MycAssay™ Aspergillus
Contents
1. Anwendereigene DNA Dekontaminationsl sung DNA Extraktions Kit siehe unten MycAssay CC Kit siehe unten Probe Als Ausgangsprobe f r den MycAssay Aspergillus Assay wird genomische Gesamt DNA verwendet die aus klinischen BAL Proben oder anderen Proben der unteren Atemwege extrahiert wurde F r diesen Zweck werden der im Folgenden genannte DNA Extraktions Kit sowie die Ausr stung empfohlen die bei der Validierung verwendet wurden MycXtra Pilz DNA Extraktions Kit REF Nr 080 005 bei Myconostica erh ltlich Laborsch ttler Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York USA Adapterplatte f r Vortex Laborsch ttler REF Nr 080 015 bei Myconostica erh ltlich MycAssay Farbabgleichskit Colour Compensation CC F r die genaue Auswertung von Daten die mithilfe des MycAssay Aspergillus Assays gewonnen wurden ist eine Farbabgleichsdatei anzuwenden die mit Hilfe des Myconostica MycAssay CC Kits Ref Nr 080 080 angelegt wurde Nach dem Erstellen kann diese Datei f r mehrere L ufe auf demselben Ger t verwendet werden Bitte wenden Sie sich wegen weiterer Einzelheiten an Ihren rtlichen Vertriebspartner Hinweise zur Durchf hrung Lesen Sie das gesamte Protokoll bevor Sie mit der Durchf hrung beginnen Die Durchf hrung des MycAssay Aspergillus Tests dauert ohne DNA Extraktion ungef hr zwei Stunden je nach Anzahl der zu analysierenden Proben Das Ansetzen der Reaktionen f2. r den Test sollte in einer PCR Workstation oder in einem Labor das r umlich vom PCR Labor getrennt ist durchgef hrt werden Falls eine PCR Workstation nicht zur Verf gung steht sollte das Ansetzen der Reaktionen in einem f r PCR geeigneten Bereich des Labors der r umlich getrennt ist von den Bereichen die f r DNA Extraktionen genutzt werden und der regelm ig mit DNA Dekontaminations Reagenzien gereinigt wird erfolgen W hrend des Ansetzens der Real Time PCR Reaktionen sollten Sie allerdings keine DNA Dekontaminationsl sungen verwenden da dies die Reaktionen inhibieren k nnte Verwenden Sie Mikroliter Pipetten f r den Transfer von Fl ssigkeiten F r das Ansetzen der Reaktionen sollten separate Mikroliter Pipetten verwendet werden die regelm ig dekontaminiert werden sollten 13 Siehe beispielsweise Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 4 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Aspergillus Respiratorische Proben LightCycler 2 0 Es wird empfohlen Low Retention Filter Pipettenspitzen zu verwenden um sicherzustellen dass w hrend des PCR Setup keine DNA durch Anhaftungen verloren geht Mit R hrchen Nr 4 sollten Sie besonders vorsichtig umgehen Es enth lt Positivkontroli DNA Material und eine Kontamination k nnte falsch positive Tes
3. Die Experimente wurden unter Verwendung einer Charge des MycAssay Aspergillus Kits und zwei verschiedenen Thermocyclern an zwei unterschiedlichen Standorten im Vereinigten K nigreich durchgef hrt Die Ergebnisse wurden unter Ber cksichtigung des Grenzwerts der Leerprobe LoB und des klinischen Cut off Werts CCO ausgewertet Bei der sechsfachen Konzentration der Nachweisgrenze LoD stimmten die Ergebnisse bei 100 der getesteten Proben hinsichtlich des LoB Werts berein positiv und 87 5 der Proben stimmten hinsichtlich des CCO Werts berein Bei Konzentrationen ber der sechsfachen Nachweisgrenze 6 x LoD stimmten 100 der Proben sowohl hinsichtlich des CCO als auch des LoB Werts berein bertragbarkeit des klinischen Cut off Wertes Der klinische Cut off bei 36 0 wurde mit dem SmartCycler Thermocycler ermittelt Dieser Cut off Wert wurde unter Verwendung einer Template DNA mit einer Aspergillus Konzentration die mit dem SmartCycler nachweislich 295 positive Ergebnisse beim CCO ergab analytisch auf die LightCycler 2 0 Plattform bertragen Es wurde ein Cp Wert von 37 0 bestimmt der dann durch Amplifikation von Template DNAs bei drei unterschiedlichen Konzentrationen best tigt wurde 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 14 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben Die folgenden Daten zur Leistungscharakteristik wurden unter Verwendung des Cepheid SmartCy
4. Lauf am Tag handelt Deutsch 7 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben Experiment Kit Wizard xj Welcome to the Experiment Kit Wizard The Experiment Kit Wizard helps you run a new experiment using the provided kit The first step is to create the new experiment To start the wizard and create a new experiment click Next If you don t want to create a new experiment at this time click Cancel Cancel Experiment Kit Wizard 5 xi Select the instrument you want to run the experiment on If the instrument is not in the list click Search fici 6937 LC 1 305 on COM1 LC_16937 ha Search wi lt Back Next gt Cancel 2 7 Benennen Sie die Laufdatei und speichern diese am gew nschten Ort 2 8 Rufen Sie durch Klicken auf die Registerkarte links im Bildschirm den Bereich Samples auf Bearbeiten Sie auf der Registerkarte Capillary View die Anzahl im Feld Sample Count und Namen der Proben Benennen Sie die Proben entsprechend dem Versuchsplan und den Positionen im Karussell Sample data T Analysis Type 7 Selected Charels 1530 580 10 840 670 705 Piin Sangles SS anpleCoun 16 LC Carousel ID MPLC Batch ID assy Ca Assay LotNo Color Comp D AN MR Repl OF Sample Note 1 Neeta z Repl of Negative Control 1 Repl of Negative Control 1 Asp 10e3 copies Repl of Asp 10e3 copies 4 Repl of Asp 10e3 copies 4 Asp
