Gebrauchsanweisung für Biofortuna SSPGo TM HLA
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1. Problem Wahrscheinliche Ursache Keine Amplifikation im Falsche DNA Konzentration Die DNA Menge durch Messung bei OD bestimmen Reaktionsgef verwendet und sicherstellen dass pro Reaktion insgesamt 50 100 ng DNA in einem Volumen von 10 ul zugegeben wurde DNA Probe enth lt PCR Kein heparinisiertes Blut verwenden DNA Proben mit Inhibitoren mehr als 1 mg dl H moglobin vermeiden Schlechte Qualit t der Die DNA Qualit t bestimmen Das OD260 230 Verh ltnis verwendeten DNA Probe sollte gem UV Spektralphotometrie 1 69 1 94 betragen Sicherstellen dass die DNA vor der Verwendung vollst ndig in der L sung resuspendiert ist Sicherstellen dass die DNA Probe mit hochreinem Wasser verd nnt wurde und h chstens 2 5 mM Tris 0 25 mM EDTA enth lt Reagenzien sind nicht Sicherstellen dass die Pellets nach Zugabe der DNA vollst ndig resuspendiert vollst ndig rehydratisiert sind Sicherstellen dass pro Reaktion 10 ul DNA L sung verwendet werden Thermocycler ist nicht richtig Sicherstellen dass das PCR Programm gem der I eingestellt Gebrauchsanweisung richtig eingegeben wurde Sicherstellen dass der beheizte Deckel des Thermocyclers aktiviert und ausreichend fest verschlossen ist Weitere Informationen entnehmen Sie bitte der Gebrauchsanweisung zum ThermocyCcler Probleme bei der Sicherstellen dass der Elektrophoresetank mit Strom Elektrophorese versorgt wird da2. Abschnitt 4 Inhalt des Kits Hinzuf gen der Abdichtungsfolien f r Platten in Kits Abschnitt 5 Nicht mitgelieferte Reagenzien Korrektur 96 Vertiefungen Thermocycler Spezifikationen und Laborausstattung hinzugef gt Lagerungsbedingungen f r Kit zu 2 28 C aktualisiert Der Umgang mit nicht hydrierten PCR Platten und Streifen Der Umgang mit hydrierten PCR Platten und Streifen Hinzuf gen von St rsubstanzen und DNA Reinheitsleitlinien Azsoy2so Messung aktualisiert Positionieren der gefriergetrockneten Pellets vor dem Hinzuf gen der Probe eingef gt Abschnitt 9 Interpretation Chargenspezifische Anmerkungen Die Kit Chargennummer muss mit der Chargennummer in der Abschnitt 8 Anweisungen zur Verwendung Verd nnen von DNA in sterilem hochreinem Wasser Interpretationstabelle bereinstimmen Ce ce 0088 DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 12 von 12 Y Anzahl der Tests Bevollm chtigter EG cij Gebrauchsanleitung beachten aal Herstellungsort vo In vitro Diagnostikum S Verfallsdatum 28 4c X i Lagertemperatur LOT Chargenbezeichnung AB Vertrieb durch Global Trade Item Number Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough CH62 3RJ UK T 44 0 151 334 0182 E info biofortuna com W www biofortuna com BIOFORTUNA SIM DIAGNOSTICS FranCaise Traductions disponibles Deut
3. herstellen Wenn das Gel bis auf ca 60 C abgek hlt ist Ethidiumbromid in einer End Konzentration von 0 5 ug ml zugeben Das Gel gie en und K mme im Mikrotiter Format einsetzen z B 12x8 Vertiefungen mit 9 mm Abstand Sobald das Gel erstarrt ist die K mme entnehmen und das Gel in 0 5x TBE Puffer legen Das Gel muss vollst ndig bedeckt sein Das gesamte PCR Produkt in Sequenz in das 2 ige Agarosegel laden und die Position jeder Reaktion notieren Zur Gr enbestimmung wird eine 1000 bp Leiter empfohlen Das Gel 20 Minuten bei 10 V cm laufen lassen Genaue Angaben zur Ausr stung entnehmen Sie bitte der Gebrauchsanweisung des Herstellers Ihres Elektrophorese Ger tes Die Betrachtung des Gels sollte mit einem UV Geldokumentations System mit UV Transilluminator erfolgen Hinweis Unzureichende Elektrophorese kann in der Vermischung gro er Amplifikate ber 600 bp mit den Kontroll Amplifikaten resultieren Bitte vergewissern Sie sich dass die Elektrophorese in der Lage ist derartige Amplifikate darzustellen Bei zu langer Elektrophorese k nnen kleine Amplifikate in die vorhergehenden Vertiefungen eines Gels verloren gehen SSPGo Kits sind so konzipiert dass die Ergebnisse manuell anhand von Interpretationstabellen die Sie unter www biofortuna com finden bestimmt werden k nnen Wenn Sie Probleme beim Zugriff auf die Internetseite haben wenden Sie sich bitte an Ihren zust ndigen Kundendienst Die Interpretationstabellen k nne
4. DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 1 von 12 ke BIOFORTUNA SSPGo Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGo HLA Typisierungskits CE Revision 5 Januar 2014 Biofortuna HLA SSPGo Kits sind qualitative DNA basierte Kits zur Bestimmung von HLA Allelen in Kits mit niedriger Aufl sung oder zur gruppenspezifischen Amplifikation von Allelen in Kits mit mittlerer Aufl sung Als allgemeine Definition f r eine mittlere Aufl sung gilt dass die meisten Ergebnisse mit einer zweistelligen Nummer eindeutig definiert werden z B DQB1 02 DOB1 05 etc Als allgemeine Definition f r eine hohe Aufl sung gilt dass die meisten Allele mit vierstelligen Nummern definiert werden wie z B DOB1 02 01 DQB1 05 01 etc Dieses Produkt ist ein In vitro Diagnostikum das nur zur Verwendung durch qualifiziertes Fachpersonal vorgesehen ist HLA Molek le spielen eine zentrale Rolle f r die Immunit t sowie die Selbst und Fremderkennung Daher sind bei den meisten Transplantationsarten zuvor eine HLA Genotypisierung und ein HLA Matching zwingend notwendig Da HLA Antigene die Spezifit t von T Zell vermittelten Immunantworten einschr nken ist die HLA Genotypisierung ein n tzliches Instrument bei der Untersuchung von Immunst rungen oder der Immunantwort auf Krankheitserreger Impfungen oder medizinische Behandlungen Dar ber hinaus kann die HLA Genotypisierung als Hilfsmittel bei der Diagnose v
5. e PCR Gef e nach Zugabe von DNA dicht verschlossen sind da andernfalls w hrend der PCR Amplifikation Verdunstung auftreten kann Dabei insbesondere auf die R nder und Ecken achten Hinweis 1 Bei Bedarf k nnen nicht hydrierte PCR Platten und Streifen vor dem Hinzuf gen von DNA bei einer Raumtemperatur bis zu 21 C und einer Feuchtigkeit unter 60 bis zu 3 Stunden au erhalb des Folienbeutels aufbewahrt werden Hinweis 2 Nach dem Befeuchten mit DNA k nnen aus frisch ge ffneten Beuteln entnommene PCR Streifen und Platten vor der PCR bis zu 24 Stunden bei 2 8 C aufbewahrt werden vorausgesetzt die Gef e werden gut versiegelt um ein Verdunsten zu verhindern Anforderungen an DNA Proben Jede Reaktion im Test wurde f r die Verwendung von 50 100 ng DNA optimiert Jede Reaktion sollte jedoch unbedingt mit exakt 10 ul Fl ssigkeit rehydratisiert werden Daher kann der Test nur mit 10 ul DNA bei 5 10 ng ul durchgef hrt werden Die DNA nur mit sterilem hochreinem Wasser zur erforderten Konzentration verd nnen Achtung Die erzeugte DNA Probe darf h chstens 2 5 mM Tris 0 25 mM EDTA enthalten Nur aus Zitrat extrahierte oder in EDTA vorbereitete DNA verwenden Da Heparin die PCR hemmen kann sollte keine DNA aus heparinisierten Blutproben extrahiert werden Es ist erwiesen dass H moglobinkonzentrationen von mehr als 1 mg dl in den DNA Proben SSPGo HLA Kits beeinflussen Die DNA kann mit allen herk mmlichen Methoden e
