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Herstellung von kaninem Interleukin-2

1. Primer Basensequenz 5 3 Position Richtung KpnIL2 GGT ACC ATG TAC AAA ATG CAA CTC TTG 26 52 vorw rts MlulL2rev ACG CGT CAA GTC AGT GTT GAG AAG ATG CTT 465 504 r ckw rts TGA CAA AAG G Der PCR Ansatz bestand aus folgenden Komponenten Tabelle 7 PCR Ansatz zum Einbau von Restriktionsschnittstellen Taq Polymerase 5 U ul Biotherm NatuTec Frankfurt 0 5 ul dNTPs 10mM Roche Mannheim 1 ul Primer for rev je 10 pmol ul je2 ul Plasmid pCR I IL2 50 ng ul lul Biotherm Puffer 10X 5 ul dd H2O 38 5 ul Die PCR wurde in einem Thermocycler Cycler TC 312 Techne Staffordshire England nach folgendem Schema durchgef hrt Dunham 1995 2 min bei 94 C initiale Denaturierung 30 Zyklen mit jeweils 30 s bei 94 C Denaturierung 30 s bei 50 C Annealing 1 min bei 72 C Verl ngerung 5 min bei 72 C Verl ngerung Abk hlung auf 4 C 3 2 1 2 Agarose Gelelektrophorese Die Auswertung der PCR erfolgte durch Gelelektrophorese Dazu wurde 0 8 w v Agarose ultraPURE Invitrogen Karlsruhe in TAE Puffer gel st Zur Herstellung des TAE Puffers diente modifiziertes TAE Puffer Konzentrat 50X Modified TAE Buffer Millipore Billerica USA das mit Wasser auf die einfache Konzentration verd nnt und mit 100 ug l Ethidiumbromid Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe versetzt wurde Nach dem Aufkochen Material und Methoden 41 wurde die
2. Plasmid DNA 1 2 ug ml 4 2 ul Fspl 5 U ul 1 ul Puffer NEB 4 NEB GmbH Frankfurt 6 ul H20 dd 48 8 ul Nach der Inkubationszeit bei der f r das Enzym optimalen Reaktionstemperatur von 37 C wurde der Erfolg der Linearisierung mittels eines Agarosegels siehe 3 2 1 2 berpr ft Erwartet wird eine Bande in der Gr e von 6 kbp Das linearisierte Plasmid wurde anschlie end durch eine Phenol Chloroform Extraktion siehe 3 2 5 2 aufgereinigt und die Konzentration der Plasmid DNA im Photometer Gene Quant II DNA RNA Calculator Pharmacia Biotech GmbH Freiburg gemessen 3 2 1 3 Stabile Transfektion mit Metafectene Die Transfektion von pTRUE IL 2 IRES erfolgte wiederum mit dem Transfektionsreagenz Metafectene Biontex Laboratories GmbH Martinsried Zus tzlich wurde das Plasmid pCEF PAC das mit dem Restriktionsenzym HindIII NEB GmbH Frankfurt linearisiert und ebenfalls in einer Phenol Chloroform Extraktion siehe 3 2 5 2 aufgereinigt wurde stabil in die Zielzellen transfiziert Dieses Plasmid tr gt das PAC Resistenzgen Resitenz gegen das Antibiotikum Puromycin wodurch nach der Transfektion eine antibiotikumgest tzte Selektion erfolgreich transfizierter Zellen erfolgen kann Die BHK Tet on Zellen wurden nach den unter 3 2 6 2 beschriebenen Schritten vorbereitet und in einer 6 Well Platte ausges t Nachdem die zur Transfektion ben tigten L sungen vorbereitet wurden siehe 3 2 6 2 wurden L sungen mit folg
3. ursuersesseesnessnessnesnnesnnnsnnnsnensnennnenn 66 3 4 1 Testprinzip des RBA Mn nannte Bnesn ne 66 3 4 1 1 Zielzelllimie C TAG u a asien iEn HR ein 66 3 4 1 2 Gewinnung und Vorbereitung der NK Effektorzellen uu22042200200rsnernnennnennnennnenneennen 67 3 4 1 2 1 Effektorzellisolierung 0 2 2 482 285208 EAE E TE E E ara 67 3 4 1 2 2 Gewinnung der BHK Test berst nde 20 0 eee cece ceceeseecseceeeeceseceeaeceseceaecneecseeeeeeaeessesseeesees 67 3 4 1 2 3 Vorbehandlung f r 12 Stunden 20 eee cece ni a E O ES E REE ia 68 3 4 2 Durchf hrung des Rose Bengal Assays RBA ssssessessssssserssrsresresresresresresrsrenresresresresensesresresres 68 3 4 2 1 Vorbereitung der CTAC Zielzellen sinipa e a E A EI 68 3 4 2 2 Festansalz nu n erniekrensin in BB E r eig 68 3 4 2 3 Rose Beng l F rbung u a en Baresbar at eig DR 69 3 4 2 4 Berechnung der Zytotoxizit t u sonen sen both 70 3 5 Quantifizierung des sezernierten rekombinanten kaninen Interleukin 2 im Bio ssay MTT Test en RBB unse 70 3 5 1 IL 2 Bioassay MIECTLL 2 Zellen 2 22 ame 70 3 5 1 1 ETEL 2 Zelllnie 22 2 28 2 ap pr kn 70 3 5 1 2 Prinzip des Bidassays a ale Bares a gt DI sinn 72 3 5 1 2 1 BHK Kult r berst nde 2 8n2ee een eo iN un ame EEE ah 72 3 5 1 2 2 Ansatz des BIO assays insere aen ss ciiuvictinnseecbse suse cs cand gsc eveseestevtooes ken EEE e immun sinn 73 3 5 2 Verschiedene Versuchsans tze des Bioassa
4. Anhang 181 92 Bezugsquellen f r Chemikalien ABgene Hamburg Superladder Low 100bp Ladder SSL 100S Typ H Sample Loading Buffer 6X AB 0584 Alexis Biochemicals Gr nberg Doxyzyklin LKT D5898 PAC Puromycin ALX 380 028 Amersham Biosciences GmbH Freiburg Thermo Sequenase Flourescent Labelled Cycle Sequencing Kit with 7 Deaza dGTP 78500 Applied Biosystems GmbH Darmstadt GeneAmp RNA PCR Core Kit N8080143 Biochrom KG Berlin Penicillin Streptomycin 10 000 U ml bzw 10 000 ug ml A 2212 Biontex Laboratories GmbH Martinsried Metafectene T020 BioRad Laboratories GmbH Miinchen Bromphenolblau 1610404 Biozym Hessisch Oldendorf Small DNA Agarose Calbiochem Darmstadt G418 Sulfat 345812 Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe Agar Agar 2266 Ampicillin K029 Bors ure 6943 Chloroform 6340 Ethanol 5054 Ethidiumbromid 7870 Formamid P040 Hydroxycholin 3406 Isopropanol CP41 Kaliumacetat T874 Lithiumchlorid P007 NaOH 9356 Roti Phenol 0038 Roti Phenol Chloroform Isoamylalkohol A156 Tris A411 Tris HCl 9090 Trypanblau 23850 X Gal CN22 Fluka Buchs Schweiz Ethanol 41322 Orange G 75380 ICN Biomedicals Costa Mesa USA Minimum Essential Medium Eagle s mit Earl s Salzen 12103 Trypsin EDTA 1689149 182 Anhang Invitrogen Karlsruhe Agarose 1000 10975 035 Agarose ultraPURE 15510 DMEM Pulver 52100 1 kb DNA Leiter 15615 SuperScript II RT 18064 TOPO TA Cloning Kit K 46
5. Ergebnisse Abbildung 23 CTLL 2 Zellen im MTT Test mittlere Formazankristallbildung erkennbar an zahlreichen blaugrau gef rten CTLL 2 Zellen und nadelartig angeordneten Formazankristallen Gewebekulturmikroskop 10x Abbildung 24 CTLL 2 Zellen im MTT Test starke Formazankristallbildung hier nahezu alle CTLL 2 Zellen blaugrau angef rbt Gewebekulturmikroskop 10 x 108 Ergebnisse 4 4 1 Einfluss unterschiedlich eingesetzter BHK Zellkonzentrationen und Inkubationszeiten Die verschiedenen BHK Klone wurden in verschiedenen Screening Untersuchungen auf die von ihnen produzierte Menge an rcIL 2 nach der Induktion mit Doxyzyklin berpr ft Wurde eine Zellkonzentration von 1 5 x 10 Zellen ml eingesetzt und die rcIL 2 Produktion f r 24 h durch Doxyzyklin induziert zeigten die transfizierten BHK Klone A5 A5 1 A5 2 A5 3 und A5 4 eine Produktion von 3 85 ng 2 19 ng 0 70 ng 1 30 ng und 1 59 ng rcIL 2 ml Grafik 4 Tabelle 25 Diese Zellklone wiesen eine basale uninduzierte rcIL 2 Produktion von 0 18 ng 0 50 ng 0 57 ng 0 45 ng und 0 48 ng rcIL 2 ml auf Der Unterschied zwischen den induziert und uninduziert produzierten rcIL 2 Konzentrationen war bis auf BHK Klon A5 2 in allen F llen statistisch signifikant jeweils p 0 008 Letzterer wies hingegen eine nicht signifikante Induktion der rcIL 2 Produktion auf p 0 915 5 0 45 4 0 Jop 3 5 L 3 0 Ouninduziert O induziert rcIL 2 Konzentr
6. Material und Methoden 33 3 1 5 3 Reverse Transkriptase Reaktion F r die RT Reaktion und die anschlie ende konventionelle PCR wurde das GeneAmp RNA PCR Core Kit Applied Biosystems GmbH Darmstadt verwendet Beide Schritte wurden in einem mit beheizbarem Deckel ausgestatteten PCR Thermocycler Multicycler PTC 200 durchgef hrt Die reverse Transkiption der mRNA zu DNA erfolgte nach dem Prinzip des Random Priming Die Zusammensetzung des Mastermixes mit einem Endvolumen von 8 5 ul ergibt sich aus Tabelle 3 Tabelle 3 Zusammensetzung des RT Mastermixes MgCl 25mM 2 ul 10X PCR Puffer KCI Tris HCl 1 ul dGTP 10 mM 1 ul dTTP 10 mM 1 ul dATP 10 mM 1 ul dCTP 10 mM 1 ul RNase Inhibitor 20 U l 0 5 ul murine reverse Transkriptase 50 U ul 0 5 ul Random Hexamers 50 uM 0 5 ul Zu diesem Mastermix wurden 1 5 ul der DNase behandelten RNA zugegeben wodurch sich f r den Reaktionsansatz ein Volumen von 10 ul ergab Dieser RT Ansatz wurde zun chst f r 8 min bei 21 C Temperaturadaptation der Oligonukleotid Hexamere danach f r 15 min bei 42 C Binden der Hexamere an die RNA Elongation durch die murine reverse Transkriptase anschlie end f r 5 min bei 96 C Inaktivierung der reversen Transkriptase L sen von RNA DNA Heteroduplexen und zum Abschlu f r mindestens 5 min bei 4 C Abk hlen des Reaktionsansatzes inkubiert 3 1 5 4 Konventionelle PCR F r dies
7. l Ss H5 Bem 8 gt SS 4 2B i rc 10 Zellen ml er BHK Klone 13 x e und Standardabweichungen n 5 der produzierten ieden LO lt 5 Ergebnisse 111 4 4 2 Koinkubation von transfizierten BHK Klonen mit CTLL 2 Zellen in Transwell Eins tzen Bei der Koinkubation der BHK Klone A5 A5 3 und A5 4 mit CTLL 2 Zellen wiesen die Klone A5 und A5 4 einen signifkanten Unterschied zwischen uninduziert und induziert sezernierten rcIL 2 Menge auf p 0 008 Dabei lagen die induziert erzielten Mengen bei 3 78 ng und 3 12 ng rcIL 2 ml wohingegen die basal abgegebene rcIL 2 Mengen 2 26 ng und 2 42 ng ml betrugen Grafik 6 Tabelle 28 BHK Zellklon A5 3 zeigte in dieser Versuchsanordnung keine signifikante Induzierbarkeit der rcIL 2 Produktion p 0 173 Die uninduzierte rcIL 2 Sekretion lag mit 2 47 ng ml sogar noch leicht ber der der induzierten Ans tze die 2 31 ng rcIL 2 ml betrug Oluninduziert 5 0 E x N y 5 o Binduziert 5 U 1 5 y Grafik 6 Mittelwerte und Standardabweichungen n 5 der produzierten rcIL 2 Konzentrationen der BHK Klone A5 A5 3 und A5 4 im Laufe der Koinkubation mit CTLL 2 Zellen Transwell Eins tzen Produktionsdauer 72 h 112 Ergebnisse 4 4 3 Zeitlicher Verlauf der rcIL 2 Produktion ber 72 h Weiterhin wurde der Verlauf der rcIL 2 Produktion durch die BHK Klone A5 A5 1 und A5 2 ber 72 h unters
8. Migrationsproteine 2 3 Lymphozytenanreicherung F r die Gewinnung der f r kanines IL 2 kodierenden mRNA werden IL 2 produzierende Zellen z B aus Milz Lymphknoten oder Blutlymphozyten ben tigt Die Anreicherung aus Vollblut f hrt hierbei zu einer hohen Zellausbeute bei relativ schneller und leichter Durchf hrung der Arbeitsschritte Au erdem kann von einem individuellen Spender ohne nachteilige Wirkung mehrfach Blut gewonnen werden w hrend dies bei Milz oder Lymphknotengewebe nicht ohne Weiteres m glich ist Zur Anreicherung von verschiedenen Fraktionen der peripheren Blutlymphozyten PBL macht man sich die unterschiedliche spezifische Dichte einzelner Leukozytenpopulationen zunutze Die inzwischen am h ufigsten angewendete Isolierungsmethode beruht auf der Zentrifugation verd nnter und mit Gerinnungshemmern versetzten Vollblutproben ber einen einstufigen Dichtegradienten mit einer spezifischen Dichte von 1 077 g ml Boyum 1968 Damit gelang erstmals die sehr reine Isolierung mononukle rer Zellen aus dem Blut In der Humanmedizin wird heute routinem ig das Trennmedium Ficoll Hypaque eingesetzt womit Literatur bersicht 13 mononukle re Zellen mit einer geringen spezifischen Dichte von Granulozyten und Erythrozyten die eine h here spezifische Dichte besitzen und somit unter dem Trennmedium sedimentieren abgetrennt werden k nnen Auch bei den Haustieren wurde die Gradientenzentrifugation mit Ficoll Hypaque zur Lymp
9. e erwartet Auf Abbildung 17 ist zu erkennen dass von 6 isolierten Kolonien 5 ein ordnungsgem zusammengesetztes Plasmid aufwiesen In Plasmid aus Bahn 4 wurde kein Insert einkloniert 3 kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 17 Agarosegel nach dem analytischen Verdau von 6 Kolonien pTRUE IL2 IRES mit Mlul und PstI Bahn 1 und 7 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 bis 6 pTRUE IL2 IRES AMluVPsrtl Ergebnisse 97 Zur weiteren Verwendung wurde das Plasmid aus Bahn 2 gew hlt Mit diesem erfolgte eine Retransformation und eine Plasmid Midi Pr paration die eine DNA Menge von 1 2 ug ul ergab Die bereinstimmung des Plasmid pTRUE IL2 IRES aus Mini und Midi Pr paration wurde durch einen erneuten analytischen Verdau mit Mlul und PstI berpr ft Abbildung 18 wobei die erwarteten Banden denen von Abbildung 17 entsprachen Das Bandenmuster stimmte in beiden F llen berein 3kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 18 Agarosegel nach dem analytischen Verdau von pTRUE IL2 IRES aus Mini und Midi Pr paration mit Mlul und PstI Bahn 1 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 pTRUE IL2 IRES AMluV Pstl aus Mini Pr paration Bahn 3 pTRUE IL2 IRES AMluV Pstl aus Midi Pr paration 98 Ergebnisse 4 2 5 Transiente Transfektion von pTRUE IL2 IRES in BHK Tet on Zellen Die transiente Transfektion des Plasmids pTRUE IL2 IRES in BHK Tet on Zellen diente zur Uberpriifung der Funktion des Reportergens Luciferase Dazu wurde das nicht linearis
10. 1994 Receptors for Interleukin 2 IL 2 In Nicola N A Hrsg Guidebook to Cytokines and Their Receptors Oxford University Press Inc Oxford S 31 37 Wagner U 1998 Ermittlung optimaler Parameter fiir die in vitro Stimulation von Hundeblutlymphozyten mit Concanavalin A Con A und Phytoh magglutinin PHA zur Gewinnung von kaninem Interleukin 2 IL 2 aus Zellkultur berst nden Vet Med Diss Justus Liebig Universit t Giessen 148 Literaturverzeichnis Wagner U Burkhardt E Failing K 1999 Evaluation of canine lymphocyte proliferation comparison of three different colorimetric methods with the 3H thymidine incorporation assay Vet Immunol Immunopathol 70 151 159 Wang X Rickert M Garcia K C 2005 Structure of the quaternary complex of interleukin 2 with its alpha beta and gammac receptors Science 310 1159 1163 Yachnin S Svenson R H 1972 The immunological and physicochemical properties of mitogenic proteins derived from Phaseolus vulgaris Immunology 22 871 883 Yang F O Brien P C Milne B S Graphodatsky A S Solanky N Trifonov V Rens W Sargan D Ferguson Smith M A 1999 A complete comparative chromosome map for the dog red fox and human and its integration with canine genetic maps Genomics 62 189 202 Yang T T Sinai P Kitts P A Kain S R 1997 Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system Biotechniques 23 11
11. Grafik 3 Tabelle 24 0 400 0 350 0 300 U 0 250 O Effektorzellen und Zielzellen 0 200 V 7 Kontrollansatz ohne Effektorzellen 0 150 Optische Dichte 0 100 0 050 vorbehandelt in RPMI vorbehandelt in BHK Uberst nden 0 000 Grafik 3 Einfluss der Vorbehandlung von Effektorzellen in unterschiedlichen Medien auf die spontane Zytotoxizit t der Effektorzellen 106 Ergebnisse 4 4 Quantifizierung des sezernierten rekombinanten kaninen IL 2 im Bioassay MTT Test Die Quantifizierung der Proliferation der CTLL 2 Zellen erfolgte ber die optische Messung der Formazankristallbildung Diese war auch mikroskopisch gut nachweisbar Wenn keine Proliferation der CTLL 2 Zellen erfolge so war auch keine Formazankristallbildung in den CTLL 2 Zellen zu erkennen siehe Abbildung 21 Abbildung 21 CTLL 2 Zellen im MTT Test keine Formazankristallbildung alle CTLL 2 Zellen ungef rbt Gewebekulturmikroskop 10 x Je mehr rcIL 2 in den zu untersuchenden BHK berst nden vorhanden war umso st rker war die Proliferation der CTLL 2 Zellen und somit auch deren Gehalt an produzierten Formazankristallen siehe Abbildungen 22 24 Abbildung 22 CTLL 2 Zellen im MTT Test schwache Formazankristallbildung erkennbar am blaugrau gef rbten Zytoplasma einzelner CTLL 2 Zellen Gewebekulturmikroskop 10 x 107
12. Miinchen in deionisiertem Formamid Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe zugegeben wonach diese erneut fiir 2 min bei 40 C sowie fiir 2 min bei 70 C inkubiert wurden 3 2 4 2 Sequenziergel und Auswertung der Sequenz Die Probenauftrennung und die Detektion der Sequenz erfolgte mit dem LI COR 4000 L DNA Sequencer Li Cor Biosciences GmbH Bad Homburg Dazu wurden 0 2 mm dicke Polyacrylamidgele verwendet Nach Reinigung Entfettung und Zusammenbau der Glasplatten wurde die Polyacrylamidl sung durch einen 0 45 um Filter mittels einer Spritze 48 Material und Methoden zwischen die Platten gegossen Die Polyacrylamidl sung setzte sich aus 32 ml Sequagel XR National Diagnostics Atlanta USA 8 ml Sequagel Puffer National Diagnostics Atlanta USA 2 ml 10X LongRun Puffer 162 g Tris Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 27 5 g Bors ure Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 9 3 g EDTA Na Merck KGaA Darmstadt mit ddH2O auf 1 1 15 ml H20 8 g Harnstoff Merck KGaA Darmstadt 400 ul 10 igem APS Ammoniumpersulfat Invitrogen Karlsruhe und 20 ul TEMED Tetramethylethylendiamin Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen zusammen Nachdem die Gelsubstanz fiir mindestens eine Stunde auspolymerisierte wurden die Platten erneut von au en gereinigt und zwischen die Elektroden des Sequenzers gespannt Als Elektrophoresepuffer diente das 10X LongRun Konzentrat in einer Verdiinnung von 1 10 Zun chst wurde ein Vorlauf von 30 min durchgef
13. 1997 Yang et al 1997 genutzt Knezevic et al 1995 verwendeten BHK Zellen zur Expression von rekombinantem humanem Interleukin 2 Dazu nutzten sie das kommerziell erh ltliche Expressionsplasmid pRC RSV Invitrogen USA das keine Induktion zur Proteinexpression ben tigt sondern eine permanente Transkription der einklonierten Gensequenzen erm glicht Das von ihnen verwendete 486 bp gro e Insert basierte auf einer cDNA eines synthetischen IL 2 Gens aus pPL Lambda transfizierten HB101 E coli Knezevic et al 1996 Ihnen gelang eine IL 2 Produktion von 5 10 ng 10 Zellen in 24 h Zudem zeigten sie dass kommerziell erh ltliches rekombinantes IL 2 das durch E coli produziert wird und daher keine 24 Literatur bersicht Glykosilierung aufweist besonders in hohen Konzentrationen einen hemmenden Effekt auf die Proliferation von IL 2 anh ngigen CTLL 2 Zellen aus bt Glykosiliertes IL 2 von eukaryotischen BHK Zellen wies speziell bei l ngerer Kultivierung eine bessere Stimulation des Zellwachstums auf Die Arbeitsgruppe f hrte weiterhin Untersuchungen zur Kultivierung der adh renten BHK Zellen auf Mikrocarriern durch Knezevic et al 1995 Dadurch lassen sich eigentlich adh rente Zelllinien in Suspension kultivieren Die Verwendung der PE 2 Macroporous Carrier von IAM Wien sterreich die aus einer Mischung aus Polyethylen und Silikat bestehen erbrachte bei einer Serumkonzentration im Kulturmedium von 2 und 5 die b
14. Bei allen Klonen war eine basale cIL 2 Sekretion im nicht induzierten Zustand nachweisbar Zusammenfassung 131 Unter serumfreien Bedingungen lie sich die Produktion von cIL 2 durch die Zugabe von Doxyzyklin nicht induzieren Unterschiedliche induzierende Doxyzyklin Konzentrationen von 0 5 bis 5 ug ml ergaben cIL 2 Konzentrationen die den Verlauf einer Dosis Wirkungskurve mit einem Optimum bei 1 ug ml aufweisen Mit der niedrigsten 0 1 ug ml und h chsten 10 ug ml untersuchten Doxyzyklin Konzentration konnte hingegen jeweils eine nur schwache Induktion der cIL 2 Produktion erzielt werden 8 Diese cIL 2 produzierenden BHK Klone sollen im Rahmen der klinischen Anwendung f r die in vitro Stimulation von LAK Zellen durch Koinkubation mit angereicherten NK Zellen von Tumorpatienten in einem kommerziell erh ltlichen Bioreaktorsystem eingesetzt werden welches urspr nglich f r die einfache Herstellung monoklonaler Antik rper konstruiert worden war In einem solchen System k nnen beide Zellarten durch eine semipermeable Membran voneinander getrennt inkubiert werden cIL 2 kann die Membran durchdringen und so eine kontinuierliche Stimulation zu LAK hervorrufen w hrend ein direkter Zell Zell Kontakt verhindert wird Die IL 2 Gabe in Intervallen und die damit verbundene stark schwankende IL 2 Konzentration im Kulturmedium wie bei den bisherigen Kultursystemen wird dadurch vermieden Die auf diese Weise erzeugten LAK sollen in eine
15. Die IL 2 abh ngige Proliferation der CTLL 2 Zellen wird anschlie end durch den mitochondrialen Umbau von MTT Mosmann 1983 quantifiziert siehe Kapitel 2 5 Literatur bersicht 25 2 9 Rose Bengal Assay RBA Ein kolorimetrisches Verfahren zur Messung der Zytotoxizit t ist der Rose Bengal Assay RBA Gondolf 1994 Dieses Verfahren basiert auf der indirekten Messung der durch Effektorzellen lysierten Zielzellen Die Zytotoxizit t der Effektorzellen f hrt zur Abl sung der adh rent wachsenden Zielzellen die dann zusammen mit den Effektorzellen aus dem Kulturgef herausgewaschen werden Die verbliebenen adh renten und nicht abgel sten Zielzellen werden anschlie end mit dem Farbstoff Rose Bengal angef rbt Der aufgenommene Farbstoff wird nach dem Lysieren der Zellen mittels Ethanol in den berstand berf hrt und dessen optische Dichte OD in einem ELISA Reader bestimmt Dieser Wert wird dann in Verh ltnis zu der optischen Dichte einer Kontrollkultur von Zielzellen ohne Zusatz von Effektorzellen gesetzt Daraus wird der prozentuale Anteil der abgel sten Zielzellen bestimmt Gondolf et al 1996 f hrten zur quantitiven Bestimmung der Zytotoxizit t einen Vergleich zwischen dem Chromium Release Assays CRA einem Standardtest zur Zytotoxizit tsmessung und dem RBA durch Beim CRA werden die Zielzellen zun chst mit radioaktiv markiertem Na Chromat inkubiert Brunner et al 1968 Dieses wird spontan von den Zellen au
16. Die auf ihre rcIL 2 Produktion zu testenden BHK Zellen wurden in sterilen 25 cm Gewebekulturflaschen Dunn Labortechnik GmbH Asbach in einem CO Brutschrank Heraeus UB 6060 EK CO Heraeus Hanau bei 37 C in 5 iger CO 2 Atmosphiare kultiviert Als Kulturmedium diente steriles RPMI FKS siehe 3 5 1 1 Die Zellen wurden etwa alle 3 bis 4 Tage mit frischem Medium versorgt und einmal w chentlich passagiert Dazu wurde der Zellrasen zun chst mit Zellkulturmedium ohne FKS zur Entfernung von Serumresten gewaschen Anschlie end erfolgte die Zugabe von 3 ml Trypsin EDTA L sung ICN Biomedicals Costa Mesa USA und die Inkubation im Brutschrank f r etwa 5 min Danach wurden die nun als Einzelzellen vorliegenden Zellen in 5 ml RPMI FKS aufgenommen und bei 400 x g und 4 C f r 5 min zentrifugiert Anschlie end wurden sie je nach Testansatz siehe 3 5 2 1 in verschiedenen Zellkonzentrationen in einer 6 Well Platte Falcon Becton Dickinson Heidelberg ausges t wobei das Volumen des Zellkulturmediums 2 ml betrug Nach einer ersten Wachstumsphase im Brutschrank von etwa 24 h erfolgte die Induktion der rcIL 2 Produktion in den Zellen durch die Zugabe von Doxyzyklin Alexis Biochemicals Gr nberg zum Kulturmedium Die Doxyzyklin Stamml sung wurde durch L sen von 2 mg Doxyzyklin in 1 ml 96 igem Ethanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe Material und Methoden 73 hergestellt Zur Induktion wurden 5 ul dieser Doxyzyklin Stamml sung zuge
17. Messung 0 062 0 047 0 048 0 056 0 042 leerwertbereinigt BHK Linie A5 1 Leerwert OD 1 Messung 0 007 0 003 0 004 0 004 0 003 0 003 uninduziert OD 1 M roes ung 0 004 0 000 0 001 0 001 0 000 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 032 0 042 0 037 0 030 0 029 0 003 induziert OD 1 M Dp at 0 029 0 039 0 034 0 027 0 026 leerwertbereinigt BHK Linie A5 2 Leerwert OD 1 Messung 0 007 0 005 0 002 0 005 0 003 0 003 uninduziert OD 1 M en 0 004 0 002 0 001 0 002 0 000 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 008 0 005 0 004 0 004 0 003 0 003 induziert OD 1 M ae 0 005 0 002 0 001 0 001 0 000 leerwertbereinigt BHK Linie A5 3 Leerwert OD 1 Messung 0 007 0 005 0 006 0 005 0 005 0 003 uninduziert OD 1 M ee 0 004 0 002 0 003 0 002 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 030 0 023 0 027 0 024 0 024 0 003 induziert OD 1 M no eens 0 025 0 020 0 024 0 021 0 021 leerwertbereinigt BHK Linie A5 4 Leerwert OD 1 Messung 0 008 0 006 0 005 0 006 0 005 0 003 uninduziert OD 1 M ee 0 005 0 003 0 002 0 003 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 034 0 036 0 034 0 037 0 036 0 003 induziert OD 1 M ee 0 031 0 033 0 031 0 034 0 033 leerwertbereinigt 170 Anhang Tabelle 43a Messwerte zu Tabelle 26 BHK Linie AS Leerwert OD 1 Messung 0 005 0 005 0 005 0 005 0 006 0 000 OD 1 Messung 0 005 0 005 0 005 0 005 0 006 i 3 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 006 0 006 0 006 0 006 0 004 0 003 OD 2 Messung 0 003 0 003 0 003 0 003 0
18. Percoll Lymphozytenisolierung k nnte sich durch die verschiedenen Zellz hlmethoden ergeben haben W hrend bei Gondolf 1994 das Differentialblutbild durch manuelles Ausz hlen von 200 Leukozyten eines May Gr nwald Giemsa gef rbten Heparin blutausstriches erfolgte konnte in der vorliegenden Arbeit das automatische Advia 120 Hematology System Bayer Diagnostics M nchen der Klinik f r Kleintiere Abteilung Innere Medizin genutzt und das Differentialblutbild mittels Durchflu zytometrie bestimmt werden Die optimalen Parameter zur Stimulation der isolierten Lymphozyten durch das Lektin Concanavalin A Con A in einer Konzentration von 2 ug ml ber einen Zeitraum von 48 h bei einer Ausgangszellkonzentration von 15 x 10 Zellen ml und die Messung der Stimulation mit dem MTT Proliferationstest unter Bestimmung des Stimulationsindex SD aus der Optischen Dichte OD von unstimulierten und stimulierten Kulturen wurde von Wagner 1998 bernommen Einerseits wurde ein Makrokulturansatz eingesetzt um eine ausreichende Lymphozytenzahl zur mRNA Isolierung zu erhalten Erg nzend wurde ein Mikrokulturansatz verwendet um die Proliferation stimulierter und nicht stimulierter Lymphozyten kontrollieren und miteinander vergleichen zu k nnen Der SI lag bei 154 f r Makrokulturen und bei 146 f r die Mikrokulturkontrollans tze Damit war eine hohe bereinstimmung beider Ansa tze und eine sehr deutliche Stimulation der isolierten Lymphozyten erkenn
19. S E Berg K 1989 Re examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth cell kill J Immunol Methods 119 203 210 Harada T Kim D W Sagawa K Suzuki T Takahashi K Saito I Matsuura Y Miyamura T 1995 Characterization of an established human hepatoma cell line constitutively expressing non structural proteins of hepatitis C virus by transfection of viral cDNA J Gen Virol 76 Pt 5 1215 1221 Helfand S C Modiano J F Nowell P C 1992 Immunophysiological studies of interleukin 2 and canine lymphocytes Vet Immunol Immunopathol 33 1 16 Helfand S C Soergel S A Modiano J F Hank J A Sondel P M 1994 Induction of lymphokine activated killer LAK activity in canine lymphocytes with low dose human recombinant interleukin 2 in vitro Cancer Biother 9 237 244 Heo D S Park J G Hata K Day R Herberman R B Whiteside T L 1990 Evaluation of tetrazolium based semiautomatic colorimetric assay for measurement of human antitumor cytotoxicity Cancer Res 50 3681 3690 Huland E Heinzer H Huland H 1994 Inhaled interleukin 2 in combination with low dose systemic interleukin 2 and interferon alpha in patients with pulmonary metastatic renal cell carcinoma effectiveness and toxicity of mainly local treatment J Cancer Res Clin Oncol 120 221 228 Huland E Huland H Heinzer H 1992 Interleukin 2 by inhalation local therapy for meta
20. hrt 2000 V 37 mA 50 W 45 C Danach wurde ein 48er Haifischzahn Kamm eingesteckt und jeweils 1 ul der entsprechenden Probe pro Vertiefung einpipettiert Die Auftrennung der Proben erfolgte ber Nacht unter den gleichen Bedingungen wie der Vorlauf Durch die Funktionen Autogain und Autofocus des Software Programmes DataCollection wurde eine korrekte Einstellung der Optik des Lasers und des Scanners sowie eine optimale Signal Verst rkung sichergestellt Das virtuelle Bild des Gels konnte schon w hrend des Laufes betrachtet und sp ter mittels zugeh riger Software ImageAnalysis automatisch oder manuell ausgewertet werden Die Sequenzdateien wurden zusammen mit den zur Auswertung ben tigten Sequenzen ber eine FTP Verbindung auf einen Server des Deutschen Krebsforschungszentrums DKFZ in Heidelberg bertragen Hier stand das GCG Programm Paket Genetics Computer Group Madison Wisconsin USA im HUSAR System Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources zur Analyse der Daten zur Verf gung Zum Vergleich der erhaltenen mit den bereits bekannten Sequenzen wurde das Programm gap verwendet Die Ergebnisse wurden manuell berpr ft gespeichert und mittels Ausdruck dokumentiert 325 Zusammenbau des Plasmides pTRUE IL2 IRES Zur Expression von Proteinen durch eukaryotische Zellen mit Hilfe des Tet on Systems ist die Transfektion zweier Plasmide erforderlich Das erste Plasmid Regulator Plasmid Kodiert f r den r
21. induziert rcIL 2 Konzentration 18 888 18 004 19 326 19 062 11 683 17 393 3 230 A5 1 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 025 0 028 0 024 0 028 0 024 uninduziert rcIL 2 Konzentration 7 021 7 319 6 869 7 394 6 862 7 093 0 250 OD 0 104 0 074 0 093 0 080 0 072 induziert rcIL 2 Konzentration 14 302 11 640 13 296 12 158 11 468 12 573 1 202 A5 2 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 019 0 017 0 015 0 012 0 017 uninduziert rcIL 2 Konzentration 6 222 5 940 5 711 5 237 5 945 5 811 0 368 OD 0 028 0 031 0 026 0 027 0 022 induziert rcIL 2 Konzentration 7 335 7 664 7 165 7 272 6 621 7 211 0 379 A5 3 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 002 0 002 0 001 0 000 0 001 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 000 0 000 1 015 0 000 1 015 0 406 0 556 OD 0 037 0 045 0 046 0 043 0 016 induziert rcIL 2 Konzentration 8 290 9 070 9 209 8 880 5 797 8 249 1 415 A5 4 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 005 0 004 0 003 0 006 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 3 714 3 250 2 729 3 756 2 854 3 261 0 474 OD 0 051 0 046 0 042 0 044 0 039 induziert rcIL 2 Konzentration 9 624 9 210 8 784 8 961 8 493 9 015 0 430 Anhang 153 Tabelle 26b Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Meng
22. tze f r 24 h serumhaltiges Kulturmedium um ein Anwachsen und Proliferieren der Zellen zu gew hrleisten In der zweiten Phase die ebenfalls 24 h dauerte wurden die Ans tze in zwei Gruppen aufgeteilt wovon eine weiterhin als Kontrolle mit serumhaltigem Medium versorgt wurde die zweite hingegen serumfreies Medium bekam Je Gruppe wurde ein Ansatz in der ersten Phase induziert ein Ansatz in der zweiten Phase w hrend ein dritter Ansatz nicht induziert wurde Die drei Gruppen die in der zweiten Versuchsphase serumfreies Kulturmedium erhalten hatten produzierten immer eine geringere Menge an rcIL 2 unabh ngig vom Zeitpunkt der Induktion Grafik 10 Tabelle 32 Die rcIL 2 Konzentration lag im Falle einer Inkubation mit serumfreien Kulturmedium uninduziert bei 3 03 ng ml Eine Induktion der Produktion in der ersten Versuchsphase ergab einen rcIL 2 Gehalt von 2 28 ng ml Wurde die rcIL 2 Sekretion in der zweiten Phase angeschaltet lag die produzierte Menge bei 2 42 ng ml O keine Induktion O Induktion in der 1 Phase Induktion in der 2 rclL 2 Konzentration in ng ml oO _ N wo gt ol O N 00 2 Phase ohne FCS 2 Phas mit FCS Grafik 10 Mittelwerte und Standardabweichungen n 5 der produzierten rcIL 2 Konzentrationen des BHK Klons A5 1 Phase der Inkubation 24 h f r alle Ans tze in serumhaltigem Medium Induktion mit jeweils 5 ug Doxyzyklin ml 116 Ergebnisse Erhielten die BHK Zellen
23. von cIL 2 Um die Produktion von rekombinantem kaninem IL 2 rcIL 2 zu erreichen sollte die Gensequenz f r cIL 2 als Copy DNA cDNA aus den angereicherten und stimulierten Lymphozyten gewonnen werden Dazu diente die RT PCR Technik Bei diesem Verfahren wird zun chst zellul re Messenger RNA in einen DNA Strang umgeschrieben Baltimore 1970 Temin und Mizutani 1970 Dies geschieht durch reverse Transkriptasen wie z B die des Avian Myeloblastosis Virus AMV oder des Molony Murine Leukemia Virus Als Primer werden meist unspezifische Oligonukleotid Hexamere verwendet In anschlie enden PCR Zyklen wird der DNA Strang amplifiziert Die dadurch gewonnene Gen Sequenz entspricht nicht der genomischen Sequenz des entsprechenden Proteins Da eine mRNA als Matrize dient fehlen die durch Splei Vorg nge entfernten Introns Somit ist die cDNA eines Gens jeweils um die Introns k rzer als das entsprechende genomische Gen Dunham 1995 synthetisierte eine cCDNA f r cIL 2 mit Oligonukleotid Primern die anhand konservierter 5 und 3 Regionen gew hlt wurden Die PCR bestand aus 30 Zyklen mit je 1 min bei 90 C Denaturierung 1 min bei 50 C Anlagerung der Primer und 1 min bei 72 C Elongation Dadurch konnte eine cDNA mit einer L nge von 653 bp gewonnen werden NCBI Accession No D30710 Sie zeigte einen offenen Leserahmen von 465 bp der von einem 31 bp langen nichtkodierenden Abschnitt am 5 Ende und einem 157 bp langen nichtkodie
24. 0 2 g KCI ad 1000 ml H20 dest pH mit 1 N HCI einstellen Phosphate buffered Saline PBS pH7 4 21 76 g NaCl krist 3 592 g Na HPO x 2 H O p a 0 544 g KH PO p a 420 ml H O dest Rose Bengal Gebrauchsl sung 0 25 0 25 g Rose Bengal ad 100 ml NaCl PBS mischen im K hlschrank aufbewahren 10X Tris Bors ure EDTA Puffer TBE 108 0 g Tris hydroxymethyl aminomethan 0 9 M 55 0 g Bors ure 0 9 M 40 ml EDTA pH 8 0 ad 1000 ml H O dest autoklavieren Anhang 187 Trypanblaul sung 0 36 360 mg Trypanblau ad 100 ml 0 9 NaCl L sung filtrieren Danksagung An dieser Stelle m chte ich mich bei allen bedanken die zum Gelingen dieser Doktorarbeit beigetragen haben Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof Dr Eberhard Burkhardt f r seine jederzeit gew hrte Unterst tzung seine guten Ideen und seine Geduld Weiterhin bedanke ich mich bei Prof Dr Manfred Reinacher f r die freundliche Aufnahme an seinem Institut Prof Dr Norbert Tautz der mir die M glichkeit gab das Tet on System zu nutzen und seiner Arbeitsgruppe Dr Alexandra M ller Dr Tobias Lackner und Sylvaine Jacobi f r die tatkr ftige Unterst tzung bei der Herstellung meiner Plasmide Dr Werner Hecht f r die Hilfe bei molekularbiologischen Arbeiten Prof Dr Reto Neiger und seinen Mitarbeitern an der Klinik f r Kleintiere Abteilung Innere Medizin f r die berlassung der Blutspendehunde und der Unterst tzung bei der Blutentnahme un
25. 001 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 152 0 140 0 148 0 150 0 075 0 000 ODT Messing 0 152 0 140 0 148 0 150 0 075 e i leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 144 0 142 0 155 0 149 0 076 0 003 OD 2 Messung 0 141 0 139 0 152 0 146 0 073 leerwertbereinigt BHK Linie A5 1 Leerwert OD 1 Messung 0 020 0 023 0 023 0 028 0 021 0 000 OD 1 Messung 0 020 0 023 003 0 028 0 021 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 033 0 035 0 027 0 031 0 029 0 003 OD 2 Messung 0 030 0 032 0 024 0 028 0 026 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 112 0 074 0 097 0 081 0 071 0 000 OD t Messung 0 112 0 074 0 097 0 081 0 071 i f leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 098 0 076 0 091 0 081 0 076 0 003 OD 2 Messung 0 095 0 073 0 088 0 078 0 073 leerwertbereinigt BHK Linie A5 2 Leerwert OD 1 Messung 0 020 0 018 0 017 0 012 0 017 0 000 PD Messung 0 020 0 018 0 017 0 012 0 017 R 5 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 020 0 018 0 016 0 015 0 019 0 003 OD Messung 0 017 0 015 003 0012 0 016 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 029 0 028 0 025 0 024 0 021 0 000 OD 1 Mess ng 0 029 0 028 0 025 0 024 0 021 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 029 0 036 0 030 0 033 0 025 0 003 OD 2 Messing 0 026 0 033 0 027 0 030 0 022 leerwertbereinigt Anhang 171 Tabelle 43b uninduziert induziert uninduziert induziert uninduziert induziert Messwerte zu Tabelle 26 A5 3 BHK Linie Leerw
26. 004 0 003 0 001 OD 2 Messung 0 001 0 001 0 001 0 003 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 040 0 041 0 041 0 043 0 034 0 000 SD Messing 0 040 0 041 0 041 0 043 0 034 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 041 0 040 0 044 0 046 0 036 0 001 OD 2 Mes n g 0 040 0 041 0 043 0 045 0 035 leerwertbereinigt BHK Linie A5 4 Leerwert OD 1 Messung 0 002 0 001 0 003 0 003 0 002 0 000 OD 1 Messung 0 002 0 001 0 003 0 003 0 002 R leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 002 0 001 0 003 0 004 0 004 0 001 OD 2 Messung 0 001 0 000 0 001 0 003 0 003 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 064 0 059 0 061 0 068 0 051 0 000 OD 1 Messung 0 064 0 059 0 061 0 068 0 051 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 062 0 059 0 064 0 066 0 053 0 001 ED ee Messung 0 061 0 058 0 063 0 065 0 052 leerwertbereinigt Anhang 175 Tabelle 45 Messwerte zu Tabelle 28 BHK Linie A5 Leerwert OD 1 Messung 0 025 0 020 0 043 0 029 0 032 0 000 OD 1 Messung 0 025 0 020 0 043 0 029 0 032 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 029 0 022 0 040 0 028 0 030 0 001 OD Meute 0 028 0 021 0 039 0 027 0 029 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 123 0 125 0 127 0 130 0 123 0 000 OD 1 Mess ng 0 123 0 125 0 127 0 130 0 123 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 125 0 131 0 132 0 124 0 119 0 001 OD ie Mess ng 0 124 0 130 0 131 0 123 0 118 leerwertbereinigt BHK Linie A5 3 Leerwert OD 1 Messung 0 047 0 045 0
27. 052 induziert rcIL 2 Konzentration 10 688 10 338 10 645 11 036 9 715 10 485 0 496 Anhang 155 Tabelle 28 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen 3 verschiedener BHK Linien nach Koinkubation mit CTLL 2 Zellen in Transwell Eins tzen eingesetzte Zellkonzentration 3x 10 Zellen ml Dauer der rcIL 2 Produktion 72h Originalmesswerte siehe Tabelle 45 A5 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe F Tabelle 39 OD 0 027 0 021 0 042 0 029 0 031 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 208 2 064 2 495 2 242 2 295 2 261 0 157 OD 0 124 0 128 0 130 0 127 0 121 induziert rcIL 2 Konzentration 3 744 3 809 3 834 3 793 3 696 3 775 0 055 A5 3 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit X s Standardverd nnungsreihe F Tabelle 39 OD 0 050 0 045 0 029 0 047 0 033 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 631 2 548 2 242 2 590 2 336 2 469 0 171 OD 0 036 0 028 0 022 0 040 0 036 induziert rcIL 2 Konzentration 2 385 2 231 2 076 2 469 2 385 2 309 0 156 A5 4 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit X s Standardverd nnungsreihe F Tabelle 39 OD 0 033 0 042 0 046 0 026 0 044 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 336 2 495 2 564 2 186 2 539 2 424 0 160 OD 0 070 0 091 0 078 0 086 0 086 induziert rcIL 2 Konzentration 2 947 3 254 3 063 3 178 3 171 3 123 0 120 156 Anhang Tabelle 29 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produziert
