Berechnung der drei unbekannten Konzentrationen mit Hilfe der genannten Gleichungen ist insofern vereinfacht als die Carotinoide im Rotbereich also bei den Wellenl ngen 662 und 645 nm keine Absorption besitzen Anzumerken ist noch dass die Einzelsubstanzen der Carotinoide vgl Versuch V 1 nur nach vorheriger chromatographischer Trennung quantitativ bestimmt werden k nnen Im vorliegenden Versuch wird der Gehalt der beiden Chlorophylle und der Gesamtcarotinoide in Brennnesselbl ttern warum bestimmt Da es sich um eine quantitative Analyse handelt haben selbstverst ndlich alle Einzelschritte des Versuchs in quantitativem Ma stab zu erfolgen d h das zu analysierende Blattmaterial ist exakt einzuwiegen die im Blattma
71. pochloritl sung 0 1 Triton X 8 min lang sterilisiert durch Zentrifugation wird der berstand entfernt und durch steriles Wasser ersetzt Insgesamt wird 5mal mit sterilem Wasser gewaschen und die Samen in 0 1 iger Agarl sung aufbewahrt Folgende Ph notypen werden unter dem Binokular festgehalten Farbe der Kotyledonen gr n gelb wei lich und Hypokotylfarbe wei rot Anthocyane Stellung der Kotyledonen auseinander gefaltet Hypokotylkr mmung Hypokotyll nge s Tafelbild Die Hypokotyle werden mit Millimeterpapier unter dem Binokular genau vermessen und die L ngen in eine Tabelle eingetragen Bitte Tabelle vorbereiten c Auswertung Die Durchschnittswerte und Standardabweichungen der Hypokotyll ngen werden ermittelt siehe t test Versuch Il 1 und in einem S ulendiagramm graphisch dargestellt Die Ergebnisse der Ph notypen werden in einer Tabelle f r die Lichtqualit ten und Linien dargestellt Welches Licht inhibiert das Streckungswachstum des Hypokotyls Welche Photorezeptoren agieren prim r Welche Ph notypen werden durch die Lichtqualit t beeinflusst welche von Phytochromen Was bedeutet die Anthocyanbildung die Sie ggf beobachten LITERATUR Koorneef M Rolff E Spruit C Genetic control of light inhibited hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana L Heynh Z Pflanzenphysiol 100 147 160 1980 49 Versuch IIV2 ARABIDOPSIS MUTANTEN ZUR UNTERSUCHUNG VON AUSGEW HLTEN
72. r Steuerung von Entwicklungs und Differenzierungsprozessen Man kann dies sehr gut beobachten indem man Pflanzenkeimlinge im Dunkeln und im Licht anzieht Im Dunkeln etiolieren Pflanzen d h das Hypokotyl streckt sich Hypokotylelongation die weitere Blattbildung und Blattausfaltung werden unterdr ckt die Plastiden bilden kein Chlorophyll aus Etioplasten Diese Entwicklung im Dunkeln wird als Skotomorphogenese bezeichnet deren Ziel die Verwendung aller Samenressourcen zur schnellstm glichen Erreichung der Erdoberfl che ist Sobald die Jungpflanzen Licht wahrnehmen wird die Hypokotylelongation inhibiert Bl tter werden entfaltet und weitere gebildet und Chlorophyll wird produziert d h die Jungpflanzen de etiolieren Diese Licht abh ngige Entwicklung hei t Photomorphogenese und erlaubt der Pflanze das schnellstm gliche Ausnutzen der Lichtenergie f r die Photosynthese In der Pflanzenphysiologie umfasst Licht den elektromagnetischen Wellenl ngenbereich von 320 nm UV A bis 760 nm Dunkelrot Wei licht enth lt dabei immer Licht unterschiedlicher Wellenl ngen Zur Wahrnehmung von Licht verf gen Pflanzen ber sensorische Photorezeptorsysteme f r verschiedene Spektralbereiche wie Phytochrom Rot und Dunkelrotlichtrezeptoren 660 730 nm Cryptochrom UV A und Blaulichtrezeptoren 340 520 nm und UV B Photorezeptoren 280 350 nm Am besten untersucht ist das Phytochromrezeptorsystem und die Rotlichtsignaltransduktion Ph
73. r Untersuchung ausgew hlter Entwicklungsprozesse 11 3 Nachweis der B Glucuronidase GUS Aktivit t in transgenen Arabidopsis Pflanzen IV Ionenaufnahme und Pufferkapazit t des Bodens IV 1 Selektive Ionenaufnahme IV 2 Pufferkapazit t des Bodens V Transpiration und Osmotische Vorg nge sss0sssssnenonnnonn V 1 Messung der Saugkraft von Kartoffelparenchym V 2 Messung des osmotischen Wertes durch Grenzplasmolyse V 3 Nachweis der Wasserdampfabgabe durch Spalt ffnungen V 4 Messung der Transpiration im Potometer A WICHTIGE INFORMATIONEN ZUM PRAKTIKUM Termine Das Praktikum findet in Nachmittagskursen ab 13 00 s t statt Der praktische Teil wird im Kursraum 1 01 Botanik Geb ude 6 1 OG durchgef hrt Treffpunkt jeweils im Seminarraum neben dem Kursraum Alle Termine werden im Zeitplan bekannt gegeben Ben tigte Schreib und Arbeitsutensilien die von jedem jeder Teilnehmer in mitgebracht werden m ssen Pr parierbesteck Schere wasserfester schwarzer Marker zum Beschriften Taschenrechner Bleistift kariertes Laborheft zur Protokollierung keine losen Bl tter Laborkittel Sicherheitsregeln e Beim Arbeiten im Laborbereich sind grunds tzlich Laborkittel zu tragen e Beim Arbeiten mit S uren und Laugen sowie organischen L sungsmitteln ist eine Schutzbrille zu tragen e Beim Pipettieren von allen Fl ssigkeiten unbedingt Peleus Ball oder andere Pipettierhilfe benutzen niemal