6. eizte Deckel aktiviert ist und ausreichend Kompressionsdruck vom Deckel ausgeht Nur die mitgelieferten Biofortuna Abdichtungsfolienverwenden Zus tzliche Folien sind im Vereinzelt auftretende Fehler aufgrund von Problemen mit der DNA DNA Problem mit der DNA Konzentration Probleme mit dem Thermocycler Keine DNA vorhanden Sicherstellen dass in allen Vertiefungen DNA vorhanden ist Falsches Volumen Sicherstellen dass zu jeder Reaktion 10 ul DNA L sung hinzugef gt wurden Zu hohe Menge an DNA hinzugef gt Bei einer Konzentration von ber 200 ng oder unter 20 ng kann es zu einer fehlerhaften PCR kommen Durch Verunreinigungen in der DNA kann es vereinzelt oder in verst rktem Ma e zu fehlgeschlagenen Amplifikationen kommen Die Konzentration und Reinheit der DNA berpr fen Die Zugabe von zu hohen Mengen an DNA zu den PCR Reaktionen kann zu verschmierten Gelbildern f hren Es ist m glich dass die DNA degradiert oder nicht rein genug ist Neue DNA Probe verwenden berpr fen dass die DNA Konzentration weder zu hoch noch zu niedrig ist Sollkonzentration 50 100 ng DNA pro Reaktion in 10 ul Bitte unbedingt die Anweisungen des Herstellers zur Wartung und Kalibrierung des Thermocyclers befolgen berpr fen dass die PCR Parameter gem der Gebrauchsanweisung richtig sind Gelfehler an Reaktionsprodukt gegeben wurde d h zwischen 5 ul und 10 ul Die Pipetten gem den Anweis
7. ersonal berpr ft werden F r eine klinische Entscheidung sollten die Ergebnisse dar ber hinaus mit einem anderen Typisierungsverfahren best tigt werden e Alle Reagenzien gem den Richtlinien der guten Laborpraxis handhaben Ce CE DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 3von 12 e Den pr PCR Bereich vom post PCR Bereich trennen Keine Materialien vom post PCR Bereich zur ck in den pr PCR Bereich bringen e Biogef hrdung Alle Blutprodukte als potentiell infekti s behandeln e Biogef hrdung Ethidiumbromid ist potentiell karzinogen Bei der Verwendung stets Handschuhe Laborkittel und Schutzbrille tragen e Biogef hrdung Vorsicht beim Umgang mit UV Quellen stets Handschuhe Laborkittel und Schutzbrille tragen Nie direkt in das UV Licht schauen e Sicherheitsdatenbl tter Material Safety Data Sheets finden Sie unter www biofortuna com Biofortuna SSPGo Kits sollten bei 2 28 C gelagert werden Sobald PCR Gef e aus den Folienbeuteln entnommen wurden sollten die Reagenzien innerhalb von 3 Stunden mit DNA rehydratisiert werden Das Verfallsdatum entnehmen Sie bitte der Verpackung Die Produkte nicht ber das aufgedruckte Datum hinaus verwenden Die Kits nicht verwenden wenn der Folienbeutel gerissen ist L cher aufweist oder keinen Antikondensationsbeutel enth lt Mithilfe der im Lieferumfang enthaltenen Abdichtungsfolien und Verschl ssen sicherstellen dass di
8. gen Kontrollbande Richtung der Elektrophorese Allelspezifische Bande Abb 1 Beispiele f r positive Reaktionen gekennzeichnet durch vorhandene allelspezifische Banden und Kontrollbanden Reaktionen 1 3 negative Reaktionen gekennzeichnet durch vorhandene Kontrollbanden und nicht vorhandene allelspezifische Banden Reaktionen 4 7 sowie eine fehlgeschlagene Reaktion gekennzeichnet durch nicht vorhandene Banden Reaktion 8 Ce CE DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 6 von 12 Stellen Sie sicher dass die Chargennummer des Kits zu der Chargennummer in der Interpretationstabelle passt Software in der manuellen Analyse von SSPGo Kit Testergebnisse und die Archivierung von Daten unterst tzen kann von der Website Biofortuna www biofortuna com heruntergeladen werden Bevor Biofortuna ein Produkt versendet wird f r jede Charge SSPGo eine Qualit tskontrolle durchgef hrt Aus jeder Kitcharge werden Proben gegen ein festgelegtes Panel mit humanen DNA Proben getestet um die ordnungsgem e Leistung sicherzustellen Jede Reaktion wurde gegen mindestens 47 DNA Proben aus einer gut charakterisierten Zelllinie validiert Biofortuna empfiehlt allen Labors f r alle neuen Typisierungsprodukte vor der Verwendung mit klinischen Proben eine interne Validierung durchzuf hren Die diagnostische Typisierung sollte nur von qualifiziertem Fachpersonal durchgef hrt und die Ergebnisse von einem a