28. 1 Inkubation des Reaktionsansatzes bei Raumtemperatur f r 5 min 2 Abk hlung auf Eis 3 Auftauen von 100 ul der E coli Suspension auf Eis und Zugabe von 2 ul des Reaktionsansatzes Inkubation f r 30 min auf Eis Hitze Behandlung der Bakterien f r 30 s bei 42 C Abk hlung des Ansatzes auf Eis Zugabe von 250 ul S O C Medium Sch ttelinkubation f r 1 h bei 37 C SOK ee A A Ausplattieren des Ansatzes auf einer Agar Platte und Inkubation bei 37 C tiber Nacht 38 Material und Methoden Am folgenden Tag wurde eine eindeutig wei e Zeichen f r erfolgreiche Transfektion des Plasmids Bakterienkolonie mit einem autoklavierten Zahnstocher gepickt und damit ein Fl ssigkulturansatz von 50 ml LB Medium angeimpft Dieser wurde ber Nacht bei 37 C auf einem Sch ttler inkubiert Die Plasmid Isolierung erfolgte mit dem NucleoBond PC100 Plasmid DNA Purification Kit Macherey Nagel GmbH amp Co KG D ren nach Protokoll des Herstellers Anschlie end wurde die Messung der optischen Dichte OD der Plasmid L sung im Photometer Gene Quant II DNA RNA Calculator Pharmacia Biotech GmbH Freiburg durchgef hrt und daraus die Menge an Plasmid DNA berechnet 3 1 6 3 Restriktionsenzymverdau Zur Kontrolle der Klonierungsreaktion wurde der Vektor mit dem einklonierten PCR Produkt in einem Restriktionsenzymverdau geschnitten Dazu wurde das Restriktionsenzym EcoRI gew hlt f r welches zwei Schnittstellen flankierend zur Multiple Cloni
29. 1 DNase Behandluns 2 2 22s242 52 804 Be street nsnio he abe seien 31 3 1 5 2 Auswahlder Primer u 2420220822205 38408 ink e een E i 32 3 1 5 3 Reverse Transkriptase Reaktion 0 ese eeeesecesesesecececsceesecesecsseeseceseceseessessaesseecseesseseaeeaes 33 3 1 5 4 Konventionelle PER esses ainsi asciicies cities atest 8er tess is EEEE lasdyava least sts 33 3 1 5 5 Agarose Gelelektroph rese 2 2cc35isidsscaieedes asetesecscgiucg en veces sensdeenebentesctscunddvesesdeduacbsetuseeseunaes 34 3 1 5 6 Sequenzierung des RT PCR Produktes 022u2220ssnesnnesnnesnossnennnennnennnnsnonnnensnennnennnennnennnennen 35 3 1 6 Klonierung des RT PCR Produktes 220224422002002B0rnnennnennnennnennennnennnnnnnnsnensnennennnennnennnennen 35 3 1 6 1 N hrmedien und Bakterienstamm ursserssersnessesnnesnnssnennnennnnsnonsnensnennnennnennnennnennennnennnennn nn 37 3 1 6 2 Kl nierungsreaktion 2 242020 een oem E e EEEE E E a A a a eE ii 37 3 1 6 3 Restriktionsenzymverdau nieres 2 200200 veces ee a e E EES 38 3 1 6 4 Reklonierung und Sequenzierung des Plasmids sssesesseesesissrsresrsrssrsrtsrrsrrsresresrrsrseresesresrest 39 3 2 Teton EXPresSSiON 4 un una REE E i 39 3 2 1 Einbau von Restriktionsschnittstellen in das cIL 2 Gen ssessesesseesesserssrsrrsrrsresreerseresesresrestes 39 3 2 1 1 Primer und PER Beding ngen u 4 42 cues 048 42 eek te beson 39 3 2 1 2 Agarose GelelektrophOrese nu Beh
30. 1243 Brown J C Hunt R C 1978 Lectins Int Rev Cytol 52 277 349 Brunner K T Mauel J Cerottini J C Chapuis B 1968 Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51 Cr labelled allogeneic target cells in vitro inhibition by isoantibody and by drugs Immunology 14 181 196 Bubenik J Lotzova E Indrova M Simova J Jandlova T Bubenikova D 1992 Use of IL 2 gene transfer in local immunotherapy of cancer Cancer Lett 62 257 262 Burkhardt E 1975 Isolierung sowie licht und elektronenmikroskopische Charakterisierung mononukle rer Blutleukozyten des Haushuhnes Vet Med Diss Justus Liebig Universit t Giessen Cantrell D A Smith K A 1983 Transient expression of interleukin 2 receptors Consequences for T cell growth J Exp Med 158 1895 1911 Cantrell D A Smith K A 1984 The interleukin 2 T cell system A new cell growth model Science 224 1312 1316 Cerruti Sola S Kristensen F Vandevelde M de Weck A L 1984 Interleukin 1 and 2 like activities in the dog Vet Immunol Immunopathol 6 261 271 Chomczynski P Sacchi N 1987 Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction Anal Biochem 162 156 159 Chong Y C Duffus W P H Hannant D 1992 Natural killer cells in horses and specific pathogen free foals infected with equine herpesvirus Vet Immunol Immunopathol 33 103 113 Christiansen N P
31. 3 beschrieben isoliert und stand so direkt zur weiteren Verarbeitung zur Verf gung 3 2 3 Klonierung und Analyse beider PCR Fragmente Zur berpr fung der Sequenzen der amplifizierten Fragmente von cIL 2 siehe 3 2 1 und dem IRES Luciferase Komplex siehe 3 2 2 wurden diese PCR Produkte in den pGEM T Vektor von Promega Madison USA einkloniert Dieser Vektor erm glicht das Einklonieren von PCR Produkten mit Adenin berh ngen siehe auch 3 1 6 und vermittelt eine Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin 3 2 3 1 Ligation Sowohl das cIL 2 Fragment als auch das IRES Luciferase Fragment wurden in den pGEM T Vektor durch Ligation eingebaut Dazu diente die T4 DNA Ligase die unter ATP Verbrauch die kovalente Verkn pfung der 3 OH mit der 5 PO Gruppe an den Enden doppelstr ngiger DNA durch Bildung einer Phosphodiesterbindung katalysiert Die beiden Ligationsans tze setzten sich folgenderma en zusammen Material und Methoden 43 Tabelle 9 Ligationsansatz zur Einklonierung in den Vektor PGEM T Rapid Ligation Buffer 2X 5 ul Promega Madison USA pGEM T Vektor DNA 50 ng ul lul Insert DNA 3 ullentweder cIL2 Fragment oder IRES Luci Fragment T4 DNA Ligase 350 U ul 1 ul TaKaRa Saint Germain en Laye Frankreich Die Reagenzien wurden sorgfaltig gemischt und tiber Nacht bei 4 C inkubiert 3 2 3 2 Transformation der pGEM T Vektoren in E coli K12 DH5 Die Herstellung transformat
32. 41 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe F zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Ey ay und by Op x Be 0 2 ng ml xl xl xl xl xl xl 1 0 4 ng ml xl xl xl xl xl xl 1 0 8 ng ml 0 005 0 004 0 004 0 002 0 005 0 004 i 1 6 ng ml 0 010 0 011 0 014 0 010 0 006 0 010 2 3 13 ng ml 0 065 0 062 0 064 0 062 0 059 0 062 6 25 ng ml 0 140 0 132 0 128 0 119 0 125 0 128 f 12 5 ng ml 0 140 0 140 0 136 0 138 0 129 0 138 z 25 ng ml 0 129 0 130 0 129 0 142 0 124 0 129 5 50 ng ml 0 126 0 135 0 132 0 136 0 098 0 131 i kursiv h chster und tiefster Wert im Rahmen des Winsorisierens gestrichen nicht durchgef hrt Messwerte stellen bereits blankbereinigte Mittelwerte aus 2 Messungen dar Ex 0 133132 aH 4 877888 bu 9 643550 Anhang 169 Tabelle 42 Messwerte zu Tabelle 25 BHK Linie A5 Leerwert OD 1 Messung 0 004 0 004 0 004 0 004 0 005 0 003 ODl Messung 0 001 0 001 0 001 0 001 0 002 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 005 0 004 0 005 0 004 0 006 0 003 De Messung 0 002 0 001 0 002 0 001 0 003 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 065 0 067 0 055 0 056 0 041 0 003 OD Meute 0 062 0 064 0 049 0 053 0 038 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 065 0 050 0 051 0 059 0 045 0 003 OD 2
33. 8 w hrend der SI der Klone A2 A3 A4 A5 A9 A10 und Al2 lediglich bei 2 6 bis 14 6 lag Die h chste Menge an Luciferase produzierte im induzierten Zustand mit 604 230 der Klon A5 Die geringste Menge erreichte der induzierte Ansatz von Klon A8 mit nur 3 763 Die Schwankungen des produzierten Reportergens sind zum Einen auf die unterschiedliche Anzahl der integrierten pTRUE IL 2 Kopien in das Genom der Wirtszellen zur ckzuf hren Zum Anderen k nnen diese Unterschiede auch auf eine unterschiedliche Zelldichte in den zu testenden Ans tzen zur ckzuf hren sein Auch wenn die Ausgangszelldichte in allen Ans tzen gleich war ist es m glich dass nicht in jedem Ansatz die gleiche Anzahl an Zellen inkubiert wurde Die Zellen wurden zum Auss en suspendiert so dass gleichgro e Aliquots dieser Suspension nicht zwangsl ufig die gleiche Menge an Zellen aufwiesen Zus tzlich k nnen ber den Inkubationszeitraum Unterschiede in der Wachstumsrate der Zellen aufgetreten sein Eine besondere Rolle nimmt Klon All ein Hier lag die Luciferase Aktivit t im induzierten Zustand mit 27 105 unter der des nicht induzierten Ansatzes die 41 632 betrug Dieser Klon verhielt sich also nach dem Tet off System Gossen et al 1995 Der Unterschied zwischen dem Tet off und dem Tet on System liegt in einem Austausch von vier Aminos uren im Tetrazyklinrepressor tetR was zu einer Konformations nderung des Proteins und damit einem ver nderten Bindungsverhalten am
34. Clin Invest 101 2406 2414 Dunham S P Argyle D J Onions D E 1995 The isolation and sequence of canine interleukin 2 DNA Seq 5 177 180 Dybkaer K Iqbal J Zhou G Geng H Xiao L Schmitz A d Amore F Chan W C 2007 Genome wide transcriptional analysis of resting and IL2 activated human natural killer cells gene expression signatures indicative of novel molecular signaling pathways BMC Genomics 8 230 Faldyna M Leva L Knotigova P Toman M 2001 Lymphocyte subsets in peripheral blood of dogs a flow cytometric study Vet Immunol Immunopathol 82 23 37 Falkenberg F W Weichert H Krane M Bartels I Palme M Nagels H O Fiebig H 1995 In vitro production of monoclonal antibodies in high concentration in a new and easy to handle modular minifermenter J Immunol Methods 179 13 29 Funk J 2001 Quantitative Untersuchungen zur Zytotoxizit t und Mitogenstimulation isolierter Blutleukozyten von Hunden mit unterschiedlichen Tumoren Vet Med Diss Justus Liebig Universit t Giessen Funk J Schmitz G Bach U Failing K Burkhardt E 2003 Influence of different tumour types on natural cytotoxicity NK cell activity and mitogen induced lymphocyte proliferation in isolated blood lymphocytes from 110 dogs with tumours Res Vet Sci 74 129 135 Funk J Schmitz G Failing K Burkhardt E 2005 Natural killer NK and lymphokine activated killer LAK cell functions from
35. IU l Penicillin und 0 1 g l Streptomycin beides Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen zugesetzt wurde Zur Selektion auf Zellen die stabil das Plasmid pEF Tet on im Genom enthalten wurden dem Kulturmedium das Antibiotikum Neomycin G418 Sulfat Calbiochem Darmstadt dessen Resistenz auf dem Plasmid vermittelt wird im Verh ltnis 1 400 zugesetzt Das Passagieren der Zellen erfolgte je nach Dichte des Monolayers in einem Abstand von drei bis vier Tagen Dazu wurde der berstand abgenommen und der Zellrasen mit 5 ml PBS 137 mM NaCl 2 7 mM KCI 4 3 mM NaHPO 1 47 mM KH3 PO auf pH 7 4 mit HCl gesp lt Die Zellen wurden anschlie end mit 1 ml Trypsin 2 5 g l Trypsin 16 mg l Phenolrot 3 3 mM EDTA in PBS bedeckt und f r etwa 3 min im Brutschrank bei 37 C inkubiert Durch Resuspension in 10 ml Zellkulturmedium wurden die Zellen abgel st und vereinzelt on dieser Suspension wurde in eine neue Schale mit 10 ml Zellkulturmedium gegeben und wieder unter den oben genannten Bedingungen inkubiert 3 2 6 2 Transiente Transfektion mit Metafectene Bei Metafectene Biontex Laboratories GmbH Martinsried handelt es sich um ein polykationisches Transfektionsreagenz das in Kombination mit einem neutralen Kolipid in liposomaler Form vorliegt Die zu transfizierende DNA bildet laut Herstellerangabe damit einen Komplex der per Endozytose in die Zellen aufgenommen wird In der Zelle wird durch Endosome Buffering und Repulsive Membran
36. P4333 Rose Bengal R3877 TEMED T9281 Trypsin T1426 TaKaRa Saint Germain en Laye Frankreich T4 DNA Ligase 2011 184 Anhang 9 3 Bezugsquellen f r Ger te und Einmalartikel Bayer Diagnostics M nchen Advia 120 Hematology System Biometra Spannungsquellen Agarosegelelektrophorese Biozym Hessisch Oldendorf PCR Thermocycler Multicycler PTC 200 Pipettenspitzen Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 2 ml Kryor hrchen Rotilabo Spritzenfilter 0 45 um P667 Rotiprotect Latex Handschuhe Rotiprotect Nitril Handschuhe Consort Belgien Microcomputer Electrophoresis Power Supply Costar Cambridge USA Transwell Eins tze 6 5 mm Dunn Labortechnik GmbH Asbach Gewebekulturflaschen 25 cm 3103 025 Eppendorf AG Hamburg Reaktionsgef e 0 5 ml 1 ml 2 ml Falcon Becton Dickinson Heidelberg 18 G Kan len 6 Loch Flachbodenplatte 48 Loch Flachbodenplatte 96 Loch Flachbodenplatte Zellkulturschalen 10 cm 15 ml Zentrifugenr hrchen Plastik Flow Laboratories Schweiz Titertek Microplate Washer S8 S12 Titertek Multiskan Plus ELIS A Photometer Forma Scientific Inc Marietta USA Brutschrank Steri Cult 200 Gilson International Bad Camberg Pipetten Heraeus Hanau Biofuge fresco Tischzentrifuge Biofuge Pico Tischzentrifuge Biofuge primo Tischzentrifuge CO Brutschrank UB 6060 EK CO Hettich Tuttlingen Hettich Rotanda K K hlzentrifuge 3512 ICN Biomedicals GmbH Eschwege Computerpr
37. Skubitz K M Nath K Ochoa A Kennedy B J 1988 Nephrotoxicity of continuous intravenous infusion of recombinant interleukin 2 Am J Med 84 1072 1075 Coley W B 1893 The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas with a report of ten original cases Am J Med Sci 105 487 511 Coley W B 1907 Sarcoma of the Long Bones The Diagnosis Treatment and Prognosis with a Report of Sixty Nine Cases Ann Surg 45 321 368 Literaturverzeichnis 137 Cook C G Splitter G A 1988 Lytic function of bovine lymphokine activated killer cells from a normal and a malignant catarrhal fever virus infected animal Vet Immunol Immunopathol 23 103 112 Cornish G H Sinclair L V Cantrell D A 2006 Differential regulation of T cell growth by IL 2 and IL 15 Blood 108 600 608 Costello R T Sivori S Marcenaro E Lafage Pochitaloff M Mozziconacci M J Reviron D Gastaut J A Pende D Olive D Moretta A 2002 Defective expression and function of natural killer cell triggering receptors in patients with acute myeloid leukemia Blood 99 3661 3667 Daemen A J Buurman W A vd Linden C J Groenewegen G Kootstra G 1984 Canine IL 2 characterization and optimal conditions for production Vet Immunol Immunopathol 5 247 258 Davis I D Jefford M Parente P Cebon J 2003 Rational approaches to human cancer immunotherapy J Leukoc Biol 73 3 29 Deleersnyder V Pil
38. Untersucht wurden u a Patienten mit Mammatumoren Leuk mien wie chronischer lymphatischer Leuk mie CLL oder chronischer myeloischer Leuk mie CML sowie Karzinome unterschiedlicher Histiogenese bersicht bei Funk 2001 Die Anzahl der isolierten NK Zellen der Tumorpatienten war allerdings im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen in den meisten Studien nicht signifikant erniedrigt Daher vermuteten einige Arbeitsgruppen dass ein Defekt der NK Zell Funktion und damit eine verminderte Effektivit t gegen ber Tumoren und deren Metastasen vorliegt die die Entstehung von Tumoren beg nstigt Neueste Untersuchungen zeigten dass Exosome die von Tumorzellen abgegeben werden einen negativen Einfluss auf die Perforin Sekretion sowie den Zellzyklus von NK Zellen und damit auf deren zytotoxische Aktivit t und Proliferation haben Jovic et al 2001 Taylor und Gercel Taylor 2005 Liu et al 2006 Zhang et al 2007 Costello et al 2002 fanden eine fehlerhafte bzw reduzierte Expression von Natural Cytotoxicity Rezeptoren NCR auf NK Zellen Weiterhin konnten abweichende Rezeptorexpressionen auf Tumorzellen nachgewiesen werden Bei der akuten 6 Literatur bersicht lymphoblastischen Leuk mie ALL wiesen Inukai et al 2006 eine verminderte Expression des Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand TRAIL Rezeptors und eine reduzierte Antwort auf Fas Ligand FasL sowie eine zus tzliche Expression von funktionslosen TRAIL
39. ab Cantrell 1984 B Zellen ben tigen zun chst eine Aktivierung durch Bindung von Immunglobulinen oder Staphylokokken Protein A um den nicht konstitutionell exprimierten IL 2R auf der Zelloberfl che pr sentieren zu k nnen Muraguchi et al 1985 Die IL 2 vermittelten Effekte liegen daraufhin in einer B Zell Proliferation und Immunglobulinsekretion wobei im fr hen Stadium der IL 2 Wirkung IgM Globuline produziert werden sp ter jedoch durch weitere IL 2 induzierte Zytokine von T Zellen der Switch auf IgG gef rdert wird Auch T Lymphozyten ben tigen eine Aktivierung durch Antigene ber den T Zell Rezeptor TCR um eine Reaktion auf IL 2 zeigen zu k nnen Dieser Antigen Kontakt bewirkt die IL 2R Expression auf T Zellen Die Sekretion von Zytokinen und lytischen Molek len wird durch TCR Kontakt initialisiert und durch IL 2 aufrechterhalten und verst rkt Cantrell und Smith 1983 Auf antigenaktivierte CD8 zytotoxische T Zellen wirkt IL 2 mitogen erh ht also die Zellteilungsrate und Proliferation Cornish et al 2006 Als Wachstumsfaktor erh ht IL 2 an aktivierten zytotoxischen T Zellen die Zellgr e Stoffwechselrate und Proteinsynthese Dies geschieht durch die vermehrte Expression von Aminos ure Rezeptor Komplexen was in einer erh hten Aufnahme von Aminos uren resultiert Gleichzeitig werden auch verst rkt Transferrin Transporter exprimiert um den f r Stoffwechselvorg nge n tigen Kofaktor Eisen der Zelle ausreichend zur
40. again complete conformity with the sequence published by Dunham et al 1995 The response plasmid pTRUE and the reporter gene were also digested by restriction enzymes which created sticky ends Then the three elements were ligated to form the response plasmid pTRUE IL 2 The response plasmid pTRUE IL 2 was transiently transfected to BHK Tet on cells which already contain the regulator plasmid pEF Tet on permanently integrated to their genome The expression of the luciferase was tested in a luciferase assay The induction of the tet on system by doxycyclin showed an approximately thousand fold increase of the luciferase activity Summary 133 5 After the stable transfection of pTRUE IL 2 to BHK Tet on cells 12 clones were tested on their expression of luciferase Out of these 11 clones revealed inducability with stimulation indexes ranging from 2 6 to 46 8 One clone A11 showed a reverse behaviour In this clone luciferase expression after induction was lower than without induction The underlying mechanism remains unclear Additional luciferase assays of recloned BHK lines proofed the inducability of the Tet on system after stable transfection Prior to the testing of the biological activity of the secreted cIL 2 the mRNA of cIL 2 was detected in transfected BHK cells by RT PCR 6 Further a possible release of factors from native BHK cells influencing the activity of effector cells by stimulating or blocking their cytotoxic activity
41. al 1995 Das Gen des cIL 2 liegt auf Chromosom 19 Yang et al 1999 Die N terminalen Aminos uren 1 bis 20 stellen eine hydrophobe Signalsequenz dar die zur Reifung und Sekretion des Proteins abgespalten wird hnlich dem hIL 2 besitzt cIL 2 eine Disulfidbr cke zwischen Cys und Cys Die Nukleotid Sequenz der cDNA von cIL 2 zeigt eine Homologie von 92 zu felinem 88 zu humanem 88 zu equinem 82 zu bovinem und 74 zu murinem IL 2 Auf Proteinebene liegt eine bereinstimmung von 90 zu felinem 86 zu humanem 84 zu equinem 76 zu murinem und 75 zu bovinem IL 2 vor IL 2 wird in erster Linie von Ty1 Zellen nach Stimulation produziert Mosmann et al 1986 Andere lymphatische Zelltypen sind jedoch auch in der Lage geringe Mengen an IL 2 zu sezernieren wie zytotoxische T Zellen Rosenberg et al 1986 oder dendritische Zellen Granucci et al 2001 Die Stimulation der Tyul Zellen zur IL 2 Sekretion kann durch Lektine wie Concanavalin A Mosmann et al 1986 induziert werden Das von aktivierten 10 Literatur bersicht Makrophagen nach Antigenkontakt abgegebene IL 1 wirkt ebenfalls aktivierend auf die IL 2 Produktion durch Ty1 Zellen Cantrell 1984 2 2 2 IL 2 Rezeptor IL 2 bindet an einen heterotrimeren Rezeptor auf der Zelloberfl che der sich aus den Untereinheiten IL 2Ra CD25 p55 IL 2R CD122 p70 und y zusammensetzt Voss 1994 Die IL 2R Untereinheit weist in ihrem extrazellul
42. bietet auf Ebene der mRNA eine weitere Ansatzstelle f r Ribosomen so dass beide Proteine parallel translatiert werden k nnen Literatur bersicht 23 Schema 3 Schematische Darstellung des Response Plasmids pTRUE cIL2 zur Expression von rcIL 2 Pmincmv minimaler Promotor des Cytomegalievirus cIL 2 Gensequenz f r cIL 2 IRES Internal Ribosomal Entry Site Luciferase Reportergen 2 7 4 Empfangerzellen des Tet on Sytems Gossen und Bujard f hrten ihre Untersuchungen zum Tet System zun chst haupts chlich an HeLa Zellen Zervixkarzinom Zelllinie durch Gossen und Bujard 1992 Gossen et al 1995 Sp ter kamen weitere Zelllinen wie HEK293 Embryonale Nierenzellen dazu Li et al 2004 nutzten die stromale Knochenmark Zelllinie QXMSC1 zur Tet on Expression von Zytokinen Prinzipiell lassen sich jedoch alle S ugerzellen mit diesem Expressionssystem transfizieren F r diese Arbeit wurden als Empf ngerzellen des Tet on Systems und zur Produktion des rcIL 2 die Zelllinie BHK 21 gew hlt Dabei handelt es sich um fibroblastische Zellen der Niere des Goldhamsters Mesocricetus auratus Diese Zelllinie wurde bereits 1961 etabliert Macpherson und Stoker 1962 Macpherson 1963 und wird haupts chlich f r Zytotoxizit tstests ISO 10993 5 1999 International Organization for Standardization ANSI Genf Schweiz und als Empf ngerlinie in Transfektionen zur Proteinexpression Schnell et al 1996 Deleersnyder et al 1997 Hussain et al
43. cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays J Immunol Methods 65 55 63 Mosmann T R Cherwinski H Bond M W Giedlin M A Coffman R L 1986 Two types of murine helper T cell clone I Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins J Immunol 136 2348 2357 Mosmann T R Fong T A 1989 Specific assays for cytokine production by T cells J Immunol Methods 116 151 158 144 Literaturverzeichnis Muraguchi A Kehrl J H Longo D L Volkman D J Smith K A Fauci A S 1985 Interleukin 2 receptors on human B cells Implications for the role of interleukin 2 in human B cell function J Exp Med 161 181 197 Nelson B H Willerford D M 1998 Biology of the interleukin 2 receptor Adv Immunol 70 1 81 Niks M Otto M Busova B Stefanovic J 1990 Quantification of proliferative and suppressive responses of human T lymphocytes following ConA stimulation J Immunol Methods 126 263 271 Otter W D Cadee J Gavhumende R De Groot C J Hennink W E Stewart R 1999 Effective cancer therapy with a single injection of interleukin 2 at the site of the tumour Cancer Immunol Immunother 48 419 420 Palmer P A Vinke J Evers P Pourreau C Oskam R Roest G Vlems F Becker L Loriaux E Franks C R 1992 Continuous infusion of recombinant interleukin 2 with or without autologous lymphokine activated killer cel
44. des sezernierten rekombinanten kaninen IL 2 im Bioassay MTT Test 106 Einfluss unterschiedlich eingesetzter BHK Zellkonzentrationen und Inkubationszeiten 108 Koinkubation von transfizierten BHK Linien mit CTLL 2 Zellen BANE rem Weld e ris Ate Mt ea 111 Zeitlicher Verlauf der rcIL 2 Produktion ber 72 h u uuesseessessessnesnnesnnennennnennnennnennnennen 112 rcIL 2 Produktion unter serumfreien Bedingungen 22u2240ssnesnnesnnennnennennnennennnennnennen 115 Induktion mit verschiedenen Doxyzyklin Konzentrationen ursuussssesssensnseessnensnnnnnnenennn 117 Diskussion rsersesnesnsesnesnsnesnesnsnesnsnssnenenssnesnsnssnsnnsnssnssnsnssnennsnssnssnsnesnennsnssnennsnssnsnesnssnsnnsnnsnsnen 118 Zusammenfassung cessonssossonssonssnnssnnsnnnennnsnnssnnnsnnsnnnsnnnsnossnnssnnssnnsnnssnnssnnssnnssnnssnnsnnssssnsnnnsnnnse 129 SLITET IIE I IA A TAE E EINE E RETT A EINT AIEEE E A 132 Literaturverzeichnis ersesrsorsesnesnsnesnennsnesnennsnesnsnnsnsnnsnnsnssnsnnsnssnsnesnssnsnssnennsnssnesnsnnsnssnsnnnnnen 135 Anhang siasesssssccessicsecsenssioscvoscessesesussdecesedincsenssssasepaddessensacndodeesoadsvesvascessedasccesassosssedsenassnacspaadesss 149 L bellen si 149 Bezussquellen f r Chemikalien nerenin 22 22 02 euren Bere 181 Bezugsquellen f r Ger te und Einmalartikel uu020us0s0ssnessnesnnennensnennnennnennonsnensnernneen 184 L sungen und Puffer 22253 Besseren Hoes eee a nein 1
45. einer R ckw rtsreaktion um das einklonierte cIL 2 Fragment von beiden Seiten sequenzieren zu k nnen Dazu wurden Primer f r M13 verwendet einem Abschnitt des acZ Gens das in vielen Vektoren die Multiple Cloning Site MCS enth lt Es kamen etwa 200 ng DNA aus der Midi Pr paration siehe 3 2 3 6 je kbp Plasmidl nge zum Einsatz Weiterhin wurden jeweils 2 pMol des passenden fluoreszierenden IRD 800 gekoppelten Primers IRD 800 MWG Biotech Ebersberg zugegeben und der Ansatz mit ddH gt 0 auf 25 ul aufgef llt Der Ansatz setzte sich folgenderma en zusammen Tabelle 1 Primer DNA Ans tze f r pGEM T IL2 1 Primer je 2 pmol ul 1 ul M13 1 ul M13rev DNA siehe 3 2 3 5 3 3 ul 3 3 ul ddH 0 20 7 ul 20 7 ul Die 25 ul Ans tze wurden zu je 6 ul auf vier PCR Gef e 1 ul Pipettierverlust aufgeteilt In je ein PCR Gef wurden 2 ul G A T oder C Mix aus dem Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Cycle Sequencing Kit with 7 Deaza dGTP Amersham Biosciences GmbH Freiburg pipettiert und nach dem Mischen im Thermocycler Cycler TC 312 Techne Staffordshire England inkubiert Die PCR lief in 30 Zyklen mit je 30 s bei 95 C 30 s bei 50 C und 45 s bei 72 C und einer abschlie enden Elongationsphase von 5 min bei 70 C ab Den Reaktionsans tzen wurden anschlie end 4 ul Stop L sung 20 mM EDTA pH 8 0 Merck KGaA Darmstadt und 300 mg l Bromphenolblau BioRad Laboratories GmbH
46. ergaben sich zwei Fragmente von 4 kbp und etwa 650 bp Gr e wie sie bei erfolgreicher Klonierung zu erwarten waren nicht dargestellt Vor der Sequenzierung erfolgte eine Reklonierung des Vektors in E coli Durch die Isolierung des Plasmids mit dem NucleoBond PC100 Plasmid DNA Purification Kit Macherey Nagel konnte eine Menge von 593 ng Plasmid DNA ml gewonnen werden 4 1 6 Sequenzierung des klonierten RT PCR Fragmentes Die erneute Sequenzierung des in den Vektor einklonierten cIL 2 Fragmentes wurde bei SeqLab Sequence Laboratories G ttingen GmbH G ttingen durchgef hrt Da sich flankierend zu der Multpile Cloning Site in der das PCR Produkt als Insert eingebaut wurde ein Sp6 und ein T7 Promotor befinden Abbildung 1 Seite 36 konnten Primer f r diese beiden Sequenzen zur Sequenzieung des einklonierten Fragmentes genutzt werden Auch hier erfolgte die Auswertung der von SeqLab bermittelten Sequenz mit den Programmen Chromas 2 3 Technelysium Pty Ltd ClustalW EMBL EBI Cambridge Gro britannien und GeneDoc 2 6 003 Multiple Sequence Alignment Editor amp Shading Utility 1997 Die Sequenz des Inserts zeigte wiederum keine Abweichung zur Original Sequenz von Dunham et al 1995 Abbildung 10a und 10b 86 Ergebnisse 20 x 40 60 D30710 cIL 2Klon AACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACT 60 x 80 x 100 x 120 D30710 cIL 2Klon APAGAATACTCAAG
47. erwarteten Banden lagen erneut bei 0 5 kbp und 3 kbp im Falle von pGEM T IL2 und bei 2 5 kbp und 3 kbp f r pGEM T IRES Wie auf Abbildung 13 dargestellt zeigten die Plasmide das erwartete Bandenmuster 3 kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 13 Agarosegelbild nach zweitem Restriktionsenzymverdau der Plasmide pGEM T IL2 und pGEM T IRES nach Midi Pr paration Bahn 1 und 6 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 und 3 pGEM T IL2 AKpnI AMlul 0 5 kbp und 3 kbp Bahn 4 und 5 pGEM T IRES AMlul APstl 2 5 kbp und 3 kbp Ergebnisse 91 4 2 3 Sequenzierung des pGEM T IL2 1 Klons Die korrekte Sequenz des amplifizierten cIL 2 Gens wurde in einer erneuten Sequenzierung berpr ft Diese erfolgte am Institut f r Virologie des Fachbereichs 10 Mit dem GCG Programm Paket Genetics Computer Group Madison Wisconsin USA im HUSAR System Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources sowie ClustalW EMBL EBI Cambridge Gro britannien und GeneDoc 2 6 003 Multiple Sequence Alignment Editor amp Shading Utility 1997 wurde die ermittelte Sequenz ausgewertet und dargestellt Abbildung 14 Die amplifizierte cIL 2 Sequenz stimmte zu 100 mit der Original Sequenz von Dunham et al 1995 berein Aufgrund der Wahl der Primer und ihrer Positionen wurden die flankierenden nicht codierenden Region entfernt die die publizierte Sequenz Dunhams aufwies Es handelt sich dabei um 31 Basen am 5 Ende vor der Sequenz des Signalpeptids und um 154
48. gliche Gr nde k nnten in unterschiedlichen Zellzahlen in der Ausgangszellsuspension oder in einem unterschiedlichen Wachstums und Stoffwechselverhalten der einzelnen Klone liegen Zusammenfassend kann festgehalten werden dass die hier erzeugten Zelllinien in der Lage sind cIL 2 zu produzieren Mit ihrer Hilfe k nnen in weiteren Studien LAK in vitro produziert werden Der Vorteil dieser transfizierten Zellen liegt in der kontinuierlichen Sekretion von cIL 2 Unter bisherigen Kulturbedingungen musste IL 2 zu bestimmten Zeitpunkten den Medien zugegeben werden um isolierte NK Zellen zu LAK zu stimulieren Dies hatte starke Schwankungen der IL 2 Konzentration im Zellkulturmedium zur Folge die nicht den Verh ltnissen in vivo entsprechen Eine Koinkubation von angereicherten NK Zellen aus Tumorpatienten mit den hier transfizierten BHK Zellen erm glicht aufgrund der kontinuierlichen cIL 2 Produktion eine kontinuierliche Stimulation und damit eine kontinuierlicher Erzeugung von LAK In weiteren Arbeiten sollen die Kulturbedingungen einer solchen Koinkubation in einem Bioreaktor untersucht werden Falkenberg et al 1995 Darin werden die cIL 2 produzierenden BHK Zellen und NK Zellen getrennt durch eine semipermeable Membran koinkubiert Das cIL 2 Kann jedoch aufgrund der Porengr e dieser Membran in das andere Kompartiment der NK Zellen bertreten und hier die Stimulation zu LAK erm glichen Diese in vitro erzeugten LAK k nnen dann in einer adopti
49. in den Bahnen 9 bis 14 pGEM T IRES nach dem Enzymverdau aufgetragen Nach dem Verdau von pGEM T IL2 wurden ein 473 bp gro es Insert und der ca 3 kbp gro e Vektor erwartet Die in den Bahnen 2 4 und 6 dargestellten Plasmide zeigen diese beiden Banden F r die weiteren Arbeiten wurde die Kolonie aus Bahn 2 pGEM T IL2 1 gew hlt 3 kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 12 Agarosegelbild nach Restriktionsenzymverdau der Plasmide pGEM T IL2 und pGEM T IRES Bahn 1 8 und 15 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 bis 7 pGEM T IL2 AKpnI AMlul 0 5 kbp und 3 kbp Bahn 9 bis 14 pGEM T IRES AMlul APstl 2 5 kbp und 3 kbp 90 Ergebnisse Der Restriktionsenzymverdau von pGEMT T IRES f hrte zu einem etwa 2 5 kbp gro en Fragment Insert sowie ebenfalls zu dem ca 3 kbp gro en Vektor Bahn 9 10 12 und 13 zeigen korrekt ligierte Plasmide von denen jenes aus Bahn 2 pGEM T IRES 2 f r die weiteren Vorg nge gew hlt wurde Um f r die weiteren Arbeiten eine gr ere Menge an Plasmid DNA zur Verf gung zu haben wurde eine Retransformation der Plasmide in E coli und eine anschlie ende Plasmid Pr paration im Midi Ma stab durchgef hrt Die Bestimmung der dadurch gewonnen DNA Menge ergaben 220 ng ul pGEM T IL2 1 und 1 57 ug ul pGEM T IRES 2 Die Analyse der so retransformierten Plasmide erfolgte wiederum durch einen Restriktionsenzymverdau mit den bereits erw hnten Restriktionsenzymen KpnI und Mlul sowie Mlul und PstI Die Gr en der
50. in der zweiten Versuchsphase serumhaltiges Kulturmedium konnte in allen drei Ans tzen eine h here rcIL 2 Produktion nachgewiesen werden Die entsprechenden Mengen lagen bei 3 18 ng 5 40 ng und 7 12 ng rcIL 2 ml Hier zeigte sich die h chste rcIL 2 Menge bei einer Induktion in Phase 2 nachdem die Zellen in der ersten Phase kein Doxyzyklin zur Induktion erhalten hatten Der Einfluss des Serums in Versuchsphase 2 war hoch signifikant p lt 0 0001 ebenso der Effekt von Doxyzyklin p 0 001 Auch die Wechselwirkung zwischen beiden Faktoren ergab einen hoch signifikanten Zusammenhang p lt 0 0001 d h die rcIL 2 Induktion durch Doxyzyklin wirkte je nach Vorhandensein von Serum im Kulturmedium unterschiedlich 117 enen Doxyzyklin Konzentrationen rcIL 2 chiedlichen mit unters des BHK Klons A5 4 nach Induktion und Standardabweichungen n 5 der produzierten Doxyzyklin Konzentrationen Konzentrationen Grafik 11 Mittelwerte 118 Diskussion 5 DISKUSSION Ziel dieser Arbeit war es die mesenchymale Zelllinie BHK mit dem Tet on Expressionssystem zu transfizieren in welches zun chst das Gen f r kanines Interleukin 2 cIL 2 einkloniert wurde Durch Induktion des Tet on Expressionssystems sollte die Sekretion von cIL 2 gestartet und biologisch aktives cIL 2 in den Zellkultur berstand abgeben werden Dazu musste zun chst die DNA Sequenz f r cIL 2 gewonnen werden Die
51. lfte der Platte und damit auch die sich in diesem Bereich befindenden Kolonien von der Fl ssigkeit bedeckt waren die zu isolierende Kolonie sich jedoch in der oberen fl ssigkeitsfreien H lfte befand In einer abgeschnittenen und sterilisierten Pipettenspitze wurde etwas Trypsin aufgenommen und auf die zu pickende Zellkolonie aufgesetzt Die Zellen dieser Kolonie konnten nach etwa 60 s durch vorsichtiges Auf und Abpipettieren aufgenommen werden wobei die Pipettenspitze nach M glichkeit nicht vom Schalenboden abgehoben werden sollte Die Zellen wurden anschlie end in eine Vertiefung einer 48 Well Platte Falcon Becton Dickinson Heidelberg berf hrt in die bereits 800 ul Selektionsmedium vorgelegt worden waren Auf diese Weise wurden insgesamt 12 Kolonien isoliert Nachdem sich in den Vertiefungen Zell Monolayer gebildet hatten wurden diese abtrypsiniertt und die Zellen zun chst in eine 6 Well Platte und sp ter in eine Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm berf hrt 60 Material und Methoden 3 2 7 5 Luciferase Assay und Auswahl der Klon Kolonien Die 12 Klone wurden anschlie end im Luciferase Assay auf die Expression des Luciferase Reportergens getestet Dazu wurden die Zellen zun chst abtrypsiniert und in eine 6 Well Platte in einer Verd nnung von 1 10 ausges t wobei f r jede Klon Linie zwei Wells angeimpft wurden Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurde ein Ansatz pro Klon durch die Zugabe von 5 ul Doxyz
52. nnungsreihe E zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Er ag und bg bereinigt 0 004 0 005 0 005 0 004 i 0 007 0 008 0 009 0 008 0 012 0 007 0 010 0 010 3 0 020 0 015 0 019 0 018 0 030 0 033 0 033 0 032 N 0 048 0 051 0 048 0 049 0 064 0 075 0 069 0 069 25 ng ml 0 141 0 168 0 151 0 153 j 50 ng ml 0 285 0 270 0 288 0 281 l Messwerte stellen bereits blankbereinigte Mittelwerte aus 2 Messungen dar OD I 0 2 ng ml 0 4 ng ml 0 8 ng ml 1 6 ng ml 3 13 ng ml 6 25 ng ml 12 5 ng ml pl 85 864461 p2 1 664575 p3 1 530299 Dabei gilt E a 1In p3 In pl b p2 p 166 Anhang Tabelle 39 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe F zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Er ar und br Op x Be 0 2 ng ml xl xl xl xl xl xl 1 0 4 ng ml xl xl xl xl xl xl 1 0 8 ng ml 0 007 0 009 0 012 0 009 0 007 0 008 i 1 6 ng ml 0 021 0 023 0 018 0 018 0 021 0 020 3 13 ng ml 0 095 0 079 0 076 0 082 0 072 0 079 6 25 ng ml 0 231 0 210 0 196 0 212 0 215 0 212 f 12 5 ng ml 0 227 0 225 0 247 0 225 0 224 0 226 2 25 ng ml x3 x3 x3 x3 x3 x3 3 50 ng ml 0
53. und FasL Rezeptoren im Falle der akuten myeloblastischen Leuk mie AML nach Um die Aktivit t und Proliferation von NK Zellen in vivo anzuregen wurden Therapiestudien mit rekombinantem IL 2 rIL 2 durchgef hrt Der systemische Einsatz von rIL 2 hat sich dabei aufgrund der gravierenden Nebenwirkungen als ung nstig erwiesen Vor allem die Verwendung von rIL 2 in hohen Dosen bewirkte bei Patienten ein akutes Nierenversagen mit Mikroalbumin mie eine erh hte Gef permeabilit t und dadurch ausgedehnte deme Leakage Syndrome bis zum Schock mit Todesfolge sowie eine respiratorische Alkalose Belldegrun et al 1987 Textor et al 1987 Christiansen et al 1988 Kozeny et al 1988 Margolin et al 1989 Mercatello et al 1991 von der Maase et al 1991 Schechter und Nagler 1992 Dies belegen auch Studien in denen Patienten in systemischer Applikation eine Kombination aus rIL 2 und LAK erhielten Rosenberg et al 1985 Albertini et al 1990 Palmer et al 1992 Die systemischen Nebenwirkungen waren bei einer Kombinationstherapie von LAK und rIL 2 zum Teil sogar gravierender als bei der Kontrollgruppe die nur rIL 2 erhielt Palmer et al 1992 Rosenberg et al 1985 fand bei 10 von 25 Patienten die eine solche Kombinationstherapie erhielten eine partielle Tumorremission und in einem von 25 eine komplette Remission In die Studie von Palmer 1992 wurden 327 Patienten aufgenommen Hier konnte bei der Wirkung auf das Tumorwachst
54. was also examined For this lymphocytes enriched in NK cells were isolated from canine blood with a 57 5 Percoll gradient and exposed to the supernatants of native BHK cells Afterwards their cytotoxic activity was measured by a colorimetric test the Rose Bengal Assay RBA By treating with these supernatants no change in the cytotoxic activity could be demonstrated Ds To proof the biological activity of the secreted cIL 2 by transfected BHK cells bioassays with the IL 2 sensitive cell line CTLL 2 were performed All tested BHK clones revealed production of biological active cIL 2 The total amount of secreted cIL 2 after induction was difficult to determine because of the variations in the cIL 2 production depending on culture conditions incubation period cell concentration All clones under study showed a basal secretion of cIL 2 in not induced conditions Without supplemented serum in the cell culture medium the cIL 2 could not be induced by doxycycline Several doxycycline concentrations from 0 5 ug ml to 5 ug ml revealed cIL 2 concentrations exhibiting a dose effect relationship with an optimum of 1 ug ml With the lowest 0 1 ug ml and the highest 10 ug ml tested doxycycline concentrations only a weak induction of cIL 2 production was achieved 134 Summary These created cIL 2 producing BHK clones are to be used in clinical applications for the stimulation of LAK cells in vitro by coincubation with enriched NK cells of tumo
55. 0 007 0 003 0 004 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 005 0 005 0 060 0 005 0 005 0 000 OD Messing 0 005 0 005 0 060 0 005 0 005 leerwertbereinigt 48h Leerwert OD 1 Messung 0 002 0 002 0 003 0 002 0 003 0 001 ie 0 001 0 001 0 002 0 001 0 002 s g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 004 0 003 0 004 0 005 0 006 0 000 OD 2 Mes n g 0 004 0 003 0 004 0 005 0 006 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 009 0 007 0 011 0 004 0 007 0 001 ODl Mess ng 0 008 0 006 0 010 0 003 0 006 5 p leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 010 0 006 0 008 0 007 0 011 0 000 OD 2 Messung 0 010 0 006 0 008 0 007 0 011 leerwertbereinigt 72h Leerwert OD 1 Messung 0 001 0 002 0 004 0 003 0 003 0 001 OD Ts Mess ng 0 000 0 001 0 003 0 002 0 002 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 002 0 002 0 002 0 004 0 003 0 000 OD Mess ng 0 002 0 002 0 002 0 004 0 003 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 023 0 024 0 014 0 016 0 010 0 001 OD 1 Mess ng 0 022 0 023 0 013 0 015 0 009 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 021 0 026 0 014 0 018 0 014 0 000 De Mesune 0 021 0 026 0 014 0 018 0 014 leerwertbereinigt 178 Anhang Tabelle 48 Messwerte zu Tabelle 31 24h Leerwert OD 1 Messung 0 005 0 006 0 006 0 005 0 006 0 001 OD Messung 0 004 0 005 0 005 0 004 0 005 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 006 0 007 0 005 0 006 0 005 0 000 OD 2 Messung 0 006 0 007 0 005 0 006 0 005 leerw
