Home

Brauns Simone Diplomarbeit - Institut für Mikrobiologie und

1. HiTrapimHs002 1_Fractions 7 HilTrap imiHs002 1_Inject Abb 4 6 Chromatogramm einer Affinit tschromatographie von His hSGT Fusionsprotein ber eine Ni NTA Sepharose Saule Das His hSGT Fusionsprotein eluiert zwischen 250 und 280 mM Imidazol Fraktionen 41 52 E coli eigene Proteine mit mehreren Histidinen binden unspezifisch an die Saule werden aber erwartungsgem bereits durch geringe Mengen an Imidazol 20 mM eluiert Fraktionen 14 26 Blau UV Absorption bei 280 nm Braun relative Leitf higkeit Gr n Elutionsgradient 20 400 mM Imidazol Einige Fraktionen wurden zur Analyse auf ein 12 5 iges SDS Gel aufgetragen sie he Abb 4 7 63 4 Ergebnisse Die blaue Kurve zeigt die UV Absorption 280 nm n Korrelation zum Volumen der eluierten Probe Die gr ne Kurve zeigt den Elutionsgradienten in Prozent Imidazol an Das hSGT His Tag Fusionsprotein eluiert zwischen 250 und 280 mM Imidazol Die einzelnen Fraktionen aus der Elution von der Ni NTA Sepharose S ule wurden mit Hilfe einer SDS PAGE analysiert siehe Abbildung 4 7 Die beiden ersten Peaks zwi schen den Fraktionen 14 und 26 enthielten unspezifisch gebundene E coli Proteine Das hSGT His Tag Fusionsprotein eluierte zwischen 250 und 280 mM Imidazol Frak tionen 41 52 Unterhalb der Fusionsprotein Bande kann man zwei weitere Proteinban den be etwa 32 und 35 kDa erkennen Um die L slichkeit des Proteins zu analysieren wurden die bei der Herstellung de
2. 15 mM reduziertes Glutathion 49 3 Material und Methoden Die Regeneration der S ule erfolgte durch Waschen mit zwei S ulenvolumen H20 ein Volumen 6 M Guanidinium Hydrochlorid und einem S ulenvolumen H20 Anschlie end wurde die S ule n 20 Ethanol berf hrt 3 2 4 1 3 Anionenaustauschchromatographie ber ResourceQ bzw MonoQ zur Trennung geladener Proteine Die ResourceQ S ule 6 ml Fertigs ule von Amersham Pharmac a Biotech besitzt starke kationische Eigenschaften Ihre Gelmatrix ist mit einem quart ren Amin verkn pft das stark positiv geladen ist DieGelmatrix fur die Mono Q HR 16 10 S ule von Amersham ist ebenfalls mit quart ren Aminen verkn pft Die Mono Q S ule von Amersham besitzt aber insgesamt eine etwas st rkere Trennleistung als die Resource Q Die Bindung von Anionen ist stark und besonders selektiv Schwach geladene Molek le das hei t solche deren pI knapp ber dem Puffer pH zwischen 0 und 1 pH Einheiten dar ber liegt eluieren fr her st rker geladene das hei t jene deren pI den Puffer pH deutlich bersteigt eluieren sp ter Entscheidend f r eine erfolgreiche Aufreinigung ist daher die Wahl des pH Wertes im Elutionspuffer der etwa eine pH Einheit ber dem pl des aufzureinigenden Proteins liegen sollte Vor der Benutzung der Resource Q S ule bzw der MonoQ S ule wurde mit drei Saulenvolumina ddH2O gesp lt und mit drei Volumina Startpuffer aquilibriert Dann wurde die Probe
3. 22 3 1 2 1 DNA Gr enmarker Merck Darmstadt AppliChem Darmstadt Merck Darmstadt Merck Darmstadt Merck Darmstadt Roth Karlsruhe Fluka Buchs AppliChem Darmstadt AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Merck Darmstadt Fluka Buchs Merck Darmstadt Fluka Buchs Sigma Aldrich Steinheim Mettler Toledo Steinbach BioRad Munchen Roche Schweiz Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Oxoid Basingstoke Hampshire England Zur Bestimmung der Gr e von DNA Fragmenten mittels Agarosegel Elektrophorese wurde der Gene Ruler 1 kb Ladder MBI Fermentas eingesetzt siehe Abb 3 1 19 U Material und Methoden Ah Af e EEE ee 20 0 25 Ms 143 65 Em 10 2 8 16 SDS PAGE Abb 3 1 Fermen Abb 3 2 NEB Protein Abb 3 3 PageRuler tas GeneRuler 1kb Marker broad range prestained Protein Ladder DNA Ladder 3 1 2 2 Protein GroBenstandard Zur Bestimmung des Molekulargewichtes der rekombinanten Proteine mittels SDS Page wurde der Protein Gr enstandard Broad Range BR von der Firma New England Biolabs Frankfurt am Main siehe Abb 3 2 der sebst hergestellte SM Marker Self Made Marker und der PageRuler Prestained Protein Ladder MBI Fermentas verwendet siehe Abb 3 3 3 1 3 Enzyme und Inhibitoren Calf Intestinal Alkaline Phosphatase CIP New England Biolabs Frankfurt
4. 86 86 y Inhaltsverzeichnis gt Diskussion 87 5 1 Klonierung der hSGT Gensequenz in den Expressionsvektor 87 pGEX6P1 1 5 2 Expression und Aufreinigung des hSGT Proteins 88 32 1 Oligomerisierungsverhalten des SGT Proteins 92 22 Oligomerisierungsverhalten des SGT Proteins nach 93 Hochsalzbehandlung 5 3 Expression und Aufreinigung des GST hSGT Fusionsproteins mit 94 anschlie ender Spaltung in GST tag und hSGT Protein 5 4 Kristallisation des His hSGT Fusionsproteins 95 5 5 Kristallisation des hSGT Proteins 97 5 6 Strukturvorhersagen f r das hSGT Protein 98 6 Zusammenfassung 103 6 1 Ausblick 104 6 2 Summary 106 7 Literaturverzeichnis 107 8 Anhang i 8 1 Daten zum theoretischen pI Wert und zum Molekulargewicht des i hSGT Proteins 8 1 1 hSGT Protein acession NM 003021 i 8 1 2 hSGT His Tag Fusionsprotein ber pET16b aufgereinigt i 8 1 3 hSGT Protein uber pGEX6P1 1 aufgereinigt GST Tag mit i PreScission Protease entfernt 8 2 Codon Usage von E coli fur das hSGT Protein il 8 3 Codon Usage von E coli jedes Codon aus der hSGT Gensequenz lil 8 4 Auswertung f r die Kalibrierung der Superdex S200 10 30 S ule iv 8 5 Posttranslationale Modifikationsstellen innerhalb des vi humanen SGT Proteins 8 6 Abk rzungsverzeichnis Vil 1 1 Einleitung l Einleitung Die Krankheit Krebs ist eine der h ufigsten Todesursachen n den westlichen Zivilisationen jeder zweite Mann und jede dritte Frau erkranken im Laufe ihres Lebens an dieser
5. einmal pro Woche bis einschlie lich vier Wochen nach dem Pipettieren der Bedingung kontrolliert Sp ter wird der Tropfen einmal im Monat berpr ft Bilder der verschiedenen Tropfen werden mit einer Digitalkamera die auf ein Binokular aufgesetzt wird aufgenommen und am PC bearbeitet Kontrast Helligkeit Gamma 3 2 5 2 Macro Seeding und Micro Seeding zur Verbesserung von Kristall wachstum und Kristallordnung Haben sich erste kleine Kristalle entwickelt die aber wegen einer zwischenzeitlich zu geringen Proteinkonzentration im Tropfen nicht mehr Weiterwachsen so kann durch Macro Seeding das Kristallwachstum fortgesetzt werden Die Kristallisationskeime aus dem ersten Tropfen werden in einen neuen Proteintropfen berf hrt sie werden ges t Deren Inhalte sind analog zum ersten mit einer Ausnahme Entweder die Prazipitans oder die Proteinkonzentration m ssen in diesen Tropfen gegen ber dem ersten verringert sein da es sonst zu einer sofortigen Prazipitation des Proteins in den neuen Tropfen kommen kann Kristalle mit ungunstiger innerer Ordnung d h sie sind z B von unregelm iger Gestalt oder sie haben eine geringe Aufl sung im R ntgendiffraktometer k nnen durch Micro Seeding verbessert werden Bruchst cke dieser Kristalle k nnen in verd nnten L sungen z B 1 200 in einer frischen Proteinl sung Kristallisationskeime f r Kristalle h herer Ordnung sein Beim Micro Seeding werde
6. Fleckenstein B Herrmann C Jung G Moarefi I and Hartl U 2002 Ligand Discrimination by TPR domains J Biol Chem 277 22 19265 19275 Callahan M A Handley M A Lee Y H Talbot K J Harper J W and Panganiban A T 1998 Functional interaction of human immunodeficiency virus type 1 Vpu and Gag with a novel member of the tetratricopeptide repeat protein family J Virol 72 6 5189 5197 Carlson C J Booth F W and Gordon S E 1999 Skeletal muscle myostatin mRNA expression is fiber type specific and increases during hindlimb unloading Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 277 2 R601 R606 108 7 Literaturverzeichnis Chamberlain L H and Burgoyne R D 1997 The molecular chaperone function of the secretory vesicle cysteine string proteins J Biol Chem 272 50 31420 6 Christensen J Cotmore S F and Tattersall P 1997 A novel cellular site specific DNA binding protein cooperates with the viral NS1 polypeptide to initiate parvovirus DNA replication J Virol 71 2 1405 1416 Cohen S N Chang A C and Hsu L 1972 Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria genetic transformation of Escherichia coli by R factor DNA Pre Natl Acad Sci USA 69 2110 2114 Cotmore S F and Tattersall P 1986 Organization of nonstructural genes of the autonomous parvovirus minute virus of mice J Virol 58 3 724 32 Cotmore S F and Tattersall P 19
7. 4 13 SM 5 1218 20 22 24 26 28 30 lt His hSGT Fusionsprotein Abb 4 13 SDS PAGE der Affinit tschromatographie von His hSGT Fusionsprotein ber eine Ni NTA Sepharose S ule Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen siehe Abb 4 12 Das Fusionsprotein ist mit einem Pfeil markiert und l uft bei ca 37 kDa Zus tzlich erscheinen in den Elutionsfraktionen zwei weitere Proteine ca 32 und 35 kDa unterhalb der Fusionsproteinbande SM self made Marker 12 5 iges SDS Gel 69 4 Ergebnisse Die einzelnen Fraktionen aus der Elution von der Ni NTA Sepharose S ule wurden mit Hilfe einer SDS PAGE analysiert siehe Abbildung 4 13 Der erste Peak Fraktionen 11 und 12 enthielten unspezifisch gebundene E coli Proteine Das hSGT His Tag Fusionsprotein eluierte bei etwa 250 Imidazol Fraktionen 18 30 Unterhalb der Fusi onsprotein Bande kann man zwei weitere Proteinbanden bei etwa 32 und 35 kDa er kennen Die Elutionsfraktionen 18 30 wurden vereinigt und fur die anschlieBende Gelfiltration auf 20 mg ml ankonzentriert siehe Abschnitt 3 2 4 3 Die Ausbeute an hSGT His Tag Fusionsprotein betrug nach diesem Reinigungsschritt 1m Schnitt 65 mg pro Liter Expressionskultur 4 2 1 3 2 Ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins nach vorheriger Affinit tschromatographie Fur die pr parative ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins aus der Affinitatschromatographie wurde
8. 5463 5467 112 7 Literaturverzeichnis Schantl J A Roza M De Jong A P and Strous G J 2003 Small gultamine rich tetratricopeptide repeat containing protein SGT interacts with the ubiquitin dependent endocytosis UbE motif of the growth hormone receptor Biochem J 373 855 863 Scheufler C Brinker A Bourenkov G Pegorano S Moroder L Bartunik H Hartl F U and Moarefi I 2000 Structure of TPR Domain Peptide Complexes Critical Elements in the Assembly of the Hsp70 Hsp90 Multichaperone Machine Cell 101 199 210 Sikorski R S Boguski M S Goebl M and Hieter P 1990 A repeating amino acid motif in CDC23 defines a family of proteins and a new relationship among genes required for mitosis and RNA synthesis Cell 60 2 307 17 Sittler A Lurz R Lueder G Priller J Lehrach H Hayer Hartl M K Hartl F U and Wanker E E 2001 Geldanamycin activates a heat shock response and inhibits huntingtin aggregation in a cell culture model of Huntington s disease Hum Mol Genet 10 12 1307 15 Smith H O and Nathans D 1973 A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes J Mol Biol 81 419 423 Steiner H H Bonsanto M M Beckhove P Brysch M Geletneky K Ahmadi R Schuele Freyer R Kremer P Ranaie G Matejic D Bauer H Kiessling M Kunze S Schirrmacher V and Herold Mende C 20
9. Die Antibiotikaresistenzen auf dem eingebrachten Plasmid erm glichen das Wachstum der plasmidtragenden Bakterien auf einem antibiotikahaltigem Medium das gleichzeitig wachstumshemmend oder letal auf andere Bakterien die das Plasmid nicht enthalten wirkt So k nnen plasmidtragende Bakterien durch Antibiotika positiv selektiert und Kontaminationen mit fremden Bakterien vermieden werden Das einklonierte Fremdgen ist bei den hier verwendeten Plasmiden 41 3 Material und Methoden so lokalisiert dass die Expression unter der Kontrolle eines IPTG induzierbaren Lac Promotors z B T5 oder T7 oder eines AHTC induzierbaren TetA Promotors liegt und gleichzeitig das Gen im offenen Leserahmen zu liegen kommt Das eingebrachte Plasmid erlaubt unter diesen Bedingungen die selektive Expression des klonierten Fremdgens Einige der in dieser Arbeit verwendeten Bakterienst mme ben tigten zus tzlich zu den Selektionsantibiotika die f r die Expression ben tigt wurden z B Kanamycin f r den Erhalt des pREP4 Plasmides das f r einen Promotorrepressor codiert Dieser senkt die Basisexpression und verhindern so die Vermehrung von im Wachstum beg nstigten Deletionsmutanten Einige ben tigen z B Chloramphenicol f r den Erhalt der RIL Plasmide RIL Plasmide enthalten extra Kopien der Gene f r in E coli nicht so h ufig vorkommende tRNAs dies sind unter anderem die f r Arginin argU Isoleucin ileY und Leucin leuW 3 2 3 4 1 Untersuch
10. Einweisungen in die Mysterien der Proteinaufreinigung Frau Dr Anja Strasser f r ihre Einf hrungen in die kristallographischen Arbeitsmethoden und Herrn Dr Christos Gouloudis und Frau Johanna Arnorsdottir ftir die standige Beantwortung meiner Fragen und ihre unkomplizierte Hilfe Des weiteren bedanke ich mich bei meinen Freunden f r die Unterst tzung und das Verstandnis das sie mir entgegenbrachten und ihre Freundschaft die mir sehr wichtig ist Besonders bedanken m chte ich mich bei Frau Cathrin Hippel und Herrn Thomas Rolf die mir in unz hligen Gespr chen halfen meine Gedanken zu sortieren Meinen Eltern m chte ich f r ihre gro e Unterst tzung und ihr Vertrauen in mich ganz lieb danken I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis l Einleitung 1 1 1 Aufbau und Struktur des SGT Proteins 3 2 Aufbau und Struktur von TPR Dom nen 6 L 3 Funktion von TPR Dom nen 7 1 4 Funktionen des SGT Proteins 8 1 4 1 SGT fungiert als ein Cochaperon 8 1 4 2 SGT ist ein Bestandteil des synaptischen Chaperon Komplexes 11 1 4 3 Weitere m gliche Funktionen des SGT Proteins 12 1 4 3 1 Interaktion des SGT Proteins mit dem B amyloid Peptid 13 1 4 3 2 Das SGT Protein interagiert mit dem Wachstumshormon Rezeptor 13 1 4 3 3 Interaktion des SGT Proteins mit Myostatin 14 1 4 3 4 Das SGT Proteins wird fur Zellteilungsprozesse benotigt 15 2 Zielsetzung 16 3 Material und Methoden 17 3 1 Material 17 3 1 1 Feinchemikalien 17 AZ Gr enstandards 18
11. Fusionsprotein ber eine Superdex 200 26 60 Die Fraktionen 165 175 des Hauptpeaks enthalten das Fusionsprotein die zwei in Abb 4 7 da runterliegenden Proteinbanden sind auf diesem Gel nicht mehr zu erkennen Der kleinere Vor peak um Fraktion 130 ist auf dem 12 5 igen SDS Gel nicht als Proteinbande zu erkennen BR broad range Marker die Zahlen entsprechen den Fraktionen des Superdex 200 26 60 Gelfiltrationslaufes siehe Abb 4 10 67 4 Ergebnisse Die Elution nach ca 170 ml entspricht einem etwa 135 kDa gro em tetramerem His hSGT Fusionsprotein Eine genaue Aussage zu dem Oligomerisierungsgrad der eluier ten Proteine ist nur schwer zu treffen da es sich immer noch um eine Mischung ver schiedengro er Proteine handelt siehe Abschnitt 4 2 1 6 Das Eluat von der Superdex S200 26 60 Gelfiltrationss ule wurde durch SDS PAGE untersucht siehe Abbildung 4 11 Auf dem 12 5 gem Gel ist unterhalb der His hSGT Fusionsprotein Bande kei ne weitere Proteinbande zu erkennen Dies kann aber auch an der geringen Konzentrati on des hSGT Fusionsproteins n den Fraktionen nach der Gelfiltration liegen In der Abbildung 4 9 kann man die sehr viel st rkere Auspr gung der hSGT Fusionsproteinbande im Vergleich zu den beiden anderen darunter liegenden Proteinen erkennen In Fraktion 11 z B sind die zwei zus tzlichen Proteinbanden auf dem SDS Gel deutlich schw cher ausgepr gt Das restliche H s hSGT Fusionsprotein aus den gepoolt
12. am Main dNTP Set Fermentas St Leon Rot Lysozym Roche Mannheim Nadel Sall Xhol New England Biolabs Frankfurt am Main T7 RNA Polymerase New England Biolabs Frankfurt am Main 20 3 Material und Methoden T4 DNA Ligase Taq Polymerase Protease Inhibitor Cocktail Tablets Complete EDTA free 3 1 4 New England Biolabs Frankfurt am Main Uni Gottingen Eigenproduktion verwendete Organismen Roche Mannheim Als Klonierungsstamme wurden die St mme E coli DH 5a XL1 Blue und XL10 Gold f r die Expressionen wurden die E coli St mme BL21 DE3 BL21 DE3 RIL BL21 DE3 RP und BL21 DE3 Rosetta 2 verwendet E coli Stamm BL21 DE3 BL21 DE3 RIL BL21 DE3 RP BL21 DE3 Rosetta 2 DH 5a XL1 Blue XL10 Gold Genotyp E coli B F dem ompT hsdS tg mpg gal A DE3 E coli B F ompT hsdS rg m dcm Tetr gal A DE3 endA Hte argU ileYleuW Camr E coli B F ompT hsdS rg m dcm Tet gal A DE3 endA Hte argU proL Cam E coli B F ompT hsdSB rb mB gal dem lacY 1 DE3 pRARE6 CmR endAl hsdR17 rk mx supE44 thil recAl gyrA Nal relAl A lacZYA argF U169 80lacZAM 15 recAl endAl gyrA96 thi I hsdR17 supE44 relAl lac F proAB lacIqgZAM15 Tn10 Tetr Tet mcrA 183 mcrCB hsdSMR mrr 173 endAl supE44 thi 1 recAl gyrA96 relAl lac Hte F proAB lacli Z M15 Tn10 Tet Amy Cam Referenz Quelle Stratagene La Jolla USA Stratagene La Jolla USA
13. mme getestet Zum einen wurde mit der Stamm BL21 DE3 RIL eine Expression durchgef hrt Dieser erlaubt die Expression von Genen die tRNAs beinhalten f r seltene Arginin Codons wie AGA und AGG das Isoleucin Codon AUA und das Leucin Codon CUA Zum anderen wurde der E coli Stamm Rosetta DE3 getestet Dieser erlaubt die Expression von Genen die tRNAs beinhalten fur seltene Arginin Codons wie AGA AGG und CGA das Glycin Codon GGA das Isoleucin Codon AUA das Leucin Codon CUA und das seltene Prolin Codon CCC Es stellte sich heraus dass der Stamm E coli Rosetta DE3 nicht in der Lage war das GST hSGT Fusionsprotein in gr eren Mengen l slich zu exprimieren siehe Abbildung 4 20 Mit dem E coli St mm BL21 DE3 RIL hingegen lie en sich gr ere Mengen an l slich exprimiertem GST hSGT Fusionprotein herstellen 95 5 Diskussion Auch bei der Aufreinigung des GST hSGT Fusionsproteins konnte das Protein nach 1D Gelelektrophorese auf einem SDS Gel in drei Fraktionen aufgetrennt werden Vermutlich handelt es sich auch in diesem Fall wieder um mRNA Abbau siehe Abschnitt 5 2 Die Aufreinigung erfolgte zunachst uber Affinitatschromatographie mittels einer Glutathion Sepharoses ule w hrend dessen bereits das Fusionsprotein durch die Verwendung des Enzyms PreScission Protease in GST tag und hSGT Protein gespalten werden konnte Nach einem abschlie enden Ausschlusschromatographie Schritt ber eine Gelfiltrationss ule Superdex 2
14. s ze exclusion Pr parative Ausschlusschromatographie Hydrophobe Interaktionschromatographie HIC Umpufferung und Entsalzung von Proteinlosungen Ankonzentrieren von Proteinl sungen durch Zentrifugation Proteinverdau mit Proteasen Kristallisation von Proteinen Kristallisationsans tze Macro Seeding und Micro Seeding zur Verbesserung von Kristall wachstum und Kristallordnung Rontgenbeugungsexperimente Ergebnisse Umklonierung von hSGT aus pET16b in pET28a und pGEX6P1 1 Expression und Aufreinigung des hSGT Proteins Expression und Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins tber den pET16b Expressionsvektor Uberexpression von His hSGT Fusionsprotein in E coli Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein nach Inkubation der Expressionskultur bei 37 C nach Induktion Affinitatschromatographische Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein 43 43 45 45 45 47 48 49 50 50 51 51 52 52 53 53 55 55 57 57 60 61 61 62 62 IV Inhaltsverzeichnis 42 122 4 2 1 2 3 4 2 1 3 4 2 1 3 1 AD Wedd 4 2 1 4 4 2 1 5 4 2 1 6 4 2 2 4 2 2 1 4 2 2 2 4 2 2 3 4 2 2 4 4 3 4 3 1 4 3 1 1 4 3 1 2 4 3 2 Anionenaustauschchromatographie ber ResourceQ zur Auf reinigung des His hSGT Fusionsproteins nach vorangegangener Affinitatschromatographie Ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins nach vorheriger Affinitatschromatographie Aufrein
15. 5 v v B Mercaptoethanol Ansatz fur ein Sammelgel Volumen 2 ml ddH2O 0 87 ml 10 APS Losung 10 ul Ansatz fur ein Trenngel Volumen 6 ml Dichte des Trenngels 12 5 0 5 SDS L sung 1 2 ml 10 APS L sung 30 ul 30 ul 3 2 1 4 2 Agarosegelelektrophorese von Nukleins uren Zur Analyse und pr parat ven Reinigung von DNA wird die Agarose Gelelektrophorese verwendet Je nach Gr e der aufzutrennenden Fragmente wurden die Agarosegele mit 0 8 bis 1 0 Agaroseante l in 1x TBE Puffer hergestellt Agarose wurde abgewogen mit TBE Puffer versetzt und zum L sen in der Mikrowelle zum Kochen gebracht F r 30 3 Material und Methoden das Gel wurde eine Flachbettkammer abgedichtet und die hei e Agarosel sung hinein gegossen Luftblasen wurden entfernt und ein Probenkamm n das Gel gesteckt Das Gel wurde dann gek hlt bei 4 C bis es erstarrte und wurde darauffolgend in eine mit lx TBE gef llte Elektrophoresekammer gelegt Zum Laden der DNA Proben wurden diese mit Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 12 mA cm Gelfl che 1 x TBE Puffer 10 x Agarosegel Probenpuffer 89 mM Tris 0 5 w v Bromphenolblau 89 mM Borsaure 0 5 w v Xylencyanol FF 2mM EDTA pH 8 0 60 v v Glycerin 3 2 1 5 Detektion von Proteinen und Nukleins uren 3 2 1 5 1 Anfarben von Proteinen mit Coomassie Brilliant Blue Elektrophoretisch aufgetrennte Prote
16. AVYFCHRASAYSELGNYAGAVODCERAICIDPAY 139 192 SEAYGRMGLALSSLNEHVEAVATYERALELDPDN PS50293 TPR_REGION 7ER repeat region circular profile 91 192 LERLETEGMEQMEVEMFELAVHFYGELIELMFPAMAVYFCMEALLAYSELGONMNYACGAVODCER AIZIDFATSERLTGENGLALSSLNEHVEAVTAYTTEERLELDFON Abb 5 3 Identifikation der TPR Motive des humanen SGT Proteins Die Aminos uresequenz des hSGT Proteins wurde ber das Programm ScanProsite untersucht Es wurden 3 TPR Motive gefunden die sich zu einer TPR Dom ne vereinigen ScanProsite ermittelte in der hSGT Sequenz acht potentielle N Myristylierungsstellen sechs Phosphorylierungsstellen f r das Enzym Casein Kinase I zwei Phosphorylierunsstellen f r die Protein Kinase C eine Phosphorylierunssequenz f r die Tyronsin Kinase und eine N Glycosylierungsstelle siehe Anhang 8 5 Posttranslationale Modifikationen sind f r die biologische Aktivit t der meisten Proteine u erst wichtig Prokaryoten k nnen keine posttranlationalen Modifikationen durchf hren weil hnen daf r die notwendigen Enzyme fehlen daher k nnen viele 101 5 Diskussion eukaryotische Proteine auch nur in eukaryotischen Wirtszellen korrekt exprimiert werden Stryer 1994 In P Markierungs Experimenten und 2D Analysen konnte gezeigt werden dass das SGT Protein NS1 spezifisch an Serin und Threoninresten phosphoryliert wird Aps 2002 Die Phosphorylierung von Proteinen kann einen Einfluss auf deren Bindungsf higkeit an andere Pro
17. Abb 4 25 Elutionsprofil einer Gelfiltration von hSGT Protein ber eine Superdex 200 10 30 S ule In diesem Versuch wurde nur die Proteine des gro en Hauptpeaks in einer Fraktion aufgefan gen Proteine in diesem Peak eluieren nach ca 11 2 ml dies entspricht oligomerisiertem hSGT Protein Die Proteine im folgenden Peak Elution nach 12 8ml sind deutlich kleiner mit einer berechneten Gr e von etwa 70 kDa Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 280 nm Braun Leitf higkeit Nach der Analyse der Fraktion 1 in einem 12 5 igen SDS Gel kann man erkennen dass hier hSGT Protein eluiert siehe Abbildung 4 26 Die mit Hilfe der Kalibrierung in Anhang 8 4 berechnete Gr e der Proteine aus dem ersten Peak Elution nach 11 2 ml entspricht in etwa 150 kDa 212 97 66 56 lt GST hSGT Fusionsprotein 43 36 hSGT 27 20 Abb 4 26 SDS PAGE der Fraktion Nr 1 der Ausschlusschromatographie von hSGT Protein ber eine Superdex 200 10 30 S ule BR broad range Marker In Spur 1 ist die Fraktion Nr 1 von der Gelfiltrationss ule aufgetra gen siehe Abbildung 4 25 in Spur 2 ist zum Vergleich noch einmal ungeschnittenes GST hSGT Fusionsprotein aufgetragen In beiden Spuren finden sich neben dem hSGT Protein bzw GST hSGT Fusionsprotein zwei darunterliegende Banden 82 4 Ergebnisse SGT Proteine konnten demnach als Tetramere eluiert werden Es ist schwierig eine Aussage zum Oligomerisieru
18. Akta Purifier HPLCs benutzt Nach dem Laden der Proteinprobe auf die Saule uber einen 50 ml Superloop wird mit vier Saulenvolumina 20 mM Imidazol 1m Waschpuffer gewaschen um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen Anschlie end wird ber einen aufsteigenden Imidazolgradienten eluiert Das Eluat wird fraktioniert und die Fraktionen mittels SDS PAGE analys ert Die Proben die das Zielprotein enthalten werden gepoolt Der Pool wird fur weitere Aufreinigungsschritte bei 4 C gelagert Wasch Bindungspuffer Elutionspuffer 20 mM Tris HCl pH 7 5 20 mM Tris HCl pH 7 5 300 mM NaCl 300 mM NaCl 20 mM Imidazol 600 mM Imidazol 2 mM B Mercaptoethanol 2 mM B Mercaptoethanol 48 3 Material und Methoden 3 2 4 1 2 Affinit tschromatographische Trennung von Proteinen mit GST Sequenz ber Glutathion Sepharose im Batch Verfahren Die Glutathion S Transferase GST ist ein Enzym welches als Bestandteil eines Fusionsproteins die Reinigung von rekombinanten Proteinen erleichtert Proteine die mit GST Sequenz exprimiert wurden lassen sich selektiv ber eine Affinitatschromatographie mittels Glutathion Sepharose aufreinigen Hierbei wird die Affinitat von GST zu dem Tripeptid N Glu Cys Gly C kurz GSH benutzt um GST gekoppelte Proteine aus einem Prtoteinextrakt von E coli zu reinigen Der Ligand GSH ist dabei kovalent an eine Tragermatrix wie z B Agarose gebunden Das Zielprotein welches als GST Fusionsprotein exprimiert wurde kann
19. Anode und Kathode der Blotkammer mit Blotpuffer angefeuchtet und gem Abbildung 12 wurden SDS Gel PVDF Membran und Whatman Papier blasenfrei geschichtet Anschlie end wurden 120 min mit 25 V und 150 mA geblottet Nach dem Blot wurde die Membran mit Ponceau S angefarbt die Protein und Markerbanden wurden mit Bleistift markiert und die Membran mit dH2O gewaschen Das geblottete Gel wurde mit Coomassie gef rbt um den Proteintransfer zu dokumentieren TBS Puffer TBS Tween Triton Puffer TBSTT 20 mM Tris HCl pH 7 5 20 mM Tris HCl pH 7 5 150 mM NaCl 500 mM NaCl 0 05 Tween 20 0 2 Triton X 100 Die Membran wurde anschlie end 3 x 5 min mit TBS gewaschen und danach 1 h bei Raumtemperatur RT oder ber Nacht bei 4 C in 1 BSA in TBS geblockt Nach dem Blocken wurde die Membran 3 x 5 min mit TBSTT gewaschen Der Prim rantik rper anti 6His mouse verd nnt 1 1 000 wurde 2 h bei RT oder ber Nacht bei 4 C inkubiert Anschlie end wurde wieder 3 x 5 min mit TBSTT gewaschen Danach wurde der Sekundarantikorper Peroxidase markierter anti mouse verd nnt 1 50 000 1 5 h bei RT oder ber Nacht bei 4 C inkubiert Ein weiterer Waschschritt mit 3 x 5 min TBSTT folgte 33 3 Material und Methoden MSB F rbel sung 6 ml 4 Chlor 1 Naphtol 14 ml 100 mM Tris ph 7 5 20 ul DPD dimethyl p phenylendiamin hydrochlorid 8 ul 30 H202 Die Farbreaktion wurde durch die mit dem Sekund rantik rper gekoppelte Peroxidase k
20. DNA Gr enmarker 18 3 1 2 2 Protein Gr enstandard 19 3 13 Enzyme und Inhibitoren 19 3 1 4 verwendete Organ smen 20 3 1 5 Plasmide und Vektoren 21 3 1 6 Primer 21 sM K ufliche Reaktionssets Kits 21 3 1 8 Chromatographies ulen und S ulenmaterialien 21 3 1 9 Antibiotika 22 3 1 10 Kristallisationsscreens 23 3 1 11 sonstige Materialien 23 3 1 12 Ger te 24 3 2 Methoden 26 II Inhaltsverzeichnis 32 32 1 1 3 2 1 2 3 2 13 3 2 1 4 3 2 1 4 1 3 2 1 4 2 PAES 32 SZ 2 12 3 2 1 5 4 3 2 1353 22 32 2 1 322 1 32212 322 13 3222 3223 3 2 2341 322 32 32 3 3 32 3 2 3 3 3 2 3 4 3 2 3 4 1 3235 3 230 3 2 3092 3 2 3 6 Allgemeine Methoden Mengenbestimmung von Proteinen Konzentrationsbestimmung von Nukleins uren Ankonzentrieren von Proteinl sungen durch Zentrifugation Gelelektrophoresen Diskontinuierliche Polyacrylamid Gelelektrophorese von Proteinen SDS PAGE Agarosegelelektrophorese von Nukleinsauren Detektion von Proteinen und Nukleins uren Anf rben von Proteinen mit Coomassie Brilliant Blue Anfarben von Nukleinsauren mit Ethidiumbromid Proteindetektion durch Western Blot DNA Extraktion aus Agarosegelen Trocknen von Polyacrylamidgelen Molekularbiologische Methoden Klonierung der Gensequenz von hSGT in Expressionsvektoren DNA Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion PCR Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen Ligation eines verdauten DNA Fragments in einen Zielvektor durch DNA
21. Fragment im jeweiligen Reaktionsansatz vorhanden Durch einen Langenabgleich der Fragmente aus den vier Reaktionsansatzen kann so die Sequenz abgeleitet werden Mit dem Seq Mix BigDye Terminator vl l von Applied Biosystems kann die komplette Reaktion in einem einzigen Ansatz durchgef hrt werden F r eine typische Sequenzierungs PCR wurde folgender Ansatz pipettiert 200 ng DNA Template 8 pmol Primer l ul Seq Mix l ul Seq Puffer ad 10 ul ddH gt O Als PCR Programm f r Sequenzierungsreaktionen wurde folgendes Programm verwendet l Denaturierung 96 C 2min 2 Denaturierung 96 C 30s 3 Hybridisierung 50 C 20s 4 Elongation 60 C 4min Schritte 2 4 30x wiederholen 5 Elongation 60 C 4min 6 Pause 2 C Nach der PCR wurden die Produkte f r den Sequenzierungsautomaten aufgereinigt um st rende Faktoren w e Primer und Polymerase zu entfernen Dem PCR Ansatz wurden 1 ul 125 mM EDTA 1 ul 3 M NaAc und 50 ul Ethanol zugegeben Dann wurde vorsichtig durch leichtes Antippen mit der Fingerspitze durchmischt f r 5 min inkubiert und anschlie end zentrifugiert 20 000 x g 15 min 4 C Der berstand wurde abgenommen und das Pellet in 70 ul Ethanol 70 39 3 Material und Methoden gewaschen Es folgte eine weitere Zentrifugation 20 000 x g 5 min 4 C Das Pellet wurde 10 min an der Luft getrocknet und schlie lich in 30 ul HPLC Wasser aufgenommen Die gereinigten DNA Fragmente wurden in dieser Arbeit in einem K
