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Dokument 1 - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus

1. E coli in LB Medium Ampicillinjo9 bei 37 C unter Sch tteln A tum in YEB Rifampicin oo und Kanamycings bei 28 C unter Sch tteln Entwickeln sich viele Kolonien soll man die Verd nnungsreihe erweitern Versuch 20 Konjugation 198 Versuch 21 Transformation Pfl Zellen 199 5 Arbeitstag bersicht zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc f Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 21 Transformation Pfl Zellen 200 21 1 Transformation pflanzlischer Zellen Im Jahr 1907 beschrieben Smith und Townsend erstmals eine Pflanzenkrankheit die bevorzugt am Wurzelhals verschiedener Pflanzenarten in Form unterschiedlich gro er Wucherungen Tumorbildung crown gall auftritt Als Verursacher vermuteten sie das weltweit verbreitete gramnegative Bodenbakterium Agrobakterium tumefaciens A tum besitzt ein ringf rmiges DNA Molek l DNA Plasmid das in einer oder mehreren Kopien vorliegt Die Plasmid DNA e
2. 1 V US 72 Versuch 7 Enzymkinetik D 4C Erl uterungen zu diesem Versuch anhand eines Beispiels In Abh ngigkeit von der Substrat Konzentration habe sich z B folgender Produkt Umsatz V in U ml ergeben S mMol X Achse 0 2 0 4 1 0 2 0 4 0 10 0 2 32 2 56 V U ml Y Achse 0 68 1 02 1 68 2 02 Diese Ergebnisse werden zun chst in MICHAELIS MENTEN Darstellung aufgetragen s Abb 7 D 4C 1 Es wird ersichtlich da aus dieser Art der Darstellung Informationen ber die Gr e von Km und Vmax nur ann hernd abzuleiten sind Die Ermittlung von Km und V max Ist durch die Auftragung nach LINEWEAVER BURK zu erreichen Hierzu werden zun chst die reziproken Werte von V und S errechnet 5 00 2 50 1 00 0 50 0 25 0 10 1 S mMol 0 50 0 43 0 39 1 V U ml 1 47 0 98 0 60 Die LINEWEAVER BURK Auftragung erfolgt so da 1 S auf der X Achse und 1 V auf der Y Achse abgetragen werden s Abb 7 D 4C 2 Diese Abbildung zeigt da dadurch eine Linearisierung der Abh ngigkeit beider Gr en von einander zu erreichen ist Zu Abb 7 D 4C 2 Ermittlung von Km und Vmax Durch die Me punkte mu nun eine Ausgleichsgerade gelegt werden Dies kann falls die Werte es zulassen entweder per Hand erfolgen oder durch lineare Regression von 1 V auf 1 S Die lineare Regressionsanalyse ergab f r dieses Beispiel folgende Geradengleichung wobei Y 1 V und X 1 S
3. Als Medium oder Tr ger zur Durchf hrung der Elektrophorese gibt es viele Materialien die je nach Anwendungsfall spezifische Vorteile bieten Neben Papier St rke und Agargelen und verschiedenen Folien z B Polyacetat wird in der Bio chemie heute vor allem Polyacrylamid Gel PAG PAGE PAG Elektrophorese verwendet Es ist v llig ungef rbt und inert d h die Elektrophorese ist ohne chemische Ver nderungen der zu trennenden Molek le durchf hrbar PAG ist aus Acrylamid giftig unter Einsatz von quervernetzenden Faktoren vor allem N N Methylen bis Acrylamid im Labor selbst herstellbar s Abb 10 2 Einf hrung in die Elektrophorese 92 A Faktor B Faktor C Addition 9 Kompen Ladung Teilchen beider Effekte sierung gr e beider Efekte Relative Beweglichkeit 3 i Wanderungs sinn der Proteinanionen gt Kathode Einflu von Ladung und Teilchengr e auf die elektrophoretische Beweglichkeit von Pro teinen Aus Gr nden der bersichtlichkeit sind nur die berschu ladungen eingezeichnet Abb 10 1 aus AEBI H Einf hrung in die praktische Biochemie Akad Verl Ges FFM 1965 Viele Firmen liefern auch Fertiggele f r die verschiedensten Anwendungen Dabei bestimmen die Anteile von Acrylamid und bis Acrylamid im Gelansatz die Auspolymerisierung des Gels mit definierten Porenbereichen s Abb 10 3 Neben den oben besprochenen Einflu faktoren auf die elektrophoret
4. ausnutzbarer Frequenzbereich Relative Empfindlichkeit in willk rlichen Einheiten 0 2000 4000 6000 8000 Wellenl nge in A Abb 15 4 Probengef und SEV zur Messung der Radioaktivit t von niederenergetischer Strahlung mittels Fl ssig Scintillations Z hler LSC ver ndert aus Kern und Strahlentechnik Lehrbriefe der Studiengemeinschaft Darmstadt Folokolhode Dynoden Anode Probenl sung und Scintilla tor vermischt lL in Glas oder Plastik Vial mit Schraubverschlu Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 151 Abb 15 5 Schematische Darstellung der wichtigsten elektronischen Baugruppen eines LSC aus COOPER 1981 Hochspannung Photoverst rker R hre Photoverst rker R hre Koinzidenz Schaltung Diskriminator Z hler Recheneinheit amp Zeitgeber Der uns zur Verf gung stehende LSC verf gt ber die M glichkeit 100 Proben ein oder mehrmals hintereinander automatisch zu messen Hierbei kann auch bestimmt werden mit welcher Diskriminator Einstellung einzelne Proben gemessen werden sollen Diskriminator Z hler Diskriminator Z hler B Material a 3H und 4C Standards bekannter Radioaktivit t in Plastik Vials mit Scintillator Cocktail b Fl ssig Scintillations Z hler von Philips Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 152 C Durchf hrung Demonstration a Die beiden Standard Proben werden im 3H bzw
5. 6 0 e 1000 18500 1 o 0 2 et Der Faktor 1000 resultiert dabei aus der Umrechnung von mMol ml in uMol ml D 1B Erkl rungen zu diesem Versuch Bei der Zeit Umsatz Kurve unterscheidet man gem Abb 7 D 1B im allgemeinen drei Kurven Bereiche Bereich A In diesem Bereich ist der Enzym Substrat Komplex noch nicht vollst ndig aufgebaut Er wird presteady state genannt 1 De neue Einheit f r die Enzym Aktivit t ist das Katal kat Sie ist efiniert als die Enzym Aktivit t die 1 Mol Substrat pro Sekunde umsetzt 1 U ent spricht 16 67 nkat Da die Einheit Unit noch in Gebrauch ist Biochemi S nen etc soll sie in diesem Praktikum auch noch verwendet werden Versuch 7 Enzymkinetik 62 ea y 1 Produkte a m Gasherd nn nm m nm Amann Abb 7 D IB Aus J AHLERS A ARNOLD Fr R von D RREN u H W PETER Enzymkinetik 2 Auflg G Fischer Stuttgart New York 1982 S 40 Meist ist dieser Bereich der Zeit Umsatz Kurve jedoch analytisch schwer fa bar da er nur Sekunden dauert in obiger Abbildung berzeichnet Bereich B In diesem Bereich ist der Enzym Substrat Komplex vollst ndig aufgebaut Er wird steady state Bereich genannt Die Reaktionsgeschwindigkeit V f r den Substrat Umbau bzw f r die Produkt Bildung ist hier konstant V d S dt d P dt konstant S Substrat Konzentration P Produkt Konzentration Bereich C Dieser Bereich kann
6. Gewicht bei den einzelnen Aminos uren ist es somit m glich von der Farbintensit t einzelner Aminos uren pro Fleck Gewicht die Farbintensit t des Papieruntergrunds pro Gewicht zu subtrahieren wodurch die um die Untergrund Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 78 F rbung des Papiers bereinigte konzentrationsabh ngige Ninhydrin Farbung f r jede Aminos ure zu ermitteln ist s D Auswertung Anhand von Eichchromatogrammen k nnen die in diesem Versuch zu bestimmenden Aminos uren entsprechend folgendem Schema s a R Wert Versuch 4 S 37 und Versuch 5 S 41 lokalisiert werden Papier Chromatogramm CD B Material und Ger te a entwickelte AS Chromatogramme b Ninhydrin Reagens 1 Ninhydrin mit 2 Colidin Lutidin Wasser 1 2 3 in 97 thanol abs am Tag der F rbung in brauner Flasche ansetzen c Anf rbetank mit Athanol abs ges ttigt mit CO2 Flasche und Temperatur Kontrolle 60 C Halterung f r Chromatogramme d Lichtplatte e Waage 3 Nachkommastellen f Schere g Pinzette Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 79 h Reagensgl ser i 50 thanol zur Elution j Fotometer bei 578 nm C Durchfiihrung jeweils 4 Studenten a Bereits vor Beginn des Praktikums wird aus Zeitgriinden die Anf rbung der Chromatogramme eingeleitet bzw durchgef hrt Hierzu werden die Chromatogramme mit Ninhydrin Reagens bespr ht und ges ttigt kurz durch schwenken in der Luft getro
7. Strahlung ausgel sten Lichtmenge und die im SEV sich ergebende Impulsh he proportional ist der Energie der zu messenden Strahlung Mit elektronischen Mitteln wird der Spannungsimpuls vom SEV weiterverarbeitet s Abb 15 5 Die Impulse der beiden SEV gelangen zun chst an eine sogenannte Koinzidenz Schaltung die nur die Impulse zum Verst rker weiterleitet die von beiden SEV gleichzeitig abgegeben werden Hierdurch ist es m glich Impulse die durch Umwelt Radioaktivit t in unterschiedlichem Ma e von SEV I und SEV II aufgenommen wurden von der Proben Strahlung zu trennen und damit den Background der Messung gering zu halten Die im Verst rker linear verst rkten Impulse gelangen schlie lich zu sogenannten Diskriminatoren die wegen der Proportionalit t von Impulsh he und Energie der gemessenen radioaktiven Strahlung aus der Amplitude der Impulse die Strahlungsanteile einzelner Radionuklide z B 3H 14C 32p 35s etc unterscheiden k nnen Jedem Diskriminator sind Z hler nachgeschaltet welche das Z hlergebnis in Zusammenwirken mit einem Zeitgeber als Z hlrate Impulse Min auf der Anzeige Einheit darstellen ber einen Drucker werden die Me ergebnisse mit Proben und Diskriminator Identifikation auf einem Papierstreifen ausgegeben Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 150 Abb 15 3 Typischer Empfindlichkeitsverlauf der Photokathode eines Sekund r Elektronen Vervielfachers SEV aus ALLKOFER 1971 3
8. Y a bex Y 0 38131 0 221938 X Versuch 7 Enzymkinetik 73 Definitionsgem ist der Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der Y Achse 1 V der Wert f r 1 V max und der Schnittpunkt mit der X Achse 1 S der Wert f r 1 Km Die Regressions Gerade schneidet die Y Achse also bei X 0 Somit ergibt sich Y 0 38131 0 221938 0 Y 1 V max 0 38131 a der Regr Gleichung Vmax 1 0 38131 max ist demnach 2 62 U ml Der Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der X Achse ergibt sich wenn Y 0 gesetzt wird Y 0 38131 0 221938 X 0 0 38131 0 221938 X nach X aufgel st ergibt sich 0 221938 X 0 38131 X 0 38131 0 221938 X 1 718 1 Ky 1 718 1 K 1 718 Somit ergibt sich ein Km Wert von 0 582 mMol Substrat Anmerkung Die Michaelis Konstante Km ist die Substrat Konzentration bei halb maximaler Reaktionsgeschwindigkeit des Substrat Umsatzes durch ein Enzym Sie ist somit ein Ma f r die Affinit t eines Enzyms zu einem bestimmten Substrat Ist Km hoch so besteht eine geringe Affinit t des Enzyms zum Substrat bei niedrigem Km liegt dagegen hohe Affinit t zum Substrat vor Werden einem Enzym mehrere Substrate mit unterschiedlichen Kpm Werten angeboten so werden vornehmlich die Substrate umgesetzt zu denen das Enzym eine h here Affinit t aufweist kleinere Km Werte Im allgemeinen liegen Km Werte im Bereich von 10 2 bis 10 6 Mol 74 Versuch 7 Enzymkin
9. d Eppendorf Pipetten e K vetten R hrst bchen Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung 86 C Durchf hrung 4 Studenten a Jede 4er Gruppe hat hierf r vom 1 Arb Tag zwei Zucker Proben zur Verf gung Davon wird eine Probe ausgew hlt und deren Konzentrationsstufe sofort im Heft vermerkt b Die inzwischen zur Trockne eingedampfte Zucker Fraktion wird zun chst quantitativ mit je 10 ml A dest aufgenommen wobei die innere Glaswand des Becherglases intensiv mittels Gummiwischer abzureiben ist c Jede Gruppe 8 Studenten f hrt nun die beiden Analysen s o zusammen mit dem Gruppenbetreuer nach dem unten angegebenen Arbeitsschema an einem LKB Digitalphotometer bei 340 nm Molarer Extinktionskoeffizient 6 3 durch Ansatz Vorschrift Boehringer Mannheim K vette Reagenz Einsatz 1 2 3 Blindwert Saccharose Glucose Ges Glucose Probe P Fructosidase Testsatz L sg 3 6 Fructosidase H20 I Saccharose gt Glucose Fructose mischen 15 Min bei 25 C Puffer NADP ATP Testsatz L sg 1 Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung 87 K vette Reagenz Einsatz 1 2 3 Blindwert Saccharose Glucose Ges Glucose A dest ad 3 0ml 1 8ml 1 7ml mischen nach 3 Min Ablesen der Extinktionen Hexokinase Glucose 6P Dehydrogenase HK bzw G6P DH Testsatz L sg 2 HK II Glucose ATP gt Glucose 6P ADP G III Glucose 6P NADP gt Gluconat 6P NADPH H s S
10. Detektor WLD S ule Chromosorb 102 Eigenschaften siehe Be schreibung in Versuch 3 Saulen Temperatur 120 C Temperatur Einspritzblock 160 C Temperatur Detektor 160 C Tr gergas Helium Tr gergas Flu rate 60 ml Min 2 Sul Spritze 3 Proben verschiedene alkoholische Getr nke in kleinen Mengen Es k nnen auch eigene Proben mitgebracht werden C Durchf hrung s hierzu auch Durchf hrung zu Versuch 3 1 Jede Gruppe entscheidet sich f r eine der vorhandenen Proben und f hrt w hrend ca 45 Minuten am GC eine oder zwei Bestimmung en durch 2 Von jeder Probe werden 2 5 ul in den GC eingespritzt wenn sich eine stabile Basislinie am Bildschirm eingestellt hat 3 Ist nach ca 400 Sekunden der thanol Peak eluiert wird das Chromatogramm Aufnahmeprogramm ber lt ESC gt verlassen Das gesamte Chromatogramm er scheint nun auf dem Bildschirm Versuch 13 Alkoholbestimmung mittels Gaschromatografie 1283 4 Am Display des GC einen neuen Aufheizzyklus f r die n chste Analyse starten 5 ber die Taste lt O gt oder lt RETURN gt gelangt man in ein Optionsmen das eine Bearbeitung des Chromatogramms nach verschiedenen Gesichtspunkten erm g licht 6 Vor der Integration des Wasser und thanol Peaks wird zun chst die Basislinie eingestellt und falls die Basislinie eine Drift aufweist diese ber den Punkt Drift korrigiert 7 Nun kann integriert werden wobei f r jeden Peak jeweils Star
11. Versuch 5 Papierchromatografie 43 Handschwei als Verunreinigung der Probe in Erscheinung treten Nach M g lichkeit verwendet man eine Pinzette zur Hantierung mit dem Papier d Das Chromatografiepapier mit dem Gruppennamen und der Konzentrationsstufe e an den vorbereiteten Stellen kennzeichnen Hierzu bitte nur einen Bleistift verwenden Kugelschreiber oder Tinte nicht verwenden da die Farbstoffe mit den Laufmitteln der Chromatografie ebenfalls wandern w rden Zur zweidimensionalen Chromatografie kommen in den vermerkten Laufrichtungen Phenol Wasser und Butanol Eisessig Wasser Gemische zur Anwendung Trotz relativ kurzer Laufzeiten 5 Stunden bei Phenol Wasser und ca 4 Stunden bei Butanol Eisessig Wasser ist die eigentliche Chromatografie im Verlauf des Praktikumstages aus Zeitgr nden nicht m glich sie erfolgt wie die Durchf hrung der D nnschicht Chromatografie in Glastanks vom Betreuer s Versuch 4 s S 37 C1 Wodurch kommt die Trennung der einzelnen Aminos uren bei der Papier chromatografie zustande Amino S uren in Asp Gly Ala Val Leu der Probe O C OH O C OH Ose cae wae a ica Struktur H C NH Man N ale on H C H H HH a are O C OH H CH CH ee CH CH R Wert im Laufmittel Phenol 0 13 0 40 0 59 0 79 0 83 Wasser AEBI 1965 L slichkeit der Amino s uren in 0 50 25 0 16 7 8 85 2 19 Wasser g 100ml AEBI 1965 Versuch 5 Papierchromatografie
12. Versuch 8 Fortf hrung von Versuch 5 Quantitative Auswertung der zweidimensionalen Papierchromatografie der Aminos ure Fraktion von Versuch 1 1 Arbeitstag Versuchs und Zeitplan 11 Versuch 9 Quantitative Bestimmung der Saccharose und D Glucose Gehalte der Zuckerfrakti on von Versuch 1 1 Arbeitstag mittels Enzym Testsatz Versuchsziel Einf hrung in die enzymatische Analytik zur Bestimmung von Meta boliten Versuch 10 Elektrophorese eines Pr parates der sauren Phosphatase unter nativen Bedingungen mit anschlie ender Protein und Enzym spezifischer Anf rbung der Elektrophero gramme Versuchsziel Einf hrung in die Polyacrylamid Elektrophorese 5 Arbeitstag s S 113 Versuch 11 SDS Polyacrylamid Elektrophorese eines Pr parates der sauren Phosphatase unter reduzierenden Bedingungen zur Bestimmung des Molekulargewichtes von Proteinfraktionen anhand von Molekulargewichts Standards Versuchsziel Anwendung der Polyacrylamid Elektrophorese f r besondere Trenn aufgaben in der Biochemie z B Molekulargewichts Bestimmung Versuch 12 ELISA Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Ribulose Bisphosphat Carboxylase Oxygenase Rubisco Konzentration in Bl ttern Versuchsziel Einf hrung in immunologische Arbeitsverfahren Versuch 13 Quantitative Bestimmung des thanolgehaltes in verschiedenen alkoholischen Ge tr nken mittels Gaschromatografie Versuchsziel Einf hrung in quantitative Besti
13. gt rh gt mittlere Porengr f e A D 5 0 amp 2 25 30 Acrylamid Einflu der Gel Konzentration Prozent Gewicht gesamtes Gelvolumen auf die mittlere Porengr e Einf hrung in die Elektrophorese 96 Abb 10 4a aus Cooper 1981 0 8 0 6 0 2 a relative Beweglichkeit 2 gt gt gt oa _ a gesamte Gel Konzentration 5 Vernetzung Abhingigkeit der elektrophoretischen Beweglichkeit von der Gel Konzentration fur ver schiedene Proteine Einf hrung in die Elektrophorese 97 Abb 10 4b aus Cooper 1981 T i T _ A Molekulargewicht x 1074 02 04 06 08 10 Beweglichkeit Abh ngigkeit des Molekulargewichts von 37 verschiedenen Proteinen zwischen 11000 und 70000 d und ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit F r die praktische Arbeit bedeutet dies die Porengr e des PAG f r die jeweilige Trennaufgabe spezifisch zu w hlen Trennt man z B hochmolekulare Proteine in einem PAG mit zu engen Poren wird man auch bei hoher Feldst rke feststellen m s sen da die Eiwei e nicht in das PAG eindringen k nnen und demzufolge nicht zu trennen sind Will man andererseits hochmolekulare Proteine in einem PAG mit zu gro en Poren trennen so werden die Faktoren Molek lladung und Viskosit t des Mediums allein vermutlich f r eine gute Trennung nicht ausreichen Zur Trennung von Proben mit kleinen und gro en Molek len bietet sich die Anwen
14. s Plasmidkarte Abb 18 1 Ampicillin Carbenicillin Resistentgene Ap Cb Hygromycin Resistentgen Hg Mannopinsynthase MAS Promotor Glucuronidase GUS Reportergen 21 2 Methoden der Gen bertragung Um Gene in Pflanzenzellen einzuschleusen sind verschiedene Verfahren des Gentransfers entwickelt worden s 20 2 Eine davon basiert auf einem Mechanismus der Gen bertragung der in der Natur vorkommt n mlich der eben beschriebenen indirekten Gent bertragung s 21 4 durch A tum im Praktikum Prinzip H here Pflanzen sch tzen sich gegen Wasserverlust und Infektionen durch Ablagerung von Fetten und Wachsen auf ihren Oberfl chen Normalerweise kann A tum diese Barriere nicht berwinden Bei Verwundung scheiden jedoch einige Pflanzenarten phenolische Inhaltsstoffe aus s o die Agrobakterien aktivieren Eine Gen bertragung in Pflanzenzellsuspension ben tigt jedoch keine Verwundung da bei Sch tteln w hrend der Kultur gen gend verletzte Zellen vorhanden sind Versuch 21 Transformation Pfl Zellen 202 21 3 Vitalit tstest der Karottenzellen Vor der Transformation ist es ratsam die Vitalit t der Zellen zu erfassen Sie l t sich gut mit Fluoresceindiacetat FDA nachweisen Fluoresceindiacetat wird in den lebenden Zellen enzymatisch in Fluorescein und Diacetat gespalten Vitale Zellen zeigen bei dieser Nachweismethode in der blauen Erregungstrahlung Filtereinstellung s u eine gelblich gr ne Fluoreszenz w
15. 10 Minuten b Nach dieser Gleichung kann die Auswertung der Enzymaktivit ts Proben vorgenommen werden Konzentrations Stufe der Probe bitte ankreuzen Extinktionen Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 24 Die Enzymaktivit t des Pr parates der _ amp Amylase betr gt somit U ml Probe katal s S 18 D3 Ermittlung der spezifischen Enzymaktivit t a Hierbei ist zu ber cksichtigen da die Enzymkonzentration f r die Enzymaktivit ts Bestimmung 100 fach verd nnt im Vergleich zur Enzymprotein Bestimmung angesetzt war s o Nach der Ausf hrung unter Punkt A ergibt sich somit folgende Bestimmungsgleichung Enzymaktivit t 100 spezifische Enzymaktivit t U ml 100 spezifische Enzymaktivit t b Aus der Bestimmung von Enzymaktivit t und Proteingehalt ergibt sich somit eine spezifische Enzymaktivit t von katal s S 18 Einf hrung in die Gaschromatografie 25 Einf hrung in die Gaschromatografie GC zu den Versuchen 3 und 13 Versuch 3 Einf hrung in die Gaschromatografie Qualitative Untersuchun zum Retentionsverhalten von Substanzen am Beispiel der homologen Reihe Methanol Athanol n Propanol Versuch 13 Quantitative Alkohol Bestimmung in verschiedenen alkoholischen Getr nken mittels Gaschromatografie A Prinzip der Gaschromatografie Wie bereits einf hrend beschrieben liegt allen chromatografischen Verfahren das folgende zentral
16. B 7 w hrend 20 Minuten Versuch 11 Elektrophorese SDS 116 l Die gef rbten Elektropherogramme werden in 7 iger Essigs ure 9 aufbewahrt wodurch die Farbintensit t der Banden noch zunimmt D Auswertung Tabelle des Molekulargewichts der verwendeten Referenz Proteine Molekular isoelektr Protein Gewicht kd 1 Kohlens ureanhydratase 2 Ei Albumin 3 Rinderserum Albumin 4 Phosphorylase B kd Kilodalton pI pH des isoelektrischen Punktes Anhand der in obiger Tabelle angegebenen Molekulargewichte der Referenz Proteine ist das Molekulargewicht der sauren Phosphatase Bande n gr enordnungsm ig einzuordnen Durch Zerst rung h herer Organisationsformen der Proteine nach SDS Behandlung kann man dabei davon ausgehen da die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine haupts chlich von deren Kettenl nge abh ngt Dabei wandern kleinere Molek le schneller als gr ere sie sind demnach also weiter unten im Gel zu lokali sieren Am zweckm igsten geht man bei der Auswertung ohne M glichkeit einer Quantifi zierung durch ein Densitometer oder Bildanalyseverfahren folgenderma en vor 1 Nach Anf rbung der Protein Banden berf hrt man das Elektropherogramm mit etwas 7 iger Essigs ure in eine passende Petrischale Nach dem Markieren des Gruppennamens wird eine vergr ernde Fotokopie des Gels hergestellt Dabei sollte die markierte Gel Ecke nach rechts oben weisen 2 Anhand einer Fotokopie des
17. HCI durch A dest ist der Austauscher wieder regeneriert und f r neue Versuche einsetzbar Bei Anionen Austauschern z B AMBERLITE IRA 425 20 50 mesh ist die funk tionelle Gruppe R NH3tOH wobei das OH Ion gegen anorganische oder organi sche Anionen z B organische S uren R COO ausgetauscht werden kann Durch Verwendung eines berschusses einer relativ starken organischen S ure z B Amei sens ure k nnen auf diese Art gebundene Anionen wieder freigesetzt werden indem z B Formiat Ionen die S urereste der sorbierten organischen S uren verdr ngen Die Ionenaustauscher Chromatografie wird meist unter Verwendung geeigneter Puf fersysteme als Elutionsmittel auch zur Fraktionierung von geladenen Stoffgruppen verwendet Sehr bekannt ist die Auftrennung von biologischen Aminos ure Gemischen unter quantitativer Bestimmung einzelner Aminos uren Wie stark eine Aminos ure vom Ionenaustauscher gebunden wird h ngt von deren lonisations zustand ab d h von der Dissoziationskonstanten der funktionellen Gruppen der ein zelnen Aminos uren und vom pH Wert des Elutionsmittels Man nutzt also zur Trennung einzelner Aminos uren durch die Verwendung verschiedener Puffer als Elutonsmittel eventuell auch als pH Gradient die an sich geringen Unterschiede in der Ionisation der funktionellen Gruppen von Aminos uren aus Die aus der Austau scher S ule eluierten Aminos uren werden angef rbt z B mit Ninhydrin s u und kolorimetrisc
18. In diesen Gleichungen beruht der Faktor 10 darauf da jeweils nur 1 ml jeder Sephadex Fraktion Vol 10 ml mit Orcin Reagens versetzt wurde und der Faktor 20 auf dem auf die Sephadex S ule aufgetragenen Probevolumen von 20 ml e Die RNA und AMP Konzentration in 1 ml der aufgetrennten Probe betr gt somit ug ml Probe RNA sssssssseses ug ml Probe AMP ssesssseees Versuch 7 Enzymkinetik 37 3 Arbeitstag Versuche zum Einflu von pH Reaktionsdauer und Substrat Konzentration auf die Enzymaktivit t am Beispiel der sauren Phosphatase aus Kartoffeln mit p Nitrophenylphosphat als Substrat Versuchsziel Charakterisierung eines Enzyms in Hinblick auf a Enzymaktivit t und Reaktionsdauer b Enzymaktivit t und pH Wert des Mediums c Enzymaktivit t in Abg ngigkeit von der Substrat Konzentration und Bestimmung von Vmax und Km A Prinzip Die saure Phosphatase spaltet p Nitrophenylphosphat p NPP nach der Gleichung o OH N O o P O p NPP o SE OH Weder p NPP Substrat noch p Nitrophenol Produkt absorbieren im sichtbaren Wellenl n gen Bereich H O Erst nach Bildung des Na Ions im alkalischen Saure Phosphatase Bereich hat p O H p Nitrophenol Nitrophenol ein Ab H3PO sorptionsmaximum bei 405 nm k 1 Hierbei gilt E S gt ES 2 gt E P Ka wobei E f r Enzym S f r Substrat und P f r Produkt steht und durch ES des Enzyms Substrat Komplex symb
19. Konzentrationsstufe jeweils ein Kontrollwert mit anzusetzen _Versuchsansatz Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ml Puffer 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 c A dest 3 09 3 09 3 08 3 08 3 06 3 06 3 03 3 03 3 00 3 00 2 90 2 90 2 80 2 80 2 70 2 70 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 p NPP 0 01 0 01 0 02 0 02 0 04 0 04 0 07 0 07 0 10 0 10 0 20 0 20 0 30 0 30 0 40 0 40 e Im Wasserbad bei 30 C 5 Min Vortemperieren Enz Lo sg 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 g Start Uhr Leit ie er ur ae ne seat aan se aa ee ea a Sofort nach Enzym Zugabe Start mischen Zeit notieren und weiter inkubieren bei 30 C Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 NaOH a 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 nach Min 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 Ges Vol 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 ml b Messung der Extinktionen aller Proben gegen A dest
20. P D Doenecke u J Kolman 1994 Kurzes Lehrbuch der Biochemie f r Mediziner und Naturwissenschaftler G Thieme Verlag Stuttgart Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung 85 4 Arbeitstag Quantitative Bestimmung der Saccharose und D Glucose Gehalte der Zuckerfraktion von Versuch 1 1 Arbeitstag mittels Enzym Testsatz Versuchsziel Einf hrung in die enzymatische Analytik zur Bestimmung von Metaboliten A Prinzip s Einf hrun Verschiedene Reagentienhersteller haben sogenannte Enzym Tests tze zur quantitativen Bestimmung wichtiger Metaboliten in ihrem Programm wobei die Enzyme quasi als Reagentien eingesetzt werden Absorptionsspektren von NAD und NADH Sehr oft handelt es sich hierbei m um gekoppelte Enzym Reaktio nen mit Dehydrogenasen als NADH End Reaktionen die entweder NADPH NAD oder NADP zu NADH H bzw NADPH H umset l NAD zen Diese beiden Coenzyme NADP weisen ein unterschiedliches Absorptionsspektrum auf s ne benstehendes Schema anhand dessen die eigentliche Metaboli ten Bestimmung fotometrisch erm glicht wird z B Messung von NADH oder NADPH bei 340 nm B Material und Ger te a Probe eingeengte Zucker Fraktion von Versuch 1 1 AT b Enzym Testsatz Boehringer Mannheim bestehend aus folgenden L sungen Fructosidase L sung Nr 3 Puffer NADP ATP Nr 1 Hexokinase u Glucose 6 Phosphat Dehydrogenase L sung Nr 2 c Fotometer bei 340 nm
21. Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc f Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 210 22 3 Polymerasekettenreaktion Polymerase Chain Reaction PCR Die Entwicklung der Methoden zur DNA Klonierung in den siebziger Jahren gab der Forschung neue Impulse denn nun konnte man Gene und Genaktivit t auf eine Art studieren die zuvor nicht m glich gewesen war Etwas hnliches geschah in den achtziger Jahren als man wiederum eine revolution re Methode entwickelte die PCR PCR ist eine recht unkomplizierte Methode Ein kurzer Abschnitt eines DNA Molek ls wird viele Male von einer DNA Polymerase kopiert Die PCR bewirkt die selektive Vervielf ltigung eines beliebigen Abschnitts in einem DNA Molek hl Man kann dazu jeden DNA Bereich ausw hlen vorausgesetzt die Sequenzen an seinen Enden sind bekannt Dies ist notwendig da zu Beginn der PCR zwei kurze Oligonucleotidketten als Primer mit dem DNA Molek l hybridisieren m ssen Man benutzt Sequenzteile aus der Umgebung des gew nschten DNA Abschnitts um zwei synthetische DNA Oligonucleotide zu synthetisieren deren Sequenz jeweils zu einem der beiden DNA Str nge komplement r ist Diese Oligonucleotide dienen einerseits als Starthilfe Primer f r die DNA Synthesereaktion und andererseits begrenzen sie den zu vervielf ltigenden Abschnitt am Ende der Sequenz 22 3 1 Prinzip der PCR Methode Aus Zellen isolierte
22. durchf hren s u indem das S ulen Eluat mittels Schlauchpumpe in einer w hlbaren Durchflu rate abgesaugt und durch ein Durchflu fotometer bei variabler Wellenl ngen Einstellung und angeschlossenem Laborschreiber geleitet wird Ein Fraktionssammler erm glicht dabei die Sammlung einzelner Fraktionen in passenden Reagensgl sern Gerade bei der Untersuchung von Nukleins ure oder Protein Extrakten kann das Sephadex Eluat im Durchflu fotometer bei 250 260 bzw 280 nm kontinuierlich durchgemessen werden und man erh lt zugeordnet zu den gesammelten Fraktionen die Elutionskurve s Schema Reagens gl ser Wellenl nge variabel Sephadex Schlauch Durchflu Fraktions S ule punpe PCI ete sammler mi Schreiber Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 49 Im Rahmen des Praktikums stehen derartige Ger te nicht zur Verf gung so da die Sammlung einzelner Eluat Fraktionen und deren Auswertung sehr zeitaufwendig durchgef hrt werden m ssen Nachweis Reaktion f r RNA und AMP Da mittels Sephadex eine Trennung dieser beiden Substanzen erm glicht wird kann deren fotometrischer Nachweis auf einer gemeinsamen Grundlage erfolgen Wir ver wenden die Orcin Nachweismethode die darauf beruht da die in beiden Substan zen enthaltenen Pentosen durch Kochen in Anwesenheit starker S uren zu Furfural oxidiert werden s Reaktionsschema Furfural ergibt mit Orcin ein gr nes Kondensationsprodukt dessen Extinktion gegen einen Blin
23. empfindlich ist Wurde mit einem Plasmid transformiert welches eine Ampicillinresistenz tr gt sind nur diese Bakterien in der Lage auf N hrb den zu wachsen die dieses Antibiotikum enthalten N hrmedien 1 Liter Luria Berta Medium LB Medium Caseinhydrolysat Pepton 10g Hefeextrakt 5g NaCl 5g Bacto Agar 15g autoklavieren YEB Medium Fleischextrakt 5g Hefeextrakt lg Caseinhydrolysat Pepton 5g Saccharose 5g Bacto Agar 20g 1 M MgCl 2 ml pH auf 7 2 einstellen autoklavieren auf 45 C abk hlen anschlie end dazu 2 ml sterilesIM MgCl pipettieren Sterilisation erfolgt mit Rotrandfilter 0 2 um Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Antibiotika Stamml sung Ampicillin 25 mg ml steril filtrieren Carbenicillin 25 mg ml steril filtrieren bei 20 C aufbewahren Glycerinmedium 75 ul Bakteriensuspension 25 ul Glycerin autoklaviert 181 gut mischen anschlie end in fl ssigem Stickstoff schockfrieren und bei 80 C aufbewahren Bakterien k nnen unter diesen Bedingungen einige Jahre Vitalit tsverlust gelagert werden Sterilisation erfolgt mit Rotrandfilter 0 2 um ohne Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 182 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 183 2 Arbeitstag bersicht zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli
24. hrte Versuch zur Wirkung von Abschirmungsma nahmen auf die Messung der y Umweltstrahlung w re demnach wie folgt auszuwerten mit Pb mit a ohne Pb b Abschirm c Berthold Pb Abschirmung Ringe Abschirmung Z hlrate IpM Standdard abweichung s IpM Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 133 Ergebnis Da der radioaktive Zerfallsproze ein unabh ngiger zuf lliger seltener und unregelm ig auftretender Vorgang ist kann nicht vorhergesehen werden wann der n chste Zerfall eintreten wird hnliche Ereignisse sind z B die Anzahl Telefonate pro Tag die Anzahl Rosinen in einem Kuchenst ck die Anzahl Tippfehler pro Seite die Anzahl von Unwettern in einem Jahr oder das Wetter des n chsten Tages Jede Einzelmessung solcher Ereignisse wie z B der Radioaktivit t wird aber um so sicherer je l nger der Zeitabschnitt f r ihre Messung gew hlt wird Die bei kurzer Me zeit solcher Ereignisse g ltige Poisson Verteilung wird bei einer gr eren Me dauer der Normal Verteilung hnlich s u und es wird zul ssig die Standardabweichung aus der Summe solcher Ereignisse zu bestimmen Sie gibt an mit welcher Schwankungsbreite bei einer neuerlichen Messung des gleichen Pr parates unter den gleichen Bedingungen zu rechnen w re Wurde z B ein Pr parat innerhalb 30 Minuten gez hlt und man z hlte dabei 50000 Impulse so betr gt die Standardabweichung dieses Me wertes 50000 ge s 7 5 gt das
25. mit mit a ohne b Pb Abschirm c Berthold Pb Ab Pb Abschirmung Ringen schirmung Z hlrate IpM Ergebnis amp oder Strahlung ist bereits durch d nnes Blech vollst ndig zu absorbieren Die Intensit t von y Untergrundstrahlung terrestrisch kosmisch ist dagegen durch zunehmende Dicke der Bleiabschirmung wohl zu reduzieren aber nicht vollst ndig zu l schen Daher mu die Untergrundstrahlung bei jeder Radioaktivit tsmessung gesondert erfa t und von der Proben Z hlrate subtrahiert werden Merksatz Ein Blatt Papier reicht zur Absorption von a Strahlung ein Brockhaus Band zur Absorption von Strahlung der 24 b ndige Brockhaus incl Erg nzungsb nde reicht jedoch nicht aus um y Strahlung vollst ndig abzuschirmen 2 Wie sicher sind Radioaktivit tsme werte Z hlstatistik a Einzelmessung Bei einer gen gend gro en einzeln gemessenen Impulszahl ist die Standardabweichung s JIMPULSZAHL Mefzeit Min Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 132 Beispiele zur _ statistischen Beurteilung einer Messung _ einzelner unter schiedlich lange gez hlter Impulssummen Me wert Me zeit Standard abweichung Impulse Min absolut in vom Ergebnis 10 3 2 32 10 IpM 3 2 IpM 100 10 10 100 IPM 10 IpM 1000 32 3 2 1000 IpM 32 IpM 10000 100 1 10000 IpM 100 IpM 32 10 3 2 100 IpM 3 2 IpM 32 5 6 4 200 IpM 6 2 IpM 32 2 16 500 IpM 16 0 IpM Der unter C 1 angef
26. 14C Diskriminator jeweils 5 Mi nuten gez hlt b Die Me ergebnisse werden in die unter D Auswertung vorbereitete Tabelle zur Bestimmung der Z hlausbeute eingetragen D Auswertung a Zun chst ist zwischen Z hlrate und Zerfallsrate Radioaktivit t zu unterschei den Die Z hlrate IpM oder CpM Impulse Min oder Counts per Min ist nicht gleichzusetzen mit der Zerfallsrate DpM Disintegrations per Min oder Zer f lle Min eines Radionuklids s S 136 ff Erst durch Kenntnis mehrerer Kenngr en vor allem der Z hlausbeute kann die Zerfallsrate aus der Z hlrate bestimmt werden s u b Die Z hlausbeute eines Ger tes zur Messung der Radioaktivit t errechnet sich nach folgender Gleichung IpM Standard e 100 Z hlausbeute in DpM Standard Da die Zerfallsrate der Standard Proben DpM bekannt ist mu nur die Z hlrate IpM der beiden Proben bestimmt werden c W hrend die Halbwertszeit also die Zeit nach der die H lfte aller Kerne eines Ra dionuklids zerfallen ist bei 14C 5760 Jahre betr gt mu die Radioaktivit t des 14C Standards nicht korrigiert werden Allerdings erfordert der 3H Standard eine Halbwertszeit Korrektur Die Halbwertszeit von 3H betr gt 12 26 Jahre Das Standard Pr parat wurde am 20 10 1973 mit einer Zerfallsrate von 98700 DpM beschafft Die Halbwertszeit Korrektur wird nach dem Zerfallsgesetz vorgenommen Es lautet Die Anzahl radioaktiver Kerne zum jetzige