5. PCR negativ 2 10 0 83 NPW 0 94 0 91 Sensitivit t Spezifit t PCR vs Aspergillus Kultur Kultur positiv Kultur negativ PCR positiv 29 3 0 91 PPW PCR negativ 2 10 0 83 NPW 0 94 0 77 Sensitivit t Spezifit t Von den analysierten Proben enthielten nach DNA Extraktion mit dem MycXtra Kit 0 8 PCR Inhibitoren wie anhand der Ergebnisse der IAC Proben festgestellt wurde Klinische Befundung Der MycAssay Aspergillus Kit ist als diagnostisches Hilfsmittel vorgesehen Die Ergebnisse m ssen im Zusammenhang mit dem klinischen Zustand des Patienten und den Ergebnissen weiterer diagnostischer Tests bewertet werden Nachfolgend werden Empfehlungen f r Befundungen angegeben wobei jede einzelne von der Interpretation der Assay Ergebnisse abh ngt Ergebnis Ziffer 1 Aspergillus spp nicht nachgewiesen Ergebnis Ziffer 2 Aspergillus spp nachgewiesen Positives Ergebnis Mit diesem Assay wird auch Penicillium spp nachgewiesen Ergebnis Ziffer 3 Test fehlgeschlagen Anwesenheit von Inhibitoren oder anderen unbekannten Substanzen Deutsch 15 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben Grenzen des Verfahrens Die Grenzen des Verfahrens h ngen in erster Linie von der Qualit t der Prim rprobe ab Ist sehr wenig Probenmaterial vorhanden oder stammt die Probe nicht aus dem betroffenen Lungenbereich so wird der Test we
6. ist ein rekombinantes Plasmid das die Aspergillus Zielsequenz enth lt Tris HCI Puffer Der Kit enth lt au erdem Myconostica Protokoll CD ROM f r den MycAssay Aspergillus Test Gebrauchsanweisung Analysenzertifikat 12 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Deutsch 3 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben Aufbewahrung Der Kit sollte bis zum Verfallsdatum das auf dem Etikett der Schachtel angegeben ist eingefroren 15 bis 25 C gelagert werden Danach sollte er gem den rtlichen Bestimmungen entsorgt werden Nach ffnen eines Beutels muss dessen Inhalt sofort verwendet werden die Reagenzien d rfen nicht erneut eingefroren oder wiederverwendet werden Vom Anwender bereitzustellende Ger te und Materialien Real Time PCR System des Roche LightCycler 2 0 inklusive Benutzerhandbuch angeschlossenen Computers und LightCycler Software v4 1 LC 2 0 Karussellzentrifuge optional Kapillaradapter f r Minizentrifuge Probenkarussell f r 20 ul Kapillaren LC 2 0 20 ul Kapillaren mit Deckel Kapillarrack Halter Kapillar Releaser Verschlusswerkzeug Mikrozentrifuge Laborsch ttler Vortex Mikroliter Pipetten Volumenbereich 7 5 20 uL Sterile Low Retention Filter Pipettenspitzen Einmal Handschuhe puderfrei
7. 10e4 copies Repl of Asp 10e4 copies 7 Repl of Asp 10e4 copies 7 10 Asp 1065 copies 11 Repl of Asp 10e5 copies 10 12 Repl of Asp 1065 copies 10 13 Asp 10e6 copies 14 Repl of Asp 10e6 copies 13 15 Repl of Asp 10e6 copies 13 16 Positive Control alla lalelalelalslalslalelalsleinlalelalslalelalelalelale e 2 9 Setzen Sie das zentrifugierte Karussell in das LC 2 0 Ger t Stellen Sie sicher dass die Aussparung unter Probenposition 1 auf dem Karussell auf dem Stift in der Thermokammer einrastet Vergewissern Sie sich dass das Karussell fest in die Kammer eingesetzt ist und schlie en Sie den Deckel 2 10 Wenn Sie damit fertig sind dr cken Sie die Taste Start Vergewissern Sie sich dass das Ger t alle Kapillaren im Karussell gefunden hat und dass das Programm gestartet wurde Experiment Kit Wizard xj The experiment is ready to run Before starting edit the sample information and run protocol as necessary Cancel lt Back 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 8 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Aspergillus Respiratorische Proben LightCycler 2 0 3 Auswertung der Daten und Interpretation der Ergebnisse 3 2 Achtung Vor der Auswertung von Ergebnissen die mit MycAssay Aspergillus auf dem LightCycler 2 0 gemessen wurden muss ein Farbabgleichsobjekt angewendet werden Haben Sie ein solches noch nicht erstellt tun Sie dies nun und fahren erst danach mit Auswertung und Interpretation der Daten fort
8. Leistungsmerkmale des Assays wurden mit der LightCycler 2 0 Plattform unter Verwendung von 20 uL Glaskapillaren von Roche Kat Nr 04929292001 oder 11909339001 erneut validiert Diese Untersuchungen sind im Folgenden wiedergegeben Wo davon auszugehen war dass die Unterschiede zwischen den Ger te Plattformen keinen Einfluss auf die Assay Performance und daher auch nicht auf die behaupteten Leistungsmerkmale haben wurde die Untersuchung nicht wiederholt In diesen F llen wird davon ausgegangen dass die mit dem SmartCycler erhaltenen Ergebnisse auf die LightCycler 2 0 Plattform bertragbar sind Analytische Sensitivit t Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls f r den LightCycler 2 0 und der bei Myconostica hergestellten PCR Templates wurde als Grenzwert der Leerprobe Limit of Blank LoB f r den MycAssay Aspergillus Test ein Cp Wert von 39 0 bestimmt die Nachweisgrenze Limit of Detection LoD lag bei lt 25 Kopien der Target DNA Sequenz wobei der Stamm AF293 von A fumigatus verwendet wurde Analytische Selektivit t Genomische DNA die aus Penicillium spp extrahiert wurde ergab positive Ergebnisse Dies ist darauf zur ckzuf hren dass die Sequenzen der molekularen Targets zwischen Aspergillus und Penicillium hoch konserviert sind Es ist daher zu beachten dass ein mit diesem Test erhaltenes positives Ergebnis auch das Ergebnis einer Infektion mit Penicillium und nicht mit Aspergillus sein k nn
9. Nach Abschluss des Laufs berpr fen Sie den Bericht im Popup Fenster und drucken ihn bei Bedarf aus 3 3 Die Aspergillus Ergebnisse k nnen im Analysebereich Pathogen 530 und die IAC Ergebnisse im Bereich IAC 560 betrachtet werden 3 4 W hlen Sie in den beiden Bereichen ASP 530 und IAC 560 die korrekte Farbabgleichsdatei MycAssay CC file die auf das Experiment angewendet werden soll Channel 530 Color Compensation On 7 F Select Color Compensation Include Color Pos v 1 Myc CC file 530 560 3 5 Werten Sie mit den Kontrollen beginnend jede Probe wie im folgenden Flussdiagramm gezeigt aus weitere Details k nnen auch der Tabelle unter dem Flussdiagramm entnommen werden Deutsch 9 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus LightCycler 2 0 Negativkontrolle berpr fen Cp Wert beim ASP Test 39 0 bzw Kein Cp Kontamination in Probe n des Laufs MASSNAHME Lauf wiederholen Lauf fehlgeschlagen MASSNAHME Lauf wiederholen Probe positiv f r Aspergillus DNA Probe negativ f r Aspergillus DNA Negativkontrolle berpr fen Cp Wert der IAC im Bereich 30 3 33 9 JA Lauf fehlgeschlagen MASSNAHME Lauf wiederholen NEIN Positivkontrolle berpr fen Cp Wert beim ASP Test im Bereich 15 0 Testprobe berpr fen Ct Wert beim ASP Test lt 37 0 NEIN Testprobe berpr fen Cp Wert der IAC im Bereich 30 3 33 9 Amplifikation bei IAC fehlgesc
10. Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 myconojJica Respiratorische Proben MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 Respiratorische Proben REF 080 045 Vorgesehener Verwendungszweck MycAssay Aspergillus ist vorgesehen f r die Verwendung durch qualifiziertes Laborfachpersonal zum qualitativen Nachweis genomischer DNA von Aspergillus spp die aus Patientenproben des unteren Respirationstrakts z B Bronchialaspiratproben zur Abkl rung der Diagnose bei erwachsenen Patienten bei denen eine durch Aspergillus verursachte Infektion oder Allergie vermutet wird gewonnen wurde MycAssay Aspergillus wurde f r die Verwendung mit dem Roche LightCycler 2 0 validiert Informationen zum Test Aspergillus spp sind allgegenw rtige opportunistische Fadenpilze die sowohl allergische als auch invasive Erkrankungen Syndrome ausl sen Die Gattung umfasst ann hernd 300 Spezies von denen 41 mit menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden sind Die berwiegende Anzahl der Infektionen wird durch A fumigatus A flavus A terreus und A niger verursacht seltener sind A nidulans und andere seltene Spezies wie A sydowii A versicolor A lentulus und A pseudofischeri am Infektionsgeschehen beteiligt Die meisten Infektionen und Allergien die durch Aspergillus spp verursacht werden betreffen den Respirationstrakt Zu den allergischen Syndromen geh ren die allergische bronchopulmon
11. R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 8265 280 11 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A Bazelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 2 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Aspergillus Respiratorische Proben LightCycler 2 0 Verwenden Sie Reagenzien oder Kontrollen niemals nach Ablauf des Verfallsdatums Nach dem ffnen sollten die Reagenzien und Kontrollen nicht wieder eingefroren oder wiederverwendet werden Beim Umgang mit den Reagenzien des Kits sind Schutzkleidung und Einmal Handschuhe zu tragen Mikrobielle Kontamination oder Kontamination der Reagenzien durch Desoxyribonuklease DNAse w hrend der Entnahme von Aliquoten vermeiden Die Verwendung von sterilen DNAse freien Low Retention Einmal Filterpipettenspitzen oder Pipettenspitzen f r Positive Displacement Pipetten wird empfohlen Benutzen Sie f r jede Probe und jedes Reagenz eine neue Pipettenspitze Entsorgen Sie ungebrauchte Reagenzien und Abf lle gem den geltenden Bundes Landes oder rtlichen Vorschriften Zur Vermeidung von Kontaminationen mit Aspergillus oder IAC Amplicons sollten die Reaktionsgef e nach der Amplifikation nicht mehr ge ffnet werden Das Testen zus tz
12. ale Aspergillose ABPA und die allergische Aspergillus Sinusitis die in der Regel von A fumigatus verursacht werden Die chronische pulmonale Aspergillose umfasst das Aspergillom sowie die chronische kavern se pulmonale Aspergillose und die chronische fibrosierende Aspergillose Die invasive Aspergillose IA kommt in Risikopatientengruppen vor einschlie lich derjenigen die mit Kortikosteroiden behandelt werden und solchen mit Neutropenie oder einer Phagozytendysfunktion d h einer septischen Granulomatose und mit HIV Infektion Bei ungef hr 80 aller F lle von invasiver Aspergillose sind die Lungen betroffen Zur Routinediagnostik bei invasiver pulmonaler Aspergillose geh ren eine Computertomografie CT die Bronchoskopie und bronchoalveol re Lavage Mikroskopie und Kultur der Test auf Aspergillus Antigen im Blut oder die histologische Untersuchung von chirurgischen Biopsieproben Dabei treten bei der Auswertung der Kulturen h ufig falsch negative Befunde auf Tats chlich ist die bronchoalveol re Lavage nur bei etwa 40 der F lle positiv selbst wenn die Diagnose durch andere Verfahren abgesichert ist Dies zeigt die geringe Empfindlichkeit der Kulturmethode beim Nachweis der invasiven Aspergillose und der chronischen pulmonalen Aspergillose Bei positivem Befund sind Kulturen allerdings ein wichtiger Hinweis weil mit vielen diagnostischen Tests zum einen weder die Pilzgattung noch die spezies welche die Krankheit aus
13. ay Aspergillus Respiratorische Proben LightCycler 2 0 2 Durchf hrung des Laufs 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 Legen Sie die MycAssay Aspergillus Protokoll CD ROM von Myconostica in das Laufwerk ein W hlen Sie im Men File die Option Import und w hlen Sie dann Object ixo files Importieren Sie die Datei Macro MAA v1 2 ixo von der CD in die Datenbank File Edit View Tools Window Help A Analysis l A New Cri N 3 Open Ctrl O Close Girl 5 Logout Export COF Std Curve Files Batch import Object ixo files Batch export Ctrl R Desktop File name Macro MAA CC ixo My Network Fies of type Object ixo files ixo W hlen Sie im Men File die Option Save und speichern Sie das Makro Template am gew nschten Ort in der Datenbank P gt Save Experiment Kit EA E Root E System Admin Experiments C Preferences C Special Data Elan Enotes ana Macio L Analysis Templates L Experiment Macros C Report Templates C Run Templates L Sample List Templates Name Macro MAA v 1 2 Cancel W hlen Sie in der Symbolleiste die Option Run Macro A New i Run Q Analysis amp Open A Report amp Template EA Run Macro W hlen Sie die Template Datei Macro MAA v1 2 und dr cken Sie Open Folgen Sie den Anweisungen des Installationsassistenten Markieren Sie das K stchen Perform Self Test wenn es sich um den ersten