74. r Vorbesprechung gew hlt Die Ausarbeitung des Versuchsberichts ist eine sinnvolle Klausurvorbereitung Bei der Angabe von Zahlenwerten ist darauf zu achten nicht mehr signifikante Stellen anzugeben als reproduzierbar sind Bei Kurvendarstellungen sollte in der Auswertung das Zeichenpapier Millimeterpapier m glichst vollst ndig ausgenutzt werden Gleichzeitig sollten die Darstellungen aber in vern nftigen Ma stabsverh ltnissen gezeichnet und das Format so gew hlt werden dass gen gend Platz zum Anbringen der Koordinaten bleibt Diese sind stets eindeutig mit Messgr e und deren Benennung zu versehen Ebenso unmissverst ndlich muss auch eine dar ber hinausgehende Beschriftung von Abbildungen sein Tabellen und Abbildungen sind grunds tzlich mit Titel und Legenden zu versehen so dass die zugeh rigen Tabellen bzw Abbildungen f r fremde Leser ohne Zuhilfenahme des Textes verst ndlich sind Abbildungen und Tabellen nummerieren Sie bitte durch und verweisen im Text darauf Versuchsbericht Versuchstitel Hintergrund und Ziel ca Seite nur theoretische Hintergrundinformationen um das Ziel des Versuchs zu verstehen Ergebnisse Versuchsablauf und Ergebnisse keine Details zu Methoden und Material wie sie in Anleitung und Protokoll stehen Alle Ergebnisse in leicht verst ndlicher Form in Tabellen oder Abbildungen pr sentieren ggf mit statistischer Auswertung Diskussion Die Versuchsergebnisse entsprechend der
75. ranspiration aus siehe auch Versuch V 3 Die Transpiration ist f r die Pflanze lebensnotwenig da sie die treibende Kraft des Wasserstroms ist der von der Wurzel bis in die h chsten Teile der Pflanze im Xylem der Leitb ndel ber weite Strecken der Schwerkraft entgegenl uft und f r die Verteilung der in der Wurzel aufgenommenen Mineralsalze in den oberirdischen Pflanzenteilen sorgt Ausschlaggebend f r den Antrieb dieses auch als Transpirationsstrom bezeichneten Wassertransports ist die saugende Wirkung der Transpiration der oberirdischen Pflanzenteile insbesondere der Bl tter Von hier aus pflanzt sich der Transpirationssog ber die Leitbahnen des Xylems bis in die Wurzel wahrscheinlich sogar bis zur Wurzeloberfl che fort wobei das Abrei en der in den kapillaren Gef en nach oben wandernden Wasserf den infolge der starken Koh sionskr fte zwischen den Wassermolek len sowie durch die Adh sion des Wassers an die Gef w nde verhindert wird Koh sionstheorie der Wasserleitung Zur Bewerkstelligung des Transpirationsstroms muss die Pflanze keine eigene Energie aufwenden Sie nutzt hierzu die Wasserpotentialdifferenz zwischen Boden und Atmosph re aus Funktionell steht die Pflanze zwischen dem fast wasserges ttigten Bodenraum hohes Wasserpotential und dem nicht wasserdampfges ttigten Luftraum niedriges Wasserpotential Das Wasserpotential der Pflanze liegt in Bereichen von 10 bis 30 bar das der Atmosph re um 940 b
76. rationskurven kann auf die Pufferkapazit t d h die F higkeit der Bodensuspension H bzw OH Ionen abzufangen geschlossen werden Gut gepufferte B den zeigen flachen schlecht gepufferte steilen Kurvenverlauf Dar ber hinaus sind lineare Kurvenabschnitte ein Zeichen daf r dass die Pufferkapazit t im entsprechenden pH Bereich nahezu konstant ist w hrend Kr mmungen oder gar Wendepunkte auf nderungen der Pufferkapazit t hinweisen Steilheit und Form der Pufferungskurven sind abh ngig vom Vorhandensein und der Wirkung der verschiedenen Puffersysteme Dies im Einzelnen zu analysieren gelingt allerdings nur in besonderen F llen und mit gro em Aufwand b Praktische Durchf hrung Je zwei 10 g Proben von Sandboden Kalkboden und Komposterde werden in Bechergl sern mit je 100 ml 0 1 mol l KCI versetzt und auf einem Magnetr hrer zu einer homogenen Suspension vermischt Sodann wird eine Glaselektrode eingesetzt Vorsicht beim R hren und der Anfangs pH Wert bestimmt hierzu eventuell mehrere Minuten warten bis sich der endg ltige pH Wert eingestellt hat Der abzulesende pH Wert muss mindestens 30 sek stabil sein Stoppuhr Bei laufendem R hrwerk werden den Bodenausz gen nun aus einer B rette 10 ml 0 05 mol l HCI in 2 mil Portionen zugegeben Der neue pH Wert wird ebenfalls erst dann abgelesen und protokolliert wenn er mindestens 30 sek stabil ist Nach Ablesen dieses Wertes werden die n chsten 2 ml zugegeben u s w Eb