9. ie Reaktionsgef e mit der mitgelieferten Abdichtungsfolie oder den PCR R hrchenverschl ssen verschlie en Sicherstellen dass die Reaktionsgef e m glichst dicht verschlossen sind um eine Verdunstung zu verhindern Dabei insbesondere auf die R nder und Ecken achten vii Die Platte bzw Streifen direkt in den Thermocycler geben Sicherstellen dass die Gef e vollst ndig im Block eingesetzt sind und der Deckel vollst ndig geschlossen ist Anderenfalls kann es in einzelnen F llen durch Verdunsten oder Kondensieren zu einer fehlerhaften PCR kommen viii PCR Programm durchf hren siehe PCR Parameter HINWEIS ZUR RESUSPENSION Nach der Entnahme der PCR Gef e aus dem Folienbeutel sollten die Reagenzien z gig mit DNA hydriert werden Weitere Informationen entnehmen Sie bitte Hinweis 1 und Hinweis 2 HINWEIS ZUR NEGATIVKONTROLLE Einige Kits enthalten eine Negativkontrolle NTC No Template Control als letzte Reaktion in der Platte Diese Reaktionsmischung enth lt einen violetten Farbstoff zur Unterscheidung von den restlichen Reaktionen Die NTC dient zur Erkennung einer PCR Kontamination oder einer Kontamination durch genomische DNA die im Wasser enthalten sein kann das zur Resuspension der DNA verwendet wurde Liegt eine PCR Kontamination vor werden Amplifikate unterschiedlicher Gr e festgestellt HINWEIS ZUR H HE DER PCR PLATTE STREIFEN Es wird empfohlen dass die Platten und Streifen dieselbe H he aufweisen wenn s
10. ie im selben PCR Ger t verwendet werden Bei unterschiedlicher H he kann es zu unzureichendem Kontakt mit dem beheizten Deckel des PCR Ger tes kommen Dies kann zu einer schwachen oder fehlerhaften PCR Amplifikation f hren PCR Parameter Die folgenden PCR Parameter sollten verwendet werden Sicherstellen dass die Temperaturerh hungs geschwindigkeit ramp speed 1 C pro Sekunde betr gt und den beheizten Deckel aktivieren Eine vollst ndige Gebrauchsanweisung zum Thermocycler entnehmen Sie bitte dem Benutzerhandbuch des Herstellers Thermocycler sollten gem den Akkreditierungsrichtlinien der American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ASHI oder European Federation of Immunogenetics EFI kalibriert werden Denaturierung 94 C 5 Minuten Denaturierung 96 C 15 Sekunden Anlagerung 66 C 50 Sekunden 10 Zyklen Extension 72 C 30 Sekunden Denaturierung 96 C 15 Sekunden Anlagerung 64 C 50 Sekunden 20 Zyklen Extension 72 C 30 Sekunden HALTEN Bei mindestens 15 C h chstens 72 Stunden vor dem Laufen der Gels Bei Bedarf kann die PCR Platte vor dem Laufen der Gels bis zu 24 Stunden bei 2 bis 8 C aufbewahrt werden Die Platten m ssen stets gut verschlossen sein Ce ce 0088 DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 5 von 12 Gelelektrophorese Diese Anweisungen gelten f r die horizontale Agarose Gelelektrophorese Ein 2 iges Agarosegel in 0 5x TBE Puffer
11. isualisierung der Amplifikationsprodukte kann mittels Agarosegel Elektrophorese Ger ten erreicht werden die die DNA Fragmente nach ihrer Gr e trennen Ce Ce DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 2 von 12 e _PCR Platten oder PCR Streifen aus Polypropylen mit 8 bis 96 PCR Vertiefungen je nach Kit jede Vertiefung enth lt vorpipettierte gefriergetrocknete Primer Polymerase dNTPs und Puffer Alle Platten oder Streifen werden mit Abdichtungsfolien oder verschl ssen versiegelt einzeln verpackt in einem Folienbeutel mit einem Antikondensationsbeutel geliefert PCR Abdichtungsfolien und verschl sse 1 Gebrauchsanweisung Analysenzertifikat Interpretationstabellen und Sicherheitsdatenbl tter Material Safety Data Sheets MSDS k nnen von der Biofortuna Internetseite www biofortuna com heruntergeladen werden Sollte das Herunterladen nicht m glich sein wenden Sie sich bitte an Ihren zust ndigen Kundendienst CleanAmp dNTPs stehen unter der Lizenz von Trilink Biotechnologies Inc zur Verwendung in Biofortuna SSPGo Produkten Geeignete kalibrierte Pipetten und sterile Pipettenspitzen z B P10 Pipette mit 10 ul Filterspitzen DNA Isolierungskit materialien UV Spektralphotometer Polypropylen R hrchen Steriles Wasser Molecular Grade Ein Thermozylinder mit den folgenden Spezifikationen sollte verwendet werden 96 Well Thermocycler mit beheiztem Deckel mit ei