14. cler Real Time PCR Systems erhalten Interferierende Substanzen Gegenanzeigen f r die Anwendung Die folgenden Substanzen wurden in klinisch relevanten Konzentrationen getestet f r keine von ihnen wurde eine Inhibition des Assays festgestellt Acetylcystein Amphotericin Beclometason Dipropionat Budesonid Natrium Colistimethat Fluticasonpropionat Formoterolfumarat Dihydrat Ipratropiumbromid Lidocain Mannitol Salbutamolsulfat Salmeterol Natriumchlorid Natrium Cromoglicat Terbutalin Tobramycin Leistungsbewertung Zur Leistungsbewertung des MycAssay Aspergillus Kits wurden in zwei Kliniken Proben aus dem Respirationstrakt BAL Proben entnommen Aus diesen wurde dann unter Verwendung des MycXtra Pilz DNA Extraktions Kits die DNA extrahiert die anschlie end gelagert und dann im Assay analysiert wurde Die Ergebnisse wurden sowohl mit der klinischen Diagnose als auch mit Kulturergebnissen verglichen Nach Auswertung eines Datenbestands der anhand von Proben an verschiedenen Standorten und mit unterschiedlichen Patientenpopulationen gewonnen worden war wurde der Cut off bei einem Ct Wert von 36 0 festgelegt Verschiedene Cut off Werte wurden hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit mit der zwischen einer Erkrankung und einem Zustand ohne Erkrankung differenziert werden kann evaluiert PCR vs klinische Diagnose klinisch positiv klinisch negativ PCR positiv 31 1 0 97 PPW
15. e Kapillaren behutsam mit den in der Kapillarenbox bereitgestellten Deckeln Verwenden Sie hierzu ein Verschlusswerkzeug Vergewissern Sie sich dass die Kapillaren fest verschlossen sind Die Kapillaren k nnen verschlossen werden sobald die Template DNA zur Reaktion hinzugef gt wurde wenn die M glichkeit einer Kreuzkontamination bzw Kontamination durch Substanzen aus der Umwelt reduziert werden soll Steht die Karussellzentrifuge nicht zur Verf gung zentrifugieren Sie die Proben mithilfe der Adapter die den Rackhaltern beiliegen in einer Mikrozentrifuge Ansonsten fahren Sie mit Schritt 1 17 fort berf hren Sie mit gro er Sorgfalt alle Kapillaren in das Karussell Achten Sie darauf dass sie sich in exakt derselben Reihenfolge wie im Rackhalter befinden und beginnen Sie mit der ersten Kapillare in Position 1 und fahren Sie in aufsteigender Reihenfolge ohne L cken zu lassen fort Dr cken Sie jede Kapillare ganz nach unten bis sie fest eingerastet ist Wurden die Proben nicht in Schritt 1 16 zentrifugiert zentrifugieren Sie diese nun mit der LC 2 0 Karussellzentrifuge Fahren Sie unverz glich mit Abschnitt 2 fort Die angesetzten MycAssay Reaktionen zum Nachweis von Aspergillus sind f r bis zu 60 Minuten stabil Stellen Sie sicher dass der gesamte Arbeitsbereich im Anschluss an das PCR Setup gr ndlich mit DNA Dekontaminationsl sung gereinigt wird 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 6 Nur f r In vitro Diagnostik MycAss
16. en Befund Da die Differenzialdiagnose sehr umfassend ist und Tuberkulose atypische Mykobakteriose Sarkoidose Histoplasmose Kokzidioidomykose Pneumokoniose rheumatoide Lunge Spondylitis ankylosans Morbus Bechterew und andere Erkrankungen einschlie t ist das Dokumentieren der Anwesenheit von Aspergillus spp in den Proben des Respirationstrakts sehr wichtig um Verz gerungen bei der Diagnose der pulmonalen Aspergillose und eine Fehlbehandlung zu vermeiden MycAssay Aspergillus ist ein molekulardiagnostischer Kit f r den Nachweis genomischer DNA von Aspergillus spp mithilfe der Molecular Beacon Real Time PCR Technologie Der gesamte Test kann inklusive der DNA Extraktion aus der klinischen Probe innerhalb von 4 Stunden durchgef hrt werden Im Vergleich dazu werden f r Pilzkulturen mehrere Tage ben tigt um einen positiven Befund zu erhalten Dieser Assay bietet Vorteile gegen ber den gegenw rtig verf g baren diagnostischen Verfahren f r die akut invasive und die chronisch pulmonale Aspergillose Diese Vorteile umfassen einen schnelleren Nachweis von Aspergillus spp und das Potential einer gesteigerten Empfindlichkeit f r Aspergillus spp in stark abwehrgeschw chten Patienten die im Verdacht stehen eine invasive pulmonale Aspergillose zu haben Testprinzip Nach dem Mischen der Reagenzien des MycAssay Aspergillus Kits mit einer Probe die die Aspergillus DNA Zielsequenz ein Abschnitt des ribosomalen 18S Gens vo
17. hlagen MASSNAHME Probe wiederholen Bei selbem Ergebnis besteht Verdacht auf Inhibitor in Probe Nur f r In vitro Diagnostik Respiratorische Proben Probe Pathogen 530 Cp IAC 560 Cp Interpretation Weitere Ma nahme Negativkontrolle 39 0 oder Kein Cp Im Bereich 30 3 33 9 Negativkontrolle Ergebnisse der Patienten akzeptabel proben sind valide Negativkontrolle 39 0 oder Kein Cp lt 30 3 oder gt 33 9 Negativkontrolle fehlgeschlagen Gesamten Lauf wiederholen Negativkontrolle lt 39 0 Im Bereich 30 3 33 9 Kontamination Gesamten Lauf wiederholen Positivkontrolle Im Bereich 15 0 20 0 Positivkontrolle akzeptabel Ergebnisse der Patienten proben sind valide Positivkontrolle lt 15 0 oder gt 20 0 Positivkontrolle fehlgeschlagen Gesamten Lauf wiederholen Patientenprobe 239 0 oder Kein Cp Im Bereich 30 3 33 9 Probe ist negativ f r Ergebnis speichern oder Aspergillus ausdrucken Ergebnis 1 Patientenprobe lt 37 0 Probe ist positiv f r Ergebnis speichern oder Aspergillus ausdrucken Ergebnis 2 Patientenprobe 39 0 oder Kein Cp lt 30 3 oder gt 33 9 Amplifikation der IAC Analyse der Probe in der Probe wiederholen Ergebnis 3 fehlgeschlagen CCO klinischer Cut off Wert clinical cut off Alle Ergebnisse bei diesem oder kleineren Werten werden als klinisch positiv angesehen Bei anderen P