77. rker Konzentration oder bei gen gender Schichtdicke der L sung gen gt die geringe Absorption im Gr n um im durchfallenden Licht auch diesen Teil des Spektrums zu eliminieren Die L sungen erscheinen uns dann dunkelrot wird im Praktikum demonstriert Die Spektren der beiden Chlorophylle a und b zeigen trotz prinzipieller bereinstimmung charakteristische Verschiedenheiten die auf einen geringf gigen Unterschied in der chemischen Struktur zur ckgehen Chlorophyll b besitzt im Pyrrolring B am C Atom 7 anstelle der Methylgruppe bei Chlorophyll a eine Formyl oder Aldehyd Gruppe CHO Beim Chlorophyll b sind dadurch die beiden Absorptionsmaxima im blauen und roten Spektralbereich einander deutlich gen hert d h der blaue Gipfel ist zu l ngeren bathochrom der hellrote zu k rzeren Wellenl ngen hypsochrom verschoben Hinzu kommt dass beim Chlorophyll b der 18 blaue Gipfel h her hyperchrom der hellrote niedriger hypochrom als bei Chlorophyll a ist Chlorophyll b das im gesamten Blaubereich absorbiert ist gelbgr n Chlorophyll a das l ngerwelliges Blau transmittiert ist deshalb blaugr n gef rbt Die gelb bis orange gef rbten Carotinoide zeigen ein dreigipfliges Absorptionsspektrum im blauen Spektralbereich Die Maxima der beiden Hauptgipfel liegen f r die einzelnen Komponenten zwischen 430 und 490 nm Die Absorptionsspektren von Chlorophyllen und Carotinoiden k nnen wie dies in der Regel auch f r andere Stoffe
78. s h ufig quantitativ nebeneinander erfasst Dies geschieht durch die photometrische Mehrkomponentenanalyse bei der die Konzentrationen der Einzelkomponenten rechnerisch ermittelt werden Hierbei wird vorausgesetzt dass sich die Extinktionen der Einzelkomponenten bei jeder Wellenl nge addieren Es gilt also Boa Er Er Eu E oder d konst Esotal E1 a1 X C tE a2 X Ca Pueis Tei An X Cn Liegt ein Gemisch aus zwei Komponenten vor muss die Extinktion bei zwei verschiedenen Wellenl ngen gemessen werden F r beide Wellenl ngen m ssen die Extinktionskoeffizienten f r beide Komponenten bekannt sein Im Falle der Chlorophylle wird in Aceton bei 662 nm Amax f r Chlorophyll a im langwelligen Bereich und 645 nm max f r Chlorophyll b im langwelligen Bereich gemessen Die zugeh rigen spezifischen Extinktionskoeffizienten a sind der folgenden Tabelle nach Lichtenthaler amp Wellburn 1983 zu entnehmen Amax en a en b Tests nm IIxg xcm 662 88 88 11 22 645 18 91 56 11 470 2 27 81 36 227 F r die Gesamtextinktion bei 662 und 645 nm d 1 gilt dann 1 E662 88 88 X CChla T 11 22 X CChlb 2 E645 18 91 X CChla T 56 11 X CChlb Damit liegen zwei Gleichungen vor mit den unbekannten Konzentrationen ccna und ccniv Diese lassen sich durch Einsetzen errechnen 26 a Cchia 11 75 x E662 2 35 x Esas ug x ml b chip 18 61 x Esas 3 96 x Esca ug x ml Zur Bestimmung von drei Kompo
79. s mit dem Mund pipettieren e Im Kursraum sind Rauchen Essen und Trinken grunds tzlich verboten e Die Sicherheitsregeln werden besprochen und sind von allen TeilnehmerInnen zur Kenntnisnahme zu unterschreiben Vorbereitung der Versuche im Laborheft VOR DEM PRAKTIKUM Die jeweils durchzuf hrenden Versuche m ssen gr ndlich vorbereitet sein Es ist wichtig dass Sie die theoretischen Grundlagen und Anleitung nicht nur vor dem Praktikumstag lesen sondern auch verstehen Sie sollten bei der Vorbereitung die Versuchsdurchf hrung mitplanen Dies bedeutet 1 Erstellen Sie vor dem Praktikumstag gruppenweise eine Arbeitsskizze Ziel und grobe Durchf hrung 2 Erarbeiten Sie gruppenweise bereits vor dem Praktikum einen Zeitplan f r die Versuche d h wie die Teilversuche sinnvoll verschachtelt werden k nnen um die Praktikumszeit effizient auszunutzen Die Reihenfolge der Teilversuche stellt nicht unbedingt eine chronologische Anleitung dar 3 Bei einigen Teilversuchen m ssen praktische Berechnungen vorab erledigt werden d h erstellen Sie Verd nnungsschemen und andere Berechnungen gruppenweise bereits vor dem Praktikumstag wie angegeben 4 Machen Sie sich Gedanken wie die Ergebnisse am sinnvollsten dargestellt werden k nnen z B in Tabellenform als Graph etc Diese vier Punkte sollten Sie in Ihrem Laborheft vor dem Praktikum schriftlich festhalten um bei der Besprechung mit den BetreuerInnen optimal vorbereitet zu sein