22. Gene enth lt Im folgenden wurden die zwei St mme BL21 DE3 RIL und Rosetta DE3 im Hinblick auf die Expression des GST hSGT Fusionsproteins getestet 4 2 2 1 berexpression von GST hSGT Fusionsprotein in E coli und Affinitatschromatographische Aufreinigung Zur Etablierung einer geeigneten Expressions und Aufreinigungsstrategie wurde getes tet unter welchen Wachstumsbedingungen und n welchem Expressionsstamm GST hSGT Fusionsprotein in hoher Ausbeute hergestellt werden kann Hierzu wurde das hSGT pGEX6P1 1 Plasmid in die zwei zur Expression des Proteins geeigneten E coli Stamme BL21 DE3 RIL und Rosetta DE3 transformiert Die Expression wurde dann fur jeden einzelnen Bakterienstamm unter verschiedenen Bedingungen getestet Hierbei stellte sich heraus dass der Stamm E coli Rosetta DE3 nicht in der Lage war das GST hSGT Fusionsprotein in gr eren Mengen l slich zu exprimieren siehe Ab bildung 4 20 Man sieht deutlich die starke Proteinbande nach Auftragung einer Probe vom Zellpellet nach dem Zellaufschluss Im Uberstand dagegen ist nur eine schwache Proteinbande auf gleicher Hohe zu erkennen Der erste Reinigungsschritt bei der Aufreinigung des GST hSGT Fusionsproteins er folgte mit Hilfe der Glutathion Affinitatschromatographie siehe Abschnitt 3 2 4 1 2 Der Uberstand nach Zellaufschluss und Zentrifugation wurde auf die Glutathion Sepha roses ule aufgetragen Anschlie end wurde die S ule dreimal im batch
23. Hohfeld J 1998 The Carboxy Terminal Domain of Hsp70 provides Binding Sites for a Distinct Set of Chaperone Cofactors Molecular and Cellular Biology 18 4 2023 2028 Donovan E P and and Kushner S R 1986 Polynucleotide phosphorylase and ribonuclease II are required for cell viability and mRNA turnover in Escherichia coli K 12 Proc Natl Acad Sci USA 83 1 120 124 Dupressior T Vanacker J M Cornelis J J Duponchel N and Rommelaere J 1989 Inhibition by parvovirus H 1 of the formation of tumors in nude mice and colonies in vitro by transformed human mammary epithelial cells Cancer Res 49 12 3203 3208 Evans G J O Morgan A and Burgoyne R D 2003 Tying Everything Together The Multiple Roles of Cysteine String Protein CSP in Regulated Exocytosis Taffic 4 653 659 Feige U and Polla B S 1994 Hsp70 a multi gene multi structure multi function family with potential clinical applications Experientia 50 11 12 979 86 Fonte V Kapulkin V Taft A Fluet A Friedman D and Link C D 2002 Interaction of intracellular B amyloid peptide with chaperone proteins PNAS 99 14 9439 9444 Goebl M and Yanagida M 1991 The TPR snap helix a novel protein repeat motif from mitosis to transcription Trends Biochem Sci 16 5 173 7 Guetta E Graziani Y And Tal J 1986 Suppression of Ehrlich ascites tumors in mice by minute virus of mice J Natl Cancer Inst 76
24. Krankheit Bez glich des Verlusts der Lebensqualit t sowie der Mortalitatsrate stellt Krebs sogar eines der schwersten Leiden berhaupt dar Ein mit j hrlich 4000 bis 5000 allein in Deutschland diagnostizierten neuerkrankten Patienten recht h ufiger und zugleich sehr b sartiger Hirntumor ist das Glioblastom Der Name dieses Tumors leitet sich von den St tzzellen Gliazellen des Gehirns ab aus denen er entsteht Glioblastome sind hoch maligne und sehr schnell wachsende Gro hirntumore die extrem schwer zu therapieren sind Auch nach radikaler Operation Chemotherapie oder Bestrahlung tr tt meist innerhalb von Monaten ein Rezidiv auf Obwohl in den letzten Jahren eine Reihe neuer Methoden zur Behandlung dieser Krankheit erprobt wurden betr gt die berlebenszeit nach der Diagnose im statistischen Mittel nur etwa ein Jahr Derzeit w rd ein neuer Behandlungsansatz erprobt Durch die Injektion von speziellen Viren sog Parvoviren in den Hirntumor sollen die Krebszellen abget tet und das Wachstum gestoppt werden Parvoviren z hlen zu den kleinsten bis heute bekannten Viren Sie besitzen eine von einem h llenlosen Kaps d umgebene einzelstr ngige DNA von geringer Komplexit t Da sie nur f r wenige regularorische und strukturelle Proteine kodieren sind sie stark auf Faktoren der Wirtszelle angewiesen Wrzesinski 2002 und Aps 2002 Obwohl die ersten Parvoviren aus Tumorzellen von Versuchstieren isoliert wurden stellte sich bald herau
25. Ligasen Sequenzierung von DNA Fragmenten Plasmidpraparationen Plasmidpraparation m kleinen Ma stab Plasmidpr paration m mittleren Ma stab Zellbiologische Methoden Medien zur Aufzucht von E coli Kultivierung von E coli Stammen Bestimmung der Zelldichte einer Bakterienkultur Expression von rekombinanten Proteinen in E coli Untersuchung der Condon Usage Transformationen in Bakterienstamme Herstellung chemisch kompetenter E coli Zellen Transformation chemisch kompetenter E coli Zellen Uberexpression von rekombinanten Proteinen in E coli 26 26 26 27 27 27 29 30 30 31 31 33 33 34 34 34 36 37 38 39 39 39 39 39 40 40 40 41 41 41 42 43 III Inhaltsverzeichnis 3 2 3 0 32 302 32 3 1 3 2 4 3 2 4 1 3 2 4 1 1 3 2 4 1 2 3 2 4 1 3 3 2 4 1 4 3 2 4 1 4 1 3 2 4 1 5 3 2 4 2 3 2 4 3 3 2 4 4 3222 32 0 1 32 2 29 4 1 4 2 4 2 1 4 2 1 1 4 2 1 2 4 2 1 2 1 Anzucht einer Vorkultur Anzucht einer Expressionskultur Ernten und Aufschlie en von E coli Zellen Biochemische Methoden Chromatographische Trennmethoden Affinitatschromatographische Trennung von Proteinen mit His Sequenz ber N NTA Sepharose Affinitatschromatographische Trennung von Proteinen mit GST Sequenz uber Glutathion Sepharose im Batch Verfahren Anionenaustauschchromatographie ber ResourceQ bzw MonoQ zur Trennung geladener Proteine Ausschlu chromatographie Gelchromatographie Gelfiltration
26. SGT in monomeric form as GST hSGT fusion protein These results support the assumption that the N terminus of SGT mediates the ability for oligomerization 107 7 Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis Angeletti P C Walker D and Panganiban A T 2002 Small glutamine rich protein viral protein U binding protein s a novel cochaperone that affects heat shock protein 70 activity Cell Stress amp Chaperones 7 3 258 268 Apsi X 2002 Funktion des SGT NS1 Komplexes 1m Lebenszyklus autonomer Parvoviren Dissertation an der Ruprecht Karls Universit t Heidelberg Babitzke P Granger L Olszewski J and Kushner S R 1993 Analysis of mRNA decay and rRNA processing in Escherichia coli multiple mutants carrying a deletion in RNase Ill J Bacteriol 175 1 229 239 Belasco J G and Higgins C F 1988 Mechanisms of mRNA decay in bacteria a perspective Gene 72 1 2 15 23 Birnboim H C and Doly J 1979 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucl Acid Res 7 1513 1523 Blatch G L and Lassle M 1999 The tetratricopeptide repeat a structural motif mediating protein protein interactions Bioessays 21 11 932 939 Bradford M M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal Biochem 72 248 254 Brinker A Scheufler C von der M lbe F
27. Seed 266 269 SqnD 307 310 Snap PS00005 PKC PHOSPHO SITE Protein kinase C phosphorylation site bf 69 TgE 194 196 TyE PS00007 TYR PHOSPHO SITE Tyros ne kinase phosphorylation site 174 181 Khy EavaY PS00001 ASN GLYCOSYLATION A giscosyletion site 192 195 METY Vil 8 Anhang 8 6 OL A Abb Amp APS AS ATP bidest bp p BSA bzw ca pe cm d h DMSO DNA DNase DNTPs DTT EDTA et al EtOH E coli Fa Abk rzungsverzeichnis alpha Ampere Abbildung Ampicillin Ammoniumperoxodisulfat Aminos ure n Adenosintriphosphat Bidestilliert Basenpaare beta Rinderserumalbumin beziehungsweise centi als Prafix zirka Grad Celsius Zentimeter desoxy Dalton das hei t Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsaure Desoxiribonuklease Desoxynukleotidtri phosphat Dithiothreitol Ethylendiamintetracetat et altera lat und andere Ethanol Escherichia coli Firma gamma Erdanziehungskraft GST HEPES IPTG Kan kb kDa l Gramm Glutathion S Transferase Stunde N 2 Hydroxyethyl pipera zin 2 ethansulfons ure Isopropyl beta D thiogalactopyranosid kilo als Pr fix Kanamycin Kilobasenpaare Kilodalton Liter LB Medium Luria Broth Medium M m u min mRNA nm NMR OD PAGE PBS PCR PEG pH molar milli als Pr fix mikro als Pr fix Minute n messenger RNA nano als Pr fix Nanometer Nuclear magnetic resonan
28. Stratagene La Jolla USA Novagene Madison USA Invitrogen Karlsruhe Stratagene La Jolla USA Stratagene La Jolla USA 21 3 Material und Methoden 3 1 5 Plasmide und Vektoren pET 16b pET 28a Novagene Madison USA Novagene Madison USA zwischen der BamHI und der EcoRI Schnittstelle befindet pGEX 6P1 1 modifiziert sich eine zus tzliche Ndel Schnittstelle 3 1 6 Primer Novagene Madison USA Novagene Madison USA MWG Biotech Ebersberg T7 Promotor Primer T7 Terminator Primer pGEXforward 5 GCT GGC AAG CCA CGT TTG GT 3 pGEXreverse 5 CGT CTC CGG GAG CTG CAT GT 3 MWG Biotech Ebersberg 3 1 7 K ufliche Reaktionssets Kits NucleoSpin Extract Macherey Nagel D ren Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen Hilden Qiagen PCR Purification Kit Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen Hilden Qiagen Hilden Qiagen Hilden Sequence Mix Big Dye Terminator v1 1 Applied Biosystems Darmstadt sequencing kit 3 1 8 Chromatographiesaulen und Saulenmaterialien Column PD 10 Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Einweg Leers ulen BioRad M nchen 22 3 Material und Methoden Glutathione Sepharose 4 Fast Flow HiTrapChelating Ni NTA Sepharose 1 ml HiTrapChelating Ni NTA Sepharose 5 ml HisTrapChelating Ni NTA Sepharose 5 ml Resource Q 6 ml Phenyl Sepharose High Performance HiLoad 16 10 Superdex 200 HR 10 30 Superdex 200 HiLoad
29. bei 37 C unter Sch tteln inkubiert 50 ul 100 ul und 200ul des Transformationsansatzes wurden je auf einer Selektionsplatte ausgestrichen kurz an der Luft getrocknet und die Platten umgedreht ber Nacht bei 37 C inkubiert Bei Transformationen von Ligationsans tzen wurde die 43 3 Material und Methoden angewachsene ml Kultur scharf abzentrifugiert das LB Medium wurde vollst ndig abgenommen und durch 100 ml frisches LB Medium ersetzt Die Zellen wurden dann durch Pipettieren resuspendiert und der gesamte Ansatz wurde ausplattiert Auf diese Weise konnte man schon einen gro en Teil der DNA Vektor und Insert abtrennen die nicht aufgenommen wurde 3 2 3 6 Uberexpression von rekombinanten Proteinen in E coli 3 2 3 6 1 Anzucht einer Vorkultur F r eine Bakterienkultur die zur berexpression von rekombinanten Proteinen herangezogen werden soll wird zun chst eine Vorkultur angezogen In einem Kolben wurden 10 50 ml LB Medium mit den Selektionsantibiotika versetzt und mit einem Abstrich einer bewachsenen Agarplatte angeimpft Bei 37 C wurde die Kultur sch ttelnd f r 14 bis 16 Stunden inkubiert 3 2 3 6 2 Anzucht einer Expressionskultur Im Allgemeinen wurde LB Medium m gew nschten Endvolumen z B 1 Liter mit den entsprechenden Ant biotika versetzt und mit der vorbereiteten E coli Vorkultur 1 30 bis 1 100 angeimpft Im Inkubator wurden die Zellen bei 37 C dem Temperaturoptimum von E coli oder bei geringeren
30. ber einen Superloop geladen die Saulenmatrix mit mindestens drei Volumina Puffer gewaschen und anschlie end mit einem linear steigenden Salzgradienten eluiert Es wurden meist 3 ml Fraktionen gesammelt die sp ter via SDS PAGE analys ert wurden Die Fraktionen mit dem Zielprotein wurden vereinigt und f r weitere Aufreinigungsschritte bei 4 C aufbewahrt Wasch Bindepuffer Elutionspuffer 20 mM Tris HCl pH 7 0 50 mM Tris HCl pH 7 0 500 mM NaCl 2 mM DTT 2 mM DTT 1 mM EDTA 1 mM EDTA Die S ulen wurden nach Benutzung mit 1 M NaOH gesp lt und wieder in 20 Ethanol berf hrt 50 3 Material und Methoden 3 2 4 1 4 Ausschlu chromatographie Gelchromatographie Gelfiltration size exclusion Die Ausschlusschromatographie trennt gel ste Molek le nach ihrer Gr sse auf Die hierbei verwendeten Chromatographiesaulen bestehen aus einem por sen Gelmaterial mit definierter Porengr e Das Trennverhalten bas ert auf dem unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina der Probenmolekule Je nach Molek lgr e Molek lgestalt und gew hlten S uleneigenschaften dringen die Molek le unterschiedlich tief n die Gelmatrix ein Kleineren und globul ren Molek len steht mehr Raum zur Diffusion zur Verf gung als gr eren und ungeordneteren Daher erfahren kleinere Molek le durch das tiefere Eindringen in die Gelmatrix eine Verz gerung und eluieren sp ter von der S ule als gr ere Der Elutionspuffer selbst hat ebenfalls einen Einfl
31. hSGT Fragment als auch die Vektoren mit den selben Restrikti onsenzymen verdaut wurden konnten sie mit Hilfe einer T4 Ligase miteinander ver kn pft werden Die Ligationsansatze wurden in E coli XL1 Blue transformiert und der Transformationsansatz anschlieBend im Falle von pET28a auf einer LB Agarplatte mit Kanamycin und in Falle von pGEX6P1 1 auf einer Platte mit Ampicillin ausplattiert Die Umklonierung wurde sowohl durch einen Restriktionsverdau mit den Restriktions enzymen NdeI und Xhol als auch durch eine darauffolgende Sequenzierung verifiziert Zum Ende dieser Arbeit waren die Transformanden mit dem pET28a hSGT Konstrukt noch nicht vollst ndig sequenziert 4 2 Expression und Aufreinigung des hSGT Proteins Um das Ziel dieser Arbeit zu erreichen d h die Kristallisation des hSGT Proteins wur den zwei verschiedene Expressions und Aufreinigungsstrategien verfolgt Zum einen die Aufreinigung eines His hSGT Fusionsproteins zum anderen die Herstellung von nicht getagtem hSGT Protein Schlie lich war es unerl sslich jeweils eine zuverl ssige Expressions und Aufreinigungsstrategie zu entwickeln um die f r eine Kristallisation n tigen Proteinmengen herstellen zu k nnen Um das hSGT Protein ohne Affinitatssequenz ionenchromatographisch aufzureinigen wurde pGEX6P1 1 als Expressionsvektor verwendet Dieser Vektor besitzt zwischen der inserierten hSGT Gensequenz und dem GST Tag eine PreScission Protease Schnittstelle ber diese kan
32. hSGT Fusionsprotein betrug nach der Affini tatschromatographie und der Expression in BL21 DE3 RIL Zellen 26 mg Protein pro Liter Expressionskultur 4 2 2 2 Ausschlusschromatographische Aufreinigung des hSGT Proteins Fur die pr parative ausschlusschromatographische Aufreinigung des GST hSGT Fusionsproteins aus der Affinitatschromatographie wurde wie unter Abschnitt 3 2 4 1 3 beschrieben verfahren Fur diesen Reinigungsschritt wurde eine Superdex 200 Saule HiResolution 10 30 verwendet Von dem GST hSGT Fusionsprotein wurde nach der Ankonzentrierung auf 10 mg ml siehe Abschnitt 4 2 1 2 60 ul auf die Gelfiltrati onss ule aufgetragen siehe Abbildung 4 22 Die blaue Kurve entspricht der UV Ab sorption bei 280 nm und die rote der UV Absorption bei 260 nm Die braune Kurve stellt die Leitf higkeit dar Die H he der UV Absorption bei 260 nm betr gt 1m Maxi mum des h chsten Peaks etwa 50 mAU Im Vergleich hierzu ist die UV Absorption bei 280 nm im selben Peak mit 100 mAU 1m Maximum etwa doppelt so hoch Dieses Ver haltnis ist typisch fur Proteine a 1 5 En 13 0 Abb 4 22 Elutionsprofil einer Gelfiltration von GST hSGT Fusionsprotein ber eine Su perdex 200 10 30 S ule In diesem Versuch wurden 1 ml Fraktionen gesammelt Die Fraktionen 12 14 enthalten das GST hSGT Fusionsprotein siehe Abb 4 21 Die Proteine in den beiden Hauptpeaks unter scheiden sich hinsichtlich hres Oligomerisierungsgrades 1 Peak Dimer 2 Pea
33. nicht aus der Proteinl sung abtrennen und mussten somit f r die Kristallisationsversuche des hSGT Proteins mitverwendet werden Der wichtigste Punkt f r zuk nftige Kristallisationsversuche scheint somit die Ausarbeitung einer effektiveren Expressions und Aufreinigungstrategie zu sein mit dem Ziel der Herstellung von reinem m glichst als Monomer vorliegendem Volllangen hSGT Protein Weitere Ursachen f r die Schwierigkeiten bei der Kristallisation des SGT Proteins k nnten n seiner Sekund rstruktur begr ndet sein Aus diesem Grund wurde die Aminos uresequenz des humanen SGT Proteins mit dem Programm PSlIpredict auf seine Sekund rstruktur hin untersucht siehe Abschnitt 5 6 5 6 Strukturvorhersagen f r das hSGT Protein Obgleich Information zur drei dimensionalen Struktur des hSGT Proteins bisher fehlen kann eine Aussage zur Sekund rstruktur mit Hilfe bioinformatischer Methoden eine erste Ann herung zu Struktur und Funktion des Proteins geben Bei genauerer Betrachtung der Sekund rstrukturvorhersage siehe Abbildung 5 2 zeigt sich deutlich das verst rkte Vorkommen von a helicalen Strukturen Das Programm PSIpredict sagt insgesamt sechtzehn o Helices f r das hSGT Protein voraus Mit Hilfe von NMR Untersuchungen der TPR Dom ne des hSGT Proteins fanden Pai et al 2003 sich dass diese Dom ne aus s eben a Helices besteht die lokal siert sind von Glu92 Lys103 Helix 1 Phel07 Glull9 Helix 2 Alal25 Lys137 Helix 3 Tyrl41
34. somit an die Matrix binden w hrend die restlichen E coli Proteine ohne zu binden durch die Matrix laufen Durch einen berschu an GSH kann das GST Protein wieder von der Matrix eluiert werden Die Glutathion S Transferase stammt aus Erythrozyten und sch tzt gemeinsam mit Glutathion die Zelle Proteine und Hamoglobin vor Oxidation Glutathion wird oxidiert wobei ein Glutathiondimer mit einer Schwefelbr cke entsteht Glutathion S Transferase reduziert die entstandenen Glutathiondimere zu Glutathion w hrend es selbst an Glutathion bindet 6 ml Glutathion Sepharose 4B Amersham Bioscience Freiburg welche vom Hersteller als 20 ige Ethanoll sung geliefert wurde wurde auf eine Leers ule Poly Prep Chromatography Columns Biorad M nchen gegeben und mit drei Saulenvolumen H2O gewaschen Fur die Aufreinigung des GST hSGT Fusionsproteins wurden 25 ml des loslichen Proteinextraktes einer 1 Expressionskultur auf eine mit GSH Puffer 1 aquilibrierten S ule gegeben und anschlie end so lange mit Puffer 1 gewaschen bis mittels Biorad Test keine Proteine mehr nachweisbar waren Entweder wurde das GST Fusionsprotein sogleich durch Zugabe von GSH Puffer 2 von der S ule eluiert oder das GST hSGT Fusionsproteine wurde zuvor noch auf dem Saulenmaterial mit PreScission Protease in hSGT und GST Tag gespalten siehe Abschnitt 3 2 4 4 GSH Puffer 1 GSH Puffer 2 20 mM Tris HCl pH 7 5 20 mM Tris HCl pH 7 5 120 mM NaCl 120 mM NaCl 2 mM DTT 2 mM DTT
35. ule vorgereinigtem Fusi onsprotein mittels des Enzyms Faktor Xa den H s Tag abzuspalten Dazu wurde das Fusionsprotein zuallererst nach der Elution von der Ni NTA Sepharosesaule ber eine Column PD 10 umgepuffert siehe Abschnitt 3 2 4 4 Nach Angaben des Herstellers Novagene Darmstadt spaltet 1 U Faktor Xa 95 ei nes Kontrollproteins 50 ug innerhalb von 16 h bei Raumtemperatur F r die Versuche zur Spaltung des Fusionsproteins wurden zwei verschiedene Mengen an Enzym 1 bzw 2 U Faktor Xa auf 100 ug hSGT Protein unterschiedliche Inkubationstemperaturen 4 10 20 30 und 37 C und verschieden lange Inkubationszeiten 2 4 6 8 11 h getes tet Mit Hilfe des Programms Peptide Cutter auf der ExPASy Homepage wurde die Aminos uresequenz des hSGT Proteins auf m gliche Faktor Xa Schnittstellen unter sucht Das benutzte Programm fand keine Schnittstellen W hrend des Versuchs stellte sich heraus dass Faktor Xa das His hSGT Fusionsprotein nicht nur an der Faktor Xa Schnittstelle zwischen His Tag und Zielpro tein spaltete sondern auch in k rzester Zeit im Vorversuch bereits nach nur 2 Stunden innerhalb des hSGT Proteins schnitt siehe Abbildung 4 18 lt His hSGT Fusionsprotein Abb 4 18 Versuch zur Abspaltung des His Tag vom His hSGT Fusionsprotein mittels Faktor Xa Protease In der ersten Spalte des 12 5 igen SDS Gels wurde SM Marker aufgetragen In die Spuren 2 4 wurde ber 8 Stunden mit Faktor Xa geschnittenes
36. und die dreidimensionale Struktur des Proteins bekannt Bisher sind auch erst wenige biologische Funktionen des SGT Proteins entschlusselt Einige dieser neu entdeckten Funktionen des SGT Proteins werden in den nachsten Kapiteln kurz erlautert werden 13 1 Einleitung 1 4 3 1 Interaktion des SGT Proteins mit dem B amyloid Peptid Amyloid beschreibt eine Gruppe von Proteinaggregaten die unter einem Mikroskop betrachtet spezifische Merkmale teilen Der Name Amyloid ist etwas irref hrend Er stammt aus der Identifikation der Proteingruppe mit Hilfe einer Iod F rbung daher der Name lateinisch St rke Erst sp ter erkannte man die Gruppe der Amyloide als Proteine Amyloide spielen eine gewichtige Rolle bei einigen genetischen Erkrankungen wie z B der Chorea Huntington Krankheit siehe Abschnitt 1 4 1 Wenngleich auch noch nicht verstanden ist ob die Amyloidaggregate nun der Ausl ser der Krankheit sind oder ob sie nur ein weiteres Symptom im Krankheitsverlauf darstellen Fonte et al fanden 2002 heraus da eine Inhibierung des SGT Proteins in einer Verringerung der Toxizitat durch das B amyloid Peptid resultiert Dies weist darauf hin da Chaperone ein Rolle bei der Regulation des P amyloid Peptid Metabolismus und dessen Toxizitat spielen k nnten 1 4 3 2 Das SGT Protein interagiert mit dem Wachstumshormon Rezeptor Die Endozytose ist ein fur die Zelle wichtiger Mechanismus mit dem sie durch Einstulpung und Abschnurung der P
37. wie unter Abschnitt 3 2 4 1 3 beschrieben verfahren F r diesen Reinigungsschritt wurde eine Superdex 200 S ule HiLoad 26 60 verwendet Von dem His hSGT Fusionsprotein wurde nach der An konzentrierung auf 20 mg ml siehe Abschnitt 4 2 1 2 1 5 ml auf die Gelfiltrationssaule aufgetragen siehe Abbildung 4 14 ER J r ol i Pmj DE pi S By OIF Pi RN ET ELi Oo 1530 Abb 4 14 Elutionsprofil einer Gelfiltration von His hSGT Fusionsprotein ber eine Su perdex 200 26 60 S ule In diesem Versuch wurden 5 ml Fraktionen gesammelt Die Fraktionen 31 51 enthalten das His hSGT Fusionsprotein siehe Abb 4 15 Die Proteine n den beiden Hauptpeaks unterscheiden sich hinsichtlich ihres Oligomerisierungsgrades 1 Peak Oligomer 2 Peak Dimer Blau UV Absorption bei 280 nm Rot Leitfahigkeit 70 4 Ergebnisse Die blaue Kurve entspricht der UV Absorption bei 280 nm und die rote Kurve der Leit f higkeit Das Elutionsprofil des Gelfiltrationslaufes zeigt 2 Hauptpeaks Nach der Analyse der Fraktionen in einem 12 5 igen SDS Gel kann man erkennen dass in bei den Peaks das His hSGT Fusionsprotein eluiert siehe Abbildung 4 15 Die berechnete Gr e der Proteine aus dem ersten Peak entspricht oligomerisiertem Fusionsprotein mit einer berechneten Gr e von ca 135 kDa Dies w rde bei einer Gr e des Fusionspro teins von etwa 36 kDa einem Tetramer entsprechen Die berechnete Gr e der Proteine aus dem zweiten Peak entsprech
38. 00 10 30 S ule konnte das tetramere hSGT Protein ohne tag f r Kristallisationsversuche verwendet werden siehe Abschnitt 5 5 N heres zum Oligomerisierungsverhalten des GST hSGT Fusionsproteins kann im Abschnitt 5 2 1 nachgelesen werden 5 4 Kristallisation des His hSGT Fusionsproteins Ein Ziel dieser Diplomarbeit neben der Aufreinigung des SGT Proteins war die r ntgendiffraktometrische Strukturaufkl rung der drei dimensionalen Struktur des small glulatime rich tetratricopeptide repeat containing SGT Proteins Die Kenntnis der r umlichen Beschaffenheiteines Proteins besonders die der aktiven Zentren und Bindungsstellen ist unverzichtbar f r das urs chliche Verstehen der Funktionen des zu untersuchenden Proteins Ein weiteres Verfahren Informationen zur Funktion eines Proteins zu erhalten ist das sogenannte protein modelling Hierbei setzt man Sequenz und Struktur bereits aufgekl rter Proteine in Beziehung zueinander ein sogenannter Homologievergleich F r die Vorhersage bei nahe verwandten Proteinen z B aus derselben Proteinfamilie funktioniert das recht gut Bisher gibt es keine ver ffentlichten Modelle f r die Struktur von SGT Proteinen Die Schwierigkeit in der Erstellung eines solchen Modells liegt 1m C Terminus des Proteins begr ndet siehe Glutamin reiche C Region Abbildung 5 1 Abb 5 1 Schematischer Aufbau des SGT Proteins Es ist eine ausgepr gte Dreiteilung des Proteins zu erkennen mit den
39. 04 Antitumor vaccination of patients with glioblastoma multiforme a pilot study to assess feasibility safety and clinical benefit J Clin Oncol 22 21 4272 4281 Sterky F Holmberg A Pettersson B and Uhlen M 1996 The sequence of a 30 kb fragment on the left arm of chromosome XV from Saccharomyces cerevisiae reveals 15 open reading frames five of which correspond to previously identified genes Yeast 12 10B Suppl 1091 5 Stryer L 1994 Biochemie Spektrum akademischer Verlag GmbH 3 Auflage Stuart R A Cyr D M and Neupert W 1994 Hsp70 in mitochondrial biogenesis from chaperoning nascent polypeptide chains to facilitation of protein degradation Experientia 50 11 12 1002 11 113 7 Literaturverzeichnis Van der Spuy J Kana B D Dir H W and Blatch G L 2000 Heat shock cognate protein 70 chaperone binding site in the co chaperone murine stress inducible protein 1 maps to within three consecutive tetratricopeptide repeat motifs Biochem J 345 645 651 Tobaben S Varoqueaux F Brose N Stahl B and Meyers G 2003 A Brain specific Isoform of Small Glutamine rich Tetratricopeptide Reapeat containing Protein Binds to Hsp70 and the Cysteine String Protein J Biol Chem 278 40 38376 38383 Tobaban S Thakur P Fernandez Chacon R S dhof T C Rettig J and Stahl B 2001 A Trimeric Protein Complex Functions as a Synaptic Chaperone Machine Neuron 31 987 99
40. 16 60 Superdex 200 HiLoad 26 60 Superdex 75 HR 10 30 Superdex 75 HiLoad 26 60 3 1 9 Antibiotika Ampicillin Kanamycin Chloramphenicol Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Roche Mannheim Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Die Antibiotika Stamml sungen wurden nach Sambrock et al 1989 angesetzt sterilfiltriert und bei 20 C aufbewahrt Aus diesen sterilen Stamml sungen wurden die Antibiotika den Nahrmedien nach dem Autoklavieren und Abk hlen zugegeben e Ampicillin wurde in Hz gt Oges gel st 100 mg ml Es wurde in einer Endkonzentration von 100 ug ml eingesetzt e Kanamycin wurde in H Osest Endkonzentration betrug 50 ug ml 50 mg ml Die eingesetzte e Chloramphenicol wurde in Ethanol gel st 35 mg ml Die Endkonzentration betrug 35 ug ml 23 3 Material und Methoden 3 1 10 Kristallisationsscreens Ammoniumsulphat Screen Additive Screens 1 3 Crystal Screens 1 2 Crystal Screen Lite Crystal Screen Cryo Crystal Screen PEG Ion Crystal Screen Natrix Detergent Screens 1 3 Footprint Screens 1 3 JB Screens 1 10 Magic Screen Structure Screens 1 3 Strategy Screens 1 3 3 1 11 sonstige Materi
41. 29212912539932332393333532323932323 Pred ge A Pred HAHRARARAARAAC CARARARRARRARRARARRARRARA CCCAARRRARRARRAR AA AYGEMGLA LSSLTKAVEAVAYYKKALELDFPDNETYKSITLK 170 180 190 200 Conf J99999992252999093590999359932099990033 Pred Ce Pred ARAHRARARACCARAARAARARAARARACCAARRAARA RAR AA IAE LELREAPSPTGGVGSFDIAGLLITINP GFMSMASITLMITIT 210 220 230 240 Conf 399999999909350990993909I930999999999999095t Fred Pred HARHBAAAHHHAAC CCCCCCCCCC CHAHA HAHAH ABBR AA POIOOLMSGCMISCEMIPLGETPGETSPSONDLASLIOAGOOF 250 260 2fO 280 Conf 1 322223939337232932252 52333292333232 Pred u S Pred HHHHCCCCHHHHHHHHHHHACCCCCceccccce AA AQQMOOOIPELIEOQLRSQIRSRTPSASNDDQOE 290 300 310 Abb 1 3 Sekund rstrukturvorhersage f r das humane SGT Protein Durch die Sekund rstrukturvoraussage durch das Programm PSIpredict zeigt sich deutlich das massive Auftreten von a Helices gr ne Zylinder innerhalb der SGT Sequenz Insgesamt sagt PSIpredict sechtzehn o Helices f r das SGT Protein voraus Die sieben a Helices der TPR Dom ne wurden mit roten Zahlen markiert und die H he der blau gef rbten Balken ber den einzelnen Aminos uren gibt die Konfidenz Vertrauen der Vorhersage wider C Coil H Helix 6 1 Einleitung Bei genauerer Betrachtung der Sekund rstrukturvorhersage siehe Abbildung 1 3 zeigt sich deutlich das verst rkte Vorkommen von a helicalen Strukturen 1 2 Aufbau und Struktur von TPR Dom nen TPR tetratri
42. 4 Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraacetat Essigsaure Ethanol Ethylendiamintetraessigsaure EDTA Glyzin Glycerin Guanidiniumhydrochlorid Harnstoff Imidazol IPTG Isopropyl beta D thiogalactopyranos d dioxanfrei Kaliumacetat Kaliumchlorid Kal umformiat Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth Karlsruhe AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Roth Karlsruhe Merck Darmstadt S gma Aldrich Steinheim Roth Karlsruhe S gma Aldrich Steinheim AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe AppliChem Darmstadt Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roth Karlsruhe Fluka Buchs 3 Material und Methoden di Kaliumhydrogenphosphat Lithtumchlorid Magnesiumchlorid Manganchlorid B Mercaptoethanol Methanol Milchpulver Skim milk powder 2 Morpholinoethansulfons ure MES Natriumacetat Natriumchlorid Natriumdihydrogenphosphat Natr umformiat Nickelsulphat Hexahydrat Polyethylenglykol 200 300 400 600 1000 3000 6000 10000 Polyethylenglykol 1500 2000 4000 5000 8000 20000 Polyethylenglykol 3350 pH Pufferl sungen pH 4 01 7 0 9 21 Protein Assay Bradford Reagens Rinderserumalbumin BSA Salzs ure 37 SDS Natr umdodecylsulphat Ultrapure TEMED N N N N Tetramethylenethylendiamin Tris hydroxymethyl aminomethan Tris Trypton Pepton Yeast Extract GroBenstandards
43. 5 530 535 540 45 gt gt 100 50 p i Tt i 605 610 615 620 625 630 635 640 645 650 100 En i TEE aT i 655 660 665 670 675 680 685 690 695 700 705 710 715 720 725 730 735 740 745 750 V 8 Anhang 8 4 Auswertung f r die Kalibrierung der Superdex S200 10 30 S ule Auswertung f r die Kalibrierung der Superdex S200 10 30 Gelfiltrationss ule der Firma Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Calibration S200 10 30 3 5 3 670KD Thyroglobulin 2 5 E 158KD gamma Globulin 2 44KD Ovalbumin O 1 5 e 17KD Myoglobin 4 3 13KD B 0 5 0 8 10 12 14 16 18 20 Va mL Linear Regression Simple weighting Correlation Coefficient r 0 9998 Variable Value Std Err SS E EE A a Intercept 4 7290 0 0398 Slope 0 2273 0 0029 Conditions 50mM Tris HCI pH 7 5 150mM NaCl 5mM MgCl 0 7mL min flow 1 5MPa pressure 4 N 4 729 0 2273 Vel M 10 vi 8 Anhang 8 5 Posttranslationale Modifikationsstellen innerhalb des humanen SGT Proteins Die Aminosauresequenz des hSGT Proteins wurde mit Hilfe des Programms ScanProsite auf potentielle Modifikationstellen hin untersucht PS00008 MYRISTYL A ryrstoyleation site ff 2f GGlsSD 139 144 GNYFaGA 166 171 GLalss 214 219 GGvgSF 249 254 GMiSGG 259 264 GTpgTs 262 267 GTapso fff 282 Goqt io PS00006 CK2 PHOSPHO SITE Gasen Kinase I phosphoniaton site 46 49 TveD af 60 T1pE bf 0 TokE G4 a