56. 00 TRIzol Reagenz 15596 Macherey Nagel GmbH amp Co KG Diiren NucleoBond PC100 Plasmid DNA Purification Kit 740753 MBI Fermentas St Leon Roth EcoRI ER0271 Puffer O 10X BOS Scal ER0431 Merck KGaA Darmstadt EDTA 324503 Harnstoff 108488 Millipore Billerica USA 50X Modified TAE Buffer LSKMTAES0 UltrafreeDA 42600 National Diagnostics Atlanta USA Sequagel XR EC 842 NatuTec GmbH Frankfurt Biotherm TaqPolymerase GC 002 NEB GmbH Frankfurt BSA B9001 Buffer 1 B7001 Buffer 3 B7003 Buffer 4 B7004 Fspl R0135 HindIII R0104 Kpnl R0142 Mlul R0198 PstI R0140 PAA Laboratories GmbH C lbe Fetales K lberserum FKS A 15 042 RPMI 1640 Pharmacia Fine Chemicals Uppsala Schweden Percoll steril 17 0891 01 Promega Madison USA Luciferase Assay System E1500 pGEM T Vektor System A3600 Rapid Ligation Buffer 2X C6711 RNasin RNase Inhibitor N211 Qiagen GmbH Hilden RNase free DNase Set 7254 RNeasy Mini Kit 7410 QlAshredder S ule 7965 Anhang 183 Roche Diagnostics GmbH Mannheim Alkalische Phosphatase CIP 713023 DNase I RNase frei 4716728 NTPs 1969064 nterleukin 2 human rekombinant 1147528 RNase A 109142 ee Serva Heidelberg DMSO 20385 DTT Dithriothreitol 39759 Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Ampicillin A9393 Concanavalin A Con A C5275 Glycerin G2289 B Mercaptoethanol M3148 MTT Thiazolylblau M2128 Penicillin Streptomycin
57. 027 0 049 0 033 0 000 OD Messing 0 047 0 045 0 027 0049 0 033 s g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 052 0 044 0 030 0 045 0 033 0 001 OD 2 Mes n g 0 051 0 043 0 029 0 044 0 032 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 036 0 027 0 020 0 040 0 035 0 000 OD 1 Messung 0 036 0 027 0 020 0 040 0 035 5 p leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 035 0 029 0 023 0 040 0 036 0 001 OD 2 Messung 0 034 0 028 0 022 0 039 0 035 leerwertbereinigt BHK Linie A5 4 Leerwert OD 1 Messung 0 033 0 041 0 048 0 026 0 043 0 000 OD Ts Mess ng 0 033 0 041 0 048 0 026 0 043 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 033 0 042 0 043 0 026 0 045 0 001 OD Mess ng 0 032 0 041 0 042 0 025 0 044 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 073 0 121 0 073 0 083 0 083 0 000 OD 1 Mess ng 003 0 121 0 073 0 083 0 083 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 067 0 061 0 083 0 089 0 088 0 001 De Mesune 0 066 0 060 0 082 0 088 0 087 leerwertbereinigt 176 Anhang Tabelle 46 Messwerte zu Tabelle 29 24h Leerwert OD 1 Messung 0 002 0 002 0 004 0 002 0 002 0 001 OD 1 Mes ung 0 001 0 001 0 003 0 001 0 001 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 004 0 004 0 003 0 003 0 002 0 000 OD 2 Messung 0 004 0 004 0 003 0 003 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 056 0 061 0 077 0 074 0 081 0 001 OD 1 Messung 0 055 0 060 0 076 0 073 0 080 4 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 057 0 062 0 069 0 074 0 0
58. 1 Das Standard Bioassay Diese Ans tze dienten zum Nachweis der rcIL 2 Produktion der plasmidtragenden BHK Klone unter verschiedenen Kulturbedingungen Die Durchf hrung entsprach dem unter 4 1 2 erw hnten Versuchsablauf wobei die einges te Zellzahl bei 1 5 x 10 Zellen ml 1 3 x 10 Zellen ml oder 0 75 x 10 Zellen ml lag und die Dauer der rcIL 2 Sekretion in der Regel 24 oder 72 h entsprach Die berpr ften BHK Klone waren Klon A5 sowie die Reklone A5 1 A5 2 A5 3 A5 4 A5 5 A5 6 A5 7 A5 8 und A5 9 3 5 2 2 Koinkubation von CTLL 2 Zellen und transfizierten BHK Zellen in Transwell Eins tzen Zellen der Klone A5 A5 3 und A5 4 wurden zusammen mit CTLL 2 Zellen koinkubiert Dazu wurden 6 5 mm Transwell Eins tze Costar Cambridge USA verwendet siehe Schema 5 die eine Nucleopore Polykarbonat Membran mit einer Porengr e von 0 4 um besitzen So konnten in Wells einer 24 Well Platte die rcIL 2 produzierenden BHK Zellen mit CTLL 2 Zellen inkubiert werden wobei nur l sliche Substanzen aber keine Zellen die Membran passieren und somit die verschiedenen Zelltypen keinen Kontakt miteinander aufnehmen konnten Das produzierte rcIL 2 konnte jedoch die Membran durchdringen So wurden die CTLL 2 Zellen durch das sezernierte rcIL 2 direkt zur Proliferation angeregt ein Material und Methoden 75 Behandeln der Test berst nde siehe 3 5 1 2 1 vor dem Einsatz in ein Bioassay entfiel dadurch rcIL 2 produzierende BHK Zel
59. 10 1114 Yang W C Schultz R D Spano J S 1987 Isolation and characterization of porcine natural killer NK cells Vet Immunol Immunopathol 14 345 356 Zabala M Wang L Hernandez Alcoceba R Hillen W Qian C Prieto J Kramer M G 2004 Optimization of the Tet on system to regulate interleukin 12 expression in the liver for the treatment of hepatic tumors Cancer Res 64 2799 2804 Zhang H G Kim H Liu C Yu S Wang J Grizzle W E Kimberly R P Barnes S 2007 Curcumin reverses breast tumor exosomes mediated immune suppression of NK cell tumor cytotoxicity Biochim Biophys Acta 1773 1116 1123 Zhang Y H Liu X Y 1994 Inhibition of lung metastases of mouse mammary tumor by aerolized interleukin 2 in bacillus Calmette Guerin primed mice Proc Am Assoc Cancer Res 35 519 Anhang 149 9 ANHANG 91 Tabellen Tabelle 22 Spontane zytotoxische Aktivit t von unbehandelten Effektorzellen bei Inkubation in RPMI FKS Effektorzellen Kontrollansatz ohne Errechnete Zielzellen OD Effektorzellen OD Zytotoxizit t 0 156 0 261 0 142 0 347 0 136 0 303 0 153 0 253 0 105 0 297 0 302 0 376 0 308 0 288 x 0 138 x 0 304 55 s 0 020 s 0 038 Tabelle 23 Spontane Zytotoxizit t von unbehandelten Effektorzellen bei Inkubation in BHK Uberstanden Effektorzellen Kontrollansatz ohne Errechnete Zielzellen OD Effektorzellen OD Zytotoxizit t 0 085 0 241 0 094 0 188 0
60. 106 0 210 0 120 0 305 0 236 0 181 0 243 0 215 0 154 x 0 101 x 0 219 54 s 0 015 s 0 044 150 Anhang Tabelle 24 Spontane Zytotoxizit t von vorbehandelten Effektorzellen Effektorzellen in RPMI FKS vorbehandelt Zielzellen OD 0 210 0 250 0 283 0 313 0 312 x 0 274 s 0 044 Errechnete Zytotoxizitat 10 Effektorzellen in BHK Uberstiinden vorbehandelt Zielzellen OD 0 243 0 260 0 270 0 227 0 274 0 310 x 0 264 s 0 029 Errechnete Zytotoxizitat 0 Anhang 151 Tabelle 25 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen verschiedener BHK Linien in ng ml eingesetzte Zellkonzentration 1 5 x 10 Zellen ml Dauer der rcIL 2 Produktion 24h Originalmesswerte siehe Tabelle 42 A5 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit X s Standardverd nnungsreihe A Tabelle 34 OD 0 002 0 001 0 002 0 001 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 181 0 131 0 181 0 131 0 276 0 180 0 059 OD 0 062 0 056 0 050 0 055 0 040 induziert rcIL 2 Konzentration 4 554 4 077 3 661 3 990 2 951 3 847 0 594 A5 1 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe B Tabelle 35 OD 0 004 0 000 0 001 0 001 0 000 uninduziert rcIL 2 Konzentration 1 103 0 000 0 707 0 707 0 000 0 504 0 487 OD 0 029 0 039 0 034 0 027 0 026 induziert rcIL 2 Konzentration 2 139 2 382 2 265 2 086 2 058 2 186 0 135 A5 2 BHK Linie rcIL 2 Kon
61. 11 22 Goodman L S Wintrobe M M Dameshek W Goodman J J Gilman A McLennan M T 1946 Nitrogen mustard therapy use of methylbis B chloroethyl aminohydrochloride for Hodgkin s disease lymphosarcoma leukemia and certain allied and miscellaneous disorders J Am Med Assoc 132 126 132 Gossen M Bujard H 1992 Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters Proc Natl Acad Sci US A 89 5547 5551 Gossen M Freundlieb S Bender G Muller G Hillen W Bujard H 1995 Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells Science 268 1766 1769 Granucci F Vizzardelli C Pavelka N Feau S Persico M Virzi E Rescigno M Moro G Ricciardi Castagnoli P 2001 Inducible IL 2 production by dendritic cells revealed by global gene expression analysis Nat Immunol 2 882 888 Greeley E H Kealy R D Ballam J M Lawler D F Segre M 1996 The influence of age on the canine immune system Vet Immunol Immunopathol 55 1 10 Grone A Fonfara S Markus S Baumgartner W 1999 RT PCR amplification of various canine cytokines and so called house keeping genes in a species specific macrophage cell line DH82 and canine peripheral blood leukocytes Zentralbl Veterinarmed B 46 301 310 Hanahan D 1983 Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166 557 580 140 Literaturverzeichnis Hansen M B Nielsen
62. 247 0 226 0 235 0 212 0 172 0 224 kursiv h chster und tiefster Wert im Rahmen des Winsorisierens gestrichen nicht durchgef hrt Messwerte stellen bereits blankbereinigte Mittelwerte aus 2 Messungen dar 3 Messwerte nicht in nicht lineare Regression mit einbezogen da unplausible Werte Er 0 227534 ap 5 288459 br 9 538830 Anhang 167 Tabelle 40 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe G zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Eg ag und be oP 2 bereini t 0 2 ng ml 0 004 0 004 0 003 0 006 0 004 0 004 7 0 4 ng ml 0 002 0 003 0 003 0 004 0 003 0 003 0 8 ng ml 0 003 0 006 0 005 0 007 0 006 0 006 j 1 6 ng ml 0 007 0 006 0 006 0 006 0 005 0 006 i 3 13 ng ml 0 013 0 015 0 015 0 016 0 011 0 014 2 6 25 ng ml 0 054 0 057 0 059 0 062 0 052 0 057 12 5 ng ml 0 081 0 079 0 084 0 081 0 066 0 080 j 25 ng ml 0 082 0 074 0 094 0 089 0 076 0 082 5 50 ng ml xl xl xl xl xl xl 1 kursiv h chster und tiefster Wert im Rahmen des Winsorisierens gestrichen Messwerte nicht in nicht lineare Regression mit einbezogen da unplausible Werte Messwerte stellen bereits blankbereinigte Mittelwerte aus 2 Messungen dar Eg 0 079556 ag 5 961589 be 8 426513 168 Anhang Tabelle
63. 37 0 129 0 126 12 5 ng ml 0 127 0 138 0 133 0 118 0 158 0 133 0 130 25 ng ml 0 143 0 138 0 146 0 138 0 119 0 140 0 137 50 ng ml 0 178 0 147 0 174 0 137 0 097 0 153 0 150 kursiv h chster und tiefster Wert im Rahmen des Winsorisierens gestrichen Ec 0 142027 ac 2 248974 bc 5 122483 164 Anhang Tabelle 37 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe D zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Ep ap und bp oD x percale 0 2 ng ml 0 005 0 007 0 004 0 005 0 008 0 005 0 4 ng ml 0 005 0 005 0 005 0 006 0 007 0 005 0 8 ng ml 0 008 0 009 0 009 0 008 0 008 0 008 1 6 ng ml 0 012 0 012 0 013 0 012 0 021 0 012 3 13 ng ml 0 019 0 019 0 020 0 019 0 018 0 019 i 6 25 ng ml 0 057 0 083 0 089 0 078 0 086 0 082 12 5 ng ml 2 2 2 2 2 2 2 25 ng ml 0 230 0 234 0 227 0 238 0 207 0 230 j 50 ng ml 0 220 0 255 0 229 0 239 0 199 0 229 i kursiv h chster und tiefster Wert im Rahmen des Winsorisierens gestrichen Messwerte stellen bereits blankbereinigte Mittelwerte aus 2 Messungen dar Messwerte nicht in nicht lineare Regression mit einbezogen da unplausible Werte Ep 0 235075 ap 5 496048 bp 6 155274 Anhang 165 Tabelle 38 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd
64. 42 C Danach wurden die Zellen f r 2 min wieder auf Eis abgek hlt mit 200 ul LB Medium versetzt und f r 20 30 min bei 37 C inkubiert Nach der Zugabe von 10 ul einer 4 igen w v X Gal L sung 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolyl B D galactopyranosid Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe zur Galaktosidase Blau Wei Selektion wurden die Ans tze auf zwei Ampicillin haltigen 50 mg l LB Agar Platten ausgestrichen und ber Nacht bei 37 C inkubiert 44 Material und Methoden 3 2 3 3 Mini Pr paration der Plasmide pGEM T IL2 und pGEM T IRES aus Bakterienkulturen Die Pr paration der Plasmid DNA aus Bakterienkulturen im kleinen Ma stab Mini Pr paration zu analytischen Zwecken erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse der Zellen Birnboim und Doly 1979 und anschlie ender Pr zipitation der Plasmid DNA Von jeder der beiden LB Agar Platten wurden je 6 Einzelkolonien mit einer sterilen Pipettenspitze gepickt und in je 3 ml eines Ampicillin haltigen 100 mg l LB Mediums bertragen Diese Fl ssigkulturen inkubierten unter Sch tteln bei 37 C ber Nacht Von jeder der Fl ssigkulturen wurden 1 5 ml bei 16 000 x g f r 20 s abzentrifugiert Die Pellets wurden anschlie end in je 200 ul eiskaltem Puffer 1 50 mM Tris HCl pH 8 0 Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 10 mM EDTA Merck KGaA Darmstadt 100 mg l RNase A Roche Diagnostics GmbH Mannheim resuspendiert und die Suspension f r 5 min bei Raumtemperatur leicht gesch ttel
65. 50 ul eiskaltem Ethanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe und 10 ul 4 M Lithiumchlorid Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe zur w ssrigen Phase f r 20 min bei 25 C gef llt und anschlie end bei 4 C und 16 000 x g f r 15 min zentrifugiert Nach dem Waschen in 200 ul 70 v v Ethanol und erneuter Zentrifugation 16 000 x g 5 min wurde das DNA Pellet getrocknet und in 30 ul H gt Odd resuspendiert 3 2 5 3 Dreifachligation Der linearisierte und dephosphorylierte Vektor und die beiden Inserts wurden unter Verwendung der T4 DNA Ligase 350 U ul TaKaRa Saint Germain en Laye Frankreich zusammengef gt Dieses Enzym katalysiert die kovalente Verkn pfung der 3 OH mit der 52 Material und Methoden 5 PO4 Gruppe an den Enden doppelstr ngiger DNA durch die Bildung einer Phosphodiesterverbindung unter ATP Verbrauch Dazu wurden 2 ul des Vektors 4 ul des IRES Fragmentes und 2 5 ul des IL 2 Fragmentes mit 1 ul 10X Ligase Puffer TaKaRa Saint Germain en Laye Frankreich und 0 5 ul T4 DNA Ligase vermischt und ber Nacht bei 4 C inkubiert Zu dieser Ligation wurde parallel eine Religationskontrolle angesetzt die aus den gleichen Komponenten wie der Ligationsansatz bestand Anstelle der Fragment DNA cIL 2 und IRES wurde jedoch ddH gt O zugegeben Diese Kontrolle diente zur Absch tzung der Effizienz des Fragment Einbaus im Vergleich zur intramolekularen Religation des Vektors Die gesamten Ans tze der Dreifach Ligation und der
66. 77469 aa 3 115482 ba 2 839958 162 Anhang Tabelle 35 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe B zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Eg ag und bg x bereinigt 0 008 0 005 0 007 0 004 0 011 0 004 0 008 0 005 0 015 0 014 0 015 0 012 0 027 0 024 0 026 0 023 0 094 0 058 0 076 0 073 kw x 0 2 ng ml 0 4 ng ml 0 8 ng ml 1 6 ng ml 3 13 ng ml 6 25 ng ml 12 5 ng ml 0 267 0 287 0 277 0 274 25 ng ml 0 308 0 237 0 273 0 270 50 ng ml 0 261 0 277 0 269 0 266 Messwerte nicht in nicht lineare Regression mit einbezogen da unplausible Werte Eg 0 272983 ap 4 517160 bs 7 230056 Anhang 163 Tabelle 36 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe C zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Ec ac und bc x oD x bereinigt 0 2 ng ml 0 004 0 005 0 005 0 004 0 004 0 004 0 001 0 4 ng ml 0 008 0 008 0 008 0 008 0 007 0 008 0 005 0 8 ng ml 0 011 0 012 0 011 0 009 0 012 0 011 0 008 1 6 ng ml 0 024 0 033 0 040 0 049 0 031 0 035 0 032 3 13 ng ml 0 089 0 083 0 083 0 086 0 084 0 084 0 081 6 25 ng ml 0 133 0 131 0 122 0 124 0 1
67. 82 0 000 DD Messung 0 057 0 062 0 069 0 074 0 082 leerwertbereinigt 48h Leerwert OD 1 Messung 0 003 0 002 0 008 0 003 0 003 0 001 OD 1 Mean 0 002 0 001 0 007 0 002 0 002 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 004 0 003 0 008 0 004 0 004 0 000 OD 2 Messung 0 004 0 003 0 008 0 004 0 004 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 089 0 133 0 133 0 132 0 111 0 001 SD Messing 0 088 0 132 0 132 011 0 110 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 083 0 123 0 120 0 124 0 112 0 000 OD 2 Mess ng 0 083 0 123 0 120 0 124 0 112 leerwertbereinigt 72h Leerwert OD 1 Messung 0 001 0 001 0 003 0 003 0 003 0 001 OD 1 Messung 0 000 0 000 0 002 0 002 0 002 R leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 002 0 001 0 001 0 003 0 002 0 000 OD 2 Messung 0 002 0 001 0 001 0 003 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 128 0 160 0 163 0 161 0 160 0 001 OD 1 Messung 0 127 0 159 0 162 0 160 0 159 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 123 0 166 0 158 0 152 0 147 0 000 ODZ Messung 0 123 0 166 0 158 0 152 0 147 leerwertbereinigt Anhang 177 Tabelle 47 Messwerte zu Tabelle 30 24h Leerwert OD 1 Messung 0 001 0 002 0 005 0 002 0 003 0 001 OD sMessung 0 000 0 001 0 004 0 001 0 002 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 004 0 003 0 002 0 003 0 003 0 000 OD 2 Messung 0 004 0 003 0 002 0 003 0 003 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 005 0 004 0 008 0 004 0 005 0 001 OD 1 Messung 0 004 0 003
68. 86 Abk rzungsverzeichnis Abk rzungsverzeichnis ALL AML BHK bidest bp CD cDNA cIL 2 CLL CML Con A CTAC CTLL 2 Cys ddH 0 dH 0 dest ELISA FasL FKS G418 GAPDH GM CSF hIL 2 hTNF IFN y IL 2 IL 2R IL 15 IRES Jak kbp kDa LAK LB LGL Akute lymphatische Leuk mie Akute myeloblastische Leuk mie Baby Hamster Kidney Cells fibroblastische Nierenzelllinie des Goldhamsters Doppelt destilliert Basenpaar Cluster of Differentiation Cluster der Leukozyten Differenzierung Copy DNA DNA Kopie einer mRNA Kanines Interleukin 2 Chronische lymphatische Leuk mie Chronische myeloische Leuk mie Concanavalin A Canine Thyroid Adenocarcinoma Cell Line Schilddr sen Adenokarzinom Zelllinie vom Hund Cytotoxic T Cell Lymphoma Cell Line Zytotoxische T Zelllinie von der Maus Cystein Bidestilliertes Wasser Destilliertes Wasser Destilliert Enzym Linked Immunosorbent Assay Fas Ligand Apoptose ausl sender Ligand aus der TNF Familie Fetales K lberserum Geneticin Selektionsantibiotikum Glutaraldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor Granulozyten Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor Humanes Interleukin 2 Humaner Tumor Nekrose Faktor Interferon y Interleukin 2 Interleukin 2 Rezeptor Interleukin 15 Internal Ribosomal Entry Site Interne Ribosomen Ansatz Stelle Janus Kinasen Tyrosin Kinasen aktivieren STAT Proteine Kilobasenpaare entsprich
69. A Abbildung 1 Schematische Darstellung des pCR II TOPO Vektors mit Vergr erung der Multiple Cloning Site aus dem Benutzerhandbuch TOPO TA Cloning Five minute cloning of Tag polymerase amplified PCR products Version R April 2004 Invitrogen Carlsbad USA Material und Methoden 37 3 1 6 1 N hrmedien und Bakterienstamm Die Herstellung der Agar N hrb den und Fl ssigkulturmedien sowie die Konservierung der Bakterienkulturen erfolgte nach Angaben der Hersteller bzw nach Standardprotokollen Sambrook und Russel 2001 Den Agar N hrb den und Kulturmedien wurden 100 ug ml Ampicillin Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen zugesetzt F r die Klonierung wurde der Escherichia coli Stamm DH5a Invitrogen Karlsruhe der sich aus dem Sicherheitsstamm K12 ableitet verwendet Der Sicherheitsstamm K12 kann weder den menschlichen Darm besiedeln noch au erhalb des Labors berleben DH5a Genotyp F 680lacZAM15 A lacZYA argF U169 recAl endAl hsdR17 rx mx phoA supE44 thi 1 gyrA96 relAl tonA 3 1 6 2 Klonierungsreaktion Die Durchf hrung der Klonierung erfolgte mit den Reagenzien des TOPO TA Cloning Kits nach dem Hersteller Protokoll wonach zun chst ein Reaktionsansatz Tabelle 5 angemischt wurde Tabelle 5 Reaktionsansatz zur TOPO TA Klonierung PCR Produkt 1 5 ul Salzl sung lul Steriles Wasser 2 5 ul pCR I TOPO Vektor 1 ul Daran schlossen sich folgende Arbeitsschritte an
70. A5 9 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 007 0 007 0 008 0 008 0 005 uninduziert rcIL 2 Konzentration 4 053 4 101 4 358 4 340 3 537 4 078 0 332 OD 0 039 0 040 0 042 0 041 0 038 induziert rcIL 2 Konzentration 8 542 8 590 8 784 8 736 8 442 8 619 0 141 154 Anhang Tabelle 27 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen verschiedener BHK Linien in ng ml eingesetzte Zellkonzentration 1 3 x 10 Zellen ml Dauer der rcIL 2 Produktion 72 h Originalmesswerte siehe Tabelle 44 A5 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit X s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 003 0 001 0 001 0 003 0 002 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 854 1 015 1 015 2 854 2 636 2 075 0 971 OD 0 040 0 042 0 042 0 042 0 023 induziert rcIL 2 Konzentration 8 590 8 785 8 784 8 833 6 746 8 348 0 900 A5 3 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit X s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 002 0 001 0 003 0 004 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 333 1 536 2 729 3 250 3 031 2 576 0 675 OD 0 040 0 040 0 042 0 044 0 035 induziert rcIL 2 Konzentration 8 640 8 639 8 833 9 023 8 090 8 645 0 349 A5 4 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 002 0 001 0 003 0 003 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 333 1 015 2 854 3 072 2 854 2 426 0 834 OD 0 063 0 059 0 062 0 067 0
71. ATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATCTGAAACAAGTTACAACTGTGAATATGAJI 412 440 x 460 480 D30710 1 ITGACGAGACAGCAACCAT TACAGAATT TCTGAACAAATGGATTACCTTTTGTCAAAGCAT 480 cIL 2PCR ITGACGAGACAGCAACCAT TACAGAATT TCTGAACAAATGGATTACCTTTTGTCAAAGCAT 472 500 520 540 D30710 1 GUHKOHKOTUNEINOHHEINOHETCATAATTAAGTGCCTATTTAAAATGTATCAGGCTATTTATTTA 540 cIL 2PCR ONHKOHKOF U NEI NOHNET NOHNT GA 491 560 580 600 D30710 1 AATATTTAAAATTTATATTTATTTTTTGATGTACGTTTTGCTACCTTTTGTAATTATTAT 600 cIL 2PCR 620 640 660 D30710 1 TCTTATACTTCATATGATAAATATGGATCTTTTAAGATTCTTTTTGTAAGCCC 653 cIL 2PCR Abbildung 9 Vergleich der Sequenz des PCR Produktes cIL 2PCR mit der von Dunham 1995 ermittelten Sequenz D30710 1 hellgrau Start und Stopcodon mittelgrau codierende Sequenz fir das Signalpeptid schwarz codierende Sequenz fiir cIL 2 Ergebnisse 85 4 1 5 Klonierung des RT PCR Produktes Die erfolgreiche Klonierung des Produktes aus der RT PCR in den pCR II TOPO Vektor von Invitrogen Carlsbad USA wurde ebenfalls mit einer Agarose Gelelektrophorese berpr ft Zun chst wurde nach der Klonierungsreaktion die Plasmidmenge ermittelt die aus den transformierten E coli durch das NucleoBond PC100 Plasmid DNA Purification Kit Macherey Nagel isoliert wurde Diese Messung ergab einen Gehalt von 359 ng Plasmid DNA ml Zur Kontrolle der Klonierung wurde der Vektor in einem Enzymverdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI in zwei Teile geschnitten Es
72. Abbildung 20 Agarosegel nach der RT PCR fiir cIL 2 Bahn 1 und 8 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 RT PCR BHK Bahn 3 PCR BHK Bahn 4 RT PCR Klon Al Bahn 5 PCR Klon Al Bahn 6 RT PCR Klon A5 Bahn 7 PCR Klon A5 104 Ergebnisse 4 3 Einfluss der berst nde von nicht transfizierten BHK Zellen auf die spontane zytotoxische Aktivit t RBA Da BHK Zellen als IL 2 Produzenten genutzt werden sollten musste ein m glicher Einfluss im nicht transfizierten Zustand auf die Zytotoxizit t von Effektorzellen berpr ft und ausgeschlossen werden Die zytotoxischen Eigenschaften dieser Zellen in der sp teren Anwendung sollten lediglich durch das sezernierte rcIL 2 beeinflu t werden Jegliche stimulierende oder inhibierende Einfl sse durch andere Faktoren der BHK Zellen mussten deshalb zuvor ausgeschlossen werden Dies wurde in einem kolorimetrischen Zytotoxizit tstest dem Rose Bengal Assay RBA berpr ft Dabei wurden Effektorzellen die zuvor aus Hundeblut angereichert worden waren den BHK berst nden ausgesetzt und anschlie end ihre Zytotoxizit t gegen ber CTAC Zellen berpr ft Als Kontrolle dienten Effektorzellen die in frischem RPMI FKS Medium ohne den Einflu von BHK Kultur berst nden mit CTAC Zellen inkubiert wurden Hierbei wiesen die nur in Medium inkubierten Effektorzellen im RBA eine spontane Zytotoxizit t von 55 Grafik 2 Tabelle 22 auf mittlere optische Dichte des Testansatzes 0 138 n 5 mittlere optische Dichte d
73. Abl sen mit Trypsin Material und Methoden 61 wurden die Zellen in 5 ml Kulturmedium aufgenommen und in ein 15 ml Zentrifugenr hrchen Falcon Becton Dickinson Heidelberg berf hrt Es schloss sich eine Zentrifugation bei 400 x g f r 5 min und RT an Anschlie end wurden die berst nde abgesaugt und das Zellpellet in 1 8 ml FKS PAA Laboratories GmbH C lbe vorsichtig resuspendiert In je 2 Kryor hrchen Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe pro Zelllinie wurden 100 ul DMSO Serva Heidelberg vorgelegt und 900 ul der entsprechenden Zellsuspension dazu gegeben Nach vorsichtigem Mischen wurden die Kryor hrchen in eine mit Isopropanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe gef llte Kryobox Nalgene Labware Hereford England gestellt und bei 70 C tiefgefroren Dadurch wurden die Zellen schonend um 1 C pro Minute auf 70 C abgek hlt Danach wurden sie in fl ssigem Stickstoff dauerhaft asserviert 3 3 RT PCR zum Nachweis der cIL2 mRNA in den transfizierten BHK Zellen Zun chst wurde berpr ft ob die transfizierten Zellen berhaupt in der Lage waren rcIL 2 zu produzieren Dazu wurde eine RT PCR durchgef hrt mit der nachgewiesen werden sollte dass die Zellen mRNA besitzen die f r das rcIL 2 Protein kodiert Um jedoch auszuschlie en dass in den PCR Schritten nicht doch DNA amplifiziert wurde musste zun chst eine DNase Behandlung vorgenommen werden Dadurch wurde eventuell vorhandene DNA aus dem RNA Isolat enzymatisch a
74. Agarosel sung bis zur Verwendung bei 60 C im Wasserbad aufbewahrt Die DNA Probe wurde vor dem Auftragen auf das Gel im Verh ltnis 5 1 mit Probenpuffer gemischt 0 1 w v Orange G Fluka Schweiz 30 Glycerin Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen Parallel zu den Proben wurde die 1 kbp DNA Leiter Invitrogen Karslruhe als Gr enstandard aufgetragen Die Auftrennung erfolgte in Gel Apparaturen Werkstatt des Mehrzweckinstitutes Giessen bei einem Elektrodenabstand von 15 cm durch Anlegen einer elektrischen Gleichspannung von 120 V f r etwa 25 min Die Fluoreszenz der Proben wurde im UV Durchlicht bei einer Wellenl nge von 254 nm betrachtet und computergest tzt mittels des Systems GelPrint 20001 MWG Ebersberg durch Thermoausdruck dokumentiert 3 2 1 3 Isolierung des DNA Fragmentes Zur Isolierung des gewonnen PCR Fragmentes wurde ein pr paratives Gel hergestellt Dessen Unterschied zu dem unter 3 2 1 2 beschriebenen Gel bestand in der Gr e der Taschen in die der PCR Ansatz einpipettiert wird Diese waren gro genug um einen kompletten PCR Ansatz von etwa 50 ul zu fassen Zur Schonung der DNA und zur Vermeidung von Strangbr chen wurde dieses Gel im UV Durchlicht bei einer Wellenl nge von 312 nm betrachtet Das gesuchte Fragment von 479 bp wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten und zur weiteren Verwendung aus dem Gelst ckchen isoliert Dies erfolgte durch S ulen des DNA A garosegel Extraktion Kits UltrafreeDA Millipore
75. Basen am 3 Ende Da es sich dabei um nicht codierende Abschnitte handelt kommt ihnen f r die Expression des Proteins keine Bedeutung zu 92 Ergebnisse pGEM T IL2 D30710 pGEM T IL2 D30710 pGEM T IL2 D30710 pGEM T IL2 D30710 pGEM T IL2 D30710 pGEM T IL2 D30710 pGEM T IL2 D30710 pG EM T IL2 D30710 pGl EM T IL2 D30710 pG EM T IL2 D30710 pGl EM T IL2 D30710 u 20 40 60 AGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCACTAGTGAT TGGTACCATGTACAAAA ACTACTCACAGTAACCTCAACT CCT GCCAC ANG NO Wav a0 2 CTG CG A TG AC ATGTACAAAA ie 80 bi 100 120 TGCAACTCTT Gigs MKCO UKOCL07 NOuMe NOle ONNEA Ou u Ken Keleier v v Nes Ten feier Neleu nun TGCAACTCTTETCETTGCATCGCACTGACGETTGTACTTGTCGCAAACAGTGCACCTATTA TGCAACTCTTGTCTTIGCATCGCACTGACGCTTGTACTTGTCGCAAACAGTGCACCTATTA a 140 A 160 180 CTTCAAGCTCTACAAAGGAAACAGAGCAACAGAT GGAGCAAT TACTGCTGGATTTACAGT CTTCAAGCTCTACAAAGGAAACAGAGCAACAGAT GGAGCAAT TACTGCTGGATTTACAGT CTTCAAGCTCTACAAAGGAAACAGAGCAACAGATGGAGCAAT TACTGCTGGATTTACAGT 200 x 220 x 240 TGCTTTTGAATGGAGT TAATAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCACATTTA TGCTTTTGAATGGAGT TAATAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCACATTTA TGETTTTGAATGGAGTTAATAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCACATTTA x 260 280 300 AGT TTTACACGCCCAAGAAGGCCACAGAAT TTACACACCTTCAATGTCTAGCAGAAGAAC AGT TTTACACGCCCAAGAAGGCCACAGAAT TTACACACCTTCAATGTCTAGCAGAAGAA
76. Billerica USA nach Angaben des Herstellers Nach einer Zentrifugationsphase von 10 min bei 3 500 x g bei der die festen Gelbestandteile in der S ule zur ckgehalten wurden befand sich die extrahierte DNA im Filtrat und konnte direkt weiterverwendet werden 3 Amplifizierung des Reportergens Luciferase und der IRES Das Plasmid pCITE Luci das in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Norbert Tautz am Institut f r Virologie Fachbereich 10 der Justus Liebig Universit t Giessen vorhanden war und zur Verf gung gestellt wurde enthielt die Sequenz f r die IRES gefolgt von dem Reportergen Luciferase Dieses zusammen ca 2 5 kbp gro e Fragment wurde mit Hilfe der Primer T3 und BVTK7 Primer des Instituts f r Virologie Fachbereich 10 Justus Liebig Universit t 42 Material und Methoden Giessen in einer PCR aus dem Plasmid amplifiziert Das PCR Gemisch setzte sich folgenderma en zusammen Tabelle 8 PCR Ansatz zu Amplifikation von IRES Luciferase Taq Polymerase 5 U ul Biotherm NatuTec Frankfurt 0 5 ul dNTPs 10mM Roche Mannheim lul Primer T3 57 pmol ul 0 35 ul Primer BVTK7 10 pmol ul 2 ul Plasmid pCITE Luci 85 ng ul 0 6 ul Biotherm Puffer 10X NatuTec Frankfurt Sul ddH O 40 5 ul Die PCR sowie die Gelelektrophorese und deren Auswertung erfolgten unter den gleichen Bedingungen wie unter 3 2 1 1 und 3 2 1 2 beschrieben Auch dieses Fragment wurde aus einem pr parativen Gel wie unter 3 2 1
77. C AGTTTTACACGCCCAAGAAGGCCACAGAAT TTACACACCTTCAATGTCTAGCAGAAGAAC 320 x 340 F 360 TCAAAAACCTGGAGGAAGTGCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGTTCACTTGACAGACAJ TCAAAAACCTGGAGGAAGTGCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGTTCACTTGACAGACAJ TCAAAAACCTGGAGGAAGTGCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGTTCACTTGACAGACA 380 2 400 420 CCAAGGAATTAATCAGCAATATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATCTGAAACAA CCAAGGAATTAATCAGCAATATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATCTGAAACAA CCAAGGAATTAATCAGCAATATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATCTGAAACAA y 440 460 480 GTTACAACTGTGAATATGATGACGAGACAGCAACCATTACAGAATTTCTGAACAAATGGA GTTACAACTGTGAATATGATGACGAGACAGCAACCATTACAGAATTTCTGAACAAATGGA GTTACAACTGTGAATATGATGACGAGACAGCAACCATTACAGAATTTCTGAACAAATGGA 500 520 540 pmeAC CTT TTGICAAAGCATCTTCTCAACACTGACTTGACGCGTAATCCCGCGGCCATGGC UNO SH Isl Ie CU OVW _V_ COr WNOu IN OMNOy_vV NOr NUN NONE AAT TAAGTGCCTATTTAAAAT TTACCTTTTGTCAAAGCATCTTCTCAACACTGACTTGA TAA A 2 560 bi 580 600 GGCCEGGGAGCATGCG ACGTCEGGGCCCA ATTCGCCCTATAGTGA GTCGTAT GTATCAGGCTATTTATTTAAATATTTAAAATTTATATTTATTTTTTGATGTACGTTTTGC G G AT A T AA G G amp 620 2 640 k 660 ACAATTCAC ACCT TGTAATTATTATTCTTATACTTCATATGATAAATATGGATCTTTTAAGATTCT AC 60 41 120 101 180 161 240 221 300 281 360 341 420 401 480 461 540 521 590 581 600 641 Abbildung 14 Vergleich der Sequenz des in den pGEM T Vektor ei
78. CTATGCATCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCC 120 140 x 160 x 180 D30710 ACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCACAATGTA 36 cIL 2Klon GCCAGTGTGCTGGAATTEGCCCT TEN NENNEN Xeuy VNolouner VNoulelouiciorXerVunene 130 ACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCACAATGTA x 200 x 220 x 240 D30710 CAAAATGCAACTCTTGTCTTGCATCGCACTGACGCTTGTACTTGTCGCAAACAGTGCACC 96 cIL 2Klon QNNWAUMe or Xeouvoumneu fon uelor Uuole or Noune Cole ou mueHUNouMMCHUOICIONW VNerNewNcIonNee 2 4 0 CAAAATGCAACTCTTGTCTTGCATCGCACTGACGCTTGTACTTGTCGCAAACAGTGCACC x 260 x 280 300 D30710 TATTACTTCAAGCTCTACAAAGGAAACAGAGCAACAGATGGAGCAATTACTGCTGGATT TEREI cIL 2Klon 1lenufer V Nelouuehy K6r N V Neley V V Ney Ney Neioy V Noy Ney uneierNeier V GuyNounelouneier 300 TATTACTTCAAGCTCTACAAAGGAAACAGAGCAACAGATGGAGCAATTACTGCTGGATTT x 320 x 340 360 D30710 IACAGT TGCTTTTGAATGGAGT TAATAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCACENAIEG cIL 2Klon NOPNeMmMe oumumuves v UuelerNenimy V Uu V Uinw Uxer Ner VNOLoleloler VNOMNOUNOON NCC WHCIOMNONG 36 0 ACAGTTGCTTTTGAATGGAGT TAATAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCAC x 380 x 400 420 D30710 AT TTAAGT TT TACACGCCCAAGAAGGCCACAGAAT TTACACACCTTCAATGTCTAGCAGA AMAG cIL 2Klon MOWN Neu mime Nor Neole olorer WNerV clclolor Nor Nerv Wi Nor Nor Glen mNCrVWHCHNOHUNCINNeIN 42 0 ATTTAAGTTTTACACGCCCAAGAAGGCCACAGAATTTACACACCTTCAATGTCTAGCAGA 440 x 460 x 480 D30710 AGAACTCAAAAACCTGGAGGAAGTGCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGTTCACT TGA CEEE IIS CIL 2Klon MENNO ONNNN NAOUN VNC lou NCHU IN NNN NNN NAC
79. Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe und 10 ul 5 M Natriumacetat vermischt F r mindestens 30 min wurde die RNA bei 20 C gef llt Danach wurde sie bei 4 C und 11 000 x g f r 15 min abzentrifugiert und nach Abnahme des berstandes in 200 ul 70 Ethanol v v Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe resuspendiert Dieses wurde nach einer weiteren Zentrifugation bei 11 000 x g und 4 C f r 5 min wieder entfernt und das RNA Pellet luftgetrocknet Die RNA wurde anschlie end in 30 ul RNase freiem ddH O resuspendiert und erneut der RNA Gehalt der L sung bestimmt siehe 3 3 2 64 Material und Methoden 3 3 3 2 Denaturierung W hrend der Denaturierung erfolgte die Bindung des Reverse Primers an die RNA Der Denaturierungsansatz setzte sich folgenderma en zusammen Tabelle 14 Ans tze zur Denaturierung BHK 1 5 1 ug Gesamtzell RNA 1 6 ul 1 1 ul 1 1 ul 20 pmol MluIL2rev siehe 3 2 1 1 2 ul 2 ul 2 ul DEPC ddH O 6 4 ul 6 9 ul 6 9 ul Diese Mischungen wurde f r 10 min auf 70 C erhitzt und anschlie end auf 4 C abgek hlt 3 3 3 3 cDNA Synthese Zur cDNA Synthese wurde folgender Reagenzien Mix hergestellt Tabelle 15 Mastermix zur cCDNA Synthese RNase Inhibitor 20 U ul Rnasin Promega Madison USA 1 5 ul dNTP Mix jeweils 10 mM dATP dTTP dCTP dGTP 6ul DTT Dithiothreitol Serva Heidelberg 3 ul First Strand Buffer 10X 125 mM Tris pH 8 3 187 5 mM KCl 7 5 mM MgCl 12
80. Das Luciferase Substrat wurde bei 70 C gelagert und kurz vor dem Assay aufgetaut Die Messung erfolgte im Luminometer L Max Microplate Luminometer von Molecular Devices Sunnyvale USA und wurde mit dem Programm Soft Max Pro ausgewertet Es wurden jeweils 100 ul des unter 3 2 6 3 gewonnen Uberstandes in ein Well einer undurchsichtigen MTP einpipettiert Die vom Luminometer automatisch bei der Messung zugegebene Substratmenge lag bei 100 ul je Well 3 2 7 Stabile Transfektion von pTRUE IL 2 IRES in BHK Tet on Zellen zur Erzeugung einer IL 2 poduzierenden Zelllinie Die stabile Transfektion erfolgte mit dem linearisierten Plasmid pTRUE IL 2 IRES Durch die Linearisierung kann das Plasmid dauerhaft in das Genom der Wirtszellen integriert werden wodurch die eingebauten Gensequenzen bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben werden k nnen Als Empf ngerzellen diente wieder die BHK Tet on Zelllinie siehe 3 2 6 3 2 7 1 Zellkulturarbeiten mit BHK Tet on Zellen zur Vorbereitung der Transfektion Die Zellen wurden wie unter 3 2 6 1 beschrieben behandelt und zur Transfektion vorbereitet 58 Material und Methoden ar Linearisierung und Aufreinigung des Plasmids pTRUE IL 2 IRES Die Linearisierung erfolgte mit dem Restriktionsenzym FspI NEB GmbH Frankfurt Der Ansatz des Verdaus setzte sich folgenderma en zusammen Tabelle 14 Ansatz des Restriktionsverdaus zur Linearisierung von pTRUE IL 2 IRES
81. Durch diese Spaltung entstehen violette wasserunl sliche Formazankristalle Um deren Farbintensit t spektrometrisch in einem ELISA Reader messen zu k nnen m ssen die Kristalle gel st werden Mosmann 1983 verwendete dazu im Originalprotokoll HCl Isopropanol Die Zugabe von Salzs ure zum L sungsmittel wird notwendig um die rote Farbe des meist im Zellkulturmedium Literatur bersicht 15 vorhandenen pH Indikators in eine gelbe Farbe umzuwandeln die mit der Absorptionswellenlange von 570 nm nicht interferiert Da Isopropanol jedoch die Pr zipitation von im Kulturmedium vorhandener Proteine verursachte Denizot und Lang 1986 wurden z B serumfreie Medien und andere L sungsmittel wie Ethanol oder Propanol verwendet Denizot und Lang 1986 Untersuchungen zu alternativen L sungsmitteln wie Sodiumdodecylsulfat SDS mit Salzs ure Tada et al 1986 oder SDS mit N N Dimethylformamid pH 4 7 Hansen et al 1989 zeigten jedoch dass eine Inkubation der Mikrotiterplatten MTP im Brutschrank ber Nacht n tig war um die Kristalle Komplett aufzul sen Dimethylsulfoxid DMSO wurde von Twentyman und Luscomb 1987 als L sungsmittel eingesetzt was zu einer schnellen und vollst ndigen L sung der Kristalle f hrte Durch den Einsatz von DMSO HCl in einem Mischungsverh ltnis von 9 1 konnte sowohl eine rasche Kristallaufl sung innerhalb von 10 15 Minuten als auch eine ausreichende Ans uerung und damit Gelbf rbung des Zellkultu
82. Ende dieser Vorinkubation aufgrund der sehr geringen Zellzahlen nicht durchgef hrt werden da dies einen weiteren Verlust an Effektorzellen bedeutet h tte und somit das optimale Verh ltnis von Effektor und Zielzellen von 100 1 noch weniger h tte erreicht werden k nnen Der R ckgang der Effektorzellzahlen wurde besonders deutlich nachdem sie 12 h in dem bereits von BHK Zellen verbrauchten Medium inkubiert wurden da dieses deutlich n hrstoff rmer war und durch Stoffwechselprodukte bereits einen niedrigeren pH Wert aufwies Da jedoch im ersten Diskussion 125 Versuchsansatz kein gravierender Unterschied zwischen den Zytotoxizit ten ermittelt werden konnte ist davon auszugehen dass BHK Zellen keine Faktoren produzieren die sich stimulierend auf die NK Zell Aktivit t auswirken Die biologische Aktivit t des sezernierten cIL 2 also die F higkeit der Stimulation IL 2 abh ngiger Zellen wurde in einem Bioassay durch die Bestimmung der Proliferation der IL 2 abh ngigen Zelllinie CTLL 2 berpr ft Eine Absch tzung der Menge an sezerniertem cIL 2 musste ebenfalls mit diesem Bioassay durchgef hrt werden da ein entsprechendes ELISA System f r kanines IL 2 bis heute nicht zur Verf gung steht Die berpr fung der biologischen Aktivit t des von den transfizierten BHK Zellen nach Doxyzyklin Induktion sezernierten cIL 2 erfolgte unter verschiedenen Kulturbedingungen Bei einer eingesetzten Zellzahl von 1 5 x 10 Zellen ml und ei
83. Engl J Med 313 1485 1492 Sambrook J Russel D 2001 Molecular Cloning A laboratory manual 3rd Edition Cold Spring Laboratory Press S 2 234 Sanger F Nicklen S Coulson A R 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A 74 5463 5467 Sauve K Nachman M Spence C Bailon P Campbell E Tsien W H Kondas J A Hakimi J Ju G 1991 Localization in human interleukin 2 of the binding site to the alpha chain p55 of the interleukin 2 receptor Proc Natl Acad Sci U S A 88 4636 4640 146 Literaturverzeichnis Schechter D Nagler A 1992 Recombinant interleukin 2 and recombinant interferon alpha immunotherapy cardiovascular toxicity Am Heart J 123 1736 1739 Schmitz G 2000 Qualitative und quantitative Untersuchungen der zytotoxischen Aktivit t aus Hundeblut isolierter Leukozyten gegen ber verschiedener kaniner Tumorzelllinien Vet Med Diss Justus Liebig Universit t Giessen Schnell M J Buonocore L Whitt M A Rose J K 1996 The minimal conserved transcription stop start signal promotes stable expression of a foreign gene in vesicular stomatitis virus J Virol 70 2318 2323 Schuettrumpf J Liu J H Couto L B Addya K Leonard D G Zhen Z Sommer J Arruda V R 2006 Inadvertent germline transmission of AAV2 vector findings in a rabbit model correlate with those in a human clinical trial Mol Ther 13 1064 1073 Siegel J P