80. sich um Se Sepalen Kelchbl tter Pe Petalen Kronbl tter St Stamina Staubbl tter Ka Karpelle Fruchtbl tter In den Mutanten agamous ag apetala2 ap2 und apetala3 ap3 sind zwar alle Wirtel vorhanden aber die Identit t der Bl tenorgane in den Wirteln ist betroffen hom otische Mutation ag Mutanten haben nur Kelchbl tter und Kronbl tter Es fehlen Staub und Fruchtbl tter Die Bl tenorgane der dritten und vierten Wirtel haben erneut die Identit t der Bl tenorgane der ersten beiden Wirtel In ag Mutanten scheint au erdem das vierte Wirtel indeterminiert zu sein da sich die Abfolge der Wirtel wiederholt ap2 Mutanten fehlen Kelch und Kronbl tter ap3 Mutanten haben Kelchbl tter nicht nur im ersten sondern auch im zweiten Wirtel und dadurch keine Kronbl tter Anstelle der Staubbl tter finden sich weitere Fruchtbl tter wenn auch 52 morphologisch ver nderte und verwachsene Zum Teil sind die hier beschriebenen Ph notypen nur inkomplett ausgebildet Von den Untersuchungen an diesen Mutanten wurde ein vereinfachtes Modell zur Determinierung von Bl tenorganen erstellt das sog ABC Modell s s P ZN N NT o ABC Modell der Bl tenorganidentit tsgene A Funktion APETALA2 B Funktion APETALA3 C Funktion AGAMOUS ABC Gene werden entsprechend der unteren beiden Schemen in den vier Wirteln exprimiert Entsprechend des Modells ergibt sich dass die vier Bl tenorgane vier verschiedene
81. so Farbschreiben TSWETT fand auf diese Weise die beiden Chlorophylle a und b Zu Anfang der drei iger Jahre gelang es mit dieser Methode eine Reihe von Carotinoidfarbstoffen in pr parativem Ma stab zu isolieren so u a und Carotin Zu Beginn der sechziger Jahre wurde die 11 Adsorptionschromatographie in Form der D nnschichtchromatographie zu einem neuen vorwiegend in der Analytik verwendeten Verfahren weiterentwickelt bergang von der geschlossenen zur offenen S ule Die Verteilungschromatographie beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der zu trennenden Substanzen zwischen zwei nicht oder nur begrenzt mischbaren fl ssigen Phasen Grundlage dieses Trennverfahrens ist das Nernstsche Verteilungsgesetz Es besagt dass in einem System aus zwei nicht mischbaren Fl ssigkeiten das Verh ltnis der Konzentration eines gel sten Stoffes in den beiden Fl ssigkeitsphasen im Gleichgewichtszustand eine Konstante ist sofern die Temperatur unver ndert bleibt Mathematisch wird das Gesetz wie folgt formuliert C K konstant C2 C und C sind die Gleichgewichtskonzentrationen des Stoffes in der ersten und zweiten Phase Die Konstante K wird Verteilungskoeffizient genannt Substanzen mit verschiedenen Verteilungskoeffizienten f r ein zweiphasiges L sungsmittelsystem reichern sich also unterschiedlich in einer Phase an Diese Tatsache wird in der Praxis beim Aussch tteln von gel sten Substanzen ausgenut
82. st also eine dimensionale Gr e Sie ergibt sich aus dem Lambert Beer schen Gesetz E excxd Dieses besagt dass die Extinktion linear von der Konzentration c mol x 1 1 und der Schichtdicke d cm der zu messenden Substanzl sung abh ngt Den Proportionalit tsfaktor bezeichnet man als molaren Extinktionskoeffizienten Er stellt eine charakteristische Stoffkonstante Einheit 1000 cm x mol cm x mmol wird h ufig ohne Dimension angegeben dar die wellenl ngenabh ngig ist ex und meist f r die Absorptionsmaxima X max einer Substanz angegeben wird Anstelle des molaren Extinktionskoeffizienten verwendet man manchmal auch den spezifischen Extinktionskoeffizienten mit der Einheit 1x g x cm Da Lage und H he der Absorptionsmaxima vom jeweiligen L sungsmittel abh ngen muss bei der Angabe eines Extinktionskoeffizienten auch das L sungsmittel genannt werden Zur quantitativen Bestimmung einer Substanz mit Hilfe des Lambert Beer schen Gesetzes wird zun chst die Extinktion E der jeweiligen Probel sung bei einer charakteristischen Wellenl nge normalerweise ein Absorptionsmaximum gemessen und anschlie end aus E die Konzentration c der zu bestimmenden Substanz nach einer der folgenden Methoden ermittelt A Berechnung nach dem Lambert Beer schen Gesetz vgl vorliegenden Versuch B Bestimmung mit Hilfe einer Vergleichsl sung vgl Versuch IIV 2 C Bestimmung ber eine Eichkurve 24 Zu Method