18. hsanweisung oder das Verfallsdatum des Kits ist abgelaufen gt berpr fen Sie bitte dass der Kit unter korrekten Bedingungen gelagert wurde berpr fen Sie das Verfallsdatum der Reagenzien siehe Kit Schachtel oder Etikett auf Reagenzienbeuteln und wiederholen Sie den Lauf ggf mit einem Kit dessen Verfallsdatum noch nicht abgelaufen ist Es kam zu einem Fehler bei Schritt 1 11 bis 1 13 und die Template DNA der Positivkontrolle R hrchen 4 wurde in das falsche Reaktionsgef pipettiert gt Wiederholen Sie den Lauf f hren Sie dabei das Ansetzen der Reaktionen mit gro er Sorgfalt durch Derartige Pipettier Fehler kann man an einem h heren Fl ssigkeitsstand in einem Reaktionsgef und einem niedrigeren Fl ssigkeitsstand in einem anderen Gef im Vergleich zu den brigen Gef en erkennen Das Reagenz aus R hrchen 1 oder aus R hrchen 2 wurde nicht zur Reaktion pipettiert gt Wiederholen Sie den Lauf f hren Sie dabei das Ansetzen der Reaktionen mit gro er Sorgfalt durch Derartige Pipettier Fehler kann man an einem niedrigeren Fl ssigkeitsstand in diesem Reaktionsansatz im Vergleich zu den anderen Kapillaren erkennen Die Positivkontrolle befand sich nicht an der richtigen Position im Ger t gt Achten Sie darauf allen Kapillaren in der Software die korrekte Bezeichnung zuzuweisen Deutsch 11 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respirat
19. inander getrennt werden sodass es nach Anregung zur Fluoreszenz kommt Der Umfang der Fluoreszenz d h die Intensit t des Signals in irgendeinem bestimmten Zyklus oder nach der Beendigung der Zyklen h ngt von der Menge der spezifischen Amplicons ab die zu diesem Zeitpunkt vorhanden sind Das Real Time PCR System detektiert in Echtzeit die von jedem Beacon emittierte Fluoreszenz Vorsichtsma nahmen Dieser Kit darf nur von Laborfachpersonal verwendet werden Es werden Testverfahren f r die aerosolfreie Handhabung der Proben ben tigt Die Standard Vorsichtsma nahmen und die Labor Richtlinien sollten bei der Bearbeitung s mtlicher Proben beachtet werden Ein Material Sicherheitsdatenblatt kann von Myconostica Ltd bezogen werden Dieser Test ist nur f r den in vitro diagnostischen Gebrauch vorgesehen Dieser Test bezieht sich ausschlie lich auf die Verwendung mit dem Roche LightCycler 2 0 und der LightCycler v4 1 Software Verwenden Sie keine Reagenzien oder Kontrollen deren Schutzbeutel bei der Lieferung ge ffnet oder besch digt sind Reagenzien und Kontrollen k nnen nicht zwischen Kits mit unterschiedlichen Chargennummern ausgetauscht werden Niemals Reagenzien oder Kontrollen aus unterschiedlichen R hrchen vereinigen selbst wenn sie aus derselben Charge stammen Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 S147 154 1 Denning DW Riniotis K Dobrashian
20. kel 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL R hrchen 2 gr ner Deckel 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL R hrchen 3 farbloser Deckel 10 uL Patientenproben 10 uL R hrchen 4 schwarzer Deckel Gesamtvolumen 25 uL Pipettieren Sie die Reagenzien in derselben Reihenfolge wie sie in obiger Tabelle aufgelistet sind R hrchen 1 dann R hrchen 2 anschlie end die Template DNA Negativkontrolle Patientenprobe oder Positivkontrolle Entnehmen Sie die Aliquote aus R hrchen 1 vorsichtig die Fl ssigkeit ist etwas viskos und kann eventuell an der inneren Kante des R hrchens anhaften Falls dies geschieht zentrifugieren Sie nochmals kurz um den Inhalt vollst ndig am Boden des R hrchens zu sammeln bevor Sie erneut versuchen das gesamte Aliquot zu entnehmen Benutzen Sie f r jeden Pipettiervorgang eine neue Pipettenspitze Verschlie en Sie nach Gebrauch jedes R hrchen wieder und entsorgen Sie es mitsamt dem eventuell verbliebenen restlichen Inhalt unverz glich in einen verschlie baren Beh lter f r klinische Abf lle Nicht gebrauchte Reagenzien k nnen nicht f r sp tere Verwendung aufbewahrt werden Seien Sie beim Pipettieren der Positivkontroll DNA R hrchen 4 besonders vorsichtig und stellen Sie sicher dass keine der anderen Reaktionen damit kontaminiert wird Durch das Verschlie en aller anderer Kapillaren vor dem ffnen von R hrchen 4 kann das Risiko der Kreuzkontamination vermindert werden Verschlie en Sie di
21. l st identifiziert werden kann und zum anderen kein Hinweis auf das Empfindlichkeitsprofil gegen ber dem infektionsausl senden Isolat erhalten wird Die allergische bronchopulmonale Aspergillose f hrt zu Komplikationen bei Asthma und cystischer Fibrose und tritt selten ohne eine zugrundeliegende Erkrankung auf Die meisten F lle stehen mit A fumigatus in Zusammenhang wobei andere Pilze damit gelegentlich in Verbindung gebracht werden Die charakteristischen Merkmale dieser Erkrankung sind eine episodische Atemwegsobstruktion mit dicken Sputumpfropfen die reich an Aspergillus Hyphen sind Serumwerte des Gesamt IgE von gt 1 000 IU mL und nachweisbare spezifische IgE und IgG Antik rper gegen A fumigatus oder ein positiver Haut Prick Test auf Aspergillus Die Sputumkulturen k nnen f r A fumigatus positiv ausfallen und die Bronchiektasie kann auf einem CT Scan der Brust erkannt werden 1 Spezies Datenbank unter www aspergillus org uk Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 Suppl 1 S207 38 3 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 4 Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 5 Greub G and Bille J 1998 Aspergillu
22. licher Kontrollen kann gem den Richtlinien oder Bestimmungen von rtlichen Landes und oder Bundesbeh rden oder akkreditierenden Organisationen erforderlich sein In Arbeitsbereichen in denen mit Proben oder Kit Reagenzien gearbeitet wird darf nicht gegessen getrunken oder geraucht werden L sungen mit einer niedrigen DNA Konzentration k nnen bei unsachgem er Lagerung instabil sein Es wird empfohlen die aus klinischen Proben extrahierte DNA bei 80 C zu lagern um die DNA Integrit t zu erhalten Wenn m glich sollte wiederholtes Auftauen und Wiedereinfrieren vermieden werden Kit Inhalt Beschreibung Der Kit enth lt f nf Folienbeutel mit jeweils drei verschlossenen Kompartimenten die Beutel k nnen einzeln aus der Schachtel entnommen und separat verwendet werden Jeder Beutel enth lt genug Reagenzien f r acht Reaktionen Volumen R hrchen 1 dNTPs 66 uL oranger Deckel MgCl2 Gepufferte L sung mit DNA Polymerasekomplex R hrchen 2 lt 0 01 Primer 66 uL gr ner Deckel lt 0 01 Molecular Beacons lt 0 0001 interne Amplifikationskontrolle IAC Die interne Amplifikationskontrolle ist ein rekombinantes DNA Plasmid das eine nicht infekti se Sequenz enth lt die mit keiner Aspergillus Zielsequenz bereinstimmt Tris HCI Puffer R hrchen 3 Negativkontrolle 25 uL farbloser Deckel Wasser R hrchen 4 Positivkontrolle 25 uL schwarzer Deckel lt 0 0001 Positivkontroll DNA Die Positivkontroll DNA