84. GGCTATTTATTTAAATATTTAAAATTTATATTTATTTTTTGATGTACGT 740 x 760 780 D30710 GCTACCTTTTGTAATTATTATTCTTATACTTCATATGATAAATATGGATCTTTTAAG 636 cIL 2Klon GCTACCTTTTGTAATTATTATTCTTATACTTCATATGATAAATATGGATCTTTTAAG 780 GCTACCTTTTGTAATTATTATTCTTATACTTCATATGATAAATATGGATCTTTTAAG 800 820 840 D30710 ATICTTTTIGTAAGCCC 653 cIL 2Klon ATTC TGTAAGCCCAAGGGCGAATTCT GCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCG 840 ATTCTTTTTGTAAGCCC 860 880 900 D30710 cIL 2Klon AGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGECETATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCG 900 920 940 960 D30710 cIL 2Klon TCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAG 960 D30710 cIL 2Klon CACAT 965 Abbildung 10b Fortsetzung des Vergleichs der Sequenz des einklonierten PCR Produktes cIL 2Klon mit der von Dunham 1995 ermittelten Sequenz D30710 schwarz codierende Sequenz f r cIL 2 798 965 Teil des Vektors 804 809 EcoRI Erkennungssequenz 867 886 T7 Promotor 88 Ergebnisse 4 2 Tet on Expression 4 2 1 Einbau von Restriktionsenzymschnittstellen durch PCR in cIL 2 Mit Hilfe von Primern wurden Schnittstellen f r die Restriktionsenzyme KpnI und Mlul flankierend zu der fiir cIL 2 kodierenden Region eingebaut Die Position fiir KpnI befindet sich zwischen den Basen 26 und 52 siehe Sequenz D30710 1 Abbildung 9 Seite 84 die Position f r Mlul zwischen den Basen 465 und 504 Durch eine Agarosegelelektrophorese wurde das dadurch amplifizierte 479 bp gro e DNA Fra
85. Gel von pGEM T IRES 2 AMluVPstV Scal und pTRUE AKpnV Pstl in Bahn 2 Bande bei 3 kbp ausgeschnitten in Bahn 3 Bande bei 2 5 kbp ausgeschnitten Pfeile Bahn 1 und 4 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 pTRUE AKpnVPsil Bahn 3 pGEM T IRES 2 AMluVPstVScal Ergebnisse 95 Vor der Ligation der drei Elemente wurde der Vektor pTRUE dephosphorylisiert um die intramolekulare Ligation der Vektorenden ohne Einbau des Inserts zu verhindern und anschlie end in einer Phenol Chloroform Extraktion wieder aufgereinigt Um die Effizienz des Einbaus der Fragmente in den Vektor im Vergleich zur intramolekularen Vektorr ckligation absch tzen zu k nnen wurde parallel zur Dreifachligation eine Religationskontrolle angesetzt bei welcher statt der einzubauenden Fragment H O bidest zugegeben wurde Nach der Transformation dieser Ans tze in E coli zeigte sich auf der Platte mit dem Dreifachligationsansatz ein sehr viel deutlicheres Koloniewachstum als auf der Platte mit den Religationsans tzen Daraus konnte auf eine relativ hohe Effizienz beim Einbau der Fragmente in den Vektor geschlossen werden 96 Ergebnisse Nach dem Picken von 6 Kolonien und deren Plasmid Midi Pr paration schloss sich ein analytischer Verdau mit Mlul und PstI an um die korrekte Ligation des Plasmids zu berpr fen Im Falle eines korrekten Einbaus wurden in der Agarosegelelektrophorese je eine Bande von 2 5 kbp IRES Luciferase Konstrukt und eine von 3 5 kbp pTRUE Vektor cIL 2 Gr
86. Grossman H B Stanisic T H Smith J A Jr Sullivan J Sarosdy M F et al 1991 A randomized trial of intravesical doxorubicin and immunotherapy with bacille Calmette Guerin for transitional cell carcinoma of the bladder N Engl J Med 325 1205 1209 Li A L Jiang J Y Ma J B Wang G M Hao J Gao X Xie S S 2004 Bone marrow stromal cell line co transfected with IL 2 and IL 3 genes can accelerate restoration of T cell immunity in allo BMT mice Chin Med J Engl 117 1223 1227 Lis H Sharon N 1973 The biochemistry of plant lectins phytohemagglutinins Annu Rev Biochem 42 541 574 Liu C Yu S Zinn K Wang J Zhang L Jia Y Kappes J C Barnes S Kimberly R P Grizzle W E Zhang H G 2006 Murine mammary carcinoma exosomes promote tumor growth by suppression of NK cell function J Immunol 176 1375 1385 Macpherson I 1963 Characteristics of a hamster cell clone transformed by polyoma virus J Natl Cancer Inst 30 795 815 Macpherson I Stoker M 1962 Polyoma transformation of hamster cell clones an investigation of genetic factors affecting cell competence Virology 16 147 151 Literaturverzeichnis 143 Margolin K A Rayner A A Hawkins M J Atkins M B Dutcher J P Fisher R I Weiss G R Doroshow J H Jaffe H S Roper M et al 1989 Interleukin 2 and lymphokine activated killer cell therapy of solid tumors analysis of toxicity and management gui
87. HU NUNEN 430 AGAACTCAAAAACCTGGAGGAAGTGCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGTTCACTTGAC x 500 520 x 540 D30710 AGACACCAAGGAATTAATCAGCAATATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATC T GARESEN CcIL 2Klon MENINI NaN AINAN AYINA NANNU uue NOUVEN 540 AGACACCAAGGAATTAATCAGCAATATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATCTGA Abbildung 10a Vergleich der Sequenz des einklonierten PCR Produktes cIL 2Klon mit der von Dunham et al 1995 ermittelten Sequenz D30710 mittelgrau codierende Sequenz f r das Signalpeptid schwarz codierende Sequenz f r cIL 2 1 144 Teil des Vektors 47 64 Sp6 Promotor 133 138 EcoRI Erkennungssequenz Ergebnisse 87 560 580 600 D30710 AACAAGTTACAACTGTGAATATGATGACGAGACAGCAACCATTACAGAATTTCTGAACAAME 456 CIL 2Klon RNGINNGMmW Nes WNouuepues Uu UNer Uuer Cole er Nor elo NN NENNEN 600 AACAAGTTACAACTGTGAATATGATGACGAGACAGCAACCATTACAGAATTTCTGAACAA 620 640 660 D30710 Miveler Guy Noob NN UUCEMNCDNGL WNorNepnerNonn TGATAATTAAGTGCCTATTT 516 cIL 2Klon MENET Amu NeloummmueyvesV V clor GuoumuouNerVNorXeuver Nowy GATAATTAAGTGCCTATTT 660 ATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCTTCTCAACACTGACTTGATAATTAAGTGCCTATTT 680 700 720 D30710 AAAATGTATCAGGCTATTTATTTAAATATTTAAAATTTATATTTATTTTTTGATGTACGT 576 cIL 2Klon AAAATGTATCAGGCTATTTATTTAAATATTTAAAATTTATATTTATTTTTTGATGTACGT 720 AAAATGTATCA
88. Herstellung von kaninem Interleukin 2 cIL 2 nach stabiler Transfektion der mesenchymalen BHK Zelllinie mit Hilfe des Tet on Expressionssystems zur Erzeugung von Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK f r eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund Sandra Sara Preis INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr med vet beim Fachbereich Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Gie en U we LAUFERSWEILERVERLAG Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich gesch tzt Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzul ssig Das gilt insbesondere f r Vervielf ltigungen bersetzungen Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme 1 Auflage 2008 All rights reserved No part of this publication may be reproduced stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means electronic mechanical photocopying recording or otherwise without the prior written permission of the Author or the Publishers 1 Edition 2008 2008 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG Giessen Printed in Germany VVB LAUFERSWEILER VERLAG edition scientifique STAUFENBERGRING 15 D 35396 GIESSEN Tel 0641 5599888 Fax 0641 5599890 email redaktion doktorverlag de www doktorverlag de Aus dem Institut f r Veterin r Pathologie des Fachbereichs Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Giessen Betreuer Prof Dr E
89. PHA F r Con A ergab die Inkubation kaniner Lymphozyten in Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 RPMI 1640 mit 2 ug Con A ml ber 72 h bei 37 C und 5 CO bei einem Serumgehalt hitzeinaktiviertes fetales K lberserum FKS von 1 im Zellkulturmedium die h chste Stimulation Die optimale Ausgangskonzentration an Lymphozyten lag bei 1 5 x 10 Zellen ml Um eine optimale Stimulation kaniner Lymphozyten mit PHA zu erzielen mussten 3 x 10 Zellen ml mit 8 ug PHA ml in RPMI 1640 mit einem Serumzusatz von 1 ber 120 h bei 37 C und 5 CO inkubiert werden Die weiteren Untersuchungen von Wagner zeigten anhand der ermittelten Stimulationsindizes dass die Stimulation unter Con A Einfluss effektiver war als die durch PHA 2 5 Proliferationstest mit Methylthiazol Tetrazolium MTT Um die Nachteile des radioaktiven Standard Proliferationstests Einbau von radioaktivem H Thymidin zu umgehen wurden Farbstofftests f r die Messung der Lymphozyten Proliferation entwickelt Der kolorimetrische Methylthiazol Tetrazolium MTT Test wurde zur Uberpriifung der Proliferation von Zellen etabliert Mosmann 1983 und basiert auf der gesteigerten mitochondrialen Aktivit t stimulierter Zellen Das Prinzip dieses Farbstofftests beruht auf der Spaltung des Tetrazoliumringes des gelben wasserl slichen Tetrazolium salzes 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 2 5 diphenyl Tetrazoliumbromid durch Dehydrogenasen aktiver Mitochondrien Slater et al 1963
90. Religationskontrolle wurden in den E coli Stamm K12 HB101 nach dem gleichen Schema wie unter 3 2 3 5 beschrieben transformiert Daran schlossen sich die unter 3 2 3 3 beschriebenen Schritte der Plasmid Mini Pr paration von 6 gepickten Kolonien an F r den folgenden analytischen Verdau siehe Tabelle 13 wurden die Restriktionsenzyme Mlul und PstI eingesetzt wonach zwei Fragmente von etwa 2 5 kbp und 3 5 kbp Gr e erwartet wurden Tabelle 13 Mastermix f r den analytischen Verdau 6 verschiedener Plasmid Mini Pr parationen von pTRUE IL 2 IRES Mlul 10 U ul 2 ul PstI 20 U ul 2 ul Puffer NEB 3 NEB GmbH Frankfurt 6 ul H 0 44 ul Dieser Mastermix wurde auf 6 Eppendorf Gef e verteilt und mit jeweils 1 ul der Plasmid DNA versetzt Nach der Inkubationszeit erfolgte die Auswertung auf einem Agarosegel wie oben beschrieben siehe 3 2 1 2 Anhand dieses Ergebnisses wurde ein pTRUE IL 2 IRES Klon ausgew hlt mit dem eine Retransformation und eine Plasmid Midi Pr partion wie unter 3 2 3 5 und 3 2 3 6 erkl rt durchgef hrt wurden Durch einen erneuten analytischen Verdau wurde die bereinstimmung des Plasmids der Mini und der Midi Pr paration nachgewiesen Material und Methoden 53 3 2 6 Transiente Transfektion von pTRUE IL 2 IRES in BHK Tet on Zellen und funktionelle berpr fung des Reportergens Luciferase Unter einer transienten Transfektion eines Plasmides versteht man die Inkorporation von Pl
91. Sharon M Smith P L Leonard W J 1987 The IL 2 receptor beta chain p70 role in mediating signals for LAK NK and proliferative activities Science 238 75 78 Simmons C C 1930 Cancer of the Buccal Mucosa The Results of Treatment by Operation and Radiation Ann Surg 92 681 693 Sladowski D Steer S J Clothier R H Balls M 1993 An improved MTT assay J Immunol Methods 157 203 207 Slater T F Sawyer B Straeuli U 1963 Studies on Succinate Tetrazolium Reductase Systems Iii Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts Biochim Biophys Acta 77 383 393 Smith K A Cantrell D A 1985 Interleukin 2 regulates its own receptors Proc Natl Acad Sci US A 82 864 868 Tada H Shiho O Kuroshima K Koyama M Tsukamoto K 1986 An improved colorimetric assay for interleukin 2 J Immunol Methods 93 157 165 Taniguchi T Matsui H Fujita T Hatakeyama M Kashima N Fuse A Hamuro J Nishi Takaoka C Yamada G 1986 Molecular analysis of the interleukin 2 system Immunol Rev 92 121 133 Taniguchi T Matsui H Fujita T Takaoka C Kashima N Yoshimoto R Hamuro J 1983 Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin 2 Nature 302 305 310 Literaturverzeichnis 147 Taura Y Ishi K Nagami M Mikasa N Nakaichi M Nakama S 1995 Changes in lymphoproliferation and DTH responses after vaccination immediately before surgery in p
92. Tetrazyklinoperator terO f hrt Gossen et al 1995 Es ist allerdings unwahrscheinlich dass im Zuge der Transfektion solch eine gravierende Mutation an der richtigen Stelle und damit eine Ver nderung der Aminos ureabfolge in Klon All entstanden ist Die Ursache f r dieses Ergebnis ist somit unklar Ein zweites Luciferase Assay mit den Klonen Al A5 und A8 ergab hnliche Werte wie die des vorausgegangenen Assays Der SI von Klon Al und A8 lag jedoch etwas unter den zuvor gemessenen Werten Klon Al produzierte im induzierten Zustand weniger Luciferase was wiederum mit einer Schwankung in der Zellzahl zu erkl ren ist Dies ist wahrscheinlich auch die Ursache daf r dass Klon A8 hier eine gr ere Menge Luciferase exprimierte Klon A5 zeigte bei diesem zweiten Screening sowohl im induzierten als auch im nicht induzierten Zustand eine h here Luciferase Produktion Auch der SI war h her Als Negativ Kontrolle wurde die Luciferase Expression in BHK Zellen untersucht die das Luciferase Gen nicht Diskussion 123 beinhalteten Mit 119 lag dieser Wert weit unter der basalen Luciferase Expression von transfizierten jedoch nicht induzierten BHK Tet on pTRUE IL 2 Zellen Die Reklone von Al und A5 verhielten sich wie ihre Ausgangszellklone Der SI von Al l und A1 2 lag mit 42 5 und 34 5 im Bereich des SI von Al Die Reklone von A5 zeigten wie die Ursprungszelllinie eine sehr hohe induzierte Luciferase Menge bei einem mittleren SI Dies deu
93. Verf gung zu stellen Dadurch werden Proteinsynthese und Proteingehalt der Zellen gesteigert was die Produktion von 12 Literatur bersicht Effektormolek len erlaubt Diese Vorg nge sind jedoch sehr energieaufw ndig So findet sich bei antigenaktivierten zytotoxischen T Zellen nach einer IL 2 Inkubation von 6 bis 8 Tagen in vitro ein R ckgang in der Zellzahl aufgrund einer erh hten Apoptoserate Cornish et al 2006 NK Zellen zeigen eine antigen unabh ngige Sensitivit t gegen ber IL 2 Sie reagieren mit einer erh hten Proliferationsrate und Synthese verschiedener Effektorproteine wie Perforin oder Granzyme die den gr ten Teil der zytotoxischen Wirkung ausmachen Weiterhin sezernieren sie nach IL 2 Kontakt ein bestimmtes Profil an Zytokinen die in erster Linie alle eine Makrophagen Monozyten aktivierende Wirkung haben Dazu z hlen IFN y TNF a und GM CSF Der Kontakt mit IL 2 bewirkt zus tzlich eine ver nderte Genexpression in NK Zellen Dybkaer et al 2007 Dadurch werden beispielsweise weitere Zytokinrezeptoren Chemokinrezeptoren und Todesrezeptor Liganden FasL und TRAIL f r die Apoptose Einleitung sowie sekretorische Proteine verst rkt produziert Auch die zunehmende Expression von spezifischen NK Zell aktivierenden Rezeptoren erh ht die Zytotoxizit t von NK Zellen Weiterhin zeigten IL 2 stimulierte NK Zellen eine verz gerte Expression proinflammatorischer Proteine wie chemotaktische Faktoren oder Adh sions bzw
94. al 1977 Dabei wird der zu sequenzierende DNA Abschnitt in vier einzelnen PCR Reaktionen amplifiziert Jede dieser Reaktionen enth lt neben einem Primer der DNA Polymerase Puffer Wasser und allen vier dNTPs auch jeweils in einem bestimmten Verh ltnis eine Sorte der 2 3 Didesoxyanaloga ddCTP ddATP ddTTP ddGTP Nach dem Einbau eines dieser Analogons durch die DNA Polymerase bricht die Kettenverl ngerung ab da aufgrund einer fehlenden 3 OH Gruppe keine weitere Phosphodiesterbindung mehr hergestellt werden kann So werden DNA Fragmente unterschiedlicher L nge produziert da die Kettenabbr che statistisch verteilt erfolgen In dem ersten der vier Reaktionsans tze befinden sich alle Fragmente die mit einem C enden in dem zweiten alle mit einem A am Schluss in dem dritten alle mit einem T und in dem vierten alle mit einem G Der Nachweis der entstandenen Fragmente deren Gr enunterschied nur ein Nukleotid betr gt erfolgt durch die Auftrennung der vier Proben in vier nebeneinander liegenden Spuren eines hochaufl senden denaturierenden Polyacrylamidgels Da der zur Reaktion verwendete Primer an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist k nnen die Fragmente durch die Anregung ber einen Laser und die Detektion des emittierten Lichtes sichtbar gemacht und so die Sequenz mit der entsprechenden Software ausgelesen werden Material und Methoden 47 3 2 4 1 Sequenzieransatz Die Sequenzier PCR erfolgte in einer Vorw rts und
95. an Position 497 499 endet Essentiell f r das weitere Vorgehen war die absolute bereinstimmung der Sequenz des amplifizierten PCR Produktes mit der vorgegebenen Sequenz um die Translation eines fehlerfreien und funktionst chtigen Proteins zu gew hrleisten 84 Ergebnisse 20 40 60 D30710 1 ACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCACARTGRNGA WU UNC or 0 Non Topp Ten NOR ENC O Gu 60 cIL 2PCR CAGTAACCTCAACTCCTGCCACAATGIBNGINVV Ue or 0 ou Ken me BHOMINe Or U 52 80 100 x 120 D30710 1 GELFNEIETTLEIHEIE TEILT INNE NENNEN 120 CIL 2PCR ele Neule eleloumieue eimlehueleler v V er es efor Nolony GIy NoumNer WV NEUR NN Nele 112 140 x 160 180 D30710 1 AACAGAGCAACAGATGGAGCAATTACTGCTGGATTTACAGTTGCTTTTGAATGGAGTTAAJ 180 cIL 2PCR AACAGAGCAACAGATGGAGCAATTACTGCTGGATTTACAGTTGCTTTTGAATGGAGTTAAJ 172 200 220 x 240 D30710 1 TTAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACACGCCCAAGAAI 240 cIL 2PCR TAATTATGAGAACCCCCAACTCTCCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACACCCCCAAGAA 232 260 280 300 D30710 1 GGCCACAGAATTTACACACCTTCAATGTCTAGCAGAAGAACTCAAAAACCTGGAGGAAGT 300 cIL 2PCR GGCCACAGAATTTACACACCTTCAATGTCTAGCAGAAGAACTCAAAAACCTGGAGGAAGT 292 320 340 360 D30710 1 GCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGT TCACTTGACAGACACCAAGGAATTAATCAGCAA 360 cIL 2PCR GCTAGGTTTACCTCAAAGCAAAAACGT TCACTTGACAGACACCAAGGAATTAATCAGCAA 352 380 400 x 420 D30710 1 TATGAATGTAACACTTCTGAAACTAAAGGGATCTGAAACAAGTTACAACTGTGAATATGAJI 420 cIL 2PCR T
96. ants suggests alternative immune defence strategy Nature 319 675 678 Kay R G Sharpin R K Brown K J Voegtli U 1973 A method for the isolation of lymphocytes from dog blood Transplantation 16 250 252 Khanna C Anderson P M Hasz D E Katsanis E Neville M Klausner J S 1997 Interleukin 2 liposome inhalation therapy is safe and effective for dogs with spontaneous pulmonary metastases Cancer 79 1409 1421 Khanna C Hasz D E Klausner J S Anderson P M 1996 Aerosol delivery of interleukin 2 liposomes is nontoxic and biologically effective canine studies Clin Cancer Res 2 721 734 Knezevic M Hohenwarter O Grabherr R Bl ml G Predl R Riiker F Schmatz C Filipic B Raspor P Katinger H 1995 Expression of recombinant human Interleukin 2 in Baby Hamster Kidney Cells and Cultivation on different Carriers In Beuvery E C Griffiths J B Zeijlemaker W P Hrsg Animal Cell Technology Developments towards the 21th Century Kluwer Academic Publishers Dordrecht S 771 775 Knezevic M Vorauer Uhl K Hohenwarter O Steindl F Grabherr R Raspor P 1996 Human interleukin 2 IL 2 expressed by transfected mammalian cells Pflugers Arch 431 R227 228 Knuth A Wolfel T Klehmann E Boon T Meyer zum Buschenfelde K H 1989 Cytolytic T cell clones against an autologous human melanoma specificity study and definition of three antigens by immunoselection Pr
97. asma nachweisbar Abbildung 7 CTLL 2 Zellen Paraffinschnitt eines Zellpellets Immunhistologischer Nachweis des CD3 Antigens Peroxidase anti Peroxidase PAP Methode 100 x Diffuse braune Reaktion des Zytoplasmas der wenig differenzierten Tumor T Zellen infolge Bindung des spezifischen Antiserums an das f r T Zellen charakteristische Antigen CD3 72 Material und Methoden Die CTLL 2 Zellen wurden als Suspensionskultur in sterilen Gewebekulturflaschen mit einer Grundfl che von 25 cm Dunn Labortechnik GmbH Asbach in einem CO gt Brutschrank Heraeus UB 6060 EK CO Heraeus Hanau bei 37 C und in 5 iger CO Atmosph re kultiviert Als Medium diente steriles RPMI 1640 Kulturmedium PAA Laboratories GmbH C lbe dem 1 Penicillin 10 000 U ml und 1 Streptomycin 10 000 pg ml beides Biochrom KG Berlin sowie 10 FKS PAA Laboratories GmbH C lbe zugegeben wurden im Folgenden als RPMI FKS bezeichnet Dem Zellkulturmedium wurde je nach gew nschter Proliferationsgeschwindigkeit der CTLL 2 Zellen 50 100 IU rhIL 2 ml Roche Diagnostics GmbH Mannheim zugesetzt Dies entspricht einer IL 2 Konzentration von 25 50 ng ml Die Zellvermehrung wurde regelm ig mit Hilfe des Gewebekulturmikroskopes kontrolliert und die Kulturen jeweils im Abstand von drei bis vier Tagen aufgeteilt Dabei wurde die Zellkonzentration auf etwa 1x 10 Zellen ml eingestellt 3 5 1 2 Prinzip des Bioassays 3 5 1 2 1 BHK Kultur berst nde
98. asmid DNA in Empf ngerzellen ohne dass ein Einbau dieses Plasmids in das Empf ngerzellgenom erfolgt Dadurch besteht zwar zum einen die Gefahr dass das Plasmid im Laufe der Zellteilungen verloren geht andererseits werden jedoch durch den zelleigenen Transkriptions und Translationsapparat die in dem Plasmid enthaltenen Gene abgelesen und entsprechende Proteine produziert Als Empf ngerzellen diente eine BHK Tet on Zelllinie Baby Hamster Kidney Zellen der bereits das Plasmid pEF Tet on stabil transfiziert wurde und die freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Prof Dr Norbert Tautz Institut f r Virologie Fachbereich 10 der Justus Liebig Universit t Giessen zur Verf gung gestellt wurde BHK Zellen sind fibroblastische Zellen aus der Niere des Goldhamsters Mesocricetus auratus Sie sind adh rent wachsende Zellen mit der f r mesenchymale Zellen typischen spindelf rmigen Morphologie und der Bildung von mehrkernigen Riesenzellen Immunhistologisch l t sich das mesenchymalen Marker Antigen Vimentin nachweisen wogegen das epitheliale Marker Antigen Zytokeratin nicht nachgewiesen werden kann siehe Abbildungen 2 4 A l G P 1j lt J 9 Si Aig Fr es Abbildung 2 BHK Zellen Objekttr gerkultur May Griinwald Giemsa 40 x Typische spindelf rmige oder ovale Gestalt fibroblastischer Zellen im Zentrum der Abbildung mehrkernige Riesenzelle 54 Material und Methoden Abbildung 3 Abbil
99. ation in ng ml Grafik 4 Mittelwerte und Standardabweichungen n 5 der produzierten rcIL 2 Konzentrationen verschiedener BHK Klone 1 3 x 10 Zellen ml Produktionsdauer 24 h 109 Ergebnisse Die BHK Klone A5 A5 1 A5 2 A5 3 A5 4 A5 5 A5 6 A5 7 A5 8 und A5 9 wurden in einer Konzentration von 0 75 x 10 Zellen ml ausges t und die rcIL 2 Produktion f r 72 h eingeschaltet Dabei zeigte Klon A5 mit 17 39 ng rcIL 2 ml die h chste rcIL 2 Produktion Grafik 5 Tabelle 26 Die anderen reklonierten BHK Klone produzierten nach Doxyzyklin Induktion 12 57 ng 7 21 ng 8 25 ng 9 02 ng 4 09 ng 5 36 ng 6 68 ng 6 36 ng sowie 8 62 eine basale uninduzierte Klone bis auf A5 5 5 81 ng 0 41 ng 3 26 ng 0 00 ng 0 81 ng 2 40 ng 2 ml Auch hier zeigten alle BHK Sekretion von rcIL 2 3 33 ng 7 2 23 ng und 4 01 ng rcIL ng relL 09 ng 2 ml Unter diesen Kulturbedingungen wiesen alle BHK Klone einen signifikanten Unterschied zwischen induzierter und uninduzierter rcIL 2 Produktion auf 0 008 p O uninduziert induziert 25 5 jw 6u ul UONENUSZUOY Z 1104 A5 2 A5 3 A5 4 A5 5 A5 6 A5 7 A5 8 A5 9 A5 A5 1 5 der produzierten rcIL 2 Mittelwerte und Standardabweichungen n Grafik 5 Zellen ml x 10 BHK Klone 0 75 verschiedener Konzentrationen Produktionsdauer 72 h 110 oOo a a 5 IL 2
100. attfand Eventuell vorhandene stille Mutationen also an zweiter oder dritter Stelle eines Codons die keinen Einfluss auf die Aminos ure Sequenz und damit auf die Funktion der Proteine haben wurden hierbei in Kauf genommen Zur Dreifachligation von cIL 2 IRES Luciferase und pTRUE Vektor wurden diese Komponenten mit Restriktionsenzymen geschnitten Die Klonierungsstrategie sah vor dass an ihren Enden sogenannte Sticky Ends entstanden Diese einstr ngigen DNA berh nge mit einer L nge von je 4 Basen finden wegen ihrer zueinander komplement ren Sequenzen w hrend der Ligation zueinander Da zu jedem berhang eines Fragmentes der berhang eines anderen Fragmentes komplement r ist sollte sich in der Ligation die gew nschte Reihenfolge ergeben berpr ft wurde auch dieses wieder durch eine Agarosegelelektrophorese nach einem analytischen Restriktionsenzymverdau Von sechs berpr ften pTRUE IL 2 Plasmiden zeigten f nf einen korrekten Einbau der Inserts in den Vektor Eines dieser Plasmide wurde ausgew hlt um in einer transienten Transfektion in BHK Tet on Zellen getestet zu werden Vor der stabilen Transfektion in diese Zellen musste die Funktionalit t des Response Plasmids im Tet on System sichergestellt werden Dazu diente das Screening auf das Reportergen Luciferase in einem induzierten und einem nicht induzierten Ansatz der transient transfizierten Empf ngerzellen Die Messung im Luciferase Assay ergab hier dass durch die Ind
101. aufhin eine Reduktion von zwei entfernten nicht behandelten Metastasen um 90 und 50 Als Nebenwirkungen wurden vor bergehendes Fieber sowie leichter Juckreiz und Erytheme beobachtet Auch die Injektion von reinem IL 2 in den Tumor und das umliegende Gewebe zeigte Erfolg Den Otter et al 1999 Otter et al 1999 Gravierende toxische Nebenwirkungen konnten bei dieser lokal begrenzten IL 2 Applikation nicht festgestellt werden Eine Kombinationstherapie mit humanem Tumor Nekrose Faktor hTNF und hIL 2 wobei hTNF intraven s und hIL 2 subkutan appliziert wurden f hrten Moore et al 1991 an 30 Hunden mit Tumoren unterschiedlicher Histogenese durch Bei den auftretenden Nebenwirkungen handelte es sich haupts chlich um Fieber Erbrechen und Diarrhoe was die Autoren aufgrund des Therapie Aufbaus der TNF Wirkung zuschrieben In dieser Patienten Gruppe wurde n mlich bei gleichbleibend geringen hIL 2 Dosen hTNF in ansteigender oder gleichbleibend hoher Konzentration oberhalb der maximal tolerierten Dosis verabreicht Die IL 2 assoziierten Nebenwirkungen Erbrechen Diarrhoe und leichte Apathie zeigten sich in geringerem Ma e Von 13 Hunden mit oralen Melanomen zeigten f nf eine Tumorregression Bei einem dieser Hunde trat eine komplette Remission des Tumors auf wobei dieser Hund auch nach drei Jahren kein Rezidiv aufwies Ein weiterer Hund zeigte eine Verkleinerung des Prim rtumors sowie einer Lymphknotenmetastase 75 der Hunde mit Plattenepi
102. bar Der SI lag in diesem Ansatz sogar um das Zwanzigfache ber dem von Wagner 1998 ermittelten SI von 7 75 120 Diskussion Um eine cDNA f r cIL 2 zu erzeugen wurde mit der aus der stimulierten Makrokultur isolierten mRNA eine RT PCR nach den Angaben von Dunham et al 1995 durchgef hrt Zun chst wurde der Erfolg dieser RT PCR auf einem Agarose Gel berpr ft Die dabei ersichtliche Bande entsprach der erwarteten und von Dunham et al 1995 angegebenen Gr e von etwa 650 bp Diese Tatsache sowie die korrekte Bande des ebenfalls in der RT PCR amplifizierten House Keeping Gens GAPDH wiesen auf einen korrekten Ablauf der RT PCR hin Die daraufhin durchgef hrte Sequenzierung des RT PCR Produktes zeigte eine hundertprozentige bereinstimmung mit der von Dunham et al 1995 ermittlten Sequenz Auch die nach der Einklonierung des RT PCR Produktes in den pCR II TOPO Vektor erneut durchgef hrte Sequenzierung ergab keine Abweichung von der Original Sequenz Damit war die Voraussetzung f r die erfolgreiche Produktion eines korrekten und biologisch aktiven cIL 2 Proteins nach Transfektion in eine Zelllinie gegeben F r die Tet on Expression musste ein Response Plasmid mit der cIL 2 Sequenz sowie einem IRES Luciferase Konstrukt hergestellt werden Dies geschah durch eine Dreifach Ligation von cIL 2 Fragment IRES Luciferase Konstrukt und dem Vektor pTRUE Schema 4 Seite 47 Dazu wurden in einer PCR mit speziellen Primern Schnittstell
103. berhard Burkhardt Herstellung von kaninem Interleukin 2 cIL 2 nach stabiler Transfektion der mesenchymalen BHK Zelllinie mit Hilfe des Tet on Expressionssystems zur Erzeugung von Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK f r eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund Inaugural Dissertation zur Erlangung des Grades eines Dr med vet beim Fachbereich Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Giessen eingereicht von Sandra Sara Preis Tier rztin aus Zweibr cken Giessen 2008 Mit Genehmigung des Fachbereiches Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Giessen Dekan Prof Dr Dr habil G Baljer Gutachter Prof Dr E Burkhardt Prof Dr J Roth Tag der Disputation 12 November 2008 Diese Arbeit entstand im Rahmen des Graduiertenkollegs 455 Molekulare Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Giessen und wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG gef rdert Ich erkl re Ich habe vorgelegte Dissertation selbst ndig und ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt die ich in der Dissertation angegeben habe Alle Textstellen die w rtlich oder sinngem aus ver ffentlichten oder nicht ver ffentlichten Schriften entnommen sind und alle Angaben die auf m ndlichen Ausk nften beruhen sind als solche kenntlich gemacht Bei den von mir durchgef hrten und in der Dissertation erw hnten Untersuchungen habe ich die Grunds tze guter wissenschaf
104. bgebaut und eliminiert Die nachfolgende PCR erfolgte mit den Primern die f r das cIL 2 Insert spezifisch sind siehe 3 2 1 1 Tabelle 6 Zur Kontrolle wurde ein PCR Ansatz angefertigt bei dem kein vorgeschalteter RT Schritt erfolgte Dadurch war auch keine cDNA im Ansatz zu erwarten die im nachfolgenden PCR Schritt h tte amplifiziert werden k nnen 3 3 1 Vorbereitung und Induktion der transfizierten BHK Zellen Zwei transfizierte Klone der BHK Zellen wurden wie unter 3 2 7 5 beschrieben in eine 6 Well Platte ausges t und nach 24 h mit 5 ul Doxyzyklin induziert Bei diesen beiden Klonen handelte es sich zum einen um eine Linie mit einem hohen absoluten Luciferase Wert A5 und zum anderen um eine Linie mit hohem Stimulationsindex A1 Als Negativ Kontrolle diente eine Kultur nativer nicht transfizierter BHK Zellen BHK 62 Material und Methoden Die Isolate der drei Kulturen wurden w hrend der folgenden Arbeitsschritte gleichartig behandelt 3 3 2 RNA Pr paration und Konzentrationsbestimmung Die Isolierung der RNA aus den BHK Zellen erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH Hilden nach Angaben des Herstellers Jede ausges te Kultur der 6 Well Platte wurde gleichartig behandelt Zun chst wurde der Zellmonolayer mit 2 ml PBS gewaschen Zu 594 ul des RLT Puffers wurden 6 ul B Mercaptoethanol Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen zugegeben und diese 600 ul Puffergemisch auf den Zellrasen verteilt Durch mehrfach
105. bnisse auch eine teilweise Automatisierung des RBA erm glicht werden Schmitz 2000 blicherweise betr gt die Inkubationsdauer beim radioaktiven CRA der zur Messung der Zytotoxizit t von NK Zellen des Menschen als Standardmethode verwendet wird nur vier Stunden F r den Hund wurde ermittelt dass nach dieser kurzen Inkubationsdauer noch keine deutliche Zytotoxizit t gegen ber den Zielzellen CTAC gemessen werden kann Helfand et al 1994 Gondolf et al 1996 und Schmitz 2000 verwendeten eine Inkubationsdauer von 14 Stunden zur Messung der Zytotoxizit t isolierter Blutleukozyten des Hundes da zu diesem Zeitpunkt im RBA die h chsten Werte gemessen wurden Material und Methoden 27 3 MATERIAL UND METHODEN Rezepte zu nicht speziell erl uterten L sungen und Puffern sind in Kapitel 9 5 Seite 187 im Anhang aufgef hrt 31 Gewinnung der IL 2 Sequenz 3 1 1 Blutentnahme und Lymphozytenisolierung mittels einstufiger Percoll Dichtegradientenzentrifugation Zur Gewinnung von Lymphozyten wurde Blut eines weiblichen adulten reinrassigen Beagles aus der Blutspendergruppe der Klinik fiir Kleintiere Abteilung Innere Medizin der Justus Liebig Universit t Giessen verwendet Die H ndin wurde mit kommerziellem Fertigfutter gef ttert und erhielt Wasser ad libitum Zum Zeitpunkt der Blutentnahme war die H ndin klinisch gesund und hatte in den vorausgegangenen drei Wochen kein Blut gespendet Das Tier wurde regelm ig gegen Hepati
106. bung der noch auf dem Plattenboden haftenden Zielzellen durch die Zugabe von 100 ul Rose Bengal L sung 0 25 w v in NaCl PBS Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen je Vertiefung und die Inkubation f r 3 min bei RT Danach wurde der berstand mit gel stem Farbstoff abgesch ttet und die MTP dreimal im Microtiterwasher Titertek Microplate Washer S8 S12 Flow Laboratories Schweiz mit dem Waschprogramm Super gewaschen Schmitz 2000 um den noch vorhandenen freien Farbstoff zu entfernen Bei diesem Programm wurde jede MTP Vertiefung dreimal mit 650 pl NaClI PBS gesp lt und noch vorhandene Fl ssigkeit anschlie end von Hand ausgeklopft Durch die Zugabe von 200 ul Ethanol PBS 50 v v pro Well wurde der Farbstoff aus den noch vorhandenen Zielzellen herausgel st und nach 5 min die optische Dichte dieser L sung im ELISA Photometer Titertek Multiskan Plus Flow Laboratories Schweiz spektrometrisch ermittelt Die Messung erfolgte bei einer Wellenl nge von 570 nm gegen eine Referenzwellenl nge von 630 nm Die Daten wurden unmittelbar nach der Messung mit Hilfe des Computerprogrammes EIA Version 3 10 Stefan Ufer und ICN Biomedicals GmbH Eschwege ausgewertet Eine Vertiefung mit Ethanol PBS ohne Farbstoff und ohne Zellen diente als Leerwert 70 Material und Methoden 3 4 2 4 Berechnung der Zytotoxizit t Die Zytotoxizit t ergab sich aus der Differenz der optischen Dichten OD der Testans tze mit und der Kontrollans t
107. d Auswertung der Lymphozytenanreicherung Dr Klaus Failing und seinen Mitarbeitern f r die Hilfe bei der Auswertung meiner Daten dem Graduiertenkolleg 455 Prof Dr Ernst Petzinger Prof Dr Rolf Bauerfeind und Frau Jana Heber f r die finanzielle F rderung und die Enth llung molekularbiologischer Geheimnisse Dr Robert Kreutzer und Dr Susanne Borst die mich bei meinen ersten Schritten auf meinem langen Weg an die Hand genommen haben Dank auch an meine Vorg nger in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Burkhardt f r die Grundlagen dieser Arbeit und an Vladimir Kocoski f r seine Hilfe und die nette Zusammenarbeit allen Mitarbeitern und Doktoranden am Institut f r Veterin r Pathologie mit denen ich in den letzten Jahren zusammenarbeiten durfte f r die sch ne unvergessliche Zeit Bianca Jens Christl Nina Inka Denis Estelle Manfred und allen anderen ausserhalb des Instituts daf r dass Ihr mich auf andere Gedanken gebracht und immer an mich geglaubt habt und meinen Eltern ohne die ich es nicht geschafft h tte VVB LAUFERSWEILER VERLAG ISBN 3 8359 534b X STAUFENBERGRING 15 D 35396 GIESSEN Tel 0641 5599888 Fax 5599890 redaktion doktorverlag de www doktorverlag de 917838351953468
108. de in den pCR I TOPO Vektor Abbildung 1 von Invitrogen Karlsruhe einkloniert Fiir diese Arbeiten wurde das TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen Karlsruhe verwendet Das Prinzip dieser Klonierung beruht darauf dass die Taq Polymerase Adenin berh nge an die 3 Enden des PCR Produktes anfiigt Der pCR II TOPO Vektor besitzt berh ngende Thymidin Reste an der Klonierungstelle so dass eine Ligation von PCR Fragment und Vektor unabh ngig von Restriktionsschnittstellen durchgef hrt werden kann 36 Material und Methoden lacZa ATG M13 Reverse Primer CAG GAA ACA GCT ATG AOC A GTC CTT TGT CGA TAC TGG u is Ml CA AGC TAT GCA TCA AGC TCG ATA CGT AGT TCG BstX EcoR Nsil si C GAG CAT GCA A TC 3 CTC GTA CGT AG T GA M13 20 Forward Primer Comments for pCR Il TOPO 3973 nucleotides LacZa gene bases 1 589 M13 Reverse priming site bases 205 221 Sp6 promoter bases 239 256 Multiple Cloning Site bases 269 383 T7 promoter bases 406 425 M13 20 Forward priming site bases 433 448 f1 origin bases 590 1027 Kanamycin resistance ORF bases 1361 2155 Ampicillin resistance ORF bases 2173 3033 pUC origin bases 3178 3851 GTG CTG GAA TTC GCC CTT ZAG GG CAC GAC CTT AAG CGG GAS PCR Product TTC CCG Promoter GGT GAC ACT ATA TGA TAT a CCA CTA GTA ACG C A GGT GAT CAT TGC CGG EcoR EcoRV GAA TTC TGC AGA TAT CTT AAG ACG TCT ATA Apa CCC AAT TCG C CCC GGG TTA AGC GGG AT
109. delines J Clin Oncol 7 486 498 Martinez Salas E 1999 Internal ribosome entry site biology and its use in expression vectors Curr Opin Biotechnol 10 458 464 Mercatello A Hadj Aissa A Negrier S Allaouchiche B Coronel B Tognet E Bret M Favrot M Pozet N Moskovtchenko J F et al 1991 Acute renal failure with preserved renal plasma flow induced by cancer immunotherapy Kidney Int 40 309 314 Mitchell D H Withrow S J Johnston M R Kruse C A 1991 Cytotoxicity against autologous allogeneic and xenogeneic tumor targets by human recombinant interleukin 2 activated lymphocytes from healthy dogs and dogs with lung tumors Am J Vet Res 52 1132 1136 Mizel S B Farrar J J 1979 Revised nomenclature for antigen nonspecific T cell proliferation and helper factors Cell Immunol 48 433 436 Mizuno S Fujinaga T Kurosawa T 1996 Changes in lymphokine activated killer activity in peripheral blood lymphocytes from canine transmissible venereal sarcoma models Exp Anim 45 289 292 Moore A S Theilen G H Newell A D Madewell B R Rudolf A R 1991 Preclinical study of sequential tumor necrosis factor and interleukin 2 in the treatment of spontaneous canine neoplasms Cancer Res 51 233 238 Morgan D A Ruscetti F W Gallo R 1976 Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows Science 193 1007 1008 Mosmann T 1983 Rapid colorimetric assay for
110. dung 4 BHK Zellen Paraffinschnitt eines Zellpellets Immunhistologischer Nachweis von Vimentin Peroxidase anti Peroxidase PAP Methode 100 x Diffuse braune Reaktion des Zytoplasmas infolge Bindung des spezifischen Antiserums an das f r mesenchymale Zellen charakteristische Zytoskelett Protein Vimentin Zellen direkt nach dem Ernten aus der Kulturflasche fixiert daher abgerundet und nicht mehr spindelf rmig wie im Monolayer der Abb 2 BHK Zellen Paraffinschnitt eines Zellpellets Inkubation mit spezifischem anti Zytokeratin Antiserum Peroxidase anti Peroxidase PAP Methode 100 x Keine Bindung des spezifischen Antiserums f r diesen Marker epithelialer Zellen Material und Methoden 55 3 2 6 1 Zellkulturarbeiten mit BHK Tet on Zellen zur Vorbereitung der Transfektion Die Zellkulturarbeiten fanden unter einer Sterilwerkbank Holten Laminar Air Flow Safe 2000 Kendro Laboratory Products GmbH Hanau statt Die BHK Tet on Zellen wurden in Zellkulturschalen Falcon Becton Dickinson Heidelberg mit einem Durchmesser von 10 cm bei 37 C und 5 CO im Brutschrank Steri Cult 200 Forma Scientific Inc Marietta USA inkubiert Als Zellkulturmedium diente BFA 34 4 5 g l DMEM Pulver Invitrogen Karlsruhe 200 uM L Alanin 225 uM L Aspartat 933 uM Glycin 510 uM L Glutamat 217 uM L Prolin 184 uM Hypoxantin 0 1 ug l Biotin 44 mM NaHCO dem 10 fetales K lberserum FKS PAA Laboratories GmbH C lbe 100 000
111. durch das Tet on Expressionssystem gesteuert werden Dazu musste die cIL 2 cDNA zusammen mit dem Reportergen Luciferase in das Response Plasmid pTRUE eingebaut werden Dies gelang indem zun chst Schnittstellen f r Restriktionsenzyme flankierend zum kodierenden Bereich in die cIL 2 cDNA eingebaut und durch Restriktionsenzymverdau berh nge mit sogenannten Sticky Ends produziert wurden Die erneute Sequenzierung der cIL 2 Sequenz ergab wiederum eine totale bereinstimmung zur von Dunham et al 1995 publizierten Sequenz Nachdem das Response Plasmid pTRUE und das Luciferase Gen ebenfalls mit Restriktionsenzymen geschnitten und so mit Sticky Ends versehen worden waren erfolgte der Zusammenbau dieser Elemente in einer Dreifachligation zu dem Response Plasmid pTRUE IL 2 130 Zusammenfassung Anschlie end wurde eine transiente Transfektion des Response Plasmids pTRUE IL 2 in BHK Tet on Zellen durchgef hrt und die Aktivit t des Reportergens berpr ft Hierbei konnte nach der Induktion des Tet on Systems mit Doxyzyklin eine um etwa das Tausendfache gesteigerte Aktivit t der Luciferase gemessen werden Nach der stabilen Transfektion von pTRUE IL 2 in BHK Tet on Zellen wurden 12 Klone auf die Expression von Luciferase untersucht 11 davon zeigten eine Induzierbarkeit mit Stimulationsindizes von 2 6 bis 46 8 Bei einer Klon Linie All wurde ein inverses Verhalten festgestellt Sie wies induziert eine geringere Luciferase E