44. 6 1177 1180 Hartl F U and Hayer Hartl M 2002 Molecular chaperones in the cytosol from nascent chain to folded protein Science 295 5561 1852 8 110 7 Literaturverzeichnis Helmbrecht K Zeise E and Rensing L 2000 Chaperones in cell cycle regulation and mitogenic s gnal transduction a review Cell Prolif 33 6 341 65 Herrero Y Calle M Cornelis J J Herold Mende C Rommelaere J Schlehofer J R Geletneky K 2004 Parvovirus H 1 infection of human glioma cells leads to complete viral replication and efficient cell killing Int J Cancer 109 1 76 84 Hirano T Kinoshita N Morikawa K and Yanagida M 1990 Snap helix with knob and hole essential repeats in S pombe nuclear protein nuc2 Cell 60 2 319 28 Hohfeld J Minami Y and Hartl F U 1995 Hip a novel cochaperone involved in the eukaryotic Hsc70 Hsp40 reaction cycle Cell 83 4 589 98 Hohfeld J Cyr D M and Patterson C 2001 From the cradle to the grave molecular chaperones that may choose between folding and degradation EMBO Rep 2 10 885 90 Honore B Leffers H Madsen P Rasmussen H H Vandekerckhove J and Celis J E 1992 Molecular cloning and expression of a transformation sensitive human protein containing the TPR motif and sharing identity to the stress inducible yeast protein STIl J Biol Chem 267 12 8485 91 Jasiecki J and Wegrzyn G 2003 Growth rate dependent RNA polyadenylatio
45. 8 4 Ergebnisse Schnittstelle PET16b hSGT wurde in XL1 Blue vermehrt anschlie end ber Midi Pr paration aus den Zellen extrahiert und mit Ndel und Xhol geschnitten Die Spaltpro dukte wurden anschlie end in einem 1 igen Agarosegel aufgetrennt die gesuchte Bande aus dem Gel geschnitten siehe Abbildung 4 1 sowie mittels des Qiagen Gel Extraction Kits aufgereinigt Ndel Xhol un 1 kb Ndel Xhol verdaut Ladder gm T ni m E k b w e Abb 4 1 Restriktionsverdau des Vektors pET16b mit inserierter hSGT Gensequenz mit den beiden Restriktionsenzymen NdeI und Xhol In den ersten drei Spuren des 1 igen Aga rosegels wurde mit nur einem Enzym geschnittenes bzw ungeschnittenes pET16b hSGT auf getragen In die letzten drei Spuren wurde mit NdeI und Xhol geschnittenes pET16b hSGT aufgetragen Das hSGT Insert ca 2 2 kbp wurde aus dem Gel ausgeschnitten Seine ehemalige Position ist an den Schatten der Ndel Xhol Spuren zu erkennen und durch Sterne gekennzeichnet Alternativ wurde zur Vermehrung des f r hSGT kodierenden Genabschnittes eine PCR von pET16b hSGT mit T7 Primern durchgef hrt siehe Abbildung 4 2 Nach Behand lung des PCR Ansatzes mit dem Qiagen PCR Purification Kit wurde die amplifizierte DNA mit dem Restriktionsenzymen NdeI und Xhol geschnitten und die entstandenen Spaltprodukte in einem igen Agarosegel aufgetrennt Die gesuchte Bande wurde aus dem Gel herausge
46. 8 5 Apsi 2002 Die Phosphorylierung von Proteinen kann auch einen Einfluss auf deren Bindungsfahigkeit an andere Proteine aus ben Miyata er al 1997 Nach Infektion von Wirtszellen mit autonomen Parvoviren akkumuliert SGT mit NS1 in nukle ren Strukturen die als Orte der viralen Replikation identifiziert wurden und deshalb als APAR bodies Autonomous Parvovirus associated Replication Bodies bezeichnet werden Cziepluch er al 2000 und Bash r er al 2001 W hrend n den meisten Publikationen das Protein als SGT bezeichnet wird wird in anderen Publikationen die Bezeichnung Ubp verwendet als Abk rzung fur vpu binding protein da es die M glichkeit besitzt mit Vpu einem humanen immun defizienten Virus kodiertem Protein zu interagieren Callahan et al 1998 Angeletti et al 2002 3 1 Einleitung 1 1 Aufbau und Struktur des SGT Proteins SGT ist ein ubiquitar exprimiertes und evloution r konserviertes Protein Nachdem zuerst von Ciepluch er al 1998 eine f r SGT kodierende cDNA aus einer Fibroblasten cDNA Bank der Ratte rSGT isoliert wurde konnte bereits kurz darauf die f r das humane SGT hSGT kodierende cDNA aus einer humanen Plazenta cDNA Bank isoliert werden Humane SGT Transkripte wurden in den verschiedensten menschlichen Geweben gefunden wie z B in Herz Gehirn Plazenta Leber Niere Magen und m Skelettmuskel Das humane SGT Protein ist auf dem Chromosom 19p13 lokalisiert und besteht aus 313 Amino
47. 87 The autonomously replicating parvoviruses of vertebrates Adv Virus Res 33 91 174 Cotmore S F and Tattersall P 1998 High mobility group 1 2 proteins are essential for initiating rolling circle type DNA replication at a parvovirus hairpin origin J Virol 72 11 8477 8484 Cyr D M Langer T and Douglas M G 1994 DnaJ like proteins molecular chaperones and specific regulators of Hsp70 Trends Biochem Sci 19 4 176 81 Cziepluch C Kordes E Poirey R Grewenig A Rommelaere J and Jauniaux J 1998 Identification of a Novel Cellular TPR Containing Protein SGT That Interacts with the Nonstructural Protein NS1 of Parvovirus H 1 J Virol 72 5 4149 4156 Cziepluch C Lampel S Grewenig A Grund C Lichter P and Rommelaere J 2000 H 1 Parvovirus Associated Replication Bodies a Distinct Virus Induced Nuclear Structure J Virol 74 10 4807 4815 D Andrea L D and Regan L 2003 TPR proteins the versatile helix Trends Biochem Science 28 12 655 662 D Arcy A Elmore C Stihle M and Johnston J E 1996 A novel approach to crystallizing proteins under oil Journal of Crystal Growth 168 175 180 109 7 Literaturverzeichnis Das A K Cohen P W and Barford D 1998 The structure of the tetratricopeptide repeats of protein phosphatase 5 implications for TPR mediated protein protein interactions EMBO J 17 5 1192 1199 Demand J Luders J and
48. 9 Toolan H W 1960 Production of a mongolian idiot like abnormality in hamsters Fed Proc 19 208 Toolan H W 1967 Lack of oncogenic effedt of the H viruses for hamsters Nature 214 92 1036 Towbin H Staehelin T and Gordon J 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci USA 76 4350 4354 Tsai J and Douglas M G 1996 A conserved HPD sequence of the J domain 1s necessary for YDJ1 stimulation of Hsp70 ATPase activity at a site distinct from substrate binding J Biol Chem 271 16 9347 54 Wang H Zhang Q and Zhu D 2003 hSGT interacts eith the N terminal region of myostatin Biochem And Biophysical Research Communications 311 877 883 Wilson G M Jindal H K Yeung D E Chen W and Astell C R 1991 Expression of minute virus of mice major nonstructural protein in insect cells purification and identification of ATPase and helicase activities Virology 185 1 90 98 Wilson R Ainscough R Anderson K Baynes C Berks M Bonfield J Burton J Connell M Copsey T Cooper J et al 1994 2 2 Mb of contiguous nucleotide sequence from chromosome III of C elegans Nature 368 6466 32 8 114 7 Literaturverzeichnis Winnefeld M Rommeleare J and Cziepluch C 2003 The human small glutamine rich TPR containing protein s required for progress thro
49. C unter stetigem Sch t teln inkubiert bis die Zellen eine ODgoo von ca 0 6 Adsorptionseinheiten erreichten Anschlie end wurden sie mit 0 5 mM IPTG induziert In Vorversuchen zeigte sich dass durch das Herabsenken der Wachstumstemperatur nach der Induktion von 37 C auf 20 C die Ausbeute an rekombinantem Protein deutlich erh ht werden konnte Aller dings mussten die Zellen durch das temperaturbedingte verlangsamte Wachstum nach der Induktion f r ca 12 Stunden wachsen Nach erreichen einer OD von 1 8 2 Ad sorptionseinheiten wurden die Zellen geerntet Zur berpr fung der Expression wurden kurz vor der Induktion und zum Zeitpunkt der Zellernte nach Induktion je zwei Proben der Expressionskultur entnommen und die ODsoo bestimmt Anschlie end wurden gleiche Mengen an Zellen in Laemmli aufge nommen und 5 Min aufgekocht Das Zelllysat wurde in einem 12 5 igen SDS Polyacrylamidgel analysiert siehe Abbildung 4 5 SM Abb 4 5 Expressionsniveaus von His Marker vr hSGT Fusionsprotein in BL21 DE3 nach Kultivierung in einem 10 Liter Bioreaktor In Spur 1 des SDS Gels wurde der SM Marker Self Made Marker aufgetragen in Spur 2 und 3 die Proben vor Induktion v 1 und n die Spuren 3 und 4 die Proben zur Zeit der Zellernte nJ Das His hSGT Fusionsprotein l uft bei einer Gr e von 37 kDa siehe Abschnitt 4 2 Die molekulare Masse der einzelnen Markerproteine st in kDa angegeben Der Pfeil kennzeichnet das hSGT Prote
50. CCCCCcCc CHAHR HAAHAHAHAHHAA AA POIOQLMSGMISGGMTPLGTPGTSPSOITDLASLIQAGOOF 250 260 270 280 Conf JJ932223333333333333323333333332322 Pred Pred HHHHCCCCHHHHHHHHHHANCCCCCccecccce AA AQQMOOOIPELIEOQLRSQIRSRTPSASNDDOQOE 290 300 310 Abb 5 2 Sekund rstrukturvorhersage f r das humane SGT Protein Durch die Sekund rstrukturvoraussage durch das Programm PSIpredict zeigt sich deutlich das massive Auftreten von a Helices gr ne Zylinder innerhalb der SGT Sequenz Insgesamt sagt PSIpredict sechtzehn o Helices f r das SGT Protein voraus Die sieben a Helices der TPR Dom ne wurden mit roten Zahlen markiert und die H he der blau gef rbten Balken ber den einzelnen Aminos uren gibt die Konfidenz der Vorhersage wider C Coil H Helix 100 5 Diskussion Viele fre ber das Internet verf gbare Programme k nnen die Aminos uresequenz des zu untersuchenden Proteins mit denen bekannter Proteine vergleichen deren Terti rstruktur aufgekl rt wurde und somit ber verschiedene Parameter die hnlichkeit mit bekannten Proteindom nen ermitteln Alle verwendeten Programme identifizierten die drei TPR Motive als bekannte Strukturen siehe Abbildung 5 3 Das Programm ScanProsite auf der Internetseite www expasy org kann zus tzlich posttranslationale Modifikations Stellen n der Sequenz von Proteinen identifizieren hSGT 313 AS PS50005 TPR 7ER repeat profie 91 124 AERLETEGNEQMEVENF ELAVHF YGKLIELNP AN 125 158
51. DADVDASOGASAGGLPDLGSLLGGGLGGLMNNPOLMOAAOKMMSNPGAMONTOKMMODPSIROMAEGF 330 340 350 360 hSGT OAGOOFAOOMOOONPELIEOLRSO IRSRTPSASNDDOOR Sequence residues rSGT OAGOOFAOOMOO EFVEQIRSQVVRSRTPSASHEEQQE Sequence rSGT residues CSGT AAGOOMAARMOETNPELIENLRROFGPGADGGAPPPNPPO sequence coGcl residues YOROO7CcASGGGTPNLSDLMNNPALRNMAGNLFGGAGAOSTDETPDNENKO Sequence YOROO7c residues Abb 1 1 Sequenz Alignment verschiedener SGT Proteine vom Menschen hSGT Ratten rSGT Ciepluch et al 1998 Caenorbabditis elegans cSGT Wilson 1994 und Saccharomyces cerevisiae YORO07c Sterky et al 1996 Wenn die SGT Sequenz aller vier verschiedenen Spezies identisch ist wurden die entsprechenden Bereiche innerhalb der Sequenz mit rot farblich markiert Bereiche mit gro er hnlichkeit wurden gr n hervorgehoben und Bereiche innerhalb der Sequenzen mit geringer hnlichkeit wurden blau markiert Die Positionen der drei TPR Motive siehe Abschnitt 1 2 wurde unterhalb der Aminos ure Sequenzen eingezeichnet Die vier Positionen der Asparagin Prolin Motive wurden berhalb der Aminos ure Sequenzen mit gelben Pfeilen gekennzeichnet Tobaban er al 2003 4 1 Einleitung Eukaryotische Organ smen von Hefen ber Nematoden und Fliegen bis hin zu den S ugetieren enthalten Gene die f r das small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing SGT Protein codieren In einem Sequenz Alignment unterschiedlicher SGT Proteine si
52. Die hohe Salzkonzentration f hrte zu einem Wasserentzug durch die Erh hung der Ionenstarke und damit zu einer Stabilisierung der hydrophoben Wechselwirkungen Es folgte eine Aggregation der SGT Proteine Proteine mit vielen hydrophoben Oberfl chen aggregieren bei geringeren Salzkonzentrationen als Proteine mit wenigen hydrophoben Oberfl chen Diesen Effekt kann man s ch z B auch beim Aussalzen von Proteinen zu Nutze machen SGT Proteine scheinen ausgepr gte hydrophobe Oberfl chenbereiche zu exponieren Die Beziehung zwischen tetrameren SGT Protein Komplexen und der Salzkonzentration in einem Standard Gelfiltrationspuffer 0 1 M NaCl sollte in weiteren Versuchen n her betrachtet werden Eine Erniedrigung dieser Salzkonzentration k nnte vielleicht die Ausbildung oligomerer Komplexe verringern Erste Untersuchungen des dimerisierten hSGT Proteins mit Hilfe von UV spektrometrischen Untersuchungen zeigten keinerlei H nweise auf eine unspezifische Aggregation der beiden Proteine in dem Zweierkomplex weder bei dem His hSGT Fusionsprotein noch bei dem hSGT Protein ohne tag Das oligomerisierte His hSGT Fusionsprotein nach Hochsalzbehandlung hingegen zeigte in den Untersuchungen deutliche Anzeichen einer unspezifischen Aggregation der Proteine Daten nicht gezeigt Die Ergebnisse aus den Untersuchungen zu den tetrameren SGT Komplexen waren nicht eindeutig Dies k nnte f r eine teilweise unspezifische Aggregation 94 5 Diskussion
53. Gegenionen als Bindungspartner f r die aufzutrennenden Molek le an Die Auftrennung erfolgt ber kompetitive Verdr ngung der Probemolekule durch st rkere Ionen im Elutionspuffer Bei Kationentauschern werden Kationen wie Na oder NH verwendet bei Anionentauschern Cl oder SO Schwach geladene Molek le eluieren fr her als stark geladene Auf diese Weise k nnen Proteine nativ nach ihrem isoelektrischen Punkt pl getrennt werden Die Ausschlusschromatographie Gelfiltration trennt gel ste Molek le nach ihrer Gr e auf Die hierbei verwendeten Chromatographies ulen bestehen aus einem por sen Gelmaterial mit definierter Porengr e Das Trennverhalten bas ert auf den unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina der Probenmolektle Je nach Molek lgr e Molek lgestalt und gew hlten S uleneigenschaften dringen die Molek le unterschiedlich tief in die Gelmatrix ein Kleineren und globul ren Molek len steht mehr Raum zur Diffusion zur Verf gung als gr eren und ungeordneteren Daher erfahren kleinere Molek le durch das tiefere Eindringen in die Gelmatrix eine Verz gerung und eluieren sp ter von der S ule als gr ere Der Elutionspuffer hat ebenfalls einen Einfluss auf die Trennung der Molek le Entscheidend ist hierbei das L slichkeitsverhalten unterschiedlicher Molek le be der Salzkonzentration des Puffers Die Ausschlusschromatographie ist daher eine beliebte Methode um Proteine nach den ersten Aufreinigungss
54. His Tag Fusionsprotein uber pET16b aufgereinigt 1 11 al 31 41 51 1 MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMDNKKRLAY AIIQFLHDQL RHGGLSSDAQ ESLEVAIQCL 60 61 ETAFGVIVED SDLALPOTLP EIFEAAATGK EMPQDLRSPA RTPPSEEDSA EAERLKTEGN 120 121 EQMKVENFEA AVHFYGKAIE LNPANAVYFC NRAAAYSKLG NYAGAVQDCE RAICIDPAYS 180 181 KAYGRMGLAL SSLNKHVEAV AYYKKALELD PDNETYKSNL KIAELKLREA PSPTGGVGSF 240 241 DIAGLLNNPG FMSMASNLMN NPQIQQLMSG MISGGNNPLG TPGTSPSOND LASLIQAGQQ 300 301 FAQQMQQONP ELIEQLRSQI RSRTPSASND DOOE Theoretical pI 5 56 Mw average mass 36583 74 Mw monoisotopic mass 36560 80 8 1 3 hSGT Protein ber pGEX6P1 1 aufgereinigt GST Tag mit PreScission Protease entfernt 1 11 21 31 41 Sl 1 GPLGSPNSRM DNKKRLAYAI IOFLHDOLRH GGLSSDAOES LEVAIOCLET AFGVTVEDSD 60 61 LALPOTLPEI FEAAATGKEM PODLRSPART PPSEEDSAEA ERLKTEGNEO MKVENFEAAV 120 121 HFYGKAIELN PANAVYFCNR AAAYSKLGNY AGAVODCERA ICIDPAYSKA YGRMGLALSS 180 181 LNKHVEAVAY YKKALELDPD NETYKSNLKI AELKLREAPS PTGGVGSFDI AGLLNNPGFM 240 241 SMASNLMNNP QIQQLMSGMI SGGNNPLGTP GTSPSONDLA SLIQAGQQFA QQMQQQNPEL 300 301 IEBOLRSOIRS RIPSASNDDO OF Theoretical pI 4 87 Mw average mass 34929 03 Mw monoisotopic mass 34907 13 ii 8 Anhang 8 2 Codon Usage von E coli f r das hSGT Protein Die folgenden Diagramme wurden mit der Software GCUA graphical codon usage analyser erstellt Dieses Programm wurde von Herrn Thomas Sch dl entwickelt und ist unter folgender Internetadresse zu finden http gcua scho
55. In diesem Versuch konnte gezeigt werden dass alle drei auf dem SDS Gel sichtbaren Proteinbanden nach Affinitatschromatographie von His hSGT Fusionsprotein siehe Abbildung 4 13 His markierte Proteine enthalten 4 2 2 Expression und Aufreinigung des hSGT Proteins ber den pGEX6P1 1 Expressionsvektor mit anschlie ender Abspaltung des GST Tag mittels PreScission Protease Der Vorteil des pGEX 6P1 1 Vektors liegt dar n dass das hSGT Protein als N terminales GST Fusionsprotein exprimiert werden kann Das GST hSGT 75 4 Ergebnisse Fusionsprotein kann anschlie end durch das Enzym PreScission Protease in GST und hSGT gespalten werden Bei dieser Spaltung beh lt das hSGT Protein nur wenige Ami nos uren am N terminus brig Um einen Hinweis zu bekommen welcher E coli Stamm fur die Expression des GST hSGT Fusionsproteins geeignet st wurde eine Analyse der Codon Usage vorgenom men Die graphischen Auswertungen dieser Untersuchungen k nnen m Anhang s ehe Anhang 8 2 und 8 3 nachgeschlagen werden Wie 1m Anhang 8 2 sehr deutlich zu sehen ist k nnen Probleme auftreten bei der unter schiedlichen Codon Usage von Homo sapiens und E coli Bei dem Protein hSGT s ehe Anhang 8 3 treten diese Probleme geh uft bei der Aminos ure Arginin und hier haupt s chlich bei den Codons AGA und AGG auf Aus diesem Grund wurde nach einem Expressionsstamm gesucht der f r die meisten in E coli ungew hnlichen tRNAs extra Kopien jener
56. Kristallisation von Proteinen 3 2 5 1 Kristallisationsansatze Bei der Kristallisation eines Proteins wird mit Hilfe von Salzen Puffern und Pr zipitantien eine Proteinl sung in den bers ttigten Zustand berf hrt In diesem metastabilen Zustand gibt es zwei M gl chkeiten wie ein Protein sich verhalten kann 54 3 Material und Methoden I Es f llt aus die Konzentration an gel stem Protein sinkt dadurch drastisch ab Dieser Vorgang ist stark exergonisch da so der h chste Grad an Entropie erreicht werden kann II Das Protein bildet Kristallisationskeime aus aus denen richtige Proteinkristalle wachsen k nnen Dieser Proze geschieht in der Regel deutlich langsamer als die Prazipitation und ist auch nicht so energetisch g nstig da nicht die maximale Entropie erreicht wird In der Kristallographie wird nach Bedingungen gesucht die den zweiten Fall erm glichen Dazu werden zu Beginn sog Initial Screens durchgef hrt um erste Kristallisationsbedingungen f r ein Protein zu finden Bei den Initial Screens handelt es sich um eine Sammlung von Eingangsbedingungen die relat v h ufig zur Kristallisation verschiedener Proteine gef hrt haben Das aufgereinigte Protein wird dabei zu Anfang meist n einer Konzentration von 10 mg ml getestet Sobald Bedingungen ausgemacht sind die f r eine Kristallisation g nstig sind wird in einem Raster um die Bedingungen herum optimiert Dabei k nnen die Konzentrationen der enthalt
57. L umgangen werden siehe Abschnitt 5 2 103 6 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Eine haufig auftretende und trotz intensiver Forschung noch immer nahezu unheilbare Tumorerkrankung ist das Glioblastom Derzeit wird ein neuer Behandlungsansatz erforscht bei dem Tumorzellen durch Injektion von Parvoviren abget tet werden sollen Die F higkeit der Parvoviren Wachstum und Etablierung experimentell induzierter Tumoren zu hemmen h ngt vermutlich mit dem Nicht Strukturprotein 1 NS1 zusammen dem wohl wichtigsten regulator schen Faktor n Parvoviren Zellul re Proteine die mit NS1 interagieren stellen somit auch potentielle Zielmolek le f r die Behandlung des Glioblastoms mit Hilfe autonomer Parvoviren dar Ein solches Protein ist das SGT welches im Mittelpunkt dieser Arbeit stand Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer geeigneten Expressions und Aufreinigungsstrategie f r das humane SGT Protein Anschlie end sollten Kristallisationsversuche durchgef hrt werden um mittels R ntgenbeugungsexperimenten Daten f r die Strukturaufkl rung zu erhalten Hierzu wurden verschiedene Expressions und Aufreinigungsstrategien etabliert mit dem Ziel gr ere Mengen an m glichst reinem hSGT Protein in E coli zu exprimieren SGT konnte hochrein als Mischung von Volll ngenprotein und zwei vom C Terminus verk rzten SGT Fragmenten aufgereinigt werden Zum einen wurde hSGT durch Proteasespaltung des aufgereinigten GST hSGT Fusionspro
58. Nach Auswertung aller durchgef hrten initial screens lie sich auch keine Aussage zum Kristallisations oder Pr zipitationsverhalten des Proteins unter variierenden Bedingungen treffen Es konnte z B keine Abh ngigkeit der Pr zipitationswahrscheinlichkeit vom pH Wert dem Einsatz von Alkoholen oder bestimmten Salzen in der Kristallisationsl sung gefunden werden Sowohl beim Versuch der Kristallisation des Fusionsproteins als auch des hSGT Proteins ohne tag trat in vielen Kristallisationsbedingungen das Ph nomen der Phasenseparation auf Bei diesem Ph nomen kann das Protein innerhalb der l Tr pfchen sehr stark konzentriert aber noch fl ssig sein und oft erscheinen nach 98 5 Diskussion einiger Zeit Kristalle in diesen Bedingungen In der vorliegenden Arbeit f hrte allerdings auch die Phasenseparation zu keiner Kristallbildung des SGT Proteins Dennoch k nnten diese Bedingungen Ansatzpunkte f r weitere Versuche liefern indem das fl ssige konzentrierte Protein aus den l Tr pfchen f r Seeding Versuche dem sogenannten Streak Seeding verwendet wird Das Problem bei allen Kr stallisationsversuchen sowohl mit dem His hSGT Fusionsprotein als auch mit dem hSGT Protein ohne tag ist die Hetero Oligomerisierung des selben Nach wie vor lie en sich die zwei weiteren verk rzten SGT Proteine die in SDS Gelen unterhalb der eigentlichen hSGT Protein Bande zu sehen sind siehe Abbildungen 4 15 und 4 26
59. Nukleotiden Smith et al 1973 Man findet diese Enzyme in Prokaryoten dort dienen sie dem Abbau von Fremd DNA In der eigenen DNA sind die entsprechenden Erkennungssequenzen modifiziert methyliert und werden daher nicht geschnitten Restriktionsendonukleasen haben fur das Klonieren von DNA gro e Bedeutung gewonnen Ihre bemerkenswerteste Eigenschaft besteht darin Sequenzen mit 37 3 Material und Methoden zweifacher Rotationssymmetrie so genannte Palindrome zu erkennen und so zu spalten dass berh ngende DNA Enden sticky ends entstehen Diese berh ngenden DNA Enden hybridisieren leicht mit komplement ren Enden und erm glichen so das gerichtete Einklonieren in mit den gleichen Enzymen ebenfalls zu sticky ends geschnittene Vektoren Ein typischer Ansatz von 20 ul enthielt lug DNA 2 ul Restriktionsenzympuffer 10x 0 5 ul entspricht 1 U Restriktionsendonuklease f r 3 Schnittstelle 0 5 ul entspricht 1 U Restriktionsendonuklease f r 5 Schnittstelle 2 ul BSA 10x von einigen Enzymen ben tigt ad 20 ul ddH20 Der Ansatz wurde f r 1 12 h abh ngig von den verwendeten Restriktionsenzymen bei 37 C nkubiert Anschlie end wurden die geschnittenen Fragmente in einem Agarosegel analys ert und gegebenenfalls f r anschlie ende Klonierungen aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert 3 2 2 1 3 Ligation eines verdauten DNA Fragments in einen Zielvektor durch DNA Ligasen Ligasen katalysieren d
60. O Microfluidizer 110 S Microtip 102 C Schutt Gottingen Merck Darmstadt Beckman Coulter Krefeld Eppendorf Hamburg Sarstedt N mbrecht Eppendorf Hamburg Falcon Deutschland Vivascience Hannover Vivascience Hannover Beckman Coulter Krefeld Applied Biosystems Darmstadt BioRad Munchen Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Zirbus Bad Grund Carl Zeiss Jena Schutt Gottingen BioRad Munchen Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Biometra Gottingen Heidolph Schwabach BioRad Munchen IKA Staufen Techne Minneapolis USA New Brunswick Scientific Nurtingen IKA Staufen Microfluidics USA Branson Ultrasonics Corporation Danbury USA 25 3 Material und Methoden PCR Ger te pH Meter Photometer Pipettierhilfe Accu Jet R ntgendiffraktometer RU H3R Rotationssch ttler Rotor JA 20 JA 30 50 T Rotor JLA 8 1000 Rotor S4180 Semi Dry Blotkammer Sonifier 250 Spektralphotometer Superloops 10 ml 50 ml Taumelrollenmischer RM5 Thermomixer comfort Tischzentrifuge 5417 R Tischzentrifuge Microcentrifuge II Ultraschallbad Sonorex Super RK 510 Unitron Schuttelinkubatoren Vortex Zentrifuge Allegra 21R Zentrifuge Avanti J 20 XPI J 301 JA 20 Eppendorf Hamburg Beckman Coulter Krefeld Eppendorf Hamburg Brand Wertheim Rigaku The Woodlands USA Karl Hecht Staufen Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld BioRad Munchen Branson Ult
61. Pr paration und Kristallisation des small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing protein SGT Diplomarbeit vorgelegt von Simone Brauns aus Helmarshausen angefertigt im Institut fur Molekulare Strukturbiologie an der biologischen Fakultat der Georg August Universitat zu Gottingen 2005 Referrent Prof Dr R Ficner Korreferent Prof Dr O Einsle Tag der Abgabe der Diplomarbeit 03 02 2005 Letzter Tag der m ndlichen Pr fung 07 05 2004 Ich w dme diese Arbeit all jenen die an mich geglaubt haben meinen Eltern die mir die Welt zeigten und Thomas der sie zusammen mit mir durchschreitet Alles Wissen und alles Vermehren unseres Wissens endet nicht mit einem Schlu punkt sondern mit einem Fragezeichen Hermann Hesse 1877 1962 Danksagung Hiermit m chte ich mich bei den zahlreichen Personen bedanken die auf verschiedenste Art und Weise zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben Mein besonderer Dank gilt Prof Dr Ralf Ficner der mir die Bearbeitung dieses interessanten Themas erm glichte und mich stets bei Problemen unterst tzte Be Herrn Dr Ach m Dickmanns m chte ch mich f r seine mmer w hrende Gespr chsbereitschaft bedanken Allen Mitarbeitern der Abteilung molekulare Strukturbiologie danke ich f r die hervorragende und freundschaftliche Zusammenarbeit und die tolle Arbeitsatmosph fre Mein besonderer Dank gilt zudem Herrn Winfried Lendeckel f r seine ersten
62. Scheufler er al 2000 siehe Abschnitt 1 4 1 1 4 1 SGT fungiert als ein Cochaperon Nach wie vor ist die Bedeutung der glutamin reichen Dom ne am C Terminus des SGT Proteins nicht bekannt Auch die Bedeutung der vier Asparagin Prolin Motive NP Motive 1m Ein Buchstaben Code ist nicht vollstangig verstanden 1999 fanden Liu et al heraus dass das SGT Protein mit dem Hitze Schock verwandten Protein Hsc70 interagiert Hitze Schock Proteine sind eine Reihe von in der Natur stark konservierten Proteinen deren Expression sehr stark durch Hitzestress induziert wird Hitzeschock Proteine geh ren zur Familie der molekularen Chaperone Diese k nnen an Polypeptidketten binden und dabei z B die unspezifische Aggregation schwach bindender Seitenketten verhindern Sie erleichtern die Faltung anderer Proteine k nnen aber auch bei der Anordnung mehrerer Polypeptide zu gr eren Strukturkomplexen helfen Lehninger er al 1994 Die Untersuchung molekularer Mechan smen von Chaperonen nimmt seit einigen Jahren einen immer gr er werdenden Stellenwert in der medizinischen Forschung ein denn ein gemeinsames Merkmal der meisten neurodegenerativen Krankheiten ist die Bildung von Proteinaggregaten n Nervenzellen Im gesunden Organ smus verhindern molekulare Chaperone eine falsche Proteinfaltung die zu einer Aggregatbildung dieser Proteine durch die Oberflachenexposition hydrophober Reste f hren kann Ein Beispiel hierf r st die Krankheit Chorea H
63. Substrat Bindestelle e und der wenig konservierte C Terminus der f r eine Wechselwirkung mit einigen Cochaperonen z B dem DnaJ verantwortlich ist Cyr et al 1994 Neuere Untersuchungen zeigen dass auch die carboxy terminale Dom ne n die Substratbindung involviert ist Demand er al 1998 Es scheint so zu sein dass sowohl das Hsp70 als auch das Hsc70 Protein nicht selbst akt v Konformations nderungen von Proteinen induzieren sondern vielmehr als Akzeptor f r andere Proteine dienen welche anschlie end die eigentliche Faltung bzw Degradation durchf hren Hartl er al 2002 siehe Abbildung 1 5 folding machine degrading machine Hsp40 Hsp40 Hop lt a promotes folding recruits Hsp90 BAG 1 CHIP recruits the mediates proteasome ubiquitination Abb 1 5 Kofaktoren konkurrieren um die Bindungsstellen am Hsp70 Protein und bestimmen somit seine Funktion Das Hsp70 Protein ist grin eingefarbt Deutlich ist die Dreiteilung des Proteins in ATPase Dom ne Substrat Bindestelle f r Peptide und carboxy terminale Dom ne f r die Wechselwirkung mit verschiedenen Cochaperonen zu erkennen Das Bild stammt aus der Genetik Vorlesung 2004 von Herrn Langer Uni K ln Um die Faltung von Proteinen durchzuf hren kann Hsc70 mit einer gro en Anzahl verschiederer Kofaktoren kooperieren die alle eine sogenannte tricopetide repeat TPR Dom ne beinhalten Brinker et al 2002 Das Hsp70 and Hsp90 organizing protein HOP
64. T ist ein Bestandteil des synaptischen Chaperon Komplexes Im Jahr 2001 wurde von Tobaben et al ein synaptischer Chaperon Komplex vorgestellt der aus den drei Proteinen Hsc70 SGT und dem synaptic vesicle cysteine string protein in der Kurzform CSP besteht CSP ist ein typischer Vertreter aus der Familie der DnaJ Proteine Es fungiert als ein pr synaptisches Cochaperon w hrend der Neurotransmission an den Synapsen und kann sehr stark die ATPase des Hsc70 Proteins aktivieren CSP formt mit SGT und Hsc70 einen ADP abh ngigen Dreierkomplex auf den synaptischen Vesikeln welcher durch ATP aufgel st werden kann CSP bindet ber seine DnaJ Dom ne m N Terminus an das Hsc70 Protein Das charakteristische Merkmal aller zu DnaJ homologen Proteine ist die 70 AS umfassende J Dom ne Sie besteht aus vier a Helices wobei zwischen Helix II und Helix III das 12 1 Einleitung hochkonservierte Tripeptid HPD exponiert wird Dieses Tripeptid ist essentiell f r die Interaktion zwischen DnaJ ahnlichen Proteinen und Proteinen aus der Hsc70 Familie W hrend bei einer Mutation innerhalb der kompakten Helix turn Helix Struktur das DnaJ Protein noch eingeschr nkt funtionsfahig ist verliert es bei einer Mutation im HPD Tripeptid seine F higkeit an Hsc70 zu binden Tsai et al 1996 Chamberlain et al 1997 In der Mitte des CSP befindet s ch eine cystein reiche Dom ne die palmitoyliert ist und dadurch das Protein an den synaptischen Vesikeln
65. Temperaturen bis zu einer OD6oo von etwa 0 5 0 7 wachsen gelassen Wurden gr ere Mengen an Protein ben tigt konnte eine Anzucht der Expressionskultur in einem 10 Bioreaktor durchgef hrt werden In Abh ngigkeit der Zelldichte ndert sich die Sauerstoffaufnahme und die CO2 Produktion einer Zellkultur In einem ungeregelten System kann die Gel stsauerstoffkonzentration und der pH Wert nicht konstant gehalten werden dadurch variieren diese beiden Gr en und beeinflussen den Kultivierungsverlauf Aus diesem Grund erfolgte ein ScaleUp der Expressionsbedingungen auf einen 10 Liter Bioreaktor mit pO2 und pH Sonde Erst in Bioreaktoren mit pO2 und pH Sonde und einer Regelung beider Parameter durch automatische Variation der Zusammensetzung der Gaszufuhr und bedarfsgerechter Zugabe von Natronlauge k nnen pO2 und pH Wert konstant gehalten werden 44 3 Material und Methoden Die Proteinexpression f r das H s hSGT Fusionsprotein wurde n einem System mit 10 Liter Reaktorvolumen durchgef hrt Der verwendete Reaktor wurde zur Sterilisation mit allen installierten Komponenten wie z B Schl uchen und Flaschen in einen Gro raumautoklaven HST 4 5 8 Bad Grund bei 121 C f r eine Stunde dampfsterilisiert Die Kultivierung erfolgte im Batch Verfahren Die Bedingungen wurden auf 20 C und einen pH Wert von 7 5 eingestellt Die Durchmischung erfolgte mit 500 Upm Nach der Zellernte wurde das Zellpellet aus dem Fermenter in 10 mal 50 ml Re