27. 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc f Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 206 22 1 Nachweis des eingebauten Gens Eine Transformation ist erst dann erfolgreich abgeschlossen wenn man die gesuchte DNA Sequenz in transgenen Zellen bzw Pflanzen nachgewiesen hat Es gibt mehrere Techniken zur Identifizierung klonierter Gene z B 1 Der Einsatz von Farbstoffen X Gluc 2 Polymerasekettenreaktion Polymerase Chain Reaction PCR 3 Blotting Techniken Southern Blot 22 2 Der Einsatz von Farbstoffen Der Gebrauch chromogener Substrate war f r die Entwicklung genetischer Screeningmethoden sehr wichtig Das bekannteste System ist die chemische Verbindung X Gluc _ 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl d glucuronid ein farbloses Substrat der in h heren Pflanzen nicht vorkommenden Glucuronidase GUS Im Praktikum wurde das GUS Reportergen gekoppelt mit dem auf Auxin ansprechenden Mas Promotor Velten et al 1984 in das Genom der Karottenzellen eingebaut Durch Zugabe von X Gluc zu
28. DNA wird erhitzt 95 C und dadurch in ihre Einzelstr nge zerlegt Diese beiden DNA Str nge l t man mit zwei im berschu vorhandenen chemisch synthetisierten DNA Oligonukleotiden hybridisieren die jeweils 15 30 Nucleotide lang sind und in ihrer Sequenz zu den ausgew hlten Abschnitten der DNA passen Die beiden Oligonucleotide dienen als spezifische Primer f r die Synthese der DNA am Anfang bzw am Ende der gew nschten DNA Sequenz die von der DNA Polymerase Taq Polymerase katalysiert wird Dieses Enzym kopiert die DNA die sich zwischen den Oligonucleotiden befindet Nach mehreren Reaktionszyklen liegen viele Kopien des gesuchten DNA Abschnittes vor Das Prinzip der PCR ist auf der n chsten Seite dargestellt Das Bakterium Thermus aquaticus Taq lebt in hei en Quellen und viele seiner Enzyme so auch Taq Polymerase sind hitzestabil das hei t sie werden bei hohen Temperaturen nicht denaturiert Die Hitzestabilit t der Taq Polymerase ist eine wesentliche Voraussetzung f r die PCR Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 211 DNA Matrize BAER ER U EEK DE Fa a a OC I DE i FD a RE Zr Sa 5 a Denaturierung der DNA Matrize a 77 TrTTTtTrrtrtrrtrtrttttttttttttttttttttttrttttttttetten BP eh a VE LEG TER RE KEN LER BER URN RE BEN LAN RN EN EV UA EN KEN A DIN N REN RN N EG KEN EN ER RE EN REN EN EN REN BEE UND ts 5 Anlagerung der Primer und der DNA Polymerase u a a Era nu gt 2a 3 D Extension gt Oa aT
29. Die Lichtmenge die von den Bestandteilen des Scintillator Cocktails nach Kollision mit 8 Teilchen abgegeben wird ist sehr klein und erfordert eine h chst empfindliche Me anordnung Das Hauptelement dieser Me anordnung besteht aus dem bereits er w hnten Sekund r Elektronen Vervielfacher SEV Meist wird das Probengef mit dem Scintillator Cocktail zwischen zwei SEV in einer lichtdichten mit schwerem Bleimantel gegen Umwelt Radioaktivit t abgeschirmten Kammer im Ger t angeord net Wie Abb 15 4 zeigt gelangen die vom Scintillator Cocktail abgegebenen Lichtblitze auf eine bei 400 bis 500 nm maximal empfindliche Photokathode s Abb 15 3 aus der dadurch Elektronen herausgeschlagen werden Jedes dieser freigesetzten Elektronen wird durch positiv geladene Pralldynoden so stark beschleunigt da an diesen Dynoden von Stufe zu Stufe Sekund r Elektronen herausgeschleudert werden die ihrerseits wieder Sekund r Elektronen freisetzen u s w Auf diese Weise wird ein aus der Photokathode emittiertes Elektron um den Faktor 100 bis 108 vervielfacht Der sich damit ergebende Elektronenstrom flie t von der Anode des SEV ber einen Arbeitswiderstand ab an dem sich ein Spannungsimpuls aufbaut der ber einen Kondensator von der Hochspannung abgetrennt elektronisch weiterverarbeitet und zur Messung der in der Probe vorhandenen Radioaktivit t verwendet wird Dabei ist nochmals zu betonen da die im Scintillator Cocktail durch die einfallende 6
30. Die Zucker Fraktion wird von den Betreuern der Arbeitsgruppen im Trocken schrank bei 50 C zur Trockne eingeengt bei h herer Temperatur w rden Zuk ker karamelisieren h Nachdem nun die Zucker Fraktion erfa t ist k nnen die amphoteren Aminos uren durch Zugabe von 2N NH4OH als Anionen vom Kationen Austauscher abgel st und eluiert werden i Hierzu wird ein mit dem Namen und AS gekennzeichnetes 400ml Becherglas unter die S ule gestellt und die Aminos ure Fraktion mit ca 60ml 2N NH4OH eluiert Da dieser Vorgang oft l ngere Zeit in Anspruch nimmt kann auch ein 100ml K lbchen mit 60 70ml 2N NH4OH vorsichtig in den S ulentrichter der Austauschers ule der mit gen gend 2N NH4OH gef llt sein mu gest lpt wer den Dadurch ist die AS Elution ber Nacht ohne Anwesenheit der Praktikan ten m glich j Ist die AS Elution beendet wird die AS Fraktion in einem weiteren Trocken schrank bei 55 C zur Trockne eingeengt k Das Regenerieren der Kationen Austauscher durch Neutralwaschen und Behand lung mit IN HCI wird vom Betreuer im Institut durchgef hrt D Auswertung Bei diesem Versuch erfolgt zun chst keine weitere Auswertung W hrend die Aminos ure Fraktion im Versuch 5 2 AT mittels zweidimensionaler Pa pierchromatografie in ihre Einzelkomponenten aufgetrennt und danach die ein zelnen Aminos uren in Versuch 8 4 AT quantitativ bestimmt werden erfolgt die quantitative Bestimmung von Saccharose und D Glucose in
31. Elektropherogramms kann die Einordnung des Mole kulargewichts der Proteine im Pr parat der Sauren Phosphatase anhand der Refe renz Proteine relativ leicht erfolgen s Ergebnis Tabelle s S 117 Versuch 11 Elektrophorese SDS 117 Ergebnis der Berechnung von Rf Werten s S 111 f r die Protein Banden der Sauren Phosphatase im Vergleich mit den Banden der Referenz Proteine a Saure Tho pharase b Referenz Proteine a f b a Rf Bitte Protein Banden markieren die im Hinblick auf ihren Rg Wert in a und b bereinstimmen und demnach hinsichtlich ihres Moleku largewichts vermutlich identisch oder hnlich sein k nnten Versuch 11 Elektrophorese SDS 118 Versuch 12 ELISA 119 5 Arbeitstag ELISA Test zur quantitativen Bestimmung der Ribulose Bisphosphat Carboxy lase Oxigenase Rubisco Konzentration in Bl ttern Methode U GROSS Versuchsziel Einf hrung in immunologische Arbeitsverfahren A Prinzip allgemein Die ELISA Technik erm glicht bei einem vorhandenen Mikrotiterplatten Reader eine quantitative Erfassung geringster Mengen an Antik rpern bzw Antigenen Dabei wird ein Antigen oder Antik rper Molek l an ein Enzymsystem gekoppelt welches eine Farbreaktion eingehen und so zur quantitativen Bestimmung des Antigens oder des Antik rpers f hren kann Erforderliche Antik rper AK werden ber das Immunsystem von Tieren gebildet In der Herstellung unterscheidet man mono und polyclonale Antik rpe
32. Min gef rbt Im Praktikum wird 5 ul Ethidiumbromid L sung zu dem Gel vor dem Giessen gegeben Das Ethidiumbromid lagert sich zwischen die Basen der Nukleins uren und leuchtet bei Bestrahlung mit UV Licht 254 nm Mit Hilfe eines Transilluminators und einer Sofortbildkammera Polaroid kann die Verteilung der DNA auf dem Gel photographisch festgehalten werden L sung I 50 mM Glucose 25 mM Tris pH 8 0 10 mM EDTA mit bidest Wasser auffiillen autoklavieren Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 183 L sung II 0 2 N NaOH 1 w v SDS mit bidest Wasser auffiillen L sung III 5 M K Acetat 60 Eisessig 11 5 mit bidest Wasser auff llen RNase A Stamml sung 10 mg ml in 10 mM Tris HCl pH 7 5 und 15 mM NaCl l sen Proteinase K Stamml sung 20 mg ml TE Puffer 10 mM Tris pH 8 0 1 mM EDTA TBE Puffer 10x 100 mM Tris Base 100 mM Bors ure 2 5 mM EDTA Ethidiumbromid giftig 10 mg ml Stamml sung Na Acetat L sung 3 M Na Acetat pH 6 0 mit Essigs ure einstellen Versuch 20 Konjugation 189 3 Arbeitstag bersicht zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Sel
33. Produkte 2 5 des ersten 5 3 Zyklus ass LI a a a a Denaturierung Anlagerung der Primer und der DNA Polymerase F 5 gt gt en 5 gt FR 5 3 gt 37 a baiak ao pe 5 Extension S oe CC A Oa Pr a oe meh a 5 N an aan au Dana an RE a 0 SS a 5 Produkte des zweiten 2 CAA T Page Zyklus 2 aa T E ISEA act 3 Denaturierung Anlagerung der Primer und der DNA Polymerase Extension gt ee eee ern 3 Ponik ea a a G0 a Oe a 0 des dritten ae 5 en CA er Rene 3 3 ee oo 0 a nee Vermehrung der Ziel CETE E EEE RE ER DIE RE ER 3 en r Sequenzen 3 Das Prinzip der PCR Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 212 Die Temperatur des Reaktionsansatzes wechselt in jedem Zyklus zwischen drei Werten 1 der Denaturierungstemperatur ca 94 C bei der durch L sen der Basenpaarungen die DNA Einzelstr nge entstehen die dann in der n chsten Syntheserunde als Matrize dienen 2 Hybridisierungstemperatur hier 54 C sonst abh ngig von der Zusamensetzung der Nucleotide bei der sich die Primer an die Matrize heften 3 die Temperatur bei der die de novo DNA Synthese stattfindet ca 712 C sie liegt knapp unterhalb des Temperaturoptimums der Taq Polymerase 22 3 2 PCR Reaktionsansatz Die PCR wird in einem Endvolumen von 50 ul durchgef hrt Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes ist wie folgt 10 ul DNA 3 10 ng Sul 10 x ul PCR Puffer lul 10 mM dATP dCTP dGTP und dTTP lul 10 uM
34. Sch tteln besch digt werden 10 11 12 13 14 Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 215 Wasserbad auf 65 C stellen L sungen unter 4 und 8 im Wasserbad erhizten fl ssigen N besorgen Abnutschapparatur aufbauen Einen Teil der Zellsuspension mit einer sterilen Gewebekulturpipette an der Sterilbank entnehmen anschlie end abnutschen Proben von 1 g FG einwiegen und unter Zugabe von fl ssigen N Vorsicht m rsern Den Vorgang 2 3 mal wiederholen Auf die Probe 1 ul mg 65 C hei en 2x CTAB Extraktionspuffer geben anschlie end in ein autoklaviertes Eppendorfreaktionsgef berf hren und 3 Min ins Wasserbad stellen 1Volumenteil VT Chloroform Isoamylalkohol 24 1 hinzu pipettieren vorsichtig und gut mischen zwischen zwei Fingern schaukeln 5 10 Min bei 13000 Upm zentrifugieren Raumtemperatur Die obere Phase in ein autoklaviertes Eppendorfreaktionsgef berf hren 1 10 Volumenteil VT 65 C hei e 10 CTAB L sung hinzupipettieren 1 VT Chloroform Isoamylalkohol 24 1 zugeben und gut mischen 5 10 Min bei 13000 Upm zentrifugieren Autoklaviertes Eppendorfreaktionsgef mit 1 VT CTAB Pr zipitationspuffer vorlegen berstand der zentrifugierten Proben sehr sauber abnehmen und zum CTAB Pr zipitationspuffer pipettieren 20 Min stehen lassen anschlie end 10 15 Min bei 13000 Upm zentrifugieren berstand verwerfen Pellet in 400 ul TE Highsalt Puffer aufnehmen und gut
35. Stunden bei 37 C inkubieren Nach der Inkubation wird die Probe auf 1 iges Agarosegel aufgetragen Die Gr e der Schnitte Banden sollen ca 240 4000 und 6200 Basenpaaren sein s Plasmidkarte Abb 18 1 20 2 Konjugation Die bertragung von genetischem Material DNA durch direkten Kontakt von Zelle zu Zelle nennt man Konjugation Die Gen bertragung durch Konjugation wurde an Escherichia coli entdeckt Genaustausch durch Konjugation und Mobilisierung von Genen durch Plasmide sind im Reich der Prokaryonten sehr weit verbreitet Die konjugative bertragung des Bin rvektors von Escherichia coli in Agrobacterium tumefaciens erfolgt durch die Methode der triparentalen Paarung nach VAN HAUTE et al 1983 Im Praktikum ist der E coli Stamm S 17 1 Spender Donor und A tumefaciens Empf nger Recipient Dieser Stamm besitzt neben dem chromosomalen Streptomycinresistenzgen die Mob und Tra Funktion SIMON 1984 die bei Konjugation eine bertragung des Plasmids in andere Bakterien durchf hrt Versuch 20 Konjugation 192 Der Agrobacterium Stamm GV3101 pMP90ORK ist Standardwirt des pPCV Plasmids plant cloning vector Dieser Stamm hat ein chromosomales Markergen das f r Rifampicinresistenz codiert VAN LAREBEKE et al 1977 und KONCZ et al 1990 und einen Tr ger pMP9ORK ein Helferplasmid das neben einem Kanamycin Resistenzgen die Virulenzfunktion f r den Transfer der T DNS von Agrobacterium in Pflanzenzellen hat mehr dazu
36. Volumen umzurechnen Hierbei ist jedoch zu beachten da die zu messende Probe die Beschaffenheit Dichte spezifisches Gewicht etc von Standardproben aufweisen sollte um die Proben Aktivit t in Bq g oder Bq ml angeben zu k nnen D Auswertung a Studenten die eigene Proben mitgebracht hatten bekommen die ausgedruckten Ergebnisse der Messungen ausgeh ndigt b Die brigen Studenten f gen ihrem Protokollheft eine Kopie der Ergebnisse der 40K Messung in 400g KCI Salz bei c Aus der Z hlrate der KCl Probe IpM ermittle man nach den in folgender Anmerkung aufgef hrten Angaben die Ausbeute der 40K Messung mitttels y Spektrometrie Hierzu einige Anmerkungen Jedes Kalium Salz enth lt pro Gramm Kalium 0 118 mg 49K Dies f hrt zur Emission von 3 5 y Quanten Sek pro Gramm Kalium Die Energie der Gammastrahlung von 40K betr gt 1 460 MeV 400g KCI enthalten Atomgewicht K 39 100 Molekulargewicht KCl 74 557 Versuch 17 y Spektroskopie 169 1 Gramm Kalium emittiert 3 5 y Quanten pro Sekunde insgesamt sollten demnach von 400g KCl y Quanten pro Sekunde emittiert werden Die Impulssumme des Photopeaks von 400g KCI betr gt nach Impulse E Literatur Petzold W u H Krieger 1988 Strahlenphysik Dosimetrie und Strahlenschutz Bd 1 B G Teubner Stuttgart Versuch 17 y Spektroskopie 170 Versuchs und Zeitplan 171 III Versuche zu gentechnischen Verfahren Seite Versuchs und Zeit
37. asymptotisch verlaufen wenn 1 entweder ein Gro teil des Substrates bereits verbraucht ist 2 oder die Konzentration an entstehendem Produkt so gro ist da entweder die Bildung oder der Zerfall des Enzym Substrat Komplexes verhindert wird Versuch 7 Enzymkinetik 63 Wie Abb 7 D 1C zeigt k nnen Zeit Umsatz Kurven prinzipiell folgenden Verlauf nehmen Umsatz Reaktionsprodukte Zeit Versuchsdauar gt Abb 7 D 1C Aus H AEBI Einf hrung in die praktische Biochemie Akad Verlagageg FFM 1965 5 302 Erl uterungen zu Abb 7 D 1C Fall A linearer Verlauf Fall B Fortschreitende Reaktionsverz gerung Reaktion 1 Ordnung Fall C St rung der Testreaktion durch entgegengesetzt verlaufende Umset zung Versuch 7 Enzymkinetik 64 Fall D Vorzeitiges Erreichen der Bedingungen wie in Abb 7 D1 B Bereich Fall E Autokatalytischer Kurvenverlauf Versuch 7 Enzymkinetik 65 C 2 2 Versuch Enzymatische Spaltung von p Nitrophenylphosphat durch Saure Phosphatase in Abh ngigkeit von der Enzym Konzentra tion bei Substrat UberschuB a Versuchsansatz Reagens Zusatz ml zu den Proben Reagentien 1 2 3 4 5 Citrat Puffer c 0 80 0 80 0 80 0 80 0 80 A dest 2 95 2 95 2 90 2 85 2 80 p NPP d 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 Im Wasserbad bei 30 C 5 min vortemperieren Saure Phosphatase g Ve 0 05 0 05 0 10 0 15 0 20 mischen weiter inkubieren bei 30 C 1N NaOH a 2 0 2 0
38. den transgenen Zellen wird die GUS Aktivit t folgenderma en nachgewiesen An der Sterilbank wird 1 ml der transgenen Zellsuspension in ein Eppendorfreaktionsgef berf hrt anschlie end bei 4000 5000 Upm f r 5 Min zentrifugiert der berstand wird verworfen Das Zellsediment wird in 0 5 ml X Gluc L sung resuspendiert und bei 37 C f r 12 Stunden inkubiert Bonitur Die in transgenen Zellen exprimierte GUS spaltet das Substrat X Gluc in Glucuron und ein Indolyl Derivat das zum blauen Dibrom dichlor Derivat oxidiert Die blaue Farbe ist makroskopisch erkennbar X Gluc L sung 10 ml N N Dimethylformamid 10 15 Tropfen X Gluc 10 mg 0 1 M Phosphat Puffer 9 8 ml KH gt POy K HPO pH 7 0 5 mM Kalium Ferricyanid 100 ul Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 207 5 mM Kalium Ferrocyanid 100 ul Triton X 100 10 ul Sterilfiltrieren bei 18 C aufbewahren Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 208 Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 209 7 Arbeitstag Flie schema zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum
39. der Zucker Fraktion in Versuch 9 4 AT Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 17 1 Arbeitstag Charakterisierung eines Q Amylase Pr parates im Hinblick auf seine spezifische Enzymaktivit t a Bestimmung des Proteingehaltes b Bestimmung der Enzymaktivit t Versuchsziel Einf hrung in die Methodik von Proteinbestimmung und enzymatischer Analyse A Prinzip Will man die Aktivit t eines Enzyms charakterisieren so gen gt oft nicht nur die eigentliche Aktivit tsbestimmung sondern man m chte auch wissen wieviel Enzymprotein die enzymatische Umsetzung bewerkstelligt Bezieht man die Enzym aktivit t auf die Menge an Enzymprotein so erh lt man die sogenannte spezifische Enzymaktivit t welche die Leistungsf higkeit eines Enzympr parates besser als die alleinige Bestimmung der Enzymaktivit t charakterisieren kann Die Aussage der spezifischen Enzymaktivit t ist etwa zu vergleichen mit der Produktion einer Autofirma die pro Woche z B 50 PKWs herstellt Will man die Leistungsf higkeit dieser Firma im Vergleich mit einer anderen Firma mit gleicher Wochenleistung n her untersuchen interessiert z B die Anzahl Arbeitskr fte oder die Menge an Produktionskapital etc die am Produktionsprozess beteiligt sind Haben bei der ersten Firma z B 100 Arbeitskr fte bei der zweiten aber nur 50 an der Produktion mitgewirkt so ist die zweite Firma bei gleicher Wochen Produktion sehr viel effizienter einzu
40. die Chromatogramme in einen thanol ges ttigten Tank wasserfrei unter CO gt Atmosph re ohne O bei 60 C 45 Minuten lang eingeh ngt werden Ninhydrin reagiert mit einzelnen Aminos uren unter Bildung AS spezifischer Farbt nung die aus dem Chromatografie Papier zu eluieren und gegen einen Blindwert zu messen ist Anhand von Chromatogrammen mit definierten Aminos ure Konzentrationen wurden Eichfaktoren f r die einzelnen Aminos uren ber lineare Regressionsanalysen ermittelt so da deren quantitative Auswertung m glich ist s D Auswertung Allerdings sind noch einige Angaben ber das Verfahren der Auswertung erforderlich Ninhydrin reagiert nicht nur mit Aminos uren sondern auch mit Luftverunreinigungen die ber die Laboratmosph re mit dem Chromatografie Papier in Ber hrung gekommen sind z B Zigarettenrauch Daher mu ein Verfahren zur Kompensation der in jedem Labor unterschiedlich hohen Untergrundf rbung des Chromatografie Papiers gefunden werden Hierzu wird an einer bestimmten Stelle der Chromatogramme ein Papier Blindwert zusammen mit den einzelnen Aminos ure Flecken Spots ausgeschnitten seine Ninhydrin F rbung ber die Elution und Extinktionsmessung miterfa t und seine Untergrund Farbintensit t auf seine Fl che bezogen Da die Dicke von Chromatografie Papier sehr konstant ist entspricht die Fl che dem Gewicht des ausgeschnittenen Papier Blindwerts In Anbetracht unterschiedlicher Fleckgr en
41. diese nicht mehr zu erkennen nach erfolgter Chromatografie kann nun die Silikagelschicht der Platte zerkratzt werden f Mit einer geeigneten Spr hvorrichtung wird nun das Dragendorff sche Reagens gleichm ig ber die Platte gespr ht Vorsicht HCI g Nach Trocknung der Platte erscheinen die Flecken der beiden Substanzen ange f rbt auf dem Chromatogramm Mit einem Bleistift die beiden Flecken umfahren und die Stellen h chster Farbintensit t markieren R Wert Ermittlung s S 37 Versuch 4 D nnschichtchromatografie 40 D Auswertung Zur quantitativen Auswertung von D nnschichtchromatogrammen Papierchromato grammen Elektropherogrammen etc werden heute Computer gesteuerte Bildaus wertungsverfahren eingesetzt Im Rahmen dieses Praktikums soll jedoch nur gezeigt werden wie die Substanz spezifische Wanderungsgeschwindigkeit anhand des Re Wertes zu charakterisieren ist Gem seiner Definition s o ist der Re Wert die auf die Wanderungsstrecke des Laufmittels vom Auftragspunkt bezogene Wanderungsstrecke einer Substanz wobei der R Wert je nach Gleichm igkeit der Schichtdicke des Silikagels eine gewisse Varianz aufweisen kann Strecke Strecke A B Ry Wert Auftragspunkt Substanz Auftragspunkt Auftragspunkt A B Substanzmitte Laufmittelfront Cholinchlorid Cholinchlorid Versuch 5 Papierchromatografie 41 2 Arbeitstag Zweidimensionale Papierchromatografie von Amino uren Auftragen eines Aliquot
42. dung von sogenanntem Gradienten PAG an d h im unteren Teil dieser Gele ist die Einf hrung in die Elektrophorese 98 Acrylamid Konzentration hoch w hrend sie nach oben zur Probenauftragsseite hin kontinuierlich abnimmt Dadurch ergeben sich von unten nach oben Poren mit zunehmender Gr e Der Vorteil dieser Gradientengele ist da gro e Molek le oben gut in das Gel eindringen und wandern k nnen w hrend kleine Molek le im unteren Gelbereich durch zunehmend engere Poren daran gehindert werden aus dem Gel herauszuwandern bevor noch die Gro molek le ausreichend gut getrennt sind Die PAGE kann entweder in Rundgelen die in kleinen Glasr hrchen hergestellt wur den oder in Flachgelen zwischen rechteckigen Glaskasetten durchgef hrt werden Der Vorteil von Flachgelen ist die Trennung von Parallelproben im gleichzeitigen Vergleich mit Referenz Proben innerhalb eines Elektropherogramms Bei der Durchf hrung der PAGE zur Trennung von Proteingemischen spielt auch das zu verwendende Puffersystem eine entscheidende Rolle Zum einen gew hrleistet es w hrend der Elektrophorese einen konstanten pH Wert im Gel und im Elektroden puffer zum anderen stellt es Elektrolyten zur Stromleitung zwischen den Elektroden zum Gel und innerhalb des Gels zur Verf gung Das Trennergebnis wird ebenfalls vom verwendeten Puffer beeinflu t Proteine mit einem isoelektrischen Punkt IEP ber dem Puffer pH liegen als Kationen vor Proteine mit einem IEP unte
43. einem drei dimensionalen Netzwerk von Polysaccharid ketten elektrochemisch neutralen Verhaltens d h sie verh lt sich indifferent gegen ber Kationen und Anionen Typ G im Unterschied zu DEAE Sephadex Anionen Austauschern und CM und SE Sephadex Kationen Austauschern Sephadex Typ G wird in verschiedenen Vernetzungsgraden hergestellt die eine un terschiedlich gro e Porosit t des Netzwerkes bedingen Ein hoher Vernetzungsgrad ergibt eine kompakte Struktur mit geringer Porosit t w hrend ein niedriger Vernet zungsgrad eine hochpor se Struktur zur Folge hat Entsprechend dem Vernetzungs grad erh lt man verschiedene Untergruppen des Typs G G 10 G 25 G 50 G 75 G 100 und G 200 wobei der Vernetzungsgrad in dieser Reihung von G 10 bis G 200 ab und die Porosit t zunimmt Da der Vernetzungsgrad von Sephadex wiederum die Gr e der in das Netzwerk dif fundierbaren Molek le bestimmt w hrend die ber eine bestimmte Gr e hinausge henden Molek le ungehindert die S ule verlassen k nnen h ngt die Wahl des zu verwendenden Sephadex Typs von der Gr e der zu trennenden Molek le ab Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 46 Angaben zu einigen Sephadex G Typen Korngr e Wasser Trennbereich Sephadex Typ um Aufnahme MG ml g 1000 5000 10000 30000 40000 150000 800000 Gelbett u eres inneres Sephadex Typ Volumen Volumen Volumen ml g ml g Wirkungsweise von Sephadex Zur Herstellung einer Se
44. einem mit dem Namen und Zucker markierten 400ml Becherglas e mit einer Tropfgeschwindigkeit von etwa 20 Tropfen Min sammeln c Wenn die Probe gerade in die Oberfl che des Kationen Austauschers eingedrun gen ist A dest vom Nachwaschen des Probenglases auf die S ule aufbringen ohne da in die Austauscher S ule Luft eindringen kann d Wenn der S ulentrichter wieder leergelaufen ist das Nachsp len des Probengef Bes und das Aufbringen auf die S ule noch zweimal wiederholen e Ist das Nachsp len des Probengef es abgeschlossen und das Nachsp lwasser gerade wieder in die Oberfl che des Austauschers eingesickert wird mit klei nen Portionen A dest der S ulentrichter mehrmals nachgesp lt wobei man zwischen den Nachsp lvorg ngen wiederum die Fl ssigkeit in die S ule hat einsickern lassen Versuch 1 Ionenaustauschchromatografie 16 Wird das Nachsp len ohne vorheriges Einsickern des vorherigen Sp lwassers in die S ule durchgef hrt erzielt man eine permanente Verschleppung von Pro benbestandteilen infolge kontinuierlicher Verd nnung und letztendlich eine un zureichende Trennung der beiden Stoffgruppen Aminos uren und Zucker f Nun wird der Kationen Austauscher mit ca 50ml A dest neutral gewaschen da durch Umtausch von Ht gegen Aminos uren Ht Ionen im Efluat austreten Ist die S ule neutral mit Indikator Papier testen ist anzunehmen da auch die Zuckermolek le die S ule verlassen haben g
45. eines Gemisches aus Cholinchlorid und Chlorcholinchlorid CCC mittels D nnschichtchromatografie Versuchsziel Demonstration der Leistungsf higkeit der DC bei der Trennung eng verwandter Molek le bei eindimensionaler Arbeitsweise und gleichzeitig Vorberei tung f r die zweidimensionale Papierchromatografie s Versuch 5 Versuchs und Zeitplan 10 Versuch 5 Zweidimensionale Papierchromatografie von Aminos uren Auftragen eines Aliquots der Aminos ure Fraktion von Versuch 1 auf Chromato grafie Papier Versuchsziel Vorstellung zweidimensionaler Chromatografieverfahren und einfache M glichkeiten zu deren quantitativer Auswertung Versuch 6 Sephadex Gelfiltration zur Trennung nach Molek lgr e am Beispiel einer aus RNA und AMP bestehenden Probe einschlie lich Erstellung von RNA und AMP Eichkurven Versuchsziel Einf hrung in die S ulen Chromatografie mit Schwerpunkt Molekular sieb Gelfiltration 3 Arbeitstag s S 57 Versuch 7 Enzymkinetische Methoden Zum Einflu von pH Reaktionsdauer und Substrat Konzentration auf die Enzymak tivitit am Beispiel der sauren Phosphatase aus Kartoffeln mit p Nitrophenylphosphat als Substrat Versuchsziel Charakterisierung eines Enzyms in Hinblick auf a Enzymaktivit t und Reaktionsdauer b Enzymaktivit t und pH Wert des Mediums c Enzymaktivit t in Abh ngigkeit von der Substrat Konzentration und Bestimmung von Vmax und Km 4 Arbeitstag s S 77
46. germateri al z B Celite Kieselgur als station rer Phase getrennt wobei Gase z B N2 He Einleitung 5 lium oder Argon als mobile Phase dienen In Abh ngigkeit vom S ulenf llmaterial als station rer Phase wird die GC S ule bis auf 350 C beheizt Bei Verwendung von Celite als Tr germaterial f r PEG kann jedoch z B nur bis 140 C beheizt werden Die verwendete Arbeitstemperatur richtet sich nach der Beschaffenheit der zu trennenden Stoffe und der zu verwendenden station ren Phase Die aus der GC S ule austretenden Gase werden aufgrund ihrer verschiedenen physikalischen Eigenschaf ten z B spezifische W rmeleitf higkeit oder elektrische Leitf higkeit in entspre chenden Detektoren gemessen und registriert Die Substanzen als station re Phase sollen einen hohen Siedepunkt gt 400 C und einen niedrigen Dampfdruck aufweisen Die Gaschromatografie wird verwendet z B zur Trennung und Analyse pflanzlicher Aromastoffe oder nach deren Veresterung von h hermolekularen Fetts uren niedermolekularen Kohlenhydraten Aminos uren usw 2 Enzymuntersuchungen Enzymuntersuchungen werden in der Biochemie in gro em Umfang durchgef hrt Zum einen sind Enzyme in sogenannten Enzym Tests tzen gewisserma en Reagen zien mit deren Hilfe eine gro e Zahl wichtiger Metaboliten relativ einfach quantita tiv zu bestimmen sind s Versuch 9 Zum anderen besteht die Notwendigkeit En zyme die an wichtigen Stoffwechselwegen beteiligt s
47. gig entleeren die Starttaste S auf der Computertastatur dr cken und die Spritze langsam aus dem Einspritzblock ziehen c Das Signal am Bildschirm solange verfolgen bis der n Propanol Peak aus der S ule ausgetreten ist und das Chromatogramm Aufnahme Programm durch lt ESC gt verlassen Auf dem Bildschirm erscheint nun das gesamte Chromatogramm Durch Dr cken der Optionstaste lt O gt oder RETURN gelangt man in ein Untermen und w hlt Hardcopy zum Ausdruck des Chromatogramms D Auswertung Die Erfassung der Retentionszeiten der 3 Alkohole und des Luftpeaks erfolgt aus dem Chromatogramm am Bildschirm indem mit dem Grafik Cursor die Peakspitzen der Substanzen aufgesucht werden Bei jeder Position des Cursors wird n mlich am unteren Bildschirmrand die aktuelle Signalamplitude und Retentionszeit angegeben so da man leicht die jeweiligen Peakmaxima mit der zugeh rigen Retentionszeit auffinden kann Versuch 3 Gaschromatografie allgemein 35 Die Retentionszeiten der 3 Alkohole reduziert man um die Retentionszeit des Luft peaks s folgende Auswertungstabelle und tr gt die bereinigten Retentionszeiten t auf der logarithmisch geteilten Y Achse gegen die Anzahl C Atome in den Alkohol Molek len auf halblogarithmisches Papier auf s anliegendes Beispiel Luft ta Sec ccccecceeees tar Sec Methanol thanol n Propanol n Butanol extrapolieren E Literatur KAISER R 1973 Chromatografie
48. hier aus da unter den gew hlten Bedingungen die Saure Phosphatase denaturiert ist und keine Enzymfunktion mehr aufweist B Material 1 Elektrophorese Apparatur und Netzteil 2 SDS vorbehandelte Proben der Sauren Phosphatase SP 3 SDS vorbehandelte Referenz Proteine definierten Molekulargewichts MP 4 Tris Tricin SDS Puffer Konzentrat pH 7 5 vor Gebrauch 20 fach verd nnen SOml 5 Eppendorf Varipipette 1 10ul wei e Spitzen 6 Polyacrylamid Fertiggel SDS 620 6 20 Acrylamid Gradient 7 F rbel sung Gradipure 8 10 ige Trichloressigs ure 9 7 ige Essigs ure Versuch 11 Elektrophorese SDS 114 C Durchf hrung C1 SDS Vorbehandlung der Phosphatase Probe und der Referenz Proteine Zun chst aus 300 mg SDS 1g Saccharose 0 25mg Bromphenolblau 50mg Dithio threitol DTT und 20 fach verdiinntem TTS Puffer 4 ad 10 ml den Proben Puffer herstellen Die Protein Proben und die Referenz Protein Probe getrennt in Proben Puffer l sen 100ul mg Protein und bei 100 C 5 Minuten kochen Die Lysate gegebenenfalls in der Zentrifuge kl ren wird vom Betreuer vorbereitet Beim Aufkochen der Proben im Proben Puffer kann ein Teil des als Reduktionsmittel zugesetzten DTT verbraucht werden so da eine weitere Zugabe von DTT nach Ko chen und Abk hlen der Probe erforderlich sein kann Auf diese Weise vorbehandelte Proteinproben k nnen auch tiefgefroren gelagert wer den Nach dem Auftauen ist j
49. hrend tote Zellen diese Fluoreszenz nicht zeigen Befindet sich jedoch Chlorophyll in den Zellen ist eine Rotfluoreszenz zu beobachten Die Durchf hrung dieser Methode erfolgt nach Widholm 1972 20 ul einer acetonischen Stamml sung von FDA 5 mg ml wird 1 ml Zellsuspesion zugesetzt so da eine Endkonzentration von 0 01 FDA erreicht wird Nach einer Inkubation von 3 Min bei Raumtemperatur kann man die gef rbten Zellen unter dem Auflichtilluminator beobachten Filtereinstellung am Auflichtilluminator Fa Leitz Wetzlar 3 3 2x Interferenz Blaufilter KB 490 Dichromatischer Teilerspiegel TK 400 eigebauter Sperrfilter K 515 Sperrfilter im Filterschieber K 490 21 4 Co Kultur von Agrobakterium tumefaciens und Pflanzenzellen 5 Tage vor Versuchsbeginn wird 2 5 ml PCV packed cell volume Pflanzenzellsuspension s 18 1 in 250 ml Erlenmeyerkolben mit B Medium subkultiviert wird vom Betreuer durchgef hrt Nach 5 Tagen Subkultur befinden sich die Zellen in einer hohen Wachstumsphase 2 Tage vor Versuchsbeginn wird A tum in 5 ml YEB Cbjoo s 19 4 angeimpft und bei 28 C unter Sch tteln kultiviert wird vom Betreuer durchgef hrt Nach 2 Tagen Kultur befinden sich die A tum Zellen in der mittleren Logphase Es werden 2 x 1 5 ml Bakterienzellen in autoklavierte Eppendorfreaktionsgef e berf hrt anschlie end wird bei 4000 5000 Upm f r 10 Min abzentrifugiert und die berst nde werden verworfen Die Bakteriensedime
50. in der Gasphase 5 B nde B I Hochschultaschenb cher Mannheim Retentionszeit Ct n Sek Versuch 3 Gaschromatografie allgemein Beispiel zur Auswertung der Retentionszeiten von 5 Alkoholen 10000 8000 6000 4000 2000 1000 800 600 400 1 2 3 4 5 Anzahl C Atome im Molek l 36 Versuch 4 D nnschichtchromatografie 37 2 Arbeitstag Qualitative Untersuchung eines Gemisches aus Cholinchlorid CC und Chlorcholinchlorid CCC mittels D nnschichtchromatografie Versuchsziel Demonstration der Leistungsf higkeit der DC bei der Trennung eng verwandter Molek le bei eindimensionaler Arbeitsweise und gleichzeitig Vorbereitung auf die zweidimensionale Papierchromatografie Versuch 5 A Prinzip s auch Einleitung zu chromatografischen Verfahren Dazu noch ein Hinweis Bei eindimensionaler Arbeitsweise unterteilt man das D nn schichtchromatogramm in einzelne Bahnen Au er den zu untersuchenden Proben k nnen auf diese Weise auch Referenzsubstanzen zur Identifizierung unbekannter Probenkomponenten mitlaufen Dabei werden die getrennten Substanzen nach dem sogenannten Rf Wert charakterisiert und unterschieden Dieser Wert ist ein Ma f r die Substanz spezifische Wanderungsgeschwindigkeit im Chromatografieverlauf und sichtbarer Ausdruck des Verteilungskoeffizienten Der R Wert wird errechnet indem man die Laufstrecke einer Substanz A Auftragspunkt bis Substanzschwer punkt in Relation zur Wanderungsstrec
51. k nnen die Bakterien auf einem entsprechenden N hrboden LB Medium Ampi oo ausplattiert werden Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 179 mas promoter p1 p2 430 bp EcoRi Hindlill Xbal Bglll Psti SAll Xbal BamHI Smal vo Pvul 9 47 a aT Pstl 9 27 i EcoRV 0 81 Pvul 7 70 p PCV812 Sstl 2 05 10 00 Kb PROS I seu 2 77 ne Pstl 3 24 X Kpni 6 80 Pvul 3 25 Sstll 3 67 Sstll 5 90 N Sphl 4 35 EcoRV 4 80 Abbildung 18 1 Plasmidkarte von pPCV812 Das Plasmid wurde uns freundlicherweise von Dr Koncz MPI K ln zur Verf gung gestellt mas Mannopinsynthase gus Glucuronidase hyg gt Hygromycin Ap Cb gt Ampicillin Carbenicillin Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 180 19 4 Ausplattieren transformierter Bakterien E coli Stamm HB101 und Selektion transformierter Klone a Ausplattieren transformierter Bakterien Hierbei geht man von der Bakterienmischung aus die nach der Transformation im LB Medium vorliegt Ein Aliquot 30 50 100 ul der Suspension wird auf einer N hragarplatte LB Medium 100 mg l Ampicillin ausplattiert Ist die L sung getrocknet werden die Agarplatten f r 12 16 Stunden in einem Brutraum bei 37 C inkubiert b Selektion transformierter Bakterien Bakterien die nicht transformiert wurden d h keine Plasmid DNA aufgenommen haben m ssen ausselektiert werden Deshalb bedient man sich des Bakterienstammes HB101 der gegen das Antibiotikum Ampicillin
52. rechten oberen Ecke der rechten Gelh lfte B mit dem Spatel ein kleines Gel Eck zur Markierung abstechen und dieses Gel mit einer Versuch 10 Elektrophorese nativ 110 Spritzflasche A dest vorsichtig in eine mit B markierte Petrischale B 13 bersp len zur Enzym spezifischen F rbung l A In gleicher Weise mit Gelh lfte A verfahren und das Gel in die mit A mar kierte Petrischale zur Protein spezifischen Anf rbung berf hren m B Die zur Enzym spezifischen F rbung vorgesehene Gelh lfte B sofort mit 50 ml Citrat Puffer B 10 berschichten und f r 10 Minuten auf Eis oder in K hl schrank stellen Dadurch erreicht man eine Umstimmung des pH Werts von 8 3 w hrend der Elektrophorese auf den f r die Saure Phosphatase optimalen pH von 5 6 s Versuch 7 s S 57 m A Die andere Gelh lfte A wird zur Protein spezifischen Anf rbung zun chst f r 10 Minuten mit 10 iger Trichloressigs ure B 7 behandelt Dabei erfolgt eine Ausf llung Denaturierung und Fixierung der getrennten Proteine im Elektrophe rogramm C2 Weiterer Gang der Enzym spezifischen F rbung des Gels nl Nach erfolgter Einstellung des pH Werts wird der Citrat Puffer vorsichtig vom Gel abgegossen Die Inkubation der Gelh lfte B in 50 ml Substratl sung B 11 erfolgt w hrend 5 Minuten bei Zimmertemperatur Nach kurzer Zeit ist eine rote Bande im Gel sichtbar die sich infolge Diffusion relativ schnell verbreitert n2 Nach Abgie en der Substra