12. n kann Sicherstellen dass sich die Agarose vor dem Gie en des Gels vollst ndig aufgel st hat Sicherstellen dass das Gel nicht zu lange laufen gelassen wird da kleinere Amplifikate aus dem Gel herauswandern k nnen Sicherstellen dass das Gel lange genug laufen gelassen Sicherstellen dass alle Vertiefungen in der richtigen I wurde um die Trennung der Banden zu erm glichen Frische Ethidiumbromid L sung verwenden Probleme mit dem Thermocycler Probleme aufgrund von Verdunstung Fehler k nnen insbesondere im Randbereich des Assays dadurch auftreten dass der Deckel nicht fest genug verschlossen wurde Dies kann auf halber H he der PCR Vertiefung zu Verdunstung und Kondensation der PCR Reaktion f hren und ein Fehlschlagen der PCR verursachen Bitte unbedingt die Anweisungen des Herstellers zur Wartung und Kalibrierung des Thermocyclers befolgen berpr fen dass die PCR Parameter gem der Gebrauchsanweisung richtig sind Sicherstellen dass alle Vertiefungen ausreichend abgedeckt und verschlossen sind Achten Sie dabei besonders auf die Vertiefungen in der N he der R nder der PCR Platten bzw Streifen DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 9 von 12 Problem Verschmiertes Gelbild Schwache Amplifikation Wahrscheinliche Ursache Handel erh ltlich L sung Sicherstellen dass der beh
13. n spezifische f r die Interpretation relevante Hinweise enthalten Das Gelfoto unter Ber cksichtigung der passenden Kit und Chargennummern an das entsprechende Interpretationsformular heften Das Gelbild untersuchen Jede Reaktion sollte eine positive Kontrollbande enthalten Hierzu die Interpretationstabellen zu Hilfe nehmen da bei verschiedenen SSPGo Produkten die Gr e unterschiedlich sein kann Interne Kontrollbanden k nnen wesentlich schw cher erscheinen wenn allelspezifische Banden vorhanden sind Ist eine allelspezifische Bande jedoch keine Kontrollbande vorhanden sollte dies dennoch als positives Ergebnis betrachtet werden Alle Banden unter 70 bp ignorieren da es sich hierbei um freie Primer handelt Die positiven Reaktionen bestimmen Positive Reaktionen sind durch Banden in erwarteter Gr e gekennzeichnet wie in den Interpretationstabellen angegeben Beachten Sie dass in einer bestimmten Reaktion mehr als eine Produktgr e vorliegen kann hierbei handelt es sich um Multiplexreaktionen die in den Interpretationstabellen angegeben sind Die positiven Reaktionen mit den Interpretationstabellen vergleichen Ein positives Ergebnis in einer Reaktion deutet darauf hin dass mindestens eines der Allele vorhanden ist die in der Interpretationstabelle hierzu angegeben sind Jedes beliebige Allel kann in mehreren R hrchen amplifiziert sein ist das Allel vorhanden sollte in allen relevanten Reaktionen eine positive Reaktion vorlie