112. e 43c Messwerte zu Tabelle 26 BHK Linie A5 6 Leerwert OD 1 Messung 0 003 0 002 0 002 0 004 0 004 0 003 OD 1 Messune 0 000 0 001 0 001 0 001 0 001 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 003 0 004 0 004 0 005 0 004 0 004 OD 2 Messung 0 000 0 000 0 000 0 001 0 000 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 016 0 015 0 014 0 018 0 019 0 003 OD 1 Messung 0 013 0 012 0 011 0 014 0 015 4 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0015 0 015 0 016 0 016 0 019 0 004 OD 2 Messung 0 011 0 011 0 012 0 012 0 015 leerwertbereinigt BHK Linie A5 7 Leerwert OD 1 Messung 0 003 0 002 0 002 0 007 0 002 0 000 OD 1 Me un 0 003 0 002 0 002 0 007 0 002 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 004 0 005 0 004 0 004 0 003 0 003 OD 2 Messung 0 001 0 002 0 001 0 002 0 000 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 019 0 021 0 027 0 026 0 020 0 000 SD Messing 0 019 0 021 0 027 0 026 0 020 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 024 0 024 0 027 0 028 0 020 0 003 OD 2 Mes n g 0 021 0 021 0 024 0 025 0 017 leerwertbereinigt BHK Linie A5 8 Leerwert OD 1 Messung 0 003 0 004 0 002 0 006 0 003 0 000 OD 1 Messung 0 003 0 004 0 002 0 006 0 003 R leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 004 0 004 0 004 0 003 0 003 0 003 OD 2 Messung 0 001 0 001 0 001 0 000 0 000 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 025 0 019 0 023 0 019 0 019 0 000 OD 1 Messung 0 025 0 019 0 023 0 019 0 019 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messu
113. e Acidolysis die gekoppelte DNA freigesetzt Remy et al 1995 Die BHK Tet on Zellen wurden am Vortag wie unter 3 2 6 1 beschrieben abtrypsiniert und 200 ul der Zellsuspension in 2 ml Kulturmedium entspricht 1 10 in einer 6 Well Platte 56 Material und Methoden Falcon Becton Dickinson Heidelberg ausges t Dadurch wurde f r die Transfektion eine Dichte des Monolayers von etwa 90 erreicht Vor der Transfektion wurden zun chst die Plasmid DNA siehe 3 2 5 3 und die Metafectene Stamml sung auf Raumtemperatur gebracht und vorsichtig gevortext In sterilen Eppendorf Gef en wurden mit serum und antibiotikafreiem Zellkulturmedium folgende L sungen angemischt L sung Al 50 ul Kulturmedium 1 5 ug Plasmid DNA L sung A2 50 ul Kulturmedium L sungB 5 ul Metafectene 100 ul Kulturmedium Die Transfektion erfolgte in folgenden Schritten 1 Jeweils 50 ul der L sung B zu den L sungen Al und A2 Negativkontrolle geben und vorsichtig mischen Zur Bildung des DNA Lipid Komplexes 20 min bei Raumtemperatur inkubieren Beide Ans tze zu den Zellen geben und vorsichtig mischen Inkubation f r 3 him Brutschrank bei 37 C und 5 CO u ee Eh Absaugen des DNA Lipid Komplex haltigen Kulturmediums und Ersetzen durch serum und antibiotikahaltiges Kulturmedium 6 Zugabe von Doxyzyklin Alexis Biochemicals Griinberg Konzentration 2 mg ml im Verh ltnis 1 400 3 2 6 3 Luciferase Assay zur Uberpriifung de
114. e rcIL 2 Mengen der BHK Linie A5 nach 24 48 und 72 h eingesetzte Zellkonzentration 1 5 x 10 Zellen ml Originalmesswerte siehe Tabelle 46 24h x s OD 0 003 0 003 0 004 0 003 0 002 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 313 0 304 0 378 0 239 0 174 0 282 0 078 OD 0 057 0 062 0 073 0 074 0 082 induziert rcIL 2 Konzentration 15 847 17 648 21 887 22 255 25 076 20 543 3 732 48 h X s OD 0 004 0 003 0 008 0 004 0 004 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 378 0 239 1 170 0 378 0 378 0 509 0 374 OD 0 086 0 128 0 127 0 128 0 112 induziert rcIL 2 Konzentration 26 786 43 013 42 430 43 013 36 603 38 369 7 016 72h X s OD 0 002 0 001 0 002 0 003 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 120 0 067 0 186 0 304 0 239 0 183 0 094 OD 0 126 0 163 0 161 0 157 0 154 induziert rcIL 2 Konzentration 42 041 56 557 55 596 54 055 52 896 52 229 5 866 rcIL 2 Konzentration berechnet mit Standardverd nnungsreihe E Tabelle 38 Anhang 157 Tabelle 30 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen der BHK Linie A5 1 nach 24 48 und 72 h eingesetzte Zellkonzentration 1 5 x 10 Zellen ml Originalmesswerte siehe Tabelle 47 24h x s OD 0 003 0 003 0 004 0 003 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 260 0 239 0 394 0 239 0 304 0 287 0 065 OD 0 005 0 005 0 034 0 005 0 005 induziert rcIL 2 Konzentration 0 614 0 533 9 137 0 533 0 614 2 287 3 830 48h x s OD 0 003 0 003 0 004 0 004 0 005 un
115. ellten Effektorzellsuspension wurden je 100 ul zu den Zielzellen pipettiert Als Negativkontrolle dienten Zielzellkulturen denen keine Effektorzellen zugegeben wurde Diese Ans tze erfolgten zum einen in sterilem RPMI FKS Zus tzlich wurde der gleiche Testansatz in von BHK Zellen f r 24 h konditioniertem RPMI FKS siehe 3 4 1 2 2 durchgef hrt Dazu wurde vor der Zugabe der Effektorzellen das Kulturmedium der CTAC Zellen abgesaugt und durch 100 ul des vorbereiteten BHK Kultur berstandes siehe 3 4 1 2 2 ersetzt Weiterhin wurden die unter 3 4 1 2 3 vorbehandelten Effektorzellen eingesetzt Nach ihrer 12stiindigen Inkubation wurden sie zun chst mit RPMVFKS gewaschen und anschlie end wieder in der gleichen Menge frischem RPMI FKS resuspendiert Auf eine Zellz hlung und Material und Methoden 69 die Einstellung auf 1 x 10 Zellen ml wurde verzichtete da die absolute Zellzahl bereits bei lediglich etwa 0 5 x 10 Zellen lag und keine weiteren Zellverluste stattfinden sollten Je nach Effektorzellzahl erfolgten die unterschiedlichen Ans tze im Vierfach F nffach Sechsfach oder Neunfachansatz 34 2 3 Rose Bengal F rbung Nach 14stiindiger Inkubation der Mikrotiterplatten im Brutschrank bei 37 C und 5 CO2 wurden Medium Effektorzellen und abgel ste Zielzellen mit einer Mehrkanalpipette nach f nfmaligem vorsichten Mischen abpipettiert wobei darauf geachtet wurde den Boden nicht zu ber hren Anschlie end erfolgte die F r
116. en Schritt wurde ein 50 ul Ansatz bestehend aus 39 ul Mastermix Tabelle 4 10 ul RT Produkt und 1 ul Primergemisch je 0 5 ul des Vorw rts und des R ckw rtsprimers Konzentration der Primerstamml sung je 20 pmol ul hergestellt 34 Material und Methoden Tabelle 4 Zusamensetzung des PCR Mastermixes MgCl 25 mM 2 ul 10X PCR Puffer KCI Tris HCl 4 ul Ampli Taq Polymerase 5 U l 0 25 ul depc Aqua bidest 32 75 ul Nach einer anf nglichen Inkubation der PCR Ans tze fiir 5 min bei 94 C Denaturierung der DNA RNA Heteroduplexe folgten 30 Zyklen der folgenden Schritte min bei 94 C Denaturierung min bei 50 C Primeranlagerung min bei 72 C Elongation der angelagerten Primer durch die Taq Polymerase Zum Abschluss wurde eine weitere Elongationsphase von 1 min bei 75 C angeschlossen Die Reaktionsans ze wurden daraufhin auf 4 C abgek hlt 3 1 5 5 Agarose Gelelektrophorese Die Auswertung und Dokumentation der RT PCR erfolgte durch die Elektrophorese der DNA Amplifikate in einem horizontalen 1 igen Agarose Gel Dazu wurde zun chst 1 g Agarose Agarose 1000 Invitrogen Karlsruhe durch Aufkochen in der Mikrowelle vollst ndig in 100 ml TBE Puffer aufgel st und mit 1 ul Ethidiumbromid Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe versetzt Das Gel wurde blasenfrei gegossen und nach Erstarren verwendet 15 ul des PCR Produktes wurden mit 3 ul Probenpuffer Typ II Sample Loading B
117. en in die cIL 2 Sequenz eingebaut die au erhalb der kodierenden Bereiche lagen Das IRES Luciferase Konstrukt konnte ebenfalls in einer PCR aus dem Vektor pCITE Luci amplifiziert werden Beide PCR Produkte wurden in den Vektor pGEM T einkloniert um sie durch Transformation in E coli Bakterien in ausreichender Menge vermehren zu k nnen Jeder Schritt wurde durch eine Agarosegelelektrophorese und falls angebracht einen vorgeschalteten Restriktionsenzymverdau kontrolliert Nach der pGEM T Klonierung wurden je Plasmid 6 Kolonien auf den korrekten Einbau der Inserts in den Vektor berpr ft um eine Kolonie mit korrekt eingebautem Fragment ausw hlen zu k nnen Einige der Kolonien wiesen kein einkloniertes Insert auf da eine Religation des Vektors mit sich selbst m glich ist Da das cIL 2 Insert vor der Klonierung in einer PCR vervielf ltigt wurde musste auch hier wieder die cIL 2 Sequenz berpr ft werden um so Schreibfehler der DNA Polymerase ausschlie en zu k nnen Wiederum ergab sich hierbei eine komplette bereinstimmung zur Original Sequenz In den flankierenden nicht kodierenden Bereichen zeigten sich zwar Differenzen diese waren jedoch auf Vektor oder Primersequenzen zur ckzuf hren und damit f r die entscheidende kodierende Sequenz bedeutungslos Diskussion 121 Auf die Sequenzierung des IRES Luciferase Konstruktes wurde verzichtet da sp ter in der transienten Transfektion eine funktionelle berpr fung des Enzyms st
118. en verschiedener BHK Linien in ng ml eingesetzte Zellkonzentration 0 75 x 10 Zellen ml Dauer der rcIL 2 Produktion 72 h Originalmesswerte siehe Tabelle 43a d A5 5 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 002 0 002 0 000 0 001 0 001 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 000 0 000 0 000 0 000 0 000 0 000 0 000 OD 0 005 0 007 0 007 0 008 0 006 induziert rcIL 2 Konzentration 3 579 4 246 4 246 4 358 4 001 4 086 0 312 A5 6 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 001 0 001 0 001 0 001 0 001 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 000 0 000 0 000 2 030 2 030 0 812 1 112 OD 0 012 0 012 0 012 0 014 0 016 induziert rcIL 2 Konzentration 5 233 5 149 5 149 5 480 5 797 5 362 0 279 A5 7 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 002 0 002 0 002 0 004 0 001 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 551 2 636 2 333 3 138 1 318 2 395 0 671 OD 0 020 0 021 0 026 0 026 0 019 induziert rcIL 2 Konzentration 6 426 6 557 7 105 7 107 6 222 6 684 0 404 A5 8 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 002 0 003 0 002 0 003 0 002 uninduziert rcIL 2 Konzentration 2 551 2 729 2 333 2 001 1 536 2 300 0 474 OD 0 023 0 018 0 023 0 018 0 018 induziert rcIL 2 Konzentration 6 738 6 083 6 746 6 156 6 083 6 361 0 349
119. ender Zusammensetzung mit serum und antibiotikafreiem Kulturmedium in sterilen Eppendorf Gef en angemischt Material und Methoden 59 e L sung A 2 5 ug pTRUE IL 2 IRES AF sspI 0 2 ug pCEF PAC AHindill 100 ul Kulturmedium e L sungB 10 ul Metafectene 100 ul Kulturmedium Die Transfektion erfolgte wie unter 3 2 6 2 beschrieben wobei jedoch der letzte Schritt die Zugabe von Doxyzyklin entfiel 3 2 7 4 Klonierung der transfizierten Zellen Um erfolgreich transfizierte Zellen zu vereinzeln wurde 48 h nach der Transfektion das Kulturmedium abgenommen und der Zellmonolayer mit PBS gewaschen Nachdem mit 0 5 ml Trypsin die Zellen abgel st wurden erfolgte die Aufnahme der Zellen in 10 ml serum und antibiotikahaltigem Zellkulturmedium siehe 3 2 6 1 dem zus tzlich die Selektionsantibiotika G418 50 mg ml Calbiochem Darmstadt und PAC 2 mg ml Alexis Biochemicals Gr nberg jeweils in einer Konzentration von 1 400 zugesetzt wurden Selektionskulturmedium Von dieser Suspension wurden je 1y 1000 face F509 und oo in einer neuen Zellkulturschale mit 10 cm Durchmesser in 10 ml Selektionsmedium inkubiert Nach einer Wachstumsphase von etwa drei Wochen konnten einzelne Kolonien aus den Schalen isoliert werden Dazu wurde zun chst die kolonientragende Zellkulturschale mit 10 ml PBS gewaschen AnschlieBend wurden 5 ml PBS auf die Platte gegeben und diese zum Picken der Kolonien leicht schr g gehalten sodass etwa die H
120. er Verwendung dieses 57 5 igen Percoll Gradienten war eine geringere Verunreinigungen mit Granulozyten und Monozyten vorhanden Die Ergebnisse von Gondolf 1994 zeigten in dieser Gradientenstufe einen Anteil an neutrophilen Granulozyten von lediglich 5 4 w hrend eosinophile Granulozyten mit 1 4 und Monozyten mit 6 2 im Isolat vorhanden waren Diese Zellpopulationen k nnen sich negativ auf die Stimulation von Lymphozyten auswirken unter anderem aufgrund ihrer starken Abgabe an sauren Stoffwechselprodukten die zur schnellen Ans uerung des Diskussion 119 Zellkulturmediums f hren sowie der kurzen Lebensdauer von Granulozyten unter Kulturbedingungen und der damit verbunden Freisetzung von Enzymen und toxischen Zerfallsprodukten Kristensen et al 1982 Die hier durchgef hrte Lymphozytenisolierung ergab eine absolute Zellzahl von 4 51 x 10 Zellen ml mit einem hohen Anteil an Lymphozyten von 92 5 Neutrophile Granulozyten eosinophile Granulozyten und Monozyten waren nur zu 0 6 4 7 beziehungsweise 1 7 vorhanden Damit lag die Zahl der isolierten Zellen zwar unter den von Gondolf 1994 angegebenen Werten die Reinheit der Lymphozyten war jedoch deutlich h her Dies kann darin begr ndet liegen dass zwischen einzelnen Spenderhunden zum Teil deutliche Unterschiede in Bezug auf Zellausbeute und Lymphozytenreinheit auftraten Ein weiterer Grund f r die im Vergleich zu Gondolf 1994 erzielten unterschiedlichen Ergebnisse der
121. eren Dafiir wurden die fiir das cIL 2 Fragment spezifischen Primer eingesetzt Tabelle 6 Kapitel 3 2 1 1 Getestet wurden die Klone Al und A5 nach der Induktion des Tet on Systems mit Doxyzyklin nach 24 h Aus diesen sowie aus den nativen nicht transfizierten BHK Zellen wurde die Gesamt RNA isoliert wobei zun chst folgende RNA Mengen gewonnen wurden BHK nativ 612 ng ul KlonAl 1184 ng ul Klon A5 876 ng ul Um eventuell vorhandene DNA aus dem RNA Isolat zu entfernen wurde im Anschluss eine DNase Behandlung durchgef hrt Nach einer erneuten Phenol Chloroform Aufreinigung erfolgte eine weitere Bestimmung der RNA Menge mit folgenden Werten BHK nativ 616 ng ul Klon Al 892 ng ul Klon A5 936 ng ul Diese RNA Isolate wurden daraufhin in der RT PCR eingesetzt Zur Kontrolle wurden die gleichen Isolate in einer PCR ohne RT Schritt eingesetzt Sollten sich in diesen Ans tzen Banden bei 0 5 kbp zeigen w re DNA amplifiziert worden und die DNase Behandlung nicht effizient gewesen Ergebnisse 103 Das Ergebnis der RT PCR wurde in einer Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht Abbildung 20 wobei eine Bande mit der cDNA f r cIL 2 bei etwa 0 5 kbp erwartet wurde Diese Bande trat wie erwartet bei den mit Doxyzyklin induzierten Ans tzen von Klon Al Bahn 4 und Klon A5 Bahn 6 auf wobei die cIL 2 Bande von Klon A5 deutlich st rker ist 3 kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp p u m en a
122. erilen konischen 15 ml Glaszentrifugenrohrchen vorsichtig auf jeweils 3 ml der Percoll Gradientenl sung geschichtet Alle L sungen wurden bei Raumtemperatur verwendet Die Zentrifugation der R hrchen erfolgte bei 800 x g und 15 C f r 25 min Hettich Rotanda K K hlzentrifuge Hettich Tuttlingen Nach dem Zentrifugieren waren die Lymphozyten sowie einige wenige Granulozyten und Monozyten als 1 2 mm breite deutliche wei e tr be Bande erkennbar Die Erythrozyten hatten sich als Zellpellet am Boden des Reagenzglases abgesetzt der berwiegende Anteil der Granulozyten befand sich als wei e Wolke dar ber Die Zellbande wurde mittels einer Pasteurpipette abgesaugt und zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen 400 x g 4 C 5 min Danach wurde das Zellpellet in 3 ml RPMI 1640 1 hitzeinaktiviertes Fetales K lberserum FKS PAA Laboratories GmbH C lbe resuspendiert 3 1 2 Mitogen Stimulation der Lymphozyten 200 ul der Lymphozytensuspension wurden zun chst mit 400 ul einer 0 36 igen Trypanblaul sung Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe gemischt Die Gesamtzellzahl und der Prozentsatz der lebenden nicht angef rbten Zellen sowie der toten diffus blau gef rbten Zellen wurden in einer Modifizierten Neubauer Z hlkammer bestimmt Die Differenzierung der isolierten Leukozyten wurde in 200 ul der Lymphozytensuspension im Advia 120 Hematology System Bayer Diagnostics M nchen durchflu zytometrisch durchgef hrt Die aus dem Heparinblut
123. ert OD 1 Messung 0 001 0 001 0 003 0 003 0 003 0 003 OD Te Messung 0 002 0 002 0 000 0 000 0 000 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 003 0 003 0 005 0 004 0 005 0 004 OD 2 Messung 0 001 0 001 0 001 0 000 0 001 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 042 0 047 0 051 0 047 0 018 0 003 OD t Mess ng 0 039 0 044 0 048 0 044 0 015 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 038 0 049 0 048 0 045 0 020 0 004 OD 2 Messung 0 034 0 045 0 044 0 041 0 018 leerwertbereinigt BHK Linie A5 4 Leerwert OD 1 Messung 0 006 0 003 0 001 0 010 0 003 0 000 ODE Messung 0 006 0 003 0 001 0 010 0 003 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 007 0 007 0 007 0 005 0 005 0 003 OD Messung 0 004 0 004 0 004 0 002 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 051 0 047 0083 0 050 0 039 0 000 OD T Messung 0 051 0 047 0 043 0 050 0 039 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 053 0 048 0 043 0 040 0 041 0 003 OD 2 Messung 0 050 0 045 0 040 0 037 0 038 leerwertbereinigt BHK Linie A5 5 Leerwert OD 1 Messung 0 002 0 001 0 003 0 003 0 002 0 003 ODE Messung 0 001 0 002 0 000 0 000 0 001 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 001 0 002 0 004 0 003 0 004 0 004 OD Messung 0 003 0 002 0 000 0 001 0 000 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 008 0 010 0 010 0 011 0 009 0 003 OD Te Messing 0 005 0 007 0 007 0 008 0 006 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 008 0 011 0 011 0011 0 010 0 004 OD 2 Messung 0 004 0 007 0 007 0 007 0 006 leerwertbereinigt 172 Anhang Tabell
124. ertbereinigt OD 1 Messung 0 000 0 001 0 004 0 000 0 001 0 001 OD 1 Mess ng 0 001 0 002 0 003 0 001 0 000 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 006 0 004 0 005 0 005 0 005 0 000 OD Messing 0 006 0 004 0 005 0 005 0 005 leerwertbereinigt 48h Leerwert OD 1 Messung 0 018 0 007 0 013 0 030 0 025 0 001 ie 0 017 0 006 0 012 0 029 0 024 s g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 019 0 010 0 014 0 045 0 022 0 000 OD 2 Mes n g 0 019 0 010 0 014 0 045 0 022 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 006 0 006 0 005 0 002 0 005 0 001 ODl Messuns 0 005 0 005 0 004 0 001 0 004 5 p leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 010 0 011 0 008 0 007 0 010 0 000 OD 2 Messung 0 010 0 011 0 008 0 007 0 010 leerwertbereinigt 72h Leerwert OD 1 Messung 0 056 0 092 0 061 0 068 0 070 0 001 OD 1 Messing 0 055 0 091 0 060 0 067 0 069 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 057 0 073 0 063 0 069 0 065 0 000 OD Mess ng 0 057 0 073 0 063 0 069 0 065 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 020 0 022 0 021 0 023 0 018 0 001 OD 1 Mess ng 0 019 0 021 0 020 0 022 0 017 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 018 0 022 0 019 0 021 0 019 0 000 OD 2 Messung 0 018 0 022 0 019 0 021 0 019 leerwertbereinigt Anhang 179 Tabelle 49 Messwerte zu Tabelle 32 Medium Medium Des Phase 1 Phase 2 OD 1 Messung 0 003 0 003 0 002 0 003 0 001 0 000 ODT Messung 0 003 0 003 0 002 0 003 0 001 leerwertbereinig
125. es Auf und Abpipettieren wurden die Zellen lysiert und das Lysat anschlie end auf eine QIAshredder S ule Qiagen GmbH Hilden gegeben die in ein 2 ml Reaktionsgef platziert wurde Nach einer Zentrifugation bei 13 000 x g f r 2 min wurden dem Durchfluss 600 ul 70 iges Ethanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe zugegeben und durch Pipettieren gr ndlich vermischt Daraufhin wurde die Probe in zwei Portionen zu 700 ul und 500 ul auf eine RNeasy S ule Qiagen GmbH Hilden gegeben und jeweils bei 10 000 x g f r 15 s zentrifugiert Der Durchfluss wurde verworfen Nach der Zugabe von 700 ul RW 1 Puffer wurde die S ule bei 10 000 x g f r 15 s zentrifugiert und der Durchfluss wiederum verworfen Anschlie end wurden 500 ul des RPE Puffers Konzentrat vorher mit dem vierfachen Volumen Ethanol abs Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe mischen aufpipettiert und die S ule erneut bei 10 000 x g f r 15 s gewaschen Der dritte Waschschritt erfolgte erneut mit 500 ul RPE und einer Zentrifugation bei 13 000 x g f r 2 min Die S ule wurde nun in ein frisches steriles RNase freies Reaktionsgef berf hrt Zur Elution der an die S ulenmembran gebundenen RNA wurden 30 ul RNase freies ddH gt O zugegeben und die S ule f r 60 s bei 10 000 x g zentrifugiert Da m glichst viel RNA gewonnen werden sollte wurde der letzte Schritt wiederholt Um den RNA Gehalt der L sungen zu bestimmen wurde die UV Licht Absorption der verd nnten L sung in Quarzgla
126. es Kontrollansatzes 0 304 n 9 Vergleichend dazu wurden in einem weiteren Testansatz Effektor und Zielzellen zusammen im berstand von BHK Zellen inkubiert Nach der Inkubation war hier eine praktisch gleich hohe spontane Zytotoxizit t von 54 Grafik 2 Tabelle 23 nachweisbar mittlere optische Dichte des Testansatzes 0 101 n 4 mittlere optische Dichte des Kontrollansatzes 0 219 n 9 0 300 7 J D Effektorzellen und Zielzellen Kontrollansatz ohne Effektorzellen N Optische Dichte oO D oO oO 0 050 4 Se in frischem RPMI in BHK Uberstand Grafik 2 Einfluss von nativen BHK berst nden und frischem RPMI auf die spontane Zytotoxizit t von Effektorzellen gegen CTAC im RBA Ergebnisse 105 Weiterhin wurden die Effektorzellen zun chst f r 12 Stunden entweder in BHK Kultur berst nden oder in sterilem RPMI FKS vorinkubiert um den Einflu des BHK Kultur berstandes auf die Zytotoxizit t der Effektorzellen zu ermitteln Danach zeigten die Effektorzellen aus der Vorinkubation in RPMI FKS eine spontane Zytotoxizit t von 10 mittlere optische Dichte des Testansatzes 0 274 n 5 mittlere optische Dichte des Kontrollansatzes 0 304 n 9 w hrend bei den Effektorzellen die 12 h in BHK berst nden vorinkubiert wurden keine spontane Zytotoxizit t nachweisbar war mittlere optische Dichte des Testansatzes 0 264 n 6 mittlere optische Dichte des Kontrollansatzes 0 219 n 9
127. es Waschen des RNA Pellets mit 1 ml 75 igem Ethanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe sorgf ltig mischen und bei 7 500 x g f r 15 min zentrifugieren 8 Verwerfen des Ethanol berstandes und Trocknen des RNA Pellets bei ge ffnetem Eppendorfgef 9 Resuspendieren des RNA Pellets in 50 ul RNase freiem Wasser Alle Arbeitsschritte wurden zum Schutz vor RNasen mit ungepuderten Latexhandschuhen durchgef hrt Die RNA Konzentation wurde anschlie end im Photometer Gene Quant II DNA RNA Calculator Pharmacia Biotech GmbH Freiburg photometrisch bei einer Wellenl nge von 260 nm ermittelt und daraufhin eine Konzentration von 100 ng RNA ul mit RNase freiem Wasser eingestellt 3 1 5 RT PCR Alle Schritte wurden soweit nicht anders erw hnt im Eisbad durchgef hrt 3 1 5 1 DNase Behandlung Aufgrund der zu erwartenden DNA Kontamination musste der RT PCR eine DNase Behandlung RNase free DNase Set Qiagen Hilden vorausgehen Diese sowie die RT Reaktion und die PCR wurden in 0 5 ml fassenden RNase freien und autoklavierten PCR Reaktionsgef en durchgef hrt 32 Material und Methoden F r diese Reaktion wurde zun chst ein DNase Mastermix Tabelle 1 von 3 29 ul pro Ansatz hergestellt und mit jeweils 6 5 ul RNA Verd nnung gemischt Tabelle 1 Zusammensetzung des DNase Mastermix MnCl 10 mM lul 10X PCR Puffer KCI Tris HCI lul DNase I 10 U ul lul RNase Inhibitor 35 U ul 0 29 ul Dieser Reaktio
128. eses System basiert auf den regulatorischen Elementen des Tetrazyklin Resistenz Operons von E coli In diesem Operon wird die Transkription des resistenzvermittelnden Gens durch den Tetrazyklinrepressor tefR negativ reguliert Bei Anwesenheit von Tetrazyklin dissoziiert tetR vom Operator der innerhalb der Promotorregion des Operons gelegen ist und erm glicht so die Transkription Die hohe Bindungsaffinit t von tefR an Tetrazyklin oder dessen Derivate und die folgende z gige Abl sung vom Operator erm glichen eine sehr sensitive Steuerung der Expression der resistenzvermittelnden Proteine Berens und Hillen 2003 18 Literatur bersicht 2 7 1 Das Tet off Expressionssystem Um in eukaryotischen Zellen den prokaryotischen Tetrazyklinrepressor fefR als Transaktivator nutzen zu k nnen wurde eine Fusion der Aminos uren 1 207 des terR mit den 127 Aminos uren des C terminalen Endes des Virionprotein 16 des humanen Herpes simplex Virus HSV VP16 durchgef hrt Gossen und Bujard 1992 Dieses Virionprotein ist essentiell f r die Transkription fr her viraler Proteine Dadurch wurde der Transkriptionsrepressor in einen Transkriptionsaktivator umgeformt Minimale Promotoren die mit dem Tetrazyklinoperator tetO fusioniert wurden konnten nun von diesem Hybridtransaktivator stimuliert werden Minimalen Promotoren wie zum Beispiel Pcmvmins fehlen Verst rkersequenzen die sonst zu einer eher unkontrollierten Hintergrundexpression der
129. esten Ergebnisse bez glich Wachstumsverhalten und Proteinproduktion der BHK Zellen Zur Expression von rcIL 2 im Tet on System ist die Transfektion des Regulator und des Response Plasmids n tig Eine BHK Tet on Zelllinie die bereits das Regulator Plasmid stabil in ihrem Genom integriert hat wurde freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Prof Dr Norbert Tautz vom Institut f r Virologie Fachbereich 10 der Justus Liebig Universit t Giessen zur Verf gung gestellt Die Transfektion des Response Plasmids pTRUE IL2 wurde mit dem polykationisches Transfektionsreagenz Metafectene Biontex durchgef hrt 2 8 IL 2 Bioassay Zur quantitativen IL 2 Bestimmung und zum Nachweis der biologischen Aktivit t von IL 2 entwickelten Gillis et al 1978 ein Bioassay Die IL 2 Konzentrationen in Zellkultur berst nden wird dabei mit Hilfe der murinen zytotoxischen T Zelllinie CTLL 2 ermittelt Diese Zellen berleben und proliferieren nur in Anwesenheit von IL 2 Inzwischen wird dieses Bioassay routinem ig zur Bestimmung der IL 2 Menge sowie der biologischen Aktivit t eingesetzt Eine Einheit 1U entspricht dabei der Menge IL 2 die ben tigt wird um 50 des maximalen Wachstums der CTLL 2 Zellen zu erreichen Mosmann und Fong 1989 Auch beim Hund wird diese Technik angewandt da CTLL 2 Zellen sich ebenfalls sensitiv gegen ber kaninem IL 2 erwiesen haben Cerruti Sola et al 1984 Krakowka et al 1987 Helfand et al 1992 Wagner 1998
130. fgenommen und bindet an intrazellul re Proteine Durch Zugabe der Effektorzellen kommt es zur Zerst rung eines Teils der Zielzellen und zur Freisetzung des Cr in den Uberstand Die Radioaktivit t des Uberstandes wird dann in einem Szintillationsz hler gemessen Der Vergleich zwischen CRA und RBA erbrachte bei gleicher Inkubationsdauer im RBA konstant um etwa 10 h here Werte als im CRA Diese Ergebnisse legten den Schlu nahe dass mit dem RBA nicht nur nekrotische sondern auch apoptotische Zielzellen erfasst werden Schmitz 2000 Bei der Apoptose l sen sich zwar die Zielzellen von der Unterlage ab ihre Zellmembran bleibt jedoch zun chst intakt Somit kann mit Hilfe des RBA zus tzlich zur Nekrose auch die Apoptose der Zielzellen gemessen werden Dagegen erfasst der CRA apoptotische Zellen nicht da bei dieser Methode eine Membransch digung der Zielzellen die Voraussetzung f r die Freisetzung von gt IChrom in den Uberstand ist Urspr nglich wurden im RBA die Waschschritte die nach der Zugabe des Farbstoffs Rose Bengal erfolgen mussten von Hand durchgef hrt Gondolf 1994 Hierbei wurde der Farbstoff h ufig nicht vollst ndig entfernt wodurch Schwankungen der optischen Dichte zwischen den Vertiefungen der 96 Loch Flachbodenplatte zu beobachten waren und 26 Literatur bersicht inkonstante Messergebnisse erzielt wurden Durch den Einsatz eines Microplate Washers konnte jedoch neben einer h heren Konstanz der Untersuchungserge
131. g der optischen Dichte OD wurde spektrophotometrisch in einem ELISA Photometer Titertek Multiskan Plus Flow Laboratories Schweiz bei einer Wellenl nge von 570 nm durchgef hrt Die Auswertung der Daten ber arithmetische Mittelwerte und SI 30 Material und Methoden erfolgte unmittelbar nach der Messung mit Hilfe des Computerprogrammes EIA Version 3 10 Stefan Ufer und ICN Biomedicals GmbH Eschwege Als Referenzwellenl nge zur Korrektur des unspezifischen Hintergrundes wurde eine Wellenl nge von 630 nm gew hlt Der MTT Test wurde in Anlehnung an das Protokoll von Mosmann 1983 durchgef hrt Zur besseren L sung der gebildeten Formazankristalle im Medium wurde jedoch statt Isopropanol HCl Dimethylsulfoxid DMSO HCl eingesetzt 1 Herstellung der MTT Gebrauchsl sung durch L sen von 5 mg MTT in 1 ml PBS 2 Inkubation von 20 ul MTT Gebrauchsl sung je Vertiefung f r 4 h bei 37 C und 5 CO2 3 Zentrifugation der MTP bei 1000 x g 20 C f r 5 min Vorsichtiges Absaugen des berstandes mittels einer Eppendorfpipette um die auf den Platten befindlichen Formazankristalle nicht wieder aufzuwirbeln 4 Zugabe von 200 ul DMSO Gebrauchsl sung Vertiefung 180 ul DMSO 20 ul IN HCl zum L sen der Formazankristalle Inkubation f r 10 15 min bei Raumtemperatur 5 Ermittlung der OD der violetten Farbl sung bei einer Wellenl nge von 570 nm 3 1 4 Gewinnung der mRNA Die Isolierung der Gesamt RNA aus den stimulierten Ly
132. geben wodurch sich je Well eine Konzentration von 5 ug ml einstellte Die Dauer der Sekretion von rcIL 2 in das Kulturmedium richtete sich nach dem Versuchsansatz siehe 3 5 2 Vor der Verwendung im Bioassay wurden die berst nde zun chst bei 15000 x g f r 5 min zentrifugiert um m glicherweise darin enthaltene Zellen und Zelltr mmer abgestorbener Zellen zu entfernen Anschlie end wurden die berst nde zus tzlich ber einen Spritzenfilter mit einer Porengr e von 0 45 um Rotilabo Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe filtriert Die berst nde wurden entweder sofort in ein Bioassay eingesetzt oder bei 20 C f r maximal 2 Wochen gelagert Unmittelbar vor ihrer Verwendung im Bioassay wurden die berst nde je nach Bedarf mit frischem RPMI FKS im Verh ltnis 1 1 gemischt Dies war n tig da in einigen Versuchsans tzen die Test berst nde bereits f r bis zu 72 h als Zellkulturmedium der transfizierten BHK Zellen dienten und dementsprechend verbraucht waren Da die CTLL 2 Zellen w hrend des Bioassays allerdings weitere 72 h in diesen Testmedien wachsen sollten wurde eine Erg nzung mit frischem Medium notwendig 3 3 1 2 2 Ansatz des Bioassay Als Standard wurde rhIL 2 Roche Diagnostics GmbH Mannheim eingesetzt Ausgehend von 50 ng ml wurden neun verschiedene Standardstufen in einer Zweierverd nnungsreihe durch Verd nnung mit RPMI FKS hergestellt wodurch sich die Konzentrationen von 50 ng ml 25 ng ml 12 5 ng ml 6 25 ng m
133. gebnisse sind in Tabelle 20 dargestellt Tabelle 20 Messwerte des Luciferase Assays der transfizierten BHK Klone Al A5 und A8 sowie der Negativkontrolle BHK Tet on Klon Al A5 AS BHK Tet on induziert 36 715 1 147 100 8 739 119 nicht induziert 1 196 60 027 292 Stimulationsindex 30 7 19 1 29 9 Ergebnisse 101 Von den Klonen Al A5 und A8 wurde weiterhin eine Reklonierung durchgef hrt Je Klon erfolgte eine Isolierung von zwei Reklonen die wiederum in einem Luciferase Assay auf die Anwesenheit des Reportergens berpr ft wurden Tabelle 21 Tabelle 21 Messwerte des Luciferase Assays der Reklone Klon All A1 2 A5 1 A5 2 A8 1 A8 2 induziert 58 429 16725 904040 761 350 5919 29 nicht induziert 1 374 485 67 341 50 356 356 24 Stimulationsindex 42 5 34 5 13 4 15 1 16 6 1 2 Die Ergebnisse zeigen dass es sich bei Reklon A8 2 m glicherweise um eine nicht transfizierte BHK Zelle handelte die isoliert wurde F r weitere Arbeiten wurde der Schwerpunkt auf Klon A5 und seine Reklone gelegt da dieser Klon die absolut h chste Expression des Reportergens aufwiesen Allerdings zeigte dieser Klon auch bereits eine hohe Basisexpression im nicht angeschalteten Zustand 102 Ergebnisse 4 2 7 RT PCR zum Nachweis der cIL 2 mRNA in den transfizierten BHK Zellen Mit der RT PCR sollte berpr ft werden ob die transfizierten Zellen in der Lage sind die mRNA fir cIL 2 zu produzi
134. gew nschten Genprodukte f hren w rden Geringe Tetrazyklinkonzentrationen verhinderten die Bindung des tetrazyklinkontrollierten Transaktivators tTA an tetO und f hrten dadurch zur Stummschaltung der an tetO angeschlossenen Gene siehe Schema 1 Die Menge der produzierten Proteine konnte um den Faktor 10 reguliert werden Gossen und Bujard 1992 Literatur bersicht 19 Tc Tc gt Schema 1 Tet off System Die Zugabe von Tetrazyklin bewirkt die Abl sung des Transaktivators und verhindert damit die Transkription des Gens X Pcmv Promotor des Cytomegalievirus tefR Tetratzyklinrepressor VP16 Virionprotein 16 des humanen Herpes simplex Virus tTA tetrazyklinkontrollierter Transaktivator Te Tetrazyklin tetO Tetrazyklinoperon Pmincmv minimaler Promotor des Cytomegalievirus 20 Literatur bersicht 2 7 2 Das Tet on Expressionssystem Der Nachteil des Tet off Systems liegt in der kontinuierlichen Tetrazyklingabe zur Stummschaltung des gew nschten Gens Obwohl die n tigen Antibiotikumkonzentrationen gering sind und nicht im zytotoxischen Bereich liegen ist f r eine Reihe von Anwendungen dieses Expressionssystems eine permanente Tetrazyklingabe ung nstig zum Beispiel bei Expressionsstudien in vivo an transgenen M usen oder der Gentherapie Zus tzlich sind die kinetischen Eigenschaften eines Systems ung nstiger wenn zun chst der Effektor abgel st werden muss Daher entwickelten Gossen et al 1995 ei
135. gment sichtbar gemacht Abbildung 11 Bahn 3 Weiterhin wurde mit Hilfe institutsspezifischer Primer aus dem von der Arbeitsgruppe von Prof Dr Norbert Tautz zur Verf gung gestellten Plasmid pCITE Luci die Sequenz des IRES Luciferase Konstruktes in einer PCR vervielf ltigt Auf Abbildung 11 ist in Bahn 2 das Ergebnis dieser PCR mit einer Bande bei der erwarteten Gr e von 2 5 kbp zu erkennen 1 2 3 4 5 6 3kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 11 Agarosegelbild nach Einbau der Restriktionsenzym Schnittstellen in cIL 2 und nach Amplifikation des IRES Luciferase Fragmentes Bahn 1 und 6 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 IRES Luciferase Fragment 2 5 kbp Bahn 3 cIL 2 0 5 kbp Bahn 4 und 5 Negativkontrollen Ergebnisse 89 4 2 2 Analyse der cIL 2 und IRES Luciferase Fragmente Nachdem die 0 5 kbp und die 2 5 kbp gro e Bande aus einem anschlie end hergestellten pr parativen Gel ausgeschnitten isoliert und in den Vektor pGEM T Promega Madison USA kloniert worden waren wurden nach der Transfektion der Plasmide pGEM T IL2 und pGEMT T IRES in E coli Bakterien je Plasmid sechs Kolonien isoliert und weiter untersucht Dazu erfolgte ein analytischer Verdau mit Restriktionsenzymen um den korrekten Einbau der PCR Amplifikate in den Vektor zu berpr fen pGEM T IL2 wurde mit KpnI und Mlul pGEMT T IRES mit Mlul und PstI geschnitten Abbildung 12 stellt das Ergebnis des Enzymverdaus dar In den Bahnen 2 bis 7 wurde pGEM T IL2
136. h verschiedene Doxyzyklin Konzentrationen wurden zun chst einer Regressionsanalyse mit dem Programm BMDP6D unterzogen Aufgrund des hier ermittelten nicht linearen Zusammenhangs der eine lineare Regression nicht erm glichte erfolgte ein Gruppenvergleich durch eine einfaktorielle Varianzanalyse mit dem Programm BMDP7D Die Signifikanzen wurden wie folgt benannt p lt 0 001 hoch signifikant 0 001 lt p lt 0 01 signifikant 0 01 lt p lt 0 05 schwach signifikant p gt 0 05 nicht signifikant 80 Ergebnisse 4 ERGEBNISSE 4 1 Gewinnung der cDNA fiir cIL 2 4 1 1 Lymphozytenisolierung und Stimulation Die Auswertung des Differentialblutbildes der Heparinblutprobe der Hiindin im Advia 120 Hematology System Bayer Diagnostics Miinchen ergab einen absoluten Gehalt an Leukozyten von 7 69 x 10 Zellen l Davon waren 66 0 neutrophile Granulozyten 23 1 Lymphozyten 7 8 Monozyten 2 6 eosinophile Granulozyten und 0 6 basophile Granulozyten Nach der Zentrifugation ber einen 57 5 igen Percoll Gradienten wurde das Isolat mit den angereicherten Lymphozyten ebenfalls im Advia 120 Hematology System Bayer Diagnostics M nchen gemessen Dabei ergab sich eine absolute Zahl an Leukozyten von 4 51 x 10 Zellen l wovon 92 5 Lymphozyten waren Weiterhin enthielt das Isolat 0 6 neutrophile Granulozyten 1 7 Monozyten 4 7 eosinophile Granulozyten und 0 6 basophile Granulozyten Die parallel dazu durchgef hrte Ze
137. healthy dogs and 29 dogs with a variety of spontaneous neoplasms Cancer Immunol Immunother 54 87 92 Gallardo H F Tan C Sadelain M 1997 The internal ribosomal entry site of the encephalomyocarditis virus enables reliable coexpression of two transgenes in human primary T lymphocytes Gene Ther 4 1115 1119 Gastl G Finstad C L Guarini A Bosl G Gilboa E Bander N H Gansbacher B 1992 Retroviral vector mediated lymphokine gene transfer into human renal cancer cells Cancer Res 52 6229 6236 Gillis S Ferm M M Ou W Smith K A 1978 T cell growth factor parameters of production and a quantitative microassay for activity J Immunol 120 2027 2032 Literaturverzeichnis 139 Gillis S Mochizuki D Y Conlon P J Hefeneider S H Ramthun C A Gillis A E Frank M B Henney C S Watson J D 1982 Molecular characterization of interleukin 2 Immunol Rev 63 167 209 Gillis S Watson J 1980 Functional activity and biochemical characterization of IL 2 produced by murine tumor cell lines Behring Inst Mitt 67 48 57 Gondolf C 1994 Untersuchungen zur Zytotoxizit t von Natural Killer NK und Lymphokin aktivierten Killer LAK Zellen aus dem peripheren Blut des Hundes Vet Med Diss Justus Liebig Universit t Giessen Gondolf C Burkhardt E Failing K Stitz L 1996 A new colorimetric method for measuring cell mediated cytotoxicity in dogs Vet Immunol Immunopathol 55
138. hnet mit Standardverdiinnungsreihe E Tabelle 38 Anhang 159 Tabelle 32 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen zur berpr fung der rcIL 2 Produktion unter serumfreien Bedingungen mit der BHK Zelllinie A5 Originalmesswerte siehe Tabelle 49 Medium Medium z g Phase 1 Phase 2 OD 0 002 0 002 0 002 0 003 0 002 RPMI FKS RPMI ITS K 2 104 2 104 3 424 3 981 3 651 3 053 0 888 onzentration RPMUFKS eer OD 0 002 0 001 0 000 0 003 0 002 Doxyzyklin A 2 104 1 877 0 000 3 981 3 424 2 277 1 549 Konzentration RPMI OD 0 002 0 002 0 001 0 002 0 002 RPMUEKS Doxyzykli reIL 2 RN 2 104 2 284 1 877 2 104 3 753 2 424 0 757 Konzentration OD 0 001 0 002 0 002 0 002 0 002 RPMI FKS RPMI FKS rcIL 2 1 877 3 424 3 424 3 753 3 424 3 180 0 743 Konzentration RPMI FKS OD 0 007 0 008 0 008 0 007 0 007 D kli RPMI FKS rcIL 2 ORYAN f 5 373 5 604 5 493 5 262 5 262 5 399 0 149 Konzentration RPMI FKS OD 0 015 0 017 0 020 0 019 0 015 RPMUFKS Doxvzukli ek OXYZ AAN 6 766 7 143 7 497 7 359 6 835 7 120 0 319 rcIL 2 Konzentration berechnet mit Standardverd nnungsreihe G Tabelle 40 Konzentration 160 Anhang Tabelle 33 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen zur berpr fung des verschiedener Doxyzyklin Konzentrationen auf die rcIL 2 Produktion der BHK Zelllinie A5 4 Originalmesswerte siehe Tabelle 50 Doxyzyklin x k