53. s o und mi t nach 30 Minuten im Fotometer bei einer Wellenl nge von 578 nm gegen den Blindwert Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 21 d Die Extinktionen der drei Proben k nnen in die vorbereitete Tabelle s D Auswertung eingetragen und nach der dort besprochenen Methode ausgewertet werden C2 Enzymaktivit tsbestimmun a Ganz wichtig Haben Sie die am Arbeitsplatz vorgefundene Proben Konzen trationsstufe im Protokollheft vermerkt s o b In gro e Reagensgl ser 3 Proben 1 Blindwert 1 ml St rke L sung pipettieren c W hrend man in das Blindwert Reagenzglas 1 ml Puffer pipettiert werden die 3 Proben Reagensgl ser mit je 1 ml amp Amylase L sung versetzt d Alle 4 Gl ser sofort in ein Wasserbad bei 30 C stellen und kontrollieren ob f r das Abstoppen der Enzym Reaktion ein Wasserbad zum Kochen gebracht worden ist e Genau 10 Min die Enzym Ans tze bei 30 C inkubieren und danach sofort 2 ml Dinitrosalicyls ure zugeben die Proben 5 Minuten zur Denaturierung des Enzyms und zur Farbreaktion auf gebildete Maltose in kochendes Wasser stellen die Gl ser unter Leitungswasser abk hlen mit 25 ml A dest auff llen und gut mischen f Die Extinktionen der Proben gegen den Blindwert bei 546 nm messen in die vorbereitete Tabelle eintragen und die Enzymaktivit t der o Amylase auswerten s D Auswertung D Auswertung D1 Auswertung der Protein Bestimmung a Die Proteinkonzentration
54. sind weitere Banden vorhanden mu das Experiment wiederholt werden 22 4 Extraktion pflanzlicher DNA Die Extraktion pflanzlicher DNA erfordert folgende Schritte 1 die Zellwand mu aufgebrochen werden 2 die Zellmembran mu so aufgel st sein da die DNA aus der Zelle in den Extraktionspuffer bertritt 3 die DNA mu vor DNase gesch tzt sein 4 Denaturierung sowie Entfernung von Proteinen 5 Ein Brechen der DNA mu m glichst gering gehalten werden 22 4 1 CTAB Preparation pflanzlicher Gesamt DNA CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid Cetrimid Hexadecyltrimethy ammoniumbromid MG 364 5 g Formel Cj6H33NCH3 2Br Die Methode macht sich die Eigenschaft von RNA und DNA zunutze bei einer hohen Salzkonzentration in Gegenwart von CTAB L sung 2 X CTAB in L sung zu bleiben bei Reduzieren der Salzkonzentration unter 0 4 M jedoch mit CTAB zu pr zipitieren L sung CTAB Pr zipitationspuffer s S 211 Viele der pflanzlichen Polysaccharide sind in keiner dieser Salzkonzentrationen l slich und k nnen deshalb bei hoher Salzkonzentration von den sich in der L sung befindenden Nucleins uren getrennt werden Vor Beginn des Experiments Sterilbank einschalten inTrockeneis bzw fl ssiger Stickstoff m rsern Dazu Detergenz SDS oder CTAB gt EDTA ist ein Chelat das Mg bindet Das Mg ist ein wichtiger Cofaktor f r Nucleasen Chloroform Phenol s S 211 5 DNA in der L sung kann durch ein schnelles
55. stoppen und wenn noch ein Fertiggel vorhanden ist die vorhergehenden Schritte wiederholen wobei nun besonders darauf zu achten ist da weder Pufferbr cken in der Gelkassette noch Luftblasen in den Probentaschen den normalen Ablauf der Elektrophorese behindern Scheint alles normal zu laufen dann nach etwa 2 Minuten wenn die Brom phenolblau Zone in das Gel eingewandert ist das Netzger t abschalten den Deckel entfernen und vorsichtig mit einer Pinzette den Plastik Probenkamm aus dem Gel ziehen Dies ergibt eine gleichm igere und h here Feldst rke im Gel 1 Den Deckel wieder aufsetzen das Netzger t einschalten und bei 200 V solange die Elektrophorese fortf hren bis die Bromphenolblau Bande den unteren Gelrand erreicht hat Auch hierbei sollte die Stromst rke ab und zu berpr ft werden j Danach die Spannung am Netzger t abschalten und das Gel aus der Apparatur nehmen Dabei die Gelkante an der die Proben aufgebracht wurden nach oben halten wobei die Markierung am Klebestreifen nach rechts weisen sollte An der rechten Seite der Glaskasette den markierten Klebstreifen entfernen und die obere Glasplatte aufklappen k Mit einem Spatel das auf der unteren Glasplatte aufliegende Gel in der Mitte durchstechen Auf jeder Gelh lfte befinden sich somit 4 Proteinspuren mit unterschiedlicher Protein Konzentration Wir erhalten damit 2 identische Elektropherogramme linke H lfte A rechte H lfte B 1 B Nun zun chst an der
56. t z T auch ohne Zerst rung des Untersuchungsobjekts C Gentechnologische Methoden Die sich gegenw rtig in der Entwicklung befindenden und von vielen Arbeitsgruppen intensiv bearbeiteten und auch schon vielfach in die Praxis eingef hrten gentechno logischen Methoden sollen einer gezielten mit der Ver nderung bestimmter Merk male verbundenen Beeinflussung des Genoms dienen Obwohl solche Genomver n derungen grunds tzlich auch an Gameten an der intakten Pflanze oder an Apexzellen mit anschlie ender Bewurzelung der davon gewonnenen Stecklinge vorgenommen werden k nnen sind bis heute Zellkulturen mit anschlie ender Regeneration von Pflanzen das am h ufigsten verwendete oder wenigstens angestrebte Zellmaterial f r gentechnische Arbeiten mit h heren Pflanzen Grunds tzlich stehen heute mehrere Verfahren zur bertragung und zum Einbau von genetischem Fremdmaterial in zu Pflanzen regenerierbares Zellmaterial auf einem praxisreifen Niveau zur Verf gung Bei dem einen Verfahren handelt es sich darum die F higkeit von Protoplasten zu nutzen genetisches Fremdmaterial nach Perkussi on ihrer Zellmembranen meist durch Elektroschock direkt einzubauen und dann sp ter zu exprimieren Beim zweiten Verfahren wird dagegen die nat rlich in Agro bacterium tumefaciens vorhandene F higkeit zur bertragung genetischen Materials mit dessen folgender Expression genutzt Dieses Verfahren wird im Praktikum durchgef hrt W hrend im ersten Fal
57. u 10 Probentasche 2 3 4 und 5 ul Referenz Protein Probe 5 6 7 8 Probentasche 1 2 3 und 5 ul s Phosphatase Probe g Nach vollst ndiger F llung des oberen Puffertrogs mit Elektroden Puffer den Deckel auf die Apparatur aufschieben und die beiden Anschlu kabel farbrichtig mit dem Netzger t verbinden h F r ca 2 Minuten 200 V anlegen bis die blaue Bromphenolblau Zone mit den Proteinproben in das Gel eingewandert ist Stromst rke pr fen s o und da nach vorsichtig den Probenkamm mit einer Pinzette aus dem Gel ziehen Dies er gibt eine gleichm igere Feldst rke im Gel i Nun bei 200 V solange die Elektrophorese durchf hren bis die Bromphenolblau Bande Pufferfront den unteren Gel Rand erreicht hat j Die Spannung am Netzger t abschalten und das Gel aus der Apparatur nehmen Dabei die Gelkante an der die Proben aufgebracht wurden nach oben halten An einer Seite der Glaskasette den Klebstreifen entfernen und die obere Glasplatte aufklappen Das Gel ist v llig klar und gegen das Licht gesehen erkennt man eventuell bereits Protein Banden k Mit einem Messer die rechte obere Ecke des Gels zur Orientierung abtrennen und das Gel vorsichtig in eine passende Petrischale gleiten lassen Zun chst zur Fixierung Denaturierung der Protein Banden 10 ige Trichloressigs ure B 8 w hrend 10 Minuten einwirken lassen Darauf folgt die Anf rbung der Proteine durch Coomassie Brilliant Blue G 250 Gradipure
58. wird nach bereits bestehenden Eichkurven berechnet Dabei entsprechen 100 ug ml Protein einer Extinktion von 0 155 ber einen Dreisatz kann aus dem Mittelwert der gemessenen Extinktionen die zugeh rige Proteinkonzentration errechnet werden 0 155 100 ug ml Mittelwert Extinktion X Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 22 100 Mittelwert Extinktion X nnn nnn nnn nn nnn nnn nnn nnn nnn nee eee eee ee ml 0 155 ug ml Da der Faktor 100 0 155 aus der Eichkurve bei dieser Berechnung immer gleich bleibt fa t man ihn als sogenannten Eichfaktor EF Konzentration pro mittlere Extinktion zusammen und schreibt die Bestimmungsgleichung ug ml Protein EF Mittelwert Extinktion ug ml Protein 100 0 155 Mittelwert der Extinktionen b Nach dieser Gleichung kann die Auswertung der Proben vorgenommen werden Konzentrationsstufe der Probe bitte ankreuzen Extinktionen Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 23 D2 Auswertung der Enzymaktivitats Bestimmung a Aus bereits bestehenden Eichkurven f r Maltose als Produkt der Enzymreaktion f r d Amylase ergibt sich ein Eichfaktor von 100 uMol ml EF Maltose 0 585 F r die Bestimmung der Enzymaktivit t ergibt sich somit folgende Bestimmungsgleichung s A Prinzip Enzymaktivit t pro ml EF Maltose Mittelwert Ext pro Minute EF Maltose Mittelwert Extinktion
59. zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc f Blauf rbung PCR Southern Verfahren Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 184 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Plasmidvermehrung Plasmidisolierung Mini Prep Reinigung der Plasmid DNA Gelelektrophorese quant und qualit Bestimmung des DNA Gehaltes Transformation in E coli Stamm S 17 1 f r Konjugation Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 185 19 5 Plasmidvermehrung Hierzu wird ein Bakterienkolonie von einer entsprechenden Agarplatte s 1 Praktikumstag mit einer Impf se entnommen und in 5 ml LB Medium Ampicillin bertragen vom Betreuer durchgef hrt Diese Kultur l t man ber Nacht sog bernachtkultur ca 16 Stunden aufwachsen 19 6 Kleine Plasmid Pr paration Mini prep Am n chsten Morgen werden ca 1 5 ml der Ubernachtkultur in ein Eppendorfreaktionsgef berf hrt auf Eis gek hlt und anschlie end 10 Min bei 5000 Upm bei 4 C abzentrifugiert Der berstand wird vollst ndig entfernt Jetzt wird zu dem Sediment 100 ul L sung I s 19 9 gegeben und gut resuspendiert Durch Z
60. 015 Min 1 000 Min Mittelwert Standard Abweichung s sin vom Mittelwert Ergebnis Wie oben bereits beschrieben sind die Ergebnisse von innerhalb zu kurzer Zeit gemessenen Z hlraten von seltenen Ereignissen bei arithmetischer Mittelung der Me wiederholungen nicht korrekt da die Einzelwerte nicht normal sondern Poisson verteilt sind Bei der Messung von Radioaktivit t erreicht man erst durch die Verl ngerung der Me zeit bei gen gend gro er Anzahl an Wiederholungen die Normal Verteilung Erst dann ist die Berechnung der Standardabweichung nach der Formel f r Einzelmessungen zur Beurteilung der statistischen Sicherheit eines Mittelwertes zul ssig 5 Messung der Gesamt y Radioaktivit t in einer Pilzprobe aus Tschechien Anwendung der gezeigten Zusammenh nge auf die Messung der y Radioaktivitat in einer Steinpilz Probe mit dem GKSZ in Berthold Abschirmung als Vorbereitung Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 136 auf den Versuch zur Identifizierung und Aktivit tsbestimmung einzelner y Nuklide in dieser Pilzprobe Die Me dauer sollte dabei mindestens 5 Minuten betragen Versuch Messung von 64 3g getrockneter Steinpilze aus Tschechien Impulse Me zeit Standard Ergebnis Min wei chung Nulleffekt Pilzprobe Nulleffekt Pilzprobe Formel f r die Standardabweichung einzelner Me werte IMPULSZAHL S Mefzeit Min Formel f r die Standardabweichung der Pilzp
61. 04 ZH 1 344 Parasiten B 005 ZH 1 345 Bakterien B 006 ZH 1 346 Pilze b 007 ZH 1 347 der BG Chemie
62. 2 f llen so da der Probenkamm im Gel ca 1 cm berstaut ist Mittels Pasteur Pipette und Gummiball sind eventuell verbliebene Luftblasen im Probenkamm von oben in das Gel schauen durch einen kr ftigen Pufferstrom zu entfernen f Die Probe der Sauren Phosphatase B 3 mittels Eppendorf Varipipette vorsichtig applizieren Dabei f r jede Probe eine neue Pipetten Spitze verwenden Die Sac charose Zugabe zum Ansatz der L sung verhindert hierbei die Vermischung der Probe mit dem Puffer Bei der Proben Beschickung nach folgendem Schema s S 109 verfahren 1 und 12 Probentasche jeweils frei lassen 9 10 und 11 Probentasche jeweils 2 4 7 und 10 ul S Phosphatase Probe Versuch 10 Elektrophorese nativ 109 die 6 u 7 Probentasche bleiben frei zur sp teren Teilung des Elektropherogramms f r die beiden Farbeverfahren Bitte vermerken welche Probentasche mit welchem Proben Volumen jeweils zu bef llen ist g Den Deckel auf die Apparatur aufschieben und die beiden Anschlu kabel farbrich tig mit dem Netzger t verbinden h F r 2 Minuten 200 V anlegen bis die blaue Bromphenolblau Zone in das Gel ein gewandert ist Dabei ist die Stromst rke des Netzger tes zu berpr fen Ergibt sich dabei keine oder eine zu gro e Stromst rke Normalwert ca 20 50mA so ist das ein Hinweis darauf da beim Ger te Zusammenbau oder der Gel und Probenbeschickung Fehler gemacht wurden In diesem Fall die Elektrophorese
63. 2 0 2 0 2 0 Zugabe nach Minuten 0 30 30 30 30 Ges Volumen ml V 6 00 6 00 6 00 6 00 6 00 b Messung der Extinktion aller Proben gegen A dest bei 405 nm in 1cm K vetten Extinktionen der Proben 1 2 3 4 5 Extinktionen D 2 Auswertung a Errechnung der Extinktions Differenzen AE f r die Reagensgl ser Nr 2 bis 5 gegen den Enzym Konzentrations Blindwert Reagensglas Nr 1 Proben Nummer 2 3 4 5 ml Enzym L sung Ve 0 05 0 10 0 15 0 20 Extinktions Diff AE Versuch 7 Enzymkinetik 66 b Auftragen der AE Werte in Abh ngigkeit von der Enzym Menge ml Enzym L sung in ein Enzym Konzentrations Umsatz Diagramm c Bestimmung der Enzymaktivit t der Sauren Phosphatase jeder Probe anhand der berechneten AE Werte Proben Nummer ml Enzym L sung Ve Extinktions Diff AE Enzym Aktivitat U ml Enzym Aktivit t U ml Probe AE e 6 0 e 1000 18500 e Le Ve et s Erl uterungen unter Punkt D 1A s S 60 Versuch 7 Enzymkinetik 67 C 3 3 Versuch Enzymatische Spaltung von p Nitrophenylphosphat durch Saure Phosphatase in Abhangigkeit vom pH Wert der Inkubationsl sung bei Substrat und Enzym berschu a Versuchsansatz pH Wert 2 00 4 00 5 60 8 00 Puffer Citrat h Citrat i Citrat c TRIS j Proben Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 Volumen ml a Puffer 0 8 0 8 0 8 0 8 b A dest 2 9 2 9 2 9 2 9 c p NPP d 0 2 0 2 0 2 0 2 Im Wasse
64. 2N NH4OH wodurch die amphoteren Aminos uren in Anionen berf hrt und somit vom Kationen Austauscher nicht mehr gebunden werden und mit dem Elutionsmittel die S ule verlassen Versuch 1 Ionenaustauschchromatografie 14 Wirkungsweise von Ionenaustauschern Der DOWEX Kationen Austauscher geh rt zu einer Gruppe von Kunstharz Austauschern mit austauschf higen SO3H Gruppen Der Austauscher R SO3 H kann somit ein H Ion abdissoziieren das aber aus Gr nden der Elektroneutralit t in der N he der dissoziierten Gruppe bleibt Das Ht Ion kann sich nur dann entfernen wenn ein anderes positiv geladenes Ion an seine Stelle tritt und der eigentliche Aus tausch Proze stattfindet Bei der Trennung von Aminos uren macht man sich deren amphotere Natur zunutze indem man als H verdr ngendes Ion die im sauren pH Bereich positiv geladene Aminogruppe der Aminos uren verwendet wof r vom Kationen Austauscher H Ionen abgegeben werden Durch einen danach aufgebrachten berschuss an 2N NH4OH wird das S ulenmedium alkalisch wodurch die gebundenen amphoteren Aminos uren dann als Anionen vorliegen demzufolge vom Kationen Austauscher wieder freigesetzt und ausgewaschen werden Die brigen nicht amphoteren anorga nischen aber auch organischen Kationen einer biologischen Probe werden jedoch weiterhin am Austauscher sorbiert Erst durch einen berschu an H Ionen IN HCl werden auch diese freigesetzt und eluiert Nach Auswaschen bersch ssiger
65. 44 Wie der obigen Tabelle zu entnehmen ist deutet der R Wert der homologen Reihe Gly Ala Val und Leu darauf hin da die Affinit t zur station ren Phase Wasser als Bestandteil des Laufmittels sorbiert durch die Cellulose des Papiers einerseits mit zunehmender Kettenl nge am o C Atom immer schw cher wird was auch in der Verringerung der Wasserl slichkeit dieser Aminos uren zum Ausdruck kommt Andererseits weist Asp die geringere Wasserl slichkeit der f nf Aminos uren auf doch Asp zeigt von allen f nf Aminos uren den geringsten Re Wert Allein nach seiner Wasserl slichkeit m te Asp den h chsten Re Wert aufweisen Dies macht deutlich da insbesondere Struktureffekte bei der Affinit t der Aminos uren zu einer der beiden Phasen im Zwei Phasen System eine wichtige Rolle spielen s a Alkohole in der Gaschromatografie Bei Asp ist es die zweite Carboxylgruppe die eine gr ere Hydrophilit t dieser Aminos ure bewirkt Trotzdem weist Asp eine schlechtere Wasserl slichkeit auf als z B Val mit mehreren apolaren Gruppen Die Bedeutung von Struktureffekten f r die Affinit t zur station ren oder mobilen Phase zeigt besonders die Aminos ure Prolin Pro Sie weist mit 162 g 100ml Wasser die h chste Wasserl slichkeit aller Aminos uren auf hat dagegen mit 0 88 einen der h chsten R Werte aller Aminos uren s AEBI 1965 d h da diese Aminos ure eine sehr hohe Affinit t zur mobilen Phase Phenol und nicht zur statio
66. 5 ml eiskalter 100 mM MgCl L sung resuspendiert anschlie end 15 20 Min auf Eis inkubiert Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 178 Dieser und alle folgenden Schritte sollten unbedingt auf Eis oder im K hlraum durchgef hrt werden Es wird sofort bei 4 C f r 10 Min bei 4000 5000 Upm K hlzentrif ge 4 C zentrifugiert Der berstand wird vollst ndig abdekantiert und das Sediment in 0 5 ml 100 mM MgCl L sung resuspendiert Die Suspension wird dann f r 10 20 Min auf Eis abgestellt Die Zellen sind jetzt kompetent und k nnen f r Transformationen verwendet werden Kompetente Zellen k nnen einige Tage auf Eis oder einige Monate im Glycerinmedium gelagert werden 19 3 Transformation des Bakterienstammes HB101 E coli mit dem Plasmid pPCV812 s Abb 18 1 Der Vorgang der Transformation ist die Aufnahme externer Plasmid DNA durch entsprechend kompetente Bakterienst mme Zu 50 100 ul der kompetenten Bakteriensuspension s 18 3 werden 100 200 ng Plasmid DNA gegeben Um eine Adsorption der DNA an die Bakterien zu erm glichen wird die Mischung f r 15 Min auf Eis inkubiert Dann erfolgt ein W rmeschock von 5 Min bei 37 C wodurch die adsorbierte Plasmid DNA aufgenommen wird Der Vorgang wird noch einmal wiederholt Eine Zugabe von LB Medium und 1 stiindiges Sch tteln der Mischung bei 37 C f rdern das Wachstum der transformierten Bakterien und Synthese von A Lactamase gegen Ampicillin Nach diesem Zeitraum
67. A tumefaciens Plasmidisolierung Mini Prep Reinigung der Plasmid DNA quant und qualit Bestimmung des DNA Gehaltes Identifizierung des Plasmid pPCV 812 durch Verdau mitRestriktionsenzym EcoRV Gelelektrophorese Vermehrung f r Co Kultur mit Pflanzenzellsuspension siehe 2 Praktikumstag Versuch 20 Konjugation 197 20 3 Konjugation des E coli Stammes S 17 1 enth lt Plasmid 812 mit dem Agrobakterium tumefaciens Stamm GV3101pMP90 RK Beide Bakterien St mme werden zur Vermehrung in 5 ml Medium mit entsprechenden Antibiotika berf hrt bernachtkultur Weil A tum langsamer w chst soll man zwei Tage vor der Konjugation mit der Vermehrung beginnen Nach der Vermehrung werden die St mme zun chst durch Zentrifugation bei 4000 5000 Upm Raumtemperatur von ihrem N hrmedium getrennt im YEB Medium aufgenommen 1 1 gemischt je 100 ul und anschlie end auf YEB Agarplatten ohne Antibiotika tropfenweise aufgetragen Die Inkubation dauert etwa 1 Tag bei 28 C Nach der Inkubation werden die Bakterien mit einer Impf se aufgenommen in 2 ml YEB Medium resuspendiert und nach dem folgendem Schema verd nnt s u anschlie end auf einer YEB Agarplatte mit Rifampicin oo und Carbenicillin oo bei 28 C f r 2 Tage inkubiert Danach werden die gewachsenen Kolonien daraufhin untersucht ob das Plasmid aufgenommen wurde siehe 3 Praktikumstag a 100 ul ausplattieren
68. Ci P dCTP gegeben und vorsichtig gemischt Die Probe wird dann bei 37 C f r 1 Stunde inkubiert Bei Ende der Inkubationszeit wird die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0 2 M EDTA L sung gestoppt anschliessend werden dazu 50 ul dd H O pipetiert 22 7 3 Abtrennung der freien Nukleotide Da bei der Reaktion die Nucleotide im berschu zugegeben werden liegen am Ende der Reaktion noch nicht eingebaute Nucleotide vor Sie m ssen entfernt werden da es sonst bei Verwendung der Probe als Gensonde zu unspezifischer Bindung von Nucleotiden aus dem Labellingmix kommt und die Signale undeutlich werden Zum Abtrennen der Nucleotide wird eine Sephadex G 50 S ule s a S 45 ff verwendet Sie trennt mittels des sog Molekularsiebeffekts kleine von gr eren Molek len ab Die Abtrennung der Nucleotide erfolgt mit Quick Spin Colum Sephadex G 50 Die S ule wird mit 100 ul radioaktiv markierter Sonde beladen und 4 min bei 1 100 g zentrifugiert Die Fraktion wird in einem verschlie baren 0 5 ul Eppendorfgef gesammelt 22 8 Pr hybridisierung Um unspezifische Bindungen auf den Filtern zu vermeiden m ssen die Bindungsstellen auf dem Filter abges ttigt werden Dies erfolgt durch den Vorgang der Pr hybridisierung Die Membran wird nach dem Cross Linken eingerollt und anschlie end in Hybridisierungsr hrchen eingelegt 1 ml pro 1 cm Membranfl che mit der Hybridisierungsl sung Rapid hyb buffer wird in R hrchen eingef llt und fest versc
69. DNA in kompetente Bakterienzellen Selektion und anschlie end Vermehrung f r Mini prep Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 175 18 1 Gewinnung von Zellsuspensionen Zur Erstellung transgener Pflanzen ist es sinnvoll Pflanzenmaterial zu nehmen das sich nach der Kultur zu Pflanzen regenerieren l t Karotten sind als Modellpflanze gut geeignet weil man ber die somatische Embryogenese eine gro e Anzahl von Pflanzen erstellen kann mehr dazu Neumann 1995 18 1 1 Oberfl chenssterilisation von Karottensamen Etwa vier Wochen vor Versuchsbeginn werden die Karottensamen sterilisiert Hierzu werden sie 1 Min mit 70 igem Ethanol und anschlie end ca 1 5 bis 2 Stunden unter R hren mit einem Magnetr hrer mit einer 1 1 5 verd nnten Natrium Hypochloritl sung ca 7 aktives Chlor und einem Tropfen Tween 80 behandelt Unter sterilen Bedingungen wird der Samen nach mehrmals mit sterilem Aqua dest gewaschen und auf B N hrmedium mit 0 4 ige Gelrite 0 5 ppm 2 4 D ausgelegt Die Kultivierung erfolgt f r ca 4 Wochen dann wird der am Hypokotyl des Keimling gebildete Kallus in fl ssiges Bs Medium zur Erstellung von Suspensionskulturen berf hrt Zur Erhaltung der Kulturen werden sie alle 2 Wochen in B N hrmedium subkultiviert 18 1 2 Kulturbedingungen Die in vitro Kultur erfolgt bei 28 C und einer Dauerbelichtung mit ca 4000 Lux Osram Lumilux white Als Kulturgef e f r die Agarkulturen dienen handels blich
70. DS haltigen Gelen mit SDS Elektrodenpuffer der Elektrophorese unterzogen Durch Vergleich mit SDS vorbehandelten Referenz Proteinen bekannten Molekulargewichts ist besonders gut mit einer Flachgel Einf hrung in die Elektrophorese 99 Elektrophorese s o das Molekulargewicht unbekannter Proben Proteine bestimmbar s Abb 10 5 Abb 10 5 aus Cooper 1981 0 e rn Rinder Serumalbumin X m 4 Katalase S 60 RuDP Carboxylase schwere Kette 3 50 Ovalbumin 4 HMG CoA Alkohol 40 Synthase dehyase i 53000 0 30 2 02 0 25 03 Beweglichkeit Bestimmung des Molekulargewichts der Untereinheit der HMG CoA Synthase aus Mitochondrien durch DS Gelelektrophorese Die SDS Behandlung von Proteinen bewirkt folgendes 1 berdeckung individueller Ladungsunterschiede einzelner Proteine durch das anionische Detergenz 2 Spaltung von Wasserstoff Briickenbindungen 3 Verhinderung von Aggregationen einzelner Proteine 4 Streckung von Polypeptidketten und Bildung ellipsoider Strukturen Die letztlich ellipsoid geformten Proteinketten nehmen masse spezifische Mengen an SDS auf und erhalten dadurch eine negative Nettoladung die proportional ist dem Molekulargewicht der behandelten Proteine Die nach SDS Behandlung resultierende Einf hrung in die Elektrophorese 100 elektrophoretische Beweglichkeit ist somit ein Ma f r das Molekulargewicht der Proteine Der Einflu von SDS auf h here Protein S
71. Kurve 2 Ge Li Halbleicterdecektor planar aktive Fl che 3 ca aktive Dicke 12 mm Al Fenster 0 5 ma Sperrschicht 500 um Germanium Relative Halbwercbreice T H der Tocalabsorptions linie 0 4 8 der Impulse liegen ia der Totalabsorptions linie 92 im Compcton Kontinuun Versuch 17 y Spektroskopie 167 Unser Ger t verf gt ber einen ADC der die Impuls Amplituden in etwa 1000 einzelne Digitalwerte umwandelt und ber etwa 1000 einzelner Speicherzellen Bei Halbleiter Detektoren verwendet man meist sogar etwa 5000 oder 8000 einzelner Energie Kan le Beispiele zur Identifizierung und Messung von 134Cs 137Cs und 40K enthaltenden Proben werden im Verlauf der Demonstration gezeigt B Material und Ger te a Nahrungsmittel Proben die nach Tschernobyl noch P Radionuklide enthalten k nnten Die Studenten k nnen eigene Proben zur Verf gung stellen b KCI Probe zur Messung der nat rlichen Radioaktivit t von 40K c Kristall Scintillations Z hler 2x2 Zoll NaJ Tl mit Bleiabschirmung und Proben Gef en d Vorverst rker und Vielkanal Analysator Berthold Ortec Computer und Drucker C Durchf hrung a Bis zum Ende dieses Praktikumstages nach Absprache auch an weiteren Tagen au erhalb dieses Praktikums k nnen Ihre Proben gemessen werden b Die Probe wird zun chst in eine sogenannte Marinelli Schale gef llt deren Form der Oberfl che des Kristall Scintillations Z hlers gut angepa t ist Danach da
72. Me ergebnis ist somit 30 1667 IpM 7 5 IpM Dies bedeutet da bei einer neuerlichen Messung des gleichen Pr parates der zu erwartende Me wert mit einer statistischen Wahrscheinlichkeit von 68 3 zwischen 1667 7 5 1659 und 1667 7 5 1675 liegen w rde Will man die statistische Sicherheit der Aussage des Ergebnisses erh hen rechnet man mit dem doppelten Wert der Standardabweichung Dann k nnte man mit 95 Sicherheit von einem zu erwartenden Me wert zwischen 1652 und 1682 ausgehen Dieses Verfahren ist nur bei Nukliden mit l ngerer Halbwertszeit bei l ngeren Messungen anzuwenden die aufgrund ihrer Me dauer nicht beliebig oft wiederholt werden k nnen F r die Auswertung von Messungen mit einzelnen Wiederholungen gelten dagegen die blichen statistischen Gesetze zur Pr fung von Verteilungen s n chster Versuch Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 134 4 Kurzzeitig gez hlte Ergebnisse von Radioaktivit tsmessungen sind Poisson verteilt b Me wiederholungen Das Ziel dieses Versuches besteht darin zu zeigen da die Messung seltener Ereignisse innerhalb einer mit Absicht zu kurz gew hlten Zeitspanne nur sehr ungenau ber den aus Parallelmessungen arithmetisch errechneten Mittelwert und die Standardabweichung auszuwerten ist Wie anhand von im Labor ermittelten Parallelwerten Tab 14 1 gezeigt werden kann sind 50 innerhalb 0 015 Minuten ermittelte Me werte der Umweltstrahlung nicht normal
73. Pauler B Imani J u K H Neumann Institut f r Pflanzenern hrung der Justus Liebig Universit t Gie en Praktikum biochemischer radiobiochemischer und sentechnischer Methoden F r Studenten der Ern hrungswissenschaften der Agrarwissenschaften und der Biologie Vorwort II Vorwort Das hier vorgelegte Praktikumsbuch ist das Ergebnis einer ber viele Jahre hinweg sich entwickelnden Erfahrung in der Durchf hrung von Praktika durch die Studenten in die biochemische Laborarbeit eingef hrt werden sollen W hrend in den ersten beiden Teilen biochemisches Grundwissen vermittelt wird besteht das Ziel des dritten Teils der Einf hrung in gentechnische Verfahren darin molekularbiologisch biochemisches Wissen und K nnen auf eine bestimmte Zielsetzung hin anzuwenden Die beiden ersten Teile des Praktikums werden mit maximal 40 Studenten durchgef hrt der dritte Teil ist auf 12 bis 15 Studenten allein aus Platzgr nden in unserem Institut beschr nkt Der gentechnologische Teil kann nur von Studenten wahrgenommen werden die die ersten beiden Teile die f r das 5 und 6 Semester vorgesehen sind erfolgreich absolviert haben Es soll darauf hingewiesen werden da sowohl f r den radiochemischen als auch f r den gentechnischen Teil des Praktikums beh rdliche Genehmigungen erforderlich sind Auf Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven Isotopen wird an verschiedenen Stellen im radiochemischen Teil des Buches eingega
74. R R 1990 Elektrophorese Praktikum VCH Weinheim VOET D u J G VOET 1992 Biochemie VCH Weinheim Einf hrung in die Elektrophorese 104 Versuch 10 Elektrophorese nativ 105 4 Arbeitstag Elektrophorese eines Pr parates der Sauren Phosphatase unter nativen Be dingungen mit anschlie ender Protein und Enzym spezifischer Anf rbung der Elektropherogramme Versuchsziel Pr fung eines Pr paratess der Sauren Phosphatase auf Verunreinigungen durch andere Proteine der Kartoffel Einf hrung in die Elektrophorese A Prinzip s Einf hrung A1 Versuchsfrage Bei den enzymkinetischen Untersuchungen s Versuch 7 kam ein Pr parat der Sau ren Phosphatase aus Kartoffeln Firma BOEHRINGER zur Anwendung Dieses Pr parat soll in diesem Versuch auf seine Reinheit berpr ft werden indem es zun chst unter nativen Bedingungen d h ohne Denaturierung und Reduzierung s Einf h rung elektrophoretisch getrennt wird Dabei ist zu untersuchen welche Protein Ban den auf eventuelle Verunreinigungen durch andere Proteine der Kartoffel und welche auf die Saure Phosphatase selbst zur ckzuf hren sind Dabei soll gezeigt werden da Enzymproteine nach dieser Art der Elektrophorese noch aktiv sind und ihre funktio nale Enzymstruktur erhalten bleibt Durch das Verfahren ist entsprechend der jeweiligen Substrat polymerisation ein bestimmtes Protein am Elegtropherogramms zu lokalisieren Der Versuch gliedert si
75. abs zum Reinigen der Hb Pipette g KMnO4 L sung und Filterpapier h F n i Dragendorff sches Reagens Zun chst sind zwei Stamml sungen herzustellen 1 0 85g Wismutsubnitrat in einer Mischung aus 10ml Eisessig und 40ml A dest 2 8 08 KJ in 20 ml A dest Zum Gebrauch mischt man 1 0ml L sung 1 und 1 3ml L sung 2 in einem 25ml K lbchen mit 5 0 ml Eisessig und f llt mit A dest auf 25ml auf j Spr hvorrichtung im Abzug C Durchf hrung je 4 Studenten a Bereits vor Beginn des Praktikums ist das Laufmittel B d in die Chromatogra fietanks zu f llen damit die S ttigung der Tankatmosph re bis zum Beginn dieses Versuches gew hrleistet ist b Zun chst sollte der Umgang mit einer Hb Pipette bzw Eppendorf Pipette zum Auftragen von Proben auf die D nnschichtplatte ge bt werden Hierzu wird unter Verwendung von KMnO4 L sung sie ist in der Hb Pipette und auf dem Filterblatt gut sichtbar versucht genau 20ul anzusaugen und portionsweise unter Trocknung mit einem F n kleine Substanzflecken auf Filterpapier aufzutragen Je besser es gelingt Proben in kleinen Flecken aufzutragen desto besser wird die Trennung der anschlie enden Chromatografie e Versuch 4 D nnschichtchromatografie 39 Auftragspunkte c Erst wenn die Handhabung der Pipette voll beherrscht wird sind 20ul der Cholinchlorid CCC Probe B a ent sprechend dem nebenstehenden Schema auf die D nnschichtplatte aufzutragen Die Auftrags
76. afie A Prinzip s Einf hrung in die Gaschromatografie s S 25 A1 Vorbemerkung W hrend im ersten Versuch zur Einf hrung in die Gaschromatografie niederkettige Alkohole im Hinblick auf ihr Retentionsverhalten untersucht wurden liegt es nahe die Gaschromatografie auch zur quantitativen Bestimmung des thanol Gehaltes in verschiedenen Getr nken einzusetzen Im Gegensatz zu einem FID Flammenionisations Detektor dem gebr uchlichsten Detektor im praktischen Einsatz der GC ist mit dem WLD unseres Gaschromatografen auch Wasser nachzuweisen so da die beiden Hauptkomponenten Wasser und thanol in Getr nken gleichzeitig bestimmt werden k nnen Anwendungsm glichkeiten f r diese Methode w ren z B die Alkohol Bestimmung in Alkohl enthaltenden Medikamenten Melissengeist und anderen Pflanzenausz gen oder in Fruchts ften um G rungsprozesse w hrend deren Herstellung oder Lagerung Verderb zu erfassen Auch die Pr fung auf Abwesenheit von giftigem Methanol in verschiedenen G rungsprodukten w re durchf hrbar Das Prinzip der quantitativen Analyse basiert hier auf einer Integration der Peaks von Wasser und thanol und Ausgabe der anteiligen Fl chenintegrale nach der 100 Methode Dabei bleiben allerdings die in der Einf hrung angesprochenen Korrektur faktoren f r ein eventuell unterschiedliches Ansprechverhalten des WLD auf Wasser und thanol unber cksichtigt Wie die folgenden Ergebnisse von Voruntersuchungen
77. als Substrat inkubiert 10 Minuten bei 30 C im Thermostat stoppt die Enzymreaktion durch Erhitzen auf 100 C im Wasserbad ab und bestimmt danach den Gehalt an Maltose als Produkt im Testansatz nach Zugabe von 2ml Dinitrosalizyls ure photometrisch gegen einen Blindwert D Die neue Einheit f r die Enzymaktivit t ist das Katal Sie ist definiert als der Substrat Umsatz eines Enzyms in Mol Sekunde Da aber die Einheit Unit auch noch blich ist wenden wir sie auch in diesem Praktikum an Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 19 Prinzip der Bestimmung des Gehaltes an Enzymprotein Es gibt zahlreiche Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration Hier wird die Methode nach LOWRY verwendet die eine Erweiterung der bekannten Biuret Methode darstellt Letztere war eines der ersten kolorimetrischen Arbeitsverfahren zur Proteinbestimmung und ist auch heute noch im Einsatz wenn es auf eine schnelle aber nur grobe Proteinbestimmung ankommt Die Reaktion beruht auf einer Komplexierung von Kupferionen mit den Peptidbindungen von Proteinen und Tyrosin Resten in alkalischer L sung Die Bestandteile des Ansatzes f r die Biuret Methode sind Cu ID Sulfat in Na K Tartrat L sung und NaOH Die LOWRY oder auch Folin Ciocalteau Phenol Methode zur Proteinbestimmung basiert zun chst ebenfalls auf einer Komplexierung von Cu Ionen mit Proteinen im alkalischen Bereich Der Cu Protein Komplex reduziert dann das aus Phosphomolybdat und P
78. an definierten thanol Wasser Gemischen zeigen ist mit diesem Verfahren eine ausreichende Genauigkeit zu erzielen Versuch 13 Alkoholbestimmung mittels Gaschromatografie 126 Tabelle 1 Ergebnisse von Voruntersuchungn Messung abs ETOH H20 2 ETOH 96 99 als technischer Alkohol 96 ig angegeben und aus steuerlichen Gr nden verg llt Anteil Wasser und Verg llungsmittel nicht bekannt 1 VT abs ETOH H20 50 1VTH20 ETOH 50 Anmerkung Volumen Kontraktion 1 VT abs ETOH H20 67 2 VT H20 ETOH 33 Anmerkung Volumen Kontraktion Zwetschgenwasser Bei offener Vorratsflasche nimmt Athanol abs hoch polar begierig Wasser aus der Luft auf Andererseits verdampft Athanol abs aus offener Vorratsflasche Dadurch kann sich die aktuelle Athanol Konzentration in oft gebrauchten Vorratsflaschen ndern Versuch 13 Alkoholbestimmung mittels Gaschromatografie 127 Anmerkung Bei der 100 Methode zur Bestimmung der Anteile von Wasser und Athanol zu beachten da insofern ein Fehler entstehen kann als die untersuchten Pro dukte noch weitere Ingredientien enthalten k nnen die entweder gaschromato grafisch nicht erfa bar sind oder erst sp ter bzw bei h herer Temperatur von GC S ule eluiert werden Hier steht das Prinzip im Vordergrund nicht die abso lute Genauigkeit B Material und Reagentien 1 Gaschromatograf in Verbindung mit einem Computer ber eine ADC Steckkarte Trennbedingungen