66. Uel54 Helix 4 Ser159 Serl71 Helix 5 H s175 Leul86 Helix6 und schlie lich Glul93 Lys205 Helix 7 Diese Ergebnisse spiegeln sich auch in den Sekund rstruktur Voraussagen des Programms PSIpredict wieder siehe Abbildung 5 2 99 5 Diskussion cont 113223322133233332132 23 gt 3132 3233332223 Prec _ Oe D Pred CCHARRARRAARARARARAR AARC CHBRAARCCHAHAAHA HA AA MDITKRRLA YAIIQF LADQ LRAGG LSSDAQESLE VAIOC LE 10 20 30 40 Conf 1JJ32233922332239223393333332392333333223228 Fred Pred AHAAACCCC CHAHAARARAAA AAARAA HARAR AR AHA HAAHA AA AA TAF CYTVEDSDLA LPOTLPEIFE AAATCFEPPODLESF AR 50 60 FO s0 Conf Ja22252222222323392223222323232239223323222328 Fred Fred HCHAARCCHARARARAARARAARAARRAARACCRAARAAAARAARAAAA AA TFFSEEDSAEAERLEKTEGCIEOMEVEITEFE AAVHF YCRAIEL 30 100 110 170 Conf 3999909999599990999950999999999999930999 a5 Fred 3 E 3 Pred CCCCHAAHRAAAAAHAAHACCHAAHBAAHRRAABAAACCCCHA AA IPAITAV YF CIIRAAAYSKLGITYAGAVQODCERAIC IDPAYSK 130 140 150 160 cont 3919129191993332329321212339539922922322 Fred M ee ED A Pred HAHRARARARARAC CHARA ARARAARAARACCCARARARARAAA AA AYTGRMGLA LSS LITRAVEAVAY YKRALE LDPDIE TYESIT LE 170 180 130 200 Cont 39333392292533333933 3333333333233333393232 Fred B Pred HARRARARACCHAARRARARARAARCCAARAARAR HABA HA AA AA IAE LELREAPSPTGGVGSFDIAGLLIMTTP GFMSMASITLMITIT 210 220 230 240 Conf 3999999999093509909939099930999999999999095t Fred Pred BAAHAAARAHAAACCCOCC
67. Verfahren 76 4 Ergebnisse gewaschen und das GST hSGT Fusionsprotein mit Elutionspuffer von der Saulenmatrix eluiert 1 ml gro e Fraktionen wurden aufgefangen und im Bradford Schnelltest qualita t v auf hren Proteingehalt getestet Die S ule wurde solange mit Elutionspuffer gesp lt bis im Bradford Test keine Protei ne mehr detektiert werden konnten Das Eluat von der Glutathion Sepharoses ule wurde mittels SDS PAGE untersucht siehe Abbildung 4 20 von P D W BR 13 45 mu 2 116 Sa 564 ri GST hSGT Fusionsprotein 43 36 Abb 4 20 Expressionsniveaus von GST hSGT Fusionsprotein in Rosetta DE3 Rosetta DE3 E coli Zellen mit pGEX6P1 1 hSGT Plasmid wurden bei 37 C in LB Medium bis zu einer OD o9 von 0 6 wachsen gelassen Dann wurde die Proteinexpression mit 0 5 mM IPTG induziert und die Zellen f r weitere 4 Std bei 20 C inkubiert Vor und nach der Induktion wurde eine Proben abgenommen die OD o9 bestimmt gleiche Mengen an Zellen wurden in Laemmli aufgenommen und 5 Min aufgekocht Das Zelllysat wurde in einem 12 5 gen SDS Polyacrylamidgel analysiert V I vor Induktion n I nach Induktion zum Zeitpunkt der Ernte BR Broad Range Marker U berstand P Pellet D Durchfluss der Glutathion Sepharoses ule w hrend des Proteinauftrags W Durchfluss durch die S ule nach 3maligem Waschen Obwohl der gr te Teil des Fusionsproteins unl slich war lie sich der l sliche Teil do
68. aktionsgefaBe der Fa Eppendorf Deutschland aliquotiert und bei 20 C zur sp teren Nutzung tiefgefroren Bei Ernte und Aufschluss der Zellen wurde wie in Abschnitt 3 2 3 7 beschrieben verfahren Zur Induktion der Proteinexpression wurde die Zellsuspension mit IPTG in einer Endkonzentration von 0 5 bis 1 mM versetzt Nun wurden die Zellen weiter sch ttelnd inkubiert bis eine OD o9 von 1 5 2 0 erreicht ist An diesem Punkt verl sst die Kultur den logarithmischen Wachstumsbereich und geht in die station re Phase uber Die Zellen wurden 15 min bei 6000 x g und 4 C abzentrifugiert und das Pellet bis zur Proteinaufreinigung bei 20 C gelagert Einige Proteine akkumulieren in E coli in so genannten Proteineinschlusspartikeln engl inclusion bodies Es gibt mehrere M glichkeiten dies zu vermeiden Zun chst kann die Induktionstemperatur gesenkt werden um eine niedrigere Expressionsrate zu erreichen Zus tzlich kann 1 2 Glucose zugegeben werden um die Basisexpression des Zielproteins zu reprimieren Da namlich das einklonierte Gen unter der Kontrolle eines Lac Promotors liegt wirkt ein Abbauprodukt der Lactose wie z B Glucose inhibierend auf die Repressorfreisetzung vom Promotor vor dem eigentlichen Gen Glucose reprimiert ebenfalls die Synthese anderer Proteine die an Stoffwechselwegen beteiligt sind Schlie lich k nnen andere Expressionsstamme getestet werden Folgende Expressionsvektoren wurden in verschiedene Wirtsstamm
69. alien Cryschem Plate 24Wells sitting drop Crystal Clear Tape S Brauns Gottingen Hampton Research Aliso Viejo USA Eigener Screen nach Rezeptur der Fa Hampton Research Aliso Viejo USA Eigener Screen nach Rezeptur der Fa Hampton Research Aliso Viejo USA Eigener Screen nach Rezeptur der Fa Hampton Research Aliso Viejo USA Eigener Screen nach Rezeptur der Fa Hampton Research Aliso Viejo USA Eigener Screen nach Rezeptur der Fa Hampton Research Aliso Viejo USA Hampton Research Aliso Viejo USA M Rudolph Gottingen Eigener Screen nach Rezeptur der Fa Jena Bioscience Jena S Andrade Gottingen M Rudolph Gottingen R Ficner Gottingen Hampton Research Aliso Viejo USA Henkel Aachen 24 3 Material und Methoden Einmal Mikrotiterplatten Glasger te JA30 Zentrifugenr hrchen Pipetten verstellbar Pipettenspitzen Reaktionsgef sse 0 5 ml 1 5 ml 2 0 ml Reaktionsgefasse 15 ml 50 ml Sterilfilter 0 2um 0 4um Vivaspin Konzentratoren Zentrifugenbecher 1 1 500 ml 3 112 AbiPrism 3100 DNA Sequencer Ger te Agarose Gelelektrophoresekammer kta Prime kta Purifier Autoklav HST 4 5 8 Binokulare Brutschrank Mytron GelDoc Geldokumentationsger t Gelelektrophorese amp Blotkammer SDS Gelelektrophoresekammer Gelsch ttler Promax 1020 Geltrockner Gel Air Dryer Heizbad Heizblock Dri Block CB 2A Innova 4230 Sch ttelinkubator Magnetruhrer IKAMAG RE
70. apillarsequenzierer von Applied Biosystems analysiert 3 2 2 3 Plasmidpraparationen Die Methoden zur Plasmidpraparation basieren auf der Methode der alkalischen Lyse Birnboim et al 1979 3 2 2 3 1 Plasmidpr paration im kleinen Ma stab Bei Mini Pr parationen kurz Mini Preps werden Plasmide aus einer 10 50 ml gro en E coli bernachtkultur isoliert F r Mini Preps wurde das NucleoSpin Plasmid Kit von Macherey Nagel verwendet Dabei wurde nach den Angaben zur Isolation im Benutzerhandbuch des Herstellers verfahren 3 2 2 3 2 Plasmidpr paration im mittleren Ma stab F r die Vermehrung und Isolierung von DNA in mittlerem Ma stab um klonierte Plasmide f r Expressionsetablierungen zu erhalten wurden Midi Pr parationen kurz Midi Preps durchgef hrt Dabei wurden 100 200 ml einer E coli bernachtkultur aufgeschlossen und die DNA pr pariert In dieser Arbeit wurde das Plasmid Midi Kit von Qiagen benutzt und die DNA nach den Angaben des Herstellers isoliert 3 2 3 Zellbiologische Methoden 3 2 3 1 Medien zur Aufzucht von E coli LB Medium 10g Bacto Tryptone 5g Bacto Yeast extract 10g NaCl ad 1 1 H20 Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavieren die Lagerung bei 20 C Bertani 1951 LB Agar f r Selektionsplatten 250 ml LB Medium 3g Agar Agar 40 3 Material und Methoden Der Agar wurde durch Erhitzen gelost Sobald der LB Agar unter stetigem Ruhren auf etwa 40 45 C abgek hlt war wu
71. asser eingeweichte Cellophanfolie dann das Polyacrylamidgel und anschlie end eine zweite in Wasser eingeweichte Cellophanfolie auf einen Spannrahmen gelegt Das Gel musste gut entsalzt sein da 34 3 Material und Methoden sonst Verf rbungen auftraten Zwischen Gel und den Folien sowie zwischen beiden Folien sollte sich keine Luftblase befinden um ein Einrei en des Gels zu vermeiden Nun wurde ein zweiter Rahmen auf die Folien gelegt und mit Klammern fixiert Im Geltrockner bei etwa 70 C in hei er Umluft war das Gel nach zwei Stunden getrocknet Bei Raumtemperatur war das Gel nach 20 Stunden getrocknet und konnte aus den Rahmen genommen und archiviert werden 3 2 2 Molekularbiologische Methoden 3 2 2 1 Klonierung der Gensequenz von hSGT in Expressionsvektoren Plasmide sind bei Bakterien nat rlich vorkommende ringformige DNA Molekule die zusatzliche Gene tragen z B Antibiotikaresistenzen und zwischen Bakterien ausgetauscht werden k nnen Es ist auch m glich solche Plasmide zu modifizieren und n Bakterien einzuschleusen Bei Klonierungen wird das Zielgen zun chst amplifiziert und anschlie end in einen geeigneten Vektor gebracht Das daraus resultierende Plasmid besitzt fur die nachfolgende Expression der eingebrachten Gene wichtige Eigenschaften wie zum Beispiel einen induzierbaren Promotor f r eine Regualtion der Expression Gene f r die Inaktivierung von Antibiotika und schlie lich die Gensequenz fur die Expre
72. atalys ert Die Membran wurde 2 5 min in die F rbel sung gegeben bis es zur Farbreaktion kam Als letzter Schritt wurde die Membran mit dH2O gewaschen und getrocknet Sie wurde dann dunkel gelagert um ein Ausbleichen zu verhindern In dieser Arbeit wurde versucht mittels Western Blot His markierte Kontaminanten in aufgereinigten hSGT L sungen zu detektieren 3 2 1 5 4 DNA Extraktion aus Agarosegelen Diese Methode eignet sich um 70 bp bis 10 kb lange DNA Fragmente aus niedrig schmelzenden Standard Agarosegelen zu extrahieren und zu reinigen In dieser Arbeit wurde dazu das Gel Extraction Kit der Firma Qiagen benutzt Die durch Ethiditumbromid angefarbte DNA vgl 3 2 1 5 2 wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aus der Agarose herausgel st Anschlie end wurde s e an eine S ule gebunden gewaschen und von der S ule eluiert Es wurde nach Angaben des Herstellers verfahren F r die Klonierung von DNA Fragmenten in Vektorsysteme ist diese Methode n tzlich da elektrophoretisch aufgetrennte DNA aus den Agarosegelen ausgeschnitten und so aufgereinigt werden kann Bei den ausgeschnittenen DNA Banden handelte es sich um bereits mit Restriktionsenzymen geschnittene DNA Fragmente und Vektoren die von ungeschnittener und einfach geschnittener DNA getrennt wurden 3 2 1 5 5 Trocknen von Polyacrylamidgelen Polyacrylamidgele konnen zu Dokumentationszwecken zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet werden Dazu wurde zun chst eine in W
73. ben Ziel dieses Aufreinigungsschrittes war die Abtrennung der zwei auf dem SDS Gel siehe Abbildung 4 7 unterhalb der Fusionsproteinbande zu erken nenden Proteine 32 und 35 kDa gro Hierzu wurde ber Affinitatschromatographie vorgereinigtes His hSGT Fusionsprotein ber eine Column PD 10 umgepuffert siehe Abschnitt 3 2 4 4 und anschlie end auf eine ResourceQ S ule aufgetragen siehe Ab bildung 4 8 Simone ResQ003 1_U V1_280nm Simone Res 0003 1_UNZ_260nm Simone Res O003 1_Cond Simone Res Q003 1_Cond Simone ResQ003 1_Cone Simone ResQ003 1 Fractions Simone ResQ003 1_Logbook mA naraz amra 3 5 0 10 0 150 3 i 300 ml Abb 4 8 Chromatogramm einer Anionenaustauschchromatographie des His hSGT Fusionsproteins ber eine ResourceQ S ule Im Chromatogramm sind zwei Hauptpeaks zu erkennen wobei der zweite Peak doch deutlich gr er als der erste ist Einige Fraktionen wurden zur Analyse auf ein 12 5 ges SDS Gel aufgetragen siehe Abb 4 9 Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 260 nm Braun relative Leitf higkeit Gr n Elutionsgradient 0 500 mM NaCl Zur Analyse des Saulenlaufes wurden einige Fraktionen auf ein 12 5 iges SDS Gel aufgetragen siehe Abbildung 4 9 65 4 Ergebnisse FPBR 2 3 9 1011121314 a piled lt His hSGT Fusionsprotein Abb 4 9 SDS PAGE der Anionenaustauschchromatographie des His hSGT Fusionsproteins ber eine ResourceQ S ule Die Zahlen bezeichne
74. berfuhrt und ultrazentrifugiert 108 000 x g 30 min 4 C Alternativ konnten die Zelltrt mmer auch durch 30 min tige Zentrifugation bei 40 000 x g 4 C und anschlie ender Sterilfiltration mit einen 0 2 um Vorsatzfilter von Vivascience entfernt werden Nach der Trennung des Lysats in Zelltriimmer und Uberstand wurde Proben ber SDS PAGE analysiert und der berstand wurde chromatographisch aufgetrennt 3 2 4 Biochemische Methoden 3 2 4 1 Chromatographische Trennmethoden Es gibt zahlreiche chromatographische Trennmethoden wie z B Affinitats Gel Ionenaustausch oder Gaschromatographie Bei der nativen Trennung von Proteinen wird meist auf Affinitats Ionenaustausch und Gelchromatographie zur ckgegriffen Die Affinitatschromatographie beruht auf spezifischen und reversiblen Interaktionen 46 3 Material und Methoden von Saulenmaterial und Molek l Abh ngig von der Beschaffenheit des Saulenmaterials und der Probe adsorbieren Molek le an die Matrix Das Adsorbens kann von der S ule durch kompetitive Verdr ngung Konformationswechsel durch nderung des pH Wertes oder durch nderung der lIonenst rke eluiert werden Die Affinit ts chromatographie stellt eine sehr spezifische und selektive Trennmethode f r Biomolekiile dar Bei der lIonenaustauschchromatographie werden geladene Molek le nach ihrer Ionenst rke bei einem bestimmten pH Wert aufgetrennt Die Tr germatrix der Chromatographies ule bietet dabei
75. ce Optische Dichte Polyacryamidgel elektrophorese Phosphat gepufferte Kochsalzl sung Polymerase Chain Reaction Polyethylenglykol potentium hydrogenii pr mRNA Vorlaufer mRNA vili Anhang RNA RNase rpm S S cerevisiae S pombe SDS sog Taq Polymerase TBE TEMED Tris Tris HCl tRNA UV vel v v w v z B R bonukleins ure R bonuklease Umdrehungen pro Minute Sekunde Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Natriumdodecylsulphat sogenannt Thermus aquaticus DNA Polymerase Tris Borat EDTA Losung N N N N Tetra Methylethylendiamin Tris hydroxymethyl aminomethan Tris hydroxymethyl aminomethan Hydrochlorid Transfer RNA Unit Enzymeinheiten Ultraviolett Volt vergleiche Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen zum Beispiel
76. ch der Aufreinigung beider Proteinvariationen als Fusionsprotein und als reines Protein wurden sogenannte initial screens verwendet um erste Erkenntnisse ber m gliche Kristallisationbedingungen zu erfahren In einer dieser initial screen Bedingungen konnten Kristalle beobachtet werden deren Wachstum anschlie end durch diverse Techniken verbessert werden konnte siehe Abschnitt 5 4 Obgleich es nicht gelang dass humane SGT Protein n einer Form zu kristallisieren die es erm glicht h tte mittels r ntgendiffraktometrischer Untersuchungen die drei dimensionale Struktur des Proteins aufzukl ren konnten dennoch im Rahmen dieser Arbeit erste Bedingungen gefunden werden bei denen eine Kristallbildung des humanen SGT Proteins beobachtet werden konnte 5 1 Klonierung der hSGT Gensequenz n den Expressionsvektor pGEX6P1 1 Nachdem sich eine Spaltung des His hSGT Fusionsproteins in hSGT Protein und His tag als nicht durchf hrbar erwies siehe Abschnitt 4 2 1 5 wurde die Gensequenz fur das hSGT Protein mit dem Ziel der spateren Spaltung des neuen Fusionsproteins in den 88 5 Diskussion Expressionsvektor pGEX6P1 1 umkloniert Zur Erzeugung eines GST hSGT Fusionsproteins wurde die Gen Sequenz f r das humane SGT Protein in den Expressionsvektor pGEX6P1 1 kloniert Dazu wurde die Gen Sequenz von SGT an ihrem N Terminus m Leserahmen mit GST und einer Erkennungsregion f r eine PreScission Protease zur enzymatischen Abs
77. ch gut mit Hilfe der Glutathion Affinitatschromatographie aufreinigen Wie schon beim His hSGT Fusionsprotein zeigen sich auch beim GST hSGT Fusionsprotein drei Banden auf dem Gel vgl Abbildung 4 7 und 4 20 Das GST hSGT Fusionsprotein hat ein theoretisches Molekulargewicht von 62 kDa 35 kDa hSGT Protein ohne Tag 27 kDa GST Tag Die beiden unterhalb der Fusionsproteinbande zu findenden Proteine besitzen Molekulargewichte von etwa 58 und 54 kDa Aufgrund der Schwierigkeit von Rosetta DE3 Zellen das Fusionsprotein in ausrei chenden Mengen l slich zu produzieren wurde von weiteren Versuchen mit diesem Ex pressionsstamm abgesehen Die Ausbeute an GST hSGT Fusionsprotein betrug nach 77 4 Ergebnisse der Affinitatschromatographie und der Expression in Rosetta DE3 Zellen nur 1 6 mg Protein pro Liter Expressionskultur Zeitgleich zur Expression des GST hSGT Fusionsprotein in Rosetta DE3 wurde auch eine Expression des Fusionsproteins in E coli BL21 DE3 RIL durchgef hrt Die Ex pressionsbedingungen waren identisch Nach dem Zellaufschluss zeigte sich dass das Fusionsprotein aus E coli BL21 DE3 RIL Zellen in loslicher Form gewonnen werden konnte In Abbildung 4 21 kann man deutlich erkennen dass nur ein geringer Teil des Gesamt fusionsproteins im Pellet nach dem Zellaufschluss zu finden ist Der berwiegende Teil des GST hSGT Fusionsproteins befindet sich in l slicher Form im berstand Die Auf reinigung des Fusionsprotein
78. ches gro e Expressionsausbeuten mit einer zeitsparenden wenige Schritte umfassenden Aufreinigungsstrategie kombiniert um die Proteinverluste w hrend der gesamten Aufreinigung gering zu halten Die Wahl fiel auf ein bakterielles Expressionssystem E coli Diese werden sehr h ufig verwendet da sie vergleichsweise kosteng nstig sind und auch der ben tigte Zeitaufwand gering ist im Vergleich mit anderen Expressionssystemen Zudem ist die Ausbeute an rekombinantem Protein recht hoch 89 5 Diskussion In der Biochemie wird h ufig die Methode der Metallchelat Affinitatschromatographie IMAC immobilisierte Metallchelat Affinitatschromatographie eingesetzt bei der eine schnelle Isolierung des rekombinanten Proteins durch Einf hrung einer Polyhistidin Markierung His tag erfolgen kann Der Vorteil einer recht kleinen Markierung wie dem His tag liegt darin dass er aufgrund seiner geringen Gr e weniger mit dem Fusionsprotein interagiert als es z B eine gro e Markierung tun w rde Aus diesem Grund mu er auch f r d e Kristallisationsversuche n cht unbedingt abgespalten werden F r diesen Expressionsansatz wurde der pET16b Expressionsvektor verwendet Der f r hSGT kodierende Genabschnitt Accession NM 003021 war bereits ber die Restriktionsschnittstellen NdeI und Xhol in den Vektor pET16b kloniert worden und wurde mir freundlicherweise fur die Diplomarbeit von Herrn R Ficner Molekulare Strukturbiologie Gottingen zur Ve
79. chritten von Verunreinigungen abzutrennen Die Aufl sung ist abh ngig von der Flussgeschwindigkeit und dem aufgetragenen Probenvolumen wobei kleine Volumina vorzuziehen sind 47 3 Material und Methoden 3 2 4 1 1 Affinit tschromatographische Trennung von Proteinen mit His Sequenz ber Ni NTA Sepharose Proteine die mit N oder C terminaler His Sequenz exprimiert wurden lassen sich selektiv ber eine Affinitatschromatographie mittels immobilisierter Metallchelat komplexe aufreinigen IMAC engl immobilized metal chelating affinity chromatography Hierbei bilden zwei Histidine ber die freien Elektronenpaare ihrer Stickstoffe koordinative Bindungen zu einem immobilisierten Metallion aus Dabei bildet sich ein Chelatkomplex der kompetitiv durch Imidazol aufgel st werden kann Die Metallionen z B Ni oder Co m ssen zweiwertig sein und sind meistens an NTA Nitrilotriessigsaure Sepharose gebunden Bei der IMAC durfen die verwendeten Puffer weder DTT noch EDTA enthalten da chelatkomplexbildende Substanzen die Kopplung der Proteine st ren Anstelle von DTT wird daher B Mercaptoethanol eingesetzt In dieser Arbeit wurden f r die Aufreinigung von Proteinen mit His Sequenz die HiTrapChelating Ni NTA Sepharose S ulen von Amersham Pharmacia Biotech benutzt Nickel ist uber vier koordinative Bindungen an NTA gebunden NTA ist kovalent an die Sepharose Tragermatrix gebunden Fur die Affinitatschromatographie mit Ni NTA Sepharose wurden
80. copeptide repeat Motive sind Sequenzabschnitte mit einer degenerierten Konsensussequenz aus 34 Aminos uren von denen einige konserviert sind die in mehreren Wiederholungen aufeinander abfolgen k nnen Goebl et al 1991 Sie bilden amphiphatische Helices aus die aber meist als Helix turn Helix Motiv welche aus 2 aniparallelen a Helices bestehen vorliegen Mehrere hintereinander liegende TPR Motive k nnen eine TPR Dom ne formen wobei diese Dom nen aus 3 16 Wiederholungen dieser 34 Aminos urereste bestehen und ein komplett hel cales strukturelles Motiv ausbilden S korsky et al 1990 Diese die gesamte TPR Dom ne umspannende superhelicale Architektur stammt aus der parallelen Aufschichtung der zwei a Helices jedes einzelnen TPR Motivs siehe Abbildung 1 4 Abb 1 4 Struktur der TPR 1 Dom ne des HOP Proteins HOP ist ein Akronym und steht f r Hsp70 and Hsp90 organizing protein Die TPR 1 Domane des HOP Proteins zeigt eine gro e Sequenz hnlichkeit zu der TPR Dom ne des SGT Proteins Das Bild zeigt die molekulare Oberfl che von TPR 1 in grau wobei im Inneren die Proteinkette als gefaltetes Band zu erkennen ist Das gesamte Molek l erinnert von seiner drei dimensionalen Struktur an eine Wendeltreppe wobei die einzelnen TPR Motive aus jeweils zwei a Helices bestehen und die Treppenstufen dieser gedachten Wendeltreppe darstellen Das erste TPR Motiv ist gelb eingef rbt das zweite wurde rot markiert und das dritte und letz
81. dem Protein die M glichkeit zur Dimerisation die innerhalb des N Terminus begr ndet ist nehmen k nnen Durch weitergehende Untersuchungen sollten diese Vermutungen aber noch erh rtet werden Fur die Verhinderung evtl Abbauvorg nge am C Terminus des Proteins sollte der C Terminus des SGT Proteins durch eine weiter Markierung gesch tzt werden Es st darauf zu achten dass beide Markierungen sowohl am N als auch am C Terminus gut abspaltbar sind um Interaktionen dieser Markierungen mit dem Protein w hrend der Kristallisation von vornherein auszuschlie en Diese projizierten Versuche werden sicherlich auf lange Sicht hin gesehen die M glichkeit bieten die drei dimensionale Struktur des SGT Protein aufzuk ren 105 6 Zusammenfassung F r ein besseres Verst ndnis der Funktionen des SGT Proteins reicht es allerdings nicht aus seine drei dimensionale Struktur aufzukl ren Ferner sollten seine Interaktionen mit anderen Proteinen wie dem NS1 Protein n her in den Blickpunkt der Forschung ger ckt werden Die Charakterisierung der Aktivierbarkeit der ATPase von NS1 durch das SGT Protein ist eine dieser noch zu untersuchenden Fragestellungen Eine andere besch ftigt sich mit den Moglichkeiten der posttranslationalen Modifikationen des SGT Proteins durch NSI Und auch die Vermutung der SGT NS1 Komplex k nnte Chaperonfunktion besitzten mu jedoch noch erh rtet werden F r die Zielsetzung der Kristallisation des SGT kombiniert
82. den durchgefuhrten Versuchen festgestellt werden Wahrend in den schnell wachsenden Kulturen fast ausschlieBlich oligomerisiertes tetrameres Fusionsprotein von der Gelfiltrationss ule eluiert werden konnte siehe Abbildung 4 10 konnte nach einer Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins aus langsamer wachsenden Kulturen eine Mischung aus oligomerisiertem tetramerem und dimerisiertem Fusionsprotein gewonnen werden siehe Abbildung 4 14 Durch eine Erniedrigung der Inkubationstemperatur w hrend der Expression und einem damit einhergehenden verlangsamten Wachstum der E coli Kultur wird zwar der mRNA Abbau verst rkt aber gleichzeitig kann ein verlangsamtes Wachstum der Zellen auch zu einer Dimerisierung des SGT Proteins f hren welches f r Kristallisationsversuche besser geeignet ist als oligomerisiertes tetrameres Protein In den Naturwissenschaften besteht Unklarheit dar ber n welchem Teil des SGT Proteins d e F higkeit zur Oligomerisierung verborgen liegt Kordes et al 1998 vermuten dass d e TPR Dom ne an der Oligomerisierung des SGT Proteins beteiligt ist Tobaben er al 2003 dagegen konnten zeigen dass eine am N Terminus verk rzte Variante des SGT Proteins seine F higkeit zur Oligomerisation verliert Auch in den Versuchen zu dieser Arbeit zeigte sich dass Veranderungen am N Terminus z B durch Anheftung eines gr eren tags Einflu nehmen auf die Art der Oligomerisierung des SGT Proteins Wohingegen nach der Expressi
83. den viralen Lebenszyklus sind Cotmore et al 1987 Beides sind Phosphoproteine die durch alternatives SpleiBen aus der selben pra mRNA entstehen und sich nur hinsichtlich hres C Terminus unterscheiden Cotmore et al 1986 NS1 st der wichtigste regulator sche Faktor autonomer Parvoviren und tr gt essentiell zur viralen DNA Replikation Genexpression und _ Virus vermittelte Zytotoxizitat bei Tullis et al 1988 Bei NS1 handelt es sich um ein multifunktionelles Protein Neben einer DNA Helikase und ATPase Aktivit t Wilson er al 1991 Nuesch er al 1995 verf gt NS1 ber eine strang und sequenzspezifische Endonukleaseaktivitat Christensen et al 1997 und Cotmore et al 1998 Zellul re Proteine die mit NS1 interagieren stellen somit auch potentielle Zielmolekule f r die Krebstherapie des Glioblastoms mit Hilfe des autonomen Parvovirus Hl dar 1998 wurde das SGT Protein von Cziepluch er al unter zu Hilfenahme eines Yeast two hybrid Systems als Interaktionspartner von NS1 identifiziert Cziepluch et al 1998 SGT ist eine Abk rzung f r small glutamine rich tetratricopeptide repeat TPR containing protein An Hand von GST Pulldown Assays konnte eine direkte Interaktion von NSI mit dem SGT Protein nachgewiesen werden Kordes er al 1998 Dar berhinaus konnte durch P Markierungs Experimenten und 2D Analysen gezeigt werden dass das SGT Protein NSI spezifisch an Serin und Threoninresten phosphoryliert wird siehe Anhang
84. die Strukturaufkl rung ungeeignet sind dagegen polykristalline Aggregate oder amorphe Substanzen F r diese Arbeit wurde neben dimerisiertem MHis hSGT Fusionsprotein auch aufgereinigtes hSGT Protein ohne Tag zur Kristallisation verwendet Mit dem His hSGT Fusionsprotein gelang es einige Kristalle herzustellen diese eigneten sich allerdings nicht f r eine Strukturaufkl rung mittels R ntgenstrukturanalyse denn entweder waren s e n cht gro genug f r eine Messung m Diffraktometer oder s e streuten den R ntgenstrahl n cht und somit waren auch keine auswertbaren Reflexe auf dem Reflektor zu erkennen Andere Kristalle stellten sich schlussendlich als Salzkristalle heraus Die n der Bedingung Crystal Screen 2 Nr 43 gewachsenen nadelf rmigen Proteinkristalle konnten durch eine Herabsenkung sowohl der MPD Konzentration auf 30 als auch des pH Wertes des Puffers von 8 5 auf 8 0 n hrem Wachstum verbessert vergr ert werden Viele Proteine kristallisieren bei einem pH Wert der etwa um eins ber oder unter dem isoelektrischen Punkt des Proteins liegt Der soelektrische Punkt des His hSGT Fusionsproteins liegt bei 5 6 siehe Anhang 8 1 2 Es scheint sich zu best tigen dass 97 5 Diskussion eine Absenkung des pH Wertes von 8 5 auf 8 0 bei der Kristallisation des Fusionsproteins ein verbessertes Kristallwachstum herbeif hrt Eine zus tzliche Verringerung des pH Wertes f hrte allerdings zu keinen weiteren positiven Ef
85. dieses Sterns hat eine L nge von ca 60 uM und eine Breite von 5 7 uM Bedingung im Tropfen 100 mM Tris HCl pH 8 0 30 v v MPD 200 mM Ammonium Phosphat Proteinkonzentration im Tropfen 8 mg ml Temperatur 20 C Obwohl nadelf rmige Kristalle f r konventionelle Einkristallbeugungsmethoden eigent lich ungeeignet sind wurde dennoch einer dieser Kristalle im Diffraktometer vermes sen streute den R ntgenstrahl jedoch nicht Aus diesem Grund wurden zum Zwecke der weiteren Verbesserung der Kristalle die Additiv Screens 1 3 der Fa Hampton Research und die Detergenzien Screens 1 3 der Fa Hampton Research als Zusatz in der oben genannten verbesserten Bedingung eingesetzt Hierbei wird das Additiv oder Detergens 1 10 im Tropfen verd nnt Durch den Zusatz von Mangan Chlorid zur Kristallisations l sung Additive Screen 1 Nr 7 konnten zus tzliche Kristalle mit einer pyramiden f rmigen 3D Struktur gewonnen werden siehe Abbildung 4 29 Abb 4 29 Kleine pyramidenf rmige Kristalle in der angepassten Bedingung CS2 Nr 43 nach Zugabe des Additivs Mangan Chlorid Aufnahme mit einer Digitalkamera mit vorgespann tem Polarisationsfilter ber Nacht waren in dieser Bedingung kleine pyram denf rmige Kristalle ge wachsen Jede Seitenkante eines Kristalls hat eine L nge von 4 uM und eine H he von 3 uM Bedingung im Tropfen 100 mM Tris HCl pH 8 0 30 v v MPD 200 mM Ammonium Phosphat 10 mM Mangan Chlorid Proteinkon
86. doppelstrangige RNA schneidet Babitzke et al 1993 Der Abbau von mRNAs kann durch die Ausbildung sekundarer Strukturen am 3 Ende der mRNAs deutlich verlangsamt werden Die Firma Invitrogen entwickelte einen E coli Stamm der eine andere Losung zur Verringerung des mRNA Abbaus vorschlagt Sie fugten dem E coli BL21 DE3 Stamm eine Mutation in dem Gen rnel3l zu Dieses Gen kodiert fur die RNase E Durch die Verwendung dieses Expressionsstammes konnte der mRNA Abbau f r das SGT Protein m glicherweise vermindert werden Die Vermutung bei den beiden auf einem SDS Gel zus tzlich zu sehenden Proteinbanden unterhalb der hSGT Proteinbande k nnte es sich um eine Folge des mRNA Abbaus innerhalb der E coli Zellen handeln kristallisierte sich erst zum Ende dieser Arbeit heraus F r Untersuchungen die diese These st tzen k nnten blieb deshalb leider keine Zeit mehr Fur weitergehende Versuche zur Expression des humanen SGT Proteins in Prokaryoten schlage ich deshalb die Verwendung des E coli BL21 Star DE3 Stammes der Fa Novagene vor der die besagte Mutation in dem rne131 Gen besitzt Das Problem der zwei zusatzlichen Proteinbanden auf einem SDS Gel nach der Aufreinigung von SGT Protein konnte auch in einigen Publikationen wie dem zur Identifizierung des SGT Proteins Cziepluch et al 1998 beobachtet werden Es scheint ein generelles Problem zu sein wenn SGT Proteine in E coli Zellen exprimiert werden 91 5 Diskussion Jasiecki