139. hozytenisolierung eingesetzt so auch beim Hund Kay et al 1973 beim Haushuhn Burkhardt 1975 beim Schwein Yang et al 1987 beim Schaf Rai el Balhaa et al 1985 beim Rind Cook und Splitter 1988 und beim Pferd Chong et al 1992 Beim Hund wurde jedoch unter der Verwendung von Ficoll Hypaque eine relativ starke Verunreinigung der Lymphozyten mit Granulozyten festgestellt Daemen et al 1984 Einige Arbeitsgruppen f hrten daraufhin weitere Schritte zur Aufreinigung der Lymphozyten durch um phagozytierende bzw anhaftende Zellen zu eliminieren bersicht bei Gondolf 1994 Die Lymphozytenanreicherung ber das Trennmedium Percoll wurde von Gondolf 1994 beim Hund untersucht Percoll setzt sich aus Polyvinylpyrrolidon PVP ummantelten kolloidalen Silikonk gelchen zusammen die einen Durchmesser von 15 30 nm besitzen Durch seine extrem niedrige Osmolalit t lt 20 mOsm l bietet Percoll die M glichkeit Gradienten unterschiedlicher Dichte durch die Verd nnung der Stamml sung spezifische Dichte 1 119 g ml mit Zellkulturmedium oder NaCl PBS herzustellen ohne den osmotischen Druck der L sung stark zu ver ndern Pertoft et al 1979 Gondolf 1994 konnte den h chsten Lymphozytenanteil von 87 bei einem Percoll Anteil von 57 5 und damit bei einer Dichte von 1 072 g ml erzielen Trotzdem zeigen Faktoren wie Alter Greeley et al 1996 Rasse und Geschlecht Faldyna et al 2001 sowie Gesundheits und Ern hr
140. hrens nicht sichtbar gemacht werden kann Daten hier nicht gezeigt Eine graduelle Induzierbarkeit durch unterschiedliche Doxyzyklin Konzentrationen Gossen und Bujard 1992 konnte nicht festgestellt werden W hrend Konzentrationen von 0 1 ug ml und 10 ug ml nur eine schwache Induktion der cIL 2 Produktion hervorriefen zeigten Konzentrationen von 0 5 ug ml 1 ug ml 2 5 ug ml und 5 ug ml eine fast gleich starke Induktion der BHK Zellen was sich grafisch in Form einer Dosis Wirkungskurve darstellte Grafik 11 Die von Gossen und Bujard 1992 erzielte hohe Induzierbarkeit des Tet on Systems konnte in der vorliegenden Arbeit nicht erreicht werden Sie berichteten von einer um das Hunderttausendfache erh hten Produktion der im Tet on System exprimierten Luciferase in humanen HeLa Zellen Li et al 2004 erreichten in einer Knochenmarkszelllinie der Maus eine Produktion von murinem IL 2 von 1300 ng d 1 x 10 Zellen Auch diese hohe Konzentration konnte in der vorliegenden Arbeit nicht erreicht werden Die Ursache hierfiir ist unbekannt M glicherweise verf gen BHK Zellen bez glich der cIL 2 Produktion ber einen weniger effektiven Syntheseapparat als Knochenmarkszellen Eine andere Zelllinie mit 128 Diskussion integriertem Tet on System stand f r die vorliegende Arbeit jedoch leider nicht zur Verf gung Insgesamt traten je nach BHK Klon und Kulturbedingungen relativ deutliche Schwankungen in der produzierten Menge an cIL 2 auf M
141. icisscscscessecesscessisesesavesscdestesaczussivessecedsesdssedbessesseseddaseaseasdsastesceesgnnvedzess 49 3 2 5 2 Dephosphorylierung und Phenol Chloroform Extraktion des linearisierten Vektors pE RUE is csse5 feces sce heategecs cadens tgetd cast a Ea EE suauestbs dgees ES SR E tative sees 51 3 2 5 3 Drieifachligation saisies sts ecahsdiges ine ssesseedpbess Beni aS TE iccseeapeds 51 3 2 6 Transiente Transfektion von pTRUE IL 2 IRES in BHK Tet on Zellen und funktionelle berpr fung des Reportergens Luciferase c cccssssssessesessessesesseesesesceseseeseeseaeescescateseeseaeeseenss 53 3 2 6 1 Zellkulturarbeiten mit BHK Tet on Zellen zur Vorbereitung der Transfektion osin 2a Bun cease cgued EE EEEa RE OEE ERE sages satieiyetaseie 55 3 2 6 2 Transiente Transfektion mit Metafectene uunennssesssssnessnessnennnennnnnnennnennnennnennnnnnennennnennnn 55 3 2 6 3 Luciferase Assay zur berpr fung des Reportergens ennennennnnnneensnensennn 56 3 2 6 4 Luciferase Assay am Luminometer uuesusssessnessnesnnesnnennessennnennnennnnnnnnnnennnennnensonnnennnennnennnn nn 57 3 2 7 Stabile Transfektion von pTRUE IL 2 IRES in BHK Tet on Zellen zur Erzeugung einer IL 2 poduzierenden Zelllinie urss022020u0ssessnessennnennensnennnennnennnennnennen 57 3 2 7 1 Zellkulturarbeiten mit BHK Tet on Zellen zur Vorbereitung der Fransfektion srono iranin iee ara sinn nal Gods uesstevara vocuvepavs apdey 57 32 7 2 Linearisierung und A
142. ie handelt es ich bei der Bio oder Immuntherapie von Tumoren um einen relativ jungen Therapiezweig Die Tumorimmuntherapie bedient sich der verschiedensten k rpereigenen Abwehrmechanismen wie zum Beispiel tumorspezifischer Antik rper Aber auch zwischen dem zellul ren Immunsystem und Tumoren bestehen mannigfaltige spezifische Wechselwirkungen die genutzt werden k nnen Besonders die Nat rlichen Killerzellen NK spielen eine entscheidende Rolle in der Abwehr von Tumoren Helfand et al 1994 Brittenden et al 1996 Sie zeichnen sich dadurch aus dass sie nicht an einen vorausgegangenen prim ren Antigenkontakt mit Tumorzellen gebunden sind Sie k nnen neoplastische Zellen bereits beim ersten Kontakt spontan abt ten Durch Stimulation mit Zytokinen wie Interleukin 2 IL 2 werden NK Zellen und zytotoxische T Zellen zu Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK die sich durch eine h here Proliferationst tigkeit und eine gesteigerte zytotoxische Aktivit t gegen ber Tumorzellen auszeichnen Bei der adoptiven Immuntherapie spielt der Transfer von immunologischen Faktoren die eine antitumorale Aktivit t besitzen bzw direkt oder indirekt antitumorale Effekte vermitteln Rosenberg 1991 die entscheidende Rolle Zu diesen Faktoren z hlen auch verschiedene Immunzellen wie die NK Zellen zytotoxischen T Zellen oder LAK Zellen Zur optimalen in vitro Stimulation der NK Zellen und zytotoxischen T Zellen ist die Zugabe von IL 2 unerl sslich Diese e
143. ierte Plasmid mit dem Transfektionsreagenz Metafectene Biontex Laboratories GmbH Martinsried in BHK Zellen transfiziert und die Aktivit t der Luciferase nach dem Anschalten des Tet on Systems ermittelt Die ermittelte Aktivit t nach Induktion mit Doxyzyklin lag bei dem dimensionslosen Wert 338830 im Vergleich zu 268 bei der Negativ Kontrolle war also um etwa das Tausendfache h her Daraus konnte geschlossen werden dass das einklonierte und im Vorfeld nicht durch Sequenzierung berpr fte IRES Luciferase Fragment zur Transkription eines funktionierenden Enzyms f hrt Ergebnisse 99 4 2 6 Stabile Transfektion von pTRUE IL2 IRES in BHK Tet on Zellen zur Erzeugung einer cIL 2 produzierenden Zelllinie Hierzu wurde zun chst das Plasmid pTRUE IL2 IRES mit dem Restriktionsenzym F spl linearisiert um den stabilen Einbau in das Zellgenom zu erm glichen FspI schneidet den Vektor etwa auf H he der Base 1840 In diesem Bereich befindet sich kein essentieller Genabschnitt Die berpr fung erfolgte wiederum mit einem Agarosegel wobei die erwartete Bande eine Gr e von etwa 6 kbp hatte Abbildung 19 5 kbp 3kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 19 Agarosegel nach der Linearisierung von pTRUE IL2 IRES mit Fspl Bahn 1 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 pTRUE IL2 IRES AF spI Die nach der Phenol Chloroform Aufreinigung gemessene Plasmid DNA Menge lag bei 165 ng ul 100 Ergebnisse Nachdem das linearisierte Plasmid m
144. induziert rcIL 2 Konzentration 0 313 0 239 0 378 0 394 0 547 0 374 0 114 OD 0 010 0 007 0 010 0 006 0 009 induziert rcIL 2 Konzentration 1 480 0 882 1 488 0 713 1 390 1 191 0 366 72h x s OD 0 002 0 002 0 003 0 004 0 003 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 120 0 174 0 313 0 378 0 304 0 258 0 107 OD 0 022 0 025 0 014 0 017 0 012 induziert rcIL 2 Konzentration 4 607 5 464 2 505 3 259 2 046 3 576 1 433 rcIL 2 Konzentration berechnet mit Standardverd nnungsreihe E Tabelle 38 158 Anhang Tabelle 31 Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen der BHK Linie A5 2 nach 24 48 und 72 h eingesetzte Zellkonzentration 1 5 x 10 Zellen ml Originalmesswerte siehe Tabelle 48 24h X s OD 0 006 0 007 0 006 0 006 0 006 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 702 0 882 0 702 0 702 0 702 0 738 0 081 OD 0 003 0 002 0 005 0 003 0 003 induziert rcIL 2 Konzentration 0 395 0 226 0 533 0 307 0 341 0 360 0 114 45h X s OD 0 019 0 009 0 014 0 038 0 024 uninduziert rcIL 2 Konzentration 3 650 1 280 2 386 9 395 5 034 4 349 3 150 OD 0 008 0 009 0 007 0 005 0 008 induziert rcIL 2 Konzentration 1 188 1 297 0 892 0 574 1 100 1 010 0 286 72h x s OD 0 057 0 083 0 062 0 069 0 068 uninduziert rcIL 2 Konzentration 15 847 25 479 17 829 20 211 19 845 19 842 3 603 OD 0 019 0 022 0 020 0 022 0 019 induziert rcIL 2 Konzentration 3 785 4 605 4 055 4 607 3 650 4 141 0 449 rcIL 2 Konzentration berec
145. ionskompetenter E coli K12 DH5a Bakterien erfolgte nach der Methode von Hanahan Hanahan 1983 Hierzu wurden 10 ml LB Medium mit einer einzelnen Kolonie angeimpft und unter Sch tteln bei 37 C ber Nacht inkubiert 1 ml der Bakteriensuspension diente am n chsten Morgen zum Beimpfen von 100 ml LB Medium 20 mM MgSO und 10 mM KCI in LB Medium Die Inkubation unter Sch tteln bei 37 C erfolgte solange bis die optische Dichte OD oo einen Wert von 0 4 bis 0 55 erreichte Die Bakteriensuspension wurde unter gelegentlichem Schwenken etwa 10 min auf Eis abgek hlt und anschlie end bei 3 000 x g und 4 C f r 10 min abzentrifugiert Die Zellen wurden in 30 ml kaltem TfBI 30 mM K Acetat 100 mM RbCl 10 mM CaCl 50 mM MnCl 15 v v Glycerin auf pH 5 8 mit Essigs ure sterilfiltriert Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe oder Merck KGaA Darmstadt resuspendiert und 10 min aus Eis inkubiert Nach erneuter Zentrifugation s o wurde das Pellet in 4 ml TfBIT 10 mM MOPS 75 mM CaCl 10 mM RbCl 15 v v Glycerin auf pH 6 5 mit KOH sterilfiltriert Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe oder Merck KGaA Darmstadt gel st Bei 70 C wurde die Suspension der Bakterien in 50 ul Aliquots gelagert Zur Transformation wurden je 50 ul dieser transformationskompetenten E coli K12 DH5 Bakterien nach ihrem Auftauen auf Eis zu einem der Ligationsans tze aus 3 2 3 1 gegeben Nach einer 20min tigen Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock f r 2 min bei
146. ird Arruda et al 2001 Schuettrumpf et al 2006 sind die Folgen nicht abzusehen Die daraus resultierenden potentiellen Gefahren limitieren den Einsatz von Virusvektoren Die Aerosol Therapie stellt eine weitere M glichkeit der lokal begrenzten Applikation von Zytokinen dar So konnte beispielsweise IL 2 in vernebelter Form als Liposomen erfolgreich sowohl in der Human als auch in der Veterin rmedizin bei Bronchialkarzinomen und Lungenmetastasen von Mamma und Nierenzellkarzinomen eingesetzt werden Huland et al 1992 Huland et al 1994 Zhang und Liu 1994 Khanna et al 1996 Khanna et al 1997 2 1 1 Adoptive Tumorimmuntherapie mit IL 2 und Lymphokin akivierten Killerzellen LAK beim Menschen Die adoptive Tumorimmuntherapie wird definiert als Transfer immunologisch aktiver Faktoren mit antitumoraler Aktivit t die direkte oder indirekte Vermittler antitumoraler Effekte sind auf Tumorpatienten Rosenberg 1991 Die erste adoptive Tumorimmuntherapie f hrten Rosenberg et al 1985 mit in vitro stimulierten autologen Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK und IL 2 bei solchen Patienten mit metastasierenden Melanomen Kolonkarzinomen Nierenzellkarzinomen und Bronchialzellkarzinomen mit Erfolg durch bei denen alle anderen konventionellen Tumortherapien versagt hatten Rosenberg 1985 Rosenberg et al 1985 Literatur bersicht 5 Bei LAK handelt es sich um stimulierte Nat rliche Killerzellen oder um aktivierte zytot
147. isolierten Zellen wurden auf eine Zellzahl von 15 x 10 Zellen ml eingestellt Zur Stimulation der Lymphozyten wurde das Mitogen Concanavalin A Con A Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen in einer Konzentration von 2 ug ml eingesetzt Das gefriergetrocknete Mitogen wurde durch Zugabe von 5 ml sterilem RPMI 1640 Medium suspendiert und so eine Stamml sung mit einer Konzentration von 1 mg ml hergestellt Diese wurde in 0 1 ml Portionen in sterile 1 ml Eppendorfgef e abgef llt und bis zur Verwendung bei 20 C gelagert Nach dem Auftauen der Stamml sung wurde das Mitogen durch Zugabe von 900 ul RPMI 1640 Medium auf die Konzentration von 100 ug ml verd nnt Durch Zugabe der Material und Methoden 29 entsprechenden Menge dieser Con A Verd nnung zu der Lymphozytensuspension wurde die zuvor als optimal ermittelte Mitogen Konzentration von 2 ug ml eingestellt Wagner 1998 Um aus einer ausreichenden Menge stimulierter Lymphozyten sp ter mRNA gewinnen zu k nnen wurden 5 ml der Lymphozytensuspension in einer sterilen 25 cm Gewebekulturflaschen Dunn Labortechnik GmbH Asbach in einem CO Brutschrank Heraeus UB 6060 EK CO2 Heraeus Hanau in 5 iger CO gt Atmosph re bei 37 C f r 72 h inkubiert Als Medium diente steriles RPMI 1640 1 FKS mit einem Zusatz von 100 ul der Con A Gebrauchsl sung Zur Ermittlung der Proliferationsrate der stimulierten Lymphozyten wurde parallel zu den Makrokulturen der Kulturflaschen zus tz
148. it Metafectene in die BHK Tet on Zelllinie transfiziert und erfolgreich transfizierte Zellen im Selektionsmedium kloniert wurden wurden insgesamt 12 Klone isoliert und nach der Induktion mit Doxyzyklin auf ihre Expression des Reportergens Luciferase untersucht Die Ergebnisse dieser Messung sind in den Tabellen 19a und 19b zusammengestellt Tabelle 19a Messwerte des Luciferase Assays der transfizierten BHK Klone Al A6 Klon Al A2 A3 A4 A5 A6 induziert 53051 521350 442 300 365810 604230 26184 nicht induziert 1 133 40 364 47 709 42 981 41 345 943 Stimulationsindex 46 8 12 9 93 8 5 14 6 27 8 Tabelle 19b Messwerte des Luciferase Assays der transfizierten BHK Klone A7 A12 Klon A7 A8 A9 A10 All A12 induziert 45 691 3 763 30 048 11 753 27 105 251 300 nicht induziert 1 241 119 3 273 4 508 41 632 23529 Stimulationsindex 36 8 31 6 92 2 6 10 7 Nach diesem ersten Screening wurden drei Klone Al A5 und A8 ausgew hlt Dabei handelte es sich um den Klon mit dem h chsten Stimulationsindex Al um den Klon mit der absolut h chsten Luciferase Aktivit t im induzierten Zustand A5 und um den Klon mit der geringsten Luciferase Aktivit t im uninduzierten Zustand A8 Diese Klone wurden erneut in einem Luciferase Assay auf Luciferase Aktivit t hin berpr ft Als Negativ Kontrolle diente die nicht mit dem Plasmid pTRUE IL2 IRES transfizierte BHK Tet on Zelllinie Die Er
149. kriptionsfaktor NF KB Dies erm glicht die Expression der a Untereinheit auf der Zelloberfl che wodurch sich der hoch affine IL 2 Rezeptorkomplex aus allen drei Untereinheiten formieren kann Die Bindung an IL 2Ra f hrt zu einer Konformations nderung des IL 2 Molek ls wodurch eine passendere Bindungsstelle f r IL 2R und somit eine h here Bindungsaffinit t geschaffen wird In der Quart rstruktur von IL 2 IL 2Ra IL 2RB y zeigt IL 2Ra keine direkte Verbindung zu IL 2R y Wang et al 2005 Literatur bersicht 11 Den Kontakt zwischen IL 2 und IL 2Ra stellt die Schleife zwischen den a Helices A und B im IL 2 Molek l her Sauve et al 1991 An IL 2RB bindet IL 2 mit Teilen der a Helices A und C Kuo und Robb 1986 F r den minimalen Kontakt zu y sind Aminos urereste der a Helices A und D zust ndig Voss et al 1993 Die Bindung von IL 2 an seinen hoch affinen Rezeptor f hrt zur Internalisierung des Rezeptors und zur Ligandendegradation erh ht aber gleichzeitig die Konzentration von IL 2Ra auf der Zelloberfl che und damit auch die Dichte des kompletten Rezeptors aus allen drei Untereinheiten Smith und Cantrell 1985 2 2 3 Wirkung von IL 2 Verschiedene Populationen immunologisch aktiver Zellen zeigen eine Reaktion auf IL 2 Dazu z hlen B Lymphozyten T Lymphozyten und NK Zellen Die Wirkung von IL 2 auf Zielzellen h ngt von der IL 2 Konzentration der IL 2 Rezeptorenart und dichte und der Dauer der IL 2 Wirkung
150. l 3 13 ng ml 1 6 ng ml 0 8 ng ml 0 4 ng ml und 0 2 ng ml ergaben Zus tzlich wurde ein Standardansatz ohne rhIL 2 angefertigt Die Zellkultur berst nde wurden wie unter 3 5 1 2 1 beschrieben gewonnen Als Negativkontrolle dienten berst nde nativer also plasmidfreier BHK Zellen Die Durchf hrung des Bioassays gliederte sich wie folgt 1 Zweimaliges Waschen der CTLL 2 Zellen mit RPMI FKS bei 400 x g 20 C f r 5 min zur Entfernung von IL 2 Resten 2 Einstellen der Zellkonzentration auf 1 x 10 Zellen ml 3 Pipettieren von 100 ul dieser Suspension pro Probenansatz in je ein steriles Eppendorfgef 4 Zentrifugation bei 500 x g 20 C f r 3 min und Absaugen des berstandes 74 Material und Methoden 5 Resuspension der Zellen in je 100 ul des jeweiligen Probenansatzes und Eins en in je eine Vertiefung einer MTP Die Zellkultur berst nde Negativkontrollen und Standards wurden in jeweils drei bzw f nf gleichen Ans tzen eingesetzt Daneben wurde ein Leerwert bestehend aus Zellkulturmedium ohne Zellen in eine Vertiefung der MTP einpipettiert 6 Inkubation der MTP f r 72 h bei 37 C und 5 CO2 7 Bestimmung der Zellproliferation mittels MTT Tests Die Durchf hrung erfolgte wie unter 3 1 3 beschrieben jedoch wurden pro Vertiefung nur 10 ul MTT Gebrauchsl sung sowie 100 ul DMSO Gebrauchsl sung eingesetzt 8 Zweifache Messung der MTP im Photometer 3 5 2 Verschiedene Versuchsans tze des Bioassays 3 5 2
151. len en q Nucleopore Membran O O O O O 4 CTLL 2 Zellen Schema 5 Schematische Darstellung eines Transwell Einsatzes mit permeabler Nucleopore Membran in einer Vertiefung einer 24 Well Platte und den inkubierten rcIL 2 produziernende BHK Zellen und CTLL 2 Zellen F r diese Versuchsanordnung wurden die CTLL 2 Zellen zweimal mit RPMI FKS gewaschen und auf eine Dichte von 1 x 10 Zellen ml eingestellt 600 pl dieser Zellsuspension wurde in die Vertiefungen der 24 Well Platte gegeben Die rcIL 2 produzierenden BHK wurden abtrypsiniert und auf eine Zellzahl von 3 x 10 Zellen ml eingestellt Nachdem die Transwell Eins tze vorsichtig mit Hilfe einer sterilen Pinzette in die Vertiefungen mit CTLL 2 Zellen eingeh ngt worden waren wurden 100 ul der BHK Zell Suspension in die Eins tze pipettiert F r jeden der drei BHK Klone wurde ein durch Doxyzyklin induzierter und ein nichtinduzierter Ansatz hergestellt Anschlie end wurde die 24 Well Platte f r 72 h bei 37 C und 5 CO im Brutschrank inkubiert Gleichzeitig wurde die rhIL 2 Standard Verd nnung hergestellt und darin CTLL 2 Zellen ebenfalls f r 72 h inkubiert siehe 3 5 1 2 2 Die Transwell Eins tze wurden nach der Inkubationszeit vorsichtig mit einer Pinzette herausgehoben Die auf dem Boden der Kulturflasche liegenden CTLL 2 Zellen wurden vorsichtig auf und ab pipettiert auf 100 ul Portionen aufgeteilt und in einen MTT Test zusammen mit der rhIL 2 Standard Verdii
152. lez A Wychowski C Blight K Xu J Hahn Y S Rice C M Dubuisson J 1997 Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes J Virol 71 697 704 Den Otter W Balemans L Battermann J J Bernsen M R Cadee J A Dobrowolski Z Everse L A Fiszer Maliszewska L Gavhumende R De Groot J W De Groot K Hennink W E Hill F W Jurgenliemp Schulz I Klein W R Koten J W Maas R A Steerenberg P Stewart R Zembala M 1999 Local low dose IL 2 therapy Hepatogastroenterology 46 Suppl 1 1280 1286 Denizot F Lang R 1986 Rapid colorimetric assay for cell growth and survival Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability J Immunol Methods 89 271 277 Devos R Plaetinck G Cheroutre H Simons G Degrave W Tavernier J Remaut E Fiers W 1983 Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E coli Nucleic Acids Res 11 4307 4323 Dow S Elmslie R Kurzman I MacEwen G Pericle F Liggitt D 2005 Phase I study of liposome DNA complexes encoding the interleukin 2 gene in dogs with osteosarcoma lung metastases Hum Gene Ther 16 937 946 138 Literaturverzeichnis Dow S W Elmslie R E Willson A P Roche L Gorman C Potter T A 1998 In vivo tumor transfection with superantigen plus cytokine genes induces tumor regression and prolongs survival in dogs with malignant melanoma J
153. lfe eines pr parativen Gels siehe 3 2 1 2 und 3 2 1 3 isoliert wozu jeweils 50 ul der Verdaue auf dieses Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt wurden 3 2 5 2 Dephosphorylierung und Phenol Chloroform Extraktion des linearisierten Vektors pTRUE Das geschnittene Vektor Plasmid pTRUE wurde vor der Dreifachligation dephosphoryliert um eine intramolekulare Ligation der Molek lenden ohne den Einbau der Inserts zu verhindern Hierzu wurden nach der Pr paration aus dem Agarosegel 10 v v Dephosphorylierungspuffer Roche Diagnostics GmbH Mannheim und 1 U Alkalische Phosphatase CIP calf intestine phosphatase 1 U ul Roche Diagnostics GmbH Mannheim zugegeben und der Ansatz bei 37 C f r 5 min inkubiert Die dephosphorylierte Vektor DNA wurde anschlie end durch eine Phenol Chloroform Extraktion gereinigt Dazu wurde das Volumen des Ansatzes zun chst mit H2Odd auf 100 ul eingestellt Nach der Zugabe von 100 ul ges ttigtem Phenol Roti Phenol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe ges ttigt mit 10 mM Tris HCl Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 1 mM EDTA pH 8 0 Merck KGaA Darmstadt 0 1 w v Hydroxycholin Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe gr ndlichem Vermischen und einer Zentrifugation bei 16 000 x g f r 5 min wurde die w ssrige Phase in ein frisches Eppendorf Gef berf hrt mit 150 ul Chloroform Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe versetzt und erneut zentrifugiert 16 000 x g 5 min Die DNA wurde durch Zugabe von 2
154. lich ein Mikrokultursystem angelegt Dazu wurden je 200 ul der Lymphozytensuspension pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte MTP 96 Loch Flachbodenplatte Falcon Becton Dickinson Heidelberg ausges t Es wurden Sechsfach Ans tze gleicher Kulturen durchgef hrt Als Gewebekulturmedium diente in allen F llen wieder RPMI 1640 1 FKS Zu den mitogenhaltigen Kulturen wurden jeweils 4 ul der Gebrauchsl sung von Con A mit einer Konzentration von 100 ug ml zugegeben Unstimulierte Kulturen erhielten lediglich RPMI 1640 1 FKS ohne Mitogen Die MTP wurde zusammen mit den 25 cm Gewebekulturflaschen 72 h lang bei 37 C in 5 iger CO2 Atmosph re inkubiert 3 1 3 berpr fung der Stimulation mit der MTT Proliferationsmessmethode Zur Bestimmung der Proliferation der stimulierten Zellkulturen im Vergleich zu unstimulierten Kontrollkulturen ohne Mitogenzusatz wurde die kolorimetrische Methode des MTT Tests durchgef hrt Die Stimulation wurde als Stimulationsindex nach folgender Formel berechnet Stimulationsindex SD Mittelwert der stimulierten Kulturen Mittelwert der unstimulierten Kulturen Zur Proliferationsmessung wurde das Tetrazoliumsalz 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 2 5 diphenyl Tetrazoliumbromid Methylthiazol Tetrazolium MTT Sigma Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen eingesetzt das von lebenden Zellen zu dunkelblauen bis violetten Formazan Kristallen umgebaut wird siehe Abbildungen 21 bis 24 Seite 106 und 107 Die Ermittlun
155. lium MTT u s0sssennsenssnennneennennnn 14 2 6 RT PCR zur Amplifikation einer Copy DNA CDNA von CIL 2 ueessessnessnessnsnersnennnennnn 16 2 7 Tetrazyklinabh ngige Expression von Genen uuesnsssessnessnessnennorsnensnennnennnennnennnennennnennnennn nn 17 2 7 1 Das Teet ff Expressionssystem a ame leur a N 18 2 7 2 Das Tet on Expressionssystem nerion ioien ie a a a EAEE EHRE 20 2 7 3 Verwendete Regulator und Response Plasmide eee eeceeseeseeeecsceeseceseeeseeseeeseeeeeeaeessessaes 22 2 7 4 Empf ngerzellen des Tet on Systems esensssseseseresesersererereresseesessesstnsesrerererescssennenrrsresersresessess 23 2 8 IL 2 Bi0assay an er RR ii iii 24 2 9 Rose Bengal Assay RBA iienaa eeneteke a BRHtp a aan 25 3 Material und Methoden sesersesnesessesnesnsnesnssnsnesnsnesnesnenssnssnensnnssnsnesnssnenennrsnsnnnennsnnsnssnsnnsnnnen 27 3 1 Gewinnung der IL 2 Sequenz 4 2 3 22 0 uenkaeinseingss nlssnbnsiies BEER 27 3 1 1 Blutentnahme und Lymphozytenisolierung mittels einstufiger Percoll Dichtegradientenzentrifugation irois erisir esei i EEE EE ENEE EA ES E S 27 3 1 2 Mitogen Stimulation der Lymphozyten ursuessessnesnessnessnesnnesnnnsnensennnennnennnennennnennnensnennn nn 28 3 1 3 berpr fung der Stimulation mit der MTT Proliferationsmessmethode enen 29 3 1 4 Gewinnung der mRNA u 8 een aneinsa bes RR Elan 30 3 1 5 RT PER 2 220420 Betten E nie BER In nennen 31 3 1 5
156. llz hlung in einer Modifizierten Neubauer Z hlkammer mit Trypanblau gef rbten Zellen ergab eine Zellzahl von 4 1 x 10 Zellen l und einen Anteil von etwa 98 lebender Zellen Nachdem die Lymphozyten wie unter 3 1 2 beschrieben mit Con A stimuliert worden waren ergab die MTT Proliferationsmessung der stimulierten Lymphozytenmakrokulturen aus der 25 cm Kulturflaschen eine durchschnittliche optische Dichte OD von 0 154 siehe Grafik 1 Die Positiv Kontrollen der Mikrokulturen wiesen eine durchschnittliche optische Dichte von 0 146 und die Negativkontrollen eine von 0 001 auf Daraus ergab sich f r die Makrokulturen ein Stimulationsindex SD von 154 und f r die Mikrokulturans tze ein SI von 146 O CAA s 2025 ZD 2 82 Ergebnisse 4 1 3 RT PCR zur Gewinnung der cDNA Nach der DNase Behandlung wurde die gewonnene und auf 100 ng RNA ml eingestellte RNA in der RT PCR eingesetzt Anschlie end erfolgte die Auswertung und Dokumentation mit Hilfe der Agarose Gelelektrophorese wobei jeweils 15 ul des PCR Produktes aufgetragen wurden Abbildung 8 zeigt dass eine Bande bei etwa 650 bp liegt Bahn 2 und 3 Dies entspricht der erwarteten Gr e von 653 bp der amplifizierten Sequenz von cIL 2 In Bahn 2 und 3 befindet sich der gleiche Versuchsansatz wobei lediglich die Primerkonzentration variiert wurde In Bahn 2 lag sie bei 10 pmol in Bahn 3 bei 20 pmol In Bahn 1 und 6 wurde der 100 bp Gr enmarker a
157. logie Fachbereich Veterin rmedizin der Justus Liebig Universit t Giessen modifiziertes und von diesem freundlicherweise zur Verf gung gestellten Konstrukt Rinck et al 2001 In diesem Plasmid steht die Expression von rtTA unter der Kontrolle des humanen Elongationsfaktors la EF la einem starken Promotor Zur Herstellung dieses Regulator Plasmids wurde der offene Leserahmen ORF des rtTA mittels PCR aus dem Plasmid pTet on Clontech Laboratories Inc USA amplifiziert Anschlie end erfolgte der Einbau des ORF in den mit Swal geschnittenen Vektor cdEF321swxneo Harada et al 1995 Das resultierende Plasmid PEF tet on NEO tr gt so neben einer Neomycinresistenz auch den ORF f r rtTA unter der Kontrolle von EF 1a Als Response Plasmid im Tet on System wird das Plasmid pTRUE genutzt ein vom Institut f r Virologie Fachbereich 10 der Justus Liebig Universit t modifizierten Vektor auf der Basis des Vektors pTRE Clontech Laboratories Inc USA In dieses Response Plasmid wird die durch RT PCR gewonnene Sequenz fiir cIL 2 zusammen mit dem Reportergen Luciferase einkloniert siehe Schema 3 Das Reportergen erm glicht eine z gige berpr fung der Klonierung und der Funktion des Tet on Systems Zwischen beide Gensequenzen wurde der Abschnitt einer Internal Ribosomal Entry Site IRES eingebaut Dadurch wird die Expression von zwei einzelnen voneinander unabh ngigen Proteinen erm glicht Gallardo et al 1997 Martinez Salas 1999 Die IRES
158. ls for the treatment of advanced renal cell carcinoma Eur J Cancer 28A 1038 1044 Papa M Z Mule J J Rosenberg S A 1986 Antitumor efficacy of lymphokine activated killer cells and recombinant interleukin 2 in vivo successful immunotherapy of established pulmonary metastases from weakly immunogenic and nonimmunogenic murine tumors of three district histological types Cancer Res 46 4973 4978 Pertoft H Hirtenstein M Kagedal L 1979 Cell separations in a new densitiy medium Percoll In Reid E Hrsg Cell populations methodological surveys B Biochemistry Ellis Horwood Ltd Chichester UK S 67 80 Quesada J R Reuben J Manning J T Hersh E M Gutterman J U 1984 Alpha interferon for induction of remission in hairy cell leukemia N Engl J Med 310 15 18 Quintin Colonna F Devauchelle P Fradelizi D Mourot B Faure T Kourilsky P Roth C Mehtali M 1996 Gene therapy of spontaneous canine melanoma and feline fibrosarcoma by intratumoral administration of histoincompatible cells expressing human interleukin 2 Gene Ther 3 1104 1112 Rai el Balhaa G Pellerin J L Bodin G Abdullah A Hiron H 1985 Lymphoblastic transformation assay of sheep peripheral blood lymphocytes a new rapid and easy to read technique Comp Immun Microbiol Infect Dis 8 311 318 Literaturverzeichnis 145 Remy J S Kichler A Mordvinov V Schuber F Behr J P 1995 Targeted gene transfe
159. mphozyten erfolgte in Anlehnung an Chomezynski und Sacchi 1987 nach dem Prinzip der sauren Guanidin Isothiozyanat Phenol Chloroform Extraktion mit TRIzol Reagenz Invitrogen Karslruhe Dazu wurden zun chst die Zellen aus den Kulturflaschen in ein konisch zulaufendes 15 ml Glaszentrifugenr hrchen bertragen und bei 400 x g und 12 C f r 5 min zentrifugiert Das Pellet wurde anschlie end in 1 ml RPMI 1640 ohne FKS resuspendiert Nach berf hren dieser Suspension in ein 2 ml Eppendorfgef wurden die Zellen erneut pelletiert und nach folgenden Schritten weiter bearbeitet 1 Lyse der Zellen durch Zugabe von 1 ml TRIzol kontinuierliches Schwenken f r 5 min und anschlie ende Inkubation bei Raumtemperatur f r weitere 5 min 2 Phasentrennung durch Zugabe von 200 ul Chloroform Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 15 s kr ftig sch tteln anschlie end 2 3 min bei Raumtemperatur inkubieren 3 Zentrifugieren bei 12 000 x g f r 10 min dadurch Auftrennung in eine RNA haltige obere w ssrige Phase und eine DNA haltige untere Phenol Chloroform Phase Material und Methoden 31 4 berf hren der w ssrigen Phase in ein frisches 2 ml EppendorfgefaB Verwerfen der Phenol Chloroform Phase 5 Zugabe von 500 ul 100 igem Isopropanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe und Pr zipitation der RNA f r 10 min bei Raumtemperatur oder ber Nacht bei 40 C 6 Zentrifugation bei 12 000 x g f r 10 min 7 nach Absaugen des berstand
160. mrechnungen ausgedr ckt und berechnet gel p3 a In p3 In pl b p2 Wurde zur Ermittlung der rcIL 2 Konzetration die Standardverd nnungsreihe E verwendet siehe Anhang Tabelle 12 erfolgte dies jedoch ber folgende Formel In 10 1 p3 p2 pl oD pl IL 2 Konzentration Diese Gleichung ergibt sich durch Umformung der oben genannten Formel Da die nicht lineare Regression der Standardverd nnungsreihe E f r p3 einen negativen Wert ergab und der Logarithmus naturalis f r negative Werte nicht definiert ist wurde der Umweg ber diese Umformung n tig Von den F nffach Ans tzen der zu testenden BHK berst nde wurde zun chst der Leerwert abgezogen und dieser Wert f r die OD in die obige Formel eingesetzt wodurch der rcIL 2 Gehalt ermittelt werden konnte Falls es sich um verd nnte berst nde handelte siehe 3 5 1 2 1 wurde die ermittelte Menge mit dem Verd nnungsfaktor 2 multipliziert Die Material und Methoden 79 Werte aus den Doppelmessungen wurden gemittelt Die Ergebnisse von induzierten und nicht induzierten BHK Zellen wurden durch einen Wilcoxon Mann Whitney Test Statistikprogramm BMDP3D auf ihre Signifikanz berpr ft Die statistische Auswertung des Versuchs zur berpr fung der rcIL 2 Produktion unter serumfreien Bedingungen wurde durch eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit dem Statistikprogramm BMDP7D durchgef hrt Die Ergebnisse aus den Untersuchungen zur rcIL 2 Induktion durc
161. n 1 5 x 10 Zellen ml 114 Ergebnisse In dieser Verlaufsstudie des transfizierten Klons A5 2 fiel hingegen auf dass die uninduzierten Ans tze eine deutlich h here rcIL 2 Menge sezernierten als die mit Doxyzyklin induzierten Grafik 9 Tabelle 31 Die uninduziert produzierten rcIL 2 Konzentrationen lagen nach 24 48 und 72 h bei 0 74 ng 4 35 ng und 19 94 ng rcIL 2 ml Dagegen wiesen die berst nde der induzierten Ans tze einen deutlich schw cheren Anstieg der rcIL 2 Mengen von lediglich 0 36 ng 1 01 ng und 4 14 ng ml auf Sowohl die induzierten als auch die nicht induzierten Ans tze f hrten aber zu einen kontinuierlichen Anstieg des rcIl 2 Gehaltes wobei der Unterschied im rcIL 2 Gehalt nach 24 h und 72 h zwischen den beiden Ans tzen signifikant p 0 008 war Nach 48 h war lediglich ein nur schwach signifikanter Unterschied zu beobachten p 0 016 Klon A5 2 25 5 2 20 c S 15 4 EPE Ouninduziert S Dinduziert n 10 x A 54 I E 24 h 48 h 72h Grafik 9 Mittelwerte und Standardabweichungen n 5 der produzierten rcIL 2 Konzentrationen des BHK Klons A5 2 nach 24 h 48 h und 72 h eingesetzte Zellkonzentration 1 5 x 10 Zellen ml Ergebnisse 115 4 4 4 rcIL 2 Produktion unter serumfreien Bedingungen Die Produktion von rcIL 2 unter serumfreien Bedingungen wurde mit dem BHK Klon A5 in einem zweiphasigen Versuchsaufbau verfolgt In der ersten Phase erhielten alle Ans
162. n die nun einzeln vorliegenden Zellen in 5 ml MEME FKS aufgenommen und bei 4 C f r 5 min bei 400 x g zentrifugiert Nach Absaugen des berstandes wurde das Zellpellet in 5 ml MEME FKS resuspendiert und zur Zytotoxizit tspr fung im RBA eingesetzt 3 4 1 2 Gewinnung und Vorbereitung der NK Effektorzellen 3 4 1 2 1 Effektorzellisolierung Die Isolierung der NK Zellen aus Hundeblut erfolgte nach dem unter 3 1 1 angegebenen Protokoll Hierbei muss jedoch betont werden dass durch das Isolierungsverfahren der Lymphozyten nur eine Anreicherung der NK Zellen jedoch keine reine NK Zell Fraktion erreicht werden kann Gondolf 1994 Nach der Einstellung der Zellkonzentration auf 1 x 10 Zellen ml wurden die Zellen auf zwei Portionen aufgeteilt und in verschiedenen Ans tzen den BHK berst nden ausgesetzt 3 4 1 2 2 Gewinnung der BHK Test berst nde Als zu testender berstand diente Kulturmedium einer 72 h alten BHK Kultur Nach dem Passagieren wurden etwa 2 x 10 BHK Zellen in einer 25 cm Gewebekulturflasche ausges t wobei steriles RPMI 1640 mit 10 FKS und 1 Penicillin Streptomycin als Kulturmedium diente siehe 3 1 1 Die Zellen wurden mit dem Gewebekulturmikroskop t glich auf ihr Wachstum hin kontrolliert Nachdem sich eine Konfluenz von etwa 80 eingestellt hatte wurde das Medium abgesaugt und vollst ndig durch frisches Kulturmedium ersetzt Nach einer weiteren Inkubationszeit von 24 h wurde das nun von den BHK Zellen konditionie
163. n vitro Stimulation von NK Zellen aus Tumorpatienten erfolgen Durch eine Koinkubation in einem Bioreaktor k nnen beide Zellpopulationen getrennt voneinander kultiviert werden Falkenberg et al 1995 Eine semipermeable Membran mit einer entsprechenden Ausschlussgrenze erm glicht jedoch den bertritt von cIL 2 aus dem Produktionsabteil in das Kompartiment mit den zu stimulierenden NK Zellen Diese nun zu LAK stimulierten autologen Zellen k nnen dem Patienten im Zuge der adoptiven Tumorimmuntherapie wieder verabreicht werden der somit nicht mit xenogenen Zellen oder Stoffen in Ber hrung kommt Auch k nnte auf diese Weise der Einfluss von blockierenden Faktoren der Tumorzellen oder von die Immunantwort herabregulierenden Regulatorzellen auf die zytotoxische Aktivit t von NK Zellen und zytotoxischen T Zellen umgangen werden wie dies h ufig bei in vivo Immunreaktionen gegen Tumoren zu beobachten ist Literatur bersicht 3 2 LITERATUR BERSICHT 2 1 Tumorimmuntherapie W hrend die Behandlung von Tumorerkrankungen durch chirurgische Exzession schon seit langem praktiziert wurde f hrten verschiedene Entdeckungen erst zu Beginn des 20 Jahrhunderts zur Entwicklung der Strahlentherapie Binkley 1929 Simmons 1930 und der Chemotherapie Goodman 1946 Rhoads 1946 bei inoperablen Tumoren Die Tumorimmuntherapie hingegen entwickelte sich erst seit den fr hen Sechzigern des 20 Jahrhunderts nachdem bahnbrechende neue Erkenntnisse be
164. nen modifizierten tetR Durch Mutagenese wurde ein Austausch von vier Aminos uren erzielt was zu einer Konformations nderung des Proteins f hrte Aufgrund dieser r umlichen Strukturver nderung konnte durch Zugabe von Tetrazyklin eine Bindung dieses reversen Tetrazyklinrepressors rterR an das rerO erzielt und die Transkription nachgeschalteter Gene ausgel st werden Nun war die Anwesenheit des Tetrazyklins zur Proteinexpression n tig siehe Schema 2 Li et al 2004 transfizierten stromale Knochenmarkszellen mit den Genen f r IL 2 und IL 3 im Tet on System Sie erreichten eine Zytokin Produktion f r IL 2 von 1300 ng d 1 x 10 Zellen und fiir IL 3 von 1100 ng d 1 x 10 Zellen Literatur bersicht 21 Tc Tc Schema 2 Tet on System Tetrazyklin bindet an den reversen Transaktivator und bewirkt damit die Transkription des Gens X Pcmv Promotor des Cytomegalievirus rterR reverser Tetratzyklinrepressor VP16 Virionprotein 16 des humanen Herpes simplex Virus rtTA reverser tetrazyklinkontrollierter Transaktivator Te Tetrazyklin tetO Tetrazyklinoperon Pmincmv minimaler Promotor des Cytomegalievirus 22 Literatur bersicht 2 7 3 Verwendete Regulator und Response Plasmide Ein Bestandteil des zur Produktion von rcIL 2 verwendeten Expressionssystems ist das Regulator Plasmid pEF Tet on Dieses Plasmid codiert f r den rtTA und tr gt eine Resistenz gegen Neomycin Es handelt sich dabei um ein im Institut f r Viro
165. ner Produktionszeit von 24 h lag die h chste Konzentration an sezerniertem cIL 2 bei 3 85 ng ml Klon A5 Insgesamt war zu beobachten dass bei dieser Ausgangszellkonzentration das Kulturmedium ein starkes Absinken des pH Wertes aufwies Dies beeintr chtigte nachfolgende Bioassays mit CTLL 2 Zellen Daher wurden geringere Zellzahlen verwendet und die Produktionszeit von cIL 2 verl ngert So ergab der Einsatz von 0 75 x 10 Zellen ml ber eine Produktionszeit von 72 h eine h here Konzentration an cIL 2 in den Kultur berst nden Hier lag die h chste Konzentration bei 17 39 ng cIL 2 ml Klon A5 Bei einer Zellkonzentration von 1 3 x 10 Zellen ml und einer Produktionszeit von ebenfalls 72 h wurden maximal 10 49 ng cIL 2 ml sezerniert Klon A5 4 Die getesteten BHK Klone zeigten bis auf Klon A5 2 alle eine signifikante Induzierbarkeit der cIL 2 Produktion durch Doxyzyklin Dies l sst auf ein funktionierendes Tet on Expressionssystem in den BHK Zellen schlie en Viele der Klone wiesen eine basale cIL 2 Produktion auf was sich mit m glichen Einfl ssen von zelleigenen Promotoren erkl ren l sst in deren N he Anteile des Tet on Systems integriert wurden Auch die Anzahl der stabil in das Genom integrierten pTRUE IL 2 Kopien hat einen Einfluss auf die Menge des produzierten cIL 2 Dies spiegelt sich auch in der unterschiedlich hohen cIL 2 Produktion der einzelnen BHK Klone wieder In den Versuchen zeigte lediglich Klon A5 2 keine Signifikanz