79. and e bedeutet da sich das Molek l im angeregten Triplett Zustand befindet Relative Z hlausbeute verschiedener L sungsmittel tr ne nn nn Verbindung relative Z hlausbeute me Toluol 100 Methoxybenzol Anisol 100 Xylol 97 1 3 Dimethoxybenzol 81 1 4 Dioxan 70 Ethylenglykol dimethylether 60 Aceton 12 Tetrahydrofuran a Ethanol 0 Ethylenglykol monomethylether 0 Ethylenglykol 0 aeee es Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 148 Abb 15 2 Angaben zu prim ren und sekund ren Scintillatoren aus COOPER 1981 PPO paso pica CH CH Bis MSB UNE EL CH Ch Dimethyl POPOP nn Struktur der gebr uchlichsten prim ren und sekund ren Szintillatoren Fluoreszenz Maxima verschiedener Szintillatoren in Toluol Fluoreszenz Maxima nm Name MG i hy Ay a re ee Prim re Scintillatoren Naphthalin 128 325 336 351 Anthracen 178 405 428 454 Terphenyl 230 355 PPO 2 5 Dephenyloxazol 221 365 380 PBD 2 Phenyl 5 4 biphenylyl 1 3 4 oxadiazol 298 364 377 Butyl PBD 2 4 t Butylphenyl 5 4 biphenylyl 1 3 4 oxadiazol 354 367 382 BBOT 2 5 Bis 5 t butylbenzoxazol 2 yl thiophen 430 438 Sekund re Scintillatoren POPOP 1 4 Bis 5 phenyloxazol 2 yl benzol 271 420 44l DMPOPOP 1 4 Bis 4 methyl 5 phenyloxazol 2 yl benzol 392 430 Bis MSB p Bis o methylstyryl benzol 310 423 Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 149 A 2 Apparative Voraussetzungen zum Betrieb eines LSC
80. ase in Abh ngigkeit von der Reaktionszeit bei Substrat UberschuB a Versuchsansatz Enzym Konzentrationsstufe 1 oder 2 Bitte ankreuzen Reagens Zusatz ml zu den Proben Reagentien 1 2 3 4 5 6 Citrat Puffer c 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 A dest 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 2 8 p NPP d 0 2 02 02 02 02 02 Im Wasserbad bei 30 C 5 min vortemperieren mischen weiter inkubieren bei 30 C 1N NaOH a 20 20 20 20 20 20 Zugabe nach Minuten 0 10 20 30 40 50 Ges Volumen V 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 b Messung der Extinktionen aller Proben gegen A dest bei 405 nm Extinktionen der Proben 1 2 3 4 5 6 Extinktionen D 1 Auswertung a Errechnung der Extinktions Differenzen AE f r die Proben Nr 2 bis 6 gegen den Zeit Blindwert Pobe Nr 1 Proben Nummer Reaktions Zeit Min Extinktions Differenz AE Versuch 7 Enzymkinetik 60 b Auftragen der AE Werte in Abh ngigkeit der Reaktionszeit in ein Zeit Umsatz Diagramm c Bestimmung der Enzymaktivit t der Sauren Phosphatase jeder Probe anhand der AE Werte s Abschnitt D 1A Proben Nummer Reaktions Zeit Min Extinktions Differenz AE Enzym Aktivit t Units ml D 1A Zur Berechnung der Enzym Aktivit t wird das LAMBERT BEER sche Gesetz verwendet Wiederholung Extinktion geced Dabei bedeuten c Konzentration Mol Liter d Schichtdicke der K vette in cm Stoff spezifische Proportionalit tskonstante bei defi
81. atman Papier Nylonmembran Gel m Whatman Papier Transferfl ssigkeit Abbildung 22 2 Das Schema verdeutlicht den Aufbau der Transfer Anordnung Die Abbildung wurde aus Maniatis et al Molecular Cloning A Laboratory Manual 1982 entnommen Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 222 Der Transfer der DNA erfolgt mit dem durch Kapillarkr fte erzeugten Pufferstrom Nach einer Transferzeit von ca 16 Stunden wird der Blot abgebaut Die Lage der Gelslots wird auf dem Filter mit einem Bleistift durch Einstiche markiert Ob der Transfer vollst ndig ist l t sich unter UV Licht 254 nm feststellen Die durch Ethidiumbromid angef rbten Banden d rfen im Gel nicht mehr zu sehen sein Die Membran kann dann luftgetrocknet sehr lange einige Wochen bis Monate aufbewahrt werden 22 6 3 Kovalente Bindung der DNA an die Membran Eine kovalente Bindung der membrangebundenen DNA ist n tig da diese ansonsten durch das in den Hybridisierungs und Waschl sungen enthaltene SDS sukzessive von der Membran abgewaschen w rde Anderson und Young 1985 Durch UV Bestrahlung entstehen kovalente Bindungen zwischen prim ren Aminogruppen der Nylonmembran und dem Thymin der DNA Church und Gilbert 1984 Hierbei wird der Blot mit der DNA Seite nach oben in UV Crosslinker eingelegt anschlie end eine Minute crossgelinkt 22 6 Herstellung der Sonde Ca 5 ug gereinigter Plasmid 812 mit eingebautem MAS Promotor wird mit dem Restrikt
82. atografie 83 D1 Beispiel zur Auswertung Gegeben Ext Papier Blindw 0 017 Gewicht Papier Blindw 120 mg Ext Asparagins ure 0 120 Gewicht ASP 157 mg a Der K Wert ergibt sich somit aus 0 017 120 0 000142 Ext mg d h pro mg Gewicht des Papiers betr gt der Wert f r die Untergrund F rbung 0 000142 Extinktions Einheiten b Mit dem K Wert wird nun berechnet welcher Anteil der Extinktion des Asparagins ure Flecks auf die Untergrund F rbung entf llt P Gewicht AS e K P 157 0 000142 P 0 022 Ext mg mg c Dieser Anteil der Untergrund F rbung des Papiers wird als n chstes von der Extinktion der Aminos ure abgezogen X 0 120 P Wert X 0 120 0 022 X Wert 0 098 d Die somit von der Untergrund F rbung bereinigte Extinktion der Aminos ure wird mit den Koeffizienten der f r die entsprechende Aminos ure berechnete lineare Regressionsgleichung verrechnet woraus sich deren Konzentration ergibt Y Xeb a F r Asparagins ure ergibt sich somit Y 0 098 e 198 22 4 5388 Y 19 426 4 5388 Y 23 964 ug Asparagins ure 20 ul Probe auf dem Chromatogramm e Da die Probe ein Gesamtvolumen von 2ml 2000u1 umfa te wir aber nur 20ul davon auf das Chromatogramm aufgetragen hatten ergibt sich ein Vol Faktor von 2000 20 100 Wir erhalten also ug Asparagins ure Probe 23 964 e 100 2396 4 Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 84 E Literatur Karlson
83. aute E Maes J H Warren M Van Montagu M Schell J 1983 Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322 A novel strategy for the received genetic of Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens EMBOJ 2 411 417 Van Larebeke N Genetello C Hernalsteens J P Depicker A Zaenen I Messens E Van Montagu M Schell J 1977 Transfer of Ti plasmid between Agrobacterium strains by mobilization with the conjugative plasmid RP4 Mol Gen Genet 152 119 124 Velten J Velten L Hain R Schell J 1984 Isolation of a dual plant promoter fragment from the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens The EMBO Journal vol 3 No 12 pp 2723 2730 Vervliet G et al 1975 Gen virol 26 33 48 10 Weiterf hrende Literatur Alberts B Bray D Lewis L Raff M Roberts K Watson J D 1990 Molekularbiologie der Zelle VCH Verlagsgesellschaft Brown T A 1996 Gentechnologie f r Einsteiger Spektrum Akademischer Verlag M lhardt C 2000 Der Experimentator Molekularbiologie 2 Auflage Spektrum Akad Verlag Literatur 233 Grieb B 1992 Untersuchungen zur Induktion der Kompetenz zur somatischen Embryogenese in Karotten Petiolenexplantaten Daucus carota L Histologie und Proteinsynthesemuster Wiss Verl Maraun Frankfurt Main Halbrock K Seadler H Salamini F und Schell J 1991 Pflanzenz chtung aus der N he gesehen Max Planck I
84. bei 405 nm Ext D 4 Auswertung a Berechnung der Extinktions Differenzen AE Differenz Ext Enzym Ext H 0 also z B Ext Probe 1 Ext Probe 2 Ext Probe 3 Ext Probe 4 usw und Berechnung der Enzym Aktivit t in U ml Probe Ext Diff A EE E E Nesacteeccaceeaceenses A E EEEE ed A E AE TEAS EEEE A EA EEE EAE E A sakocsecoasbececsscuees Enz Akt U ml sera en ee ae ae ee ee Sedececandekdexseetous s D3 b Substrat Konzentrationen in den einzelnen Substrat Stufen in mMol p NPP Rechnung selbst nachvollziehen Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 MMol p 0 0333 0 0667 0 1333 0 2333 0 3333 0 6667 1 000 1 333 NPP c Auftragen der Enzymaktivit tswerte U ml V auf der Y Achse gegen die millimolare Konzentration des Substrats p NPP auf der X Achse MICHAELIS MENTEN Darstellung Beispiel s Abb 7 D 4C 1 d Auftragen der reziproken Werte der Enzymaktivit t 1 U auf der Y Achse gegen die reziproke millimolare p NPP Konzentration 1 S auf der X Achse LINEWEA VER BURK Darstellung Beispiel s Abb 7 D 4C 2 e Bestimmung von Km und Vmax wenn m glich entsprechend lin Regression der reziproken Werte des LINEWEAVER BURK Plots Hierzu sind zun chst die Werte f r 1 U und 1 mMol p NPP 1 S zu berechnen Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
85. ca 2x20mm zerschneiden wobei ebenfalls eine Pinzette zu verwenden ist Die Streifen am besten in einer geknickten Karteikarte sammeln und vorsichtig in entsprechend beschriftete Reagensgl ser berf hren Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 80 h Die Elution der AS spezifischen F rbung mit 50 igem thanol sollte begleitet durch fteres vorsichtiges Kippen der mit Parafilm verschlossenen Reagenzgl ser solange durchgef hrt werden bis die Papierstreifchen nicht mehr gef rbt sind ca 60 90 Min aber bitte nicht sch tteln da dadurch Papierfasern abgel st werden k nnen wodurch die thanolphase getr bt werden kann und bei der Fotometrie Probleme best nden 1 Die Extinktions Messung der Farbintensit t im thanol Extrakt erfolgt im Fotometer bei 578 nm gegen 50 igen Athanol als Blindl sung D Auswertung a Zur Ermittlung der Untergrundf rbung des Chromatogramms pro Massen Flachen Einheit wird zun chst die Extinktion des Papier Blindwertes gegen 50 igen thanol auf seine Fl che Gewicht in mg umgerechnet es ergibt sich der Korrekturwert K nach folgender Formel k Extinktion Papier Blindwert gegen 50 thanol Gewicht Papier Blindwert in mg b Der folgende Rechengang ist nun f r jede einzelne Aminos ure eines Chromatogramms getrennt durchzuf hren P Wert P Gewicht AS Fleck in mg e K Ermittlung der Papier Untergrundf rbung unter dem AS Fleck X Wert X Extinkti
86. ch in folgende Arbeitsschritte 1 PAG Elektrophorese im Flachgel von 8 Parallelproben der Sauren Phosphatase 2 Trennung des Elektropherogramms in zwei H lften mit jeweils 4 Parallel Spuren 3 Die getrennten Proteine werden in einer Gelh lfte wie blich fixiert und mit Coomassie Brilliantblue G 250 angef rbt 4 Die andere Gelh lfte wird ohne Fixierung der getrennten Proteine nach Einstellung eines optimalen pH Werts in Substrat und F rbel sung f r Saure Phosphatase inkubiert 5 In Gelbereichen mit Saurer Phosphatase Aktivit t entstehen rote Banden da das aus dem Substrat enzymatisch freigesetzte Produkt an einen Azofarbstoff gekoppelt wird s S 107 Versuch 10 Elektrophorese nativ 106 B Material 1 Elektrophorese Apparatur und Netzteil 2 TEB Puffer Tris EDTA Borat Konzentrat f r Proben Ansatz und Elektrophorese 10 fach verd nnen 3 Probe der Sauren Phosphatase 10 mg Saure Phosphatase 1 g Saccharose 0 25 mg Bromphenolblau in 1ml TEB Puffer B 2 l sen 4 Eppendorf Varipipette 1 10ul wei e Spitzen 5 Polyacrylamid Fertiggel HILINX Acrylamid Gradient 5 50 Zur Protein F rbung A 6 F rbel sung Gradipure 7 10 ige Trichloressigs ure 8 7 ige Essigs ure 9 passende Petrischale A Zur Enzym F rbung B 10 Citrat Puffer o 1M pH 5 6 10 5 g Citronens ure x 1 H20 in 100 ml A dest l sen 100 ml IN NaOH zugeben und mit A dest auf 500 ml auff llen da
87. cknet und in den Anf rbetank erkl ren lassen eingeh ngt Bei 60 C unter einer mit thanol abs und CO ges ttigten Kammer verl uft die Ninhydrin Reaktion mit Aminos uren quantitativ s A b Nach 45 Minuten werden die Chromatogramme ca 7 Minuten unter dem Abzug getrocknet Colidin Lutidin zur Stabilisierung der F rbung riecht sehr unangenehm wird brigens auch als Verg llungsmittel f r technischen zollfreien Alkohol verwendet c Auf einem Lichtpult werden die einzelnen gef rbten Aminos uren nach der obigen Abbildung identifiziert und mit Bleistift umkreist Bleistift wird sp ter nicht miteluiert An einer besonderen Stelle wird auch der Papier Blindwert Papier BW markiert Die Abk rzung der AS und des Papier Blindwerts in die Umkreisung eintragen sonst vergi t man leicht welchen AS Spot man gerade ausgeschnitten hat s f d Jede 4er Gruppe bearbeitet nun ihr Chromatogramm nach folgender Vorschrift wobei das Ninhydrin getr nkte Papier nur an Stellen ohne BW oder Aminos ure Flecken angefa t wird e Sechs mit Asp Gly Ala Val Leu und BW beschriftete Reagensgl ser vorbereiten f Auf einer sauberen Unterlage Filterpapier die umkreisten Flecken ausschneiden ihr Gewicht in mg feststellen hierzu bitte eine Pinzette verwenden und die Gewichte in der Auswertetabelle s D Auswertung notieren g In Anbetracht des dicken Chromatogramm Papiers nun die ausgeschnittenen Flecken in d nne Streifchen
88. d f r ca 30 min in 1 8 iger HCl unter Schwenken bei Raumtemperatur inkubiert bis die Blaumarker Banden Bromphenolblau ins gelbliche verf rben Dadurch wird die DNA partiell depuriniert was bei der nachfolgenden Denaturierung eine Fragmentierung der DNA zur Folge hat Der Schritt dient der Erh hung der Transfereffizienz gro er DNA Fragmente gt 23 kb Anschlie end wird das Gel f r ca 35 min in 200 ml Alkali Transfer Puffer bis die Blaumarker Banden wieder blau sind inkubiert wodurch die DNA im Gel denaturiert wird Nur einzelstr ngige DNA bindet an der Membran 22 6 2 Blotaufbau Der Blot wird in Anlehnung an Maniatis et al 1982 und Mason and Williams 1985 aufgebaut s Abb 22 2 Eine Schale wird mit Transfer Puffer gef llt in welche eine Filterpapierbr cke Whatman 3 eintaucht die auf einer ber die Schale gelegten Glasplatte aufliegt Auf die mit Transfer Puffer befeuchtete Filterbr cke wird das Gel mit der Oberseite nach unten aufgelegt und mit der mit bidest Wasser befeuchteten nucleins urebindenden Nylonmembran Hybond N der Firma Amersham bedeckt Diese wird mit in Transfer Puffer getr nkten Filterpapieren Whatman 3 iiberdeckt Darauf folgt ein Stapel Papierhandtiicher die von einem Gewicht beschwert werden Filterpapiere Membran und Papierhandt cher werden auf Gelgr e geschnitten Die Fl che um das Gel herum wird mit Parafilmstreifen abgedeckt Abbildung 22 2 zeigt den Blockaufbau O Wh
89. der Energie der einfallenden radioaktiven Strahlung ist Es ist also auch m glich obwohl in der Praxis eher selten erforderlich auf einer Me platte unterschiedliche Radionuklide nachzuweisen Das Z hlrohr ist an seiner Unterseite offen so da auch schwachenergetische oder B Strahlung zu erfassen ist 1 Rekombination 2 Ionisationskammerbereich S ttigung 3 Proportionalbereich 4 bergangsbereich 5 GM Bereich b st rker ionisierendes Teilchen 6 Dauerentladung Z hlrohr Spannung lonisationsstrom in Abh ngigkeit von der anliegenden Spannung eines Iomisations detektors Abb 16 1 Die ortsempfindliche Arbeitsweise des Z hlrohrs wird dadurch erreicht da im Z hl rohr ein positiv geladener Anodendraht und einige Kathodendr hte in L ngsrichtung ca 20 cm gespannt sind Tritt nun durch das an seiner Unterseite offene mit unter schiedlichen Schlitzblenden versehene Z hlrohr radioaktive Strahlung ein wird das Versuch 16 Radioscanner 157 st ndig nachgef hrte Z hlgas Methan Argon s o ionisiert Die dabei freigesetzten Elektronen werden zum Anodendraht hin stark beschleunigt und erreichen ihn an der Stelle der Aussendung der radioaktiven Strahlung Im Anodendraht entsteht ein Elek tronenstrom dessen Laufzeit bis zur nachgeschalteten Elektronik proportional ist dem Ort des Eintritts der Radioaktivit tsstrahlung In einem Zeitanalysator werden diese Laufzeit Unterschiede gemessen und zur Ortsbestim
90. det e Nach Ende der Messung kann zun chst eine Untergrund Korrektur vorgenommen werden Danach werden die Stellen am Bildschirm mit ausgewiesener Radioakti vit t markiert entweder mittels Ellipse oder Rechteck wonach die einzelnen Flecken integriert werden k nnen Dabei kann es von Vorteil sein nur bestimmte Teile der Gesamtbildes auf dem Bildschirm darzustellen f Die Ergebnisse der Integration einzelner Flecken in IpM sind in die unter D Auswertung vorbereitete Tabelle einzutragen D Auswertung a Zur Einsch tzung der Aufl sung des TLC Scanners wurde ein aliquoter Teil der radioaktiv markierten Tinte auch im LSC gemessen 20ul wiesen eine Zerfallsrate von 559845 DpM auf b Zur Auswertung die Integrationsergebnisse in folgende Tabelle eintragen und im Vergleich zur LSC Messung die Ausbeute im Proportional Z hlrohr f r 14C errechnen Tinten Volumen Zerfalls Z hl Errechnete fleck Tinte rate LSC rate Ausbeute Nr ul DpM IpM 20 559845 Mittlere Ausbeute Versuch 16 Radioscanner 160 Versuch 17 y Spektroskopie 161 6 Arbeitstag Identifizierung und Radioaktivit ts Bestimmung von y Nukliden in Nahrungsmitteln z B getrocknete Pilze N sse Milchpulver Tee etc mit einem Na TI J y Spektrometer Versuchsziel Einf hrung in die Arbeitsweise eines y Spektrometers mit Vielkanal Me vorrichtung A Prinzip Die y Spektrometrie mit Na Tl J Kristall Scintillations Z hlrohren ist auch h
91. durch Eichung wird aus der Z hlrate die Zerfallsrate Die Eichung erfolgt indem unter genau gleichen apparativen Bedingungen wie bei der Probemessung und bei Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 139 gleicher physikalischer Beschaffenheit wie bei der Probe eine oder mehrere Standardprobe n mit bekannter Zerfallsrate Radioaktivit t gemessen wird werden Eine Me reihe habe z B folgende Ergebnisse erbracht Z hlrate Probe 1000 IpM 1 Z hlrate Standard 10000 IpM 1 0 1 uCi 1 Ci Curie 2 2210 Zerf lle pro Minuten DpM daher entspricht 0 1 pCi 2 2210 DpM Es mu also folgende Beziehung gelten die nach den Regeln eines Dreisatzes aufzul sen ist 2 2210 DpM 10000 IpM X DpM 1000 IpM 1000 X DpM 2 22 10 e DpM DpM Te pM X DpM 2 22e10 DpM Anmerkung Die g ltige Einheit der Radioaktivit t ist das Becquerel Bq die Einheit Curie wird aber immer noch verwendet 1 Bq 1 Zerfall Sekunde 37000 Bq 37kBq 2 2210 DpM 1 uCi Nun ist schlie lich die Zerfallsrate die Strahlungsintensit t die Radioaktivit t einer Probe ermittelt Es fehlen nur noch einige Gesichtspunkte die man sich zur Interpretation eines Ergebnisses aus der Radiochemie zunutze machen sollte a Bei der Untersuchung der Pilzprobe interessierte beispielsweise welche Radioak tivit t in welcher Pilzmenge frisch oder trocken enthalten ist und welche Menge
92. dwert gemessen wird JO 7 CHOH u HO OH Q CH kochen 3 Pentose gt Furfural Orcin ee H ions produkt gr n Dabei ist zu beachten bei Ansatz einer Eichkurve jeweils die zu bestimmenden Sub stanzen zu verwenden da z B Desoxypentosen in DNA nur einen Bruchteil der bei RNA resultierenden Farbintensit t mit Orcin ergeben B Material und Ger te B1 Erstellung von RNA und AMP Eichkurven a RNA Stamml sung in Puffer Konzentration 1000 pg ml b AMP Stamml sung in Puffer Konzentration 100 ug ml c 100ml Me kolben zum Ansatz von 3 Eichl sungen unterschiedli cher Konzentration s u d _Phosphat Puffer pH 6 7 zum Ansatz der Eichl sungen e graduierte Reagensgl ser 4ml Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 50 f vorbereitetes Orcin Reagens 0 1g Fe D Cl2 wird in 100 ml 36 iger HCl gel st Vor Gebrauch versetzt man diese L sung mit 0 01 g Orcin ml g Wasserbad bei 100 C h Fotometer bei 670 nm B2 Elution der Sephadex G 25 S ule und Bestimmung der Menge an RNA und AMP im S uleneluat a bereits vorbereitete Sephadex G 25 S ule b Phosphat Puffer pH 6 7 zur Elution c graduierte Reagensgl ser 4ml d _ungraduierte Reagensgl ser e Orcin Reagens 0 1g Fe IDCl gt wird in 100 ml 36 iger HCl gel st Vor Ge brauch versetzt man diese L sung mit 0 01 g Orcin ml f Wasserbad bei 100 C g Fotometer bei 670 nm h 2 10ml Me kolben zur Sammlung
93. e Babynahrungsgl ser und Einmachgl ser die mit 50 ml bzw 100 ml Medium bef llt werden 18 1 3 N hrmedium Die Zusammensetzung des N hrmediums ist folgender bersicht zu entnehmen Das N hrmedium wird vollst ndig angesetzt und dann der pH Wert mit Hilfe von HCl bzw NaOH auf 5 7 eingestellt Die anschlie ende Sterilisation des N hrmediums und anderer Fl ssigkeiten erfolgt durch Autoklavieren bei 121 C und 1 1 bar f r 30 Min Glassachen und Bestecke werden im Trockenschrank bei 150 C f r 4 Stunden sterilisiert Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 176 Die verwendeten Stamml sungen zum Ansatz der N hrmedien haben folgende Zusammensetzung Stamml sung B5 Gamborg et al 1968 ad 1 1 Aqua dest a Makroelemente NaH PO 2H gt 0 1 50 g KNO 30 008 NH4 2SO 1 34g MgSO 7H2O 5 008 CaCl 2H 0 1 508 b Mikroelemente MnSO 7H gt 0 100 00 mg H BO 5 H O 30 00 mg ZnSO 7H O 20 00 mg Na MoO 2H O 2 50 mg CuSO 5H O 0 25 mg KJ 7 50 mg Fe L sung ad 1 1 Aqua dest Fe EDTA 4 638 Mg L sung ad 11 Aqua dest MgSO 7H2O 36 008 Vitaminl sung ad 100 ml Aqua dest Nikotins ure 50 00 mg Thiamin 10 00 mg Pyridoxin 10 00 mg Hormonl sungen jeweils ad 100 ml Aqua dest myo Inosit 500 00 mg 2 4 D 10 00 mg in ca 1 ml abs Ethanol vor l sen N hrl sung nach Gamborg et al 1968 modifiziert nach Sch fer et al 1988 Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 177 Zusammen
94. e Empfindlichkeit Ec des WLD f r eine bestimmte Substanz ist mVolt Beim WLD sind Nachweisgrenzen in der Gr enordnung von 10 8 bis 10 9 g Substanz pro ml Tr gergas zu erreichen Auch die Temperatur des WLD mu wie beim Einspritzblock um ca 30 50 C h her sein als die der GC S ule wobei die S ulentemperatur in einem temperierbaren S ulenofen s Abb 3 1 G je nach der Verdampfbarkeit der Probensubstanzen einzustellen ist Dabei kann es bei schwierigen Trennproblemen auch durchaus notwendig sein die S ulentemperatur im Verlauf eines Chromatogramms in zeitlich definierten Schritten auf h here Temperaturen hochzufahren Temperaturprogramm F r unsere Trennaufgabe arbeiten wir jedoch isotherm d h die S ulentemperatur verbleibt im Verlauf der Gaschromatografie konstant Die Zuf hrung des Tr gergases s Abb 3 1 A D erfolgt aus einer Druckflasche mit Druckminderventil ber ein Nadelventil zur Feinjustierung Dabei mu gew hrleistet sein da der Tr gergasstrom konstant und mit definierter Durchflu rate zur Verf gung steht Der Tr gergasdurchflu wird mittels Str mungsmesser s Abb 3 1 J auf den gew nschten Wert eingestellt Wichtig dabei ist da alle gasf hrenden Teile des Gaschromatografen also Einspritzblock S ule und Detektor gasdicht verbunden sind ansonsten w ren unreproduzierbare Ergebnisse zu erwarten Alle Verschraubungen des Gassystems sind daher auf Dichtheit zu berpr fen Seifenblas
95. e Prinzip zugrunde W hrend der Chromatografie erfolgt eine kontinuierliche Verteilung eines Substanzgemisches innerhalb eines Zwei Phasen Systems welches aus einer unbeweglichen station ren Phase und einer beweglichen mobilen Phase besteht Bei der Gaschromatografie ist die mobile Phase das mit definierter Flu rate durch die S ule stromende Tr ger Gas hier Helium w hrend die station re Phase entweder aus geeigneten Feststoffen mit gro er sorbierender Oberfl che GSC gas solid chromatography bestehen kann oder aus hochsiedenden Fl ssigkeiten die an nicht sorptionsf higen Feststoffen gebunden sind GLC gas liquid chromatography Im berwiegenden Umfang wird heute die GLC angewendet Der stoffspezifische Verteilungskoeffizient a s auch S 1 _ Konz station re Phase Konz mobile Phase entscheidet dar ber wie schnell eine Substanz die GC S ule wieder verl t Eine Substanz mit sehr kleinem a Wert hohe Konzentration in mobiler Gas Phase bei kleiner Konzentration in station rer Phase verl t die GC S ule sehr rasch w hrend eine Substanz mit hohem a Wert hohe Konzentration in station rer Phase bei kleiner Konzentration in Gas Phase in der GC S ule stark retardiert wird Daraus re sultiert bei einem vorgegebenen Substanzgemisch die Trennung einzelner Substanzen wobei es allerdings einer l ngeren Methodenentwicklung bedarf die Konditionen der mobilen und station ren Phase an das Trennprob
96. e T DNA sowie einen Block von Genen vir Region die mit der Infektiosit t des Bakteriums im Zusammenhang stehen Nach einem spezifischen Schnitt in die Donor DNA wird ein durch Protein gesch tzter DNA Bereich hier T DNA in die Akzeptor Zelle und dort in den Zellkern transferiert Auf den Transport der Fremd DNA zum Kern spezialisierte Proteine unterst tzen diesen Vorgang Als Startsignal f r die Etablierung der Wechselwirkung fungiert eine phenolische Verbindung die von der Pflanze produziert worden ist z B ein Acetophenon Dieses Signal wird von einem Rezeptor auf der Cytoplasma Membran des Bakteriums erkannt und weitergeleitet In der Folge wird ein Transkriptionsfaktor aktiviert der wiederum andere Gene der vir Region aktiviert Versuch 21 Transformation Pfl Zellen 201 Ti Plasmide k nnen unter bestimmten Umst nden aus Bakterien isoliert bzw in Bakterien aufgenommen werden ohne da dadurch die berlebensf higkeit der Bakterien beeinflu t wird Gentechniker erkannten da jedes fremde DNA St ck das in die T DNA des Ti Plasmids eingebaut wird mit diesem zusammen bertragen wird Um diese Form des Gentransfers f r praktische Z chtungszwecke nutzen zu k nnen mu ten jedoch eine Reihe von Modifikationen vorgenommen werden Vor allem war es notwendig die T DNA zu entsch rfen um eine Tumorbildung bei der Pflanze zu verhindern Die T DNA von Plasmid pPCV812 enth lt folgende Gene die in Pflanzenzellen eingebaut werden
97. e w ssrige Phase wird in ein steriles Eppendorfreaktionsgef berf hrt und mit einem entsprechenden Volumen Chloroform Isoamylalkohol 24 1 gemischt und ausgeschiittelt anschlie end bei 13000 Upm f r 3 Min zentrifugiert Danach wird die obere Phase in ein steriles Eppendorfreaktionsgef berf hrt und mit Isopropanol gef llt 19 6 2 F llung der DNA mit Isopropanol Zur Erh hung der Konzentration mu die DNA nach der Reinigung gef llt und in kleineren Volumen aufgenommen werden Zu der DNA L sung wird 1 10 des Volumens 3 M Na Acetat L sung pH 6 0 und 2 3 v v Isopropanol gegeben Die Mischung wird gut gesch ttelt und einige Minuten auf Eis gelegt Danach wird die DNA mittels Zentrifugation sedimentiert 15 Min bei 13000 Upm Nach Trocknung in TE Puffer pH 7 6 oder in autoklaviertem bidest Wasser l sen anschlie end die Konzentration bestimmen und bei 18 C lagern 19 7 Quantitative und qualitative Bestimmung des DNA Gehaltes Um eine quantitative wie qualitative Einsch tzung des DNA Gehaltes in der L sung vornehmen zu k nnen wird ein Aliquot der L sung auf 1 100 verd nnt Dann wird die Absorptionsmessung in Quarzk vetten im Spektralphotometer durchgef hrt Die Menge an Rein DNA ist direkt propotional der optischen Dichte OD der L sung bei einer Wellenl nge von 260 nm Eine OD 260 nm von 1 0 entspricht einer DNA Konzentration von 50 ug ml Um die Qualit t der DNA bestimmen zu k nnen wird eine verg
98. edoch erneut aufzukochen und gegebenenfalls DTT zu zusetzen C2 Ger te Vorbereitung und Elektrophorese s Versuch 10 a Das SDS PAG in Glaskasetten mit Klammer versehen auf Lufteinschl sse achten und einen Plastik Probenkamm mit 12 Probentaschen leicht in das Gel eindriik ken b Die Gelkasette in die Silikongummi Dichtung des oberen Puffertrogs vorsichtig einschieben die leicht mit Silikonpaste eingefettet wird Das Gel soll die einzige Verbindung zwischen oberem und unterem Puffergef bilden c Den unteren Puffertrog mit ca 700ml TTS Puffer 4 bef llen d Den oberen Pufferbeh lter mit Gel in das untere Pufferreservoir einsetzen und die Puffer Einf llh he unten einjustieren e Auch den oberen Puffertrog zun chst mit wenig TTS Puffer f llen Mittels Pasteur Pipette und Gummiball sind eventuell verbliebene Luftblasen im Probenkamm von oben in das Gel schauen durch einen kr ftigen Pufferstrom zu entfernen f Die Protein Proben und Marker Proteine mittels Eppendorf Varipipette vorsichtig applizieren dabei f r jede Probe eine neue Pipetten Spitze verwenden Die Versuch 11 Elektrophorese SDS 115 Saccharose Zugabe zum Proben Puffer verhindert hierbei die Vermischung der Proben mit dem Elektroden Puffer Bei der Proben Beschickung nach folgendem Schema verfahren wobei man sich notiert welche Probe wo aufgetragen werden soll 1 u 2 und 11 u 12 Probentasche jeweils frei lassen 3 u 4 und 9
99. ehr oder weniger ma ge schneiderte Pflanzenarten herzustellen darf nicht vergessen werden da damit le diglich genetisches Rohmaterial gewonnen werden kann das noch der z chteri schen Bearbeitung bedarf bevor den praktischen Landwirten Saatgut f r den Feldan bau zur Verf gung gestellt werden kann Heute werden jedoch bereits in der Welt insbesondere in den USA hunderttausende ha mit gentechnisch bearbeiteten Nutz pflanzen Mais Soja u a angebaut Praktikumsteile I Chromatografische Verfahren und Enzym Analytik und II Radiobiochemie Organisation Soweit die theoretischen Grundlagen bei den im folgenden aufgef hrten Versuchen und Reaktionen bereits in der Biochemie Vorlesung besprochen wurden wird auf deren Abhandlung bei den Versuchsanleitungen verzichtet W hrend einige Versuche jeweils an einem Nachmittag abgeschlossen werden erstrecken sich manche Versuche z B 1 3 5 8 und 9 z T ber mehrere Praktikum stage Bei der Versuchsvorbereitung sollte dies beachtet werden damit der Kontext erhalten bleibt Bei der praktischen Durchf hrung der Versuche bilden jeweils acht Studenten eine Arbeitsgruppe die von einem Betreuer angeleitet wird Dabei bearbeiten jeweils 2 4 oder 8 Studenten im teamwork eine Versuchsfrage gleichzeitig wobei die Konzen trationsstufe der Proben unterschiedlich ist i Protokollf hrung Uber Prinzip Verlauf und Ergebnis aller Versuche ist von jedem Praktikumsteilneh mer e
100. ein DpM C mg Protein nach Puls Phase nach Chase Phase Protein A 800000 400000 Protein B 700000 600000 Ergebnis Protein B ist demnach metabolisch stabiler als Protein A Wurde z B f r die Pulse Phase C markiertes Leucin verwendet so kann unter Ber cksichtigung seiner zu Versuchsbeginn vorliegenden spezifischen Radioaktivit t nach Ermittlung der Leucin Konzentration in beiden Proteinen auch dessen Konzentration in den beiden Proteinen berechnet werden Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 142 Tab 14 1 Me werte f r Abb 14 1 14 2 WOONAUAUNE 3 3 2 2 1 3 3 3 4 8 L 1 4 1 1 2 2 4 1 1 2 2 2 1 3 2 1 oO 2 4 2 2 3 1 1 3 2 1 4 1 oO 3 5 2 4 2 4 4 2 1 bzw Absolute H ufigkeit prozentuale Wahrscheinlichke t Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 143 Abb 14 1 MeBzeit 0 015 Minuten Mittelwert Standar dabu p Werte H ufigkeit Poisson Ver teilung Normal Verteilung Klasseneinteiluna bzw Absolute H ufigkeit prozentuale Wahrscheinlichkeit Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 20 Abb 14 2 Me zeit 1 000 Minuten 160 0 ll Mittelwert Standar dabu By Werte H ufigkeit Normal Verteilung 120 130 140 150 160 170 180 190 0 Klasseneinteilung ee 144 200 Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 145 6 Arbeitstag Bestim
101. einzelner Sephadex Fraktionen 1 Reinsubstanz Probe mit RNA und AMP C Durchf hrung C1 Erstellung von RNA und AMP Eichkurven jeweils 4 Studenten a Aus der RNA Stamml sung 10 5 und 2 5 ml mit sauberer Pipette in entsprechend beschriftete 100ml Me kolben pipettieren mit Phosphat Puffer zur Marke auf f llen mit Stopfen verschlie en und intensiv mischen Wir erhalten 3 Eichl sun gen mit den Konzentrationen von 100 50 und 25 ug ml RNA b In gleicher Weise aus der AMP Stamml sung 50 25 und 5 ml in 3 weitere Me kolben pipettieren Dies ergibt 3 Eichl sungen mit einer AMP Konzentration von 50 25 und 5 ug ml c Nach guter Durchmischung dieser Eichl sungen pipettiert man aus jeder Eich l sung jeweils dreimal je 1 ml in ein graduiertes beschriftetes Reagensglas f gt je 1 ml Orcin Reagens hinzu Pipettierhilfe verwenden und kocht den Ansatz 45 Minuten im Wasserbad Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 51 d F r die RNA und AMP Eichung ist je ein Blindwert aus 1 ml Phosphat Puffer in einem graduierten Reagensglas anzusetzen und nach c wie die Proben mit 1 ml Orcin Reagens zu kochen d Nach Abk hlen der Reagensgl ser unter flie endem Leitungswasser wird mit A dest zur Marke 4 ml aufgef llt gut gemischt und im Fotometer bei 670 nm gegen den Blindwert gemessen e Die gemessenen Extinktionswerte in die unter D1 Auswertung aufgef hrte Ta belle eintragen C2 Sephadex G 25 Gelfiltration von RNA und AMP
102. ektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 20 Konjugation 190 Transformation in E coli zur Konjugation Plasmidvermehrung in E coli S17 1 Plasmidisolierung Mini Prep Reinigung der Plasmid DNA quant und qualit Bestimmung des DNA Gehaltes Identifizierung des Plasmid pPCV 812 durch Verdau mit Restriktionsenzym EcoRV Gelelektrophorese Vorbereitung f r Konjugation mit A tumefaciens siehe 2 Praktikumstag Versuch 20 Konjugation 191 20 1 Identifizierung des Plasmids pPCV 812 Um die Identit t eines Plasmids zu berpr fen sollte man es mit entsprechenden Endonucleasen Restriktionsenzyme verdauen schneiden Hier ist zu ber cksichtigen da sich noch eine erhebliche Menge an RNA in der Plasmidpr paration befinden kann Daher wird zum Restriktionsenzymverdau simultan ein Abbau der RNA mittels zugesetzter RNase A durchgef hrt Auch st ren Verunreinigungen Proteine Phenol etc so da die verwendete Menge an Restriktionsenzym relativ hoch ist Im Praktikum wird das Plasmid pPCV 812 durch das Enzym EcoRV dieses Enzym schneidet das Plasmid an 3 Stellen verdaut Reaktionsansatz DNA L sung 0 5 1 0 mg 10 ul 10x TBE Puffer 2 ul Enzym EcoRV 5 10 u 05 ul bidest Wasser 75 ul 20 ul 1 1 5
103. elwerten der Eichfaktoren fiir RNA und AMP ist die Konzentration dieser beiden Substanzen in den gesammelten Sephadex Fraktionen zu bestimmen s D2 D2 Auswertung der Sephadex Gelfiltration a Die Extinktionen der einzelnen Sephadex Fraktionen nach Reaktion mit dem Orcin Reagens k nnen zun chst in die vorbereitete Tabelle s u eingetragen werden b Mit diesen Extinktionswerten ist ein Sephadex Elutionsprofil zu zeichnen Dabei auf der Abszisse die Fraktionsnummern und auf der Ordinate die zugeh rigen Extinktionswerte eintragen c Anhand des Elutionsprofils wird unter Mithilfe der Betreuer entschieden welche Fraktionen auf RNA und AMP entfallen d Mit den Mittelwerten der Eichfaktoren s D1 f r RNA und AMP k nnen nun die RNA und AMP Gehalte pro ml aufgetragener Probe in den zugeh rigen Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 55 Sephadex Fraktionen nach den auf S 55 56 aufgef hrten Formeln berechnet werden Fraktion _Extinktion Fraktion _Extinktion Fraktion _Extinktion 25 43 26 44 27 45 28 46 29 47 30 48 31 49 32 50 33 51 34 52 35 53 36 54 37 55 38 39 40 41 42 Extinktionen aller RNA Fraktionen Extinktionen aller AMP Fraktionen Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 56 Extinktionen aller RNA Fraktionen EF RNA 10 ug ml RNA 22 2 2 2222 nn nn 20 Extinktionen aller AMP Fraktionen EF AMP 10 ug ml AMP 2 222 nn 20
104. ema s S 121 in die wells einer Mirkotiterplatte pipettiert Die beschickte Platte wird 18 Stunden bei 4 C im Dunklen inkubiert 120 ELISA Versuch 12 VSITA In gwaps ongadig SE 1u 3nor 0 mas quron o ain ju aHgy o mes ung ae 1w srigo any purigo fe nn Be wrlgs o u rlgs o jw arigc 0 jwysr z 0 jw sricz 0 jwyaricz0 WOMIT MT Versuch 12 ELISA 121 Nach mehrmaligem Nachwaschen der Platte mit Waschpuffer erfolgt das Blockieren freier Bindungsstellen auf der inneren well Oberfl che der Titerplatte mit einer 5 igen L sung von Rinderserum Albumin Nach einst ndiger Inkubation bei Raum temperatur erfolgt abermals ein Waschproze Nun erfogt die Bindung des als 1 AK verwendeten Anti Rubisco Antiserums an das Antigen in den wells der Titerplatte w hrend einer 1 5 Stunden dauernden Inkubation bei 25 C in Wasserdampf ges ttigter Atmosph re wonach nicht gebundener 1 AK abermals dreimal mit Waschpuffer auszuwaschen ist W hrend diese Vorarbeiten in Anbetracht zu kurzer Zeit am Praktikumsnachmittag noch im Institut durchgef hrt werden werden die folgenden Arbeitsschritte im Praktikum ausgef hrt Nachweis Reaktion a Bindung des 2 AK Ziegen Anti Kaninchen AK gekoppelt an Alkalische Phosphatase Verd nnung 1 1000 e 1 Std Inkubation bei 25 C und Auswaschen von nicht gebundenem 2 AK durch 3x Waschen mit Waschpuffer f Start der Enzym Substrat Reaktion des geko