87. drei TPR Motiven in der Mitte und der Glutamin reichen Region im C Terminus 96 5 Diskussion Bisher ist nur sehr wenig ber diesen Teil des Proteins bekannt und auch Datenbankvergleiche zur Sequenz des C Terminus zeigen keine hnlichkeiten mit bekannten Proteinstrukturen Ein protein modelling nur f r die TPR Dom ne innerhalb des hSGT Proteins sollte aber durchaus moglich sein da bereits einige Strukturen von TPR Dom nen anderer Proteine ver ffentlicht wurden zu denen die TPR Dom ne aus SGT eine hohe Homologie aufweist Eine Sequenzahnlichkeit von ber 50 bedeutet auch eine hohe Struktur hnlichkeit Aber selbst be erfolgreicher Strukturaufkl rung mittels R ntgendiffraktometrie kann die Kenntnis von der Terti rstruktur d h der Raumstruktur nicht notwendigerweise ausreichen die Funktion des Proteins zu bestimmen Eine Voraussetzung f r die Strukturaufkl rung von Proteinen mittels R ntgendiffraktometrie st die dreidimensional periodische Anordnungen der zu untersuchenden Molek le sprich Protein Kristalle Proteinkristalle sind oft schwer zu z chten sind sie aber schlie lich in ausreichender Gr e vorhanden k nnen sie f r die Kristallstrukturanalyse genutzt werden F r die Strukturaufkl rung via R ntgenstrukturanalyse wird allerdings ein sogenannter Einkristall ben tigt Ein Einkristall engl single crystal ist ein Kristall dessen Bausteine ein einheitliches homogenes Kristallgitter bilden F r
88. drophoben und hydrophilen Regionen werden in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration auf eine entsprechende S ule aufgetragen Das Salz entzieht den Proteinen hre Hydrath lle somit treten vermehrt unpolare Gruppen an die Oberfl che Die Proteine adsorbieren an die hydrophoben Liganden Im Falle der HiLoad 26 10 Phenyl Sepharose High Performance der Firma Amersham sind derivatisierte Phenyl Gruppen an eine stark vernetzte Agarose Matrix gekoppelt Je hydrophober das aufzureinigende Protein ist desto geringer mu die einzusetzende Salzkonzentration sein Durch kontinuierliche Veringerung der Salzkonzentration k nnen die Proteine von der S lule eluiert werden da der hydrophile Charakter der Proteine langsam wieder zunimmt Wasch Bindepuffer Elutionspuffer 20 mM Tris HCl pH 7 0 50 mM Tris HCl pH 7 0 2M NH4SO4 2 mM DTT 2 mM DTT 1 mM EDTA 1 mM EDTA Die S ulen wurden nach Benutzung mit 1 M NaOH gesp lt und wieder in 20 Ethanol berf hrt 3 2 4 2 Umpufferung und Entsalzung von Proteinl sungen In vielen F llen ist es notwendig Proteinl sungen f r weitere Aufreinigungsschritte umzupuffern und so zu entsalzen Proteine mit geringer L slichkeit werden h ufig n hoher Salzkonzentration aufgeschlossen und einige Affinitatschromatographien sind auf ein schmales pH Optimum abgestimmt F r Ionenaustauschchromatographien ist es jedoch essentiell dass der pH Wert und d e Salzkonzentration des Puffers auf den pl des aufzureinig
89. e transformiert His hSGT pET16b Ampicillin GST hSGT pGEX6pI I Ampicillin 45 3 Material und Methoden 3 2 3 7 Ernten und Aufschlie en von E coli Zellen Um rekombinante Proteine aus Bakterienzellen zu isolieren m ssen die Zellen geerntet und aufgebrochen werden Die Ernte erfolgte durch Zentrifugat on 6 000 x g 15 min 4 C und einmaligem Waschen in eiskaltem PBS Puffer 140 mM NaCl 10 mM NaH gt POy Na gt HPO pH 7 4 mit anschlie ender Zentrifugation 4 800 g 20 min 4 C Der Zellaufschluss konnte mechan sch durch pneumatische Zelldesintegration Fluidizer durch Zusatz von Lysozym und Schockgefrieren oder physikalisch durch Ultraschalldesintegration Sonifier erfolgen In dieser Arbeit wurden die Bakterienzellen mit Lysozym im Fluidizer mit vorhergehender Ultraschallbehandlung im Sonifier aufgeschlossen Ein Zellpellet aus 1 Schuttelkultur wurde in 25 ml Lysispuffer mit Lysozym aufgetaut und resuspendiert Um proteolytische Enzyme zu inaktivieren wurde vor dem Auftauen eine halbe Tablette Protease Inhibitor Cocktail Complete EDTA free im Lysispuffer gel st Der Zellaufschluss 1m Fluidizer wurde bei 80 90 psi in 5 7 Zyklen durchgef hrt Beim Aufschluss im Sonifier wurde die Zellsuspension auf Eiswasser f nfmal f r 25 Sekunden sonifiziert Dabei wurden folgende Einstellungen verwendet duty cycle 50 output control 6 Nach dem Aufschluss der Zellen wurde die Suspension in JA30 Zentrifugenr hrchen u
90. e naturiertes Pr zipitat Die L sungen n den anderen Wells blieben klar Bis zum heuti gen Tag war in keiner Bedingung eine Kristallbildung zu erkennen Entweder war das Protein n den Wells vollst ndig zu einem amorphen Pr zipitat ausge fallen oder die L sungen in den Wells blieben v ll g klar Es wurden keine nicht amorphen Proteinaggregationen oder andere Strukturen die zur Kristallbildung f hren k nnen gefunden 4 3 2 Kristallisation des hSGT Proteins Affinitats Markierungen an Proteinen haben den Nachteil dass sie mit dem Protein in teragieren konnen Zudem konnen sie bei der Kristallisation storen Aus diesem Grund sollte nicht nur His hSGT Fusionsprotein sondern auch hSGT Protein ohne Markierung kristallisiert werden Das hSGT Protein war nach der Gelfiltrationssaule als letztem Reinigungsschritt auf eine Konzentration von 16 mg ml ankonzentriert worden siehe Abschnitt 4 2 2 4 Nach der Gelfiltration lag es in einem Puffer mit 0 1 M NaCl und 20 mM Tris HCl pH 7 5 vor Die Kristallisationsansatze wurden bei 20 C pipettiert und inkubiert siehe Ab schnitt 3 2 5 1 Wie schon bei der Kristallisation des Fusionsproteins konnte auch in diesem Fall eine Prazipitation des Proteins nach nur einem Tag in etwa 30 der untersuchten Bedin gungen festgestellt werden Auch bei dieser Kristallisation des hSGT Proteins ohne Tag wurden bis zur Fertigstellung dieser Arbeit keine nicht amorphen klaren Proteinaggre gationen oder a
91. e Herstellung von His hSGT Fusionsprotein zum anderen wurde hSGT Protein ohne Tag zur Kristallisation verwen det Der fur hSGT kodierende Genabschnitt Accession NM 003021 war bereits ber die Restriktionsschnittstellen Ndel und XhoI in den Vektor pET16b kloniert worden und wurde mir fur die Diplomarbeit von Herrn R Ficner Molekulare Strukturbiologie Got tingen zur Verf gung gestellt Unter Zuhilfenahme des pET16b Vektors mit integriertem hSGT kodierendem Ge nabschnitt konnte ein Fusionsprotein mit N terminalem His Tag und C terminalem Zielprotein mit dazwischenliegender Faktor Xa Schnittstelle exprimiert werden Wie unter Abschnitt 4 2 1 6 gezeigt konnte dieses Fusionsprotein nicht ber die Faktor Xa Schnittstelle n Zielprotein und His Tag gespalten werden Aus diesem Grund wurde der f r hSGT kodierende Genabschnitt Accession NM 003021 mit dem Ziel der sp teren Spaltung von Zielprotein und Tag in zwei weitere Vektoren kloniert Einerseits in einen pET28a Vektor mit N terminalem His Tag und einer zwischen diesem Tag und dem Zielprotein liegenden Thrombin Schnittstelle H s Tag und Thrombin Schnittstelle sind durch einen kurzen Linker Ser Ser Gly voneinander getrennt Andererseits wurde ein Konstrukt aus pGEX 6P1 1 modifizierter pGEX 6P1 Vektor siehe Abschnitt 3 1 5 und hSGT Gensequenz hergestellt In diesem Fall liegt zwischen dem N terminalen GST Tag und der Sequenz f r das Zielprotein eine PreScission Protease 5
92. e Oligomere und Dimere aus His hSGT Fusionsprotein durch hohe Salzkonzentrationen 1 M NaCl in ihre Un tereinheiten aufspalten lassen Die Wirkung von Hochsalz kann zum einen durch den 71 4 Ergebnisse Ionenaustauscheffekt erkl rt werden wobei die Ionen des Salzes geladene Proteinreste verdr ngen Andererseits kann die steigende Ionenst rke auch die zur Bindung notwe nigen elektrostatischen Wechselwirkungen schw chen F r die praparative ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins unter Hochsalzbedingungen wurde wie unter Abschnitt 3 2 4 1 3 be schrieben verfahren Allerdings wurde dem Elutionspuffer 1 M NaCl zugegeben Vor dem Auftrag auf die Superdex S200 10 30 S ule wurde das His hSGT Fusionsprotein ebenfalls in einen Puffer mit entsprechender Salzkonzentration berf hrt F r die Superdex S200 10 30 wurde eine Kal brierung durchgef hrt Die Auswertung dieser Kalibrierung ist im Anhang nachzuschlagen siehe Anhang 8 4 Wie in Abbil dung 4 16 zu sehen ist eluiert das His hSGT Fusionsprotein unter Hochsalzbedingun gen 1 M NaCl ebenfalls in 2 Hauptpeaks von der Superdex S200 10 30 Saule Die Proteine 1m zweiten Peak eluieren nach ca 12 5 ml dies w rde laut Kalibrierung einem Molekulargewicht von ungefahr 77 kDa entsprechen d h das His hSGT Fusionsprotein liegt nach der Hochsalzgelfiltation mit 1 M NaCl zu einem Teil als Dimer vor Die Pro teine im ersten Peak eluieren schon nach et
93. e kleinere Proteine 4 2 2 3 Proteolytische Spaltung des GST hSGT Fusionsproteins durch PreScission Protease in hSGT und GST Tag Innerhalb des GST hSGT Fusionsproteins liegt eine PreScission Protease Schnittstelle welche hSGT und GST voneinander trennt Ist diese Aminos uresequenz f r das Enzym zug nglich wird sie spezifisch durch die PreScission Protease erkannt und geschnitten Die proteolytische Spaltung wurde w e n Abschnitt 3 2 4 4 Methode 1 Spaltung direkt auf dem S ulenmaterial beschrieben durchgef hrt Um hSGT Protein ohne Tag zu er halten wurde das GST hSGT Fusionsprotein mit der PreScission Protease gespalten 80 4 Ergebnisse Anschlie end wurde die Proteolytische Spaltung in einem 12 5 igen SDS Gel ber pr ft siehe Abbildung 4 24 lt GST hSGT Fusionsprotein Pe lt hSGT _ lt GST 20 Abb 4 24 PreScission Protease Spaltung des GST hSGT Fusionsproteins Das 12 5 ige SDS Gel zeigt die Spaltung des GST hSGT Fusionsproteins mit der Protease PreScission BR Broad Range Marker Spur 1 wurde mit rekombinantem Protein vor der Spal tung beladen es fungierte in diesem Versuch als Krontrolle zur proteolytischen Spaltung In Spur 2 wurde mit PreScission Protease geschnittenes Fusionsprotein aufgetragen Das GST hSGT Fusionsprotein das hSGT Protein und die Glutathion S Transferase GST sind jeweils mit Pfeilen markiert Zur Kontrolle der Spaltung wurde ungespaltenes GST hSGT Fusi
94. edl de hSGTcodon fraction colored n red sequence derived from Homo sapiens Codontable black Escherichia coli K12 Mean difference 16 94 100 50 0 HUN fCTOOrRGACOCOORFOFORFOFEF RAC OC ae Od O EI I EI ET EHRE LEERE TEN ae ae ET ERLERNEN Sa ee Soe eS ea BE a eS ee ee BE Ala Arg Asn Asp Cys End Gin Glu 100 50 0 SEE hs I 2 ee I ee ee ee En Fe Dr fe 2 a E OOOOO lt lt lt OOOO r F ee fC fee Gly His Ile Leu Lys Met Phe 100 50 u LOOR Or DU FS DOOF OOr tDOPF GOOOROO OOGOGOOOGSZSA FFFF ee ee ee ee Pro Ser Thr TrpTyr Val il 8 Anhang 8 3 Codon Usage von E coli f r jedes Codon aus der hSGT Gensequenz hSGTthreshold 1 20 grey threshold 2 10 red sequence derived from Homo_sapiens Codontable Escherichia_coli_K12 100 BO 0 L 5 10 15 20 40 45 SO 100 S0 u 35 60 65 70 75 80 35 90 95 100 100 su 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 100 OD N 160 165 170 175 180 190 195 200 In E Li Te f tt Tw 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 100 50 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 100 SO 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 100 50 D BZBEZE ZBElE BEECE TEER 355 360 365 370 375 380 385 390 395 400 IV 8 Anhang 420 425 4 440 445 450 N Mn D i 405 410 1 Lu GQ A LJ Un En in 7 TILT f i 455 AGO 465 470 475 L A80 485 490 495 500 s0 520 52
95. ehe Abbildung 1 1 zeigt sich in der Aminos uresequenz von rSGT und hSGT eine sehr hohe Homologie von 91 Bei n herer Betrachtung der SGT Sequenz findet sich eine auspep gte Dreiteilung des Proteins siehe Abbildung 1 2 Am C Terminus zeigt das Protein eine Anreicherung mit der Aminos ure Glutamin innerhalb der letzten 50 Aminos uren In dieser glutamin reichen Region besteht die Aminos uresequenz des SGT Proteins zu fast 30 aus Glutamin Hier befinden sich auch vier Asparagin Prolin Motive NP Motive Tobaben et al 2003 w hrend sich 1m Zentrum des Proteins eine Region mit drei TPR Motiven tetratricopeptide repeat befindet Aufbau und Struktur der TPR Motive werden in Abschnitt 1 2 n her erl utert Im N Terminus des SGT Proteins befindet sich eine m gliche coiled coil Dom ne Tobaben er al postulierten 2003 da der N Terminus des SGT Proteins sowohl Homo als auch Hetero Oligomerisationen des Proteins vermitteln kann Diese Region des Proteins beinhaltet einen stark konservierten Bereich von Aminos uren von dem zun chst angenommen wurde er w rde ein viertes TPR Motiv formen aber dieses vierte TPR Motiv ist offensichtlich nicht konserviert Die Aminos uresequenz innerhalb des N Terminus des SGT Proteins st aber anscheinend bestrebt eine sogenannte coiled coil Dom ne zu bilden welches ein bekanntes Dimerisations Motiv darstellt Verschiedene SGT Proteine k nnen ebenso effizient heterotypisch miteinander interagieren w
96. eitionen des Laufpuffers mit hoher Geschwindigkeit durch das elektrische Feld und berholen dabei die aufgetragenen Proteine Daraus resultiert hinter den Proteinen eine Zone geringerer Ionendichte und erh hter Feldst rke aufgrund dessen die Proteine und Folgeionen beschleunigt werden Die Geschwindigkeit der Proteine ist dabei gr er als die der Folgeionen aber langsamer als die der Leitionen Es resultiert die Fokussierung der Proteine als scharfe Bande an dem Feldst rkesprung Beim Auftreffen auf das Trenngel ndern die Folgeionen aufgrund des erh hten pH Wertes hre Ladung und damit hre Ionenbeweglichkeit Sie berholen die Proteine die dann wieder in einem Gebiet konstanter Feldst rke wandern Die Folge st eine normale Gelelektrophorese Das Trenngel wirkt als Molekularsieb da die Proteine durch die weit engeren Poren des Trenngels in Abh ngigkeit ihrer Masse verlangsamt werden und so nach ihrem Gewicht bzw hrer Gr e aufgetrennt werden F r die Vorbereitung einer SDS PAGE wurden zwei Glasplatten mit Ethanol gereinigt und staubfrei trocken gerieben Zwei 1 mm dicke Abstandshalter Spacer wurden an den R ndern platziert und d e Glasplatten wurden unten mit einem Gummi abgedichtet Die Glaplatten wurden an den R ndern geklammert Anschlie end wurde das Trenngel zwischen die Glasplatten bis 2 cm unter den Rand gegossen und f r die Dauer der Polymerisation ca 30 min mit Isopropanol berschichtet Nach dem Auspolymeri
97. en Ein PCR Zyklus besteht aus drei Schritten I Spaltung der DNA Doppelhelix f r die Hitzedenaturierung der DNA wird das Reaktionsgemisch auf 95 C erhitzt Die beiden komplement ren DNA Strange werden voneinander getrennt II Hybridisierung der Primer mit der DNA annealing der PCR Ansatz wird auf eine Temperatur gesenkt die etwa 3 C unter den Schmelzpunkten der Primer liegt um ein optimales weil hochspezifisches Hybridisieren der Primer mit der DNA zu gewahrleisten HI DNA Synthese durch die DNA Polymerase die optimale Temperatur f r die verwendeten Taq und Pfu DNA Polymerasen liegt bei 68 72 C Die Elongationszeit hangt von der Lange des zu amplifizierenden Fragments ab und sollte bei etwa min pro 1000 Basenpaaren liegen Diese drei Schritte laufen mehrmals hintereinander ab um eine ausreichende Menge an PCR Produkt zu erhalten Die bereits entstandenen DNA Str nge dienen in den Folgezyklen wiederum als Matrizen so dass die Vermehrung der zu amplifizierenden DNA Sequenz exponentiell zunimmt F r einen typischen PCR Ansatz 50 ul wurde pipettiert l ul 5 Primer 10 mM l ul 3 Primer 10 mM 1 ul dNTPs 100 mM 5 ul Taq Polymerase Puffer 10x l ul Taq Polymerase 5 U ul 40 ul ddH2O 1 ul DNA 200 ng ul 36 3 Material und Methoden Die PCR zur Amplifizierung von hSGT aus pET16b in E coli BL21 DE3 wurde im Thermocycler mit folgendem Programm durchgef hrt l Denaturierung 94 C 10m
98. en Elutionsfraktionen 41 52 nach der Affinitatschromatographie wurde ebenfalls ber Ausschlusschromatographie aufgereinigt Die Ausbeute an Fusionsprotein betrug nach dem Gelfiltrationsschritt ca 15 mg pro Liter Expressionskultur Die Fraktionen mit dem Fusionsprotein wurden vereinigt und das Protein auf 5 mg ml ankonzentriert Es konnte somit f r Kristallisationsversuche verwendet werden siehe Abschnitt 4 3 4 2 1 3 Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein nach Inkubation der Expressionskultur bei 20 C nach Induktion Nach einer Inkubation der Expressionskultur nach der Induktion bei 20 C statt 37 C ergibt sich wahrend der Gelfiltration ein ganzlich anderes Bild Fur diesen Versuch wurde die Anzucht der Expressionskultur in einem 10 Bioreaktor durchgefuhrt siehe Abschnitt 3 2 3 6 2 4 2 1 3 1 Affinit tschromatographische Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein Der erste Reinigungsschritt erfolgte uber die HiTrapChelating Ni NTA Sepharose Saule nach der in Abschnitt 3 2 4 1 1 beschriebenen Methode Fur die Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins wurde ein Zellpellet aus 1 Liter Bakterienkultur aus dem Fermenter resuspendiert und die Zellen mit einer Kombination aus enzymatischer Lyse Ultraschall und mechanisch durch pneumatische Zelldesintegration Fluidizer auf gebrochen Nach Zentrifugation wurden Uberstand und Zellpellet getrennt Das Fusi onsprotein aus dem proteinreichen Zelluberstand wurde anschlie end ber ei
99. en dimerisiertem His hSGT Fusionsprotein SM _30 32 34 35 36 38 40 42 SM 44 46 48 50 52 54 56 02 7 66 lt His hSGT Fusionsprotein Abb 4 15 SDS PAGE der Fraktionen der Ausschlusschromatographie von His hSGT Fusionsprotein ber eine Superdex 200 26 60 Die Fraktionen 32 52 enthalten das Fusionsprotein die zwei in Abb 4 13 darunterliegenden Proteinbanden sind auch auf diesem Gel gut zu erkennen SM self made Marker die Zahlen entsprechen den Fraktionen des Superdex 200 26 60 Gelfiltrationslaufes siehe Abb 4 14 Nach der Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein nach einer Inkubation der Ex pressionskultur be1 37 C konnte nur oligomerisiertes Fusionsprotein erhalten werden Wurde die Expressionskultur aber bei 20 C bis zur Ernte der Zellen inkubiert konnte auch dimerisiertes Fusionsprotein von der Gelfiltrationss ule eluiert werden Dieses dimerisierte Fusionsprotein wurde auf eine Konzentration von 16 mg ml ankonzentriert und f r Kristallisationsversuche eingesetzt siehe Abschnitt 4 3 4 2 1 4 Ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins unter Hochsalz Bedingungen Wie in Abbildung 4 14 zu sehen ist eluiert das His hSGT Fusionsprotein von der Su perdex 200 26 60 S ule in zwei Hauptpeaks Die Proteine im ersten Peak entsprechen oligomerisiertem His hSGT Fusionsprotein die im zweiten Peak dimerisiertem Fusi onsprotein Mit diesem Versuch soll getestet werden ob sich di
100. enden Proteins abgestimmt sind Durch Dialyse oder die Verwendung von Entsalzungss ulen k nnen Proteinl sungen entsalzt werden Mittels der Dialyse durch eine semipermeable Membran k nnen Proteine von kleineren Molek len Salzionen getrennt werden Die Ionen diffundieren in die umgebende L sung geringerer Salzkonzentration bis zur Einstellung des Konzentrationsgleichgewichts Entsalzungss ulen HiPrep 26 10 Desalting oder PD 10 funktionieren grunds tzlich 52 3 Material und Methoden wie Gelfiltrationss ulen Die Poren des Saulenmaterials sind kleiner um das Eindringen von Proteinen in die Gelmatrix zu verhindern Salzionen und andere niedermolekulare Molek le Elutionssubstrate von Affinitatschromatographien k nnen in diese Poren eindringen und ihre Elution wird dadurch verz gert Die S ule wurde mit dem Zielpuffer aquilibriert und die Proteinl sung aufgetragen Dann wurde mit dem Zielpuffer eluiert und das Eluat fraktioniert Die HiPrep 26 10 Desalting Saule von Amersham Pharmacia Biotech trennt 15 ml Proteinlosung von bersch ssigem Salz ab Zwei dieser S ulen wurden in Reihe geschaltet um 30 ml Rohextrakt mit MnmA ohne Affintatsequenz in hoher Salzkonzentration 300 mM NaCl in geeignete Puffer f r An oder Kationenaustauschchromatographie 100 mM NaCl zu berf hren PD 10 S ulen k nnen nur Proteinl sungen bis zu einem Volumen von 2 5 ml entsalzen Sie eignen sich daher um hochkonzentriertes aufgereinigtes Pr
101. enen Salze Puffer und Pr zipitantien var ert werden es k nnen aber auch Substitutionen getestet werden F r die Kristallisation im sog sitzenden Tropfen werden 24er Ansatz Kristallisationsplatten der Marke Cryschem Plate verwendet deren einzelne Kammern eine zentrale S ule mit dar n liegender Vertiefung dem sog well und ein darunter liegendes Reservoir besitzen In das Reservoir wird eine Bedingung vorgelegt die dann im Well mit dem Protein zu einem Tropfen vermischt wird Es besteht also ein Konzentrationsgradient an Salzen und Prazipitantien zwischen Tropfen und Reservoir da der Tropfen neben dem Protein nur 50 der Salz und Prazipitans Konzentration des Reservoirs enth lt Durch Diffusion des Wassers aus dem Tropfen in das Reservoir wird der Tropfen m Well nun langsam eingeengt und das enthaltene Protein ankonzentriert Wird dabei der Punkt der bers ttigung berschritten Es kann als Ausweg aus diesem metastabilen Zustand spontan eine Proteinkristallisationskeimung stattfinden Zun chst werden 500 ul der zu testenden Kristallisationsbedingung in das Reservoir pipettiert Aus diesem wird nun 1 ul entnommen und in den Well berf hrt Anschlie end wird 1 ul der Proteinl sung in den Well pipettiert und gut gemischt Schlie lich wird der Well mit Klarsichtklebeband verschlossen um einem Austrocknen vorzubeugen Der Tropfen wird n der ersten Woche t gl ch kontrolliert Danach wird 55 3 Material und Methoden
102. erweise durch SGT aktiviert werden kann Bei den meisten Chaperon unterst tzten Reaktionen ist die Hydrolyse von ATP essentiell Aps 2002 SGT ist ein ubiquitar exprimiertes und evloutionar konserviertes Protein Bisher wurden die Gene die fur das small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing SGT Protein codieren nur in eukaryotischen Organismen von Hefen ber Nematoden und Fliegen bis hin zu den S ugetieren gefunden Die Auswertung eines Sequenz Alignments von vier unterschiedlichen SGT Proteinen kann in Abschnitt 1 1 nachgelesen werden Uber die Biochemische Funktion des SGT Proteins in der Zelle ist bisher allerdings nur wenig bekannt Weiterhin ist auch unbekannt wo und durch welche Enzyme das SGT Protein in der Zelle posttranslational modifiziert wird und in 102 5 Diskussion wie weit Phosphorylierungen des SGT Proteins eine regulator sche Rolle spielen k nnen F r die Zielsetzung der Kristallisation des SGT Proteins kombiniert mit Untersuchungen zur Funktion des Proteins bietet sich deshalb eine Expression des eukaryotischen SGT Proteins in Hefezellen an Die Proteinexpression in Hefezellen kombiniert die Vorteile der Bereitstellung der meisten eukaryotischen post translationalen Modifikationen wie Phosphorylierung oder Glycosylierung mit hohen Expressionsraten die f r Kristallisationsversuche essentiell sind Auf diesem Weg k nnte auch die Problematik des vorzeitigen mRNA Abbaus in E coli BL21 DE3 RI
103. et al 2003 untersuchten die Polyadenylierung von mRNA in Bakterien denn Polyadenylierung von mRNA ist nicht nur ein eukaryotisches Ph nomen Sie fanden heraus dass polyadenylierte mRNA in Bakterien effizienter abgebaut wird als nicht modifizierte mRNA Wobei die mRNA Polyadenylierung in E coli st rker messbar ist in langsam wachsenden Kulturen Ein Vergleich der drei Proteinbanden auf einem SDS Gel nach der Aufreinigung ber eine Gelfiltrationss ule zeigt auch in den w hrend dieser Arbeit durchgef hrten Versuchen einen Unterschied in der Auspr gung der zwei zus tzlichen Proteinbanden im Vergleich zum gew nschten Volll ngen Fusionsprotein wenn die Expressionskulturen bei verschiedenen Temperaturen inkubiert wurden Bei den langsamer wachsenden Kulturen Expression bei 20 C f r etwa 12 Stunden siehe Abbildung 4 13 waren die beiden zus tzlichen Proteinbanden auf einem SDS Gel nach einer 1D Gelelektrophorese signifikant st rker ausgepr gt als in den schneller wachsenden Expressionkulturen Inkubation bei 37 C f r 4 Stunden siehe Abbildung 4 7 Auch wenn sich die Expressionsausbeute durch ein verlangsamtes Wachstum deutlich steigern l t ist bei der Expression des SGT Proteins aus den oben genannten Grunden von einer Erniedrigung der Inkubationstemperatur wahrend der Expression abzuraten Alle Versuche zur Abtrennung der zwei zus tzlichen Proteine aus dem Gesamtproteingemisch schlugen fehl Sie lie en sich weder durch A
104. fekten auf das Kristallwachstum Nach Zugabe des Additivs Mangan Chlorid konnte das zus tzliche Wachstum kleiner drei dimensionaler pyram denf rmiger Kristalle beobachtet werden Nach wie vor waren auch die nadelf rmigen Kristalle in den untersuchten Bedingungen wiederzufinden Die kleinen 3D Kristalle konnten durch eine Kombination der Techniken Micro und Macro Seeding vergr ert werden Nachdem s e eine Gr e erreicht hatten d e es erm glichte s e r ntgendiffraktometrisch zu untersuchen konnte nach einer Analyse der Reflexe auf dem Detektor ausgeschlossen werden dass es sich bei den Kristallen um Protein Kristalle handelt Sie zeigten das typische Muster f r Salzkristalle Nach dem Zusatz von Detergenzien in die Kristallisationstropfen konnten keine positiven Effekte auf das Kristallisationsverhalten des SGT Proteins beobachtet werden Auch wenn erste Raster Screens um die Ausgangsbedingung CS2 Nr 43 zu keinen Ver nderungen n der Kristallform f hrten scheint die verbesserte Bedingung von CS2 Nr 43 nach einer Verringerung der MPD Konzentration und des pH Wertes doch ein guter Ansatzpunkt f r weitergehende Kristallisationsscreens zu sein 5 5 Kristallisation des hSGT Proteins Die Kristallisation des hSGT Protein ohne Markierung blieb bislang erfolglos Auch die m glichen Proteinkristalle in der Bedingung CS2 Nr 43 des His hSGT Fusionsproteins lie en sich mit dem hSGT Protein ohne tag nicht reproduzieren
105. g der Myostatin Sekretion eine gro e Rolle als auch bei der Aktivierung der Skelettmuskel Zellen w hrend der Myogenese Wang et al 2003 15 1 Einleitung 1 4 3 4 Das SGT Proteins wird f r Zellteilungsprozesse ben tigt Eukaryotische Organ smen von Hefen ber Nematoden bis zu den S ugetieren enthalten das small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing SGT Protein Da TRP Dom nen zuallererst als Protein Interaktionsdom nen von Zellzyklus Proteinen cell division cycle proteins Cdc beschrieben wurden Hirano er al 19990 lag die Vermutung nahe dass auch SGT Proteine in diese Funktionen involviert sein konnten Untersuchungen zur Lokalisation des hSGT Proteins in den Zellen zeigten eine Akkumulation dieses Proteins in Strukturen welche f r die Zellteilung relevant sind wie z B in der Mittelzone oder an dem Mittelk rper des Spindelapparates Winnefeld er al 2003 Bei der Untersuchung von SGT Knock down Populationen stellte sich heraus dass eine drastische Verringerung des hSGT Proteins zu einer Reduzierung der Zellteilung f hrt Zellen dieser Knock down Populationen sind nicht in der Lage die Zellteilung zu vervollst ndigen Dies wird durch einen mitotischen Arrest ausgel st deren Folge der Zelltod ist 16 2 Zielsetzung 2 Zielsetzung der Arbeit Eine h ufig auftretende und bis heute noch nahezu unheilbare Tumorerkrankung ist das Glioblastom Trotz intensiver Forschung gibt es nur wenige Fortschr
106. gegeben und mit f nf S ulenvolumina gewaschen Das Saulenmaterial wurde dann in ein Falcon R hrchen berf hrt Dann wurden 20 ul PreScission Protease pro mg hSGT Protein zugegeben Das Fusionsprotein wurde ber Nacht bei 4 C bei stetiger Durchmischung auf einem Taumelrollenmischer geschnitten Nach dem Verdau wurde das Saulenmaterial zur ck n die Einweg Leers ule berf hrt mit zwei Volumina Waschpuffer gesp lt und so geschnittenes hSGT eluiert und fraktioniert Fraktionen aus Wasch und Elutionsschritten wurden ber SDS PAGE analysiert Bei der zweiten Methode wurde dem Fusionsprotein aus der Elution der GSH Sepharoses ule 20 ul PreScission Protease pro mg hSGT Protein zugegeben und analog zur ersten Methode verdaut Zur Trennung von hSGT GST GST hSGT Fusionsprotein und PreScission Protease wurde das Proteingemisch ber eine H Prep 26 60 Superdex 200 S ule von Amersham Pharmacia Biotech aufgereinigt Das His hSGT Fusionsprotein besitzt eine Faktor Xa Protease Schnittstelle Der His Tag wird am besten nach der Verwendung der Ni NTA Sepharoses ule durch Faktor Xa Protease Verdau abgetrennt Das Fusionsprotein aus der Elution der Ni NTA Sepharoses ule wurde zuerst ber eine Column PD 10 umgepuffert Faktor Xa Puffer 50mM Tris HCl pH 8 0 100mM NaCl lmM CaCl Anschlie end wuden zu 50 ug hSGT Protein je 1 U Faktor Xa Enzym zugegeben und die Ans tze bei verschiedenen Temperaturen ber Nacht inkubiert 3 2 5
107. hSGT Protein 1U Enzym pro 50 ug Prote in aufgetragen In Spalte 5 kann man von der Ni NTA Sepharoses ule eluiertes ungeschnitte nes hSGT Protein erkennen 14 4 Ergebnisse 4 2 1 6 Kontrolle des hSGT His Tag Fusionsproteins m Eluat der Ni NTA Sepharoses ule mittels Western Blot In Abbildung 4 17 kann man unterhalb der erwarteten hSGT His Tag Fusionsproteinbande noch zwei weitere Banden ca 32 und 35 kDa gro erkennen Um einen Hinweis zur Identit t dieser zwei Proteinbanden zu erhalten wurde ein Wes tern Blot durchgef hrt siehe Abschnitt 3 2 1 5 3 Mit dem Prim rantik rper anti 6His mouse konnte durch diesen Versuch gezeigt werden welche der von der Ni NTA Sepharoses ule eluierten Proteine einen His Tag besa en Gleichzeitig wurde auch das von der Superdex 200 26 60 eluierte hSGT His Tag Fusionsprotein unter sucht siehe Abbildung 4 15 Nach dem Western Blot sind auf der Membran zwei His markierte Proteinbanden deutlich zu erkennen Ihre Gr en betragen 37 und 32 kDa Zwischen diesen Prote inbanden ist noch eine weitere Bande sehr schwach auf der Membran zu erkennen Die Gr e dieses His markierten Proteins betr gt ca 35 kDa Abb 4 19 PVDF Membran nach Western Blot zur Detektion His markierter Proteine Auf der PVDF Membran s nd nach dem Anf rben zwei Protein Banden deutlich zu erkennen 37 und 32 kDa gro die dazwischenliegende Bande 35 kDa gro ist nur sehr schwach ausgepr gt