14. nderen qualifizierten Mitarbeiter berpr ft werden Die Leistung des SSPGo HLA Typisierungskits wurde in einer in f nf Pr fzentren durchgef hrten In vitro Diagnostikastudie mit dem Diagnostikum One Lambda Labtype SSO verglichen Die im Rahmen der SSPGo Pr fung durchgef hrte Locus Typisierung lieferte Testergebnisse f r HLA A HLA B HLA C HLA DQA1 HLA DQB1 HLA DRB1 3 4 5 HLA DPB1 DPA1 und HLA DQA1 05 DQB1 02 DOS Die klinische Wirksamkeit der SSPGo HLA Typisierungskits zeigt eine 98 3 100 ige bereinstimmung mit dem Vorg ngerprodukt SSO Verfahren mit nicht weniger als 95 Konfidenz der Genotypisierung der getesteten HLA Allele der Klasse I und Il aus DNA die aus 5 10 ng ul Vollblut gewonnen wurde Unter Ausschluss dreier 3 best tigter nicht bereinstimmender Genotypisierungsergebnisse wurde 100 bereinstimmung bei 1 222 Proben f r 3 Chargen jeden Testkists in den klinischen Pr fzentren in den USA und Gro britannien erzielt Die Reproduzierbarkeit der SSPGo HLA Typisierungskits von Pr fzentrum zu Pr fzentrum wurde an drei Pr fzentren anhand eines repr sentativen Panels von 8 SSPGo PCR Reaktionen gegen die mit 4 ng ul und 11 ng ul den unteren und oberen Grenzen des Testkit Konzentrationsbereichs formulierten gelieferten DNA Proben gepr ft Eine Gesamtanzahl von 958 960 gleichm ig ber die drei externen Pr fzentren verteilten Einzelreaktionen war konkordant zu den DNA Proben was insgesamt in einer berei
15. ner Temperatur von 104 C f r lfreien Betrieb Temperaturerh hungsgeschwindigkeit 1 0 C pro Sekunde Temperaturbereich 4 0 C bis 99 9 C Temperaturgenauigkeit 0 25 C im Bereich von 35 C bis 99 9 C Temperaturkalibration r ckf hrbar auf Referenzstandard Thermozylinder anhand der nachstehend in Abschnitt 8 aufgef hrten PCR Parameter programmieren 000000 Hinweis Eine vollst ndige Gebrauchsanweisung zum Thermocycler entnehmen Sie bitte dem Benutzerhandbuch des Herstellers Thermocycler sollten gem den Akkreditierungsrichtlinien der American Society of Histocompatibility and Immunogenetic ASHI oder European Federation of Immunogenetics EFI kalibriert werden e Gelelektrophorese Reagenzien Agarose 0 5x TBE DNA Molekulargewichtsmarker 1 000 bp 10 mg ml Ethidiumbromid e Gelelektrophorese Ausr stung Geltanks Netzanschluss Geldokumentations System mit UV Transilluminator e Software in der manuellen Analyse von SSPGo Kit Testergebnisse und die Archivierung von Daten unterst tzen kann von der Website Biofortuna www biofortuna com heruntergeladen werden Hinweis Alle Ver nderungen der vorgegebenen Bedingungen wie z B Andere Temperaturerh hungsgeschwindigkeiten k nnen die Interpretation der Testergebnisse beeinflussen e Zur Verwendung als In vitro Diagnostikum e Die Tests sollten nur von qualifiziertem Fachpersonal durchgef hrt werden e Alle Typisierungsergebnisse sollten von qualifiziertem Fachp
16. nstimmung von 99 7 0 995 LCL resultierte Die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge wurde anhand dreier Chargen eines repr sentativen SSPGo HLA Testkits von einem einzigen Pr fzentrum Betreiber in einem DNA Konzentrationsbereich von 5 10 ng uL gepr ft Die Pr fung der Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge f r die SSPGo HLA Typisierung ergab bei insgesamt 390 Tests von 130 130 DNA Proben eine 100 ige bereinstimmung zum Vorg ngermodell f r die drei 3 gepr ften Chargen des repr sentativen SSPGo HLA Testkits Konkordante SSPGo HLA positive Best tigung wurde f r Allele der Klasse I und Klasse Il in Vergleichstests mit LABTyp SSO getesteten klinischen Proben erhalten Eine interne SSPGo HLA Pr fung lieferte bereinstimmende Ergebnisse zu DNA Referenzproben au er bei nicht verf gbaren Proben f r bestimmte seltene HLA DPB1 Allele und seltene HLA B Allele sowie Allelegruppen wie B 59 01 B 78 und B 83 01 Die folgenden seltenen Allelegruppen konnten nicht best tigt werden B 59 B 78 B 83 DPB 21 01 DPB 26 01 02 DPB 27 01 DPB 28 01 DPB 29 01 DPB 31 01 DPB 34 01 DPB 35 01 01 DPB 39 01 DPB 45 1 DPB 46 01 DPB 51 01 DPB 55 01 DPB 59 01 DPB 63 01 DPB 81 01 DPB 85 01 amp DPB 105 01 Ce CE DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 7 von 12 1 Bunce M et al Tissue Antigens 1995 Nov 46 5 355 67 2 Saiki RK et al Nature 1986 Nov 13 19 324 6093 163 6