166. ng 0 023 0 019 0 025 0 020 0 019 0 003 ED ee Messung 0 020 0 016 0 023 0 017 0 016 leerwertbereinigt Anhang 173 Tabelle 43d Messwerte zu Tabelle 26 uninduziert induziert A5 9 leerwertbereinigt BHK Linie Leerwert OD 1 Messung 0 009 0 008 0 008 0 009 0 006 0 000 OD 1 Messune 0 009 0 008 0 008 0 009 0 006 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 007 0 008 0 010 0 009 0 006 0 003 OD 2 Messung 0 004 0 005 0 007 0 006 0 003 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 040 0 041 0 043 0 042 0 040 0 000 OD 1 Messung 0 040 0 041 0 043 0 042 0 040 leerwertbereinigt OD 2 Messung 0 041 0 041 0 043 0 043 0 039 0 003 ODZ Messung 0 038 0 038 0 040 0 040 0 036 174 Anhang Tabelle 44 Messwerte zu Tabelle 27 BHK Linie A5 Leerwert OD 1 Messung 0 003 0 001 0 001 0 002 0 001 0 000 OD 1 Messune 0 003 0 001 0 001 0 002 0 001 g leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 003 0 001 0 001 0 004 0 003 0 001 OD 2 Messung 0 002 0 000 0 000 0 003 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 041 0 041 0 040 0 042 0 022 0 000 OD 1 Messung 0 041 0 041 0 040 0 042 0 022 4 leerwertbereinigt induziert OD 2 Messung 0 039 0 043 0 044 0 043 0 024 0 001 ODZ Messing 0 038 0 042 0 043 0 043 0 025 leerwertbereinigt BHK Linie A5 3 Leerwert OD 1 Messung 0 002 0 003 0 004 0 004 0 004 0 000 OD 1 Me un 0 002 0 003 0 004 0 004 0 004 leerwertbereinigt uninduziert OD 2 Messung 0 002 0 000 0 002 0
167. ng Site Abbildung 1 jedoch keine weiteren im Vektor vorhanden sind Dadurch entsteht ein Vektor Fragment von 4 kbp Gr e und ein etwa 0 65 kbp gro es Fragment des PCR Inserts F r den Verdau wurde folgender Ansatz hergestellt 1 5 ul Plasmid DNA 2ul Puffer O MBI Fermentas St Leon Roth 1 5ul EcoRI 10 U ul MBI Fermentas St Leon Roth 15ul H gt Odd Dieses Gemisch wurde f r 2 h im Wasserbad bei 37 C inkubiert Anschlie end erfolgte die berpr fung der Fragmente mit Hilfe einer Agarosegelelektrophorese 2 Agarose 1000 Invitrogen Karlsruhe Material und Methoden 39 3 1 6 4 Reklonierung und Sequenzierung des Plasmids Um eine ausreichende Plasmid Menge zur Sequenzierung zu erhalten wurde das Plasmid in E coli Bakterien vermehrt Dazu wurden mit einem autoklavierten Zahnstocher einige Bakterien aus der Fl ssigkultur siehe 3 1 6 2 in 50 ml LB Medium berf hrt und ber Nacht bei 37 C auf einem Sch ttler inkubiert Am n chsten Tag erfolgte die Plasmid Pr paration aus 6 ml dieser Bakterienkultur mit Hilfe des NucleoBond PC 100 Plasmid DNA Purification Kit Macherey Nagel GmbH amp Co KG D ren nach Angaben des Herstellers Die Menge isolierter Plasmid DNA wurde im Photometer Gene Quant II DNA RNA Calculator Pharmacia Biotech GmbH Freiburg ermittelt Die Sequenzierung des einklonierten PCR Produktes erfolgte mit einem Aliquot von 15 ul entspricht 4 5 ug Plasmid DNA bei SeqLab Sequence Lab
168. nklonierten cIL 2 mit der von Dunham et al 1995 ermittelten Sequenz D30710 schwarz codierende Sequenz f r cIL 2 mittelgrau codierende Sequenz f r das Signalpeptid hellgrau Primerpositionen Primer KpnIL2 von 26 bis 52 Primer MlulL2rev von 465 bis 504 Ergebnisse 93 4 2 4 Zusammenbau von pTRUE IL2 IRES Um das vollst ndige Response Plasmid in einer Dreifachligation zusammenbauen zu k nnen mussten zuerst die einzelnen Komponenten in Restriktionsemzymverdauen geschnitten und anschlie end aus pr parativen Gelen isoliert werden Zun chst wurde das Plasmid pGEM T IL2 1 mit den Enzymen KpnI und Mlul geschnitten Abbildung 15 zeigt das pr parative Gel aus dem die so entstandene 0 5 kbp gro e Bande des cIL 2 ausgeschnitten wurde 3kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 15 Pr paratives Gel von pGEM T IL2 1 AKpnl Mlul Bande bei 0 5 kbp ausgeschnitten Pfeil Bahn 1 1 kbp Gr enmarker Bahn 2 pGEM T IL2 1 AKpnI AMlul 94 Ergebnisse Der Vektor pTRUE wurde mit den Enzymen KpnI und PstI verdaut was zu einer 3 kbp gro en Vektor Bande f hrte Abbildung 16 pGEM T IRES 2 wurde mit Mlul PstI und Scal geschnitten Neben der 2 5 kbp gro en Bande des IRES Luciferase Fragmentes bildeten sich so zwei weitere Bruchst cke des Plasmids von 1 9 kbp und 1 1 kbp Gr e Abbildung 16 Dies erleichterte das Ausschneiden der 2 5 kbp gro en Bande 3 kbp 2 kbp 1 kbp 0 5 kbp Abbildung 16 Pr paratives
169. nnne nn 8 Sequenzierung des RT PCR Produktes u 02uusssessnessesnnesnessnesnnennnennnnnnnennonnnennnennnennnennnn nen 83 Klonierung des RT PCR Produktes 2202224220020022nernnennnennnennnennennnennnnnnnnnnennnennnennnennnennnennen 85 Sequenzierung des klonierten RT PCR Fragmentes 220222022202snesnnesnnennennnennnennnennnennnennen 85 Tet on Expression eisaenteeiseliiegiehalnsteen en E E a ea ETENEE IERA Eei aS 88 Einbau von Restriktionsenzymschnittstellen durch PCR in cIL 2 ueeseesensesnersnennnennn 88 Analyse der cIL 2 und IRES Luciferase Fragmente urssusssessnessnenneennennnennnennnnnnennnennnenen 89 Sequenzierung des PGEM T IL2 1 Klons 220220022002s0ssnessnennnennnesnnennnnnnennnennnennnennnennen 91 Zusammenbau von PTRUE IL2 IRES uunserssessnessssnessnesnnesnnennnnnnnnnennnennnennnennnnnnensnennne nn 93 Transiente Transfektion von pTRUE IL2 IRES in BHK Tet on Zellen n een 98 Stabile Transfektion von pTRUE IL2 IRES in BHK Tet on Zellen zur Erzeugung einer cIL 2 produzierenden Zelllinie esuuss00ssnesneesnesnnesnnennnennnennennnennnennennnn 99 RT PCR zum Nachweis der cIL 2 mRNA in den transfizierten BHK Zellen 102 Einfluss der berst nde von nicht transfizierten BHK Zellen auf die spontane zytotoxische Aktivit t RBA ueseeessessnersnesseennnennennnennnennnnnnnnsnensennnenn 104 Quantifizierung
170. nnungsreihe eingesetzt siehe 3 5 1 2 2 76 Material und Methoden 3 5 2 3 Zus tzliche Bioassays 3 5 2 3 1 Zeitlicher Verlauf der rcIL 2 Produktion ber 72 h Die BHK Klone A5 A5 1 und A5 2 wurden weiterhin in einem Versuch zum 72 h Verlauf der rcIL 2 Produktion eingesetzt Daf r wurden je Klonlinie Zellen in 3 Wells einer 6 Well Platte unter den unter 3 5 1 2 1 aufgef hrten Bedingungen ausges t und induziert Die eingesetzte Zellzahl lag bei 1 5 x 10 Zellen ml Von jedem Klon wurde nach einer Induktionsdauer von 24 48 und 72 h das Medium abpipettiert f r das Bioassay wie unter 3 5 1 2 1 beschrieben vorbereitet und in einem abschlie enden Bioassay siehe 3 5 1 2 2 auf den Gehalt an rcIL 2 berpr ft Damit konnte der Verlauf der rcIL 2 Produktion ber 72 h verfolgt werden 3 5 2 3 2 rcIL 2 Produktion in serumfreiem Kulturmedium Weiterhin erfolgte die Untersuchung der rcIL 2 Produktion unter serumfreien Bedingungen Zellen des Klons A5 wurden dazu in 6 Wells einer 6 Well Platte inkubiert Jedes Well erhielt die in Tabelle 18 dargestellten Zellkulturmedien Die eingesetzte Zellzahl lag bei 1 x 10 Zellen je Well Die Untersuchungsdauer von Phase und Phase 2 umfasste jeweils 24 h Tabelle 18 _Zellkulturmedien je Ansatz Ansatz Well Phase 1 Phase 2 1 RPMI FKS 5 ul Doxyzyklin RPMI 2 RPMI FKS RPMI 5 ul Doxyzyklin 3 RPMI FKS RPMI 4 RPMI FKS 5 ul Doxyzyklin RPMI FKS 5 RPMI FKS RPMI FKS 5 ul D
171. nsansatz mit einem Endvolumen von jeweils 9 79 ul wurde im PCR Thermocycler Multicycler PTC 200 Biozym Hessisch Oldendorf zun chst f r 10 min bei 37 C Aktivit tsoptimum der DNase und anschlie end f r 5 min bei 75 C Denaturierung der DNase inkubiert Danach wurden die Reaktionsgef e auf 4 C abgek hlt Die DNase Behandlung der RNA erfolgte unmittelbar vor der Durchf hrung der RT PCR in die 1 5 ul der so behandelten RNA eingesetzt wurden 3 1 5 2 Auswahl der Primer Im Rahmen einer RT PCR wurde eine cDNA f r kanines IL 2 cIL 2 synthetisiert Die Primer dazu wurden nach der von Dunham et al 1995 ver ffentlichten Sequenz f r cIL 2 NCBI Accession No D30710 synthetisiert siehe Tabelle 2 Neben den Primern f r das cIL 2 wurden auch Primer eingesetzt die Abschnitte der Glutaraldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase GAPDH amplifizieren Grone et al 1999 Dies diente zur berpr fung der Nukleins ure Integrit t des korrekten Ablaufs der einzelnen Arbeitsschritte sowie als Positivkontrolle House Keeping Gen Tabelle 2 Sequenz und Position der Primer sowie erwartete L nge des Amplikons Primer Basensequenz 5 3 Position Richtung erwartete L nge des Amplikons GAPDH s GCC AAA AGG GTC ATC vorw rts 229 bp ATC TC GAPDH as GGC CAT CCA CAG TCT r ckw rts TCT cIL 2 s TGA TGA GTG CAT TGG 1 17 vorw rts 653 bp AG cIL 2 as GAT TCT TTT TGT AAG 636 653 r ckw rts CCC
172. ntigene von Tumoren sowie antigenspezifische und ex vivo vermehrte zytotoxische T Zellen verwendet Auch unspezifische Stimulantien der Immunantwort kommen zur Anwendung Hierzu ist das Bacillus Calmette Guerin zu z hlen das bei Harnblasentumoren erfolgreich eingesetzt wird Lamm et al 1991 Die Wirkung dieser 4 Literatur bersicht Therapie beruht auf der induzierten Zystitis und der damit verbundenen Aktivierung von Lymphozyten und Zytokinen Bettex Galland et al 1991 Weiterhin wurden verschiedene Zytokine auf ihre Anwendbarkeit bei Tumorerkrankungen erforscht Als vielversprechend erwies sich beispielsweise Interferon a IFN a in der Therapie bestimmter Leuk mie Formen Quesada et al 1984 Die Applikation von Zytokinen erfolgt meist systemisch Andere Verbreichungsformen finden sich in der Injektion von genetisch ver nderten Virusvektoren die das Gen des betreffenden Zytokins tragen und direkt in und um das Tumorgewebe injiziert werden k nnen Bubenik et al 1992 Gastl et al 1992 Bei der Verwendung von Viren als Genvektoren besteht jedoch die Gefahr dass diese Viren nicht auf das Tumorgewebe beschr nkt bleiben sondern auch in anderen Organen auftreten k nnen So zeigte sich in verschiedenen Studien dass diese Viren unter anderem in Ovarien und Hoden sowie in Sperma vorhanden sind Boyce 2001 Auch wenn weitere Untersuchungen ergaben dass die Vektor DNA in der Regel nicht auf die DNA germinativer Zellen bertragen w
173. oc Natl Acad Sci U S A 86 2804 2808 Koehl U Sorensen J Esser R Zimmermann S Gruttner H P Tonn T Seidl C Seifried E Klingebiel T Schwabe D 2004 IL 2 activated NK cell immunotherapy of three children after haploidentical stem cell transplantation Blood Cells Mol Dis 33 261 266 142 Literaturverzeichnis Kozeny G A Nicolas J D Creekmore S Sticklin L Hano J E Fisher R I 1988 Effects of interleukin 2 immunotherapy on renal function J Clin Oncol 6 1170 1176 Krakowka S Ringler S S Lewis M Olsen R G Axthelm M K 1987 Immunosuppression by canine distemper virus modulation of in vitro immunoglobulin synthesis interleukin release and prostaglandin E2 production Vet Immunol Immunopathol 15 181 201 Kristensen F Kristensen B Lazary S 1982 The lymphocyte stimulation test in veterinary immunology Vet Immunol Immunopathol 3 203 277 Kuo L M Robb R J 1986 Structure function relationships for the IL 2 receptor system I Localization of a receptor binding site on IL 2 J Immunol 137 1538 1543 Lafreniere R Rosenberg S A 1985 Adoptive immunotherapy of murine hepatic metastases with lymphokine activated killer LAK cells and recombinant interleukin 2 RIL 2 can mediate the regression of both immunogenic and nonimmunogenic sarcomas and an adenocarcinoma J Immunol 135 4273 4280 Lamm D L Blumenstein B A Crawford E D Montie J E Scardino P
174. ogramm EIA Version 3 10 Anhang 185 Kendro Laboratory Products GmbH Hanau Sterilwerkbank Holten Laminar Air Flow Safe 2000 Li Cor Biosciences GmbH Bad Homburg LI COR 4000 L DNA Sequencer Molecular Devices Sunnyvale USA L Max Microplate Luminometer MWG Ebersberg GelPrint 2000i Nalgene Labware Hereford England Freezing Container Mr Frosty Pharmacia Biotech GmbH Freiburg Photometer Gene Quant II DNA RNA Calculator Sarstedt N mbrecht NH Heparinrohrchen Techne Staffordshire England Thermocycler Cycler TC 312 Werkstatt des MZI JLU Giessen Elektrophoresekammern Absaugeinrichtung 186 Anhang 9 4 L sungen und Puffer Ethanol PBS 50 v v Ethanol und NaCl PBS zu gleichen Teilen mischen Ethidiumbromid 0 2 g Ethidiumbromid MW 394 3 ad 20 ml H O bidest gut sch tteln im K hlschrank lichtgesch tzt lagern LB Agar 10 g Tryptone 5 g Hefenextrakt 10 g NaCl 15 g Agar 950 ml H O bidest pH mit NaOH auf 7 0 einstellen ad 1000 ml H O bidest autoklavieren und abkiihlen lassen 100 ug ml Ampicillin hinzuf gen und in sterile Petrischalen gie en im K hlschrank aufbewahren LB Medium 10 0 g Tryptone 5 0 g Hefenextrakt 10 0 g NaCl 950 ml H O bidest pH Wert mit NaOH auf 7 0 einstellen ad 1000 ml H O bidest autoklavieren im Kiihlschrank aufbewahren NaClI L sung 1 5 M 87 66 g NaCl ad 1000 ml H O dest NaCl PBS pH 7 4 1 42 g Na HPO x 2 H O 0 2 g KH PO 8 0 g NaCl
175. okken Enterotoxin B Serin Stimulationsindex Signal Transducers and Activators of Transcription zytoplasmatische Transkriptionsfaktoren Tris gepufferte Bors ure EDTA L sung T cell growth Factor heute Interleukin 2 T Zell Rezeptor Tetrazyklinoperator Tet off System Induktion der Proteinproduktion durch das Entfernen von Tetrazyklin oder einem Analogon z B Doxyzyklin Tet on System Induktion der Proteinproduktion durch die Zugabe von Tetrazyklin oder einem Analogon z B Doxyzyklin Tetrazyklinrepressor T Helferzellen Subtyp 1 Tumor Nekrose Faktor Apoptose ausl sendes Zytokin Abk rzungsverzeichnis TRAIL TRE Trp TA VP16 Tumor Necrosis Factor related Apoptosis inducing Ligand Apoptose ausl sender Ligand aus der TNF Familie Tetracyclin responive Element auf Tetrazyklin reagierendes Element Tryptophan Tetrazyklinkontrollierter Transaktivator Virionprotein 16 des humanen Herpes simplex Virus Einleitung 1 1 EINLEITUNG Die Tumortherapie hat in der Tiermedizin in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen Besonders der Hund spielt als Tumorpatient eine gro e Rolle nicht nur aufgrund seines sozialen Ranges als Bester Freund des Menschen Er stellt wegen seiner hohen Pr valenz von Spontantumoren sowie deren biologischem Wachstumsverhalten ein Modell f r humane Tumortherapieans tze dar Neben den klassischen Tumortherapien wie der chirurgischen Exzission Strahlen oder Chemotherap
176. onzentration OD 0 005 0 002 0 003 0 004 0 008 0 1 ug ml 2 A 1 438 1 151 1 289 1 350 1 653 1 376 0 187 Konzentration OD 0 021 0 024 0 019 0 021 0 019 0 5 ug ml De ar 2 148 2 219 2 072 2 134 2 087 2132 0 058 Konzentration OD 0 021 0 025 0 022 0 024 0 022 1 0 ug ml EJA Eu 2 134 2 246 2 176 2 218 2 163 2 187 0 045 Konzentration OD 0 022 0 018 0 020 0 020 0 020 2 5 ug ml 2 reas 2 162 2 057 2 104 2 119 2 119 2 112 0 038 Konzentration OD 0 017 0 018 0 017 0 017 0 016 5 0 ug ml gt pee 2 026 2 042 2 023 2 009 1 992 2 018 0 019 Konzentration OD 0 005 0 003 0 001 0 004 0 003 10 0 ug ml aoe Eu 1472 1 242 0 999 1 350 1 242 1 261 0 175 Konzentration rcIL 2 Konzentration berechnet mit Standardverd nnungsreihe H Tabelle 41 Anhang 161 Tabelle 34 Optische Dichten im MTT Test der rhIL 2 Standardverd nnungsreihe A zur Berechnung der produzierten rcIL 2 Menge Mittelwerte um den Blank Wert bereinigte Mittelwerte sowie die nach nicht linearer Regression erhaltenen Variablen Ea aa und ba mp x Bea 0 2 ng ml 0 007 0 011 0 008 0 009 0 006 0 4 ng ml 0 011 0 016 0 011 0 013 0 010 0 8 ng ml 0 014 0 019 0 013 0 015 0 012 1 6 ng ml 0 026 0 024 0 029 0 026 0 023 3 13 ng ml 0 045 0 048 0 053 0 049 0 046 6 25 ng ml 0 087 0 072 0 106 0 088 0 085 12 5 ng ml 0 104 0 111 0 141 0 119 0 116 25 ng ml 0 228 0 231 0 218 0 226 0 223 50 ng ml 0 196 0 231 0 251 0 226 0 223 Ea 0 2
177. oratories G ttingen GmbH G ttingen 3 2 Tet on Expression Das Tet on Expressionssystem erm glicht die Expression einklonierter Gene in Abh ngigkeit von Tetrazyklin bzw seiner Derivate wie etwa Doxyzyklin Gossen und Bujard 1992 Das System beruht auf der Transfektion zweier verschiedener Plasmidvektoren in die Zielzelle wovon einer f r den reversen Tetrazyklinaktivator rtTA kodiert Regulator Plasmid w hrend das zweite Plasmid Response Plasmid die zu exprimierenden Gene in diesem Fall das Gen f r cIL 2 sowie das Reportergen Luciferase unmittelbar stromabw rts des Tetrazyklin responsive Elements TRE enth lt Nach der stabilen Transfektion beider Vektoren in die Zielzellen kann die Expression der Zielsequenzen durch Zugabe von Doxyzyklin angeschaltet werden 3 2 1 Einbau von Restriktionsschnittstellen in das cIL 2 Gen 3 2 1 1 Primer und PCR Bedingungen Die Sequenz des cIL 2 sowie die Internal Ribosomal Entry Site IRES und das Reportergen Luziferase wurden im Rahmen einer Dreifachligation in das Plasmid pTRUE eingef gt Dazu wurden mit Hilfe von speziell designten Primern Tabelle 6 in einer PCR Schnittstellen f r 40 Material und Methoden die Restriktionsenzyme KpnI und Mlul in die Sequenz des cIL 2 eingebaut wobei ein Fragment mit einer L nge von 479 bp erwartet wird Tabelle 6 Sequenz und Position der Primer im cIL 2 Gen NCBI Accession No D30710 sowie Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme
178. oxische T Zellen Ihnen kommt als Teil des angeborenen Immunsystems bei der Abwehr von virusinfizierten Zellen sowie neoplastischen Zellen eine besondere Rolle zu da sie spontan ohne vorausgegangenen Antigen Kontakt diese Zellen lysieren k nnen Eine potentielle Zielzelle muss sich durch ihre k rpereigene MHC Signatur ausweisen um so den Angriff der NK Zellen abzuwehren Missing self Hypothese Karre et al 1986 Ein prim rer Antigen Kontakt wie z B bei zytotoxischen T Lymphozyten ist f r die Aktivit t der NK Zellen nicht n tig Deren Stimulation geschieht durch IL 2 das von Tyul Zellen produziert wird Mosmann et al 1986 LAK zeichnen sich lichtmikroskopisch durch einen gr eren Durchmesser als normale Lymphozyten aus Des weiteren sind azurophile Granula im Zytoplasma typisch die sich in der Einbuchtung des nierenf rmigen Zellkerns finden Daher werden diese Zellen auch Large Granular Lymphocytes LGL genannt Sie machen etwa 5 der im peripheren Blut vorkommenden Lymphozyten aus Der direkte Beweis der Bedeutung der LGL bei der Verhinderung von Metastasen wurde durch den adoptiven Transfer von LGL in NK Zell defiziente M use erbracht Diese bildeten nach der Gabe von LGL keine Metastasen aus w hrend sie ohne Rekonstitution mit LGL zahlreiche Tumormetastasen erkennen lie en Brittenden et al 1996 Dass die spontane zytotoxische Aktivit t von LGL und NK Zellen bei Tumorpatienten herabgesetzt ist zeigten zahlreiche Studien
179. oxyzyklin 6 RPMI FKS RPMI FKS Die Ans tze in Well 1 2 und 3 erhielten also in der zweiten Phase serumfreies Medium wobei die rcIL 2 Produktion dieser Ans tze einmal w hrend der serumhaltigen Phase Well 1 und einmal w hrend der serumfreien Phase Well 2 induziert wurde Die Ans tze 4 und 5 stellten die zugeh rigen Positivkontrollen unter serumhaltigen Bedingungen die Ans tze 3 und 6 die jeweiligen Negativkontrollen ohne Induktion durch Doxyzyklin dar Die aus dieser Anordnung gewonnen Zellkultur berst nde wurden wie unter 3 5 1 2 1 beschrieben gewonnen behandelt und im Bioassay berpr ft Material und Methoden 77 32 2932 Induktion durch verschiedene Doxyzyklin Konzentrationen Die St rke der Induktion durch Doxyzyklin wurde in einer weiteren Versuchsanordnung mit des transfizierten BHK Klons A5 4 untersucht Die Zellen wurden wie unter 3 5 1 2 1 beschrieben in 6 verschiedenen Wells einer 6 Well Platte ausges t und inkubiert Die Menge des zugegeben Doxyzyklin lag jedoch bei 0 ul 0 5 ul 1 ul 2 5 ul 5 ul und 10 ul so dass Doxyzyklin Konzentrationen von 0 ug ml 0 5 ug ml 1 ug ml 2 5 pg ml 5 ug ml und 10 ug ml vorlagen Nach 48 h wurden die berst nde unter 3 5 1 2 1 beschrieben gewonnen und in einem Bioassay eingesetzt 3 5 3 Berechnung der rcIL 2 Konzentration Um die produzierten rcIL 2 Mengen berechnen zu k nnen wurde eine nicht lineare Regression der OD Werte aus der photometrischen Auswertung de
180. pension beim Versuchsansatz und eine dadurch zu geringe eingesetzte Zellzahl zu ber cksichtigen Weiterhin wurde der Verlauf der cIL 2 Produktion ber 72 h untersucht Dazu wurden von drei BHK Klonen nach 24 h 48 h und 72 h berst nde auf den cIL 2 Gehalt im Bioassay mit Hilfe von CTLL 2 Zellen gemessen Klon A5 zeigte ber diesen Zeitraum einen kontinuierlichen Anstieg der cIL 2 Produktion von 20 54 ng ml ber 38 37 ng ml bis 52 23 ng ml Dies ist auch gleichzeitig die h chste cIL 2 Konzentration aller BHK Klone Die uninduziert produzierte Konzentration von cIL 2 lag zu jedem Zeitpunkt unter 1 ng ml F r diesen Ansatz wurde mit 1 5 x 10 Zellen ml eine recht hohe Zellkonzentration eingesetzt was die gro e Menge an produziertem cIL 2 erkl rt Der Klon A5 1 wies nach 48 h eine geringere Menge an cIL 2 auf als nach 24 h Dies ist eventuell auf eine ungleichm ige Suspension der Zellen bei der Einstellung der Zellkonzentration zu Beginn des Versuchs zur ckzuf hren so dass in dem 48 h Ansatz weniger Zellen anwuchsen als in den anderen Ans tzen Die nach 72 h h chste cIL 2 Kon zentration lag mit 3 58 ng ml deutlich unter der von Klon A5 produzierten Konzentration Klon A5 2 lie ber den Zeitraum von 72 h einen Anstieg der cIL 2 Produktion in den nicht induzierten Ans tzen erkennen der signifikant bzw schwach signifikant ber der Konzentration in den induzierten Ans tzen lag Die Hemmung der cIL 2 Produktion durch Zugabe und die F
181. pie vielversprechend ist Jardine et al 1989 Mitchell et al 1991 Gondolf 1994 Mizuno et al 1996 Literatur bersicht 9 2 2 Interleukin 2 IL 2 2 2 1 Charakteristika des Gens und des Proteins Das zu den Zytokinen z hlende Interleukin 2 IL 2 wurde erstmals 1976 von Morgan et al 1976 als T Zell Wachstumsfaktor T Cell Growth Factor TCGF beschrieben Der Name Interleukin 2 wurde 1979 w hrend des Zweiten Internationalen Lymphokin Workshops in Ermatingen Schweiz eingef hrt Mizel und Farrar 1979 1983 gelang erstmals die Klonierung und Sequenzierung von humanem IL 2 hIL 2 Devos et al 1983 Taniguchi et al 1983 hIL 2 besteht aus 153 Aminos uren wobei die ersten 20 Aminos uren eine Signalpeptidsequenz darstellen die zur Reifung des Proteins abgespalten werden Taniguchi et al 1986 Das Molekulargewicht des Glykoproteins liegt bei 15 5 kDa Gillis et al 1982 In der Terti rstruktur setzt sich hIL 2 aus f nf a Helices A B B C D und zwei gt eine Disulfidbr cke B Faltblattstrukturen zusammen wobei zwischen Cys und Cys vorhanden ist Bazan 1992 Das Gen f r hIL 2 befindet sich auf Chromosom 4q Siegel et al 1987 Kanines Interleukin 2 cIL 2 besitzt ein Molekulargewicht von 30 kDa Daemen et al 1984 und zeigt damit Homologien zu murinem IL 2 Gillis und Watson 1980 Die CDNA Sequenz besteht aus 465 Basenpaaren bp die f r ein Protein aus 155 Aminos uren kodieren Dunham et
182. r bearing dogs in a commercially available bioreactor system which was originally designed for simple production of monoclonal antibodies In this system both cell types can be coincubated separated by a semipermeable membrane cIL 2 can pass the membrane and can generate a continuous stimulation of LAK without direct cell to cell contact This avoids an intermitting supplementation of IL 2 to the cell culture medium and thus variable IL 2 concentrations in the medium like in hitherto culture systems LAK produced by this method are to be used in an adoptive tumor immunotherapy in dogs Literaturverzeichnis 135 8 LITERATURVERZEICHNIS Albertini M R Sosman J A Hank J A Moore K H Borchert A Schell K Kohler P C Bechhofer R Storer B Sondel P M 1990 The influence of autologous lymphokine activated killer cell infusions on the toxicity and antitumor effect of repetitive cycles of interleukin 2 Cancer 66 2457 2464 Arruda V R Fields P A Milner R Wainwright L De Miguel M P Donovan P J Herzog R W Nichols T C Biegel J A Razavi M Dake M Huff D Flake A W Couto L Kay M A High K A 2001 Lack of germline transmission of vector sequences following systemic administration of recombinant AAV 2 vector in males Mol Ther 4 586 592 Baltimore D 1970 RNA dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses Nature 226 1209 1211 Bazan J F 1992 Unraveling the struc
183. r Standard Verd nnung durchgef hrt Um Ausrei er zu eliminieren erfolgte bei F nffach Ans tzen zun chst ein Streichen der h chsten und tiefsten Messwerte einer Verd nnungsstufe Winsorisieren Dieser Schritt entfiel bei Dreifach oder Doppel Ans tzen Um den Einfluss der Eigenfarbe des Kulturmediums auszuschlie en wurde nun der Blankwert abgezogen und anschlie end der Mittelwert der ODs f r jede Konzentrationsstufe au er 0 ng ml ermittelt Falls eine 96 Well Platte zweimal gemessen wurde wurde weiterhin auch der Mittelwert je Konzentrationsstufe aus beiden Messungen ermittelt Die nicht lineare Regression dieser Standardkurven erfolgte durch die Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung der Justus Liebig Universit t Gie en unter Verwendung des Statistikprogrammes BMDP3R BMDP Statistical Software Inc Cork Ireland Da es sich bei der Kurve der Standard Verd nnung um eine logistische Funktion handelt lautet die Gleichung zur Berechnung von y Werten bei gegebenen x Werten ei E Eee Tp eT a b x 78 Material und Methoden E a und b sind f r jede Standard Verd nnung spezifische Parameter siehe unten Durch Umformung dieser Formel kann die rcIL 2 Konzentration in den getesteten BHK berst nden durch die Formel In 1l a oD b log IL 2 Konzentration berechnet werden E a und b werden durch das f r die nicht lineare Regression verwendete Statistikprogramm durch folgende U
184. r adoptiven Tumorimmuntherapie beim Hund eingesetzt werden 132 Summary SUMMARY The literature section gives a short overview on the possibilities of immunotherapy and adoptive immunotherapy of human and canine tumor bearing patients with special emphasis on the application of interleukin 2 IL 2 and Iymphokine activated killer cells LAK It was the aim of this study to modify mesenchymal BHK cells by molecular biological means tet on expression system so that these cells produce continuously biological active canine IL 2 cIL 2 This cIL 2 will be provided for clinical application in an adoptive immunotherapy in tumor bearing dogs For this purpose a cDNA for cIL 2 was amplified on basis of isolated and Con A stimulated lymphocytes of a dog according to the publication of Dunham et al 1995 who had published primers and conditions of an RT PCR for cIL 2 The cDNA generated under these conditions revealed total conformity with the sequence described by Dunham et al 1995 The expression of the cIL 2 protein by BHK cells should be controlled by the Tet on expression system So the cIL 2 cDNA and the reporter gene luciferase had to be integrated to the response plasmid pT RUE This was achieved by creating cutting sites for restriction enzymes in the non coding regions adjacent to the cIL 2 gene Digestion with these restriction enzymes created sticky ends Another verification of the cDNA sequence was performed which showed
185. r die Zusammenh nge und die beteiligten Zellpopulationen des Immunsystems gewonnen worden waren Allerdings wurden die ersten Beobachtungen bez glich des antitumoralen Potenzials k rpereigener Funktionen von dem New Yorker Chirurgen William B Coley bereits Ende des 19 Jahrhunderts gemacht Er bemerkte dass einige Patienten mit einer streptokokkeninduzierten Wundrose eine Regression ihrer Tumoren zeigten Coley 1893 und setzte gezielt eine Toxinmischung einen Extrakt aus Streptococcus und Serratia als begleitende Therapie z B bei Osteosarkom Patienten ein die zuvor chirurgisch behandelt wurden Coley 1907 Er machte jedoch antitumorale Effekte der Mikroorganismen selbst f r die Tumorregression verantwortlich Diese als Coleys Toxin bekannt gewordene Bakterienmischung galt lange Zeit als einzige systemische Behandlungsmethode von Tumoren und stellte das erste Tumorimmuntherapeutikum dar Davis et al 2003 Seit dieser Zeit hat die Immuntherapie von Tumoren deutlich an Bedeutung gewonnen Meilensteine waren dabei die Entdeckung von Tumorantigenen bei Melanomen Knuth et al 1989 oder die Erforschung dendritischer Zellen und ihrer Rolle in der Immunantwort Inaba et al 1990 Heute wird die Tumorimmuntherapie als adjuvante Therapie zur konventionellen Tumorbek mpfung oder auch als alleinige Therapie bei inoperablen Tumoren eingesetzt Dabei werden h ufig Tumorvakzinen oder auch monoklonale Antik rper gegen Oberfl chena
186. r into hepatoma cells with lipopolyamine condensed DNA particles presenting galactose ligands a stage toward artificial viruses Proc Natl Acad Sci US A 92 1744 1748 Rhoads C P 1946 Nitrogen mustards in treatment of neoplastic disease J Am Med Assoc 131 656 Rinck G Birghan C Harada T Meyers G Thiel H J Tautz N 2001 A cellular J domain protein modulates polyprotein processing and cytopathogenicity of a pestivirus J Virol 75 9470 9482 Rochlitz C F Jantscheff P Bongartz G Dietrich P Y Quiquerez A L Schatz C Mehtali M Courtney M Tartour E Dorval T Fridman W H Herrmann R 1998 Gene therapy with cytokine transfected xenogeneic cells in metastatic tumors Adv Exp Med Biol 451 531 537 Rosenberg A S Mizuochi T Singer A 1986 Analysis of T cell subsets in rejection of Kb mutant skin allografts differing at class I MHC Nature 322 829 831 Rosenberg S 1985 Lymphokine activated killer cells a new approach to immunotherapy of cancer J Natl Cancer Inst 75 595 603 Rosenberg S A 1991 Immunotherapy and gene therapy of cancer Cancer Res 51 5074s 5079s Rosenberg S A Lotze M T Muul L M Leitman S Chang A E Ettinghausen S E Matory Y L Skibber J M Shiloni E Vetto J T et al 1985 Observations on the systemic administration of autologous lymphokine activated killer cells and recombinant interleukin 2 to patients with metastatic cancer N
187. r sr er EAEE a 40 3 2 1 3 Isolierung des DNA Fragmentes u 220224420042nesnonnnennnennnennnennnnnnennnennnennnnsnensnensennnennnennennnen 41 3 2 2 Amplifizierung des Reportergens Luciferase und der IRES uurssessnessnesseesnennnennnennnennen 41 3 2 3 Klonierung und Analyse beider PCR Fragmente 22022202s0ssnernnennnesnennnensnennnennnennennnnnnen 42 3 2 3 1 T1galoN An ei nee een euere ale 42 3 2 3 2 Transformation der pGEM T Vektoren in E coli K12 DH5Q 22222essnersnennennnennennnennnn 43 3 2 3 3 Mini Pr paration der Plasmide pGEM T IL2 und pGEM T IRES aus Bakterienkulturen 44 3 2 3 4 Analytischer Verdau der Plasmide pGEM T IL2 und pGEM T IRES 0 44 3 2 3 5 Retransformation ausgew hlter PGEM T Klone 2u0224022002000sneennennnennnennnennennnennnennnnnnnn 45 3 2 3 6 Midi Pr paration der Plasmid DNA aus Bakterienkulturen und DNA Konzentrationsbestimmung isinisisi isisisi iiir e ooi 45 I Inhaltsverzeichnis 3 2 4 Sequenzierung des PGEM T IL2 1 Klons 202220222020042sesnonnnnsnnennnennnennnennennnennnennnnnnnnn 46 3 2 4 1 SEQUENZIETANSAtZ 4 2 ern rs sen E ea EAN une rndfene 47 3 2 4 2 Sequenziergel und Auswertung der Sequenz uuessesssessnessnssnnssnennnennnnsnnnsnennensnennnennnennennennnen 47 3 2 5 Zusammenbau des Plasmides PTRUE IL2 IRES u 222220020020nesnnennnennernnennnennnennnennennnennn 48 3 2 5 1 Restriktionsenzymverdad
188. rch Mutation verloren gehen k nnen so dass Antibiotika resistente Zellen kultiviert werden die kein funktionierendes Tet on System mehr in sich tragen Die weiteren Untersuchungen des produzierten cIL 2 wurde mit dem Klon A5 und seinen Reklonen durchgef hrt da das Luciferase Screening dieser Klone die h chste Proteinproduktion ergab Eine Grundvoraussetzung zur Synthese eines Proteins ist die daf r kodierende mRNA Ob die transfizierten BHK Zellen in der Lage sind nach Induktion des Tet on Systems mit Doxyzyklin die mRNA f r cIL 2 zu produzieren wurde in einer RT PCR berpr ft Hierf r war es wichtig nach der Isolierung der mRNA aus induzierten Zellen eine DNase Behandlung durchzuf hren um falsch positive Ergebnisse auszuschlie en da die DNA 124 Diskussion Sequenz f r cIL 2 in den Zellen vorhanden ist und diese nicht amplifiziert werden soll Als Negativkontrolle diente ein mRNA Extrakt aus nativen nicht transfizierten BHK Zellen In dieser RT PCR konnte in Zellen von induzierten Al und A5 Klonen die mRNA f r cIL 2 nachgewiesen werden In der Agarosegelelektrophorese zeigte sich jedoch bei dem Klon Al eine sehr schwache Bande Obwohl die RT PCR nicht als ein quantitatives Verfahren angesehen werden darf kann daraus geschlossen werden dass der Klon Al weniger cIL 2 mRNA als der Klon A5 enthielt Damit die Zelllinie BHK als cIL 2 Produzent eingesetzt werden konnte musste ausgeschlossen werde dass sie selbst Effek
189. rderung der Produktion durch das Fehlen von Doxyzyklin entspricht dem Verhalten im Tet off Expressionssystem Gossen et al 1995 Ein hnlicher Effekt wurde Diskussion 127 auch bei dem Luciferase Assay von Klon All beobachtet Der Unterschied zwischen dem Tet off und dem Tet on System liegt in einem Austausch von vier Aminos uren im Tetrazyklinrepressor ferR was zu einer Konformations nderung des Proteins und damit einem ver nderten Bindungsverhalten am Tetrazyklinoperator tetO f hrt Gossen et al 1995 Es ist allerdings unwahrscheinlich dass im Zuge der Kultivierung des Klons und seiner regelm igen Passagierung solch eine gravierende Mutation an der richtigen Stelle und damit eine Ver nderung der Aminos ureabfolge im rerR entstanden ist Die Ursache f r dieses Ergebnis ist somit unklar Untersuchungen zur cIL 2 Produktion des Klons A5 unter serumfreien Kulturbedingungen zeigten dass ohne Serumzusatz keine effektive cIL 2 Produktion stattfand Die serumfreien Ans tze produzierten hoch signifikant weniger cIL 2 als die serumhaltigen Der Serumzusatz des Mediums enth lt offensichtlich erforderliche Bestandteile wie etwa Aminos uren die zur Produktion von cIL 2 essentiell sind Eine serumfreie Produktion von cIL 2 w re zum Nachweis des cIL 2 Proteins beispielsweise im Western Blot w nschenswert Erste orientierende Versuche haben n mlich gezeigt dass cIL 2 an Serumalbumin bindet und so mit Hilfe dieses Nachweisverfa
190. ren Abschnitt verschiedene Motive auf die diese Rezeptoruntereinheit als Mitglied der Familie der H matopoetin Rezeptoren ausweisen Dazu z hlen vier konservierte Cystein Reste sowie das WSXWS Motiv einem Element aus Trp Ser Pro Trp Ser Diese B Kette ist ebenfalls Bestandteil weiterer Zytokin Rezeptoren z B des IL 15 Rezeptors Cornish et al 2006 Die y Rezeptoruntereinheit wird von einer Vielzahl an Zytokin Rezeptoren genutzt und daher auch als Common y chain ye bezeichnet Voss 1994 Auch sie tr gt extrazytoplasmatisch die Merkmale der H matopoietin Rezeptor Familie Zusammen mit dem zytoplasmatischen Abschnitt von IL 2R vermittelt sie die zytosolischen Signale die unter anderem in der Aktivierung der Janus Kinasen Jak 1 und Jak 3 sowie des Transkriptionsfaktors STATS liegen IL 2Ra ist besonders f r den IL 2 Kontakt zust ndig und besitzt nur eine kurze zytoplasmatische Dom ne ohne zellul re Signalfunktion IL 2Ra und IL 2R bernehmen die spezifische IL 2 Bindung des Rezeptorkomplexes zeigen jedoch alleine jeweils eine schwache Affinit t zu IL 2 w hrend y nicht in der Lage ist IL 2 zu binden Gabelf rmige IL 2 Rezeptoren aus IL 2RB und y mit einer mittleren IL 2 Affinit t werden konstitutionell unter anderem auf ruhenden T Zellen Makrophagen und NK Zellen exprimiert Nelson und Willerford 1998 Die Bindung von IL 2 an diese Rezeptorform induziert die streng kontrollierte Proteinsynthese von IL 2Ra ber den Trans
191. renden Abschnitt am 3 Ende flankiert wurde Das dadurch kodierte Protein wies eine L nge von 155 Aminos uren auf Literatur bersicht 17 2 7 Tetrazyklinabh ngige Expression von Genen Die gezielte Expression von Genen kann mit sogenannten On Off Systemen in vitro und in vivo erreicht werden Zabala et al 2004 Die Kontrolle von Genaktivit ten die durch verschiedene induzierbare eukaryotische Promotoren geregelt werden k nnen erfolgte lange Zeit durch verschiedene Verfahren wie Schwermetallionen Hitzeschock oder Hormone Gossen und Bujard 1992 Der Nachteil dieser Induktoren liegt jedoch in den teils unerw nschten zus tzlichen Effekten auf S ugerzellen wie bei der Induktion durch Glukokortikoidhormone sowie in der mitunter hohen basalen Expression des gew nschten Gens in den entsprechenden Systemen Durch die Entwicklung eines tetrazyklinabh ngigen Gen Expressionssystems Tet System durch Gossen und Bujard 1992 konnten diese Nachteile berwunden und ein graduell induzierbares System zur Genexpression geschaffen werden Die Vorteile von Tetrazyklin als Induktor liegen unter anderem darin dass Tetrazykline lipidl slich sind und so Lipidmembranen per diffusionem berwinden k nnen und dass die ben tigten Tetrazyklinkonzentrationen nicht in zytotoxischen Bereichen liegen Auflistung bei Zabala et al 2004 Die Genregulation im Tet System unterliegt also keinen pleiotropen Effekten oder unspezifischer Induktion Di
192. rfolgt unter Kulturbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten was gro e Schwankungen der IL 2 Konzentration im Zellkulturmedium zu Folge hat Die Bedingungen zur Erzeugung von LAK in vivo sehen jedoch anders aus Tul Zellen produzieren ber einen entsprechenden Zeitraum kontinuierlich Interleukin 2 bewirken also eine relativ konstante Aufrechterhaltung der IL 2 Konzentration Ziel dieser Arbeit war es eine Zelllinie molekularbiologisch so zu ver ndern dass sie permanent kanines Interleukin 2 cIL 2 in den Zellkultur berstand abgibt um so eine relativ konstante IL 2 Konzentration im Kulturmedium zu erreichen und damit in vivo Bedingungen 2 Einleitung m glichst nahe zu kommen Dazu wurde die mesenchymale Zelllinie BHK die im nativen Zustand keinerlei zytokin hnliche Substanzen sezerniert mit der cDNA Sequenz f r cIL 2 und dem Tet on Expressionssystem transfiziert In diesem Expressionssystem k nnen einklonierte Gene durch einen speziellen Schaltermechanismus angeschaltet also exprimiert werden Das Anschalten erfolgt durch die Zugabe von Doxyzyklin zum Zellkulturmedium Weiterhin sollte in dieser Arbeit die Menge und die biologische Aktivit t des so produzierten cIL 2 berpr ft werden Dazu wurde die IL 2 abh ngige Zelllinie CTLL 2 eingesetzt und deren Wachstums und Proliferationsverhalten in den cIL 2 haltigen berst nden der transfizierten BHK Zellen untersucht Der Einsatz der transfizierten BHK Zelllinie soll in der i
193. rmediums erzielt werden Wagner et al 1999 Mosmann 1983 konnte nachweisen dass die Menge an gebildeten Formazankristallen proportional zur Zellzahl ist Er zeigte auch dass aktivierte Zellen mehr Formazan produzierten als ruhende Die MTT Methode bestimmt also im Gegensatz zu anderen Testverfahren wie der H Thymidin Inkorporation TdR bei der radioaktiv markiertes Thymidin w hrend der Zellproliferation in neu synthetisierte DNA eingebaut wird die Zellzahl und aktivit t am Ende des Tests Der MTT Test stellt eine kosteng nstige und schnelle Alternative zur Proliferations berpr fung dar bei der in kurzer Zeit eine schnelle Probenzahl untersucht werden kann und die auf radioaktive Substanzen verzichtet Zum Einsatz kommt der MTT Test bei der berpr fung der Proliferation von Blutlymphozyten beim Menschen Niks et al 1990 und beim Hund Taura et al 1995 Mosmann 1983 etablierte ihn zur Quantifizierung der Proliferation von mitogenstimulierten Milzzellen der Maus Weitere Einsatzgebiete sind die Bestimmung des IL 2 Gehaltes anhand der Proliferation von IL 2 abh ngigen T Zelllinien Mosmann 1983 Denizot und Lang 1986 Sladowski et al 1993 und NK Zelllinien Tada et al 1986 sowie die Ermittlung der in vitro Zytotoxizit t von Tumortherapeutika Twentyman und Luscombe 1987 und von Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK Heo et al 1990 16 Literatur bersicht 2 6 RT PCR zur Amplifikation einer Copy DNA cDNA