83. stoffwechselaktiven Geweben und Organen der Keimpflanze geleitet werden k nnen Der Mobilisierung liegen enzymatische Prozesse zugrunde Einige bei diesen Vorg ngen aktive Enzyme liegen bereits im ruhenden Samen vor und werden bei der Quellung lediglich aktiviert andere m ssen w hrend des Keimvorgangs neu gebildet werden mRNA und Proteinsynthese dies ist nur bei entsprechendem Quellungsgrad des Samens m glich Die Mobilisierung eines pflanzlichen Reservestoffes unter Beteiligung von Gibberellinen wird im Folgenden am Beispiel der St rkeverzuckerung in Gerstenkaryopsen Karyopse Grasfrucht aus oberst ndigem Fruchtknoten bei der Frucht und Samenschale verwachsen sind Gerstenkorn verfolgt St rke ist das wichtigste Speicherkohlenhydrat in Pflanzen Sie entsteht in den Chloroplasten bei der Photosynthese aus der zun chst gebildeten Glukose Die Organellen in denen St rke gespeichert wird sind Amyloplasten Sie finden sich vorwiegend in Speichergeweben und Speicherorganen wie Samen Wurzeln oder Spross bzw Wurzelknollen 35 Pflanzliche St rke besteht in der Regel aus zwei chemisch verschiedenen Polysacchariden Amylose und Amylopektin In St rkek rnern liegt Amylopektin meist zu 80 90 vor h ufig als H llsubstanz des St rkekorns Amylose im Zentrum zu 10 20 Amylose besteht aus 200 1000 Glukose Molek len die in ausschlie lich 1 4 0 D Glykosidbindungen in demnach unverzweigter Kette verkn pft si
84. terial enthaltenen Pigmente sind daraus ersch pfend zu extrahieren es d rfen bei der Extraktion und bei der Bearbeitung des Extraktes keine Pigmentverluste eintreten und schlie lich m ssen die aus der eingewogenen Blattmenge extrahierten Pigmente zur photometrischen Messung in einem genau definierten L sungsvolumen vorliegen 27 b Praktische Durchf hrung 1 Extraktion Etwa 250 mg frische Brennnesselbl tter Urtica dioica ohne Stiele werden mit einer Schere zerkleinert und auf der Analysenwaage abgewogen Mit wenig Aceton werden sie im M rser unter Zusatz einer Spatelspitze CaCO und einiger Spatelspitzen Seesand gr ndlich zerrieben es d rfen danach keine Blattstrukturen mehr erkennbar sein der berstand nach Zugabe weiterer ml Aceton vorsichtig d nnen Glasstab an M rserausguss anlegen in eine Glasfilternutsche G4 abdekantiert und mittels Wasserstrahlpumpe in einen 50 ml Rundkolben abgesaugt Der R ckstand im M rser wird mehrmals mit Aceton ausgesp lt und die Sp lfl ssigkeit ebenfalls abgesaugt Der Sp lvorgang wird solange wiederholt bis die Sp lfl ssigkeit farblos ist Danach wird der Extrakt aus dem Rundkolben durch einen Trichter in einen 50 ml Messkolben gegossen Auch der Rundkolben wird anschlie end mehrfach nachgesp lt bis die 50 ml Marke im Messkolben erreicht wird Der Messkolben wird mit Parafilm verschlossen 2 Extinktionsmessung Die Extinktion des Extrakts wird bei 662 Chl a 645 Chl
85. trennung durch Adsorptionschromatographie beruht auf vielfach wiederholter Adsorption und Desorption der zu trennenden Stoffe an der Oberfl che eines Adsorptionsmittels Hierzu kommt es wenn ein Substanzgemisch mit Hilfe einer fl ssigen oder gasf rmigen mobilen Phase durch die Schicht des Adsorptionsmittels als station rer Phase gef hrt wird Es bildet sich f r jede einzelne Komponente des Gemischs ein Adsorptionsgleichgewicht aus Resultiert daraus eine unterschiedliche Adsorption f r zwei Substanzen an der festen station ren Phase so wandern diese verschieden schnell und werden getrennt Die station re Phase bilden Sorbentien wie z B Calciumcarbonat Kieselgel oder Aluminiumoxid Ist die mobile Phase fl ssig so handelt es sich meist um ein organisches L sungsmittel das auch als Flie mittel oder Elutionsmittel bezeichnet wird F r ein solches System gilt allgemein leicht adsorbierbare und schwer eluierbare Stoffe wandern langsamer schwer adsorbierbare und leicht eluierbare Stoffe dagegen schneller Die Adsorptionschromatographie wurde erstmals von dem russischen Botaniker TSWETT im Jahre 1906 angewandt Er lie einen Petroleumbenzinextrakt aus gr nen Bl ttern durch ein mit Calciumcarbonat gef lltes Glasrohr S ule laufen und beobachtete dass sich der anfangs einheitliche Extrakt in mehrere gr n und gelb gef rbte Zonen aufgliederte Chromatographie chroma chromatos gr Farbe graphein gr schreiben historisch gesehen al