23. n Aspergillus enth lt erfolgt die DNA Amplifikation im Thermocycler Der Assay enth lt au erdem eine interne Amplifikations Kontrolle IAC ein DNA Fragment das weder in Aspergillus spp noch in anderen Pilz oder Bakteriengenomen und auch nicht im menschlichen Genom vorkommt um inhibitorische Substanzen im PCR Ansatz nachzuweisen und die Funktionalit t der Assay Reagenzien zu best tigen Die amplifizierten DNA Zielsequenzen werden mithilfe der Molecular Beacon Technologie nachgewiesen Molecular Beacons sind einzelstr ngige Oligonukleotid Hybridisierungssonden die eine Stamm Schleifen Struktur engl stem and loop structure bilden Die Schleife enth lt eine zu einer Zielsequenz komplement re Sondensequenz und der Stamm Sequenzstrang wird durch die Anlagerung der komplement ren Armsequenzen gebildet die an jeder Seite der Sondensequenz lokalisiert sind Das Ende des einen Arms ist kovalent mit einem Fluorophor der bei Anregung mit Licht geeigneter Wellenl nge fluoresziert verbunden w hrend das Ende des anderen Arms ebenfalls ber eine kovalente Bindung ein Quencher Molek l tr gt das die Fluoreszenz des Fluorophors unterdr ckt solange es sich in unmittelbarer N he befindet Die Molecular Beacons fluoreszieren nicht wenn sie frei in der L sung vorliegen Wenn sie jedoch mit einem Nukleins urestrang hybridisieren der eine Zielsequenz enth lt erfolgt eine Konformations nderung durch die Fluorophor und Quencher vone
24. ngen und vor dem PCR Setup v llig trocken sind Die Bedingungen unter denen der Kit gelagert wurde entsprachen nicht den Angaben im Abschnitt Aufbewahrung dieser Gebrauchsanweisung oder das Verfallsdatum des Kits ist abgelaufen gt berpr fen Sie bitte dass der Kit unter korrekten Bedingungen gelagert wurde berpr fen Sie das Verfallsdatum der Reagenzien siehe Kit Schachtel oder Etikett auf Reagenzienbeuteln und wiederholen Sie den Lauf ggf mit einem Kit dessen Verfallsdatum noch nicht abgelaufen ist Entweder wurde das Reagenz aus R hrchen 1 oder 2 nicht zur PCR Reaktion gegeben oder die doppelte Menge des Reagenzes aus R hrchen 2 wurde pipettiert gt Wiederholen Sie den Lauf f hren Sie dabei das Ansetzen der Reaktionen mit gro er Sorgfalt durch Derartige Pipettier Fehler kann man an einem h heren oder niedrigeren Fl ssigkeitsstand in einer der Reaktionskapillaren im Vergleich zu den anderen Kapillaren erkennen Es wurde nicht die korrekte CC Datei auf die Daten angewendet gt Erstellen Sie mithilfe des Myconostica MycAssay CC Kits eine CC Datei wenden Sie diese auf die Ergebnisse an und f hren Sie die Auswertung erneut durch Wenden Sie sich wegen weiterer Einzelheiten zu diesem Kit an Ihren rtlichen Vertriebspartner Die Positivkontrolle ergibt ein negatives Ergebnis Die Bedingungen unter denen der Kit gelagert wurde entsprachen nicht den Angaben im Abschnitt Aufbewahrung dieser Gebrauc
25. niger sensitiv und kann falsch negative Werte liefern _BAL Proben sollten vor der DNA Extraktion aus dem Pellet zentrifugiert werden Die Daten zeigten auch dass durch eine Volumenreduktion des f r die DNA Extraktion verwendeten berstands wobei die Volumenreduktion durch den Zentrifugationsschritt erreicht wurde die Menge an Inhibitoren die in das Assay System eingeschleppt werden reduziert wird Falsch positive Ergebnisse sind m glich wenn es sich beim infizierenden Erreger um Penicillium spp handelt der mit diesem Kit nicht von Aspergillus spp differenziert werden kann Obwohl das MycXtra Pilz DNA Extraktionsverfahren so entwickelt wurde dass PCR Inhibitoren entfernt werden sind nicht alle Medikamente oder Patientenpopulationen daraufhin evaluiert worden Das Verfahren ist weder umfassend mit Sputum Proben noch mit induzierter Kochsalzl sung oder mit Proben von Kindern evaluiert worden Von au en eingetragene Kontaminationen der Originalprobe oder der Kit Reagenzien k nnen zu falsch positiven Testergebnissen f hren Derartige Kontaminationen k nnen durch mit Aspergillus verunreinigte Luft unsaubere experimentelle Arbeitstechnik beim Umgang mit der Positivkontrolle oder durch eine u erliche Kontamination insbesondere von Pipettierhilfen mit Aspergillus DNA verursacht werden Da ein richtig positives Ergebnis bei Proben von Patienten die vor bergehend oder dauerhaft mit Aspergillus spp kolonisiert
26. orische Proben 4 4 Patientenproben sind negativ und die IAC liegt au erhalb des akzeptablen Bereichs Ergebnis 3 Wahrscheinlich enthalten die Patientenproben PCR Inhibitoren gt Wir empfehlen die DNA aus den Proben mit dem MycXtra Pilz DNA Extraktions Kit MycXtra Fungal DNA Extraction Kit zu isolieren 4 5 Die Patientenprobe ist negativ im Bereich ASP 530 und die IAC 560 Kurve hat sich deutlich von der regul ren Grundlinie wegbewegt siehe nachfolgende Beispielabbildung Pfeile zeigen ungew hnliche Kurven an Amplification Curves Die PCR Reaktion wurde inhibiert gt Stellen Sie sicher dass die Arbeitsfl che sowie Ger te und Hilfsmittel nach der Anwendung von Dekontaminationsl sungen und vor dem PCR Setup v llig trocken sind gt F hren Sie den Lauf der Patientenprobe nochmals durch Tritt das Problem erneut auf ist der PCR Inhibitor in der Probe vorhanden Geben Sie Nicht bestimmt als Ergebnis f r die Probe an 4 6 Die Ergebnisse im Bereich IAC 560 stimmen nahezu exakt mit denen im Bereich Pathogen 530 berein Es wurde keine oder eine falsche Farbabgleichsdatei CC Datei auf die Versuchsergebnisse angewendet gt berpr fen Sie in beiden Analysebereichen ob der Farbabgleich aktiviert ist und ob dieselbe MycAssay CC Datei auf beide Kan le angewendet wurde 4 7 Die Grundlinie stimmt bei manchen Proben mit der Negativkontrolle berein was auf eine nich