108. haperone gesteigert werden kann Auch die Abl sung des Substrates ist ATP abhangig und kann durch Cochaperone unterst tzt werden Hohfeld et al 1995 Bei den Hitzeschock Proteinen sowie auch dem Hsc70 bestimmen die jeweiligen Partnermolek le die genaue Art der Funktion des Komplexes HIP Hsc70 interacting protein und HOP Hsp70 and Hsp90 organizing protein sind gebunden wenn es um die Proteinfaltung geht CHIP C terminus of the Hsc70 interacting protein dagegen ist an das Hsc70 Protein gebunden wenn es um den Abbau von Proteinen geht Hohfeld et al 2001 Chaperone assistieren also nicht nur bei der Proteinfaltung wahrend der Neusynthese naszierender Polypeptidketten sondern auch bei der Erkennung denaturierter Proteine Sie identifizieren die missgefalteten Proteine und helfen bei deren Faltung oder sie machen sie der Proteolyse zuganglich Die Funktionen von Hsc70 im Cytosol sind vielf ltig Neben den bisher beschriebenen Beteiligungen an der Faltung und Degradation von Proteinen spielt es auch noch eine Rolle bei Transportprozessen von Proteinen in die Mitochondrien Stuart er al 1994 und es ist an der Regulation des Zellzyklus beteiligt Helmbrecht er al 2000 10 1 Einleitung Die Struktur des Hsc70 Proteins l t sich in drei funktionelle Bereiche einteilen siehe Abbildung 1 4 e Zum einen die hochkonservierte N terminale ATPase Dom ne e in der Mitte des Proteins ein konservierter Bereich mit der hydrophoben
109. i herangezogen 1 A 260 50 ug ml doppelstr ngige DNA 1 A 260 37 ug ml einzelstr ngige DNA Die Reinheit der Nukleins urel sung wird ber den Quotient der Extinktionen bei 260 nm und 280 nm ermittelt W hrend die aromat schen Basen der Nukleins uren ein Absorptionsmaximum von 260 nm und e n Halbmax mum bei 280 nm bes tzen absorbiert Tryptophan eine aromat sche Aminos ure der Proteine vor allem m Bereich von 280 nm Reine DNA liegt bei einem Quotienten von 1 8 bis 2 0 vor Mit Protein verunreinigte DNA Losungen besitzen einen kleinerem A260 A280 Quotienten 21 3 Material und Methoden 3 2 1 3 Ankonzentrieren von Proteinl sungen durch Zentrifugation Eine einfache Methode zum Ankonzentrieren von Proteinl sungen ist die Verwendung von sogenannten Centricons und Microcons Auf einen Zentrifugenbecher ist eine H lse gesteckt n deren unterem Drittel eine Membran mit bestimmter Porengr sse sitzt Diese Membran ist durchl ssig f r Wasser Ionen und kleine Molek le allerdings nicht f r Proteine d e gr er als der Ausschluss der Membran sind Durch Zentrifugation 3 000 4 500 g 4 C Zeit unterschiedlich k nnen Proteine auf diese Weise ankonzentriert werden In dieser Arbeit wurden Vivaspin Konzentratoren der Firma Vivascience verwendet 3 2 1 4 Gelelektrophoresen 3 2 1 4 1 Diskontinuierliche Polyacrylamid Gelelektrophorese von Proteinen SDS PAGE Die SDS PAGE nach Laemmli er al 1970 wird zu
110. ie Phosphodiesterbildung benachbarter Nukleotide eines DNA Stranges In der Natur spielen sie deshalb bei der DNA Replikation eine entscheidende Rolle Sie verkn pfen z B be1 der DNA Replikation die Okazaki Fragmente eines zum Mutterstrang neu gebildeten komplement ren Tochterstranges In der Molekularbiologie werden sie dazu benutzt komplementare sticky ends von DNA Fragmenten nach der Hybridisierung der berh ngenden Enden zu verkn pfen Sie erm glichen auf diese Weise das Einklonieren von Genen in ein geschnittenes Plasmid Ein typischer Ligationsansatz setzte sich wie folgt zusammen 0 2 ul T4 DNA Ligase 10 U ul 2 ul geschnittener Vektor 6 ul Insert verdautes Gen 2 ul T4 DNA Ligase Puffer 10x ad 20 ul ddH O Die Ligation wurde bei 4 C ber Nacht oder bei 16 C ber 3 6 Stunden durchgef hrt 38 3 Material und Methoden 3 2 2 2 Sequenzierung von DNA Fragmenten Die Sequenzierung von DNA wird mit der didesoxy Methode nach Sanger 1977 durchgef hrt Dabei werden bei der Amplifizierung der zu sequenzierenden DNA in einer PCR Kettenabbr che der Polymerase Reaktion durch den zuf lligen Einbau eines ddNTPs didesoxy Ribonukleosidtriphosphat erzeugt Hierzu werden vier PCR Ans tze mit dNTPs versetzt Eines der vier liegt jedoch nicht als dNTP sondern als ddNTP vor Da hier die 3 OH Gruppe fehlt kommt es zum Kettenabbruch Der Statistik folgend ist damit jedes m gliche auf das entsprechende ddNTP endende
111. ie sie auch homotypische Dimere ausbilden k nnen Tobaben er al 2003 N TPR1 TPR2 TPR3 NP und Q reich C Abb 1 2 Schematischer berblick ber die einzelnen Dom nen des SGT Proteins Im N Terminus ist eine m gliche coiled coil Dom ne CC eingezeichnet Die drei TPR Motive der TPR Dom ne finden s ch in der Mitte des Proteins und am C Terminus findet sich eine glutamin reiche Dom ne innerhalb derer sich auch vier Asparagin Prolin Motive NP Motive befinden Nach Tobabaen et al 2002 F r einen genaueren berblick ber die Sekund rstruktur des hSGT Proteins wurde dessen Aminos uresequenz mit Hilfe des Programms PSIpredict untersucht 5 1 Einleitung cont 313533132333333333333 gt 3 gt 3332 333333333 Prec u TEE EEE Pred CCHHAHAAHAAAAHAHAAAAAACC CHAHAACCHAHAAAAHR AA MDITKKRRLA YATIQF LADQ LRAGG LSSDAQESLE VAIOC LE 10 20 30 40 cont 3939252312533333333333333333333233333233 8 Prod E Pred AAAHCCCCCHAAAHAAAAA AHAARA HARAR AR AAA HAAH AHA AA TAFCWVTVEDSDLALPFOTLFEIFEAAATGEEMPFOULFSF AR 50 60 TO SO cont a9939299999999999999999290999909990093354 Pred gt Fred ACHARAACCRHARRARARAARARAARAARACCARARARARRAAARRARAR AA TPPSEEDS AEAER LE TEGHEOME VEIMFE AAVHF YCRAIEL 30 100 110 120 con 1029222392233339232 gt 23233327332232252331392X Fred Pred CCC CHARARAARARAAAAARAACCHAAARAAARARAARAACCCCAA AA NPATAVYF CITRAAAYSKLGITYAGAVQDCERAIC IDPAYSEK 130 130 150 160 cont 19199
112. iert Schantl et al fanden 2003 heraus da sowohl der Vorl ufer als auch die endg ltige Form des Rezeptors mit dem SGT Protein interagieren Diese Interaktion des SGT Proteins mit dem UbE Motiv wird von dem ersten TPR Motiv des small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing protein vermittelt und ist unabh ngig von einer Ubiquitin Konjugation Schantl er al 2003 1 4 3 3 Interaktion des SGT Proteins mit Myostatin Myostatin gehort zu einer Gruppe von Proteinen die bei der Regulation des Zellwachstums eine Rolle spielen sogenannte TGF transforming growth factor Proteine Es wird in den Muskelzellen gebildet und begrenzt deren Wachstum Die Differenzierung von Satellitenzellen in der Skelettmuskulatur zu Muskelzellen wird durch Myostatin gehemmt Carlson et al 1999 Unter Zuhilfenahme eines Yeast two hybrid Systems wurde hSGT als Myostatin assozilertes Protein identifiziert und die Interaktion zwischen beiden Proteinen wurde anschlieBend durch Pull down Assays bestatigt Fur diese Interaktion ist die N terminale Region des Myostatin Proteins und die C terminale Dom ne von Aminos ure 158 313 des SGT Proteins n tig Innerhalb dieser Sequenz befindet sich auch das dritte und damit letzte TPR Motiv von SGT Der C Terminus ohne das dritte TPR Motiv besitzt nicht die M glichkeit mit dem Myostatin Protein zu interagieren Das small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing Protein spielt sowohl bei der Vermittlun
113. iger Affinit tschromatographie F r die pr parative ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins aus der Affinitatschromatographie wurde wie unter Abschnitt 3 2 4 1 3 beschrieben verfahren F r diesen Reinigungsschritt wurde eine Superdex 200 S ule 66 4 Ergebnisse HiLoad 26 60 verwendet Durch die Verwendung einer Gelfiltration als letzten Rei nigungsschritt kann das zu kristallisierende Protein zeitgleich in einen entsprechenden Puffer berf hrt werden Dieser Schritt erspart eine abschlie ende Umpuffe rung Dialyse des Proteins Von dem His hSGT Fusionsprotein wurde nach der Ankon zentrierung auf 2 mg ml siehe Abschnitt 4 2 1 2 1 ml auf die Gelfiltrationss ule aufge tragen siehe Abbildung 4 10 Die blaue Kurve entspricht der UV Absorption bei 280 nm und die rote Kurve der Leitf higkeit 0S Norlaw05 1_UV 2003Nor aro 005 1_ Cand 2003Nor Lar 5 1_Canc 2008 Now 20005 1_Fractions 2003Nor12r0005 1_Logbodk 20 Abb 4 10 Elutionsprofil einer Gelfiltration von His hSGT Fusionsprotein ber eine Su perdex 200 26 60 S ule In diesem Versuch wurden 1 ml Fraktionen gesammelt Die Fraktionen 165 175 enthalten das hSGT His Tag Fusionsprotein siehe Abb 4 11 Blau UV Absorption bei 280 nm Rot Leitf hig keit SM 130 165 170 172 175 180 185 al O2 von lt His hSGT Fusionsprotein 15 Abb 4 11 SDS PAGE der Fraktionen der Ausschlusschromatographie von His hSGT
114. igung von His hSGT Fusionsprotein nach Inkubation der Expressionskultur bei 20 C nach Induktion Affinitatschromatographische Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein Ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins nach vorheriger Affinitatschromatographie Ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins unter Hochsalz Bedingungen Versuch zur Spaltung des His hSGT Fusionsproteins durch das Enzym Faktor Xa in His Tag und hSGT Kontrolle des hSGT His Tag Fusionsproteins 1m Eluat der Ni NTA Sepharosesaule mittels Western Blot Expression und Aufreinigung des hSGT Proteins ber den pGEX6P1 1 Expressionsvektor mit anschlie ender Abspaltung des GST Tag mittels PreScission Protease berexpression von GST hSGT Fusionsprotein in E coli und Affinitatschromatographische Aufreinigung Ausschlusschromatographische Aufreinigung des hSGT Proteins Proteolytische Spaltung des GST hSGT Fusionsproteins durch PreScission Protease in hSGT und GST Tag Ausschlusschromatographische Aufreinigung des hSGT Proteins nach vorherigem PreScission Protease Verdau Kristallisation des hSGT Proteins und des His hSGT Fusions proteins Kristallisation des His hSGT Fusionsproteins Kristallisation des oligomerisierten His hSGT Fusionsproteins Kristallisation des dimerisierten His hSGT Fusionsproteins Kristallisation des hSGT Proteins 64 65 67 67 69 70 73 74 74 75 78 79 80 82 83 83
115. in 2 Denaturierung 94 C 30s 3 Hybridisierung 56 C 30s 4 Elongation 72 C 2min Schritte 2 4 30x wiederholen 5 Elongation 72 C 7min 6 Pause 4 C F r die Klonierung der Gensequenz f r das zu untersuchende Protein in Vektoren enthalten die Primer normalerweise bereits die Sequenzen f r die 5 und 3 Restriktionsschnittstellen mit deren Hilfe das korrekte Einpassen der DNA Sequenz in den Zielvektor gelingt Bei der Umklonierung eines Gens von einem Vektor in den anderen k nnen diese Restriktionsschittstellen f r den Zielvektor entweder durch Primer in der PCR eingef hrt werden oder sie werden durch einen Zwischenklonierungsschritt aus einem weiteren Vektor in den Zielvektor eingeschleppt Um den Einbau eines Inserts n einen Vektor nach einer erfolgreichen Transformation eines Bakterienstammes mit diesem Vektor zu untersuchen kann eine Kolonie PCR durchgefuhrt werden Die einzelnen transformierten Kolonien auf einer Selektionsplatte konnen so auf das richtige Insert untersucht werden Alternativ kann auch eine Test Restriktion durchgefuhrt werden Die mit Restriktionsenzymen geschnittene DNA wird in einem Agarosegel aufgetrennt und das so erhaltene Bandenmuster wird dann mit dem erwarteten Bandenmuster verglichen 3 2 2 1 2 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Basensequenzen in DNA Doppelhelices und hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen zwischen zwei
116. in welches als His hSGT Fusionsprotein berexprimiert wurde TIT dd 4 _ u L 62 4 Ergebnisse Nach erfolgter Auftrennung in einem 12 5 igen SDS Gel kann in dem induzierten Lysat ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 37 kDa identifiziert werden Dieses fehlt in den nichtinduzierten Zellen 4 2 1 2 Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein nach Inkubation der Expressionskultur bei 37 C nach Induktion 4 2 1 2 1 Affinit tschromatographische Aufreinigung von His hSGT Fusionsprotein Der erste Reinigungsschritt erfolgte ber die HiTrapChelating Ni NTA Sepharose S ule nach der n Abschnitt 3 2 4 1 1 beschriebenen Methode F r die Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins wurde ein Zellsediment aus Liter Bakterienkultur re suspendiert und die Zellen mit einer Kombination aus enzymatischer Lyse Ultraschall und mechanisch durch pneumatische Zelldesintegration Fluidizer aufgebrochen In diesem Fall wurde die Expressionskultur nach der Induktion bei 37 C f r 4 Stunden inkubiert Nach Zentrifugation wurden berstand und Zellpellet getrennt Das Fusions protein aus dem proteinreichen Zell berstand wurde anschlie end ber eine HiTrapChelating Ni NTA Sepharose Saule aufgereinigt Die Abbildung 4 6 zeigt ein typisches Chromatogramm einer solchen Aufreinigung HiTrap imlHs002 1 _UWA _280nm HTrapimlHis002 1_Cond HiTrap imiHis002 1_Cond HTrapimlHsf02 1_Cone
117. ine k nnen mit Coomassie Brilliant Blue G250 sichtbar gemacht werden wobei die Nachweisgrenze bei 0 3 ug Protein je Bande liegt Das Gel wird nach der Elektrophorese 1m Coomassie Farbebad mindestens 30 min inkubiert intensivere Banden k nnen mit mehrmaliger F rbung und Entfarbung oder einer F rbung ber Nacht 12 16 h erzielt werden Anschlie end wird das Gel unter mehrfachem Erneuern des Entfarbebads mehrere Stunden entfarbt Gestoppt wird der Entf rbevorgang mit 5 Essigs ure oder Wasser Farbelosung Entf rbel sung 0 2 w v Coomassie Brilliant Blue R250 45 v v Ethanol 0 05 w v Coomassie Brilliant Blue G250 10 v v Essigs ure 42 5 v v Ethanol 5 v v Methanol 10 v v Essigs ure Alternativ kann das SDS Gel in einer L sung von 10 Ethanol 5 Essigs ure und 0 002 Coomassie Brilliant Blue G 250 uber Nacht gefarbt werden 31 3 Material und Methoden 3 2 1 5 2 Anfarben von Nukleins uren mit Ethidiumbromid Elektrophoretisch aufgetrennte Nukleins uren k nnen mit Ethidiumbromid m UV Licht sichtbar gemacht werden Hierzu wurde das Gel 15 30 min m Ethidiumbromidbad mit 0 5 ug ml Ethidiumbromid inkubiert und anschlie end unter UV Licht bei 254 beziehungsweise 365 nm detektiert Ethidtumbromid interkaliert in die DNA und fluoresziert dabei intensiv orange Bei 365 nm wird vor allem DNA detektiert die noch f r weitere Reaktionen zur Verf gung stehen soll also z B durch Restriktio
118. innerhalb des Viererkomplexes sprechen Die Ergebnisse lassen vermuten dass zwei SGT Dimere innerhalb derer die Proteine spezifisch miteinander interagieren unspezifisch zu einem Tetramer ber hydrophobe Wechselwirkungen aggregieren Dee Expression und Aufreinigung des GST hSGT Fusionsproteins mit anschlieBender Spaltung in GST tag und hSGT Protein Um einen Hinweis zu bekommen welcher E coli Stamm fur die Expression des GST hSGT Fusionsproteins geeignet ist wurde eine Analyse der Codon Usage vorgenommen Die graphischen Auswertungen dieser Untersuchungen k nnen m Anhang siehe Anhang 8 2 und 8 3 nachgeschlagen werden Die Codon Usage beschreibt das Ph nomen dass Varianten des universellen genetischen Codes von verschiedenen Spezies unterschiedlich verwendet werden Das hei t bestimmte Codons des degenerierten Codes werden bevorzugt benutzt was letztlich der tRNA Konzentration innerhalb der Zelle entspricht Die Codon Usage spielt eine gro e Rolle bei der Regulation der Proteinbiosynthese Selten verwendete Codons k nnen die Translation bremsen w hrend h ufig genutzte Codons die Translation beschleunigen k nnen Bei der gentechnischen Produktion eukaryotischer Proteine n Prokaryoten kann es daher von Vorteil sein einen Expressionsstamm auszuw hlen welcher die Expression von Genen erlaubt die f r tRNAs f r seltene Codons kodieren F r die Expression des GST hSGT Fusionsproteins wurden zwei unterschiedliche E coli St
119. it vorgespann tem Polarisationsfilter ber Nacht waren in dieser Bedingung kleine nadelf rmige Kristalle gewach sen Jede einzelne Nadel dieses Sterns hat eine L n ge von ca 20 uM und eine Breite von 1 2 uM Bedingung im Tropfen 100 mM Tris HCl pH 8 5 50 v v MPD 200 mM Ammonium Phosphat Proteinkonzentration im Tropfen 8 mg ml Temperatur 20 C Da die Kristalle f r eine Vermessung im Diffraktometer zu klein waren und sie auf grund ihrer geringen Gr e auch nicht ber SDS PAGE analysiert werden konnten wurde versucht ihr Gr enwachstum zu verbessern Durch ein systematisches Raster von Bedingungen die sich geringf gig in ihren Salz und Prazipitanskonzentrationen unterschieden wurde versucht eine Bedingung zu finden bei der sich die Kristalle ver gr ern lie en Auch die pH Werte und die Pufferzusammensetzungen wurden ver n dert Salze wurden durch andere Salze mit hnlichen Ionenradien ersetzt 84 4 Ergebnisse Hierbei stellte sich heraus dass die Kristalle nach geringf gigen nderungen der Ein gansbedingungen in CD2 Nr 43 auf 30 MPD 0 1 M Tris HCl pH 8 0 und 0 2 M NH 2HPOs etwas verbessertes Gr enwachstum zeigten siehe Abbildung 4 28 Abb 4 28 Nadelf rmige Kristalle in der ange passten Bedingung CS2 Nr 43 Aufnahme mit einer Digitalkamera mit vorgespann tem Polarisationsfilter Uber Nacht waren in dieser Bedingung nadelf rmige Kristalle gewachsen Jede einzelne Nadel
120. itte in der Behandlung dieses malignen Gro hirntumors Derzeit wird ein neuer Behandlungsansatz erforscht bei dem Tumorzellen durch Injektion von Parvoviren abget tet werden sollen In Untersuchungen konnte gezeigt werden dass Parvoviren Wachstum und Etablierung experimentell induzierter Tumoren hemmen k nnen Guetta et al 1986 und Dupressior et al 1989 Warum Parvoviren in der Lage sind Tumorzellen abzut ten ist noch nicht gekl rt vermutlich h ngt diese F higkeit aber mit einem bestimmten viralen E wei stoff dem Nicht Strukturprotein 1 NS1 zusammen Herrero Y Calle et al 2004 und Steiner et al 2004 NSI ist der wichtigste regulatorische Faktor autonomer Parvoviren und tr gt essentiell zur viralen DNA Replikation Genexpression und Virus vermittelte Zytotoxizitat bei Tullis et al 1988 Zellul re Proteine die mit NS1 interagieren stellen somit auch potentielle Zielmolek le fur die Krebstherapie des Glioblastoms mit Hilfe autonomer Parvoviren dar 1998 wurde das SGT Protein von Cziepluch er al unter zu Hilfenahme eines Yeast two hybrid Systems als Interaktionspartner von NS1 identifiziert Cziepluch et al 1998 SGT ist eine Abk rzung f r small glutamine rich tetratricopeptide repeat TPR containing Protein An Hand von GST Pulldown Assays konnte eine direkte Interaktion von NS1 mit dem SGT Protein nachgewiesen werden Kordes et al 1998 SGT ist ein ubiquita r exprimiertes und evloution r konserviertes Protei
121. k Monomer Blau UV Absorption bei 280 nm Rot UV Absorption bei 280 nm Braun Leitfahigkeit 13 4 Ergebnisse Das Elutionsprofil des Gelfiltrationslaufes zeigt zwei Hauptpeaks Fraktionen 12 14 Nach der Analyse der Fraktionen in einem 12 5 igen SDS Gel kann man erkennen dass n beiden Peaks das GST hSGT Fusionsprotein eluiert siehe Abbildung 4 23 Die mit Hilfe der Kalibrierung in Anhang 8 4 berechnete Gr e der Proteine aus dem ersten Peak Elution nach 11 5 ml entspricht dimerisiertem Fusionsprotein mit einer Gr e von etwa 130 kDa Die berechnete Gr e der Proteine aus dem zweiten Peak Elution nach 13 ml entsprechen monomerem GST hSGT Fusionsprotein mit einer Gr e von ca 60 kDa Auch wenn monomeres SGT Protein von dieser S ule eluiert werden kann besteht es dennoch aus einer Mischung verschiedengro er Proteine Der Gr enunterschied der verschiedenen SGT Proteine ist so gering dass sie ber eine S200 Gelfiltrationss ule nicht getrennt werden k nnen lt GST hSGT Fusionsprotein Abb 4 23 SDS PAGE der Fraktionen der Ausschlusschromatographie von GST hSGT Fusionsprotein tiber eine Superdex 200 10 30 Saule BR broad range Marker die Zahlen entsprechen den Fraktionen des Superdex 200 10 30 Gelfiltrationslaufes siehe Abb 4 16 Alle relevanten Fraktionen wurden 2 mal auf das 12 5 ige SDS Gel aufgetragen In beiden Hauptpeaks finden sich neben dm GST hSGT Fusionsprotein auch zwei weiter
122. lasmamembran Nahr und Botenstoffe aufnehmen kann Die so entstehenden endozytotischen Transportvesikel verschmelzen anschlieBend mit endosomalen Kompartimenten Im Vergleich zur Endozytose werden bei der Exozytose durch Verschmelzung von sekretorischen Vesikeln mit der Plasmamembran Proteine und Lipide in die Plasmamembran eingebaut Diese k nnen durch Endozytose wieder in die Zelle aufgenommen und durch erneuten Einbau in neue sekretorische Vesikel wiederverwendet werden Hierf r schn ren sich zuerst intrazellulare Transportvesikel TV von der Plasmamembran ins Zellinnere ab und fusionieren anschlie end mit einem fr hen Endosom in dem der Vesikelinhalt und die Membranbestandteile sortiert werden Das Recycling zur Plasmamembran erfolgt vom fr hen Endosom uber ein Recycling Endosom Zur Degradation werden die Substanzen ber ein sp tes Endosom zum Lysosom transportiert Stryer 1994 14 1 Einleitung Das Wachstumshormon Growth Hormone GH wird n der Hypophyse hergestellt freigesetzt und reguliert z B den Wasserhaushalt die Kohlenhydrat Konzentration und die EiweiB Bilanz Die Aktivit t von GH h ngt aber nicht nur von der Anwesenheit des Hormons ab sondern auch von der Verf gbarkeit seines Rezeptors Schantl er al 2003 Die Endozytose des growth hormone receptor GHR wird von dem ubiquitin conjugating System einem cytosolischem zehn Aminos ure gro em Motiv dem ubiquitin dependent endocytosis UbE Motiv regul
123. li M G Yahara I and Baulieu E E 1997 Phosphorylation of the immunosuppressant FK506 binding protein FKBP52 by casein kinase II regulation of HSP90 binding activity of FKBP52 Proc Natl Acad Sci USA 94 26 14500 14505 Mullis K Faloona F Scharf S Saiki R Horn G and Erlich H 1986 Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 1 263 273 Nuesch J P Cotmore S F and Tattersall P 1995 Sequence motifs in the replicator protein of parvovirus MVM essential for nicking and covalent attachment to the viral origin identification of the linking tyrosine Virology 209 1 122 135 Pai M Yang C Tzeng S Wang C and Cheng J 2003 Letter to the Editor H PN and C resonance assignments of the Tetratricopeptide Repeat TPR Domain of hSGT J Biomolecular NMR 26 381 382 Saiki R K Scharf S Faloona F Mullis K B Horn G T Erlich H A and Arnheim N 1985 Enzymatic amplification of beta globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 230 1350 1354 Sambrook J Fritsch E F and Maniatis T Hrsg 1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual 2 Edition Cold Spring Habour Laboratory Press New York Sanger F Nicklen S and Coulson A R 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 74 12
124. mente wurden wie folgt durchgef hrt Der Proteinkristall wurde mit einer kleinen Schlinge aus dem Kristallisationstropfen entnommen und vor den Strahlengangverschluss des Diffraktometers gespannt Dabe wurde der Kristall in einem Stickstoffgasstrahl gek hlt und anschlie end der R ntgenstrahlung ausgesetzt Der Kristall rotierte dreidimensional um vorher definierte Gradzahlen um so durch die Drehung der theoretischen Ebenen durch den Kristall ein Beugungsspektrum zu erhalten F r Testzwecke also um zu verifizieren ob der Kristall aus Protein oder Salz besteht wurde er um 5 Grad binnen einer Minute gedreht Das Beugungsmuster wurde ber einen strahlungssensitiven Schirm detektiert und am PC ausgewertet 57 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse Der Ergebnisteil gliedert sich n drei Abschnitte wobei m ersten Teil erl utert wird wie die Umklonierung von hSGT aus pET16b in pET28a bzw pGEX6P1 1 durchge f hrt wurde Im zweiten Teil werden unterschiedliche Expressions und Aufreinigungsstrategien be schrieben um das hSGT Protein n ausreichender Menge und Reinheit fur die Kristalli sation zu gewinnen Der dritte Teil stellt schlieBlich die Kristallisationsversuche mit aufgereinigtem hSGT Protein bzw His hSGT Fusionsprotein dar 4 1 Umklonierung von hSGT aus pET16b in pET28a und pGEX6P1 1 Um das Ziel dieser Arbeit zu erreichen die Kristallisation des hSGT Proteins wurden zwei unterschiedliche Wege eingeschlagen Zum einen di
125. mit Untersuchungen zur Funktion des Proteins bietet sich deshalb eine Expression des eukaryotischen SGT Proteins in Hefezellen an Die Proteinexpression in Hefezellen kombiniert die Vorteile der Bereitstellung der meisten eukaryotischen post translationalen Modifikationen wie Phosphorylierung oder Glycosylierung mit hohen Expressionsraten die f r Kristallisationsversuche essentiell s nd 106 6 Zusammenfassung 6 2 Summary The glioblastoma is a frequently occurring tumor which is nearly incurable despite intensive research Injection of parvoviruses has been developed as a treatment strategy The ability of parvoviruses to restrain growth and establishment of experimentally induced tumors is probably connected to the non structure protein 1 NS1 the presumably most important regulatory factor of autonomous parvoviruses Cellular proteins interacting with NS1 thus represent potential target molecules for the treatment of glioblastoma with autonomous parvoviruses One of those cellular interacting factors identified for the NS1 is the SGT protein which is the focus of this work The intention of this diploma work was the establishment of a proper strategy for expression and purification of the humane SGT protein Subsequently crystallization experiments should be carried out followed by X ray diffraction for clarification of the 3D structure of the hSGT protein Different expression and purification strategies were established to prod
126. n Seit 1998 als Cziepluch et al eine SGT kodierende cDNA aus einer Fibroblasten cDNA Bank der Ratte isolierten wurden bereits einige Interaktionspartner des SGT Proteins identifiziert dennoch blieben viele Fragen zur Funktionsweise des Proteins offen Ein wichtiger Schritt bei der Untersuchung des SGT Proteins welcher gleichzeitig zur Aufkl rung molekularer Mechanismen beitragen kann ist die Aufkl rung seiner drei dimensionalen Struktur Das Ziel dieser Arbeit bestand zuallererst in der Etablierung einer geeigneten Expressions und Aufreinigungsstrategie f r das humane SGT Protein in E coli Das Protein sollte in ausreichender Menge und m glichst frei von Kontaminationen durch Fremdprotein hergestellt werden k nnen Zum Erhalt einer drei dimensionalen Struktur des SGT Proteins sollten Kristallisationsversuche durchgef hrt werden um anschlie end mittels R ntgenbeugungsexperimenten Daten f r die Strukturaufkl rung zu erhalten 3 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3 1 Material 3 1 1 Feinchemikalien Standardchemikalien organische Substanzen und L sungsmittel wurden von verschiedenen Firmen bezogen und besitzen den Reinheitsgrad pro analysis oder 7 66 reinst Acrylamid Bisacrylamid Rotiphorese Gel 30 Agar Agar Agarose NEEO Ultra APS Ammoniumperoxidsulfat Ammoniumsulphat Borsaure Bromphenolblau Calciumchlorid Coomassie Brillant Blue G250 R250 DMSO Dimethylsulfoxid DTT 1
127. n der GST Tag von dem berexprimierten Protein abge trennt werden Das hSGT Protein ohne Tag besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von 34 kDa und besteht aus 313 Aminos uren siehe Anhang 8 1 Durch den kurzen Linker zwischen PreScission Protease Schnittstelle und Ndel Restriktionsschnittstelle erh ht sich die Lange des Proteins auf 322 Aminos uren und das Molekulargewicht auf 35 kDa siehe Anhang 8 1 F r die Herstellung des His hSGT Fusionsproteins wurde pET16b als Expressionsvek tor verwendet Der His Tag dieses Vektors besteht aus 10 Histidinen und ist uber einen kurzen Linker inklusive Faktor Xa Protease Schnittstelle mit dem inserierten Protein verkn pft Das His hSGT Fusionsprotein besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von 37 kDa und besteht aus 334 Aminos uren s ehe Anhang 8 1 61 4 Ergebnisse 4 2 1 Expression und Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins ber den pET16b Expressionsvektor 4 2 1 1 Uberexpression von His hSGT Fusionsprotein in E coli Zur berexpression des humanen SGT Proteins als His hSGT Fusionsprotein wurde der Vektor pET16b welcher das Gen des hSGT Proteins enthielt in kompetente E coli Zellen des Stammes BL21 DE3 transformiert Nach Ausstrich auf entsprechende Mar kerplatten wurden die rekombinanten Bakterien zur berexpression verwendet Fur die Expression wurden jeweils 20 ml Vorkultur zu einem Liter LB Medium mit Ampicillin gegeben Die Expressionskultur wurde dann bei 37
128. n die Fraktionen siehe Abb 4 8 FP bezeichnet das Fusionsprotein vor dem Auftrag auf die ResourceQ S ule BR bezeichnet den broad range Marker Die blauen Zah len beziehen sich auf die Markerbanden Die Elution des His hSGT Fusionsproteins findet haupts chlich in den Fraktionen 10 14 statt Auf dem 12 5 igen SDS Gel kann man deutlich erkennen dass die zwei zus tzlichen Banden unterhalb der hSGT His Tag Fusionsproteinbande nicht ber diesen Reini gungsschritt abzutrennen waren Auch wenn es auf dem Chromatogramm des Resour ceQ S ulenlaufes auss eht als w ren zwei Proteine in den beiden Hauptpeaks vonein ander getrennt worden zeigt die Auftrennung der Elutionsfraktionen in einem SDS Gel dass in allen Fraktionen die drei Proteinbanden wiederzufinden sind Aus diesem Grund wurde bei spateren Aufreinigungen auf diesen Reinigungsschritt verzichtet um Verluste an Protein wahrend der Aufreinigung gering zu halten Auch durch eine Anionenaustauschchromatographie ber eine Mono Q HR 16 10 S ule und durch eine Hydrophobe Interaktionschromatographie des hSGT Proteins mittels einer Phenylsepharose Saule HiLoad 26 10 lieBen sich die beiden 32 und 35 kDa gro Ben Proteine nicht von dem hSGT Protein abtrennen Um die Proteinverluste wahrend der Aufreinigung gering zu halten wurde auch auf diese Reinigungsschritte im weiteren Verlauf verzichtet 4 2 1 2 3 Ausschlusschromatographische Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins nach vorher