17. on Krankheiten verwendet werden bei denen bestimmte HLA Allele ma geblich mit dem Krankheitszustand im Zusammenhang stehen Die meisten HLA Gene sind hochgradig polymorph weshalb zur richtigen Bestimmung von HLA Antigenen in der Regel eine DNA Genotypisierung erforderlich ist Die PCR Genotypisierung mittels sequenzspezifischer Primer SSP ist eine schnelle Methode zur HLA Genotypisierung die insbesondere f r Situationen geeignet ist in denen eine mittlere Aufl sung erforderlich ist Alle Biofortuna SSP Kits beinhalten komplette Reaktionsmischungen in trockener Form einschlie lich Polymerase sodass der Benutzer vor der PCR lediglich die DNA hinzuf gen muss Es wird alles unternommen um die Kits gem den neuen IMGT Ver ffentlichungen zu HLA Alignments auf dem aktuellen Stand zu halten Aktualisierungen des Kits finden Sie unter www biofortuna com Die SSP PCR basiert darauf dass nur Primer mit einem exakt an eine Zielsequenz passenden 3 Ende amplifizieren Mit nicht passenden Primern lassen sich keine positiven Amplifikationsprodukte erzeugen Ein Primerpaar der internen Kontrolle das eine konservierte Region eines Housekeeping Gens amplifiziert ist in jeder PCR Reaktionsmischung enthalten das Primerpaar der internen Kontrolle ist ein Indikator f r die Integrit t der PCR Reaktion Bei der SSP Genotypisierung werden in der Regel mehrere Reaktionen verwendet die wenn sie zusammen analysiert werden den Genotyp anzeigen Die V
18. s Netzteil berpr fen und die Elektroden reinigen Das Gel in 0 5X TBE Puffer laufen lassen Sicherstellen dass 0 5 ug ml frisches Ethidiumbromid verwendet wird berpr fen dass bei der Betrachtung des Gels eine ausreichende UV Beleuchtung gegeben ist Weitere Informationen zum Geltank und zum Netzteil entnehmen Sie bitte der Gebrauchsanweisung des Herstellers Ce ce DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 8 von 12 Problem Wahrscheinliche Ursache Platten nicht richtig verschlossen L sung Unzureichend verschlossene Platten k nnen w hrend der PCR zu Verdunstung f hren Biofortuna liefert die empfohlene Abdichtungsfolien mit dem Kit Zus tzliche Folien sind im Handel erh ltlich Sicherstellen dass alle Vertiefungen ausreichend abgedeckt und verschlossen sind Achten Sie dabei besonders auf die Vertiefungen in der N he der R nder der PCR Platten bzw Streifen Einzelne Ausf lle bei allelspezifischen oder Kontroll Amplifikaten Ce 0088 Gelfehler Reihenfolge auf das Gel geladen wurden und dass in jede Vertiefung dasselbe Volumen an PCR Reaktion gegeben wurde Die Pipetten gem den Anweisungen des Herstellers kalibrieren berpr fen dass die Vertiefungen im Gel korrekt geformt sind Beim Entfernen der K mme vorsichtig vorgehen da ansonsten unter Umst nden der Boden der Vertiefungen rei e
19. sch bersetzungen verf gbar Espanol Traducciones disponibles Italiano Traduzioni disponibili Ceske P eklady k dispozici Danske Tilg ngelige overs ttelser EAANVEG SraB oLuEG petTAPP OEL Magyar Ford t sok Norske Oversettelser tilgjengelig Polska Dost pne t umaczenia Portugu s Tradu es dispon veis Poccnio MepeBoab AOCTyYMHbI Slovensk mu Preklady k dispoz cii T rk eviriler mevcut Svenska vers ttningar tillg ngliga www biofortuna com