105. en Bindungskr fte des F llmaterials zur Trennung f hren wirken z B bei der Aus tausch Chromatografie meistens mit Kunstharz als S ulenf llmaterial zus tzlich stark pH abh ngige elektrochemische Kr fte Es kommt somit zu einer direkten chemischen Reaktion zwischen den zu trennenden Substanzen und der speziellen Tr gersubstanz Dabei tritt ein Austausch von Anionen oder Kationen entsprechend der Ladung des verwendeten F llmaterials mit dem Tr germaterial ein wodurch eine Anreicherung der einen oder anderen Substanz an der station ren Phase erzielt werden kann 1 4 D nnschichtchromatografie DC Je nach der verwendeten Tr gersubstanz kommen auch bei der D nnschichtchroma tografie Verteilungs Adsorptions oder Austauscheffekte zur Wirkung so da man die DC gewisserma en als offene Chromatografies ule bezeichnen kann Die meist verwendeten Tr gersubstanzen f r die station re Phase sind Kieselgel Aluminiumoxid oder auch Austauschermaterialien also elektrochemisch geladene Kunstharze wie bei der Austausch Chromatografie die auf Glasplatten oder z B auf d nner Kunststoff oder Alufolie aufgebracht sind Die DC bildet eine wertvolle Er g nzung zur S ulen und Papierchromatografie vor allem f r qualitative Untersu chungszwecke im Labor Ihr Vorteil liegt darin da eine verh ltnism ig scharfe Trennung des zu untersuchenden Substanzgemisches in relativ kurzer Zeit erzielt werden kann Au erdem k nnen sowohl ag
106. en die substanzspezifischen Proportionali t tsfaktoren anhand von Standards zu bestimmen sind Einf hrung in die Gaschromatografie 21 OF BORSA DHSOOwR bb 3 Aufbauschema eines Gaschromatographen Stahlflasche mit Tr gergas Aus Druckreduzierventil Nadelventil zur Feinregulierung der Gasstr mung Wohlrab A l I 82 Manometer das den Gasdruck am S uleneingang anzeigt Einspritzblock Trenns ule Thermostat S ulenofen Detektor Detektorausgang Str mungsmesser Teil mit elektrischen Bauelementen Schreiber Geh use in dem sich das Heizelement des Thermostats mit Tangentialgeblase zur Luftumwalzur befindet Spritze zur Probeneingabe Flaschenventil Einf hrung in die Gaschromatografie Tr gergas j 2 vi ANSAN AR Aus WOHLRAB A 1982 ASAT OSA 28 il ow Abb 3 2 Der W rmeleitf higkeitsdetektor D VZ MZ y R R R R aufheizbarer Detektorblock Vergleichszelle Me zelle Verschraubung Hitzdraht der Vergleichszelle Hitzdraht der Me zelle Widerst nde Spannungsteiler regulierbarer Widerstand zur Regulien der Temperatur des Widerstands drahtes R Ry Batterie Schalter Einspritzblock Trenns ule Einf hrung in die Gaschromatografie 29 Beim WLD besteht zwischen dem Detektorsignal S und der Stoffkonzentration c der Zusammenhang Se E c wobei Ec ein Detektor und Substanz spezifischer Proportionalit tsfaktor ist Di
107. entechnikern gezielt benutzt Die prokaryontische Parasexualit t erfolgt nach folgenden Mechanismen 1 genetische Transformation 2 Transfektion 3 Transduktion Konjugation Auf dem Donorplasmid von E coli und dem Rezeptorplasmid von A tum m ssen homologe Bereiche als Vorraussetzung f r die Rekombination und Co Integration der manipulierten DNA aus E coli in das Ti Plasmid Rezeptorplasmid von A tum existieren E coli als Donor besitzt ein Plasmid sog Helferplasmid mit Transfer tra und Mobilisierungs mob Eigenschaften die den Transfer des gew nschten Plasmidabschnittes in A tum erm glicht Versuch 20 Konjugation 194 Versuch 20 Konjugation 195 4 Arbeitstag bersicht zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 20 Konjugation 196 Nachweis des durch Konjugation bertragenen Plasmids in Agrobakterium tumefaciens Plasmidvermehrug von
108. entest F Einf hrende Literatur KAISER R 1973 Chromatographie in der Gasphase 5 B nde B I Hochschultaschenb cher Mannheim Einf hrung in die Gaschromatografie WOHLRAB A 1982 Gaschromatographie Diesterweg Salle Sauerl nder 30 Versuch 3 Gaschromatografie allgemein 31 1 Arbeitstag Qualitative Untersuchung zum Retentionsverhalten von Substanzen in der Gaschromatografie am Beispiel der homologen Reihe Methanol thanol und n Propanol Versuchsziel Einf hrung in die Gaschromatografie A Prinzip s Einf hrung s S 25 Al Vorbemerkungen Der vorhandene Gaschromatograf hat zwei Chromatografies ulen eingebaut W hrend die rechte S ule zur Trennung unpolarer Substanzen verwendet werden kann OV 101 als Trennfl ssigkeit auf Chromosorb als Tr germaterial verf gt die linke S ule nur ber das sorptionsf hige Tr germaterial Chromosorb 102 ohne Beladung mit einer Trennfl ssigkeit Diese GC S ule ist zur Trennung polarer Substanzen geeignet ber die Eigenschaften von Chromosorb 102 informiert folgende Tabelle aus R KAISER Chromatographie in der Gasphase Teil HI Wie in der Einf hrung beschrieben sollte die Retentionszeit einer Substanz bei definierten gaschromatografischen Bedingungen konstant sein und zur Identifizierung einer Substanz dienen Dabei ist die Retentionszeit einer Substanz von deren Verteilungskoeffizienten s o S 1 in einem Zwei Phasen System in unserem Fa
109. er Protein und Enzym spezifischer Anf rbung der Elektropherogramme Versuch 11 SDS Elektrophorese des Pr parates der Sauren Phosphatase unter denaturierenden Bedingungen zur Bestimmung des Molekular gewichtes anhand von Referenz Proteinen Elektrophorese bedeutet Wanderung geladener Substanzen im elektrischen Feld wobei sich Kationen zur Kathode Pol und Anionen zur Anode Pol bewegen Dieses Verfahren wird als biochemische Standardmethode z B in der analytischen und pr parativen Proteinchemie zur DNA Sequenzierung und Trennung von DNA Bruchst cken eingesetzt s S 186 F r die Beweglichkeit eines geladenen Molek ls im elektrischen Feld ist eine Reihe von Faktoren bestimmend Zun chst einmal ist die treibende Kraft F die auf ein Molek l einwirkt direkt proportional der Gesamtladung Q dieses Molek ls und der St rke des elektrischen Feldes E d E wobei Feldst rke d cm Weiterhin wird sich ein Molek l im elektrischen Feld um so langsamer bewegen k nnen je gr er seine Reibung mit dem umgebenden Medium ist Dabei ist die Reibung umso gr er je gr er das wandernde Molek l und je viskoser das Medium ist STOKE sches Gesetz Auch die Form des Molek ls spielt hierbei eine wichtige Rolle s w u Der Einflu von Ladung und Gr e auf die elektrophoretische Beweglichkeit von Proteinmolek len bei als konstant angenommener Feldst rke ist schematisch aus Ab bildung 10 1 ersichtlich
110. er langen Zeitdauer bis zum Vorliegen eines Autoradiogramms hat man seit einiger Zeit Ger te entwickelt welche fl chige Objekte zur Messung ihrer Radioaktivit ts Verteilung an Z hlrohren schrittweise oder m anderf rmig vorbeibe wegen die sogenannten Radio aktivit ts scanner Hierzu wird z B eine D nn schichtplatte auf einem in X und Y Richtung motorisch steuerbaren Tisch befestigt Die w hrend des Scannens am Detektor anliegenden Signale werden auf Laborschreiber oder Integratoren protokolliert Neue Ger te arbeiten mit ortsempfindlichen Gas Durchflu Proportional Z hlrohren die auf einer Bahn eines Chromatogramms alle radioaktiven Ereignisse messen k n nen Die Signale des Z hlrohrs werden in einem Computer Bahn f r Bahn abgespei chert und k nnen mittels speziellem Programm zu einer fl chigen Darstellung am Versuch 16 Radioscanner 156 Bildschirm oder Drucker gelangen Nach diesem Prinzip arbeitet auch das uns zur Verf gung stehende Ger t Zun chst ist zu erkl ren wie ein Gas Durchflu Proportional Z hlrohr arbeitet Das Z hlrohr wird mit einem leicht zu ionisierenden Gas hier 10 Methan 90 Argon kontinuierlich durchstr mt Die angelegte Hochspannung bewirkt das Arbeiten im sogenannten Proportionalbereich der Z hlrohr Charakteristik s Abb 16 1 aus Kern und Strahlentechnik Lehrbriefe der Studiengemeinschaft Darmstadt Das bedeutet da die Amplitude des Z hlrohrsignals streng proportional
111. es Probenauftrags d thanol abs zum Reinigen der Hb Pipette e Gummiwischer f KMnO4 L sung und Filterpapier g F n h Laufmittel 1 Laufrichtung Wasserges ttigtes Phenol 150 g Phenol 50 ml Wasser 60 C 2 Laufrichtung Butanol Eisessig Wasser 200 25 100 ml C Durchf hrung je 4 Studenten a Jede 4er Gruppe hat vom 1 Arbeitstag Vorreinigung der Aminos ure Fraktion mittels Kationen Austauscher zwei Proben zur Verf gung Davon bitte eine Probe ausw hlen und die vermerkte Proben Konzentrationsstufe a b c oder d sofort in das Protokollheft schreiben b Da die Handhabung der zu verwendenden Pipette vom Probenauftrag auf die D nnschichtplatte bereits beherrscht wird nun die in einem Becherglas eingetrocknete Aminos ureprobe mit genau 2ml A dest aufnehmen die Aminos uren an der Glasinnenseite mit Gummiwischer l sen und 20ul davon portionsweise s o unter Trocknung mit dem F n auf das Chromatografiepapier am Auftragspunkt Kreuzungspunkt der beiden eingezeichneten Linien auftragen Dabei wird das Papier am Auftragspunkt auf ein Uhrglas gelegt damit die aufgetragene Probe an der Papierunterseite nicht abgesaugt wird durch darunter liegendes Papier etc und an anderer Stelle mit einem Uhrglas beschwert damit das Papier unter dem F n nicht flattert c Das Chromatografiepapier sollte dabei nur an der Seite gegen ber des Auftrags punkts mit den Fingern ber hrt werden damit nicht Aminos uren der H nde
112. etik TOW UOTE AYUSZUOM JPAYSANS OT G 0 l 1 1 i i 1 1 eben Gaus S5 wy O Td US 1UELI ST TSPeUYDTL I Ir U 2 9b ze Yaa Sense CTW AD A 15 Versuch 7 Enzymkinetik CIOWY 8G O H U I 4 97U M 1I LIu N ZI zn YS NZI FEIZZ 0O 8 LEISE O Y X G U A zuotssaubay UL QX S Bun yuansny YO d IANg 494e m ur CEJ rE A gy AZT Versuch 7 Enzymkinetik 76 E Literatur AHLERS J A ARNOLD R von DOHREN u H W PETER 1982 Enzym kinetik G Fischer Stuttgart BERGMAYER H U 1974 Methoden der enzymatischen Analyse Bd I und II Verlag Chemie Weinheim MATTENHEIMER H 1971 Die Theorie des enzymatischen Tests Boehringer Mannheim GmbH STRYER L 1994 Biochemie 2 korr Nachdruck Spektrum Akad Verlag VOET D u J G VOET 1992 Biochemie VCH Verlagsgesellschaft Weinheim Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 77 4 Arbeitstag Fortf hrung von Versuch 5 2 AT s S 41 Quantitative Auswertung der zwei dimensionalen Papierchromatografie der Aminos ure Fraktion von Versuch 1 1 AT s S 11 A Prinzip Die im Institut zwischenzeitlich chromatografierten Aminos uren sind zun chst unter standardisierten Bedingungen anzuf rben bevor ihre quantitative Bestimmung erfolgen kann Hierf r wird die Ninhydrin Reaktion s z B Karlson et al 1994 verwendet Sie verl uft dann quantitativ ab wenn
113. eute noch eine probate Methode zur Identifizierung von Nukliden mit y Strahlung und zur Bestimmung ihrer Strahlungsintensit t obgleich der Einsatz moderner hochreiner im Betrieb aber teurer K hlung mit fl ssigem Stickstoff Halbleiter Detektoren in Bezug auf ihre Me empfindlichkeit nicht bertroffen werden k nnen Sind z B in Nahrungsmitteln nur relativ wenige y Nuklide zu identifizieren z B in der Situation nach Tschernobyl sind Na Tl J Kristall Scintillations Detektoren f r diese Zwecke noch durchaus einsetzbar Die von Nukliden ausgesendete y Strahlung trifft zun chst auf den Kristall des Scintillations Z hlrohrs meist ein mit etwa 1 Tantal Tl dotierter NaJ Kristall Na TDJ Die Absorption der Yy Quanten infolge Photo Compton und Paarbildungs Effekt f hrt zu einer Anregung von Kristall Molek len und als Folge zu einer Aussendung von Lichtquanten Das emittierte Licht wird hnlich wie bei der LSC Messung an der Photokathode von Photomultipliern PM oder Sekund r Elektronen Vervielfachern SEV s S 149 in Photoelektronen umgesetzt s Abb 17 1 Der Elektronenstrom wird als Impuls in der nachgeschalteten Elektronik weiterverarbeitet und zur Anzeige gebracht Dabei ist festzuhalten da die Amplitude der im SEV erzeugten Impulse streng proportional ist der Energie der einfallenden y Strahlung so da eine Nuklid Identifikation ber sogenannte Im pulsh hen Analysatoren vorgenommen werden kann Die Arbeit mit Impuls
114. g ngige Verfahren ist die Glasmilch Methode Die Elution der DNA aus Agarose Gelst cken durch die Glasmilch Methode basiert auf der L slichkeit der Agarose in hoch konzentriertem Kalium bzw Natriumjodid Dabei wird die DNA isoliert indem die DNA Molek le sich an die Glaspartikeln heften Diese Methode ist schnell durchf hrbar und die dadurch isolierte DNA hat einen hohen Reinheitsgrad so da keine Phenol Chloroform Extraktion notwendig ist Bei dieser Methode ist die h chste Ausbeute bei der Isolierung von Fragmentgr en zwischen 300 3000 Basenparen zu erreichen Hierbei wird ein borationenfreies Puffersystem TAE verwendet da die Haftung der DNA Molek le an die Glaspartikel durch Borat Ionen gest rt wird Die klein geschnittenen DNA haltigen Agarosest cke werden mit dreifachem Volumen 6 M Natriumjodid L sung versetzt Durch 10miniitige Inkubation bei 55 C werden die Agarose Gelst cke aufgel st Abschlie end wird eine homogen gemischte Glaspartikelsuspension 5 ul pro 5 ug DNA dem Ansatz zugef gt Der Ansatz wird unter gelegentlichem Schwenken 15 min auf Eis inkubiert Dadurch wird die DNA an die Oberfl che der Silica Matrix adsorbiert Die Glaspartikel DNA Suspension wird durch kurze Abzentrifugtion 5 Sec bei 13000 rpm pelletiert und der berstand aus Natriumjodid und Agarose entfernt Das Pellet wird mit der Waschl sung durch dreimaliges Resuspendieren und Pelletieren gewaschen Die DNA wird durch zweimal wiederholte E
115. gemeinen Sicherheitsvorschriften des Instituts vorgesehenen Ma nahmen durchzuf hren Die Bedienung von Autoklaven ist ausschlie lich hierf r gesondert eingewiesenen Personen gestattet Die Betriebsanweisung Arbeiten mit Radioisotopen und Arbeiten mit ultravioletten Lichtquellen sind f r entsprechende Arbeiten einzuhalten Die Bedienungsanleitung des Autoklaven und der Zentrifugen sind einzuhalten Es ist ein Log Buch ber die im Labor vorhandenen GVO und die sonstigen biologischen Agenzien jegliche im Labor vorhandene gentechnisch ver nderte DNA und die damit durchgef hrten Arbeiten zu f hren Gentechnisch ver nderter Organismus 5 6 Telefonverzeichnis und Fluchtplan Projektleiter privat dienstl Beauftragter f r die Biologische Sicherheit dienstl Polizei Feuerwehr Universit ts Nummern Notarzt Notarztwagen Betriebs rztin Durchgangsarzt Intensivstation 6 2 6 3 Anhang 240 Augenklinik Uni Klinik Sonstige Krankenh user Als g ltige gesetzliche Vorschriften sind zu ber cksichtigen Sicherheitsfibel des Instituts G ltige gesetzliche Vorschriften Gentechnikgesetz Gentechniksicherheitsverordnung Aufzeichnungs verordnung Bundesseuchengesetz Gefahrstoffverordung Mutterschutzgesetz Arbeitsst ttenverordung Druckbeh lterverordnung Merkbl tter der zust ndigen Berufsgenossenschaft z B Sichere Biotechnologie Laboratorien B 002 ZH 1 342 Betrieb B 003 ZH 1 343 Viren B 0
116. gens c Folin Ciocalteu Phenol Reagens d 4 normale ca 20 ml fassende Reagensgl ser e Thermostat 30 C f Digital Fotometer Wellenl nge 578 nm B2 Enzymaktivitats Bestimmun Reagenzien und Probe rot beschriftet a amp Amylase Pr parat in Phosphat Citrat Puffer 0 1M pH 6 9 in gestufter Konzentration Ansatz Konzentration 1 100 Die am Arbeitsplatz vorgefundene Konzentrationsstufe sofort im Protokollheft vermerken sonst kann keine Bewertung der Ergebnisse erfolgen b St rke L sung in Phosphat Citrat Puffer c Dinitrosalicyls ure d 4 gro e ca 30 ml fassende Reagensgl ser e Thermostat 30 C und 100 C f Digital Fotometer Wellenl nge 546 nm C1 Durchf hrung der Protein Bestimmung Der Versuch wird mit 3 Parallelen und einem Blindwert fiir die kolorimetrische Analyse durchgef hrt Dabei werden der Blindwert L sung alle Reagentien au er der zu bestimmenden Substanz zugesetzt d h anstelle der Enzym L sung wird Phosphat Citrat Puffer verwendet a Ganz wichtig Haben Sie die Proben Konzentrationsstufe im Protokollheft vermerkt s o b Zu 1 ml amp Amylase L sung 3 Reagensgl ser mit Probe 1ml Puffer in Blindwert Reagensglas f gt man 5 ml Cu Tartrat Reagens B1 b zu mischt und l t den Ansatz f r genau 10 Min bei 30 C im Thermostaten reagieren c Nun f gt man zu jedem Reagensglas einzeln 0 5 ml Folin Reagens B1 c hinzu mischt jede Probe sofort intensiv durch
117. geringere Affinit t zu einer der beiden Phasen aufweisen Der Verteilungskoeffizient _ Konz station re Phase Konz mobile Phase ist bei jedem chromatografischen Verfahren der entscheidende Faktor f r die Trennung einzelner Substanzen eines Probengemisches Die station re Phase kann auch spezielle chemische oder physikochemische Beson derheiten aufweisen die mit bestimmten Stoffklassen w hrend der Chromatografie selektiv in Wechselwirkung treten z B Adsorption Absorption oder Ionenaustausch einzeln oder auch in Kombination Es hat sich eingeb rgert das chromatografische Verfahren nach diesen Spezialeffekten zu benennen Adsorptions Ionenaustausch Molekularsieb Chromatografie etc Beispielhaft soll die Adsorptionschromatografie im folgenden n her erl utert werden Seit TSWETT wurde dieses Verfahren in den zwanziger und drei iger Jahren weiter vervollkommnet und schlie lich auch auf nicht gef rbte Stoffe bertragen Da heute die Chromatografie eine so wichtige Rolle f r die biochemische Analytik spielt war jedoch erst durch Einf hrung der Papier Chromatografie durch CONSDEN GORDON und MARTIN in den vierziger Jahren m glich Zur Adsorptions Chromatografie verwendet werden verschiedene f r die jeweiligen Trennaufgaben besonders geeignete Adsorbentien die ggf vorbehandelt sein k nnen vorwiegend Aluminiumoxid aber auch z B Puderzucker Kieselgur und andere stark oberfl chenaktive Stoffe die oftmals in einer best
118. gr erten Ma stab 2 Die elektrophoretische Beweglichkeit einzelner Proteinbanden wird nun relativ zur Pufferfront Gel Ende mit dem Rf Wert s Versuche 4 und 5 charakterisiert wobei man die nach 1a oder 1b auf Papier bertragenen Strecken benutzt z B Strecke Gel Anfang bis Gel Ende a Strecke Gel Anfang bis Bande b Rr b a Somit erhalten einzelne Banden Positionen einen zur Pufferfront relativen Wert der zwischen 0 und 1 liegt 3 Durch die Errechnung von Rf Werten f r die nach beiden Verfahren gef rbten Elektropherogramme sollte es m glich sein Banden mit Phosphatase Aktivit t den Protein spezifisch gef rbten Banden zuzuordnen und zu entscheiden welche Proteinbanden auf Verunreinigungen des Pr parates der Sauren Phosphatase zur ckzuf hren sind Anmerkung Mittlerweile gibt es sehr leistungsf hige Me ger te Densitometer oder Bildauswerte systeme zur quantitativen Auswertung von z B Elektropherogrammen und D nnschicht Chromatogrammen sowohl im Hinblick auf die Ermittlung der Versuch 10 Elektrophorese nativ 112 relativen Beweglichkeit als auch auf die Bestimmung der relativen Farbintensit t getrennter Substanzen Ergebnis der Berechnung von Rg Werten f r die Protein Banden des nach zwei Verfahren angef rbten Elektropherogramms a Protein F rbung b S Phosphatase F rbung b a Rf b a Rf Bitte Protein Banden markieren die im Hinblick auf ihren Rf Wert in a und b bereinstimmen und dem
119. gressive Laufmittel Gemische als auch aggressive Spr h Reagenzien zum Nachweis und zur Identifizierung der getrennten Substanzen herangezogen werden was bei der Papierchromatografie nicht m glich ist 1 5 Elektrophorese Hochmolekulare biologische Substanzen wie z B Proteingemische oder Nukleins u re Fraktionen lassen sich mit Hilfe der Elektrophorese trennen Aber auch zur Sepa Einleitung 4 ration von niedermolekularen Stoffklassen wie z B Aminos uren u a kann oft die Elektrophorese als Erg nzung zur Papierchromatografie verwendet werden Bei der Elektrophorese erfolgt der Transport von Molek len auf einem gepufferten Papierstreifen oder in organischen Gelen im elektrischen Feld entsprechend ihrer La dung zur Anode oder Kathode Die an Elektroden angelegten Spannungen betragen 110 oder 220 Volt bei der Hochspannungs Elektrophorese sogar bis 10000 Volt und mehr w hrend die Stromst rke des elektrischen Feldes auf etwa 0 5 bis 1 0 Milliam pere gehalten wird Die Elektrophorese wird wie die Papierchromatografie in einem geschlossenen Gef durchgef hrt Die Verwendung verschiedener Puffer f hrt zu einer breiten Anwen dungsm glichkeit dieses Verfahrens Neben der Papier Elektrophorese bei der wie der Name schon sagt Papier als Tr germaterial verwendet wird sind heute auch Elektrophorese Verfahren bekannt bei denen andere Tr gerstoffe Polyacrylamid Gel Sepharose St rke Agarose etc mit Vorteil verwendet
120. h hen Analysatoren s Abb 17 2 ist sehr zeitaufwendig Das zur Selektion einzelner Impuls Amplituden einzustellende Fenster ist jeweils spezifisch zu setzen und die Anzahl der zugeh rigen Impulse am Me ger t abzulesen Ein Energiespektrum ergibt sich somit aus vielen einzelnen Me punkten s Abb 17 3 Versuch 17 y Spektroskopie 162 Abb 17 1 Aufbau eines Na Tl J Kristall Scintillations Detektors aus Petzold W u H Krieger 1988 Strahlenphysik Dosimetrie und Strahlenschutz Bd 1 B G Teubner Stuttgart a a a a i X Geh use No INT Tr aly sia sta Ach Pholokathode x N Ringschale l ee _ Mu Merait Multiplyer Abschirmung Versuch 17 y Spektroskopie 163 Abb 17 1 Fortsetzung Aufbau eines Na Tl J Kristall Scintillations Detektors aus Kern und Strahlentechnik Lehrbriefe der Studiengemeinschaft Darmstadt SEV Multiplyer Szintillationskristoll Fotohathode Oynoden Anode Lichtleiter lichtundurchl ssige Kapsel Versuch 17 y Spektroskopie 164 Abb 17 2 Aufbau eines Me platzes zur Impulsh hen Analyse Y Spektroskopie aus Petzold W u H Krieger 1988 Strahlenphysik Dosimetrie und Strahlenschutz Bd 1 B G Teubner Stuttgart Impulsh he Eichung Intensit t Energie gt Versuch 17 y Spektroskopie 165 Abb 17 3 Energiespektrum von 857s als Beispiel f r ein punktweise erstelltes Inpul
121. h quantitativ bestimmt Auf der Grundlage dieser S ulen Ionenaustausch Chromatografie wurden vollautomatische Methoden zur quantitati ven Aminos ure Bestimmung entwickelt Versuch 1 Ionenaustauschchromatografie 15 Will man wie in unserem Fall eine Stoffgruppe Aminos uren mittels Papierchromatografie trennen st ren z B stark hydrophile Substanzen wie Zucker oder andere Polyhydroxy Verbindungen bei der geplanten Chromatografie W rde man die Zucker vor der Chromatografie nicht entfernen h tte dies eine sehr schlechte Trennung der Aminos uren zur Folge Auch bei der Aufarbeitung biologischer Extrakte zur anschlie enden Chromatografie von Aminos uren wird das Verfahren der Kationen Austauschtrennung zur Vorreini gung der Aminos ure Fraktion verwendet B Material a Reinsubstanz Probe 5 Aminos uren 2 Zucker mit gestufter Konzentration b Kationen Austauscher DOWEX 50 x 4 100 200 mesh in einer Glass ule c IN HCl d 2N NH4OH e zwei 400ml Bechergl ser C Versuchsdurchf hrung a Die Austauscher S ule darf unter keinen Umst nden trockenlaufen Luftblasen in der S ule w rden an diesen Stellen den Zugang an die austauschf higen Gruppen ausschlie en wodurch man mit Substanzverlusten und einem schlech ten Trenneffekt rechnen m te b Die Reinsubstanz Probe a quantitativ in den Trichter der bereitstehenden Katio nen Austauscher S ule b berf hren Den S ulenauslauf ffnen und das Efluat in
122. hlossen Danach wird das Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 221 Hybridisierungsr hrchen in den Hybridisierungsofen eingelegt und f r mind 2 Stunden bei einer Temperatur von 65 C drehend inkubiert Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 228 22 9 Hybridisierung Nach der Pr hybridisierung wird die denaturierte Sonde zugesetzt und f r ca 12 Stunde bei 60 C inkubiert 22 9 1 Waschen der Membran Nach dem Ablauf der Hybridisierungszeit wird das Hybridisierungsglasr hrchen abgek hlt und dessen Inhalt in den Radioaktivit tsabfall entsorgt Die Membran wird noch in dem Hybridisierungsglasr hrchen f r 30 min bei Raumtemperatur mit einer L sung aus 2 x SSC 0 1 X SDS gewaschen anschlie end wird sie eingeschwei t und danach einem R ntgenfilm Hyperfilm MP Amersham exponiert Die nach der Waschzeit zu messende Hintergrundstrahlung bestimmt ob noch weiter gewaschen werden mu Man sollte aber nicht zuviel waschen da sonst die Oligonucleotidbindung die ja sehr schwach ist schnell abgewaschen wird Hier ist es ratsamer die Membran zuerst vorl ufig einer Fluorographie z B f r einige Stunden mit einer Verst rkerfolie Screen bei 70 C zu unterwerfen Sollten die Signale zu unspezifisch sein kann man immer noch weiter nachwaschen 22 10 Autoradiographie Der noch feuchte Filter wird in Plastikfolie eingeschwei t und in eine mit einem Intensifying Screen versehene DuPont Cronex Casset gelegt und mit einem R
123. hosphowolframat bestehende Folin Ciocalteu Phenol Reagens woraus eine intensiv blaue F rbung resultiert Die LOWRY Methode ist etwa um den Faktor 20 empfindlicher als die Biuret Methode allerdings etwas zeitaufwendiger Bei Zugabe des Folin Reagens ist es ganz wichtig darauf zu achten da die Probe sofort nach der Reagenszugabe intensiv gesch ttelt werden mu da das Folin Reagens nur im sauren pH Bereich best ndig ist der Reaktionsansatz jedoch durch die Komponenten der Biuret Reaktion stark basisch ist pH 10 Die Folin Reaktion mu demnach durch sofortiges Umsch tteln einer Probe einsetzen k nnen noch bevor das Folin Reagens im alkalischen pH Bereich zersetzt wird Beachtet man diese Zusammenh nge nicht erh lt man fehlerhafte Ergebnisse Anmerkung Da Enzymaktivit tsbestimmungen generell sehr viel empfindlicher sind als die Proteinbestimmungsmethode werden zur Enzymaktivit tsbestimmung 100 fach verd nnte Amylase Proben im Vergleich zur Proteinbestimmung ausgeteilt s Auswertung B Material und Ger te B1 Proteinbestimmung Reagenzien und Probe blau beschriftet a amp Amylase Pr parat in Phosphat Citrat Puffer 0 1M pH 6 9 in gestufter Konzentration Ansatz Konzentration 1 1 Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 20 Die am Arbeitsplatz vorgefundene Konzentrationsstufe sofort im Protokollheft vermerken sonst kann keine Bewertung der Ergebnisse erfolgen b Cu Tartrat Rea
124. hromosorb 102 s Tabelle 3 1 st rker retardiert wird Die Reihenfolge der Elution von der GC S ule ist daher Methanol thanol n Propanol und n Butanol Tabelle 3 1 Eigenschaften von Chromosorb 102 nach KAISER 1973 Bezeich Zusammen Vorbe Oberfl che Dichte nung setzung handlung m g g ml warme Extrak por ses Styrol tion 24h mit Chromo Divinylbenzol Aceton und sorb 102 Polymeres aus 24h mit n 300 400 0 20 R hm u Haas Hexan Aus Amberlite NAD 2 heizen 24h bis 300 C Versuch 3 Gaschromatografie allgemein 33 Zur genauen Bestimmung der Retentionszeiten ben tigen wir noch das Totvolumen der GC S ule d h das Volumen an Tr gergas welches sich nach Einspritzen der Probe zun chst noch in der S ule befindet Nach dem Einspritzen der Probe vergeht also noch eine bestimmte Zeit t t Zeit sec bis das Tr ger gas mit d r Probenkomponenten am t S ulenausgang Detektor dr ankommt Diese Zeit ist me bar wenn mit der Probe Luft in die S ule eingespritzt wird Luft bewegt sich gleich schnell wie Tr gergas durch die S ule und ist am Chromatogramm als kleiner Peak nach dem Einspritzen der Probe kenntlich Die Zeit zwischen Einspritzen der Probe und dem Luftpeak wird als Durchbruchszeit ta bezeichnet s Skizze und kennzeichnet das Volumen an Tr gergas in der S ule Die Gesamt Retentionszeit einer Substanz ta vermindert um ta f hrt zu der wahren Retentionszeit t T
125. hszelle VZ und Me zelle MZ voraus und basiert darauf da sich der elektrische Widerstand eines Hitzdrahtes aus Wolfram Rhenium Legierung dann ver ndert wenn im Tr gergasstrom eine Substanz aus der GC S ule mitgef hrt wird Dies ist darauf zur ckzuf hren da die W rme des Hitzdrahtes der Me zelle durch Substanzen in unterschiedlichem Ma e abgeleitet wird als vom Hitzdraht der Vergleichszelle durch die Tr gergas str mt Die Hitzdr hte von Me und Vergleichszelle sind in einer WHEATSTONE schen Br ckenschaltung WB mit verstellbaren Vergleichswiderst nden verschaltet die von einer konstanten Spannung gespeist wird Flie t nur Tr gergas aus der GC S ule wird die Diagonalspannung der Br cke s Abb 3 2 Punkte 1 u 2 mit einstellbaren Vergleichswiderst nden auf 0 abgeglichen Tritt danach eine Substanz aus der GC S ule so ergibt sich eine Spannungs nderung an der WB deren Amplitude ber einen Verst rker ver ndert werden kann Die im Verlauf der Gaschromatografie sich kontinuierlich ndernden Spannungsamplituden werden mittels Schreiber oder Analog Digital Wandler ADC durch einen Computer in Abh ngigkeit von der Zeit registriert Die Spannungs nderung an der WB ist dabei direkt proportional der Konzentration an getrennter Substanz Allerdings ist dabei zu beachten da jede Substanz bei definierter Konzentration eine unterschiedlich hohe Spannungs nderung am WLD ausl st so da f r quantitative Auswertung
126. hutzma nahmen oder eine Arbeitsplatzwechsel veranla t werden k nnen Verhalten im Labor Schutzkleidung und pers nliche Schutzma nahmen sind entsprechend sachgerechter guter mikrobiologischer Technik zu handhaben Vor Aufnahme der Arbeiten hat sich jeder Benutzer des Labors ber Standort und Funktion von Desinfektionsmittel Feuerl scheinrichtungen Erste Hilfe Einrichtungen Augenduschen K rperduschen sowie ber Fluchtplan zu informieren 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 2 11 2 12 2 13 2 14 2 15 Anhang 236 Die Labort ren und fenster sind w hrend des Arbeitens im Labor geschlossen zu halten Im Labor ist immer ein geschlossener kochbarer Laborkittel zu tragen dessen Armel nicht ber die Handgelenke hochgestreift oder gekrempelt werden d rfen Im Labor ist immer festes geschlossenes und trittsicheres Schuhwerk zu tragen Beim Arbeiten mit Arbeitsstoffen die bei Hautkontakt gesundheitsgef hrdend sein k nnen sind Einmalhandschuhe zu verwenden Einmalhandschuhe sind durch Umst lpen auszuziehen und d rfen nicht wiederverwendet werden Arbeitskleidung ist immer getrennt von der normalen Kleidung aufzubewahren Das Mundpipettieren ist im Labor untersagt Es m ssen mechanische Pipettierhilfen verwendet werden Das Labor soll aufger umt und saubergehalten werden Das Aufbewahren von nicht umittelbar im Labor ben tigten Gegenst nden im Labor ist zu ver
127. immten Reihenfolge ber einander geschichtet in Pulverform in ein senkrecht stehendes Glasrohr eingef llt werden Das in einem geeigneten L sungsmittel das auch Komponenten f r die sta Einleitung 2 tion re Phase enthalten kann z B Wasser s a Papier Chromatografie gel ste Sub stanzgemisch l t man durch das bef llte Chromatografierohr von oben her gege benenfalls unter Druck oder Sogwirkung die S ule passieren Die Substanz mit der h chsten Affinit t zum Adsorbens wird dabei in der obersten Zone des S ulenf llma terials adsorbiert Auf diese folgen dann entsprechend unterschiedlich hoher Affini t t zum Adsorbens die brigen Probenkomponenten Die dabei entstehenden Zonen oder Banden werden in geeigneter Weise gegebenenfalls durch Anf rbung soweit die Substanzen keine Eigenf rbung aufweisen identifiziert Werden in einer S ule verschiedene Adsorbentien schichtweise verwendet s o so wiederholt sich bei jeder Adsorbens Schicht diese Zonenbildung entsprechend der Adsorbensaffinit t s Verteilungskoeffizient der verschiedenen Stoffe wodurch sich scharfe Trenneffekte erzielen lassen 1 1 Chromatografische Arbeitsverfahren Auf dem unter Punkt 1 beschriebenen Grundprinzip der Chromatografie beruhen alle heute gebr uchlichen chromatografischen Methoden Man unterschiedet ent sprechend ihrer praktischen Durchf hrung im wesentlichen folgende Arbeitsverfah ren a Papierchromatografie b S u
128. in Protokoll zu f hren Die Protokolle werden in der Regel 4 6 Wochen nach Abschlu des Praktikums abgegeben und zur Beurteilung der Praktikumsleistung herangezogen Dazu kommt noch eine m ndliche Pr fung zum Praktikumsstoff Zu Beginn des folgenden Seme sters kann das Protokoll von den Studenten wieder im Institut abgeholt werden Einleitung Versuchs und Zeitplan 9 1 Arbeitstag s S 11 Versuch 1 Vortrennung einer aus Aminos uren AS und Zuckern bestehenden Reinsubstanz Probe mittels Kationen Austauscher S ule als Vorbereitung zur anschlie enden AS Chromatografie und zur enzymatischen Untersuchung der quantitativen Zusammen setzung der Zuckerfraktion Versuchsziel Vorreinigung niedermolekularer Stoffgruppen zur anschlie enden Chromatografie oder zur quantitativen Bestimmung einzelner Komponenten mittels Enzym Testsatz Versuch 2 Charakterisierung eines amp Amylase Praparates im Hinblick auf seine spezifische En zymaktivit t a Bestimmung des Proteingehaltes b Bestimmung der Enzymaktivit t Versuchsziel Einf hrung in die Methodik von Proteinbestimmung und enzymati scher Analyse Versuch 3 Einf hrung in die Gaschromatografie GC Qualitative Untersuchung zum Retentionsverhalten von Substanzen in der Gaschromatografie am Beispiel der homologen Reihe Methanol thanol n Propanol Versuchsziel Einf hrung in die Gaschromatografie 2 Arbeitstag s S 37 Versuch 4 Qualitative Untersuchung
129. ind im Hinblick auf Aktivit t und Kinetik n her zu charakterisieren s Versuche 2 u 7 In diesem Zusammen hang sei an die Bedeutung intensiv untersuchter Leitenzyme f r die moderne medizi nische Diagnostik erinnert B Einleitung zu I Radiobiochemische Versuche Da radioaktive Nuklide eines Elementes generell in chemischer und biologischer Hinsicht gleiches Verhalten wie stabile Nuklide des gleichen Elementes aufweisen eignen sich Radionuklide aufgrund ihrer Strahlung besonders gut zur Markierung bestimmter Elemente oder Verbindungen in biochemischen Untersuchungen In Anbetracht der heute existierenden sehr empfindlichen Nachweismethoden f r Radionuklide die oftmals auch den Vorteil einer sehr vereinfachten Durchf hrbarkeit im Vergleich zu herk mmliche Untersuchungsverfahren aufweisen und wegen der M glichkeit zwischen zugef gten und bereits vorhandenen Stoffen in einem System unterscheiden zu k nnen ist die sogenannte Tracer Technik zu einem unentbehrli chen methodischen Hilfsmittel in der biologischen Forschung geworden Einige Beispiele sollen die Vorteile der Tracer Technik verdeutlichen s z B Ver such 2 Einleitung 6 a Markierung physiologisch interessanter Verbindungen und die Beobachtung im Verlauf des Stoffwechsels Aufkl rung von Stoffwechselwegen b Bestimmung biologischer Halbwertszeiten oder der Verweildauer eines Stoffes im Organismus c Nachweis kleinster Stoffmengen ber deren Radioaktivit
130. ind qualitative z B Autoradiographie oder quantitative Auswerteverfahren z B mittels Densitometer oder Radioaktivit ts Scanner und die Dokumentation der Ergebnisse z B durch Fotografie durchf hrbar Apparative Voraussetzungen der Elektrophorese Die Ausr stung zur Durchf hrung der Elektrophorese PAGE besteht aus einer Elektrophorese Apparatur s Abb 10 7 und einem geeigneten Netzger t Die Elektrophorese Kammer besteht aus einem unteren und oberen Puffer Trog in den das Flachgel innerhalb zweier Glasplatten dicht eingesetzt wird Im oberen und unteren Puffergef befinden sich Platindraht Elektroden die ber einen Deckel be r hrungssicher mit der Spannungsversorgung verbunden werden Einf hrung in die Elektrophorese 102 Abb 10 7 aus Ger tebeschreibung der Firma Micrograd Elektrophoresegerat zur PAGE Deckel Strom Anschlu Puffergefats Dichtung ftir Gelkassette unteres Puffer Gefals Einf hrung in die Elektrophorese 103 Literatur AEBI H 1965 Einf hrung in die praktische Biochemie Akad Verl Ges FFM BERTRAM S u H G GASSEN 1991 Gentechnische Methoden G Fischer Stuttgart BURCK H C 1966 Histologische Technik G Thieme Stuttgart COOPER T G 1981 Biochemische Arbeitsmethoden W de Gruyter Berlin New York MAURER H R 1968 Disk Elektrophorese W de Gruyter Berlin STRYER L 1994 Biochemie Spektrum Akad Verlag WESTERMEIE