86. tsteht Glukose 1 phosphat Beim Abbau durch Hydrolasen werden die Glykosidbindungen durch Wasser 37 hydrolytisch gespalten Diese Enzyme hei en Amylasen Sie hydrolysieren St rke zum Disaccharid Maltose In Gerstenk rnern Hordeum vulgare wird die a Amylase bei der Keimung in den Aleuronzellen synthetisiert und ins Endosperm sezerniert Dies wird durch Gibberellins ure GA gesteuert Das vom Embryo produzierte Hormon gelangt nach der Quellung in die Aleuronzellen und bewirkt dort die Aktivierung des a Amylase Gens Es kommt so zu einer de novo Synthese der a Amylase Die Resorption der Zucker erfolgt durch den Embryo Dieser Prozess wird auch in der Brauerei ausgenutzt Um die Maltoseproduktion bei der Malzbildung zu beschleunigen wird gelegentlich GA zugesetzt In diesem Versuch wird die a Amylase Aktivit t in gequollenen und nicht gequollenen Gerstenk rnern berpr ft die auf einem St rke Agar Medium inkubiert werden Durch KII L sung kann die intakte St rke nachgewiesen werden Um die Getreidek rner mit a Amylase Aktivit t zeigen sich farblose H fe aufgrund des St rkeabbaus Durch Zusatz von Gibberellins ure im St rkeagar wird die a Amylase Synthese verst rkt Keine Aktivit t ist nachweisbar wenn die Getreidek rner durch Hitze abget tet werden Scutellum Keimblatt Campbell Reece Biologie 6 Aufl 2004 Abb Mobilisierung von Zucker w hrend der Keimung von Gerstenpflanzen durch Gibberellins
87. tsverh ltnisse zwischen verschiedenen Pflanzenarten zu bestimmen und Stammb ume zu erstellen verl sst man sich daher nicht mehr auf rein morphologische Kriterien sondern zieht molekulare Daten hinzu Hier eignen sich konservierte Gene der Photosynthese oder ribosomale DNA besonders gut Trotz gro er morphologischer Unterschiede lassen sich einzelne Arten durch molekulare Bestimmung ihrer Verwandschaftsverh ltnisse zum Teil in einem Stammbaum neu einordnen Schl sselgene der Pflanzenentwicklung hat man insbesondere anhand des Modells Arabidopsis thaliana untersucht Molekulargenetische Methoden waren sehr wichtig zum Auffinden von Schl sselgenen in Entwicklungsprozessen Wie bereits im vorangegangenen Versuch erl utert wurde werden dazu Mutantenpopulationen erstellt In der Entwicklungsphysiologie werden die mutagenisierten Populationen nach Individuen mit ver nderter Morphologie durchsucht Diese Mutanten m ssen zun chst 50 genetisch n her bestimmt werden Eine zu kl rende Frage betrifft die Auspr gung des Ph notyps Die Mutation kann rezessiv wirken d h nur im homozygoten Zustand des mutanten Allels ist der Ph notyp zu erkennen Allel Zustand des Gens Ist hingegen ein Wildtyp Allel vorhanden heterozygoter Zustand zeigt sich die ph notypische Ver nderung durch das mutante Allel nicht mehr Auf der anderen Seite kann sich die Mutation dominant auswirken d h eine Kopie des mutanten Allels reicht f r die Auspr gung des Ph
88. tung des Versuchs ebenfalls festhalten z B Pflanzenanzuchtbedingungen Sie k nnen dar ber hinaus alles aufschreiben und zeichnen was Ihnen wichtig erscheint Ergebnisse der Teilversuche Zahlen Tabellen Zeichnungen etc Ihre Beobachtungen und kurze Schlu folgerung Weiterf hrende Literatur zur Kursthematik Campbell E A 2003 Biologie 6 Auflage Spektrum Hess D 1999 Pflanzenphysiologie 10 Auflage Ulmer Kutschera U 1998 Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie Quelle amp Meyer L ttge U Kluge M Bauer G 1999 Botanik 3 Auflage Wiley VCH Mengel K 1991 Ern hrung und Stoffwechsel der Pflanze 7 Auflage Fischer Nultsch W 1996 Allgemeine Botanik 10 Auflage Thieme Richter G 1998 Stoffwechselphysiologie der Pflanzen 6 Auflage Thieme Schopfer amp Brennecke 1999 Pflanzenphysiologie 5 Auflage Springer Taiz amp Zaiger 2002 Plant Physiology 3 Auflage Sinauer Auswertung und Versuchsbericht NACH DEM PRAKTIKUM Die Ausarbeitung des Versuchsberichts erledigen Sie bitte am Ende oder nach dem Praktikum Forschungsergebnisse werden in der Regel schriftlich ver ffentlicht Ganz hnlich sollten Sie Ihren Versuchsbericht aufbauen Einen Vorschlag finden sie unten Den Versuchsbericht verfassen Sie bitte auf Bl ttern mit Seitenangaben und liefern ihn den jeweiligen BetreuerInnen zum Beispiel im Hefter ab Der Termin f r die letztm gliche Abgabe von Versuchsberichten wird bei de
89. uch aber Triticum Weizen siehe dazu auch Campbell S 965 967 Bei Koleoptilen wird das Auxin in der nicht wachstumsf higen Spitze produziert wandert polar basipetal und l st in den tiefer gelegenen Regionen ein starkes Streckungswachstum aus Entfernt man 30 die Spitze reagiert das brige Koleoptilgewebe aus Mangel an eigenem Auxin auf von au en zugef hrtes Auxin sehr empfindlich Die Gr e des Streckungswachstums kann man mit zwei Methoden messen 1 Man f hrt dem Koleoptilstumpf Auxin einseitig zu und l st damit an dieser Flanke Zellstreckung aus was zu einer Kr mmung in Richtung der entgegengesetzten Flanke f hrt Die Gr e des Kr mmungswinkels dient als Ma f r die Auxinmenge WENT scher Kr mmungstest siehe Campbell S 967 Dieser Test ist zwar die genaueste Methode aber relativ schwierig auszuf hren 2 Einfacher aber etwas weniger empfindlich ist der Zylindertest bei dem die L ngenzunahme eines Koleoptilzylinders in der entsprechenden Hormonl sung gemessen wird Die h chste Zuwachsrate im Koleoptilzylinder Test liegt im Bereich einer IES Konzentration von 10 mol l H here oder niedrigere Konzentrationen sind weniger oder gar nicht wirksam b Praktische Durchf hrung L sungen Als Testl sungen werden benutzt L sung 1 1 x 10 mol l IES Vorratsl sung 10 mol l in w ssrigem 0 01 mol l Phosphatpuffer KH2PO4 pH 5 0 der Phosphatpuffer wurde vorher mit NaHPO 4 x 2 H2O