20. schlicherweise als spezifische Bande interpretiert Entnehmen Sie die richtige Bandengr e den spezifischen Interpretationstabellen berpr fen ob alle spezifischen Amplifikationen die richtige Gr e aufweisen oder ob ein Artefakt Verschleppung Primer Dimer f lschlicherweise als Amplifikation interpretiert wurde Reaktionen wurden in der falschen Reihenfolge geladen Anordnung der PCR und Gelspuren berpr fen Eine einzelne PCR ist fehlgeschlagen berpr fen ob alle internen positiven Kontrollen vorhanden sind Wenn keine Reaktionen fehlen erneut interpretieren Keine kleinen Amplifikate In der Probe wurde ein neues vorhanden Allel identifiziert Wird die Elektrophorese zu lange durchgef hrt wandern kleine Amplifikate aus dem Gel heraus oder an der Ethidiumbromid Front vorbei oder sie werden beim Eintritt in die vorherige Gelvertiefung zerstreut Die f r Ihr Gelsystem geeigneten Elektrophoresebedingungen verwenden Gelegentlich k nnen neue Allele entdeckt werden die auf ein Amplifikationsmuster schlie en lassen das keinen m bestehenden Allel en entspricht Bitte wenden Sie sich diesbez glich an Ihren zust ndigen Kundendienst ce DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 11 von 12 nderung Von Version 4 zu Revision 5 nderungsdatum 21 Januar 2014 e DN Abschnitt nderungsbeschreibung
21. ungen des Herstellers kalibrieren Sicherstellen dass in jede Vertiefung dasselbe Volumen Frische Ethidiumbromid L sung verwenden Unspezifische Amplifikation Problem mit der DNA Konzentration berpr fen dass die DNA Konzentration weder zu hoch noch zu niedrig ist Sollkonzentration 50 100 ng DNA pro Reaktion in 10 ul Reaktionen wurden in der falschen Reihenfolge geladen Ein berlaufen aus den benachbarten Vertiefungen bei der Elektrophorese vermeiden indem die Vertiefungen nicht berladen werden und sichergestellt wird dass das Anordnung der PCR und Gelspuren berpr fen l Gel erstarrt ist bevor die K mme entfernt werden CE 0088 CE DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 10 von 12 Problem Neues Allel wurde identifiziert Wahrscheinliche Ursache Zuvor nicht sequenzierte Allele k nnen mit einem neuen Amplifikationsmuster vorhanden sein Bei Verwendung von alten Interpretationsbl ttern ein aktuelleres Alignment Update von www biofortuna com herunterladen Wenn das neue Muster hierdurch nicht interpretiert werden kann sollten Sie mit einem anderen Biofortuna Kit eine erneute berpr fung durchf hren oder versuchen die Sequenz mittels sequenzbasierter Typisierung zu identifizieren l Amplifikationsmuster kann nicht interpretiert werden CE 0088 Ein Artefakt wurde f l
22. xtrahiert werden Bitte sicherstellen dass der ODz 0 2s0 der DNA Probe bei der Messung durch UV Spektralphotometrie zwischen 1 66 und 1 94 liegt Pr PCR Anweisungen i Eine n SSPGo Platte oder Streifen aus einem verschlossenen Beutel nehmen il Chargenbezeichnung des Assays notieren iii Achten Sie vor dem Entfernen der Folie bzw des Verschlusses darauf dass sich alle gefriergetrockneten Pellets PCR Reagenzien unten in der Platte bzw dem R hrchen befinden Klopfen Sie andernfalls vorsichtig gegen das Gef damit sich die Pellets absenken CE CE 0088 DOT111v08 Gebrauchsanweisung f r Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE Revision 5 Seite 4 von 12 Bitte beachten Sie dass die erste Reaktion jedes Test Abschnitts im Gegensatz zum restlichen Kit immer hellrosa bzw im hydrierten Zustand rot ist Einige PCR Platten enthalten eine violett gef rbte Negativkontrolle Kontrolle ohne Template in der letzten Vertiefung der Platte iv Mit einer sterilen Pipette 10 ul DNA L sung in jede Vertiefung der Platte bzw des Streifens pipettieren Siehe hierzu den Hinweis in Abschnitt 8 zu Anforderungen an DNA Proben Wenn die Platte eine violett gef rbte integrierte Negativkontrolle enth lt 10 ul Probenverd nnungsmittel ohne DNA hinzupipettieren Siehe Hinweis zur Negativkontrolle in Abschnitt 8 v Sicherstellen dass die Trockenreagenzien in jeder Vertiefung vor dem Thermocycler Schritt mit der DNA in Ber hrung kommen vi D
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