129. n die Kristallisationskeime wie beim Macro Seeding in neue Tropfen berf hrt Auch hier gilt dass entweder Prazipitans oder Proteinkonzentration verringert sein sollten 3 2 5 3 Rontgenbeugungsexperimente Fur die Durchf hrung eines R ntgenbeugungsexperimentes mit einem Proteinkristall wird dieser in einem R ntgendiffraktometer mit R ntgenstrahlen beschossen die durch die Elektronen im Kristallgitter abgelenkt werden Da im Kristallgitter sich jede Struktur die gr er als die Einheitszelle ist sich durch Translation oder Additionen dieser Einheitszelle erzeugen l sst und dadurch eine unendliche Periodizitat entsteht werden die R ntgenstrahlen an theoretischen Ebenen durch den Kristall gebeugt Das aus einem R ntgenbeugungsexperiment resultierende Beugungsmuster stellt daher viele 56 3 Material und Methoden einzelne Punkte dar die durch eine reverse Fourier Transformation die Raumkoordinaten der theoretischen Ebenen genauer die Schnittstellen dieser Ebenen mit den drei Raumachsen wiedergeben an denen der R ntgenstrahl gebeugt wurde So kann aus einem Datensatz mit vielen solcher R ntgenbeugungsmuster eine so genannte Elektronendichtekarte der Einheitszelle 1m Kristall erstellt werden In dieses wird durch PC Analysemethoden die Aminos uresequenz des Proteins eingebaut so dass schlieBlich eine dreidimensionale Struktur des untersuchten Proteins auf atomarer Ebene dargestellt werden kann Die R ntgenbeugungsexperi
130. n in Escherichia coli EMBO reports 4 2 172 177 Jacoby R O Johnson E A Ball Goodrich L Smith A L and McKisic M D 1995 Characterization of mouse parvovirus infection by in situ hybridization J Virol 69 6 3915 3919 Kordes E Savelyeva L Schwab M Rommelaere J Jauniaux J and Cziepluch C 1998 Isolation and Characterization of Human SGT and identification of Homologues in Saccheromyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Genomics 52 90 94 Laemmli U K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227 680 685 Lehninger A L Nelson D L und Cox M M 1994 Prinzipien der Biochemie Spektrum akademischer Verlag GmbH 2 Auflage 111 7 Literaturverzeichnis Liu F Wu S Hsiao C and Wang C 1999 Specific Interaction of the 70 kDa Heat Shock Cognate Protein with the Tetratricopeptide Repeats J Biol Chem 274 48 34425 34432 Main E R G Xiong Y Cocco M J D Andrea L and Regan L 2003 Design of Stable a Helical Arrays from an Idealized TPR Motif Structure 11 497 508 Mastrogiacomo A Parsons S M Zampighi G A Jenden D J Umbach J A and Gundersen C B 1994 Cysteine string proteins a potential link between synaptic vesicles and presynaptic Ca2 channels Science 263 5149 981 2 Miyata Y Chambraud B Radanyi C Leclerc J Lebeau M C Renoir J M Shirai R Catel
131. ndere Strukturen die zur Kristallbildung f hren k nnen gefunden In vielen Bedingungen konnte eine Phasenseparation beobachtet werden Bei diesem Ph nomen kann das Protein innerhalb der l Tr pfchen sehr stark konzentriert sein und oft erscheinen nach einiger Zeit Kristalle in diesen Bedingungen Aber auch Pha senseparation f hrte schlussendlich zu keiner Kristallbildung in den untersuchten Be dingungen 87 5 Diskussion 5 Diskussion Die hier vorliegende Arbeit zielte auf die Aufklarung der drei dimensionelen Struktur des humanen small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing SGT Proteins ab Das Interesse an der drei dimensionalen Struktur liegt darin begr ndet dass man hofft man auf diese Weise zur Aufklarung der Funktion des SGT Proteins beitragen zu k nnen Denn bisher ist nur sehr wenig ber die Bedeutung und Funktion des SGT Proteins bekannt Um dieses vorgegebene Ziel zu erreichen musste zuerst eine Expressions und Aufreinigungsstrategie fur das humane SGT Protein etabliert werden welche es erm glicht das hSGT Protein in ausreichender Menge und Reinheit fur die Kristallisationsversuche herzustellen Im Hinblick auf die abschlie enden Kristallisationsversuche wurden zwei Expressionstrategien verfolgt Zum einen wurde mit His markiertes hSGT Protein aufgereinigt und zur Kristallisation verwendet und zum anderen wurde hSGT Protein ohne tag hergestellt und in Kristallisationsversuchen eingesetzt Na
132. ne 68 4 Ergebnisse HiTrapChelating Ni NTA Sepharose Saule aufgereinigt Die Abbildung 4 12 zeigt ein typisches Chromatogramm einer solchen Aufreinigung Die blaue Kurve zeigt die UV Absorption 280 nm in Korrelation zum Volumen der eluierten Probe Die gr ne Kurve zeigt den Elutionsgradienten in Prozent Imidazol an Das hSGT His Tag Fusionsprotein eluiert bei etwa 250 mM Imidazol Simone HiTrapSm Gradient001 1_UV1_280nm I Simone HTrapSmi Gradient00121_Cond Simonet H TrapSmi Gradient001 1_Cond Simone HiTrapSm Gradient001 1_Conc Simene HiTrapsm GradientDD1 1_Fratins Simone HiTrapsm GradentDD1 1_Inject 1500 1000 ee 7 8 410 11 121814 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 321 32 24425 37 ba Waste 50 100 150 mi Abb 4 12 Chromatogramm einer Affinit tschromatographie von His hSGT Fusionsprotein ber eine Ni NTA Sepharose S ule E coli eigene Proteine mit mehreren Histidinen binden unspezifisch an die S ule werden aber erwartungsgem bereits durch den ersten Gradientenschritt 0 120 mM Imidazol eluiert Fraktionen 11 12 Das His hSGT Fusionsprotein eluiert im zweiten Gradientenschritt von 120 360 mM Imi dazol bei etwa 250 mM Imidazol Fraktionen 18 30 Blau UV Absorption bei 280 nm Braun relative Leitf higkeit Gr n Elutionsgradient 20 400 mM Imidazol Einige Fraktionen wurden zur Analyse auf ein 12 5 iges SDS Gel aufgetragen siehe Abb
133. ng heterooligomere Komplexe aus etwa achtzehn SGT Proteinen bildet Das Eluat von der Gelfiltrationss ule wurde mittels SDS PAGE untersucht siehe Ab bildung 4 17 In Abbildung 4 17 kann man unter der His hSGT Fusionsproteinbande wieder sehr deutlich zwei weitere Banden erkennen mir Gr en von 35 und 32 kDa Auch h here Salzkonzentrationen bis zu 2 M NaCl k nnen diese Proteine w hrend eines Gelfiltrationslaufes nicht von dem His hSGT Fusionsprotein trennen 9 10 11 12 13 lt His hSGT Fusionsprotein Abb 4 17 SDS PAGE der Fraktionen der Ausschlusschromatographie von His hSGT Fusionsprotein ber eine Superdex 200 10 30 S ule unter Hochsalzbedingungen BR broad range Marker die Zahlen entsprechen den Fraktionen des Superdex 200 10 30 Gelfiltrationslaufes siehe Abb 4 16 In beiden Hauptpeaks finden sich neben dm His hSGT Fusionsprotein auch die beiden anderen Proteine 35 und 32 kDa gro wieder 13 4 Ergebnisse 4 2 1 5 Versuch zur Spaltung des His hSGT Fusionsproteins durch das Enzym Faktor Xa n His Tag und hSGT Zus tzlich zu dem His markiertem Protein sollte auch noch der Versuch unternommen werden hSGT ohne Tag zu kristallisieren Ein 10x His Tag ist zwar im Vergleich zum hSGT Protein mit seinen 313 Aminos uren relativ klein dennoch kann durch die An wesenheit des Tags die Kristallisation des Fusionsproteins erschwert sein Aus diesem Grund wurde versucht von dem ber Ni NTA Sepharose S
134. ngsgrad der Proteine in Peak 1 zu machen da es sich noch immer um eine Mischung verschieden gro er SGT Proteine handelt Die berechnete Gr e der Proteine aus dem zweiten Peak Elution nach 12 8 ml entsprechen dimeri siertem hSGT Protein mit einer Gr e von ca 70 kDa Ein hSGT Protein ist nach Ab spaltung des GST Tags etwa 36 kDa gro Im Gegensatz zum GST hSGT Fusionsprotein scheint das hSGT Protein ohne Tag die F higkeit zu besitzen Dimere bzw Oligomere Tetramere bilden zu k nnen Die F higkeit zur Oligomerisierung be sa auch das H s hSGT Fusionsprotein Monomeres SGT Protein konnte nur als GST hSGT Fusionsprotein ber eine ausschlusschromatographische Aufreinigung gewonnen werden Die Fraktion mit dem hSGT Protein wurde auf 16 mg ml ankonzentriert Es konnte somit f r Kristallisationsversuche verwendet werden siehe Abschnitt 4 3 4 3 Kristallisation des hSGT Proteins und des His hSGT Fusionsproteins Bei der R ntgenstrukturaufkl rung von Proteinen erweist sich die Kristallisation h ufig als limitierender Schritt Die Kristallisation des hSGT Proteins und des His hSGT Fusionsproteins wurde mit der Dampfdiffusionsmethode m s tzenden Tropfen durchge f hrt Proteinl sung und Kristallisationspuffer wurden m Verh ltnis 1 1 gemischt Um erste Erkenntnisse ber m gliche Kristallisationsbedingungen zu erlangen wurden fol gende Eingangsbedingungen engl initial screens nach dem Prinzip von Spare Mat rix Screen
135. nionenaustauschchromatographie ber eine ResourceQ bzw eine MonoQ S ule abtrennen noch durch hydrophobe Interaktionschromatographie ber eine Phenylsepharose S ule noch duch verschiedene Gelfiltrationsmethoden Bei den beiden Anionenaustausch Chromatographie Saulen ResourceeQ und MonoQ reicht offensichtlich der Unterschied in der Gesamtladung der Proteine zwischen dem Volll ngen SGT Protein und den beiden am C Terminus verk rzten Fragmenten nicht aus f r eine Trennung Auch die Unterschiede in der Hydrophobizitat von Volll ngen SGT Protein und den beiden verk rzten SGT Proteinen war nicht stark genug ausgepr gt f r eine Trennung dieser Proteine ber eine Phenylsepharose S ule Schlussendlich war es auf Grund der geringen Gr enunterschiede der drei SGT Proteine auch nicht m glich das SGT Proteingemisch ber Gr enausschlu Chromatographie n die einzelnen Proteinfraktionen zu trennen 92 5 Diskussion Fur die Kristallisationsversuche wurde somit ein Proteingemisch welches aus Volll ngen His hSGT Fusionsprotein und zwei vom C Terminus verk rzten Varianten desselben besteht verwendet siehe Abschnitt 5 4 5 2 1 Oligomerisierungsverhalten des SGT Proteins Ein weiteres Problem bei der Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins ist die Homo bzw Hetero Oligomerisierung des Selben Wie auch schon beim mRNA Abbau konnte auch im Hinblick auf eine Oligomerisierung des hSGT Proteins eine Temperaturabhangigkeit in
136. nsverdau gewonnene DNA Fragmente Durch l ngere Wellenl ngen wird die Mutatiosrate herabgesetzt 3 2 1 5 3 Proteindetektion durch Western Blot Mit dem Western Blot Towbin et al 1979 kann man geringe Konzentrationen eines bestimmten Proteins in einer gemischten Proteinl sung nachweisen Nach Auftrennung einer Proteinprobe durch eine SDS PAGE werden die Proteinbanden durch Elektrotransfer auf eine Membran bertragen Ein Prim rantik rper gegen ein spezielles Protein kann nun an das zug ngliche Zielprotein binden Durch einen Sekundarantikorper gegen den Prim rantik rper mit radioaktiver Markierung oder Phosphataseaktivitat kann die Proteinbande visualisiert werden Diese Methode ist bei Verwendung von monoklonalen Prim rantik rpern h chst empfindlich und spezifisch In dieser Arbeit wurde der semi dry Western Blot mit einer BioRad Blotkammer und Sekund rantik rpern mit gekoppelter Peroxidase verwendet um einen His Tag spezifisch nachzuweisen Blot Puffer f r Semi Dry Blot 48 mM Tris 39 mM Glycin 0 0375 SDS 20 Methanol 32 3 Material und Methoden Whatman Membran SDS Gel Whatman Abb 3 4 Aufbau eines semi dry Western Blots Ein frisches SDS Gel wurde 10 min in Blotpuffer aquilibriert Zeitgleich wurden die zugeschnittene PVDF Membran und das Whatman Papier 2 x 2 St cke ebenfalls 10 min in Blotpuffer inkubiert Die PVDF Membran wurde zuvor f r 15 min in Methanol aquilibriert Danach wurden
137. on des His hSGT Proteins in schnell wachsenden Kulturen fast ausschlie lich oligomerisiertes tetrameres Fusionsprotein aufgereinigt werden konnte siehe Abbildung 4 10 gelang es nach der Expression von GST hSGT Fusionsprotein unter den selben Bedingungen neben einer geringen Menge an dimerisiertem Fusionsprotein gro e Mengen an monomerem GST hSGT Fusionprotein aufzureinigen siehe Abblidung 4 22 Aber nach der Entfernung des GST tags konnte neben einer geringen Menge an dimerisiertem SGT Protein fast 93 5 Diskussion ausschlie lich nur noch tetrameres SGT Protein von der Gelfiltrationssaule eluiert werden Aufgrund der enormen Gr e des GST tags und der damit wahrscheinlichen Interaktion mit dem SGT Protein wurde von einer Kristallisation des GST hSGT Fusionsproteins Abstand genommen 5 2 2 Oligomerisierungsverhalten des SGT Proteins nach Hochsalzbehandlung Mit diesem Versuch sollte getestet werden ob sich die tetrameren His hSGT Fusionsproteine durch hohe Salzkonzentrationen z B 1 M NaCl in ihre Untereinheiten aufspalten lassen Die Wirkung von Hochsalz kann zum einen durch den Ionenaustauscheffekt erkl rt werden wobei die Ionen des Salzes geladene Proteinreste verdr ngen Andererseits kann die steigende Ionenstarke auch die zur Bindung notwenigen elektrostatischen Wechselwirkungen schw chen Im Falle des SGT Proteins f hrte eine Hochsalzbehandlung allerdings zu einer Verst rkung des Oligomerisierungsgrades
138. onsprotein gemeinsam mit den Spaltprodukten hSGT und GST elektrophoretisch aufgetrennt Die Proteine konnten aufgrund ihrer spezifischen Molekulargewichte eindeutig identifiziert werden 4 2 2 4 Ausschlusschromatographische Aufreinigung des hSGT Proteins nach vorherigem PreScission Protease Verdau Fur die praparative ausschlusschromatographische Aufreinigung des hSGT Proteins nach der proteolytischen Spaltung des GST hSGT Fusionsproteins durch PreScission Protease wurde wie unter Abschnitt 3 2 4 1 3 beschrieben verfahren Fur diesen Reinigungsschritt wurde eine Superdex 200 Saule HiResolution 10 30 verwendet Von dem hSGT Protein wurde nach der Ankonzentrierung auf 17 mg ml siehe Abschnitt 4 2 1 2 200 ul auf die Gelfiltrationss ule aufgetragen siehe Abbil dung 4 25 Die blaue Kurve entspricht der UV Absorption bei 280 nm und die rote der UV Absorption bei 260 nm Die braune Kurve stellt die Leitf higkeit dar Das Eluti onsprofil des Gelfiltrationslaufes zeigt einen gro en Hauptpeak mit einem Maximum der UV Absorption bei 280 nm von 250 mAU und einen deutlich kleineren Peak direkt daneben 81 4 Ergebnisse SinmnonmneS20000 1 1 trv gt imnene 520000 1 1 lt on BE Ji f j i 1 3 V Zr i 1 u Aa WA A AA vs ie N WWA a A f v N ede u o a a am J o 5 0 10 0 15 0 y v Waste 20 9 25 0 ml
139. otein von n edermolekularen Bindungspartnern zu trennen 3 2 4 3 Ankonzentrieren von Proteinl sungen durch Zentrifugation Eine einfache Methode zum Ankonzentrieren von Proteinl sungen ist die Verwendung von so genannten Centricons Auf ein Zentrifugenr hrchen ist eine H lse gesteckt in deren unterem Drittel eine Membran mit bestimmter Porengr e eingelassen st Diese Membran st durchl ssig f r Wasser Ionen und kleine Molek le aber nicht f r Proteine d e gr er als der Ausschluss der Membran sind Durch Zentrifugation 3 000 4 500 x g 4 C k nnen Proteine auf diese Weise ankonzentriert werden In dieser Arbeit wurden Vivaspin Konzentratoren der Firma Vivascience verwendet 3 2 4 4 Proteinverdau mit Proteasen Das GST hSGT Fusionsprotein besitzt eine PreScission Protease Schnittstelle Durch einen Proteaseverdau k nnen Affinitatssequenz und Zielprotein voneinander getrennt werden Es gibt nun zwei Alternativen um den PreScission Protease Verdau zu realisieren Man schneidet das Fusionsprotein w hrend der Affinitatschromatographie auf dem GSH Sepharose Saulenmaterial wobei GST an der Gelmatrix gebunden bleibt oder man schneidet nach der Elution von der GSH Sepharoses ule und trennt den GST Tag danach ber eine Praparative Ausschluichromatographie vom Zielprotein ab 53 3 Material und Methoden Bei der ersten Methode wurde der Rohextrakt ber die GSH Sepharoses ule in einer Einweg Leersaule Tropfsaule
140. paltung des GST vom gew nschten Protein nach Expression kloniert Hierzu wurde die hSGT Gensequenz ber die beiden Restriktionsenzyme Ndel und Xhol aus dem Vektor pET16b herausgeschnitten Der ebenfalls mit den beiden Enzymen Ndel und Xhol geschnittene Vektor wurde nach einer Behandlung mit alkal scher Phosphatase mit dem zuvor ausgeschnittenen Gen Fragment ligiert Zur Kontrolle von Nukteotidabfolge und Leserahmen wurden die pGEX6P1 1 hSGT Klone nach Transformation in E coli XL1 blue und Durchf hrung einer PCR mit vektor spezifischen Primern siehe Abschnitt 3 1 6 sequenziert Die Sequenzierung wurde nach der didesoxy Methode nach Sanger 1977 durchgef hrt siehe Abschnitt 3 2 2 2 Erst danach erfolgt eine Transformation in einen E coli Expressionsstamm Unter zu Hilfenahme des pGEX6P1 1 Vektors konnte somit ein Fusionsprotein mit N terminalem GST tag und C terminalem hSGT Protein mit einer dazwischenliegenden PreScission Protease Schnittstelle exprimiert werden Das Fusionsprotein konnte noch w hrend der Aufreinigung mittels des Enzyms PreScission Protease n GST tag und hSGT Protein gespalten werden 52 Expression und Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins F r anschlie ende Kristallisationsversuche ist es essentiell das zu kristallisierende rekombinante Protein sehr rein und in gro en Mengen mehrere Milligramm pro Milliliter herzustellen Zu diesem Zwecke wurde ein Expressions und Aufreinigungprotokoll entwickelt wel
141. r analytischen und pr parat ven Auftrennung von Proteinen verwendet SDS ist ein Detergens welches aus einer al phatischen Kette von 12 Kohlenstoffatomen besteht und eine hydrophile Sulfatgruppe besitzt SDS lagert sich gleichm ig an Aminos uren an und entfaltet denaturiert dabei das Protein Zus tzlich werden Disulfidbr cken durch B Mercaptoethanol das 1m Probenpuffer enthalten ist reduziert und dadurch gespalten Es entsteht ein SDS Protein Komplex mit nach au en gerichteten negativen Ladungen Die Eigenladungen des Proteins sind jetzt zu vernachl ssigen und der entstandene Komplex besitzt e n konstantes Masse Ladungs Verhaltnis Unter diesen Bedingungen sind Proteine unabh ngig von ihrer Faltung in einem Molekularsieb wie dem Polyacrylamidgel nach ihrem Molekulargewicht separierbar Das Prinzip der diskontinuierlichen Gelelektrophorese beruht auf der Fokussierung von Proteinen Ornstein 1964 durch einen pH Sprung von zwei bereinander geschichteten Polyacrylamidgelen Das untere Trenngel enth lt einen Puffer mit einem pH Wert von 8 5 und einem Leition mit hoher Ionenbeweglichkeit Der pH Wert des dar ber geschichteten Sammelgels liegt deutlich tiefer bei 6 8 Das Leition des Sammelgels besitzt eine geringere Ionenbeweglichkeit Der Elektrodenpuffer enth lt ein Folgeion mit geringer Ionenbeweglichkeit dessen Ladung allerdings pH abhangig ist 28 3 Material und Methoden Durch das Einschalten des Stromes wandern die L
142. rasonics Corporation Danbury USA Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Amersham Pharmacia Biotech Freiburg Schutt Gottingen Eppendorf Hamburg Eppendorf Hamburg Sylvania Ohio USA Bandelin Berlin Infors Einsbach Schutt Gottingen Beckman Coulter Krefeld Beckman Coulter Krefeld 26 3 Material und Methoden 3 2 Methoden 3 2 1 Allgemeine Methoden 3 2 1 1 Mengenbestimmung von Proteinen Die quantitative Bestimmung von Proteinl sungen erfolgt nach der Methode von Bradford 1976 In phosphosaurer L sung lassen sich Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blau anf rben Die Proteinkonzentration kann mittels Absorption bei 595 nm photometrisch bestimmt werden da sich das Absorptionsspektrum des Farbstoffes in einem Bereich von ODs95 0 1 0 9 proportional zur Proteinkonzentration ndert 20 ul Proteinprobe werden mit I ml 1 5 in Wasser verd nnter Bradfordreagenz 1 mg ml Coomassie Brilliant Blau G250 in 85 iger H3PO versetzt und nach 10 Minuten wird die Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen Aus dem Vergleich zu einer durch verschiedene Konzentrationen an BSA erstellten Standardkurve l sst sich die Proteinmenge der unbekannten Probe ermitteln 3 2 1 2 Konzentrationsbestimmung von Nukleins uren Die Konzentration w ssriger Nukleins urel sungen wird quantitativ 1m Photometer bei 260 nm gegen einen Referenzwert bestimmt Sambrook et al 1989 Folgende Umrechnungswerte werden hierbe
143. rden 250 ul Ampicillin 100 mg ml und oder Chloramphenicol 100 mg ml und oder Kanamycin 50 mg ml unter Ruhren zugegeben Nun wurde der Agar in Platten gegossen Sollten die Agar Platten nicht selektiv sein so wurde auf den Zusatz von Antibiotika verzichtet Die Lagerung erfolgte bei 4 C 3 2 3 2 Kultivierung von E coli Stammen Alle Bakterienstamme wurden in LB Medien oder auf LB Agarplatten ber Nacht bei 37 C kultiviert Die Suspensionskulturen wurden in Reagenzglaser bzw in Glaskolben die bis maximal 25 des Gesamtvolumens bef llt waren bei 200 rpm gesch ttelt Die Aufbewahrung von Bakterienstammen erfolgte als Glycerolstock wobei eine LB bernachtkultur auf eine Endkonzentration von 20 mit Glcerol versetzt und bei 80 C gelagert wurde Bakterienstamme die fur einen k rzeren Zeitraum bis zu vier Wochen aufbewahrt werden sollten wurden auf einer Agarplatte ausgestrichen und be 4 C aufbewahrt 3 2 3 3 Bestimmung der Zelldichte einer Bakterienkultur Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm in einem Eppendorf Photometer bestimmt Als Referenz diente hierbei das Medium in dem die Bakterien herangezogen wurden 3 2 3 4 Expression von rekombinanten Proteinen in E coli E coli Zellen enthalten nach der Transformation einen Vektor der ein einkloniertes Fremdgen enth lt Gleichzeitig k nnen ein oder mehrere Gene f r Ant biotikaresistenzen enthalten sein
144. rfugung gestellt Die unter Kontrolle des PTG induzierbaren T7 Promotors stehende Expression des His hSGT Fusionsproteins erfolgte in FE coli BL21 DE3 Zellen Durch eine Erniedrigung sowohl der IPTG Konzentration von 1 mM auf 0 5 mM als auch der Inkubationstemperatur von 37 C auf 20 C konnte die Menge an loslich exprimierem Protein signifikant gesteigert werden Die Aufreinigung erfolgte problemlos tber eine HiTrapChelating Ni NTA Sepharose S ule mit einer anschlie enden Aufreinigung des Fusionsproteins ber eine Superdex S200 Gelfiltrationss ule HiLoad 26 60 Aber bereits nach der IMAC zeigte sich bei einer Kontrolle der Elutionsfraktionen auf einem SDS Gel dass sich das His hSGT Fusionsprotein uber 1D Gelelektrophorese in drei Fraktionen auftrennen lie Durch einen Western Blot und die Verwendung eines anti 6His mouse Prim rantik rpers konnte gezeigt werden dass alle drei auf dem Gel zu sehenden Proteinbanden eine His Markierung besitzen siehe Abbildung 4 19 Folglich mu der N Terminus des Fusionsproteins n allen drei Proteinfraktionen noch intakt sein In Versuchen konnte gezeigt werden dass das His hSGT Fusionsprotein auch nach 4 Wochen Lagerung bei 4 C in dem f r die Kristallisationversuche verwendeten Gelfiltrationpuffer stabil war Daten nicht gezeigt Eine M glichkeit zur Erkl rung des Vorhandenseins der zwei zus tzlichen His markierten Proteine ist der schrittweise Abbau des C Terminus des Fusionsprotein
145. rung liege in seinem N Terminus begriindet 6 1 Ausblick Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden da SGT spezifisch Dimere bildet Nur unter diesen Bedingungen war es m glich erste Proteinkristalle zu erhalten Die Bedingungen n denen diese SGT Kristalle wuchsen stellen nach weitergehenden Optimierungen eine gute Grundlage f r zuk nftige Kristallisationsversuche dar Auch streak seeding Versuche aus Bedingungen mit Phasenseparation k nnten helfen Einkristalle f r r ntgendiffraktometrische Untersuchungen zu erhalten Um kurzfristig die Probleme des mRNA Abbaus innerhalb der FE coli Zellen zu verringern bietet sich eine Erh hung der Inkubationstemperatur und damit auch eine Verk rzung der Proteinexpression an Dies bedeutet zwar eine geringere Ausbeute an SGT aber auch einen verh ltnism ig gr eren Anteil an Volll ngenprotein Ein weiteres Problem nach einer Erh hung der Inkubationstemperatur besteht aber darin dass nach einer relativ kurzen Expression fast ausschlie lich unspezifisch aggregierte tetramere SGT Komplexe aufgereinigt werden konnten Deshalb w re es ratsam die Probleme des mRNA Abbaus l ngerfristig durch die Verwendung eines RNase E defizienten E coli Stammes f r die Proteinexpression zu umgehen Erste Anzeichen sprechen daf r dass das SGT Protein in vivo als Dimer vorliegt Auch aus diesem Grund sollten gr ere N terminale Markierungen vor der Kristallisation des SGT abgespalten werden da sie
146. s Rohextraktes anfallenden Zelltrummer ebenfalls mittels SDS PAGE untersucht Das His hSGT Fusionsprotein war l slich und zum gr ten Teil im berstand vorhanden siehe Abbildung 4 7 pn en lt His hSGT mn Fusionsprotein Abb 4 7 SDS PAGE der Affinit tschromatographie von His hSGT Fusionsprotein ber eine Ni NTA Sepharose S ule Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen siehe Abb 4 6 Das Fusionsprotein ist mit einem Pfeil mar kiert und l uft bei ca 37 kDa Zus tzlich erscheinen in den Elutionsfraktionen zwei weitere Proteine ca 32 und 35 kDa unterhalb der Fusionsproteinbande BR Marker broad range ZE Zellextrak nach Aufschluss U Uberstand P Pellet 12 5 iges SDS Gel Die Elutionsfraktionen 41 52 wurden vereinigt und f r die anschlie ende Gelfiltration auf 2 mg ml ankonzentriert siehe Abschnitt 3 2 4 3 Die Ausbeute an hSGT His Tag Fusionsprotein betrug nach diesem Reinigungsschritt im Schnitt 50 mg pro Liter Ex pressionskultur 64 4 Ergebnisse 4 2 1 2 2 Anionenaustauschchromatographie ber ResourceQ zur Aufreinigung des His hSGT Fusionsproteins nach vorangegangener Affinit tschro matographie F r die Anionenaustauschchromatographie wurde ein Puffer mit einem eingestellten pH Wert von 7 0 verwendet Das His hSGT Fusionsprotein hat einen theoretischen pl von ca 5 6 siehe Anhang 8 1 Die Aufreinigung des Fusionsproteins ber d e ResourceQ erfolgte w e unter Punkt 3 2 4 1 2 beschrie
147. s dass die Viren dort opportunistisch vorliegen und nicht Ursache des Tumors sind Toolan 1960 und Toolan 1967 Autonome Parvoviren wie das H 1 Virus nutzen transformierte Zellen f r hre Vermehrung und l sen dabe den Tod dieser Zellen aus Es konnte gezeigt werden dass Parvoviren Wachstum und Etablierung experimentell induzierter Tumoren hemmen k nnen Guetta et al 1986 und Dupressior et al 1989 S e zeigen in Versuchen mit verschiedenen Karz nomtypen oncosuppressive Aktivit t Herrero Y Calle er al 2004 F r eine m gliche Behandlung des Glioblastoms wird vor allem das H 1 Virus diskutiert Der nat rliche Wirt des H 1 Virus scheint die Ratte zu sein aber auch Hamster und menschliche Zelle sind empf nglich W hrend es aber nach einer Infektion n Ratten und Hamstern zu schweren Erkrankungen kommen kann gilt das Virus im Menschen als apathogen Jacoby er al 1995 Es konnte gezeigt werden dass das H 1 Virus besonders ausgepr gt in Zellen b sartiger Hirntumore 2 1 Einleitung auftritt und bereits eine geringe Virendosis ausreicht die Tumorzellen abzut ten Warum der H1 Virus Tumorzellen abt ten kann ist noch nicht gekl rt diese F higkeit h ngt aber vermutlich mit einem bestimmten viralen E wei stoff dem NS1 Protein zusammen Herrero Y Calle et al 2004 und Steiner et al 2004 Das Genom der autonomen Parvoviren kodiert f r zwei regulatorische Nicht Strukturproteine NS1 und NS2 die essentiell fur
148. s uren mit einem Molekulargewicht von etwa 34 kDa Kordes et al 1998 20 30 40 50 60 70 80 MDNKKRLAYAIIOFLHDOLRHGGLSSDAOESLEVAIOCLETAFGVTVEDSDLALPOTLPE MDNRKRLAYAIIOFLHGOLRHGGLSSDAOESLEVAIOCLETAFGVTLEDSDLALPOTLPE cSGI___MSEEIKPSAPDAPTASPIVTRDEONLVVSFLOFIROKVSONDOATAEBOAEALEVAIOCLEHSFG LDDASYAFOPSRP YOR007c MSASKEEIAALIVNYFSSIVEKKEISEDGADSLNVAMDCISEAFGFEREAVSGILGKSEFKG 90 100 110 120 130 140 150 160 hSGT___ IFEAAATGKEMPODLR SPARTPPSEEDSAEAERLKTEGNEOMKVENFEAAVHFYGKAIELNPANAVYFCNR rSGI___ IFEAATASKEMPODPR GPDRIPPSEEDSAEBEAERLKTEGNEOMKLENFEAAVHLYGKAIELNPANAVYFCNR cSGI___ ILELFKSAEGLPEG ESALPTPSDSDISOANKLKEEGNDLMKASOFEAAVOKY NAIKLN RDPVYFCNR YOROO7 cOHLADILNSASRVPESNKKDDAENVEINIPEDDAETKAKAEDLKMOGNKAMANKDYELAINKYTEAIKVLPTNAIYYANR 170 180 190 200 hSGT___AAAYSKLGNYAGAVODCERAICIDPAYSKAYGRMGLALSSLNKHVEAVAYYKKALELDPD NETYKSNLKIAELKLREA rSGT___AAAYSKLGNYVGAVODCERAIGIDPGYSKAYGRMGLALSSLNKHAEAVAYYKKALELDPD NDTYKSNLKIAELKLREA cSGT___AAAYCRLEOYDLAIODCRTALALDPSYSKAWGRMGLAYSCONRYEHAAEAYKKALELEPN OESYKNNLKIAEDKLKEL YOROO7 CcAAAHSSLKEYDOAVKDAESAISIDPSYFRGYSRLGFAKYAOGKPEEALEAYKKVLDIEGDNATEAMKRDYESAKKKVEOS TPR3 7 290 300 310 320 hSGT PSPTGGVGSFDIAG LL WNPGFMSMAS NLM QIQQLMSGMISGG LGIPGTS PSONDLASLI rSGT PSPTGGVGSLDIAG LL NNPHFITMAS SLMNSPOLOOLMSGMISGGHNPLGTPGSS POHSDLASLI CSGT ESSRPAPGANPLAAGLLGAMGGGPGGMPAMPGMPN MONLMNEPGLMOAASOMMSDPALSDMFNNMM SGNGSIADLM YOROO7 cLNLEKTVPEOSR
149. s durch Proteasen bereits in der E coli Zelle Um diesem m glichen Effekt entgegenzuwirken sollte bei zuk nftigen Versuchen das hSGT Protein f r Kristallisationsversuche zu exprimieren der C Terminus des Proteins 90 5 Diskussion zus tzlich zum N Terminus durch einen Affinitats tag gesch tzt werden Dabei ist darauf zu achten dass s ch beide tags gut abspalten lassen Des weiteren k nnten die beiden zus tzlichen mit einem His tag markierten Proteine auch in einem anf nglichen Zerfall bzw Abbau der mRNA f r das SGT Protein in den E coli Zellen begr ndet sein Der Zerfall bzw der Abbau von mRNA spielt eine wichtige Rolle bei der prokaryotischen Genexpression Die Stabilit t einer mRNA in Prokaryoten resultiert aus ihrer Anf lligkeit f r zellul re Endoribonukleasen und 3 Exoribonukleasen Diese Anf lligkeit f r enzymatischen Abbau liegt in Unterschieden der RNA Sequenz und der RNA Struktur begr ndet Belasco er al 1988 Es wurde gezeigt dass die beiden in Bakterien am h ufigsten vorhandenen Exoribonukleasen die RNase II und die Polynucleotid Phosphorylase PNPase am Abbau der mRNA beteiligt sind indem sie die mRNA sehr schnell vom 3 Ende her abbauen Donovan er al 1986 Unterschiede in der mRNA Stabilitat k nnen auch zur unterschiedlichen Expression von Genen beitragen An dem endonukleolytischen Abbau der mRNA sind die Endoribonukleasen RNAse III und RNAse E beteiligt wobei die RNAse III sehr spezifisch