27. r eine Analyse ben tigt werden aber nur ein Satz Positiv und Negativkontrollen dann brauchen Sie die R hrchen 3 und 4 nur aus einem der Beutel zu entnehmen Mit R hrchen Nr 4 sollten Sie besonders vorsichtig umgehen Es enth lt Positivkontroll DNA Material und eine Kontamination k nnte falsch positive Patientenergebnisse verursachen Lassen Sie die R hrchen f r 5 10 Minuten bei Raumtemperatur auftauen vergewissern Sie sich dass der Inhalt jedes R hrchens vollst ndig aufgetaut ist bevor Sie mit dem n chsten Schritt fortfahren Mischen Sie den Inhalt der R hrchen und die Patientenproben kurz auf einem Laborsch ttler Vortex Zentrifugieren Sie anschlie end kurz in einer Mikrozentrifuge um den gesamten Inhalt vor Gebrauch vollst ndig am Boden der R hrchen zu sammeln Platzieren Sie die erforderliche Anzahl an 20 ul Kapillaren in einem Kapillarrack Halter Achten Sie darauf keine Abdr cke auf dem Glas zu hinterlassen Deutsch 5 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben 1 10 1 11 Pipettieren Sie die Negativkontrolle immer zuerst danach die Patientenproben Als Letztes sollte immer die Positivkontrolle hinzugegeben werden Die zu pipettierenden Volumina der Reagenzien und DNA L sungen bzw Proben sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben Reaktion Reagenz Negativkontrolle Patientenproben Positivkontrolle R hrchen 1 oranger Dec
28. roben k nnen Cp Werte von gt 37 0 gemessen werden Solche Werte spiegeln den normalen oder Hintergrund Wert der Aspergillus Last in Proben wider die aus dem Respirationstrakt gewonnen wurden Siehe den Abschnitt Klinische Befundung bei Ergebnis 1 2 oder 3 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 10 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Aspergillus Respiratorische Proben LightCycler 2 0 4 4 1 4 2 4 3 Hinweise zur Fehlersuche Die Negativkontrolle ergab ein positives Signal im 530 Kanal Beim Ansetzen kam es zu einer Kontamination Die Ergebnisse des gesamten Analysenlaufs k nnen nicht als zuverl ssig angesehen werden gt Wiederholen Sie den gesamten Lauf gehen Sie dabei mit besonderer Sorgfalt vor wenn Sie die Templates vor allem die Positivkontrolle R hrchen 4 zugeben um sicherzustellen dass es nicht zu einer Kreuzkontamination kommt gt Vergewissern Sie sich dass der Arbeitsbereich sowie Ger te und Hilfsmittel vor und nach Gebrauch auf korrekte Art und Weise dekontaminiert werden Die Negativkontrolle befand sich nicht an der richtigen Position im Ger t gt Achten Sie darauf allen Kapillaren in der Software die korrekte Bezeichnung zuzuweisen Der Cp Wert der IAC in der Negativkontrolle liegt au erhalb des akzeptablen Bereichs Die PCR wurde inhibiert gt Stellen Sie sicher dass die Arbeitsfl che sowie Ger te und Hilfsmittel nach der Anwendung von Dekontaminationsl su
29. s species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance Clin Microbiol Infect 4 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 7 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 8 Tillie Leblond I Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Deutsch 1 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben Die gegenw rtigen Methoden zur Diagnose der chronischen pulmonalen Aspergillose bestehen aus einer Kombination aus Radiologie die unspezifisch ist und Serologie Aspergillus IgG Antik rper oder pr zipitierende Antik rper die bei den meisten Formen der Aspergillose positiv ist und dementsprechend nicht spezifisch f r eine bestimmte Erscheinungsform der Aspergillose Die Kulturen f hren nur in 40 65 der F lle in denen die Diagnose durch Radiologie und Serologie best tigt wurde zu einem positiv
30. sdatum des Kits ist abgelaufen berpr fen Sie bitte dass der Kit unter korrekten Bedingungen gelagert wurde berpr fen Sie das Verfallsdatum der Reagenzien siehe Kit Schachtel oder Etikett auf Reagenzienbeuteln und wiederholen Sie den Lauf ggf mit einem Kit dessen Verfallsdatum noch nicht abgelaufen ist Das verwendete Ger t arbeitet nicht optimal berpr fen Sie bitte dass Ihr Real Time PCR Ger t ber eine regelm ig aktualisierte Wartungs Historie verf gt und vollst ndig kalibriert wurde so wie dies in der zugeh rigen Installations und Wartungsanleitung beschrieben ist Beim Software Setup wurde die falsche Protokolldatei verwendet Beachten Sie die Angaben in Abschnitt 2 und w hlen Sie von der Myconostica Protokoll CD ROM die korrekte Protokolldatei die f r die betreffende Software in der jeweiligen Version angegeben wird Nur die Datei die der installierten Software entspricht kann geladen werden Wiederholen Sie den Lauf mit der richtigen Protokolldatei Wenn Sie weitere Fragen haben oder Hilfe bei Problemen ben tigen setzen Sie sich bitte mit unserem Technischen Kundendienst productsupport lab21 com in Verbindung Deutsch 13 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Nur f r In vitro Diagnostik LightCycler 2 0 Respiratorische Proben Leistungsmerkmale und Anwendungsgrenzen Dieser Kit wurde urspr nglich mit einem Cepheid Smartcycler Real Time PCR System validiert Einige der angegebenen