131. inzip Austauscher sind durch Typ Vernetzungsgrad und Korngr e zu charakterisieren Der Vernetzungsgrad gibt die Anzahl an Querverbindungen zwischen den langge streckten Kettenmolek len meist Kunstharze auf der Basis von Polystyrol des Aus tauschers an Der Vernetzungsgrad beeinflu t die Quellung des Austauschers in w ssrigem Medium und bestimmt somit die Durchflu geschwindigkeit einer Probe durch die S ule und damit die eigentliche Trennung Die Korngr e bestimmt die aktive Oberfl che des Austauschers s o und damit die pro Gewichtseinheit austauschbaren Ladungstr ger Zur bung Man denke sich einen W rfel mit der Kantenl nge Icm und bestimme seine Oberfl che Nun teile man diesen W rfel in 1000 W rfelchen mit der Kanten l nge Imm und vergleiche deren Gesamtoberfl che mit der des Ausgangswiirfels In diesem Praktikum wird als Austauschermaterial DOWEX 50 x 4 100 200 mesh verwendet Die Angabe 100 200 mesh bedeutet eine Korngr e die durch ein Sieb mit 100 200 Maschen pro inch absiebbar ist bei einem Vernetzungsgrad von 4 Von der Austauscher S ule werden die amphoteren im sauren Milieu pH 5 0 5 5 als Kationen vorliegenden Aminos uren des auf die S ule aufgebrachten Probenge misches Amino uren Zucker gebunden Die elektrochemisch neutralen Zucker verlassen dagegen im Efluat die Austauscher S ule Die Elution der Aminos uren vom Austausch Material erfolgt mit einem basischen Elutionsmittel z B
132. ion 189 Versuch 21 Transformation pflanzlicher Zellen 199 Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS Nachweis PCR Southern Blot 205 Literatur zu III 231 Anhang 235 Einleitung l A Einleitung zu I Chromatografische Verfahren und Enzymanalytik 1 Das Prinzip chromatografischer Verfahren Das analytische Verfahren der Chromatografie geht auf die Arbeiten des Russen TSWETT zur ck der zu Anfang des Jahrhunderts eine Adsorptionsmethode zur Trennung pflanzlicher Farbstoffe entwickelte Diese Trennung wurde wie folgt durchgef hrt Ein Petrol ther Extrakt pflanzlicher Pigmente wurde auf ein mit feinpulverisiertem CaCO3 gef lltes senkrecht stehendes Glasrohr eine S ule aufgebracht Zun chst wurden die Pigmente im oberen Teil des S ulenf llmaterials sorbiert Durch die weitere Zugabe von reinem Petrol ther zur S ule verbreiterte sich die sorbierte Farbzone so weit da schlie lich mehrere gelbe und zwei gr ne Farbzonen unterschieden werden konnten Nach den am Ad sorbens gebildeten Farbzonen nannte TSWETT sein Verfahren Chromatografie Bei jeder chromatografischen Trennung ist ein Zwei Phasen System erforderlich das aus einer station ren z B CaCO3 und einer mobilen Phase z B Petrol ther be steht Die Chromatographie also die Trennung eines Probengemisches in einzelne Komponenten erfolgt dadurch da sich einzelne Probenkomponenten in dem Zwei Phasen System unterschiedlich verhalten d h eine gr ere oder
133. ionsenzym Hind IIV SstI gespalten und ein ca 2300 bp langes Fragment im Bereich der T DNA s Plasmidkarte Abb 18 1 wird durch ein pr paratives Gel isoliert Der Restriktionsspaltungsansatz mit einem Gesamtvolumen von 30 ul setzt sich folgenderma en zusammen Plasmid DNA 5 ug 10 ul 10x M Puffer 3 ul Hind II 1 5 ul bidest Wasser 15 5 ul 30 ul Die Spaltung des Plasmids erfolgt ca 5 Stunden bei 37 C im Inkubationsschrank Zur berpr fung des vollst ndigen Verdaues des Plasmids werden 3 ul Probe mittels eines analytischen Gels getrennt Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 223 Der Rest der gespaltenen Plasmidprobe wird f r ein p paratives Gel verwendet wozu ein 1 iges w v ethidiumbromidhaltiges Agarosegel low melt point Agarose vorbereitet wird Die Probe wird mit 5 ul Ladepuffer versetzt und anschlie end auf das Gel aufgetragen Zur Erkennung der Fragmentl nge werden ca 300 ng des L ngenmarkers Lamda Hind III in den Slot neben der Probe pipettiert Fiir die Elektrophorese wird 1x TBE Puffer pH 8 0 verwendet sie erfolgt bei 100 V und 70 mA f r ca 2 Stunden Nach Ablauf der Elektrophorese wird die die Sonde repr sentierende Bande auf dem UV Transilluminator unter UV Licht 366 nm aus dem Gel mit einem Skalpel herausgeschnitten und auf zwei Eppendorfreaktionsgef e verteilt 22 7 1 Isolierung DNA Fragmente aus dem Gel F r die Isolierung der Bande aus dem Gel kann man verschiedene Methoden anwenden Das
134. ische Beweglichkeit geladener Molek le spielt die Porosit t des PAG eine entscheidende Rolle Dies wird in Abbildung 10 4 f r verschiedene Referenz Proteine Marker gezeigt Einf hrung in die Elektrophorese 93 Abb 10 2 aus Cooper 1981 CH CH C NH ACRYLAMID HC jr eK TETRAMETHYLENDIAMIN TEMED i CH CH C NH CH NH C CH CH N N METHYLEN bis ACRYLAMID em CHy CH CH NH C CH CH C NH CH gt CH CH N N DIALL YL TARTARDIAMID Verbindungen zur Herstellung von Polyacrylamid Gelen CONH CONH CONH CONH CONH 50 n CH CH gt X CHy CH gt X CH CH CH CH CH gt CH Polymerisation des Acrylamids Einf hrung in die Elektrophorese 94 Abb 10 2 Fortsetzung aus Cooper 1981 CON 50 nCH CH CHy CH C NH CH CM Col aa LAD ecu ac a N a i COMM CON COMM CON CH CH CH GH Cy Gh CHl Gh CH CH CONH cONH CONH Co a Ba De a CONH CONH Vernetzung der Acrylamid Ketten Einf hrung in die Elektrophorese 95 Abb 10 2 Fortsetzung aus Cooper 1981 Einflu der Bisacrylamid Konzentra tion im Gel auf die mittlere Porengr e Gesamt Porengr e A Acrylamid Konzentration 1 5 15 25 6 5 24 19 28 _ 3 0 23 16 24 36 10 0 19 14 20 30 12 0 17 9 15 0 14 7 a Bestimmt anhand von Molek len f r die 50 des Gelvolumens zug nglich ist b N N Methylen bisacrylamid Abb 10 3 aus Cooper 1981 ro ei gt
135. ische Versuche C Einleitung zu III Gentechnische Verfahren Praktikumsteile I Chromatografische Verfahren und Enzym Analytik und II Radiobiochemie Versuchs und Zeitplan zu I und II I Versuche zu chromatografischen Verfahren und Enzymanalytik Versuch 1 Ionenaustauschchromatografie Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der o Amylase Einf hrung in die Gaschromatografie zu Versuch 3 und 13 Versuch 3 Gaschromatografie Allgemein Versuch 4 D nnschichtchromatografie Versuch 5 Papierchromatografie Versuch 6 Sephadex Gelfiltration Versuch 7 Enzymkinetik Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung Einf hrung in die Elektrophorese zu Versuch 10 und 11 Versuch 10 Elektrophorese natives Protein Versuch 11 Elektrophorese denaturiertes Protein Versuch 12 ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbend Assay Versuch 13 Alkoholbestimmung mittels Gaschromatografie Seite A BWWWNN 13 17 25 31 37 4 45 57 21 85 91 105 113 119 125 IV Inhaltsverzeichnis II Versuche zur Radiobiochemie Seite Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 129 Versuch 15 Liquid Scintillation Counting Ausbeute 145 Versuch 16 Radioscanner 155 Versuch 17 y Spektroskopie 161 III Gentechnische Verfahren Versuchs und Zeitplan zu II 171 Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 173 Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 183 Versuch 20 Konjugat
136. je Primer Oligonukleotid 0 5 ul Taq Polymerase 31 5 ul bidest Wasser 50 ul Der Ansatz wird mit 50 ul Mineral l berschichtet zur Verhinderung von Kondenswasserbildung Da moderne PCR Gr te eine temperierten Deckel besitzen ist die Anwendung des Mineral ls nicht notwendig Die PCR Reaktion erfolgt ca 35 bis 50 Zyklen in einem automatischen PCR Ger t Thermocycler Die PCR Zyklen werden bei folgenden Parametern durchgef hrt Programm 1 45 C 2min Vorheizen des Thermoblocks Programm 2 95 C 3 min Denaturierung der DNA vor Zyklusbeginn Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 213 Programm 3 1 Segment 95 C 1 min Denaturierung 2 Segment 50 C 2 min Annealing Hybridisierung 3 Segment 72 C 2min Amplifikation 35 50 Zyklen Programm 4 72 C 5 min Eine anschlieBende Amplifikation Programm 5 4 C Lagerung bis Gelelektrophorese In der folgenden Abbildung ist die Reaktionstemperatur schematisch dargestellt Temperatur CC 100 Denaturierung 90 80 70 60 Annealing 50 40 30 20 10 Zeit min Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 214 22 3 3 Gelelektrophorese der PCR Produkte siehe auch Seite 91 118 Bei den meisten PCR Experimenten erfolgt die berpr fung des Ergebnisses indem man einen Teil des Reaktionsansatzes ber ein 1 5 iges Agarose Gel trennt Nach der F rbung mit Ethidiumbromid erkennt man in der Regel eine Bande s Abb 22 1 Fehlt die erwartete Bande oder
137. ke des Laufmittels B Auftragspunkt bis Laufmittelfront setzt Rf A B CH N CH CH OH CT CH3 3N CH gt CH Cl CT Cholinchlorid CC Chlorcholinchlorid CCC In diesem Versuch ist Cholinchlorid CC von Chlorcholinchlorid CCC zu trennen CCC ist als Halmverk rzungsmittel zur Verhinderung des Lagerns von intensiv mit Stickstoff ged ngtem Getreide bekannt geworden Die Trennung w hrend der D nnschichtchromatografie kommt zustande weil durch Einf hrung der Cl Gruppe in CC eine Verminderung der Polarit t des CCC Molekiils gegen ber Cholinchlorid eintritt W hrend die polarere Substanz Cholinchlorid eher in der station ren Phase Wasseranteil des Laufmittels im Silikagel vorzufinden ist bevorzugt CCC eher die mobile Phase Athanol HCl Wie bei der Papierchromatografie Versuch 5 ist dabei zu beachten da das Laufmittel beide Verteilungsphasen enth lt die erst im Verlaufe der Chromatografie am Sorbens Silikagel bzw Cellulose des Papiers als solche wirksam werden Rf Relative front Versuch 4 D nnschichtchromatografie 38 B Material und Ger te a Cholinchlorid Chlorcholinchlorid L sung pro ml L sung Img CCC und 2mg Cholinchlorid b Glasplatten 20x20cm mit Silikagel Beschichtung c D nnschichttank zur Aufnahme der D nnschichtchromatogramme d Laufmittel 0 2N HCl mit 25 Athanol e Hb Pipette 20u1 mit Schlauch und Mundst ck oder 20ul Eppendorf Pipette f Athanol
138. ktionen Konzentration Extinktionen Mittelwerte Eichfaktoren Konzentration Mittelwert Extinktion RNA AMP Konzentration Extinktionen Konzentration Extinktionen b Nun die Eichkurven f r RNA und AMP zeichnen wobei auf der Abszisse die Konzentrationen und auf der Ordinate die Extinktionen abzutragen sind c Beim Einzeichnen der Eichkurve mittels Lineal ergeben sich fters Schwierig keiten wenn die Extinktionswerte nicht auf einer Geraden liegen Hier kann man sich durch folgendes Vorgehen helfen Bei jeder kolorimetrischen Analyse mu die Eichkurve durch den Nullpunkt ge hen d h bei Konzentration O ist die Extinktion ebenfalls 0 Somit haben wir einen Fixpunkt f r die Eichkurve die Eichgerade ist ja durch 2 Punkte definiert Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 54 Der zweite Fixpunkt ergibt sich aus dem mittleren Eichfaktor s Tabelle Durch Umstellung seiner Bestimmungsgleichung EF Konzentration Extinktion kann man zu einer bestimmten Konzentration die zugeh rige Extinktion berech nen Ist z B der mittlere Eichfaktor 180 0 und will man die Extinktion f r eine Kon zentration von 100 ug ml errechnen so ergibt sich EF Konzentration Extinktion 180 0 100 ug ml Extinktion 180 0 Extinktion 100 ug ml Extinktion 100 ml 180 0 Extinktion 0 556 Somit w re die Eichkurve vom O Punkt durch die Extinktion von 0 556 bei der Konzentration von 100 ug ml zu ziehen d Mit den Mitt
139. ktive Strahlung entsteht spontan und zuf llig Poisson Verteilung 2 Nachweis der Notwendigkeit eines leicht ionisierbaren Gases im GMZ Einsatz eines defekten GMZ mit offenem Endfenster ultrad nnes Glimmer Pl ttchen Einschlu des leicht ionisierbaren Gasgemisches Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 130 3 Nachweis der Notwendigkeit von Hochspannung HV zum Betrieb jeden Z hlrohrs bei Abschalten der HV keine Strahlungsmessung Dabei mu die Abh ngigkeit der Z hlrate von der H he der Hochspannung bei stufiger Erh hung der Hochspannung schrittweise aufgenommen werden Die Arbeitsspannung liegt im ersten Drittel des sich ergebenden Plateaus Man beachte dabei da ein Z hlrohr durch berschreiten der Maximalspannung defekt werden kann C y Kristall Szintillationsz hlrohr GKSZ aus Kern und Strahlentechnik Lehrbriefe der Studiengemeinschaft Darmstadt Szintitlationskristall Foloka thode Dynoden Anode Lichtleiter lichtundurchldssige Kapsel Messung von y Quanten unter Erfassung unterschiedlicher Impulsh hen in Abh ngigkeit von der Strahlungsenergie daher y Spektrometrie m glich Ausbeute ca 10 30 Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 131 1 Bedeutung von Abschirmungsma nahmen f r die Strahlungsmessung Versuch Messung der Umwelt y Strahlung mit dem GKSZ bei unterschiedlichen Abschirmungsma nahmen mit Blei w hrend einer Me zeit von 1 Minute
140. l sen 15 30 Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 216 Min ruhig stehen lassen 15 gel ste Nukleins ure mit 2 VT 96 Ethanol f llen und 5 Min bei Raumtemperatur RT stehen lassen 16 10 Min bei 13000 Upm zentrifugieren 17 Uberstand verwerfen und Pellet mit 80 Ethanol waschen 10 Min bei RT stehen lassen 18 10 Min bei 13000 Upm bei RT zentrifugieren 19 Uberstand verwerfen und Pellet trocknen danach in 100 ul 1x TE Puffer gut l sen 20 RNase Verdau bei 50 C mit ca 10ug RNase A anschlieBen s 19 6 1 Ger te autoklavierte Eppendorfreaktionsgsf e 1 5 ml autoklavierte Pipettenspitzen wei e gelbe blaue St nder f r Eppendorfreaktionsgef e Tischzentrifuge Wasserbad steriler M rser und Pistill sterile Gewebekulturpipetten Schwarzbandfilter Abnutschflasche Vakuumpumpe Analysenwaage sterile L ffel Themocycler Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 217 L sungen 2x CTAB 2 CTAB w v 100 mM Tris pH 8 0 20 mM EDTA pH 8 0 1 4 M NaCl 10 CTAB 10 CTAB w v 0 7 M NaCl CTAB Pr zipitationspuffer 1 CTAB w v 50 mM Tris pH 8 0 10 mM EDTA pH 8 0 TE Highsalt Puffer 10 mM Tris pH 8 0 1 mM EDTA pH 8 0 1 M NaCl 1x TE Puffer 10 mM Tris pH 8 0 1 mM EDTA pH 8 0 Alle L sungen autoklavieren und bei Raumtemperatur aufbewahren Ethanol 70 80 96 Chloroform Isoamylalkohol 24 1 Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 218 Abbildung 22 1 Nachweis des MAS Pro
141. le die Verf gbarkeit zu Pflanzen regenerierbarer Protoplasten die Voraussetzung bildet k nnen im zweiten Falle auch intakte Zellen auch im Zellverband durch Fremd DNS transformiert werden Dem steht jedoch entgegen da bis heute das bakterielle Verfahren mit wenigen Ausnahmen nur auf Dicotyledonen beschr nkt ist w hrend die direkte bertragung der Fremd DNA nach Elektroschock beim Protoplastenverfahren prinzipiell auf alle h heren Pflanzen angewendet werden kann Mit letzterem Verfahren sind die als Nutzpflanzen beson ders wichtigen Getreidearten den gentechnologischen Verfahren zug nglich Bisher hat jedoch das bakterielle Verfahren die gr ere Anwendung erfahren Einer breite ren Anwendung des Protoplastenverfahrens stehen heute noch die bei vielen Pflan zenarten einschlie lich der Gramineen vorhandenen Schwierigkeiten entgegen aus Einleitung 7 Zellkulturen intakte Pflanzen heranzuziehen Schlie lich w re noch das Particle Gun Verfahren zu erw hnen bei dem die zu bertragende DNS auf z B kleine Goldkugeln fixiert und so in die Zellen hinein geschossen wird Dieses Verfahren ist auch bei Monokotyledonen einsetzbar Anfangs konnten lediglich bei einigen Pflanzenarten wie z B bei Karotten und bei Tabak genetisch transformierte Pflanzen aus Zellkulturen erstellt werden Die Zahl der Pflanzenarten nimmt jedoch st ndig zu Bei den gentechnischen Verfahren und den gro en mit ihnen aufgezeigten M glichkeiten m
142. leichende Messung bei 280 nm durchgef hrt Der Quotient der Messung bei 260 und 280 nm sollte bei einer sauberen DNA Pr paration bei 1 8 liegen Liegt der Quotient bei 2 0 so ist die DNA mit RNA verunreinigt Liegt er unter 1 8 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 187 so ist die Pr paration mit Phenol oder Proteinen kontaminiert Es ist ratsam nach der Ermittlung der DNA Konzentration mittels Photometer die tats chliche Menge ber ein Agarosegel zu berpr fen Eine A DNA Konzentrationsreihe 5 10 20 und 30 ng A Phagen DNA dient als Standard zur Ermittlung der DNA Konzentration Die Nachweisgrenze bei dieser Methode liegt bei etwa 5 ng DNA Menge 19 8 Agarose Gelelektrophorese s auch S 91 118 Die Gele dienen der Untersuchung von DNA Fragmenten oder von Plasmiden nach einem Pr parationsschritt bzw nach dem Verdau mit Restriktionsenzymen Hierf r wird in der Regel ein 1 Agarosegel gegossen Dazu wird die Agarose unter Erhitzung in dem Laufpuffer des Gels 1x TBE Puffer s u gel st und ca 50 C hei in die Elektrophoresekammer eingef llt Die Minigelkammer nimmt ca 10 ul Probe auf Diese sollte vorher mit einem Indikator versetzt worden sein etwa 1 5 der Probe z B Bromphenolblau zum Anzeigen der Laufmittelfront 19 9 F rbung der DNA mit Ethidiumbromid Um die DNA auf dem pr parativen Analysengel sichtbar zu machen werden die Gele in einer Ethidiumbromid L sung 10ug ml in Wasser f r ca 5 15
143. lelektrophorese der PCR Produkte 214 22 4 Extraktion pflanzlicher DNA 214 22 4 1 CTAB Preparation pflanzlicher Gesamt DNA 214 8 Arbeitstag 219 22 5 Spaltung genomischer DNA 220 22 6 Southern Verfahren 220 22 6 1 Gelbehandlung 221 22 6 2 Blotaufbau 221 22 6 3 Kovalente Bindung der DNA an Membranen 222 22 7 Herstellung der Sonde 222 22 1 1 Isolierung der DNA Fragmente aus dem Gel 223 22 7 2 Radioaktive Markierung der Sonde 224 22 7 3 Abtrennung der freien Nukleotide 226 22 8 Pr hybridisierung 226 22 9 Hybridisierung 228 22 9 1 Waschen der Membranen 228 22 10 Autoradiographie 228 Literatur 231 Anhang 235 Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 173 1 Arbeitstag bersicht zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc f Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen 174 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Bakteriensuspension bernachtkultur Herstellung kompetenter Zellen Transformation Palsmid
144. lem anzupassen Einige Firmen haben sich darauf spezialisiert sehr viele unterschiedliche GC S ulen F llmaterialien f r alle m glichen Anwendungsf lle zu entwickeln Einf hrung in die Gaschromatografie 26 Ein Ma f r die Zeitdauer des Verbleibs einer Substanz in der GC S ule ist deren Retentionszeit die bei einer definierten station ren Phase temperatur und stoff spezifisch ist ber die in Vorchromatogrammen anhand von Reinsubstanzen bestimmten Retentionszeiten sind unbekannte Probenkomponenten relativ einfach identifizierbar B Apparative Voraussetzungen der Gaschromatografie s Abb 3 1 und 3 2 Ein Substanzgemisch wird ber den Einspritzblock Abb 3 1 E mittels kleinvolumiger gasdichter Spritzen auf die GC S ule aufgebracht Die Temperatur des Einspritzblocks mu in der Regel 30 50 C ber der Temperatur der GC S ule liegen damit nicht niedrig siedende Probenanteile vor dem Eindringen in die S ule ausgek hlt werden und damit der Analyse nicht zug nglich sind Am Ausgang der GC S ule befindet sich der Detektor Abb 3 1 H mit dem das Austreten getrennter Substanzen aus der GC S ule nachgewiesen wird Es gibt eine Reihe von Detektortypen mit unterschiedlich guter Eignung f r bestimmte Substanzklassen Der einfachste Detektor ist der auch bei uns eingesetzte W rme leitfahigkeits Detekor WLD s Abb 3 2 Der WLD setzt allerdings eine exakt und konstant arbeitende Temperatur Regelung von Vergleic
145. lenchromatografie Austauscher Chromatografie HPLC Gelfiltration Molekularsieb Chromatografie c D nnschichtchromatografie d Gaschromatografie e Elektrophorese 1 2 Papierchromatografie PC Bei der PC dient Filterpapier als Tr ger f r die w ssrige station re Phase Das Lauf mittel besteht dabei aus der mobilen Phase und einem Wasseranteil der bei aufstei gender PC nach erfolgter Diffusion des Laufmittels im Papier mit Cellulose die station re Phase bildet In den unendlich vielen kleinen durch die Micellen des Papiers gebildeten Elementarzellen finden quasi aufeinanderfolgende Aussch tte lungen der Substanzen im Zwei Phasen System statt Diese f hren schlie lich zur gew nschten Trennung Am Papier k nnen jedoch oftmals auch Adsorptions oder Austausch Vorg nge bei der Trennung mitwirken Einleitung 3 1 3 S ulenchromatografie Unter der Bezeichnung S ulenchromatografie wird eine Reihe von Arbeitsverfah ren zusammengefa t die unter Verwendung spezieller Tr gerstoffe mit Adsorptions Absorptions z B das mit sogenannten Molekular Siebeffekten wirkende Sephadex oder Ionenaustausch Eigenschaften in einem senkrecht stehenden Chromatografie rohr einer S ule s o ablaufen Ionenchromatografie und HPLC High Per formance Liquid Chromatography sind prominente Vertreter dieser Chromatogra fiegruppe W hrend bei der klassischen Adsorptionschromatografie nur die Oberfl ch
146. lle 50 und erh ht deren Inhalt um 1 u s w s Abb 17 4 Diese Abbildung zeigt im Vergleich zu Abb 17 3 gleichzeitig die mit einem Na T1 J und Halbleiter Detektor aufgenommenen Energie Spektren von 137Cs W hrend einer Messung ist das Auff llen der Speicher Kan le Anzahl Impulse auf der Ordinate in Abh ngigkeit ihrer Speicher Adresse auf der Abszisse zu beobachten Abb 17 4 Impulsh hen Spektren f r Cs aus Petzold u Krieger 1988 ee Compton Kontinuum Totalabsorptionslinie l f Backscatter Kontinuum Backscatter Compton Kante Kante x H Halbwertocaite I oO fF og tot z H NA ln oN 2 f Bereich Bereich I _ 2 en 2 i 0 100 200 300 00 500 Kanalnummer Impulsh henspektran f r monoenergetische Phoconensctrahlung Cs 137 Eon 661 6 keV Nullpunkt der Abszisse 2 95 keV Energieeichung 1 59 keV Kanal Photolinte 661 6 keV Kanal 414 Compton Kante 477 7 keV Kanal 298 Backscactar Kante 184 3 keV Kanal 114 Bereich I Impulshdhenbereich fiir die Schw chungsmessungen Fig 6 12 Kurven 4 50 keV bis 250 keV Bereich II Impulsh henbereich f r die Schw chungsmessungen Fig 6 12 Kurven 3 250 keV bis 450 keV Kurve l Szineillacionszahler NaJ Tl 38 1 om x 25 4 om Be Fenster 0 2 mm Relative Halbwertbreite H der Toralab sorptionslinie 8 1 25 der Impulse liegen in der Tocalab sorptionslinie 75 im Compton Xontinuua
147. lle sorptionsf higes Tr germaterial und Tr gergas abh ngig Zur Untersuchung von Faktoren welche die Retentionszeit einer Verbindung an dieser speziellen GC S ule beeinflussen und somit den Substanz Verteilungskoeffizienten verwenden wir in diesem Versuch die folgenden Alkohole deren Strukturformeln sich um jeweils eine CH gt Gruppe voneinander unterscheiden s S 32 Wie diese Tabelle zeigt steigt der Siedepunkt mit zunehmender Kettenl nge dieser Alkohole Daraus ist abzuleiten da die Gaschromatografie bei einer Temperatur durchgef hrt werden mu bei der alle zu trennenden Substanzen fl chtig sind wir w hlen 125 C Versuch 3 Gaschromatografie allgemein 32 Methanol thanol n Propanol n Butanol H gt C OH a a en H CH Mir Wee CH CH Siedepunkt in C 64 5 78 3 97 0 118 0 Bei 125 C sind zwar alle Alkohole verdampft aber Methanol thanol und n Propanol haben bei dieser Temperatur einen h heren Dampfdruck im Tr gergas der GC S ule als n Butanol so da die k rzer kettigen Alkohole schneller die S ule verlassen k nnen als n Butanol Hinzu kommt da die vier Alkohole mit zunehmender Kettenl nge unpolarer werden da sich die unpolare Restgruppe der Molek le vom Methan zum n Butanol zunehmend vergr ert Auch dieser Effekt f hrt schlie lich dazu da n Butanol in Relation zu den k rzer kettigen Alkoholen in unserer zur Trennung polarer Substanzen geeigneten GC S ule C
148. lutionsschritte gewonnen indem das DNA Glaspartikelpelet im gew nschten H O Volumen 5 10 ul bidest Wasser resuspendiert f r 5 Min bei 55 C inkubiert und kurz abzentrifugiert wird Die DNA befindet Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 224 sich in der w rigen Phase und steht f r die weitere Bearbeitung zur Verf gung Waschl sung New Wash 50 Ethanol 100 mM NaCl 10 mM Tris HCI pH 7 5 1mM EDTA TAE Puffer 40 mM Tris Acetat 1 mM EDTA pH auf 7 8 einstellen Die DNA Konzentration wird anschlie end spektrophotometrisch ermittelt s 19 7 und bis zu ihrer weiteren Verwendung bei 20 C aufbewahrt 22 7 2 Markierung der Sonde Nicht radioaktive Markierung der Sonde Einige Kits z B der auf antik rpervermittelter Farbreaktion beruhende DIG DNA Labelling and Detection Kit der Firma Boehringer Mannheim bieten eine Nicht radioaktive Markierung der Sonde an Nach Erhitzen 95 C Trennung der DNA in ihre Einzelstr nge der isolierten Template DNA s 22 11 1 und mit anschlie ender Abk hlung auf Eis wird dNTP Mix Klenow DANN Polymerase Bestandteile des Labelling und Detection Kits und Desoxyuridin Triphosphat dUTP hinzugef gt Das dUTP ist ber einen Spacer mit dem Steroid Hapten Digoxigenin verbunden Dig dUTP Nach Inkubation f r 60 min bei 37 C wird die Reaktion abgestoppt gef llt s 19 6 2 und anschie end durch Zentrifugation pelletiert Das DIG markierte Pellt wird dann in TE Puffe
149. man davon zu verzehren gedenkt Wenig Pilzmasse f r eine delikate Gem sesuppe einmal im Monat genossen d rfte wohl keinesfalls sch dlich sein Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 140 b Doch wie erfolgt die Interpretation der Messungen biochemischer Proben Da ist sicherlich die entsprechende Versuchsfrage ma geblich jeder Versuch wird entsprechend seiner Fragestellung spezifisch ausgewertet Aber eine Frage gilt es wohl immer zu beantworten Welche Radioaktivit t ist in welcher Menge meiner Substanz die man z B mit H oder C markieren wollte Daf r gibt es einen Begriff die sogenannte spezifische Radioaktivit t die angibt wieviel Impulse Min oder Zerf lle Min in einer bestimmten Substanzmenge vorliegen wie hoch also der Markierungsgrad ist Radioaktivit t spezifische Radioaktivit t oder Konzentrationseinheit Radioaktivit t spezifische Radioaktivit t Mengeneinheit Einige Beispiele 1 Bei der Untersuchung der Enzymaktivit t mit radioaktiven Substraten wird die wiedergefundene Radioaktivit t von z B applizierter hei er C Glucose L sung auf die Menge an ebenfalls zugesetzter kalter C Glucose L sung bezogen um aus der gemessenen Radioaktivit t die umgesetzte Substratmenge und demnach die Enzymaktivit t errechnen zu k nnen Entspricht z B die spezifische Radioaktivit t einer applizierten Substrat L sung 1 mCi 10 mMol oder anders ausged
150. matogrammen und oder Elektropherogrammen Versuchsziel Einf hrung in die Arbeitsweise eines TLC Radioaktivit tsscanners A Prinzip Oft besteht in einem biochemischen Labor die Notwendigkeit Ort und Intensit t radioaktiver Strahlung auf D nnschicht oder Papier Chromatogrammen oder auf Flachgel Elektropherogrammen zu messen Dies erfolgt z T immer noch ber die so genannte Autoradiografie Dieses Verfahren beruht darauf da ein Chromatogramm ein Elektropherogramm mit einer Trennung radioaktiv markierter Substanzen oder auch eine radioaktiv markierte getrocknete Pflanze fl chiges Objekt mit einem R ntgenfilm in einem lichtdichten mit Blei abgeschirmten Kasten z T bei sehr niedriger Temperatur in Kontakt gebracht exponiert wird Je nach der Energie des zur Markierung verwendeten Radionuklids dauert dieser Proze etwa 2 bis 6 Wochen Der R ntgenfilm zeigt nach seiner Entwicklung an Stellen des Pr parates mit Radioaktivit t Schw rzungen die proportional der Intensit t der Strahlung sind Die Autoradiografie wird vornehmlich zum Nachweis von a und 8 Radionukliden in Anbetracht ihrer relativ hohen Ionisationsdichte verwendet Sie ist vorallem dann sehr wertvoll wenn man eine gute Ortsaufl sung der Radioaktivit tsverteilung anstrebt Allerdings ist sie nur mit einem optischen Densitometer im Hinblick auf die Intensit tsmessung der Schw rzungs Verteilung des R ntgenfilms quantitativ auszuwerten In Anbetracht d
151. meiden Dies gilt auch f r B cher und Schreibmaterial Das Essen Trinken Rauchen Schnupfen und Schminken ist im Labor untersagt Lebensmittel d rfen nicht in das Labor hineingebracht oder dort aufbewahrt werden Auf den Arbeitsfl chen sollen nur die unmittelbar ben tigten Ger te und Materialien lagern Vorr te sollen nur in daf r vorgesehenen R umen oder Schr nken gelagert werden Ungeziefer mu bei Auftreten regelm ig bek mpft werden Bei allen T tigkeiten ist grunds tzlich darauf zu achten da Spritzer und Aerosole fl ssige und feste Schwebstoffe vermieden werden 2 16 2 17 2 18 3 1 3 2 3 3 3 4 Anhang 237 Dies gilt insbesondere f r T tigkeiten wie Umf llen Pipettieren Beimpfen R hren Sch tteln Zentrifugieren Hochdruckpressen und Arbeiten mit Ultraschall Schreib und Arbeitsfl chen sind getrennt zu halten Gezielte Verhaltensregeln Die biologische gentechnische Identit t der verwendeten Zellinien und Mikroorganismen ist regelm ig zu berpr fen und zu protokollieren Die berpr fung der Biologischen Identit t erfolgt bei jeder Subkultur durch den Zusatz der dem Marker entsprechenden Antibiotika Ger te und Materialien die aus dem Labor herausgebracht werden sollen und bei denen nicht ausgeschlossen werden kann da sie mit biologischen Agenzien kontaminiert sind m ssen vorher im Labor desinfiziert oder sterilisiert autoklaviert werden Hygiene T
152. mmungsverfahren in der Gaschroma tografie Versuchs und Zeitplan 12 6 Arbeitstag s S 129 Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen und Auswerteverfahren Versuchsziel Allgemeine Einf hrung in radiochemische Arbeitsverfahren Versuch 15 Bestimmung der Z hlausbeute von H und 14C Proben im Fl ssig Scintillations z hler Versuchsziel Messung niederenergetischer Strahler bei hoher Z hlausbeute mittels Fl ssig Scintillatinsz hler Versuch 16 Auswertung von Position bzw H he der Radioaktivit t markierter Verbindungen in D nnschicht bzw Papier Chromatogrammen und oder Elektropherogrammen Versuchsziel Einf hrung in die Arbeitsweise eines TLC Radioaktivit tsscanners Versuch 17 Identifizierung und Radioaktivit ts Bestimmung von y Nukliden in Nahrungsmitteln z B getrocknete Pilze N sse Milchpulver Tee etc mit einem Na TI J y Spektrometer Versuchsziel Einf hrung in die Arbeitsweise eines y Spektrometers mit Vielkanal Me einrichtung Versuch 1 Ionenaustauschchromatografie 13 1 Arbeitstag Vortrennung einer aus Aminos uren AS und Zuckern bestehenden Reinsubstanz Probe mittels Kationen Austauscher S ule zur anschlie enden AS Chromatografie und zur enzymatischen Bestimmung der Zuckerfraktion Versuchsziel Vortrennung niedermolekularer Stoffgruppen zur anschlie enden Chromatografie oder zur quantitativen Bestimmung einzelner Komponenten mittels Enzym Testsatz A Pr
153. moters in Genom transgener Karottenzellen durch Amplifizierung einer ca 430 bp Sequenz aus dem MAS Promoter durch das PCR Verfahren M Marker Negativkontrolle Positivkontrolle P transgene Karottenzelle Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 219 8 Arbeitstag Flie schema zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch 18 Gewinnung von Zellsuspensionen Sterilisation von Samen Versuch 19 Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung Selektion Vermehrung DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 20 Konjugation Transformation in E coli zur Konjugation Co Kultur A tum E coli Selektion DNA Pr paration DNA Identifizierung Versuch 21 Transformation Pfl Zellen Co Kultur A tum Pflanzenzellen Selektion Versuch 22 Nachweis des Fremdgens GUS mit X Gluc Blauf rbung PCR Southern Verfahren Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 220 22 5 Spaltung Gesamt DNA 10 ug genomische DNA Gesamt DNA wird mit dem Restriktionsenzym Hind III gespalten Die Auswahl des Restriktionsenzyms Hind III ist damit begr ndet da dieses Enzym nicht das gesuchte Gen im Pflanzengenom spaltet s Plasmidkarte Abb 18 1 Der Restriktionsspaltungsansatz mit einem Gesamtvolumen von 50 ul setzt sich folgenderma en zusammen Genomische DNA 10 ug 20 ul 10x M Puffer 5 ul Hind III 3 ul bidest Wasser 2 ul 50 ul Die Spaltung des Genoms erfolgt ber Nacht bei 37 C im Inkubationsschra
154. mung der Radioaktivit ts Verteilung ausgewertet s Abb 16 2 Abb 16 2 Prinzip des ortsempfindlichen Proportionz hlrohrs Betriebsanleitung BERTHOLD TA Zeit Analysator TAC Zeit Amplituden Converter ADC Analog Digital Converter ber Optionen des steuernden Programms ist es alternativ m glich eine bessere Ortsaufl sung auf Kosten der Me empfindlichkeit des Scanners zu w hlen Nach Vorgabe der Zeit f r die Messung einer Chromatografie Bahn steuert ein Tisch Vorschub die n chste zu messende Bahn am Chromatogramm an u s w bis das gesamte Chromatogramm gemessen ist Mit Hilfe des Programms kann eine zweidimensionale Darstellung der gemessenen Signale mit Farbcodierung der gemessenen Intensit t der radioaktiven Strahlung auf dem Bildschirm dargestellt Versuch 16 Radioscanner 158 werden Auch eine dreidimensionale Darstellung der Radioaktivit ts Verteilung des gemessenen Chromatogramms ist m glich Durch Integration der gemessenen Radioaktivit t in einzelnen Bereichen ist eine quantitative Auswertung der Radioaktivit ts Verteilung m glich Ein Report wird bei Bedarf auf einem angeschlossenen Drucker ausgegeben Je nach der Energie des zu messenden Radionuklids dauert ein Scannproze etwa 5 32 Stunden wobei die Signalaufnahme automatisch ohne Interaktion mit einer Person abl uft Im Vergleich zur Autoradiografie ist demnach eine gewichtige Zeitverk rzung und gleichzeitig eine quantitative Auswertung z
155. mung der Z hlausbeute von 3H und 4C Proben im Fliissig Scintillationsz hler Versuchsziel Messung niederenergetischer Strahler bei hoher Z hlausbeute mittels Fl ssig Scintillationsz hler LSC A Prinzip s Einleitung s S 5 Zur Markierung verschiedenster Substanz Klassen im Stoffwechsel werden haupts chlich Tritium 3H l4C P und S z B zur Markierung von Metaboliten oder von Proteinen und Nukleins uren s S 218 verwendet Zur Messung von niederenergetischen Radionukliden m ssen Me verfahren mit m glichst hoher Ausbeute eingesetzt werden um auch relativ schwach markierte Substanzen bei guter Me genauigkeit erfassen zu k nnen Die Z hlrate eines Strahlungs Me ger tes ist um so gr er je h her seine Z hlausbeute ist Somit scheiden Me anordnungen mit Geiger M ller oder Proportional Z hlrohren mit z T zu geringer Me ausbeute aus s Tab 15 1 Tab 15 1 Bestimmung der Z hlausbeute f r 14C und 32P mit verschiedenen Me verfahren Institutmessungen Zerfallsrate Z hlrate Errechnete Radionuklid Standard Me ver Standard Ausbeute Emax in DpM fahren in IpM in 14c 3885000 0 156 MeV 3885000 102300 32p 333000 39487 1 71 MeV 333000 115351 214594 168756 GMZ Geiger M ller Me platz MDZ Methan Durchflu Z hler LSC Fl ssig Scintillations Z hler Seit den 70er Jahren gibt es hochentwickelte Ger te zur empfindlichen und genauen Messung von H und C nach dem Pri