90. unden ist Die Wasserpotentialgleichung ist nun folgenderma en zu formulieren Das Wasserpotential der Zelle Pz ist gleich dem Potential gel ster Substanzen Pr negativer Wert weil Wasser in L sungen weniger verf gbar ist L sungen halten ihr Wasser fest plus dem Druck oder Turgorpotential Yp positiver Wert hydrostatischer Druck er hat die Tendenz Wasser fortzubewegen erweitert um ein matrikales Potential oder Quellungspotential Pt negativer Wert da an Oberfl chen bzw an Quellk rper gebundenes Wasser ebenfalls weniger verf gbar ist Wasserpotentialgleichung Yz Yr Yp Yr Je st rker erniedrigt also je st rker negativ das Wasserpotential der Zelle ist umso h her positiver ist ihre Saugkraft Das Wasserpotential einer voll turgeszenten wasserges ttigten Zelle ist gleich 0 69 Ob und in welche Richtung Wasser zwischen 2 L sungen bewegt wird h ngt nicht davon ab welche Substanzen in Wasser gel st sind sondern nur davon wie viel gel ste Substanzen das Wasser enth lt also wie viele Teilchen Molek le oder Ionen in Wasser gel st sind Eine I molare L sung einer beliebigen Substanz die nicht dissoziiert ist hat bei 0 C ein Wasserpotential von 22 7 bar oder 2 27 MPa quimolare L sungen verschiedener nicht dissoziierender Substanzen haben demnach gleiche Yn Werte Sie sind isotonisch iso gr gleich tonos gr Druck b Praktische Durchf hrung Vor dem
91. ure GA Campbell Biologie S 950 GA wird vom Embryo produziert und induziert in der Aleuronschicht a Amylase Dieses Enzym baut im Endosperm St rke ab 38 b Praktische Durchf hrung Zun chst wird der St rkeagar hergestellt Dazu werden pro Gruppe in einem 500 ml Becherglas 375 mg Kartoffelst rke 6 g Agar und 300 mg CaClx2H20 in 255 ml H2O deion auf dem Magnetr hrer unter R hren kurz aufgekocht Achtung brennt an Nachdem eine klare L sung entstanden ist wird sie bei 60 C im Trockenschrank am Arbeitsplatz aufbewahrt warum Danach werden pro Gruppe aus einer 0 3 millimolaren mM Stamml sung Gibberellins ure GA3 Strukturformel Campbell S 968 20 ml einer 0 03 mM L sung hergestellt in 20 ml Messkolben Zur Versuchsdurchf hrung werden insgesamt 7 Petrischalen gebraucht Zur Herstellung von 3 Petrischalen mit je 30 ml Inhalt werden in jede einzelne 5 ml der 0 03 mM GA3 L sung mit 25 ml St rkeagar gemischt die GA wird dadurch 0 005 mM verstanden Zuerst gibt man mit einer 5 ml Vollpipette die GAs L sung in die beschriftete Petrischale gie t 25 ml warmen St rkeagar aus einem 50 ml Messzylinder dazu und verr hrt das Ganze mit einem Plastikspatel Man stellt dann 3 weitere Petrischalen mit 30 ml reinem St rkeagar her Zur Kontrolle wird eine 7 Petrischale mit St rkeagar hergestellt die nicht mit Karyopsen best ckt wird Ein Teil der Karyopsen wurde zur Quellung ca 24 h vorher in eine Petrischale mit
92. von Blatthaaren Trichome in der Epidermis Einzelne Battepidermiszellen entwickeln sich zu Trichomen andere hingegen nicht Dies geschieht in einem Muster auf der Blattoberfl che F r die Ausbildung von Trichomen sind mehrere Schl sselgene identifiziert eines davon ist GLABRAI Der Name glabra bedeutet glatt ohne Haare glabral Mutanten bilden keine Trichome aus Das Protein GLABRA ist also f r die Ausbildung von Trichomen essentiell Es handelt sich dabei um einen Transkriptionsfaktor der f r die Determinierung von Epidermiszellen zu Trichomen wichtig ist 51 Drei weitere Mutanten haben eine ver nderte Spezifikation von Bl tenorganen und k nnen nicht alle Bl tenorgane ausbilden Man spricht im allgemeinen von vier verschiedenen Bl tenorganen die in vier Wirteln Stellungen ausgebildet werden Das erste Wirtel enth lt die gr nen Kelchbl tter das zweite Wirtel die meist bunten Kronbl tter das dritte Wirtel die Staubbl tter und das vierte Wirtel die Fruchtbl tter Anzahl und Verwachsung der Bl tenorgane in den Wirteln sind art bzw familienabh ngig Im Wildtyp Arabidopsis erfolgt die Ausbildung der Bl tenorgane entsprechend des folgenden Bl tendiagramms Die Arabidopsis Bl te Links Photo Mitte Schematischer L ngsschnitt durch das Bl tenmeristem mit den Organanlagen Rechts Bl tendiagramm Anordnung der Bl tenorgane im Querschnitt aus Schopfer amp Brennicke Bei den Bl tenorganen handelt es