31. sind erhalten werden kann ist bei der Interpretation der Testergebnisse eine klinische Beurteilung im Zusammenhang mit der Erkrankung notwendig LIZENZIERUNG TopTaq Hot Start wird von QIAGEN bezogen QIAGEN ist ein eingetragenes Warenzeichen der Qiagen GmbH Hilden Deutschland Dieses Produkt wird unter der Lizenz des Public Health Research Institute Newark New Jersey USA verkauft und darf gem den PHRI Patentrechten nur f r die humane in vitro Diagnostik verwendet werden SmartCycler ist ein eingetragenes Warenzeichen von Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 USA Dieses Produkt ist zum Teil durch eine exklusiv gew hrte Lizenz einer Patentanmeldung des Fred Hutchinson Cancer Centers in Seattle USA abgedeckt LightCycler ist ein eingetragenes Warenzeichen der Roche Diagnostics GmbH Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupport lab21 com 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 16
32. st vermeiden Sie w hrend des Ansetzens der Reaktionen die Verwendung dieser L sung da sie die PCR Reaktionen inhibieren k nnte Ein Beutel enth lt jeweils eines der R hrchen 1 2 3 und 4 Die Reagenzien in einem Beutel reichen f r die Durchf hrung von acht Reaktionen Mindestens eine Positivkontroll Reaktion und eine Negativkontroll Reaktion m ssen pro Lauf mit durchgef hrt werden wobei die Reagenzien aus einer einzigen Kit Charge stammen m ssen Daher k nnen 6 Patientenproben mit einer Packung analysiert werden Falls mehr als sechs Proben untersucht werden m ssen k nnen mehrere Beutel verwendet werden wobei die verwendeten Beutel aus derselben Kit Charge stammen m ssen Der LightCycler 2 0 kann jedoch nur bis zu 32 Proben in einem Lauf aufnehmen Es k nnen daher maximal 30 Patientenproben in einem Lauf bearbeitet werden 4 Beutel Berechnen Sie unter Ber cksichtigung der folgenden Tabelle die Anzahl der ben tigten Reaktionsans tze Anzahl Beutel Maximale Anzahl an Patientenproben 6 1 2 3 4 Nehmen Sie die entsprechende Anzahl der Beutel aus dem Tiefk hlschrank Einen Beutel der nicht mehr dicht verschlossen ist sollten Sie nicht verwenden Falls die aus den Patientenproben gewonnenen DNA Proben nach der Extraktion eingefroren wurden entnehmen Sie auch sie aus dem Tiefk hlschrank ffnen Sie die ben tigte Anzahl an Beuteln und entnehmen Sie die R hrchen Wenn insgesamt mehrere Reagenzienbeutel f
33. t erfolgte Amplifikation hindeutet Die Software hat jedoch einen positiven Cp Wert ausgegeben wie in der Abbildung unten Die Ausgabe eines positiven Cp Wertes f r ein negatives Amplifikationsdiagramm wurde bei 154 negativen Reaktionen die w hrend der Validierungsstudien ausgef hrt wurden nur zweimal beobachtet gt Geschieht dies wiederholen Sie bitte die Probe n um das Ergebnis Negativ zu best tigen Ampification Curves 1 37 1 2 noCp reported 33 33 2 030 152 Version 1 3 01MAR12 Deutsch 12 Nur f r In vitro Diagnostik MycAssay Aspergillus Respiratorische Proben LightCycler 2 0 4 8 gt Wenn ich mein CC Objekt anwende fallen einige der Daten im 560 IAC Kanal ab was zu Cp Werten au erhalb des zul ssigen Bereichs f hrt Amplification Curves Dies ist vollkommen normal bei Reaktionen die hohe Konzentrationen der DNA Zielsequenz enthalten und st rt nicht die Interpretation der Patientenergebnisse Folgen Sie dem normalen Analyseablauf Sie werden feststellen dass bei Proben die positiv auf Aspergillus sind das IAC Ergebnis nicht f r eine Ergebnisentscheidung bez glich des betreffenden Patienten erforderlich ist 4 9 In keinem Kanal wird ein Ergebnis erhalten weder bei einer Probe noch bei den Kontrollen gt Die Bedingungen unter denen der Kit gelagert wurde entsprachen nicht den Angaben im Abschnitt Aufbewahrung dieser Gebrauchsanweisung oder das Verfall
34. te Die analytische Selektivit t wurde mit DNA Proben untersucht die aus einer F lle verschiedener Pilz und Nicht Pilz Spezies extrahiert worden waren Bei folgenden Spezies wurde kein positives Ergebnis erhalten Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Auch f r die folgenden Bakterienspezies wurde kein positives Ergebnis erhalten Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitides Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius Humane DNA und die folgenden 3 Spezies Pneumocystis jirovecii Histoplasma capsulatum und Alternaria alternata wurden auf dem SmartCycler jedoch nicht auf dem LightCycler 2 0 System getestet Alle vier Proben ergaben bei dem Assay negative Ergebnisse Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit und der Wiederholbarkeit analysierten vier verschiedene Laboranten ein Set bestehend aus sieben verschiedenen Template DNAs jeweils als Dreifach Bestimmung insgesamt wurden 168 Tests durchgef hrt
35. tergebnisse verursachen Tragen Sie w hrend der gesamten Prozedur Einmal Laborhandschuhe Alle Reagenzienr hrchen m ssen nach Gebrauch und vor der Entsorgung mit dem zugeh rigen Deckel verschlossen werden Notieren Sie auf dem Versuchsplan sorgf ltig die Positionen aller Kapillaren die relevante Proben enthalten in den 32 Positionen des Karussells F r die genaue Auswertung der Daten ist eine Farbabgleichsdatei anzuwenden die mithilfe des Myconostica MycAssay CC Kits angelegt wurde Testdurchf hrung 1 Ansetzen der Real Time PCR 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 Schalten Sie das LightCycler 2 0 Real Time PCR System Ger t zugeh rigen Computer und Zentrifuge ein und starten Sie die zugeh rige Software Geben Sie Benutzername und Passwort ein wenn Sie dazu aufgefordert werden und w hlen Sie die Datenbank Diagnostic aus Wenn es sich um den ersten Lauf eines Tages handelt f hren Sie zun chst einen Selbsttest des Ger ts durch bevor Sie einen Lauf vorbereiten Achtung Vor der Auswertung von Ergebnissen die mit MycAssay Aspergillus auf dem LightCycler 2 0 gemessen wurden muss der Farbabgleichslauf abgeschlossen sein Dieser Lauf muss jedoch nicht vor der Verwendung dieses Assays durchgef hrt werden sondern kann auch sp ter erfolgen und auf die Laufdateien angewendet werden Stellen Sie sicher dass der Arbeitsbereich mit DNA Dekontaminationsl sung gereinigt und vollst ndig trocken i
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