156. n ren Phase Wasser aufweist Bei Prolin ist es offenbar die heterozyklische Ringstruktur die bei hoher Wasserl slichkeit dieser Aminos ure gleichzeitig auch ihren lipophilen Charakter ausmacht Aufgrund seiner hohen Wasserl slichkeit hat Pro brigens eine wichtige Funktion im Stoffwechsel von Pflanzen zur Osmoregulation bei Wasser oder Salzstress D Auswertung Die quantitative Auswertung der Papierchromatografie erfolgt im Versuch 7 am 4 Arbeitstag s S 77 Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 45 2 Arbeitstag Sephadex Gelfiltration zur Trennung nach Molek lgr e am Beispiel einer aus RNA und AMP bestehenden Reinsubstanz Probe einschlie lich Erstellung von RNA und AMP Eichkurven Versuchsziel Einf hrung in die S ulen Chromatografie mit Schwerpunkt Molekular sieb Gelfiltration A Prinzip s a Einleitun Die sogenannte Gelfiltration mit Sephadex Typ G ist ein chromatografisches Ver fahren das eine Sonderstellung unter allen brigen Verfahren dadurch einnimmt da es die Trennung von Substanzen nach deren Molekulargewicht Molek lgr e erm glicht hnlich wie bei der Kationen Austauscher Trennung in Versuch 1 1 AT wird Se phadex vor allem zur S ulen Chromatografie eingesetzt Es besteht aus kleinen Parti keln einer hydrophilen unl slichen Substanz die durch Quervernetzung von Ketten molek len des Polysaccharids Dextran hergestellt wird Diese Substanz besteht nach Suspendierung in Puffer aus
157. n Zeitpunkt N ist die Anzahl an zu Anfang vorliegenden Kernen No multipliziert mit der Exponentialfunk tion aus In 2 Halbwertszeit e Zwischenzeit nach folgender Formel Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 153 In2 Tet Nt No ee 0 6932 4474 9 t Nt 98700 e Dabei bedeuten Nt Heutige Zerfallsrate No Zerfallsrate am 20 10 1973 98700 DpM T 12 26 Jahre 4474 9 Tage t Zeit zwischen dem 20 10 1973 und heute Leise Tage Die Zerfallsrate des 3H Standards betr gt also d Somit kann dieser Versuch nach folgender Tabelle ausgewertet werden Zerfallsrate Z hlrate Radionuklid Standard Standard Ausbeute Emax in DpM in IpM in 3H 0 018 MeV 14C 0 156 MeV 102300 e Ist die Ausbeute f r ein Radionuklid bestimmt kann aus der Messung der Z hlrate IpM die Zerfallsrate von Proben des gleichen Nuklids selbstverst ndlich unter den gleichen Me bedingungen Anteil Probe im Scintillator Cocktail etc nach folgender Formel berechnet werden IpM Probe e 100 Zerfallsrate Probe DpM Ausbeute Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 154 E Literatur ALLKOFER O C 1971 Teilchen Detektoren Thiemig KG M nchen COOPER T G 1981 Biochemische Arbeitsmethoden W de Gruyter Berlin Versuch 16 Radioscanner 155 6 Arbeitstag Auswertung von Position bzw H he der Radioaktivit t markierter Verbindungen in D nnschicht oder Papierchro
158. nach vermutlich identisch sind Versuch 11 Elektrophorese SDS 113 5 Arbeitstag SDS Polyacrylamid Elektrophorese eines Pr parates der Sauren Phosphatase unter reduzierenden denaturierenden Bedingungen zur Bestimmung des Molekular gewichtes von Proteinfraktionen anhand von Molekulargewichts Standards Versuchsziel Anwendung der Polyacrylamid Gelelektrophorese f r besondere Trennaufgaben z B zur MG Bestimmung A Prinzip s Einf hrung zur Elektrophorese Al Versuchsfrage W hrend in Versuch 10 ein Pr parat der Sauren Phosphatase unter nativen Bedingungen elektrophoretisch getrennt und ein Enzym Nachweis nach der Elektrophorese durchgef hrt wurde arbeiten wir in diesem Versuch gezielt unter Bedingungen zur Denaturierung der Proteinstruktur zur zus tzlichen Bestimmung des Molekulargewichts der Sauren Phosphatase Hierzu wird das Pr parat der Sauren Phosphatase mit SDS behandelt Spaltung von Wasserstoff Br cken in Kombination mit reduzierenden Substanzen zur Spaltung von Disulfid Bindungen s Einf hrung zur Elektrophorese In Anbetracht der im Versuch 10 nachgewiesenen Verunreinigungen im Pr parat der Sauren Phosphatase durch andere Proteine der Kartoffelknolle treten neben den Ban den der Sauren Phosphatase noch weitere Proteinfraktionen in Erscheinung wodurch nicht entschieden werden kann welche Bande n der Sauren Phosphatase zuzuordnen ist sind Eine Enzym spezifische F rbung der Elektropherogramme scheidet
159. ne into cell cycle synchronized carrot cell suspension cultures and its expression in regenerated carrot plants Plant Cell Tissue and Organ Culture 71 2 157 164 Koncz C Langridge W H R Olsson O Schell J Szalay A 1990 Bacterial and Firefly Luciferase Genes in Transgenic Plants Advantages and Disadvantages of a Reporter Gene Developmental Genetics 11 224 232 Maniatis T Fritsch T Sambrook E 1982 Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories New York Murray M G Thompson W F 1980 Rapid isolation of high molecular weight plant DNS Nucleic Acid Research 8 19 pp 4321 4325 Neumann K H 2000 Some studies on somatic embryogenesis a tool in plant biotechnology Geb uni giessen de geb volltexte 2000 32 1 pdf p000004 pdf Rogers S O Bendich A J 1985 Extraction of DNA from milligram amounts of fresh herbarian and mummified plant tissue Plant Molecular Biology 5 pp 69 76 Literatur 232 Sch fer F Grieb B Neumann K H 1988 Morphogenic and histological events during somatic embryogenesis in intact carrot plantlets Daucus carota L in various nutrient media Bot Acta 101 362 365 Simon R 1984 High frequency mobilization of gram negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5 Mob transposon Mol Gen Genet 196 413 420 Taylor B Powell A 1982 Isolation of plant DNA and RNA BRL Magazin Focus 4 3 pp 4 6 Van H
160. ngen als Beispiel f r Sicherheitsbestimmungen im Gentechniklabor ist im Anhang als Beispiel die Betriebsanleitung f r unser Labor hier in Gie en beigef gt Die hier beschriebenen Methoden dienen als Beispiele f r verschiedene heute in der biochemischen Laborarbeit gebr uchliche Verfahren wobei sich deren Auswahl an den Forschungsarbeiten des Institutes ausgerichtet hat Sowohl f r die Beschreibung der Versuche als auch f r die Organisation der Versuchsdurchf hrung im Praktikum waren die regelm ige Auswertung der f r die einzelnen Praktikumsabschnitte durchgef hrten Kolloquien und vor allem auch die Anregungen die sich als Ergebnisse von Diskussionen mit Absolventen ergaben Die meisten Versuche erfordern quantitatives Arbeiten In dem einen oder anderen Falle wurden auch ltere heute durch modernere Versuchsanordnungen ersetzte Methoden herangezogen Diese w rde man nur noch in Labors mit einer sehr begrenzten Ger teausstattung verwenden Diese lteren Verfahren wie z B die Papierchromatographie dienen jedoch einem sehr viel besseren Verst ndnis des methodischen Prinzips der Chromatographie als ein hochtechnisches Ger t dem der Student lediglich die zu untersuchende Probe appliziert und dann vom Computer das fertig ausgerechnete Ergebnis erh lt wie dies bei den gaschromatografischen Verfahren dann der Fall ist Vorwort II Ein Praktikum mit der Zielsetzung Studenten in die Grundz ge quantitativen biochemischen Arbeiten
161. nier ter Wellenl nge molarer Extinktions Koeffizient Extinktion einer 1Mol pro Liter enthaltenden Substanz L sung bei der Schichtdicke 1cm Ist bekannt l t sich aus der Extinktion einer Testl sung deren Konzentration berechnen c Mol Liter Extinktion d Oft erfolgt noch eine Verd nnung der zu messenden Substanz im Reaktions ansatz Um die Ausgangs Konzentration der Substanz in der Probe berechnen zu k nnen mu noch ein Verd nnungs Faktor eingesetzt werden c Mol Liter Extinktion e Ve eede Ve wobei Vt das Gesamt Volumen des Testansatzes und Ve das Volumen der eingesetzten Probe sind Versuch 7 Enzymkinetik 61 F r die Enzym kinetischen Versuche des 3 Arbeitstages gilt p NPP 18500 Liter Mol d bei 405 nm wobei d 1cm Damit erh lt man endlich die vollst ndige Bestimmungs Gleichung zur Konzentrations Berechnung von p NPP c Mol Liter AE e Vt 18500 e 1 Ve bzw c mMol ml AE 6 0 18500 e 1 e 0 2 Nun mu noch die Umrechnung von mMol ml in uMol ml erfolgen und die Reaktionszeit ber cksichtigt werden da die Einheit f r die Enzym Aktivit t Unit U definiert ist als Enzym Aktivit t U ml Probe uMol Produkt ml et t Reaktionszeit in Minuten Die Enzymaktivit t der Sauren Phosphatase und damit V Umsatzeschwin digkeit ist somit aus folgender Gleichung zu berechnen Enzym Aktivit t U ml Probe V AE
162. nk Zur berpr fung des vollst ndigen Verdaues der DNA wird 3 ul Probe mittels eines analytischen Gels getrennt s 19 8 Der Rest der gespaltenen DNA Probe wird auf ein pr paratives Gel aufgetragen wof r ein 1 iges w v ethidiumbromidhaltiges Agarosegel low melt point Agarose vorbereitet wird Die Probe wird mit 10 ul Ladepuffer versetzt und anschlie end in den vierten Slot Tasche auf dem Gel aufgetragen wobei in dem dritten Slot die ebenso gespaltene DNA nicht transgener Karotten als negative Kontrolle dient Zur Erkennung der Fragmentl nge wurde ca 300 ng L ngenmarker Lamda Hind III in den ersten Slot pipettiert In den siebten Slot wird das mit Hind III gespaltene Plasmid pPCV812 mit MAS Promotor 1 10 ng als Positivkontrolle pipettiert F r die Elektrophorese wird 1x TBE Puffer pH 8 0 verwendet sie erfolgt bei 120 V und 70 mA f r ca 10 Stunden unter K hlung mit Leitungswasser Danach wird das Gel unter UV Licht fotografiert 22 6 Southern Verfahren Southern Blot ist eine der am meisten benutzten Techniken f r die Genomanalyse Southern 1975 Sambrook 1989 Das ist eine effiziente Methode zur bertragung der DNA Banden aus dem Agarosegel auf eine Membran zwecks Hybridisierun sowohl radioaktiv als auch nichtradioaktiv einer Probe Der Transfer der DNA erfolgt mit dem durch Kapilarkr fte erzeugten Pufferstrom Kapillar Transfer Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 221 22 6 1 Gelbehandlung Das Gel wir
163. nstitut f r Z chtungsforschung in K ln Potrykus I amp Spangenberg G 1995 Gene Transfer to Plants Springer Verlag Lab Manual Knippers R 1997 Molekulare Genetik Thieme Verlag 7 Auflage Neumann K H Grieb B 1992 Somatische Embryogenese bei h heren Pflanzen Grunglagen und praktische Anwendung Wiss Zeitschrift der Humboldt Univ zu Berlin R Mathematik Naturwiss 41 3 63 80 Neumann K H 1995 Pflanzliche Zell und Gewebekulturen UTB f r Wissenschaft Ulmer Verlag Sambrook J Fritsch EF Maniatis T 1989 Molecular cloning a laboratory manual 2nd edn Cold Sping Harbor Lab Cold Spring Harbor 9 31 9 46 Gelvin S B Schilperoort R B 1994 Plant Molecular Biology Manual Kluwer Academic Publishers Literatur 234 Anhang 235 Anhang Betriebsanweisung f r ein gentechnisches Laboratorium der Sicherheitsstufe 1 12 Abs 2 GenTSV 1 1 1 2 1 3 1 4 232 Organisation Allgemeine Hinweise Gentechnische Arbeiten d rfen nur in gentechnischen Anlagen durchgef hrt werden Die Durchf hrung einer gentechnischen Arbeit ist aufzeichnungspflichtig Geltungsbereich Das in der gentechnischen Anlage besch ftigte Personal ist vom Projektleiter oder dessen Beauftragten mit den Sicherheitsregeln vertraut zu machen 12 Abs 3 GenTSV Schwangerschaften sowie beeintr chtigte Abwehrlagen sind so fr h wie m glich dem Projektleiter mitzuteilen damit zus tzliche Sc
164. nte werden in 0 5 ml Bs Medium mit 0 5 ppm 2 4 D s 18 1 3 resuspendiert in die Erlemeyerkolben mit den Pflanzenzellen berf hrt und anschlie end f r eine halbe Stunde im Dunkeln cokultiviert Danach wird der Kolbeninhalt zum Absetzen der Zellen in ein 250 ml Becherglas berf hrt und nach 20 30 Min wird der berstand verworfen Versuch 21 Transformation Pfl Zellen 203 das Sediment in einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit B5 Medium berf hrt anschlie end werden die Kolben f r zwei Tage im Dunkeln bei 28 C inkubiert Nach 2 Tage Co Kultur wird wiederum der Kolbeninhalt in ein 250 ml Becherglas berf hrt nach dem Absetzen der Zellen 20 30 Min wird der berstand verworfen und das Sediment in einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit B5 Medium Cefotaxime Tricarcillin berf hrt um A fum abzut ten und zu entfernen Nach eint giger Kultur wird ca 1 ml der transgenen Zellensuspension in autoklavierte Eppendorfreaktionsgef e berf hrt anschlie end bei 4000 5000 Upm f r 10 Min abzentrifugiert Die berst nde werden verworfen Das Sediment wird mit 500 ul X Gluc s 22 2 resuspendiert und bei 37 C f r 12 16 Stunden inkubiert Nach einer erfolgreichen Transformation werden die transgenen Zellen eine blaue Farbe aufweisen Versuch 21 Transformation Pfl Zellen 204 Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 205 6 Arbeitstag Flie schema zur Gen bertragung und zum Gen bertragungsnachweis in Pflanzenzellen Versuch
165. ntgenfilm f r die erforderliche Zeit ca 1 2 Tage bei 70 C exponiert s Radiobiochemie Nach Ablauf der Expositionszeit wird der R ntgenfilm entwickelt Hierzu wird er f r 5 Min im Entwickler inkubiert 1 min in Wasser zum Abstoppen bewegt und 4 min unter Bewegung fixiert Der fixierte Film wird gew ssert und getrocknet Die Abbildung 22 3 zeigt einen Abzug des entwickelten R ntgenfilms Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 229 Abbildung 22 3 Nachweis des Gens MAS GUS in Genom transgener Karottenzellen durch das Southern Verfahren Negativkontrolle nicht transgene Karotten Positivkontrolle pPCV812 MAS GUS P transgene Karottenzelle Die Positivkontrolle mit der k rzeren Laufstrecke ist der gr ere linearisierte Plasmid w hrend die kleinere T DNA der Karottenzellen eine l ngere Laufstrecke aufweist Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 230 Literatur 231 Literatur Anderson M and Young B 1985 Quantitative filter Hybridisation in Hames B Higgins S Nucleic acid hybridisation A practical Approach IRL Press Oxford 1985 Church G Gilbert W 1984 Genomic sequencing Proc Nat Acad Sci USA 81 991 1995 Gamborg O L Miller R A Ojima K 1968 Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cultures Expl Cell Res 50 151 158 Imani J A Berting S Nitsche S Sch fer W H Gerlich und K H Neumann 2002 The integration of a major hepatitis B virus ge
166. nth lt die genetischen Informationen f r die Tumorbildung Tumor inducing Ti Plasmid Verantwortlich f r die Ver nderung der pflanzlichen Zellen ist der Einbau der DNA die aus dem bakteriellen Plasmid stammt in die DNA des Zellkerns der Pflanze Die Expression der Gene dieser zus tzlichen DNA bewirkt u a die Bildung von Hormonen Auxine Cytokinine so da das Wachstum der infizierten Pflanzenzellen ihrer eigenen Kontrolle entzogen ist und daraus ein ungehemmtes Wachstum hnlich einer Tumorzelle resultiert A tum induziert also einen pflanzlichen Tumor F r eine dauerhafte Tumorentwicklung ist es jedoch nach Integration der tumorinduzierenden genetischen Information nicht notwendig da A tum weiter in den Zellen anwesend ist Man kann die Tumorgewebe ohne A tum weiter auf entsprechendem Medium kultivieren Das ist der Beweis da A tum Pflanzenzellen genetisch ver ndert und dadurch autonomes Wachstum erzeugt F r die Besiedlung der Pflanzen durch das Bakterium und die damit verkn pfte genetische Modifikationen der Pflanze durch das Bakterium mu es zu einem Zusammenspiel zwischen Komponenten der Pflanze einerseits und Proteinen die durch Ti Plasmid kodiert werden und weiteren chromosomal kodierten bakteriellen Proteinen anderseits kommen Chromosomal kodiert ist die Synthese von Exopolysacchariden die f r den Kontakt des Bakteriums mit der Pflanze notwendig sind Der Ti Plasmid enth lt die f r den Transfer geeignet
167. nzip der Fl ssig Scintillations Spektrometrie oder auch Fl ssig Scintillations Z hler englisch LSC Liquid Scintillation Coun ter Damit sind je nach Ger te Ausstattung Ausbeuten von ber 60 f r H und von ber 90 f r C damit zu erreichen Das Prinzip der Radioaktivit tsmessung mit dem LSC beruht darauf da aliquote Teile einer Probe markierter Substanzen mit einem Gemisch fl ssiger organischer Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 146 Scintillatoren Scintillator Cocktail in einem durchsichtigen Probengef Vial aus geeignetem Plastikmaterial oder Glas vermischt werden Durch die Strahlung von 3H oder 4C werden Scintillator Molek le kurzzeitig angeregt Zum Erreichen ihres energetischen Grundzustandes erfolgt die Abgabe der Anregungsenergie in Form von Lichtquanten die in einer geeigneten Anordnung gemessen werden k nnen Die Anregung von Scintillator Molek len und damit die Menge der abgestrahlten Lichtquanten sind dabei direkt proportional der Energie der anregenden Strahlung A 1 Anregungsvorg nge im Scintillator Aus Abb 15 1 ist der Proze der Anregung von Molek len des Scintillator Cocktails durch Strahlung zu ersehen Die 8 Strahlung aus der mit dem Cocktail vermischten markierten Probe trifft zun chst auf die in gro er Menge vorliegenden L sungsmittel Molek le meist Toluol oder Xylol s Abb 15 2 f hrt zu deren Anregung und schlie lich zur Abstrahlung von Lichtquanten mit eine
168. olisiert wird B Reagentien f r alle Versuche zur Enzym Kinetik a IN NaOH b 0 IN NaOH c Citrat Puffer 0 1M pH 5 6 21 0g Citronens ure x1 H20 in ca 200ml A dest l sen Versuch 7 Enzymkinetik 58 200ml IN NaOH a zugeben und mit A dest ad 1 Liter auf f llen Davon 69ml mit 31ml 0 1N NaOH b mischen d p Nitrophenylphosphat L sung 60mM 2 33g p NPP in A dest l sen und mit A dest ad 100ml auff llen L sung bei 0 C ca 2 Wochen haltbar e p Nitrophenylphosphat L sung 20mM f r Versuch 4 0 777g p NPP in A dest l sen und A dest ad 100ml auff llen L sung bei 0 C ca 2 Wochen haltbar f Serum Albumin L sungen 1 4 ig in Citrat Puffer c 2 1 ig in Citrat Puffer c g Saure Phosphatase Lyophilisat aus Kartoffeln stabilisiert mit Serum Albumin Stamml sung 1 mg Lyophilisat wird in 2ml kalter 4 iger Albumin L sung fl gel st Vor Kursbeginn Herstellung einer Verd nnung aus 0 2ml Stamml sung 1 ige Albumin L sung f2 ad 10 ml Stabilit t bei 0 C begrenzt h Citrat Puffer 0 1M pH 2 0 i Citrat Puffer 0 1M pH 4 0 jJ TRIS HCI Puffer 0 1M pH 8 0 k Eis bzw K hlschrank zum Zwischenlagern von Enzym und Substrat L sungen 1 Photometer bei einer Wellenl nge von 405 nm m Thermostaten 30 C Versuch 7 Enzymkinetik 59 C Durchf hrung C 1 1 Versuch Enzymatische Spaltung von p Nitrophenylphosphat durch Saure Phosphat
169. on AS Spot P Ermittlung der von der Untergrundf rbung des Chromatogramms bereinigten Extinktion des AS Flecks Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 81 Y Wert Y X e b a Vorzeichen von a ber cksichtigen Einsetzen der konzentrationsspezifischen Extinktion eines AS Flecks in die durch Eichchromatogramme erstellte Regressionsgleichung s Tabelle 8 1 Volumen der Probe Vol Faktor VE Volumen der Auftrassmenge 2000 ul in unserem Fall VF a 100 Oul ug AS Probe Y e VF ug AS in der gesamten AS Fraktion der Probe Tabelle 8 1 Regressionsgleichungen f r die einzelnen Aminos uren Y Wert AS Konzentration in ug Chromatogramm b e X Wert a Vorzeichen von a ber cksichtigen Aminos ure Asparagins ure 4 5388 Glycin 0 4292 Alanin 0 9323 Valin 4 0606 Leucin 0 8913 c Die Auswertung zur Aminos ure Konzentration kann nach dem folgenden Vordruck nach der beschriebenen Methode vorgenommen und die Ergebnisse eingetragen werden Versuch 8 Auswertung der Papierchromatografie 82 Konz Stufe A B C oder D bitte ankreuzen nicht vergessen sonst kann keine Bewertung der Ergebnisse erfolgen Extinktion Papier Blindwert gegen 50 thanol K Sissies mit 6 Nachkommastellen Konzentrationsberechnung f r jede Aminos ure AS Gew mg Ext VF ug Probe Versuch 8 Auswertung der Papierchrom
170. org nge abgeschlossen wird die S ule mit gen gend Puffer vorsichtig beschickt wobei darauf zu achten ist da die S ule zwischenzeitlich nie trocken l uft C2 B Konzentrationsbestimmung von RNA und AMP im Sephadex Eluat a Sind etwa 10 Sephadex Fraktionen gesammelt C2 A je 1 ml aus jeder Fraktion in ein graduiertes Reagensglas mit gleicher Numerierung berf hren 1 ml Orcin Reagens Pipettierhilfe zusetzen und den Ansatz 45 Minuten im Wasserbad kochen b Zu diesem Ansatz auch einen Blindwert anstelle mit 1 ml des S ulen Eluats mit 1 ml Phosphat Puffer wie unter a ansetzen c Die Proben unter flie endem Leitungswasser abk hlen mit A dest zur Marke 4ml auff llen mischen und im Fotometer bei 670 nm gegen den Blindwert messen d Die gemessenen Extinktionswerte der Sephadex Fraktionen in die vorbereitete Tabelle unter D2 Auswertung eintragen und die RNA und AMP Peaks nach dem dort angegebenen Schema weiter auswerten D Auswertung D1 Auswertung der Eichkurven f r RNA und AMP a Die f r die RNA und AMP Eichl sungen erhaltenen Extinktionen zun chst in die folgende vorbereitete Tabelle eintragen und die Eichfaktoren aus Konzentration Extinktions Mittelwert errechnen s folgende Tabelle A A Konzentration Extinktionen Konzentration Extinktionen 100ug ml Mittelwerte Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 53 DNA A MD Konzentration Extinktionen Konzentration Extinktionen Konzentration Extin
171. orid Fast RED TR zu einem Azofarbstoff nach folgendem Reaktionsschema umgesetzt wird NapP03 HO cents gt ne gt NozHPOy Nophthy phosphat Nophthol Azofarbstoff Diozoniumsolz Versuch 10 Elektrophorese nativ 108 C Durchf hrung C1 Ger te Vorbereitung und Elektrophorese a Die Gelkasetten mit Klammer versehen Lufteinschl sse zwischen Gel und Glasplatten eventuell unter A dest durch vorsichtiges Dr cken auspressen und einen Plastik Probenkamm mit 12 Probentaschen an der Glaskasettenseite mit Gelaussparung leicht in das Gel eindr cken Mit einem Filzschreiber das rechte Klebeband markieren welches der Probentasche 12 zugewandt ist wichtig f r die sp tere Markierung des Elektropherogramms b Die Gummidichtung des oberen Puffertrogs mit Silikonpaste leicht einfetten und die Gelkasette vorsichtig einschieben Danach die Andruck Vorrichtung an der Unterseite des Puffertrogs arretieren Das Gel soll w hrend der Elektrophorese die einzige Verbindung zwischen oberem und unterem Puffergef bilden so da auf Dichtheit der Anordnung zu achten ist c Den unteren Puffertrog mit ca 700 ml TEB Puffer B 2 bef llen d Den oberen Pufferbeh lter mit Gel in das untere Pufferreservoir einsetzen und die Puffer Einf llh he im unteren Tank einjustieren Der Puffer Spiegel sollte ca lcm ber dem unteren Rand der oberen Pufferkammer stehen e Nun auch den oberen Puffertrog zun chst mit wenig TEB Puffer B
172. pektren von NADP und NADPH s S 85 nach ca 10 15 Min Ablesen der Extinktionen Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung 88 D Auswertung Berechnungen Blindwert Saccharose Glucose Ges Glucose Berechnung von AE AE1 E12 E11 AE2 E22 E21 AE3 E32 E31 ABIT swesstesvestant AEZ socsstescescsse NES sis deaissicsios Berechnung von AE Glucose AE3 AF1 AE Glucose AE Saccharose AE2 AE1 AE Glucose AE Saccharose Einsetzen von AE Glucose und AE Saccharose in die Formeln nach der Testsatz Vorschrift AE Glucose Glucose g l 5 441 e Glucose g l Saccharose g l 10 34 o Saccharose g l Der Wert f r die Me wellenl nge von 340 nm betr gt 6 3 Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung 89 Zum Schlu noch ber cksichtigen da zur Aufnahme der eingedampften Zucker Fraktion 10 ml A dest verwendet wurden das Proben Volumen demnach also 10 ml betr gt Glucose mg 10 ml Probe sss r000000 Saccharose mg 10 ml Probe 0seeee0 Die Konzentrationsstufe der Probe war ABCD bitte ankreuzen Versuch 9 Enzymatische Zuckerbestimmung 90 Einf hrung in die Elektrophorese 91 Grundlagen der Elektrophorese und deren Anwendungsm glichkeiten zur Trennung von Proteinen Einf hrung zu den Versuchen 10 und 11 Versuch 10 _Elektrophorese eines Pr parates der Sauren Phosphatase unter nativen Bedingungen mit anschlie end
173. phadex S ule wird trockenes Sephadex in f r die Trennauf gabe geeigneten Puffern gequollen s Wasseraufnahme von Sephadex obige Tabelle und vorsichtig in einer Glas oder Plastik S ule aufgeschichtet Je nach dem Vernetzungsgrad der einzelnen Sephadex Typen ergibt sich nach der Packung der S ule das sogenannte innere Volumen s o das von dem Polydextran Netzwerk gebildet wird und das u ere Volumen s o im Puffer rund um das Gelnetzwerk Je nach dem Sephadex Typ k nnen nun relativ kleine Molek le innerhalb oder unterhalb des Trennbereichs s obere Tabelle in das innere Volumen der Sephadex Matrix diffundieren w hrend sich gr ere Molek le nur im u eren Volumen aufhalten k nnen Wird die Sephadex S ule mit Puffer kontinuierlich durchstr mt eluiert werden die gr eren Molek le im u eren Gelvolumen im sogenannten Ausschlu bereich aus der S ule eluiert w hrend die im Gelnetzwerk befindlichen kleineren Molek le im Trennbereich der Sephadex S ule entsprechend ihrem Molekulargewicht verz gert die S ule verlassen umgekehrter Siebeffekt Hierzu ein Beispiel Substanz 1 MG 2500 Substanz 2 MG 10000 Trennbereich G 25 1000 5000 Ausschlu bereich G 25 gt 5000 s obige Tabelle Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 47 Substanz 1 kann in das Gelnetzwerk diffundieren und wird also entsprechend ihrer Gr e Molekulargewicht in der Elution verz gert Mehrere Substanzen mit Molekulargewich
174. plan 1 Arbeitstag 173 18 1 Gewinnung von Zellsuspensionen 175 18 1 1 Sterilisation von Karottensamen 175 18 1 2 Kulturbedingungen 175 18 1 3 N hrmedium 175 19 1 Bakterienvermehrung 177 19 2 Herstellung kompetenter Zellen des Bakterienstamms 177 E coli HB101 19 3 Transformation des Bakterienstamms HB101 mit 178 Plasmid pPCV812 19 4 Ausplattieren transformierter Bakterien und Selektion 180 transformierter Klone 2 Arbeitstag 183 19 5 Plasmidvermehrung 185 19 6 Kleine Plasmid Pr paration Mini prep 185 19 6 1 Reinigung von Plasmid DNA 185 19 6 2 F llung der DNA mit Isopropanol 186 19 7 Quantitative und qualitative Bestimmung des DNA Gehaltes 186 19 8 Agarose Gelelektrophorese 187 19 9 F rbung der DNA mit Ethidiumbromid 187 3 Arbeitstag 189 20 1 Identifizierung des Plasmids pPCV 812 191 20 2 Konjugation 191 4 Arbeitstag 195 20 3 Konjugation des E coli Stammes S 17 1 197 enth lt Plasmid 812 mit Agrobakteriun tumefaciens Stamm GV3101pMP90 RK 5 Arbeitstag 199 21 1 Transformation pflanzlicher Zellen 200 21 2 Methoden der Gen bertragung 201 21 3 Vitalit tstest der Karottenzellen 202 21 4 Co Kultur von A tum mit Pflanzenzellen 202 Versuchs und Zeitplan 172 6 Arbeitstag 205 22 1 Nachweis des eingebauten Gens 206 22 2 Der Einsatz von Farbstoffen X Gluc 206 7 Arbeitstag 209 22 3 Polymerasekettenreaktion Polymerase Chain Reaction PCR 210 22 3 1 Prinzip der PCR Methode 210 22 3 2 PCR Reaktionsansatz 212 22 3 3 Ge
175. ppelten Enzyms durch Substrat zugabe Substrat p Nitro phenylphosphat g Abwarten der Farbreaktion 20 40 Min und Beenden durch NaOH Zusatz B Material a Rubisco Standardpr parat b Carbonat Bicarbonat Puffer pH 9 6 jeweils frisch ansetzen 1 59g NaCO 2 93g NaHCO A dest ad 1 1 c Waschpuffer I Tris HCl pH 7 2 12 11g Tris 8 75g NaCl A dest ad 1 1 d BSA L sung 5 00g bovine serum albumine Waschpuffer I ad 100 ml e Kaninchen Anti Rubisco Antiserum f Waschpuffer II Tris HCl pH 7 2 50 ul Tween 20 BSA L sung d ad 100 ml siehe Versuche mit Saurer Phosphatase 3 Arbeitstag s S 57 Versuch 12 ELISA 122 g Ziege Anti Kaninchen Antik rper gekoppelt mit Alkalischer Phosphatase Sigma Product No A 8025 h Waschpuffer III Tris HCl pH 7 2 50 ul Tween 20 Waschpuffer Iad 100 ml 1 Substrat L sung f r Alkalische Phosphatase 100 mg p Nitrophenylphosphat Carbonat Bicarbonat Puffer b ad 100 ml j NaOH 2n C Durchf hrung C1 Vorbereitung der Mikrotiterplatten im Institut a Das zu untersuchende Rubisco Pr parat B a wird zun chst in Carbonat Bicarbonat Puffer B b gel st Jeweils 200 ul werden nach dem beiliegenden Pipettiermuster s S 121 in die wells der Mikrotiterplatte pipettiert b Die beschickte Titerplatte wird nun 18 Stunden bei 4 C im Dunkeln inkubiert c Danach erfolgt ein 3 maliges Waschen des an die Plastikwandung der wells adsor bierten Rubisco P
176. punkte sind auf einer gedachten Linie so hoch vom unteren Rand der Platte zu w hlen da sie nicht in das Laufmittel eintauchen Dabei ist weiterhin sorgf ltig darauf zu achten die Beschichtung der Platte beim Auftrage proze nicht zu besch digen da sonst der kapillare Aufstieg des Laufmittels im Sorptionsmaterial der Platte nicht funk tionieren kann Die Spitze der verwen deten Pipette sollte nur ganz vorsichtig auf die Platte gesetzt werden Dabei kann man sich vielleicht am besten helfen indem man ein Lineal zur St tze der auftragenden Hand ber die Platte h lt Auch sollte jeder Hautkontakt mit der Plattenoberfl che vermieden werden Weiterhin ist die Platte nur an ihren R ndern vorsichtig Fingern gel zu halten und zu transportieren Die mit dem F n gut getrockneten D nnschichtchromatogramme schnell in den Chromatografietank stellen 2 DCs pro Tank und diesen sofort wieder verschlies sen damit die Kammers ttigung nicht allzusehr gest rt wird Die Platte sollte bei Raumtemperatur in etwa 1 5 2 Stunden entwickelt sein wobei das Laufmittel etwa im oberen Viertel angelangt sein sollte aufsteigende Chromatografie e Nach Ablauf der Chromatografie die Platten aus dem Tank nehmen und unter dem Abzug Geruchsbel stigung gegebenenfalls unter Einsatz des F ns trocknen Bereits zu diesem Zeitpunkt wird die Laufmittelfront der noch feuchten Platte mit einem Bleistift nachgezogen sp ter nach Trocknung der Platte ist
177. r Monoclonale AK werden in Zellkulturen hergestellt wobei eine Fusion von differenzierten B Lymphocyten mit Myelomazellen B Tumorzellen stattfindet blicherweise stammen beide Zell Linien von M usen Diese Zellen produzieren absolut identische Antik rper Im Gegensatz dazu werden polyclonale Antik rper in Ratten oder Kaninchen nach dem Prinzip der Immunabwehr Immunantwort gebildet Diese Antik rper sind nicht 100 ig identisch weshalb es h ufiger zu Kreuz Reaktionen kommen kann Dies bedeutet da sich auch chemisch unterschiedliche Substanzen am selben Antik rper binden k nnen Bei einem ELISA Test unterscheidet man zwischen direkten indirekten und kompetitiven Verfahren Beim direkten ELISA Test wird die zu bestimmende Substanz direkt an der Menge der bindenden Antik rper bestimmt Dagegen erfolgt beim indirekten ELISA Test der Nachweis ber markierte zus tzliche Antik rper Beim kompetitiven ELISA Verfahren konkurrieren schlie lich sekund re Antik rper und zu bestimmende Substanz um dieselben Bindungsstellen am prim ren Antik rper A1 Prinzip der Konzentrationsbestimmung von Rubisco Protein Zur Bestimmung der Menge an Rubisco Protein wird ein Verfahren beschrieben das Herr Dr Gro im Rahmen seiner Doktorarbeit s Literatur verwendet hat Das in Carbonat Bicarbonat Puffer pH 9 6 gel ste Antigen hier Rubisco Standardpr parat oder gereinigte Rubisco aus Blattextrakten wird nach einem bestimmten Sch
178. r ckt 2 22e10 DpM 10 mMol dann entspricht die in einer Substratprobe gemessene Radioaktivit t von 2 22e10 DpM einer Substratmenge von 10 uMol woraus der Substratumsatz des Enzyms pro Zeiteinheit die Enzymaktivit t berechnet werden kann 2 Bei der Untersuchung eines Stoffwechselablaufs wird zun chst z B die in Glucose vorhandene Radioaktivit t auf die per HPLC bestimmte Glucose Menge bezogen um ber die so erhaltene spezifische Glucose Radioaktivit t den Markierungsgrad die spezifische Radioaktivit t von ebenfalls ermittelten Glucose Abbauprodukten einordnen zu k nnen Abbauprodukte mit hoher spezifischer Radioaktivit t d rften an prominenter Stelle im Abbauweg der markierten Glucose stehen 3 An Pulse Chase Experimenten wird in einer Pulsphase unter Verabreichung eines z B C markierten Pr cursors die spezifische Radioaktivit t von Stoffwechsel Abbauprodukten dieser Substanz ermittelt In einer darauf folgenden Chase Phase Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 141 wird der gleiche Pr cursor ohne Markierung C verabreicht Nach dieser Chase Phase wird nun wieder die spezifische Radioaktivit t der gleichen Metaboliten ermittelt Das Ausma der Verd nnung der spezifischen C Radioaktivit t der Pulse Phase durch C im Verlauf der Chase Phase erm glicht somit Einblicke in die Stoffwechsel Labilit t bzw Stabilit t von untersuchten Substanzen Dazu ein Beispiel DpM C mg Prot
179. r gt man die ermittelten Retentionszeiten f r die 4 Alkohole auf der logarithmisch geteilten Y Achse in Abh ngigkeit von der Anzahl an Kohlenstoff Atomen auf der X Achse auf ergibt sich eine lineare Abh ngigkeit beider Gr en Diese Darstellung ist auch hilfreich wenn man die Retentionszeit l nger kettiger Alkohole absch tzen wollte Aus dem Beispieldiagramm s S 36 ergibt sich z B f r n Pentanol eine Retentionszeit von ca 78 Minuten B Material 1 Gaschromatograf mit WLD und Ankopplung an einen Computer ber eine Analog Digital Wandler Steckkarte Trennbedingungen S ule Chromosorb 102 polar S ulen Temperatur 125 C WLD Temperatur 160 C Versuch 3 Gaschromatografie allgemein 34 Einspritzblock Temperatur 160 C Tr gergas Helium Tr gergas Flu rate 60 mI Minute 2 Mikroliter Spritze 3 Probe je 5ml Methanol Athanol und n Propanol C Durchf hrung a Zun chst abwarten bis der Gaschromatograf auf eine S ulen Temperatur von 125 C eingestellt ist Im Hauptmen des Computerprogramms Chromatogramm aufnehmen anw hlen und eine gerade Basislinie bei Verst rkung x8 und 50 mA Br ckenstrom abwarten b Mittels S5ul Spritze 2 5ul des Probengemisches aufziehen und das Restvolumen des Kolbens mit Luft f llen Spritze waagrecht halten die Nadel mit der Hand unterst tzen und sie vorsichtig durch das Septum des Einspritzblocks durchstechen und einschieben Danach den Kolben z
180. r Wellenl nge von 200 300 nm Wie sp ter bei der Besprechung der apparativen Ausstattung eines LSC gezeigt wird s A 2 kann Licht bei dieser Wellenl nge jedoch noch nicht zur Messung gelangen Im Scintillator Cocktail sind daher prim re und sekund re organische Scintillatoren in geringer Konzentration vorhanden die infolge ihrer Fluoreszenz Licht mit l ngerer Wellenl nge abgeben Der prim re Scintillator z B PPO s Abb 15 2 wird durch die Lichtquanten des L sungsmittels angeregt und strahlt Licht bei 340 400 nm ab Aber auch diese Wellenl nge kann apparativ noch nicht empfindlich genug ausgewertet werden Erst der sekund re Scintillator z B POPOP s Abb 15 2 wird durch Lichtquanten der prim ren Scintillatoren zur Abgabe von Licht mit einer Wellenl nge von 400 470 nm angeregt Diese Wellenl ngen fallen mit dem Maximum der Me empfindlichkeit der Photokathode s Abb 15 3 von sogenannten Photo Multipliern PM oder auch Sekund r Elektronen Vervielfachern SEV zusammen Versuch 15 Liquid Scintillation Counting 147 Abb 15 1 Anregung von Scintillator Molek len und Eigenschaften verschiedener L sungsmittel Aus COOPER 1981 Dr ee O e L sungsmittel an nm E u L a ER pr Se R IN J R Wechselwirkung der 8 Teilchen mit dem aromatischen L sungsmittel und anschlie ender Fluoreszenz Abstrahlung e repr sentiert das B Teilchen o ist das L sungsmittel Molek l im Grund zust
181. r dem Puf fer pH als Anionen Bei anderen Elektrophorese Verfahren mit horizontalem Tr germaterial wie z B St rke oder Agar Gelen mit der M glichkeit Proteinproben in der Gelmitte aufzu tragen sind sowohl als Kationen als auch als Anionen vorliegende Proteine trennbar Bei der Vertikal Acrylamidgel Elektrophorese mit Probenauftragung an der oberen Gelseite sind aber nur Proteine entweder als Kationen oder als Anionen zu trennen Die angelegte Elektroden Polarit t entscheidet somit ber die Trennung von Kationen oder von Anionen In Abh ngigkeit vom pH Wert des Puffersystems erh lt man folglich v llig unterschiedliche Trennergebnisse Im brigen k nnen Proteine mit einem IP der dem pH Wert des Puffers entspricht w hrend der Elektrophorese nicht wandern da sie keine Netto Ladung aufweisen Sie bleiben auch bei hoher Feldst rke am Auftragspunkt liegen Neben der Gr e s o ist auch die Form von Molek len f r ihre elektrophoretische Beweglichkeit ausschlaggebend bei Proteinen also deren Terti r und Quart r Struktur F r die Bestimmung des Molekulargewichts von Eiwei molek len gibt es die M glichkeit h here Struktur und Aggregierungsformen durch Detergentien z B SDS Sodium Dodecyl Sulfat zu zerst ren wodurch nun nur die Gr e der Prim rstruktur der Proteine Molekulargewicht f r ihre Trennung entscheidend wird Hierzu werden die Proteinproben mit SDS haltigem Puffer Proben Puffer vorbehandelt und auf S