150. s erfolgte identisch wie aus Rosetta DE3 Zellen Das Eluat von der Glutathion Sepharoses ule wurde mittels SDS PAGE untersucht siehe Abbildung 4 21 vi n P D W PR 1 L S 130 100 70 lt GST hSGT i Fusionsprotein hL 35 Abb 4 21 Expressionsniveaus von GST hSGT Fusionsprotein in BL21 DE3 RIL BL21 DE3 RIL E coli Zellen mit pGEX6P1 1 hSGT Plasmid wurden bei 37 C in LB Medium bis zu einer OD6oo von 0 6 wachsen gelassen Dann wurde die Proteinexpression mit 0 5 mM IPTG induziert und die Zellen f r weitere 4 Std bei 20 C inkubiert Vor und nach der Induktion wurde eine Proben abgenommen die ODgo9 bestimmt gleiche Mengen an Zellen wurden in Laemmli aufgenommen und 5 Min aufgekocht Das Zelllysat wurde in einem 12 5 gen SDS Polyacrylamidgel analysiert V I vor Induktion n I nach Induktion zum Zeitpunkt der Ernte PR PaigeRuler prestained Protein Ladder ber stand P Pellet D Durchfluss der Glutathion Sepharoses ule w hrend des Proteinauftrags W Durchfluss durch die S ule nach 3maligem Waschen Wie schon beim His hSGT Fusionsprotein und auch beim GST hSGT Fusionsprotein aus Rosetta DE3 Zellen findet sich auf dem 12 5 Y gen SDS Gel drei starke Protein banden das GST hSGT Fusionsprotein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 78 4 Ergebnisse 62 kDa und die beiden darunter liegenden Banden mit Molekulargewichten von etwa 58 und 54 kDa Die Ausbeute an GST
151. s verwendet e Ammoniumsulfat Screen ASS e Clear Strategy Screen CSS e Crystal Screen 1 CS1 e Crystal Screen 2 CS2 e Crystal Screen Lite CSL e Crystal Screen Cryo CSC e Crystal Screen PEG Ion CSPI e Footprint Screens 1 3 FP 1 3 e Magic Screen MS e Natrix Screen NS e Structure Screen STS 83 4 Ergebnisse 4 3 1 Kristallisation des His hSGT Fusionsproteins 4 3 1 1 Kristallisation des oligomerisierten His hSGT Fusionsproteins Das His hSGT Fusionsprotein war nach der Gelfiltrationss ule als letztem Reinigungs schritt auf eine Konzentration von 5 mg ml ankonzentriert worden siehe Abschnitt 4 2 1 2 3 Nach der Gelfiltration lag es in einem Puffer mit 0 1 M NaCl und 20 mM Tris HCl pH 7 5 vor Die Kristallisationsans tze wurden bei 20 C pipettiert und inku biert siehe Abschnitt 3 2 5 1 und die Bilder von den Kristallen wurden mit einer Digi talkamera aufgenommen Ihre Gr e wurde durch ein Messraster im Binokular be stimmt Nach einem Tag war das hSGT Protein n etwa 50 aller Bedingungen ausgefallen Die L sungen in den anderen dagegen bl eb klar In der Bedingung CS2 Nr 43 waren kleine nadelf rmige Kristalle gewachsen siehe Abbildung 4 27 Bei der Auflistung der Be dingungen wird auf die Angabe des Puffers der SGT Pr paration 20 mM Tris HCl pH 7 5 100 mM NaCl verzichtet Abb 4 27 Kleine nadelf rmige Kristalle in der Bedingung CS2 Nr 43 Aufnahme mit einer Digitalkamera m
152. schnitten und unter Zuhilfenahme des Qiagen Gel Extraction Kits aufgereinigt PCR PCR NK 1 kb Ladder ee Abb 4 2 PCR von pET16b hSGT mit T7 Primern ma S000 In den ersten beiden Spalten des 1 igen Agarosegels Sane kann man ein ca 2 4 kbp gro es PCR Produkt erkennen Br Die Gr e von 2 4 kbp entspricht einem hSGT Fragment Be 4000 as mit zwei kurzen Stiicken des pET16b Vektors Diese 3500 3000 2500 Vektor St cke entstehen aus dem Abstand der T7 Primer 2000 von dem hSGT Insert In der dritten Spalte des Agarose gels wurde die PCR Negativkontrolle ohne DNA aufge tragen 1500 1000 750 59 4 Ergebnisse Die beiden Vektoren pET28a 90k und pGEX 6P1 1 60k wurden mir freundlicherweise von Herrn C Gouloudis Molekulare Strukturbiologie G ttingen f r diese Arbeit zur Verf gung gestellt In den Vektor pET28a war ber die Restriktionsschnittstellen Ndel und Xhol bereits die Gensequenz welche f r U4 U6 90k hprp3 kodiert inseriert In den Vektor pGEX 6P1 1 hingegen war die Gensequenz f r U4 U6 60k hprp4 als Ndel Xhol Fragment klon ert Die Vektoren pET28a und pGEX6P1 1 wurden ebenfalls in E coli XL1 Blue vermehrt mittels Midi Pr paration extrahiert und mit den Restriktionsenzymen Ndel und Xhol behandelt Anschlie end wurden die Phosphorylgruppen der geschnittenen Enden des Vektors durch Zugabe von Calf intestinal alkaline Phosphatase CIP und einst ndiger Inkubation bei 37 C entfernt um einer Religa
153. sieren des Trenngels w rd der Isopropanol abgegossen und mit Wasser nachgespult Das Sammelgel wurde in den verbliebenen Raum zwischen den Glasplatten gegossen und der Probenkamm wurde zwischen die Glasplatten gesteckt Die Gummidichtung wurde nach Beendigung des Polymerisationsvorganges entfernt Das Gel wurde n eine vertikale Elektrophoresekammer gespannt und das Reservoir mit SDS Laufpuffer gef llt Der Kamm wurde vorsichtig heraus gezogen und die Probentaschen mit Puffer gesp lt um Gelreste zu entfernen Die Proteinproben wurden 1 1 v v mit Laemmli Puffer versetzt falls n tig bei 95 C fur drei bis f nf Minuten aufgekocht und mittels einer Pipette in die Taschen des Gels geladen Fur die Analyse von Zellsuspensionsproben mittels SDS PAGE wurden 1 0 ml Kultur abzentrifugiert mit Laemmli Puffer ODsoo x 0 1 ml versetzt Fur den Gr envergleich wurde ein Proteingr enstandard Marker mit aufgetragen Nach dem Auftragen auf das Gel lie man die Proben bei geringer Stromst rke ca 15 mA und maximaler Spannung in das Sammelgel einsinken Nach 10 15 min wurde die Stromstarke auf 25 29 3 Material und Methoden 30 mA erh ht um die Proteine zu einer schmalen Bande zu fokussieren und dann zu trennen 1 x SDS Laufpuffer 2x SDS Probenpuffer Laemmli Puffer 192 mM Glycin 62 5 mM Tris HCl pH 6 8 25 mM Tris HCl pH 8 3 70 mM SDS 0 1 w v SDS 50 v v Glycerin 0 1 v v Bromphenolblau 1 v v in EtOH abs
154. ssion des Zielproteins Wichtig bei Klonierungen ist dass das Zielgen im Leseraster liegt Fur die Proteinexpression beliebte Vektoren sind solche die aufwarts in 5 Richtung oder abwarts in 3 Richtung vom einklonierten Gen eine codierende Sequenz fur ein Peptid oder Protein besitzen welches als Markierung dient Eine solche Markierung engl tag erleichtert durch die Fusion mit dem zu untersuchenden Protein die spatere Proteinaufreinigung Solche Konstrukte sind z B N terminale GST Gluthation S transferase Fusionsproteine in pGEX Vektoren oder N oder C terminale His Sequenz Proteine in einigen pET Vektoren 3 2 2 1 1 DNA Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion PCR Die Polymerasekettenreaktion engl polymerase chain reaction PCR ist eine Methode um DNA Sequenzen spezifisch zu amplifizieren Saiki et al 1985 Mullis er al 35 3 Material und Methoden 1986 F r die PCR werden kurze die gew nschte Sequenz flankierende 3 und 5 DNA Oligonukleotide kurz Oligos von etwa 20 bis 30 Basenpaaren L nge ben tigt Dies sind so genannte primer die den Anfangs beziehungsweise Endpunkt der Sequenz definieren und als Startpunkt f r das Enzym DNA Polymerase dienen Zur Durchf hrung der PCR werden zu einer DNA L sung welche die Zielsequenz besitzt ein Paar von Primern alle vier Desoxyribonukleosidtriphosphate dNTPs und eine hitzestabile DNA Polymerase z B aus Thermus aquaticus gegeb
155. t Eine Kolonie wurde in 5 ml LB Medium berimpft und ber Nacht be 37 C inkubiert Die 5 ml Vorkultur wurde 1 100 in 500 ml LB Medium verd nnt und bei 37 C bis zu einer ODeoo von 0 6 wachsen gelassen Die Ernte erfolgte durch Zentrifugation 6 000 g 10 min 4 C Das Pellet wurde in 150 ml eiskaltem TFBI Puffer resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert Nach einer weiteren Zentrifugation 3 000 g 10 min 4 C wurde das Pellet in 5 ml eiskaltem TFB2 Puffer vorsichtig resuspendiert Die kompetenten Zellen wurden nun unter K hlung durch fl ssigen Stickstoff aliquotiert Die Lagerung erfolgte bei 80 C TFB1 Puffer TFB2 Puffer 30 mM KAc pH 7 0 10 mM NaMOPS pH 7 2 50 mM MnCl 75 mM CaCl 10 mM CaCl 10 mM RbCl 100 mM RbCl 15 v v Glycerin 15 v v Glycerin Der pH wurde mit 0 2 M HAc Der pH wurde mit 1 M NaOH auf 5 8 eingestellt auf 6 5 eingestellt Es folgte Sterilfiltration Es folgte Sterilfiltration 3 2 3 5 2 Transformation chemisch kompetenter E coli Zellen Unter Transformation versteht man das Einschleusen von Plasmid DNA in Bakterienzellen Zu 50 ul kompetenter Zellen wurden 20 ul Ligationsansatz oder 100 ng bis 1 ug Plasmid DNA pipettiert und gemischt Die Zellen wurden dann 20 Minuten auf Fis inkubiert F r die DNA Aufnahme wurden die Zellen bei 42 C f r 60 Sekunden inkubiert und anschlie end 3 Minuten auf Eis gestellt Nach Zugabe von 1 ml ant biotikafreiem LB Medium wurden die Zellen 60 Minuten
156. te TPR Motiv ist in blau zu sehen Die gr ne Helix am Ende stellt eine Solvating Helix dar Das Bild stammt aus Main et al 2003 Design of Stable a Helical Array from an Idealized TPR Motif 1 1 Einleitung Die konsequente r umliche Anordnung der amphiphatischen a Helices resultiert in einer rechtsdrehenden superhelicalen Struktur welche eine amphiphatische Furche ausbildet Untersuchungen deuten darauf hin dass diese Furche am Mechanismus der Proteinerkennung beteiligt ist Das et al 1998 In NMR Untersuchungen der TPR Dom ne des hSGT Proteins zeigte sich dass diese Dom ne aus sieben a Helices besteht die lokalisiert sind von Glu92 Lys103 Helix 1 Phe107 Glu119 Helix 2 Alal25 Lys137 Helix 3 Tyr141 Ile154 Helix 4 Ser159 Serl71 Helix 5 H s175 Leul86 Helix6 und schlie lich Glul93 Lys205 Helix 7 Pai et al 2003 Diese Ergebnisse spiegeln sich auch in den Sekund rstruktur Voraussagen f r das hSGT Protein ber das Programm PSIpredict wieder siehe Abbildung 1 3 1 3 Funktion von TPR Dom nen TPR enthaltende Proteine sind in ein breites Spektrum zellularer Funktionen involviert wie z B der Zellzyklus Kontrolle Transkription und Splicing dem Proteintransport der Regulation der Protein Phosphorylierung und explizit auch der Proteinfaltung Blatch er al 1999 Die wohl wichtigsten Eigenschaften von TPR Dom nen sind in ihrer Beteiligung bei Protein Interaktionen der Zusammenlagerung von M
157. teine aus ben Miyata er al 1997 untersuchten einen hnlichen Fall in dem unphosphoryliertes FKBP52 Protein in der Lage ist an Hsp90 zu binden Nach einer Phosphorylierung durch die Casein Kinase II aber verliert das FKBP52 Protein diese F higkeit Fur ein besseres Verstandnis der Funktionen des humanen SGT Proteins reicht es nicht aus seine drei dimensionale Struktur aufzuklaren Ferner sollten seine Interaktionen mit anderen Proteinen wie dem NSI Protein oder dem Chaperon Hsc70 n her in den Blickpunkt der Forschung ger ckt werden In den Untersuchungen zu dem Dreier Chaperon Komplex aus CSP SGT Hsc70 konnte dem SGT Protein eindeutig eine Cochaperonfunktion nachgewiesen werden Indem das SGT Protein die ATPase des Hsc70 aktiviert wird der Dreierkomplex bef higt z B ungefaltete Luciferase zu renaturieren Tobaben et al 2001 Fur viele virale Prozesse wie die DNA Replikation oder die Verpackung des viralen Genoms wurde in Infektionsmodellen anderer Viren die Beteiligung von Chaperonkomplexen bereits nachgewiesen Da man vermutet dass SGT auch n der parvoviralen Replikation die Funktion eines Cochaperons bernimmt und Hsc70 in APAR Bodies nicht nachgewiesen werden konnte bleibt die Frage offen wer die Funktion des Chaperons im Komplex mit SGT einnimmt Momentan wird diskutiert ob nicht auch das NS1 Protein eine Chaperonaktivit t aufweisen k nnte n einem Komplex mit SGT Denn auch das NSI Protein besitzt eine ATPase die m glich
158. teins gewonnen zum anderen wurde His hSGT Fusionsprotein aufgereinigt und kristallisiert W hrend dieser Arbeit konnten erste Kristallisationsbedingungen gefunden werden die durch weitergehende Optimierung zuk nftige R ntgenstrukturanalysen erlauben k nnten Dar berhinaus konnten m Rahmen dieser Arbeit erstmals Erkenntnisse zum Oligomerisierungsverhalten des hSGT Proteins in Abh ngigkeit verschiedener Bedingungen gewonnen werden wie z B die Inkubationstemperatur der Proteinexpression Nach einer Verringerung der Temperatur und damit einer verl ngerten Expressionszeit Konnte neben tetramerem SGT Protein auch dimeres SGT hergestellt werden In diesem Zusammenhang konnten durch UV spektrometrische Untersuchungen Hinweise auf eine unspezifische Aggregat on innerhalb des tetrameren SGT Komplexes gewonnen werden In einem SGT Dimer fanden s ch dagegen keine Hinweise auf eine unspezifische Aggregation Aufgrund dieser Daten kann vermutet werden dass zwei SGT Dimere unspezifisch aggregieren w hrend die Dimere aus zwei spezifisch miteinander interagierenden SGT Proteinen bestehen Auch die Gr e einer N terminalen Markierung zeigte einen Einflu auf das Oligomerisierungsverhalten des 104 6 Zusammenfassung SGT Proteins Mit Hilfe dieser GST Markierung war es nun erstmals m glich das SGT Protein in monomerer Form als GST hSGT Fusionsprotein herzustellen Diese Ergebnisse st tzen die Vermutung die F higkeit des SGT zur Oligomerisie
159. tion des Plasmids entgegenzuwirken Nach der Auftrennung des Restriktionsansatzes in einem 1 igen Agarosegel wurde jeweils die Vektor DNA Bande aus dem Agarosegel herausgeschnitten siehe Abbil dung 4 3 und 4 4 und die DNA mittels des Qiagen Gel Extraction Kits aufgereinigt 1kb Ladder pET28a un XhoI Ndel Ndel Xhol verdaut Abb 4 3 Restriktionsverdau des Vek tors pET28a mit inserierter hprp3 Gensequenz In den Spuren 2 4 des 1 igen Agarose gels kann man sowohl das mit den Re striktionsenzymen NdeI und Xhol heraus geschnittene hprp3 Fragment mit einer Gr e von ca 2 5 kbp erkennen als auch die ehemaligen Positionen der aus dem Gel geschnittenen Verktor Fragmente ca 5 5 kbp gro markiert durch Sterne In Spur 5 ist unverdauter Vektor aufgetragen und in den Spuren 6 und 7 jeweils einfach verdauter pET28a Vektor pGEX 6P1 1 un XhoI NdeI 1kb Ndel Xhol verdaut Ladder Abb 4 4 Restriktionsverdau des Vek tors pGEX6P1 1 mit inserierter hprp4 Gensequenz In den Spuren 1 3 des 1 igen Agarosegels kann man sowohl das mit den Restrikti onsenzymen NdeI und Xhol herausge schnittene hprp4 Fragment mit einer Gro Be von ca 2 kbp erkennen als auch die e hemaligen Positionen der aus dem Gel ge schnittenen Verktor Fragmente ca 5 kbp gro markiert durch Sterne In Spur 4 ist unverdauter Vektor aufgetragen und in den Spuren 5 und 6 jeweils einfach verdauter pGEX6P1 1 Vektor 60 4 Ergebnisse Nachdem sowohl das
160. tivs Mangan Chlorid und einer Kombination aus Macro und Micro Seeding Aufnahme mit einer Digitalkamera mit vorgespann tem Polarisationsfilter Uber Nacht waren in dieser Bedingung pyramidenformige Kristalle gewachsen Jede Seitenkante eines Kristalls hat eine L nge von 10 uM und eine H he von 8 uM Bedingung im Tropfen 100 mM Tris HCl pH 8 0 30 v v MPD 200 mM Ammonium Phosphat 10 mM Mangan Chlorid Proteinkonzentration im Tropfen 8 mg ml Temperatur 20 C Die nadelf rmigen Kristalle in den untersuchten Bedingungen siehe Abbildungen 4 27 und 4 28 konnten weder durch Micro Seeding noch durch Macro Seeding und auch nicht durch eine Kombination der beiden Methoden verbessert werden Eine ge nauere Aussage ber diese nadelf rmigen Kristalle kann nicht getroffen werden da sie weder den R ntgenstrahl im Diffraktometer streuen noch sich aufgrund ihrer geringen Gr e auf einem SDS Gel analysieren lassen 86 4 Ergebnisse 4 3 1 2 Kristallisation des dimerisierten His hSGT Fusionsproteins Das dimerisierte hSGT Protein war nach der Gelfiltration auf eine Konzentration von 16 mg ml ankonzentriert worden siehe Abschnitt 4 2 1 3 2 Nach der Gelfiltration lag es in einem Puffer mit 0 1 M NaCl und 20 mM Tris HCl pH 7 5 vor Die Kristallisati onsans tze wurden bei 20 C und bei 10 C pipettiert und inkubiert siehe Abschnitt 3 2 5 1 Nach einem Tag fand sich n etwa 30 aller Bedingungen dunkelbraunes d
161. uce substantial quantities of pure hSGT protein in E coli SGT was obtained in a highly purified form The full length protein and two SGT fragments shortened at the C terminus were separated On the one hand hSGT was extracted by cleavage of the GST hSGT fusion protein by PreScission protease and on the other hand the His hSGT fusion protein was purified and crystallized Initial crystallization conditions were found which permit future x ray structure analyses by further optimization of these conditions This is the first relsult which shows this kind of oligomerization of human SGT under different conditions The oligomerization depends for example on the incubation temperature of the expression The dimerized and tetramerited SGT proteins could be obtained after a decrease in temperature and an extended expression time After a decrease of temperature and thus an extended expression time dimerized SGT could be produced as well as tetramerized SGT protein In this context references for a nonspecific aggregation could be found within the tetramerized SGT complex by UV spectrometric investigations In dimerized SGT no evidences for a nonspecific aggregation could be found From these data it can be assumed that two SGT dimers aggregate non specifically whereas the subunits of the dimers interact specifically Also the size of the N terminal tag showed an influence on the kind of oligomerization of SGT For the first time it was possible to purify the
162. ugh cell division Experimantal Cell Research 293 43 57 Wrzesinski C 2002 Autonome Parvoviren Entwicklung einer zweiten Generation von Vektoren f r die Tumor Gentherapie und Untersuchung des Einflusses der Infektion auf die zellul re Genexpression Dissertation an der Ludwig Maximilians Universit t M nchen Wu S Liu F Hu S and Wang C 2001 Different combinations of the heat shock cognate protein 70 hsc70 C terminal functional groups are utilized to interact with distinct tetratricopeptide repeat containing proteins Biochem J 359 419 426 l 8 Anhang Anhang 8 1 Daten zum theoretischen pl Wert und zum Molekulargewicht des hSGT Proteins Die folgenden Daten wurden mit dem Programm PeptideMass berechnet Dieses Programm ist zu finden auf der Homepage des ExPASy Expert Protein Analys s System proteomics server of the Swiss Institute of Bioinformatics 8 1 1 hSGT Protein acession NM _ 003021 1 i 21 31 41 51 1 MDNKKRLAYA IIQFLHDQLR HGGLSSDAQE SLEVAIQCLE TAFGVIVEDS DLALPQTLPE 60 61 IFEAAATGKE MPQDLRSPAR TPPSEEDSAE AERLKTEGNE QMKVENFEAA VHFYGKAIEL 120 121 NPANAVYFCN RAAAYSKLGN YAGAVODCER AICIDPAYSK AYGRMGLALS SLNKHVEAVA 180 181 YYKKALELDP DNETYKSNLK IAELKLREAP SPTGGVGSFD IAGLLNNPGF MSMASNLMNN 240 241 PQIQOLMSGM ISGGNNPLGT PGTSPSONDL ASLIQAGQOF AQOMOOONPE LIEQLRSQIR 300 301 SRTPSASNDD OOE Theoretical pI 4 81 Mw average mass 34063 08 Mw monoisotopic mass 34041 69 8 1 2 hSGT
163. ultiprotein Komplexen und m Protein Targetingmechanismus von Mitochondrien und Peroxisomen zu sehen Das er al 1998 Das TPR Motiv wurde 1990 von Hirano et al als essentieller Bestandteil des nuc2 Proteins in S pombe identifiziert Zeitgleich identifizierten Sikorski et al in dem Genprodukt von Cdc23 cell division cycle proteins Cdc aus S cerevisiae auch ein TPR Motiv TPR Motive wurden in ber 300 verschiedenen Proteinen gefunden welche mit einer gro en Bandbreite biologischer Funktionen assoziiert sind Eine Analyse prokaryotischer und eukaryotischer TPR Dom nen lassen weder einen signifikanten Unterschied in der Verwendung der einzelnen Aminos uren noch in der Konsensussequenz selbst erkennen Bis Heute wurde allerdings noch keine Sequenz einer prokaryotischen TPR Dom ne aufgekl rt D Andrea er al 2003 8 1 Einleitung 1 4 Funktionen des SGT Proteins Da SGT ubiquit r exprimiert wird liegt die Schlussfolgerung nahe dass es sich bei dem SGT Protein um ein Housekeeping Protein handeln k nnte Kontr r dazu zeigen sgt Knock out Mutanten von S cervisiae allerdings keine ph notypischen Ver nderungen beim Wachstum auf verschiedenen kohlenstoffhaltigen Medien Aps 2002 Betrachtet man die gro e Homologie der TPR Dom ne des SGT Proteins mit der TPR 1 Domane des Hsp70 and Hsp90 organ zing protein HOP dr ngt sich die Vermutung auf dass auch das SGT Protein ebenso wie HOP eine Rolle als Cochaperon spielt
164. ung der Condon Usage Die Codon Usage beschreibt das Phanomen dass innerhalb des degenerierten Codes bestimmte Codons von einzelnen Spezies bevorzugt genutzt werden Diese Nutzung entspricht dann auch der tRNA Konzentration innerhalb der Zelle Die Codon Usage spielt auch eine gro e Rolle bei der Regulation der Proteinbiosynthese W hrend h ufig benutzte Codons die Translation beschleunigen k nnen kann sie von selten benutzten Codons auch gebremst werden Bei der Expression humaner Proteine in Bakterien kann es somit zu einer verminderten Effizienz derselben kommen Die Analyse der Codon Usage wurde mit der Software GCUA graphical codon usage analyser erstellt Dieses Programm wurde von Herrn Thomas Sch dl entwickelt 3 2 3 5 Transformationen in Bakterienstamme 3 2 3 5 1 Herstellung chemisch kompetenter E coli Zellen Fur die Transformation von E coli mit einem gew nschten Vektor muss der entsprechende Bakterienstamm zuerst kompetent f r die Aufnahme von Plasmiden gemacht werden Dies geschieht nach der CaCl gt Methoden Cohen et al 1972 Dabei wird die Zellmembran des Baktertums durch eine chemische Behandlung mit CaCl 42 3 Material und Methoden perforiert Durch diese por se Membran k nnen nun Plasmide n das Bakter um eingeschleust werden Zun chst wurde ein Aliquot des Stammes der kompetent gemacht werden soll auf einer antibiotikafreien LB Agar Platte ausgestrichen und ber Nacht bei 37 C inkubier
165. untington Bei dieser erblichen Erkrankung des Gehirns unterdr cken Chaperone lange Jahre die Verklumpung krank machender Proteine Tritt ein Ungleichgewicht zwischen Chaperonkapazitat und der Bildung der 9 1 Einleitung verklumpungsanf lligen E wei e auf bricht die Krankheit schlie lich aus Sittler er al 2001 Die Chaperonfunktion der Hitze Schock Proteine ist ein essentieller Teil des Abwehrmechanismus der Zelle gegen proteotoxischen Stress Da die korrekte Faltung von Proteinen aber auch in Abwesenheit von Stress fur die Zelle uberlebenswichtig ist werden Hitze Shock ahnliche Isoformen auch unter nicht Stress Bedingungen gebildet Diese werden nicht HSP sondern HSC eine Abkurzung fur heat shock cognate verwandte protein genannt Hitze Shock Proteine erf llen in der Zelle auch unter physiologischen Bedingungen wichtige Aufgaben bei der Synthese der Faltung und dem Transport von Proteinen Hartl et al 2002 Unterschieden werden die Hitze Shock Proteine an Hand ihres Molekulargewichtes Die Hsc70 Familie nimmt unter den Hitzeschock verwandten Proteinen eine herausragende Stellung ein denn man kann sie in nahezu allen Organismen und in allen zellul ren Kompartimenten finden Feige et al 1994 Das Hsc70 Protein wird in den Zellen konstitutiv exprimiert und kann bis zu 1 aller cytoplasmatischen Proteine ausmachen Die Fahigkeit von Hsc70 an Proteine zu binden ist ATP abhangig wobei die Bindung von Substrat durch Coc
166. uss auf die Trennung der Molek le Entscheidend ist hierbei das Loslichkeitsverhalten unterschiedlicher Molek le bei der Salzkonzentration des Puffers Die Ausschlu chromatographie st daher eine beliebte Methode um Proteine nach den ersten Aufreinigungsschritten von Verunreinigungen zu befreien Die Aufl sung ist abh ngig von der Flu geschwindigkeit und dem aufgetragenen Probenvolumen wobei kleine Volumina vorzuziehen sind 3 2 4 1 4 1 Pr parative Ausschlu chromatographie Die HiPrep 26 60 Superdex 200 S ule von Amersham Pharmacia Biotech eignet sich zur Trennung von Proteinen mit einer Molekulmasse von weniger als 600 kDa und die HiPrep 26 60 Superdex 75 S ule trennt Proteine bis 70 kDa Gr e Ihre Gelmatrix besteht aus Allyldextran das kovalent zu N N Methylenbisacrylamid verkn pft ist Nach Aquilibrierung der S ule mit 1 5fachem S ulenvolumen Elutionspuffer wird die Probe in einen Loop injiziert und von diesem auf die S ule aufgetragen Die Proteinprobe wird von der S ule mit Puffer eluiert 3 5 ml gro e Fraktionen werden aufgefangen und die Fraktionen anschlie end im SDS Polyacrylamidgel analysiert Elutionspuffer 20mM Tris HCI pH 7 5 100mM NaCl 2mM B Mercaptoethanol 51 3 Material und Methoden 3 2 4 1 5 Hydrophobe Interaktionschromatographie HIC Bei der hydrophoben Interaktionschromatographie werden Proteine aufgrund ihrer unterschiedlichen Hydrophobizitat voneinander getrennt Proteine mit ihren hy
167. verankert Mastrogiacomo er al 1994 Neben den synaptischen Vesikeln ist es auch noch mit sekretorischne Granula verschiedener Zelltypen assoziiert F r die regulierte Sekretion ist nur ein Komplex aus CSP und Hsc70 n tig das SGT Protein spiel hierbei keine Rolle Gareth er al 2003 F r die Interaktion mit Hsc70 in dem Dreierkomplex sind einige basische Reste in der zentralen TPR Domane von SGT verantwortlich Aber es bindet nicht nur an den C Terminus von Hsc70 sondern uber die TPR Dom ne auch an das cysteine string protein CSP Au erhalb der TPR Dom ne mangelt es dem SGT Protein an m glichen Motiven fur die Interaktion mit anderen Proteinen In Yeast two hybrid Screens wurde das SGT Protein als Interaktionspartner fur das CSP gefunden Kurz darauf fand man den oben vorgestellten Dreierkomplex auf synaptischen Vesikeln In diesem Zusammenhang postulierten Tobaban er al 2003 eine berarbeitete modulare Organisation des SGT Proteins in der der N Terminus f r die Homo und Hetero Oligomerisation des Proteins verantwortlich ist die TPR Dom ne fur die Interationen mit den beiden Proteinen Hsc70 und CSP und der C Terminus ein unabh ngiges Interaktions Modul fur potentielle Bindungpartner darstellt 1 4 3 Weitere m gliche Funktionen des SGT Proteins In den letzten Jahren verstarkte sich die Forschung uber das small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing Protein Dennoch ist erst recht wenig ber den genauen Aufbau
168. wa 8 ml Dies entspricht noch dem Aus schlussvolumen der S ule und w rde laut Kalibrierung einer Proteingr e von etwa 630 kDa entsprechen P A 18 15 lois 1A aH gt 15 0 2 0 Abb 4 16 Elutionsprofil einer Gelfiltration von His hSGT Fusionsprotein ber eine Su perdex 200 10 30 S ule unter Hochsalzbedingungen 1 M NaCl Die beiden Hauptpeaks stellen oligomerisiertes His hSGT Fusionsprotein dar wobei sie sich allerdings n ihrem Oligomerisierungsgrad unterscheiden Blau UV Absorption bei 280 nm Braun relative Leitf higkeit 12 4 Ergebnisse Im Vergleich mit dem Elutionsprofil der Gelfiltration des His hSGT Fusionsproteins unter Normalsalz Bedingungen siehe Abbildung 4 14 haben sich die Verh ltnisse zwischen oligomerisiertem und dimerisiertem Fusionsprotein nach Hochsalzbehandlung nicht signifikant ge ndert Die Gr e der Proteine aus dem zweiten Peak entsprechen 77 kDa und damit dimerisiertem Fusionsprotein Die eluierten Proteine aus dem ersten Peak dagegen sind laut Kalibrierung etwa 630 kDa gro Auch weiterf hrende Versuche mit einer Erh hung der Salzkonzentration auf 2M NaCl bzw Austausch von 1 M NaCl gegen 1 M NH SO zeigten nahezu identische Resultate Die erhoffte berf hrung von oligomerisiertem His hSGT Fusionsprotein in monomeres bzw dimerisiertes Fusions protein blieb aus Hochsalzbehandlung scheint eher kontraproduktiv zu sein da vorher tetrameres Fusionsprotein nach Hochsalzbehandlu
169. z B besteht fast ausschlie lich aus TPR Motiven neun St ck an der 11 1 Einleitung Zahl die sich zu zwei TPR Dom nen zusammenschlie en Dennoch besitzt es keine Chaperonfunktion an sich es vermittelt vielmehr den Substrat bergang von Hsp70 auf Hsp90 an welche beiden es sich ber seine TPR Motive bindet Scheufler et al 2000 Honore et al 1992 Interessanterweise sind bei Hsp70 und bei Hsp90 die letzten vier Aminos uren identisch EEVD Wu et al fanden 2001 in Untersuchungen heraus dass diese vier Aminos uren eine gro e Rolle bei der Interaktion der beiden Proteine mit TPR Motiven enthaltenden Proteine spielen Sie stellten hsc70 Mutanten mit Aminos uresubstitutionen im C Terminus her und verglichen in Co Prazipitationsversuchen die Bindungsfahigkeiten von Hsc70 und Hsc70 AEEVD an die TPR enthaltenden Proteine TPR1 HOP CHIP und hSGT Liu er al 1999 konnten nachweisen da die Tetratricopeptid Dom ne des hSGT Proteins mit dem C Terminus von Hsc70 interagiert W hrend dieser Interaktion ist das SGT Protein in der Lage die F higkeit von Hsc70 mi gefaltete Proteine wiederherzustellen zu inhibieren Wu er al 2001 Eine Entfernung der TPR flankierenden Regionen hat keinen Einflu auf die F higkeit einiger Proteine mit dem Hsc70 Protein zu interagieren Diese Proteine zu denen auch das hSGT Protein geh rt wurden zu einer Klasse TPR proteins Class I zusammengefasst van der Spuy et al 2000 1 4 2 SG
170. zentration im Tropfen 8 mg ml Temperatur 20 C 85 4 Ergebnisse Doch trotz aller Bem hungen waren diese Kristalle f r eine Vermessung im Diffrakto meter immer noch zu klein Aus diesem Grund wurde eine Kombination aus Micro und Macro Seeding eingesetzt um das Kristallgr enwachstum zu verbessern Zuerst wurde mit 2 3 kleinen pyram denf rmigen Kristallen aus der angepassten Bedingung CS2 Nr 43 nach Zugabe des Additivs Mangan Chlorid Micro Seeding durchgef hrt Bereits am n chsten Tag wurden die neu gewachsenen Kristalle aus diesen Bedingun gen im Zuge des Macro Seedings weiterverarbeitet siehe Abschnitt 3 2 5 2 Die L nge der Kristalle konnte durch diese Techniken auf 10 um erh ht werden hre H he auf 8 um siehe Abbildung 4 30 Anschlie end wurden die Kristalle m Diffraktometer vermessen Dies brachte jedoch keine Ergebnisse da keine Reflexe auf dem Detektor erkennbar waren Die durch das schnelle Wachstum der Kristalle begr ndete unregelm ige Struktur der Kristalle sollte durch verlangsamtes Wachstum verbessert werden Hierzu wurde das Reservoir mit Al s Oil berschichtet Al s Oil ist eine 1 1 Mischung aus Silicon und Paraffin l D Arcy et al 1996 Bei erneuten Messungen m Diffraktometer und nach einer optischen Auswertung der vohandenen Reflexe auf dem Detektor stellten s ch die Kristalle als Salzkristalle heraus Abb 4 30 Pyramidenf rmige Kristalle nach Zugabe des Addi

Brauns Simone Diplomarbeit - Institut für Mikrobiologie und

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Brauns Simone Diplomarbeit - Institut f&uuml;r Mikrobiologie und

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Brauns Simone Diplomarbeit - Institut für Mikrobiologie und