93. ysiologisch saure Nitrate z B KNO als physiologisch basische Salze bezeichnet Im vorliegenden Versuch wird eine Zellsuspension der Gr nalge Scenedesmus vacuolatus mit NH4 2SO4 bzw mit KNO versetzt und etwa 2 3 h inkubiert Die zu erwartenden nderungen des pH Wertes der ungepufferten L sungen werden mit einem pH Meter gemessen Grunds tzlich kann selektive Stoffaufnahme die Folge von zwei verschiedenen Ursachen sein a Das Plasmalemma ist f r verschiedene Ionen gleicherma en durchl ssig Diffusion oder Permeation Bis zum Konzentrationsausgleich au en innen werden sie gleich gut aufgenommen F r alle Ionen die im Zellinnern sehr rasch weiterverarbeitet werden 61 z B Stickstoff enthaltende Ionen bleibt jedoch ein Konzentrationsgradient erhalten Nur f r diese Ionen beobachtet man eine gro e Nettoaufnahme was zum selektiven Verschwinden eines Ions aus dem Au enmedium f hrt b Das Plasmalemma ist nur f r bestimmte Ionen durchl ssig diese werden mit Hilfe von Transportproteinen Translokatoren Carriern durch die Biomembran transportiert Es werden zwei Formen von spezifischem Transport unterschieden 1 die katalysierte Diffusion oder der passive Tr gertransport die wiederum nur zu einem Konzentrationsausgleich f hrt Hier folgt der Ionentransport dem chemischen bzw elektrochemischen Potentialgradienten des Substrats 2 der aktive Transport der unter Energieverbrauch ATP auch gegen einen Konzentr
94. ytochrome sind Proteinkomplexe die aus einem Apoprotein bestehen und einem 45 gebundenen Chromophor dem Phytochromobilin Das Chromophor liegt in Abh ngigkeit vom einfallenden Licht in den Konfigurationen cis oder trans vor Hierbei handelt es sich jedoch um ein Gleichgewicht das zur cis oder trans Form verschoben werden kann Rotlicht aktiviert den bergang zur trans Form Pfr mit einer maximalen Absorption bei 730 nm Eine Konformations nderung im Protein aktiviert Phytochrom und Photomorphogeneseantworten werden eingeleitet Bei Dunkelrot hingegen liegt die biologisch inaktive cis Form vorwiegend vor Pr mit einer maximalen Absorption bei 660 nm Da die Konversion von der aktiven in die inaktive Form und umgekehrt reversibel ist spricht man auch von Photoreversibilit t Rotlicht 660 nm Pr Pfr 4 Dunkelrotlicht 730 nm Chromophore phytochromobilin a l Pro His A v 3 Ser T s 3 Sg m f His i l Leu Thioether Cis isomer Gin linkage G l B Red light converts cis to trans o I Pro l His Ser l z rm S 5 N 10 H Trans isomer His H taa Pfr Gin Struktur der Pr und Pfr Formen des Chromophor welches kovalent mit Phytochrom verbunden ist aus Taiz amp Zaiger Pflanzen besitzen unterschiedliche Formen von Phytochromen Die Zusammenh nge zwischen Struktur und Funktion von Phytochromen wurden durch genetische Methoden 46 aufgekl rt Phytochrommutanten wurd
95. zt Da organische Substanzen besser in organischen L sungsmitteln als in Wasser l slich sind k nnen sie in einem Scheidetrichter aus w ssrigen L sungen durch Aussch tteln mit organischen in Wasser schwer l slichen L sungsmitteln extrahiert und so von gut wasserl slichen Stoffen getrennt werden Bei der Verteilungschromatographie handelt es sich um eine kontinuierliche Folge derartiger Aussch ttelungsprozesse Transportiert die mobile Phase ein Substanzgemisch entlang der station ren Phase so stellen sich st ndig neue Verteilungsgleichgewichte zwischen den beiden nicht miteinander mischbaren Phasen ein multiplikative Verteilung Es gen gen dabei bereits kleine Unterschiede zwischen den Verteilungskoeffizienten um zwei Substanzen voneinander zu trennen Die station re Phase besteht bei der Verteilungschromatographie meist aus Wasser oder anderen polaren Fl ssigkeiten welche als polarer Fl ssigkeitsfilm an einer inerten Tr gerschicht Sorbens haften Die Tr gerschicht ist nicht am Trennprozess beteiligt sie dient lediglich dazu die station re Phase aufzunehmen Die mobile Phase Solvens stellt ein mehr oder weniger apolares L sungsmittel dar Sie ist so zu w hlen dass sie sich mit der station ren Phase nicht mischt aber die zu trennenden Substanzen noch l sen kann In einem solchen System wandern polare Verbindungen langsamer als 12 apolare umgekehrt wandern die Komponenten umso schneller je besser sie in der

grundpraktikum physiologie teil

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