182. r gel st und bei 20 C aufbewahrt Im Gegensatz zur radioaktiv markierten Sonde kann man DIG markierte Sonden f r eine lange Zeit lagern Die radioaktiv markierte Sonde ist f r ihre Sensibilit t bekannt Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 225 Nach Hybridisierung an die Ziel DNA auf der Membran mit Anti Digoxigenin alkalische Phosphatase Konjugat wird die Membran in einer Farbreaktionsl sung ikubiert Nach der Abspaltung des Substrats werden die Banden auf der Membran sichtbar Das Schema soll das Prinzip einer nicht radioaktiven Sonde und anschlie ender Detektion darstellen Inkubation der Membran mit Blocking Puffer S ttigung der freien Stellen Hybridisierung der Membr mit 1 E E Hybridisierung der Membr SX mit Anti DIG alkalisches bd Phosphatase Konjugat Inkubation der Membran mit Farbreaktionsl sung die Bande wird sichtbar Versuch 22 Nachweis des Fremdgens 226 Radioaktive Markierung der Sonde s a S 129 ff Die radioaktive Markierung der Sonde erfolgt mit dem Rediprime Fa Amersham 50 ng des isolierten Fragments wird in 45 ul bidest H O aufgenommen und 5 min bei 95 C denaturiert Sofort danach wird sie 5 min auf Eis gek hlt um die DNA Einzelstr nge zu konservieren anschlie end wird kurz abzentrifugiert Denaturierte DNA wird zu dem auch die DNA Polymerase enthaltenden Labellingmix Fa Amersham gegeben und durch Schnippen gemischt bis blaue F rbung auftritt Dazu wird 5 ul 50 u
183. ransport und Entsorgung Laborkittel und Einmalhandschuhe sind vor dem vor bergehenden Verlassen des Labors innerhalb desselben abzulegen eine Ausnahme ist nur bei unmittelbar anschlie endem Betreten eines benachbarten Labors zugelassen Chemikalien d rfen au erhalb des Labors nur in geschlossenen Beh ltnissen transportiert werden Glasbeh lter m ssen dabei immer mit Ger ten transportiert werden die ein sicheres Halten und Tragen erm glichen z B Eimer oder Tragek sten mit Haltegriffen Grunds tzlich gilt da alle Abf lle die biologische Agenzien einschlie lich Nukleins uren enthalten k nnen autoklaviert werden sollen Bei der Entsorgung ist grunds tzlich darauf zu achten da durch die Wahl entsprechender Sammelbeh lter Verletzungsgefahren durch spitze scharfkantige oder splitternde Gegenst nde auch auf dem weiteren Entsorgungsweg ausgeschlossen sind Unfall und Erste Hilfe 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 5 1 Anhang 238 Unf lle im Labor sind sofort dem Projektleiter oder einem anderen Vorgesetzen mitzuteilen und zu protokollieren Verletzungen im Labor sind im Rahmen der blichen Erste Hilfe Ma nahmen sofort zu desinfizieren zu versorgen und anschlie end dem Projektleiter oder einem anderen Vorgesetzten mitzuteilen Diese haben ggf einen Krankenwagen anzufordern und einen Bereitschafts oder Betriebsarzt hinzuziehen rzte und Rettungspersonal sind grunds tzlich unter Vorlage de
184. rbad bei 30 C 5 Min vortemperieren Enzyml sung 0 1 0 1 0 1 0 1 Start Uhrzeit Ihwsisae Kelle wei Geeeseaate euaecateds lieceseasets 2evavecses Mischen weiter inkubieren bei 30 C MI 1N NaOH a 2 0 2 0 2 0 2 0 nach Minuten 0 30 0 30 0 30 0 30 Ges Vol des Ansatzes ml 6 0 6 0 6 0 6 0 b Messung der Extinktionen c der Proben bei 405 nm diesmal nicht gegen A dest sondern Probe 2 gegen Probe 1 Probe 4 gegen Probe 3 Probe 6 gegen Probe 5 Probe 8 gegen Probe 7 Versuch 7 Enzymkinetik 68 Proben Nr Extinktionen gegen die je weiligen Kon trolle D 3 Auswertung a Auftragen der Extinktionswerte in ein Umsatz Diagramm in Abh ngigkeit vom pH Wert und Ermittlung des pH Optimums fiir die Saure Phosphatase Das pH Optimum der Sauren Phosphatase liegt nach unserem Versuch bei Perc rrcccccccccccccccccce C 4 4 Versuch Enzymatische Spaltung von i i ngi Keit von der Substrat Konzentration p NPP zur Ermittlung des Km Wertes_ ohne Einflu von Hemm faktoren W hrend bei den Versuchen 1 3 jeweils bei Substrat berschu gearbeitet wurde wird die Konzentration der Substratstamml sung e in diesem Versuch von 60 auf 20 mM zun chst vermindert und dann stufenweise erh ht Anmerkung Da p Nitrophenylphosphat in w ssriger L sung bereits bei 30 C spontan hydrolysiert werden kann ist bei jeder Substrat
185. renge Proportionalit t zwischen Impulsh he und Energie der vorhandenen Gamma Radionuklide Versuch Beschreibung und Arbeitsanleitung zu diesem Versuch s Vers 17 zu erwartendes Standard y Radionuklid Z hlrate Zerfallsrate abweichung Imp sec Bq IA s 1370 s Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 138 Eigenschaften dieser Radionuklide y Radionuklid y Energie Halbwertszeit Zerfallsart MeV er 0 796 2 15 Jahre Ms 0 661 30 Jahre B WK 1 46 1 28 10 Jahre K x 137 Cs zerf llt unter Aussendung von 8 Strahlung zu Ba Dieses Nuklid liegt nur sehr kurz in angeregtem Zustand vor und geht unter Aussendung von Y Quanten in den energetischen Grundzustand ber K ist ein Radionuklid unter den brigen nicht radioaktiven Kalium Nukliden Es sendet zu etwa 89 B Strahlung und zu etwa 11 K Strahlung aus Dies ist eine charakteristische R ntgen Strahlung die aufgrund von electron capture Elektroneneinfang durch den Kern aus der K Elektronenschale entsteht R ntgenstrahlung ist wie Gamma Strahlung elektromagnetischer Natur und wird durch den GKSZ erfa t D Allgemeine Ausf hrungen zu der weiteren Auswertung radiochemischer Me werte Nun ist die Z hlrate eines Pr parates bekannt auch ihre statistische Absicherung Entspricht nun eine Z hlrate der Zerfallsrate eines Radionuklids Die Anwort ist NEIN Z hlrate Zerfallsrate IpM DpM Erst
186. robe unter Ber cksichtigung des Anteils der Untergrundstrahlung IMPULSE P N R IMPULSE N S Me zeit P N Me zeit NY P N von Probe Nulleffekt N von Nulleffekt Ergebnis Pilze N sse eventuell Milchpulver k nnen auch heute noch je nach Ortlichkeit ihrer Produktion in unterschiedlichem Ma e y Radionuklide mit l ngerer Halbwertszeit Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 137 enthalten die anl lich der Tschernobyl Katastrophe im Jahre 1986 ber die Welt verteilt wurden Mit der in diesem Versuch durchgef hrten Messung erhalten wir eine grobe Information dar ber ob die Probe als kontaminiert einzustufen ist 6 Ermittlung der y Radioaktivitat der Hauptkomponenten einer in Tschechien gesammelten Steinpilz Probe Nach der vorherigen Bauschanalyse ist nicht bekannt welche einzelnen Y Radionuklide die Gesamtz hlrate der Probe ausmachen und wie eine eventuelle potentielle Gef hrdung bei dem Verzehr dieses Nahrungsmittels zu beurteilen ist Dabei soll nur auf Energie und Halbwertszeit von vorhandenen Radionukliden nicht aber auf deren Aufnahme aus der Nahrung Wirkung im K rper und biologische Verweildauer eingegangen werden Identifizierung und Strahlungsbestimmung der Hauptkomponenten vorhandener Y Radionuklide erfolgen wiederum mit dem GKSZ mit einem NaJ Kristall wobei anstelle des Impulsz hlers eine Computer gesteuerte Vielkanal Me einrichtung verwendet wird Im GKSZ besteht st
187. roteins mit je 250 ul Waschpuffer I B c wobei die Platte zwi schenzeitlich zur Entfernung der vorherigen Waschfl ssigkeit aus den wells kr f tig auszuklopfen ist d Die an der Wandung der wells durch die zugegebenen Antik rper noch nicht abges ttigten Bindungsstellen werden mit je 250 ul BSA L sung B d blockiert Inkubation der Platte 1 Stunde bei 25 C e Dreimaliges Waschen der wells mit jeweils 250 ul Waschpuffer I B c f r je 10 Minuten und Platte ausklopfen f Zur Bindung des ersten Antik rpers B e 1 1000 verd nnt in Waschpuffer II B f an die sorbierten Antigen Bindungsstellen Rubisco Protein werden je 200 ul des verd nnten ersten Antik rper Ansatzes in die wells pipettiert und die Platte 1 5 Stunden bei 25 C in einer wasserges ttigten Atmosph re inkubiert g Dreimaliges Waschen der wells mit jeweils 250 ul Waschpuffer II B f f r je 10 Minuten und Platte zwischendurch ausklopfen C2 Arbeiten im Rahmen des Praktikums h Nun erfolgt die Bindung des 2 Antik rpers Ziege Anti Kaninchen AK B g 1 1000 mit Waschpuffer II B f verd nnt wird in einer Menge von jeweils 200 ul in jede Vertiefung well der Platte pipettiert Die Platte wird f r 1 Stunde bei 25 C inkubiert Versuch 12 ELISA 123 i Dreimaliges Waschen der wells mit jeweils 250 ul Waschpuffer III B h f r je 10 Minuten und Platte zwischendurch ausklopfen j Nun wird der Test auf Alkalische Phosphatase durchgef hrt 200 ul der Subs
188. s Verzeichnisses biologischer Agenzien im Labor ber m gliche Infektionsgefahren zu informieren Gegenst nde die eine Verletzung verursachen sowie andere m gliche Infektionsquellen sind sicherzustellen Unf lle und Verletzungen mit biologischen Agenzien sind zus tzlich dem Beauftragten f r die Biologische Sicherheit mitzuteilen Kontaminierte K rperteile sind mit alkoholischem H ndedesinfektionsmittel zu desinfizieren Kontaminierte Fl chen mit Desinfektionsmittel auf Aldehyd oder Peroxyessigs ure Basis desinfizieren Gesichtsschutz Einmal Handschuhe und die betroffenen Laborbereiche f r andere deutlich warnend zu markieren Gr ere kontaminierte Fl ssigkeitsmengen mit aufsaugendem Material bedecken dieses ist anschlie end in geeigneten Beh ltern einzusammeln und zu sterilisieren autoklavieren Kontaminierte Kleidungsst cke zu sammeln und durch Autoklavieren zu dekontaminieren Verzeichnis von Arbeitsanweisungen und Auflistungen Nach Beendigung der Arbeiten im Labor und vor dem Verlassen desselben sind die in der Betriebsanweisung Hygiene im Biologischen Sicherheitslabor der Sicherheitsstufe 1 und 2 in der Betriebsanweisung Entsorgung biologischer oder biologisch kontaminierter Agenzien und Materialien im Biologischen Sicherheitslabor der Sicherheitsstufe 1 und 2 in der Betriebsanweisung Gef hrliche Arbeitsstoffe BG Chemie Sichere 5 2 5 3 5 4 5 5 Anhang 239 Biotechnologie und in den All
189. s im Internet http www gbf braunschweig de unter DSM No 7490 bei DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Braunschweig Der Agrobacterium Stamm GV3101 pMP9ORK wird bei 28 C vermehrt Nach der Inkubation im N hrmedium mit Ampicillin und Rifampicin werden A tum Kolonien die das Plasmid aufgenommen haben selektiert Das Plasmid von E coli S 17 1 ist dar ber hinaus besser f r die Konjugation mit A tum geeignet f r die Vermehrung der Plasmiden ist dagegen der E coli Stamm HB101 besser verwendbar h here Ausbeute Darum wird die Vermehrung der Plasmid DNA zun chst mit letzterem durchgef hrt Die bertragung des aus dem HB101 isolierten Plasmides pPCV812 auf den Stamm S 17 1 folgt dem weiter oben beschriebenen Verfahren f r HB101 s 1 und 2 Arbeitstag Heutige Verfahren zum Gentransfer a Direkter Gentransfer Protoplasten Zelle ohne Zellwand nackte Zelle Polyethylenglykol PEG Elektroporation Partikelbeschuss Technik b Indirekter Gentransfer Agrobakterium tumefaciens das im Praktikum verwendete Verfahren Parasexualitat Prokaryonten verf gen generell ber keine echte Sexualit t weil das typische Fehlen eines Zellkerns weder Meiose noch Karyogamie gestattet Versuch 20 Konjugation 193 Ein Austausch genetischen Materials ohne einer Meiose Karyogamieabfolge also ber Parasexualit t spielt bei Prokaryonten eine ganz erhebliche Rolle und wird von G
190. s Steuer und Auswerte Programm am Computer laden und starten c Auf dem Bildschirm erscheint in XY Darstellung die Energie Achse X und die Ordinate f r die gemessene Anzahl der zugeh rigen Impuls Amplituden Beide Achsen k nnen unterschiedlich skaliert werden Jeder Punkt der sich ergebenden Darstellung des Energiespektrums auf dem Bildschirm entspricht dabei dem Inhalt einer Speicherzelle d W hrend der Messung kann am Bildschirm mitverfolgt werden wie sich die Impulszahl in den einzelnen Speicherzellen ver ndert Schlie lich ergibt sich ein Energiespektrum der vorliegenden y Nuklide Je nach deren Intensit t ist eine gen gend lange Zeit erforderlich bis sich eine klare Darstellung einzelner Photopeaks ergibt Versuch 17 y Spektroskopie 168 e Nach dem Proze der Datenaufnahme erfolgt die Identifikation einzelner Regionen des erhaltenen Spektrums anhand von Standard Werten die in Bibliotheks Daten abgelegt sind Es besteht auch die M glichkeit das Me spektrum mit dem Spektrum von Eichmessungen auf dem Bildschirm zu berlagern und direkt zu vergleichen d Entweder am Bildschirm oder auf dem Drucker sind die in einzelnen Speicher Energie Kan len angesammelten Impulssummen als Impulse pro Zeiteinheit auszugeben ber Standard Werte in den Bibliotheks Daten des Rechners sind die Z hlraten einzelner Spektrumsbereiche direkt in die Aktivit t der entsprechenden Radionuklide Bequerel pro Gramm Substanz oder pro Substanz
191. s der Aminos ure Fraktion von Versuch 1 auf Chromatografiepapier Versuchsziel Vorstellung zweidimensionaler Chromatografieverfahren und einfache M glichkeiten zu deren quantitativer Auswertung A Prinzip s a Einleitung zu chromatografischen Verfahren und D nnschicht chromatografie Versuch 4 Erkl rung der ein und zwei dimensionalen aufsteigenden D nnschicht oder Papier Chromatografie 1 dim Chromatogramm 2 dim Chromatogramm gt Proben Probe Substanzen Auftragspunkte 1 2 3 unterschiedliche a b c Substanzen Bei der zweidimensionalen PapierchromatografieH wird im Gegensatz zu eindimensionalen Verfahren s z B Versuch 4 die Probe nur auf einer Stelle aufgetragen Nach der Chromatografie im ersten Laufmittel wird das Chromatogramm getrocknet und um 90 gedreht in einem zweiten Laufmittelsystem chromatografiert Der Vorteil dieses Verfahrens ist die bessere Trennung von Versuch 5 Papierchromatografie 42 Substanzen die bei eindimensionaler Arbeitsweise nur unzureichend getrennt werden k nnten Je nach Anwendungsfall sind die beiden Laufmittelsysteme nach bestem Trenneffekt zu optimieren B Material und Ger te a Aminos ure Fraktion in 400ml Becherglas vom 1 Arbeitstag sie wurde inzwischen bei 50 C im Trockenschrank zur Trockne eingeengt b Hb Pipette 20u1 mit Schlauch und Mundst ck oder Eppendorf Pipette c Chromatografie Papier 20x20cm und Filterpapier zum ben d
192. s einzuf hren wird immer ein Kompromi aus dem zeitlichen Rahmen des Studienplanes den materiellen Resourcen des durchf hrenden Institutes und den wissenschaftlichen Priorit ten des f r die Durchf hrung verantwortlichen Dozenten sein Wir hoffen da der f r uns in Gie en gefundene Kompromi auch anderen Kollegen eine Anregung sein kann ber kritische Anregungen w rden wir uns freuen Das Manuskript ist urspr nglich 1998 f r die praktische Durchf hrung des Praktikums in Buchform in einem haupts chlich auf Doktorarbeiten u spezialisierten Verlag erschienen ISBN 3 8265 4193 6 Um es einem breiteren Publikum zug nglich zu machen haben wir jetzt die Herausgabe in der elektronischen Bibliothek unserer Universit t gew hlt Insbesondere der Abschnitt ber die Gentechnik aber auch andere wurden dabei gr ndlich berarbeitet und dem heutigen Stand angepa t Gie en im Dezember 2003 B Pauler J Imani K H Neumann mailto Bruno H Pauler ernaehrung uni giessen de jafargholi imani ernaehrung uni giessen de Karl Hermann Neumann ernaehrung uni giessen de Inhaltsverzeichnis A Einleitung zu I Chromatografische Verfahren und Enzym Analytik 1 Prinzip chromatografischer Verfahren 1 1 Chromatografische Arbeitsverfahren 1 2 Papierchromatografie 1 3 S ulenchromatografie 1 4 D nnschichtchromatografie 1 5 Elektrophorese 1 6 Gaschromatografie 2 Enzymuntersuchungen B Einleitung zu I Radiobiochem
193. sch tzen als erstere denn pro Arbeitskraft wurden von Firma 1 50 100 0 5 Autos Arbeiter von Firma 2 aber 50 50 1 Auto Arbeiter produziert Nun aber wieder zur ck zur spezifischen Enzymaktivit t Sie wird errechnet indem der Substrat Umsatz eines Enzyms z B 50 uMol 10 Min in 1 ml Ansatz auf die Proteinmenge z B 100 ug in 1 ml Ansatz bezogen wird Sie errechnet sich in dem gegebenen Beispiel 5 uMol Produkt Min pre m spezifische Enzym Akt 100 ug Protein pre ml Versuch 2 Spezifische Enzymaktivit t der a Amylase 18 F r den Enzym Umsatz gibt es eine internationale Einheit das Unit abgek rzt U Ein Unit ist der enzymatisch katalysierte Substrat Umsatz in uMol pro Minute Die obige Gleichung ist daher auch in Units auszudr cken spezifische Enzymaktivit t spezifische Enzymaktivit t Zur Bestimmung der spezifischen Enzymaktivit t ben tigt man daher sowohl die Bestimmung der Enzymaktivit t als auch der des Proteingehaltes im Enzympr parat Prinzip der Bestimmung der Enzymaktivit t Man inkubiert ein Enzympr parat unter optimalen genau definierten Bedingungen pH Wert Ionenst rke des Puffersystems geeignete Substratkonzentration Temperatur Zeit und gegebenenfalls Effektorenkonzentration und bestimmt nach Abstoppen der Enzymreaktion entweder das verbliebene Substrat oder das gebildete Produkt In unserem Falle versetzt man a Amylase in Phosphat Citrat Puffer pH 6 9 mit St rkel sung
194. setzung des gebrauchfertigen N hrmediums Angaben f r 1 1 Saccharose g 20 Caseinhydrolysat mg 250 Stamml sung B5 ml 100 Fe L sung ml 10 Mg L sung ml 1 Vitamin L sung ml 1 Inosit L sung ml 10 2 4 D L sung ml 5 Gelrite g 4 pH Wert auf 5 7 einstellen 19 1 Bakterienvermehrung Hierzu wird ein Abstrich eines in glycerinhaltigem Medium bei 80 C aufbewahrten Bakterienstamms hier Escherichia coli Stamm HB101 mit einer Impf se entnommen und in 5 ml LB Medium s 19 4 ohne Antibiotikum bertragen Diese Kultur l t man ber Nacht sog bernachtkultur ca 16 Stunden wachsen und zwar bei 37 C unter st ndigem Sch tteln 200 Upm Am n chsten Morgen wird diese Kultur f r eine Plasmidaufnahme kompetent gemacht 19 2 Herstellung kompetenter Zellen des Bakterienstammes E coli HB101 Die bernachtkultur wird in 100 200 ml vorgew rmtes 37 C LB Medium berf hrt und 1 2 Stunden weiter kultiviert Durch Messung der optischen Dichte OD bei 600 nm verfolgt man das Bakterienwachstum F r die Transformationseffizienz ist es entscheidend da sich die Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase befinden Deshalb wird das Bakterienwachstum bei einer OD6oo von 0 2 abgebrochen Die Kultur wird sofort auf Eis gek hlt ca 10 Min Dann werden die Bakterien in zwei Falkontuben aufgeteilt anschlie end bei 4000 5000 Upm f r 10 Min abzentrifugiert Es wird sofort dekantiert und das Sediment in 1
195. sh hen Diagramm aus _ Petzold W u H Krieger 1988 Strahlenphysik Dosimetrie und Strahlenschutz Bd 1 B G Teubner Stuttgart9 10 De a a De 90 yr cs 7 3 xX3 Beveled Nal lI 23 57 662 2 a ABSORBER 750mg cm A SOURCE DIST 10 cm ENERGY SCALE IK ev PHU r N ea rer en a E al con Pe EEE OE N E dE C SEC O 5 il 6 200 400 600 800 1000 1200 Neuere Ger te arbeiten sehr viel weniger zeitaufwendig mit der sogenannten Vielkanal Methode zur Impulsh hen Analyse Hierzu werden die Impulse vom SEV s S 149 zun chst linear verst rkt einem Analog Digital Wandler ADC zugef hrt in digitale Signale umgeformt und je nach deren Gr e in entsprechend codierte Speicher eingelesen und dort aufsummiert Die Summe der einzelnen Speicherzellen kann auf dem Bildschirm in einem XY Diagramm auf der Ordinate die Impuls Summen auf der Abszisse die Nummern der Speicherkan le nach Eichung direkt auch die Nuklid Energie ausgegeben werden Versuch 17 y Spektroskopie 166 Hierzu ein Beispiel Ein vom SEV abgegebener verst rkter Spannungsimpuls gelangt an den Analog Digital Converter Die Impuls Amplitude ergibt eine Digitalzahl von 100 ber das Auswerte Programm wird die Speicherzelle 100 angesprochen und deren Inhalt um 1 erh ht Ein anderer Impuls mit einem Digitalwert von 50 gelangt in die Speicherze
196. t und Endpunkt auf der Zeitachse zu fixieren sind Am Ende diesen Men punkt ber lt ESC gt verlas sen Das Chromatogramm zeigt nun neben jedem Peak die zugeh rigen Fl chen anteile in Prozent an Wie bereits in der Anmerkung zu obiger Tabelle erw hnt wurde bleiben nach Abbruch des Chromatogramms alle brigen Substanzen von der Analyse ausgeschlossen Bei diesem Versuch zielen wir nur auf die Bestim mung von Wasser thanol und gegebenenfalls von Methanol ab 8 ber den Optionsmen Punkt Hardcopy wird das Chromatogramm zusammen mit der Integrationsliste ausgedruckt 9 Die am Chromatogramm ausgegebenen Prozentwerte der Peaks in die folgende Ergebnisliste bertragen und die Werte der von den anderen Gruppen untersuchten Proben bernehmen Verteilung auf Methanol Athanol Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 129 6 Arbeitstag Demonstration radiochemischer Messungen Versuchsziel Einf hrung in radiochemische Arbeitsweisen und Auswertungsverfahren A Kurze Wiederholung der Theorie zur Messung radioaktiver Strahlung B Geiger M ller Z hlrohr GMZ aus Kern und Strahlentechnik Lehrbriefe der Studiengemeinschaft Darmstadt Gasf llung Hy Uz Anordnung und Schaltung eines Z blrabrs Nachweis jeglicher radioaktiver Strahlung keine Lieferung steigender Impulsh hen bei steigender Energie der Strahlung Ausbeute ca 1 1 Radioaktive Strahlung h rbar gemacht Radioa
197. t L sung wird das Gel mit 50 ml Fixier L sung B 12 bei 30 C w hrend 15 Minuten fixiert Dabei kommt es meist zu einem Schrumpfen des Gels welches jedoch bei der anschlie enden Lagerung in 7 iger Essigs ure B 8 reversibel ist C3 Weiterer Gang der Protein spezifischen F rbung des Gels ol Nach der Fixierung der Proteine im Gel durch TCA erfolgt ihre Anf rbung mit wenig GRADIPURE B 6 f r etwa 20 Minuten Zur F rbung auch schwacher Banden kann dieser Schritt auch auf 24 Stunden ausgedehnt werden 02 Die gef rbten Elektropherogramme werden in 7 iger Essigs ure B 8 aufbe wahrt wodurch die Farbintensit t der Banden noch zunimmt Versuch 10 Elektrophorese nativ 111 D Auswertung Am zweckm igsten geht man bei der Auswertung ohne M glichkeit zur Quantifi zierung durch ein Densitometer oder Bildanalysesystem folgenderma en vor 1 Nach erfolgter Anf rbung der Protein Banden der beiden Gelh lften bertr gt man a entweder auf einer Lichtplatte die Positionen der Proteinbanden zusammen mit dem oberen und unteren Gelrand Bromphenolblau markierte Pufferfront auf ein neben der Petrischale liegendes Papier Dabei ist die Intensit t der Gelbanden nach folgendem Schema zu kodieren TCA Trichloressigs ure starke Intensit t ae mittlere Intensit t Kan schwache Intensit t b oder man kopiert das Gel in einer Petrischale mit 7 iger Essigs ure mittels Fotokopierger t in einem ver
198. ten im Bereich von 1000 5000 w rden voneinander getrennt es erg ben sich mehrere Peaks in der Elutionskurve Substanz 2 kann nicht in das Gelnetzwerk diffundieren und wird im u eren Volu men der Gels ule eluiert Z B 10 Substanzen mit Molekulargewichten ber 5000 w rden gleichzeitig in einem Peak in der Elutionskurve eluiert Modell zum Zeitverlauf der Elution dieser beiden Substanzen in einer Sephadex G 25 S ule Molek le klein e gro Sephadex Zeitlicher Verlauf der Trennung Fraktionen Beginn Elution der gros sen Mole k le sephadex Sdaule Elutionsdiagramm In unserem Fall soll RNA mit einem Molekulargewicht von gt 450000 von AMP MG 450 mittels Phosphat Puffer und Sephadex G 25 getrennt werden Dies bedeutet da RNA Molek le sich nur im u eren Volumen der S ule aufhalten werden und Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 48 ihnen ein Zugang zum Gelnetzwerk verwehrt ist Aus der Sephadex S ule wird RNA demnach im Ausschlu Volumen als erster Peak eluiert Dagegen werden AMP Molek le in das Gelnetzwerk diffundieren und nach l ngerem Aufenthalt durch Phosphat Ionen des Puffers aus dem Gelnetzwerk verdr ngt und erst sehr viel sp ter als zweiter Peak eluiert Das Verfahren der Gelfiltration ist im Labor ein unentbehrliches Hilfsmittel zur pr parativen Trennung von Substanzen nach deren Molekulargewichten Molek lgr en Es l t sich mit einigem technischen Aufwand automatisch
199. trat l sung B i wird pro well einpipettiert Nach 20 40 Minuten sollte eine umso deutlichere Gelbf rbung in den wells der Platte entstanden sein je mehr zweite Antik rper gekoppelt an Alkalische Phosphatase an erste Antik rper gebunden worden sind die ihrerseits vorher in gr erer Menge mit Rubisco Protein eine Immunreaktion eingegangen waren j Die Farbreaktion der Alkalischen Phosphatase wird durch Zugabe von NaOH B j gestoppt D Auswertung Da f r das Praktikum kein Mikrotiterplatten Reader oder Photometer zur Verf gung steht kann die Auswertung nur visuell qualitativ vorgenommen werden Entsprechend den Konzentrationsangaben im Pipettierschema s S 121 ist zu pr fen ob die Farbintensit t mit steigender Rubisco Proteinkonzentration zunimmt E Literatur GROSS U 1990 Der Einflu von Saccharose und der CO Konzentration auf die Aktivit t von Ribulose 1 5 bisphosphat Carboxylase Oxygenase und Phosphoenolpyruvat Carboxylase und die Konzentration der Ribulose 1 5 bisphosphat Carboxylase Oxygenase in autotrophen Zellkulturen von Arachis hypogaea L und Daucus carota L Dissertation der Justus Liebig Universit t Gie en Versuch 12 ELISA 124 Versuch 13 Alkoholbestimmung mittels Gaschromatografie 125 5 Arbeitstag Quantitative Bestimmung des thanolgehalts in verschiedenen Getr nken mittels Gaschromatografie Versuchsziel Einf hrung in quantitative Bestimmungsverfahren in der Gaschromato gr
200. trukturformen ist jedoch nur auf die Spal tung von Wasserstoff Br ckenbindungen beschr nkt H here Struktur und Aggregat Zust nde von Proteinen welche auf Disulfid Br cken R SH HS R gt R S S R beruhen werden durch SDS nicht entfaltet Erst durch SDS Behandlung in Kombination mit reduzierenden Bedingungen durch Dithiothreitol DTT oder 2 Mercaptoethanol Geruch erreicht man eine vollst ndige Streckung auch solcher Proteinstrukturen zu ellipsoiden Polypeptid Ketten s Abb 10 6 Abb 10 6 aus Westermeier 1990 mG Terti rstruktur Quart rstruktur Nativzustand von Proteinen Quart rstruktur SDS behandelte Proteine ohne Reduzierung Einf hrung in die Elektrophorese 101 Abb 10 6 Fortsetzung aus Westermeier 1990 SDS behandelte und reduzierte Proteine Mittels geeigneter Farbstoffe z B Bromphenolblau ist der zeitliche Verlauf der Elektrophorese kontrollierbar Diese geladenen kleinmolekularen Farbstoffe wandern im elektrischen Feld zusammen mit der Pufferfront vor den zu trennenden Makro molek len Die Elektrophorese wird abgebrochen wenn die Farbstoff Bande das un tere Gelende erreicht hat Damit wird sichergestellt da w hrend der Elektrophorese keine Proteine aus dem Gel auswandern Nach der Elektrophorese sind substanzspezifische F rbeverfahren einzusetzen um ungef rbte Molek le im Elektropherogramm sichtbar zu machen Nach der Trocknung angef rbter Elektropherogramme s
201. u erreichen Zur Demonstration der Leistungsf higkeit dieses Verfahrens werden im Praktikum einige Beispiele vorgestellt B Material und Ger te a Simuliertes Papierchromatogramm An drei Stellen entlang einer Bahn in der Mitte eines Chromatografie Papiers wurde rote Tinte die mit NaH 4CO3 stark markirt ist in Mengen von 10 15 und 20 ul aufgetragen b Z hlgas P10 10 Methan 90 Argon in Stahlflasche mit Reduzier Ventil c TLC Scanner Linear Analyzer LB 285 Firma Berthold und Computer mit Steue rungs und Auswertungs Programm C Durchf hrung Demonstration a Das Papierchromatogramm ist auf dem Me tisch befestigt Zur Vermeidung von Strahlungsbelastung wird die Abdeckklappe des Ger ts immer geschlossen gehalten b Nach Einschalten des Ger ts wird Me gas mit einer in einem Durchflu me ger t ablesbaren Flu rate durch das Proportional Z hlrohr geleitet c Nach Eingabe des Start und Endpunkts der Messung auf der Y Achse des Chro matogramms angebrachte cm Skala wird die Messung gestartet Das Z hlrohr ist auf einem Hebearm befestigt der vor und nach jeder Bahn Messung das Z hlrohr vor der Bewegung zur n chsten Bahn hochf hrt damit das zu messende Chromatogramm nicht besch digt wird Versuch 16 Radioscanner 159 d W hrend der Messung sind auf dem Computer Bildschirm die einzelnen Bahnergebnisse ortsrichtig und farbcodiert zur Angabe der gemessenen Intensit t der radioaktiven Strahlung abgebil
202. ugabe von 200 ul L sung II s 19 9 werden die Bakterienzellen f r einige Minuten bei Raumtemperatur lysiert anschlie end werden 180 ul von der L sung III s 19 9 zugegeben und 5 Min auf Eis inkubiert damit erreicht man eine Ausf llung der Proteine Nach der Inkubation wird 10 Min bei 13000 Upm zentrifugiert Der berstand Plasmid im berstand wird in ein autoklaviertes Eppendorfreaktionsgef zur Reinigung aufgenommen 19 6 1 Reinigung von Plasmid DNA 1 RNase Behandlung Die RNA haltige Plasmidpr paration welche aus der alkalischen Lysis gewonnen wurde wird mit 5 ul RNase versetzt Die Inkubation erfolgt fiir 30 Min bei 37 C im Wasserbad 2 Proteinase K Behandlung Diese Behandlung kann dann n tig sein wenn Proteine sehr fest an die DNA gebunden sind Proteinase K wird in einer Konzentration von 0 05 mg ml eingesetzt Die Inkubation erfolgt fiir 30 Min bei 37 C Transformation in E coli zur Plasmidvermehrung 186 3 Phenol Chloroform Extraktion von DNA Um st rende Proteine die bei der DNA Aufbereitung ausgef llt werden auch RNase und Proteinase Reste zu entfernen wird die DNA haltige L sung mit einem gleichen Volumen Extraktionsphenol Tris Puffer ges ttigtes Phenol unter dem Abzug versetzt und heftig gemischt Die Phasen trennen sich binnen 5 Min Dann sch ttelt man erneut aus In einer Zentrifuge bei Raumtemperatur k nnen die Phasen bei 13000 Upm w hrend 3 5 Min getrennt werden Di
203. und Bestimmung der RNA und AMP Konzentration C2 A Sephadex Elution 8 Studenten a Zun chst wird der Puffer berstand ber dem Sephadex Gel vorsichtig mittels Pi pette abgesaugt generell Sephadex S ule nie trocken laufen lassen s Kationen Austauscher Trennung Versuch 1 1 AT b Nun 20 ml aus der RNA und AMP enthaltenden Probe L sung mit einer Pipette auf die S ule aufbringen wobei die Probe vorsichtig an der Glasinnenwandung der S ule langsam ablaufen sollte damit die Oberfl che des Sephadex Gelbetts keinen Krater bekommt c Nun ein 10ml K lbchen unter den S ulenauslauf stellen und die S ule auf eine Tropfgeschwindigkeit von ca 30 Tropfen Min einstellen d Ist das 10ml K lbchen bis zur Marke bef llt das zweite K lbchen unterstellen den Inhalt des ersten in ein nummeriertes ungraduiertes Reagensglas entleeren U S W W hrend die ersten sechs 10ml Fraktionen verworfen werden noch keine RNA in Sicht sollten die Fraktionen 7 bis 50 auf RNA und AMP untersucht werden e Ist die Probe in die Sephadex S ule eingedrungen die Glaswand der S ule die mit Probe in Ber hrung kam dreimal mit Puffer nachsp len wobei jedesmal die Sp lfl ssigkeit zuerst in die S ule eingedrungen ist bevor man den n chsten Sp lvorgang einleitet Hierdurch wird verhindert da Proben Bestandteile ver schleppt werden und das Elutionsprofil darunter leidet Versuch 6 Sephadex Gelfiltration 52 f Sind die drei Sp lv
204. verteilt s Abb 14 1 es liegt vielmehr eine schiefgipfelige Poisson Verteilung vor Das arithmetische Mittel ist 2 32 mit einer Standardabweichung die es bei Poisson Verteilung nicht gibt deren Berechnung ohne statistischen Sinn w re von 1 449 63 vom Mittelwert wobei dieser Mittelwert mit dem Maximum der Poisson Verteilung nicht deckungsgleich ist Unter den gleichen Bedingungen wurden daraufhin 25 Me wiederholungen w hrend einer Minute gez hlt Aus Abb 14 2 ist zu erkennen da bereits nach der Me zeit von Minute eine weitgehende Normalverteilung zu erreichen ist Der Mittelwert dieser zweiten Me reihe liegt bei 160 0 die Standardabweichung betr gt 11 1 7 vom Mittelwert Wie bei einem Vergleich der beiden Mittelwerte zu erkennen ist wird bei der Kurzzeit Messung ein zu niedriger Mittelwert ermittelt 2 32 1 000 0 015 154 7 der zwar auf eine Me zeit von 1 Minute umgerechnet noch innerhalb der Schwankungsbreite von 160 0 11 1 liegt Dieser Versuch ist nun aus Zeitgriinden mit jeweils 5 Me wiederholungen zu wiederholen und nach den angegebenen Formeln fiir die Ermittlung von Mittelwert und Standardabweichung auszuwerten X Mittel 2 02 95 s 2 N N 1 X Me wiederholung N Anzahl Werte Versuch 14 Demonstration radiochemischer Messungen 133 Versuchsauswertung 5 Me werte Me zeit 0 015 Min 5 Me werte Me zeit 1 000 Min Auswertung der beiden Me reihen Me zeit 0
205. von 69 ml mit 31 ml 0 1N NaOH mischen pro Gel 50 ml 11 Substrat L sung 20 mg Na 1 Naphthylphosphat und 20 mg Fast Red TR mit 50 ml Citrat Puffer B 10 auf Magnetr hrer ca 30 Minuten r hren und ber das Gel durch Falten filter filtrieren L sung stets frisch ansetzen 50 ml pro Gel 12 Fixierl sung 70 thanol 5 Eisessig 25 A dest 50 ml pro Gel 13 passende Petrischale B Versuch 10 Elektrophorese nativ 107 Anmerkungen zur Anf rbung der Elektropherogramme Protein F rbung Gradipure enth lt Coomassie Brilliantblue G 250 einen Farbstoff der sich an Pro teine anlagert und in 7 iger Essigs ure eine stabile F rbung ergibt blau Mit diesem Farbstoff sind Proteinmengen bis zu 1 2 ng noch nachweisbar Enzym F rbung Im allgemeinen gilt da Enzym spezifische Farbreaktionen in ihrer Nachweis Emp findlichkeit den Protein spezifischen F rbe Methoden weit berlegen sind Das Prinzip Enzym spezifischer F rbungen von Elektropherogrammen ist der Histo logie entlehnt und besteht darin da ein leicht in das Polyacrylamidgel diffundieren des Substrat nach der enzymatischen Umsetzung an einen Farbstoff gebunden wird der nicht aus dem Gel diffundieren kann oder unl slich ist Nach BURK 1966 und MAURER 1968 wird im Falle der Sauren Phosphatase Na 1 Naphthylphosphat als Substrat verwendet Nach der enzymatisch katalysierten Abspaltung von Phosphat entsteht Naphthol das mit Diazonium Chl
206. werden Das Prinzip ist jedoch bei all diesen Methoden etwa gleich Von den neueren Verfahren soll nur noch die Polyacrylamid Gelelektrophorese er w hnt werden Hierbei dient Polyacrylamid als Tr ger hnlich wie Sephadex stellt Polyacrylamidgel eine Art Netzwerk dar in dem analog dem Trenneffekt bei Sepha dex zus tzlich zur Trennung nach der elektrochemischen Ladung von Makromolek len die Auftrennung in einzelne Komponenten nach Molek lgr e erfolgt Mit die sem Verfahren ist eine sehr viel bessere Auftrennung von z B Proteinfraktionen m glich als mit der herk mmlichen Papier Elektrophorese W hrend z B das Albu min bei der Niederspannungs Papier Elektrophorese nur als eine einzige Fraktion in Erscheinung tritt kann es mit der eindimensionalen Polyacrylamid Gelelektrophorese je nach seiner Herkunft in 5 bis 8 Unterfraktionen aufgetrennt werden Bei der zweidimensionalen Gelelektrophorese bei der durch Verwendung von Ampholyten noch Unterschiede nach dem isoelektrischen Punkt der einzelnen Proteine ausgenutzt werden sind einige Hundert bis mehrere Tausend Proteinarten nachweisbar 1 6 Gaschromatografie GC Bei der GC werden Gase oder auch Fl ssigkeiten mit Siedepunkten bis etwa 350 C in Form von D mpfen in einem l ngeren Chromatografie Rohr 2 6m bei Kapillar GC auch noch l nger entweder an Feststoffen mit gro er innerer Oberfl che oder an mit einer Tr gerfl ssigkeit z B Polyethylenglycol PEG getr nktem Tr

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