194. rte Material und Methoden 45 Die Restriktionsans tze setzten sich folgenderma en zusammen Tabelle 10 Ans tze f r Restriktionsverdau der Plasmide pGEM T IL2 pGEM T IRES DNA siehe 3 2 3 3 2 ul 2 ul KpnI 10 U ul 0 5 ul Mlul 10 U ul 0 5 ul 0 5 ul PstI 20 U ul 0 5 ul Reaktionspuffer 1 ul OFA TaKaRa 1 ul Buffer 3 NEB GmbH Frankreich Frankfurt BSA 10 ug ul 0 5 ul ddH O 5 5 ul 6 ul Die Ans tze wurden gr ndlich gemischt und f r etwa 15 min bei 37 C inkubiert Die Analyse erfolgte durch Agarose Gelelektrophorese und Durchleuchtung siehe 3 2 1 2 3 2 3 5 Retransformation ausgew hlter pGEM T Klone Anhand der Ergebnisse der Gelelektrophorese wurden die Klone pGEM T IL2 1 und pGEM T IRES 2 zur weiteren Verarbeitung ausgew hlt Diese wurden zun chst retransformiert um so eine gr ere Menge an Plasmid DNA zu gewinnen Die Retransformation fand mit Hilfe des E coli Stammes K12 HB101 nach dem gleichen Schema wie unter 3 2 3 2 beschrieben statt allerdings gen gten hierf r 1 ul Plasmid L sung aus Mini Pr paration siehe 3 2 3 3 und 10 ul E coli Suspension Diese retransformierten Bakterien wurden auf einer Ampicillin haltigen LB Agarplatte ausplattiert und ber Nacht bei 37 C inkubiert Mit den gewachsenen Kolonien wurden am n chsten Tag jeweils 50 ml eines Ampicillin haltigen LB Mediums beimpft 3 2 3 6 Midi Pr paration der Plasmid DNA aus Bakterienkul
195. rte Medium abpipettiert und bei 400 x g f r 5 min zentrifugiert um eventuell vorhandene tote Zellen zu entfernen Zus tzlich wurde der berstand noch ber einen Spritzenfilter mit einer Maschenweite von 0 45 um Rotilabo Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe filtriert 68 Material und Methoden 3 4 1 2 3 Vorbehandlung f r 12 Stunden In einem der Ans tze wurden die Effektorzellen f r 12 h den berst nden von BHK Zellen ausgesetzt Dazu wurden die gewonnen Effektorzellen siehe 3 4 1 2 1 erneut aufgeteilt und eine H lfte f r 12 h in den Test berst nden siehe 3 4 1 2 2 im Brutschrank bei 37 C und in 5 iger CO2 Atmosph re inkubiert Die zweite H lfte der Effektorzellen diente als Kontrolle und wurde ber den gleichen Zeitraum unter gleichen Bedingungen in nicht vorbehandeltem sterilem RPMI FKS kultiviert 3 4 2 Durchf hrung des Rose Bengal Assays RBA 3 4 2 1 Vorbereitung der CTAC Zielzellen Die CTAC Zielzellen wurden zun chst wie unter 3 4 1 1 beschrieben vorbereitet Anschlie end wurden die Zellen gez hlt und auf eine Konzentration von 1 5 x 10 Zellen ml eingestellt Von dieser Suspension wurden 100 ul in je eine Vertiefung einer 96 Loch Flachboden Platte Falcon Becton Dickinson Heidelberg einges t und f r acht Stunden im Brutschrank inkubiert so dass die Zellen am Plattenboden anhaften konnten Danach wurden die Effektorzellen zugegeben 3 4 2 2 Testansatz Von der auf 1 x 10 Zellen ml eingest
196. s Reportergens Die Expression des Reportergens Luciferase wurde mit Hilfe des Kits Luciferase Assay System Promega Madison USA durchgef hrt Das Enzym Luciferase katalysiert mit Hilfe des Kosubstrats ATPeMg die Oxidation des Substratmolek ls Luciferin zu Oxyluciferin Die chemische Energie dieser Oxidation wird durch Elektronen berg nge als Lichtimpuls emmittiert Diese Lichtimpulse werden als dimensionslose Werte angegeben Das Luciferase Assay System nutzt zus tzlich Koenzym A CoA f r eine verbesserte Kinetik dieser Enzymreaktion Material und Methoden 57 Die Arbeitsschritte erfolgten nach Herstellerangaben 24 h nach Transfektion und Induktion wurde die Zellen zun chst lysiert Dazu wurde der mitgelieferte 5X Lysis Puffer mit H2Odd im Verh ltnis 1 4 gemischt Das Kulturmedium der Zellen wurde abgesaugt und der Monolayer einmal mit PBS gewaschen Anschlie end wurden 400 ul 1X Lysis Puffer pro Well einer 6 Well Platte zugegeben und f r 5 min bei Raumtemperatur inkubiert Durch mehrfaches Auf und Abpipettieren wurden die Zellen danach abgel st in ein Eppendorfgef berf hrt und auf Eis zwischengelagert Nachdem das Gemisch f r 10 15 s gevortext wurde schloss sich eine Zentrifugation f r 15 s bei 12 000 x g und Raumtemperatur an Der berstand wurde in ein neues Eppendorfgef berf hrt und bis zur Messung der Luciferaseaktivit t auf Eis gelagert 3 2 6 4 Luciferase Assay am Luminometer
197. s geschah aus IL 2 produzierenden kaninen Lymphozyten Hierf r wurde auf Blutlymphozyten des Hundes aus folgenden Gr nden zur ckgegriffen Erstens ist ihre Gewinnung durch Venenpunktion wesentlich einfacher und ohne erhebliche invasive Ma nahmen durchzuf hren im Vergleich zur Gewinnung von Lymphozyten aus lymphatischen Organen wie Lymphknoten oder Milz Zweitens gab es in unserer Arbeitsgruppe bereits gro e Erfahrung mit der Isolierung von Hundeblutlymphozyten und mit ihrer optimalen Mitogenstimulation Gondolf 1994 Gondolf et al 1996 Wagner 1998 Die Isolierung von Lymphozyten aus Vollblut erfolgt meist durch Zentrifugation ber verschiedene Dichtegradienten So wird f r die Anreicherung humaner Lymphozyten Ficoll Hypaque verwendet was sich jedoch f r die Isolierung von Hunde Lymphozyten als weniger geeignet erwiesen hat Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe Gondolf 1994 zeigten dass die Isolierung ber eine Percoll Gradientenl sung wesentlich bessere Ergebnisse liefert So konnte die h chste Reinheit an Lymphozyten bei einer Zentrifugation mit einem Percoll Anteil von 57 5 und einer Dichte von 1 072 g ml erzielt werden Im Vergleich zu einem 58 5 igen Percoll Gradienten mit welchem insgesamt 11 5 x 10 Zellen ml gewonnen wurden konnten zwar nur insgesamt 9 9 x 10 Zellen ml isoliert werden der Anteil an Lymphozyten war bei diesem 57 5 igen Percoll Gradienten jedoch mit 76 55 um etwa 15 h her denn bei d
198. sk vetten bei einer Wellenl nge von 260 nm dem Absorptionsmaximum von Nukleins uren im Photometer Gene Quant II RNA DNA Calculator Pharmacia Biotech GmbH Freiburg gemessen Material und Methoden 63 3 3 3 Ablauf der RT PCR Eine RT PCR erm glicht den Nachweis bestimmter RNA Abschnitte Da sich RNA nicht direkt durch Einsatz der PCR amplifizieren l sst muss diese vorab in eine cDNA umgeschrieben werden Dies wird durch die reverse Transkription mit einer reversen Transkriptase erreicht Um jedoch zu gew hrleisten dass durch die PCR keine DNA amplifiziert wird die sich in dem RNA Isolat befinden kann erfolgte zun chst eine DNase Vorbehandlung 3 3 3 1 DNase Vorbehandlung Zu den drei RNA Isolaten wurden jeweils 2 5 ul RNase freie DNase I Roche Diagnostics GmbH Mannheim sowie 6 ul NEB 1 Puffer NEB GmbH Frankfurt und RNase freies ddH gt O ad 60 ul zugegeben und der Ansatz f r 45 min bei 37 C inkubiert Um Reste des Enzyms und der Puffersalze zu entfernen erfolgte anschlie end eine Phenol Chloroform Extraktion zur Aufreinigung der RNA Dazu wurde zun chst das Volumen des Ansatzes mit RNase freiem ddH2O auf 100 ul eingestellt Nach der Zugabe von 100 ul Roti Phenol Chloroform Gemisch 1 1 Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe und gutem Durchmischen erfolgte eine Zentrifugation bei 11 000 x g f r 5 min Die obere Phase wurde danach in ein frisches steriles Reaktionsgef berf hrt und mit 250 ul absolutem Ethanol
199. static renal cell carcinoma J Urol 147 344 348 Hussain M A Lee J Miller C P Habener J F 1997 POU domain transcription factor brain 4 confers pancreatic alpha cell specific expression of the proglucagon gene through interaction with a novel proximal promoter G1 element Mol Cell Biol 17 7186 7194 Inaba K Metlay J P Crowley M T Witmer Pack M Steinman R M 1990 Dendritic cells as antigen presenting cells in vivo Int Rev Immunol 6 197 206 Inukai T Zhang X Goto M Hirose K Uno K Akahane K Nemoto A Goi K Sato H Takahashi K Honna H Kagami K Nakamoto K Yagita H Okumura K Koyama Okazaki T Nakazawa S Sugita K 2006 Resistance of infant leukemia with MLL rearrangement to tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand a possible mechanism for poor sensitivity to antitumor immunity Leukemia 20 2119 2129 Literaturverzeichnis 141 Jardine J H Jackson H J Lotzova E Savary C A Small S M 1989 Tumoricidal effect of interleukin 2 activated killer cells in canines Vet Immunol Immunopathol 21 153 160 Jovic V Konjevic G Radulovic S Jelic S Spuzic I 2001 Impaired perforin dependent NK cell cytotoxicity and proliferative activity of peripheral blood T cells is associated with metastatic melanoma Tumori 87 324 329 Karre K Ljunggren H G Piontek G Kiessling R 1986 Selective rejection of H 2 deficient lymphoma vari
200. t Anschlie end erfolgte die Zugabe von jeweils 200 ul Puffer 2 200 mM NaOH Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe 1 w v SDS ICN Eschwege und ein weiteres Sch tteln f r 5 min bei Raumtemperatur Nach der Zugabe von 200 ul Puffer 3 2 8 M Kaliumacetat pH 5 1 Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe und griindlichem Mischen folge eine erneute Zentrifugation bei 16 000 x g fiir 10 min bei 4 C Die w ssrige Phase wurde danach abpipettiert und in 500 ul Isopropanol Carl Roth GmbH und Co Karlsruhe aufgenommen wodurch die Plasmid DNA gefallt wurde Es schloss sich eine Zentrifugation bei 16 000 x g und 4 C fiir 20 min an Die Pellets wurden nach dem Waschen mit 200 ul 70 v v Ethanol Fluka Buchs Schweiz auf einem Heizblock bei etwa 45 C getrocknet und anschlie end in 50 ul ddH2O resuspendiert 3 2 3 4 Analytischer Verdau der Plasmide pGEM T IL2 und pGEM T IRES Sowohl die sechs isolierten pGEM T IL2 Klone als auch die sechs Klone von pGEM T IRES wurden mit Restriktionsendonukleasen verdaut um den korrekten Einbau der Inserts zu berpr fen F r den Verdau von pGEM T IL2 wurden die Enzyme KpnI und Mlul beide NEB GmbH Frankfurt verwendet wonach ein Fragment von etwa 473 bp cIL 2 Insert und ein ca 3 kbp gro es Fragment Vektor erwartet wurde Danach wurde pGEM T IRES mit Mlul und PstI beide NEB GmbH Frankfurt verdaut was zu einem Fragment von etwa 2 5 kbp IRES Luciferase Konstrukt und ebenfalls zu einem Vektorrest von 3 kbp f h
201. t RPMI FKS RPMI OD 2 Messung 0 002 0 002 0 003 0 004 0 005 0 002 OD 2 Messung 0 000 0 000 0 001 0 002 0 003 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 003 0 002 0 000 0 003 0 002 0 000 ODI Mess ng 0 003 0 002 0 000 0 003 0 002 RPMI FKS leerwertbereinigt RPMI Doxyzyklin OD 2 Messung 0 001 0 001 0 002 0 004 0 003 0 002 OD 2 Mess ng 0 001 0 001 0 000 0 002 0 001 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 003 0 004 0 002 0 003 0 002 0 000 OD 1 Messung 0 003 0 004 0 002 0 003 0 002 RPMI leerwertbereinigt RPMI FKS Doxyzyklin OD 2 Messung 0 001 0 001 0 002 0 002 0 004 0 002 OD 2 Mess ng 0 001 0 001 0 000 0 000 0 002 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 000 0 002 0 002 0 002 0 001 0 000 OD 1 Messung 0 000 0 002 0 002 0 002 0 001 leerwertbereinigt RPMUFKS RPMI FKS OD 2 Messung 0 001 0 001 0 002 0 004 0 003 0 002 OD 2 Messung 0 001 0 001 0 000 0 002 0 001 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 008 0 008 0 008 0 007 0 007 0 000 Ea E E 0 008 0 008 0 008 0 007 0 007 gt RPMUFKS 2 Doxyzyklin OD 2 Messung 0 008 0 010 0 009 0 008 0 008 0 002 OD 2 Messung 0 006 0 008 0 007 0 006 0 006 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 014 0 017 0 021 0 018 0 017 0 000 ea ee 0 014 0017 0 021 0018 0 017 RPMI FKS Doxyzyklin OD 2 Messung 0 017 0 019 0 020 0 021 0 015 0 002 OD 2 Messung 0 015 0 017 0 018 0 019 0 013 leerwertbereinigt 180 Anhang Tabelle 50 Messwerte zu Tabelle 33 Doxyzyklin Leerwer
202. t konzentration OD 1 Messung 0 007 0 005 0 006 0 006 0 012 0 002 OD 1 Mesune 0 005 0 003 0 004 0 004 0 010 leerwertbereinigt 0 1 ug ml OD 2 Messung 0 007 0 004 0 005 0 006 0 009 0 003 OD 2 Messung 0 004 0 001 0 002 0 003 0 006 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 023 0 025 0 022 0 022 0 019 0 002 OP Fe Mess ng 0 021 0 023 0 020 0 020 0 017 leerwertbereinigt 0 5 ug ml OD 2 Messung 0 024 0 027 0 020 0 024 0 024 0 003 OD Messung 0 021 0 024 0 017 0 021 0 021 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 023 0 027 0 022 0 024 0 023 0 002 OD 1 Messung 0 021 0 025 0020 0 022 0 021 leerwertbereinigt 1 0 ug ml OD 2 Messung 0 023 0 027 0 027 0 028 0 025 0 003 OD 2 Messung 0 020 0 024 0 024 0 025 0 022 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 025 0 021 0 022 0 023 0 023 0 002 OPEL Messung 0 023 0 019 0 020 0 021 0 021 leerwertbereinigt 2 5 ug ml OD 2 Messung 0 023 0 020 0 022 0 022 0 022 0 003 OD gt Messung 0 020 0 017 0 019 0 019 0 019 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 019 0 019 0 017 0 018 0 018 0 002 OD 1 Messung 0 017 0 017 0 015 0 016 0 016 leerwertbereinigt 5 0 ug ml OD 2 Messung 0 020 0 021 0 022 0 020 0 019 0 003 OD 2 Messune 0 017 0 018 0 019 0 017 0 016 leerwertbereinigt OD 1 Messung 0 008 0 005 0 003 0 006 0 004 0 002 OD 1 Messung 0 006 0 003 0 001 0 004 0 002 leerwertbereinigt 10 0 ug ml OD 2 Messung 0 007 0 005 0 004 0 006 0 006 0 003 OD 2 Messung 0 004 0 002 0 001 0 003 0 003 leerwertbereinigt
203. t 1000 bp Kilodalton atomare bzw molekulare Ma einheit Lymphokin aktivierte Killerzellen Luria Bertani Medium Large Granular Lymphocyte gro er granulierter Lymphozyt Abk rzungsverzeichnis MEME MTP MTT NCR NK OD ORF PAC PBL PBS PCR pEF PHA Pro pTRUE RBA rcIL 2 rhIL 2 rIL 2 RPMI RT rtetR RT PCR rtTA SEB Ser SI STAT TBE TCGF TCR tetO Tet off Tet on tetR Tyl TNF Minimum Essential Medium Eagle s mit Earl s Salzen Gewebekulturmedium Mikrotiterplatte 96 Loch Platte Methylthiazol Tetrazolium Natural Cytotoxicity Receptors zusammenfassende Bezeichnung f r aktivierende Rezeptoren und Korezeptoren zur Vermittlung zytotoxischer Funktionen von NK Zellen Nat rliche Killerzellen Optische Dichte Open Reading Frame Offener Leserahmen Puromycin Selektionsantibiotikum Periphere Blutlymphozyten Phosphate Buffered Salin Phosphat gepufferte Salzl sung Polymerase Chain Reaction Polymerase Kettenreaktion Regulator Plasmid im Tet on System tr gt den Promotor Human Elongation Factor 1a Phytoh magglutinin Prolin Response Plasmid im Tet on System Rose Bengal Assay Rekombinantes kanines Interleukin 2 Rekombinantes humanes Interleukin 2 Rekombinantes Interleukin 2 Roswell Park Memorial Institut Gewebekulturmedium Raumtemperatur Reverser Tetrazyklinrepressor Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion Reverser tetrazyklinkontrollierter Transaktivator Staphylok
204. tTA reverser tetrazyklinabh ngiger Transaktivator an den Tetra oder Doxyzyklin binden kann Das zweite Plasmid Response Plasmid tr gt die Erkennungssequenz f r den Material und Methoden 49 rtTA Doxyzyklin Komplex Tetrazyklin Responsive Element bzw Tetrazyklinoperator gefolgt von einem Promotor und der Gensequenz des gew nschten Proteins hier cIL2 sowie das IRES Luciferase Konstrukt Als Response Plasmid wurde hier das Plasmid pTRUE verwendtet ein am Institut f r Virologie Fachbereich 10 der Justus Liebig Universit t Giessen modifizierter pTRE Vektor Clontech Laboratories Inc USA Durch eine Dreifachligation siehe Schema 4 von pTRUE der Gensequenz f r cIL 2 und des IRES Luciferase Konstruktes wurde das Response Plasmid pTRUE IL2 IRES hergestellt pTRUE IRES Luciferase pTRUE KpnI Mlul PstI Schema 4 Klonierungsstrategie f r pTRUE IL2 IRES und hierbei verwendete Restriktionsenzyme 3 2 5 1 Restriktionsenzymverdau Um die drei Abschnitte im Rahmen einer Dreifach Ligation verbinden zu k nnen musste zun chst ein Verdau mit Restriktionsenzymen erfolgen um die gew nschten Fragmente aus den pGEM T Plasmiden auszuschneiden Dazu wurden Restriktionsenzyme gew hlt die auf beiden Seiten der DNA Fragmente kompatible 5 oder 3 berh nge brig lie en sticky ends Auf diese Weise konnte die intramolekulare Religation der Vektor DNA reduziert und der Einbau der Fragmente in der gew nschten Orien
205. te auf Zellen mit spontaner zytotoxischer Aktivit t aus bt also Faktoren mit stimulierender oder blockierender Wirkung auf Effektorzellen in das Kulturmedium abgibt Die sp ter koinkubierten Effektorzellen sollen lediglich ber das produzierte cIL 2 stimuliert werden Um dies zu berpr fen wurden Effektorzellen den berst nden von nativen nicht transfizierten BHK Zellen ausgesetzt und daraufhin ihre Zytotoxizit t in einem Rose Bengal Assay RBA berpr ft In einem der beiden durchgef hrten Versuche wurden frisch isolierte Effektorzellen und Zielzellen in den BHK berst nden inkubier Als Kontrolle wurde frisches Zellkulturmedium statt BHK berstand verwendet Die Zytotoxizit t in den Test berst nden lag mit 54 praktisch genauso hoch wie die der Kontrollans tze mit 55 In dem zweiten Versuchsansatz wurden frisch isolierte Effektorzellen zun chst f r 12 h in Kultur berst nden nativer BHK Zellen inkubiert Sie lie en danach keine Zytotoxizit t erkennen Im Kontrollansatz aus Zellen die f r 12 h in regul rem Zellkulturmedium inkubiert worden waren lag die Zytotoxizit t auch nur bei 10 In beiden F llen ist also ein deutlicher R ckgang der zytotoxischen Aktivit t zu erkennen gewesen Dies ist h chstwahrscheinlich auf eine Deaktivierung oder gar auf ein Absterben der Effektorzellen in der dem RBA vorgeschalteten Inkubation von 12 h Dauer zur ckzuf hren Eine Zellz hlung oder eine Lebend Tot Differenzierung konnte am
206. tete darauf hin dass die Ausgangsklone Al und A5 bereits relativ homogene Zellpopulationen hinsichtlich der Anzahl der ins Genom integrierten Plasmid Kopien und der Proteinexpression darstellten so dass Tochterpopulationen die auf einer einzigen Zelle dieser Ausgangspopulationen beruhten ein hnliches Expressionsmuster zeigten und daher keine gro en Unterschiede zu den Ursprungsklonen aufwiesen Der SI von Reklon A8 1 war lediglich etwa halb so gro wie der SI von A8 Hier wurde offenbar eine Zelle zum Ausgangspunkt der Reklon Linie die m glicherweise weniger pTRUE IL 2 Kopien enthielt als der Durchschnitt der heterogenen A8 Population Weiterhin wies A8 2 sowohl im induzierten als auch im nicht induzierten Zustand eine so geringe Menge an Luciferase auf dass diese Werte noch unter denen der Negativ Kontrolle lagen Es handelte sich hierbei um eine Zellpopulation die entweder auf eine nicht transfizierte BHK Zelle zur ckzuf hren ist oder in der ein Defekt im Tet on System aufgetreten ist Da die Transfektionen von Regulator und Response Plasmid durch die bertragung von Antibiotika Resistenzen kontrolliert und die entsprechend erfolgreich transfizierten Zellen durch Antibiotika Zus tze zum Zellkulturmedium selektiert werden ist dieses Ereignis zwar ungew hnlich jedoch nicht auszuschlie en Es ist durchaus m glich dass die Antibiotika Resistenzen bei der Zellteilung weiter gegeben werden jedoch essentielle Teile des Tet on Systems du
207. thelkarzinomen sowie alle Hunde mit Mastzelltumoren wiesen in dieser Studie eine teilweise Regression der Neubildungen auf Dow et al 1998 untersuchten die in vivo Transfektion von Tumorzellen mit dem Gen f r cIL 2 Dazu injizierten sie Vektoren die das Gen des Staphylokokken Enterotoxins B SEB und entweder das cIL 2 Gen oder eine f r GM CSF kodierende DNA enthielten als 8 Literatur bersicht Lipidkomplexe in den Tumor und das umliegende Gewebe sowie in einigen F llen auch in den region ren Lymphknoten Von den 26 behandelten Hunden mit malignen Melanomen zeigten 12 eine komplette oder partielle Remission der Tumoren Nebenwirkungen waren kaum zu beobachten und beschr nkten sich auf vereinzelt lokale deme an der Injektionsstelle und eine vor bergehende Anorexie Weiterhin untersuchten Dow et al 2005 die intraven se Applikation von cIL 2 DNA Liposom Komplexen bei Hunden mit Lungenmetastasen von Osteosarkomen Sie fanden unter anderem eine gesteigerte Aktivit t der NK Zellen sowie eine erh hte cIL 2 Konzentration im Lungenparenchym Drei von 20 Hunden zeigten eine Tumorregression Bei allen behandelten Hunden war die mittlere berlebenszeit deutlich verl ngert Einen hnlichen Therapie Ansatz unternahmen Thamm et al 2003 Sie konstruierten einen Expressionsvektor der f r das Staphylokokken Enterotoxin A und f r cIL 2 kodierte und injizierten diesen in das Tumorgewebe Untersucht wurden 16 Hunde mit Weichteilsarkomen
208. tierung sichergestellt werden Hier wurden die Enzyme Kpnl Mlul und Pstl ausgew hlt die die folgenden Erkennungssequenzen und Schnittstellen charakterisieren 50 Material und Methoden Kpnl Mlul Pstl 5 kd W 5 3 5 3 G GTAQCC 3 C ICATGG A CGCGT 3 T GCGQA C TGCAIC 3 G ACGTG Die Verdauans tze bestanden aus folgenden Komponenten Tabelle 12 Ans tze zum Restriktionsverdau pTRUE pGEMT IL2 1 pGEMT IRES 2 DNA 3 ug 21 5 ul 6 2 ul 3 2 ul KpnI 10 U ul 2 0 ul 2 5 ul Mlul 10 U ul 2 5 ul 1 5 ul PstI 20 U ul 1 5 ul 0 5 ul Scal 10 U ul 1 5 ul Puffer 7 0 ul Buffer 1 5 ul OFA 10 ul TaKaRa H NEB GmbH Frankfurt TaKaRa Frankreich TaKaRa Frankreich BSA 10 pg pl 0 5 ul 0 5 ul 0 5 ul H 0 37 5 ul 33 3 ul 82 8 ul Diese Ans tze wurden gr ndlich gemischt und f r 15 min bei optimaler Temperatur inkubiert Das Plasmid pGEMT IRES 2 wurde zus tzlich mit dem Restriktionsenzym Scal MBI Fermentas St Leon Roth geschnitten um die Gr e des verbleibenden Vektorrests weiter zu reduzieren Dadurch war das Ausschneiden des IRES Luciferase Fragments aus dem nachfolgenden pr parativen Agarose Gel leichter da der ungeschnittene Vektor mit etwa 3 kbp und das Fragment mit etwa 2 5 kbp relativ dicht beieinander lagen Material und Methoden 51 Die drei zu kombinierenden Fragmente wurden mit Hi
209. tis contagiosa canis Leptospirose Parvovirose Staupe und Tollwut geimpft Der H ndin wurden mit Hilfe von 18 G Kan len Becton Dickinson Heidelberg 40 ml Blut aus der Vena jugularis in sterile 10 ml NH Heparinr hrchen Sarstedt N mbrecht entnommen Die Verarbeitung des Blutes erfolgte unmittelbar nach der Entnahme Mittels des Advia 120 Hematology System Bayer Diagnostics M nchen wurden in der Klinik f r Kleintiere Abteilung Innere Medizin ein rotes und ein wei es Blutbild der Probe erstellt sowie die absoluten Zellzahlen ermittelt Die Isolierung der Lymphozyten aus dem Heparinblut erfolgte ber eine Gradientenl sung aus Percoll Pharmacia Fine Chemicals Uppsala Schweden mit einer spezifischen Dichte von 1 072 g ml Dazu wurden nach Angaben des Herstellers neun Teile Percoll mit einem Teil steriler 1 5 M NaCl L sung zu einer Stamml sung mit einer spezifischen Dichte von 1 119 g ml gemischt Durch Verd nnung mit sterilem Gewebekulturmedium RPMI 1640 PAA Laboratories GmbH C lbe dem 1 Penicillin 10 000 U ml und 1 Streptomycin 10 000 ug ml beides Biochrom KG Berlin zugegeben wurden und das im Folgenden als RPMI 1640 28 Material und Methoden bezeichnet wird wurde eine Gebrauchsl sung mit einem Percoll Anteil von 57 5 entspricht einem spezifischen Gewicht von 1 072 g ml hergestellt Das Heparinblut wurde im Verh ltnis 1 3 mit sterilem RPMI 1640 Medium verd nnt und in 5 ml Portionen in st
210. tlicher Praxis wie sie in der Satzung der Justus Liebig Universit t Giessen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis niedergelegt sind eingehalten Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung sscsersesnesnsesnesnsnssnesnsnssnennsnesnennsnesnennsnesnennsnesnennsnensnsnssnenssnssnennsnssnesnsnssnesnsnesnsnnsnesnssnnne 1 2 Literatur bersicht er0e0orsesnesnssesnesnenssnesnsnssnesnsnssnennsnesnenssnesnennsnennenssnennsnnsnennssssnensnsnssnennsnnenennne 3 2 1 Lumorimm ntherapie 2 22 25 2 arse iis bes cosdeate due chcnee ocean A bs deere ee nike 3 2 1 1 Adoptive Tumorimmuntherapie mit IL 2 und Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK beim Menschen ccccccccccccesssssssceecceeeesssseceeccceeessssceececeeesnsnseeeeeceesensnseeees 4 2 1 2 Adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund 000 0 eee eescceeseeceseeeeeeeesneeeseeeesnecesaeeesneeenaeeeseeeeaeees 7 2 2 Interleukin 2 1 2 2 4 2 edss oh aed a doves a a e a a von wees b 9 2 2 1 Charakteristika des Gens und des Proteins 0 cece eseeseeeseesseeseeeeeeseceseseeeseeeaeeesecnsessseeeeeaeees 9 22 2 II 2 Rezeptor 2 22 ak e aaa T a E O tern 10 2 2 3 Wirkung Von TE 2 3 4 2 0sabeaeisuneseielsinkttekneEis iii 11 2 3 Lymphozytenanteicherung aicsin ienris e 1m ei REhRban 12 2 4 Stimulation von kaninen Lymphozyten uurssesssessnessnesnnennennnennnennnnnnonsnensnensnennnennannnennennnen 13 2 3 Proliferationstest mit Methylthiazol Tetrazo
211. ture of IL 2 Science 257 410 413 Belldegrun A Webb D E Austin H A 3rd Steinberg S M White D E Linehan W M Rosenberg S A 1987 Effects of interleukin 2 on renal function in patients receiving immunotherapy for advanced cancer Ann Intern Med 106 817 822 Berens C Hillen W 2003 Gene regulation by tetracyclines Constraints of resistance regulation in bacteria shape TetR for application in eukaryotes Eur J Biochem 270 3109 3121 Bettex Galland M Studer U E Walz A Dewald B Baggiolini M 1991 Neutrophil activating peptide 1 interleukin 8 detection in human urine during acute bladder inflammation caused by transurethral resection of superficial cancer and bacillus Calmette Guerin administration Eur Urol 19 171 175 Binkley G E 1929 Radiation in the Treatment of Rectal Cancer Ann Surg 90 1000 1014 Birnboim H C Doly J 1979 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic Acids Res 7 1513 1523 Boyce N 2001 Trial halted after gene shows up in semen Nature 414 677 Boyum A 1968 Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood Isolation of monuclear cells by one centrifugation and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g Scand J Clin Lab Invest Suppl 97 77 89 136 Literaturverzeichnis Brittenden J Heys S D Ross J Eremin O 1996 Natural killer cells and cancer Cancer 77 1226
212. turen und DNA Konzentrationsbestimmung Zur Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterienkulturen im gr eren Ma stab zum Zwecke der weiteren Verwendung wurde das NucleoBond PC100 Kit mit Anionen Austauscher S ulen und mitgelieferten Puffern Macherey Nagel GmbH amp Co KG D ren nach Angaben des Herstellers verwendet Das so gewonnene Plasmid DNA Pellet wurde in 210 ul ddH2O aufgel st 46 Material und Methoden Um den DNA Gehalt einer L sung zu bestimmen wurde die UV Absorption der verd nnten L sung in Quarzglask vetten bei einer Wellenl nge von 260 nm dem Absorptionsmaximum von Nukleins uren im Photometer Gene Quant II DNA RNA Calculator Pharmacia Biotech GmbH Freiburg gemessen Die Analyse der retransformierten Plasmide erfolgte durch erneuten Restriktionsenzymverdau wie in 3 2 3 4 beschrieben wof r jedoch 200 ng Plasmid DNA aus der Midi Pr paration eingesetzt wurden 3 2 4 Sequenzierung des pGEM T IL2 1 Klons Da das einklonierte Fragment von cIL 2 zur sp teren Transskription und Translation in ein biologisch aktives Protein vorgesehen waren musste durch eine erneute Sequenzierung die korrekte Basensequenz berpr ft werden Auf die berpr fung der Sequenz des IRES Luciferase Konstruktes wurde zun chst verzichtet Sie erfolgte sp ter anhand des Nachweises der funktionellen Aktivit t dieser Abschnitte Die Ermittlung von DNA Sequenzen erfolgte nach der Kettenabbruch Methode nach Sanger Sanger et
213. ucht Der Klon A5 zeigte dabei einen kontinuierlichen Anstieg der sezernierten rcIL 2 Menge Grafik 7 Tabelle 29 Diese stieg von 20 54 ng rcIL 2 ml nach 24 h auf 38 37 ng rcIL 2 ml Nach 72 h betrug die produzierte Menge rcIL 2 52 23 ng ml Die in dieser Zeit produzierte basale rcIL 2 Konzetration lag zwischen 0 18 ng und 0 51 ng ml Die Induktion der rcIL 2 Sekretion war zu allen drei Zeitpunkten signifikant p 0 008 Klon A5 70 E gt 60 c z 50 2 w 40 Duninduziert S 30 O induziert 5 g 205 a 10 GS 0 S 24h 48 h 72h Grafik 7 Mittelwerte und Standardabweichungen n 5 der produzierten rcIL 2 Konzentrationen des BHK Klons A5 nach 24 h 48 h und 72 h eingesetzte Zellkonzentration 1 5 x 10 Zellen ml Ergebnisse 113 Die Verlaufsstudie des BHK Klons A5 1 ber 72 h ergab nach 72 h eine maximale rcIL 2 Menge von 3 58 ng ml Grafik 8 Tabelle 30 Nach 48 h war mit 1 19 ng rcIL 2 ml eine geringere Konzentration messbar als nach 24 h Hier lag der Wert bei 2 29 ng rcIL 2 ml Wieder zeigte sich in allen drei F llen eine Signifikanz zu den uninduziert sezernierten rcIL 2 Mengen p 0 008 Klon A5 1 O uninduziert O induziert rclL 2 Konzentration in ng ml 24h 48h 72h Grafik 8 Mittelwerte und Standardabweichungen n 5 der produzierten rcIL 2 Konzentrationen des BHK Klons A5 1 nach 24 h 48 h und 72 h eingesetzte Zellkonzentratio
214. uffer 6X ABgene Hamburg gemischt und in die Taschen des Gels einpipettiert Um die Gr e der PCR Amplifikate bestimmen zu k nnen wurde zus tzlich ein 100 bp Gr enmarker Superladder Low 100bp Ladder ABgene Hamburg verwendet Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei einer Spannung von 6 V cm und einer Stromst rke von 500 mA f r 42 min Microcomputer Electrophoresis Power Supply Consort Belgien Zur Visualisierung mittels Durchlicht wurde das Gel auf einem UV Transilluminator UV Transilluminator 312 nm Vilber Lourmat Torcy Frankreich bei einer Wellenl nge von 312 nm betrachtet Anschlie end wurde das Agarose Gel fotografiert wozu das Instant Camera System Polaroid MP4 mit 667 Schwarz Wei ISO3000 36 Instantfilm Kassetten Photo Bessier Wiesbaden verwendet wurde Die Belichtungszeit betrug bei Blende 5 6 1 Sekunde Material und Methoden 35 3 1 5 6 Sequenzierung des RT PCR Produktes Die berpr fung der Sequenz stellte sich als essentiell heraus da potentielle Lesefehler der Polymerase zu einer falschen Basenfolge und folglich zu einem fehlerhaften cIL 2 Protein f hren k nnten Das PCR Fragment wurde zur berpr fung der korrekten Basenfolge sequenziert Dies erfolgte bei SeqLab Sequence Laboratories G ttingen GmbH G ttingen mit einem Aliquot des PCR Ansatzes sowie den beiden unter 3 1 5 2 beschriebenen Primern f r cIL 2 3 1 6 Klonierung des RT PCR Produktes Das sequenzierte PCR Produkt wur
215. ufgetragen Das House Keeping Gene GAPDH das zur berpr fung des korrekten Ablaufs der RT PCR und zur Kontrolle der Nukleins ure Integrit t in den gleichen Arbeitsschritten mit amplifiziert wurde befindet sich in Bahn 4 Bahn 5 stellt die Negativ Kontrolle dar hier wurde keine Nukleins ure in die RT PCR eingesetz 700 bp 500 bp 300 bp 100 bp Abbildung 8 Agarosegel nach der RT PCR zur Ampifizierung der cDNA von cIL 2 Bahn 1 und Bahn 6 100 bp Gr enmarker Bahn 2 und 3 cIL 2 cDNA Bahn 4 GAPDH Bahn 5 Negativkontrolle Ergebnisse 83 4 1 4 Sequenzierung des RT PCR Produktes Die Sequenzierung des Produktes aus der RT PCR wurde bei SeqLab Sequence Laboratories G ttingen GmbH G ttingen durchgef hrt Die Auswertung der ermittelten Sequenz erfolgte mit den Programmen Chromas 2 3 Technelysium Pty Ltd ClustalW EMBL EBI Cambridge Gro britannien und GeneDoc 2 6 003 Multiple Sequence Alignment Editor amp Shading Utility 1997 Der Vergleich der von SeqLab ermittelten Sequenz des PCR Produktes mit der cIL 2 Sequenz die Dunham et al 1995 ver ffentlichten zeigt eine hundertprozentige bereinstimmung beider Sequenzen Abbildung 9 In der von diesen Autoren angebenen Sequenz befindet sich zwischen Position 32 und 91 ein Signalpeptid mit dem Startcodon ATG an Position 32 33 und 34 Im Anschluss daran folgt die 405 Basen lange f r cIL 2 codierende Region die mit dem Stopcodon TGA
216. ufreinigung des Plasmids pTRUE IL 2 IRES 00 eee eeeeeeeeeee 58 3 2 7 3 Stabile Transfektion mit Metafecteme uuunnsnssessnessnessnesnnnsnnsnnennnennnesnnennnnnnennnennnennnennnnnnan 58 3 2 7 4 Klonierung der transfizierten Zellen moraine ronen e EE REE E R 59 3 2 7 5 Luciferase Assay und Auswahl der Klon Kolonien esesssessesseesresseseserresresrestesresresrsrenresresrese 60 3 2 7 6 Reklonier ns e 2 22 E E A E IE E E h 60 3 2 8 Kryokonservierung der gewonnenen Zell Klone essssesserssrssesseeresrerrssrsresresresresrssrssrsresresees 60 3 3 RT PCR zum Nachweis der cIL2 mRNA in den transfizierten BHK Zellen 61 3 3 1 Vorbereitung und Induktion der transfizierten BHK Zellen u22002200sn0snnernnennnenneennen 61 3 3 2 RNA Pr paration und Konzentrationsbestimmung urssesssessessnessnersnennnennensnennnennnennnennnnnnen 62 3 3 3 Ablauf der RT PCR ic sectiscd een een an en 63 3 3 3 1 DNase Vorbehandlung 20 astra 63 3 3 3 2 Denat rierung z r raesn ker areas E en Ra Ebn ar 64 3 3 3 3 CDNA Synthese u ee arena nenn Reiters iin 64 3 3 3 4 PER vesseisucoaced ices stessiessns aa a a e godess A Sevect uct ah cibaauepesca toate ah seaichoodess aasaee Soethas 65 3 3 3 5 Agar se Gelektroph orese un nenn anne ann biedbersgedsecdeuseavebeysoatess 66 3 4 Einfluss der berst nde von nicht transfizierten BHK Zellen auf die spontane zytotoxische Aktivit t von Effektorzellen
217. uktion des Tet on Systems eine Steigerung der Expression von Luciferase um das etwa Tausendfache erreicht wurde Dieser Faktor liegt zwar unter dem von Gossen und Bujard 1992 angegeben Wert die in ihren Untersuchungen die Expression von Proteinen um den Faktor 10 steigern konnten zeigt aber dennoch eine deutliche Induzierbarkeit der Proteinexpression Daher konnte die Konstruktion des Response Plasmids pTRUE IL 2 als erfolgreich angesehen werden Die stabile Transfektion des Plasmids pTRUE IL 2 erfolgte mit einem linearisierten Plasmid Linearisierte DNA wird in das Genom der Wirtszellen integriert und so auf Tochterzellen bei der Zellteilung weitergeben Allerdings l sst sich nicht vorhersagen wie viele Kopien des Plasmids aufgenommen und an welchen Stellen im Genom sie eingebaut werden So ist es m glich dass die transfizierte DNA in der N he von starken Promotoren oder anderen aktiven Stellen integriert wird was eine erh hte basale Produktion der einklonierten Protein Sequenzen zur Folge hat Um dies einsch tzen zu k nnen erfolgte eine 122 Diskussion weitere berpr fung der Enzymaktivit t der Luciferase in induzierten und nicht induzierten Ans tzen je Klon im Rahmen eines Luciferase Assays Die zw lf aus der stabilen Transfektion isolierten und berpr ften Klone wiesen unterschiedliche Ergebnisse bez glich der Luciferase Expression auf Die Klone Al A6 A7 und A8 zeigten einen hohen Stimulationsindex zwischen 27 8 und 46
218. ul DEPC ddH O 4 5 ul Von diesem Ansatz wurden je 9 ul sowie je 1 ul reverser Transkriptase SuperScript I RT 200 U ul Invitrogen Karlsruhe zu den Denaturierungsans tzen zugegeben und gemischt Danach erfolgte die reverse Transkription f r 40 min bei 42 C mit anschlie ender Denaturierung bei 94 C f r 5 min und erneuter Abk hlung auf 4 C Material und Methoden 65 3 3 3 4 PCR Zur Amplifizierung der cDNA in der PCR wurde ein Mastermix nach Tabelle 16 angemischt Tabelle 16 Mastermix zur PCR Taq Polymerase 5 U ul Biotherm NatuTec GmbH Frankfurt 1 5 ul dNTP Mix jeweils 10 mM dATP dTTP dCTP dGTP 6 ul 20 pmol KpnIL2 Forward Primer siehe 3 2 1 1 6 ul Biotherm Puffer 10X NatuTec GmbH Frankfurt 30 ul DEPC ddH O 196 5 ul Zu den drei PCR Reaktionsgef en mit der synthetisierten cDNA wurden je 80 ul dieses Mastermixes zugegeben Parallel dazu wurde eine Kontroll PCR des RNA Isolates siehe 3 3 3 1 durchgef hrt Damit sollte berpr ft werden ob nach der DNase Behandlung noch Reste von DNA in den drei RNA Isolaten vorhanden waren Tabelle 17 Ans tze zur Kontroll PCR BHK 1 5 1 ug RNA 1 6 ul 1 1 ul 1 1 ul Taq Polymerase 5 U ul Biotherm NatuTec GmbH 0 5 ul 0 5 ul 0 5 ul Frankfurt Biotherm Puffer 10X NatuTec GmbH Frankfurt 5 ul Sul 5 ul 20 pmol MluIL2rev siehe 3 2 1 1 2 ul 2 ul 2 ul 20 pmol KpnIL2 siehe 3 2 1 1 2
219. ul 2 ul 2 ul dNTP Mix jeweils 10 mM dATP dTTP dCTP dGTP lul 1 ul 1 ul DEPC ddH O 37 9 ul 38 4 ul 38 4 ul Die anschlie ende PCR mit allen sechs Ans tzen wurde in einem Thermocycler Cycler TC 312 Techne Staffordshire England in folgenden Schritten durchgef hrt 2 min bei 94 C initiale Denaturierung 30 s bei 94 C Denaturierung 30 s bei 50 C Annealing 1 min bei 72 C Elongation 5 min bei 72 C Elongation Abk hlung auf 4 C 30 Zyklen mit jeweils 66 Material und Methoden 3 3 3 5 Agarose Gelektrophorese Durch die Gelektrophorese der PCR Produkte erfolgte deren berpr fung und Auswertung Die durchgef hrten Schritte entsprachen dem bereits unter 3 2 1 2 ausgef hrten Arbeitsgang 3 4 Einfluss der berst nde von nicht transfizierten BHK Zellen auf die spontane zytotoxische Aktivit t von Effektorzellen Da BHK Zellen als IL 2 Produzenten genutzt werden sollten musste auch ein m glicher Einfluss im nicht transfizierten Zustand auf die Zytotoxizit t von Effektorzellen berpr ft und ausgeschlossen werden Die Aktivit tssteigerung von zytotoxischen Effektorzellen sollte in der sp teren Anwendung lediglich durch das sezernierte rcIL 2 hervorgerufen werden Jegliche stimulierende oder inhibierende Einfl sse durch andere Faktoren der BHK Zellen mussten deshalb zun chst ausgeschlossen werden Dazu wurde der Effekt von BHK berst nden auf Effektorzellen berpr ft die aus Hundebl
220. um kein signifikanter Unterschied zwischen der Therapie mit LAK und rIL 2 und der Therapie mit rIL 2 alleine gefunden werden Dies stand jedoch im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tierversuchen an M usen die den erfolgreichen Einsatz von LAK versprachen Lafreniere und Rosenberg 1985 Papa et al 1986 Um die systemischen Nebenwirkungen auf den Patienten zu vermeiden ist daher die Therapie mit LAK ohne IL 2 Gabe zu bevorzugen Die Anreicherung von LAKs und ihre in vitro Stimulation und Vermehrung mit IL 2 sowie die anschlie ende Reapplikation zeigte hinsichtlich der Vertr glichkeit keine gravierende Nebenwirkungen Koehl et al 2004 Literatur bersicht 7 2 1 2 Adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund Zur Tumorimmuntherapie beim Hund wurde IL 2 in verschiedenen Therapiestrategien angewendet Quintin Colonna et al 1996 setzten IL 2 lokal ein Sie injizierten Hunden mit metastasierenden Melanomen die chirurgisch und mit anschlie ender lokaler Bestrahlung behandelt wurden in die vorherige Tumorlokalisation Vero Zellen die einen Expressions vektor mit dem Gen f r humanes IL 2 hIL 2 trugen Im Vergleich zur Kontrollgruppe in der die Hunde nur chirurgisch mit anschlie ender Strahlentherapie behandelt wurden zeigten die Tiere eine verl ngerte mittlere berlebenszeit sowie eine verringerte Rezidivrate Rochlitz et al 1998 injizierten ebenfalls Vero IL 2 Zellen in nicht operable Tumoren Ein Hund mit einem Weichteilsarkom zeigte dar
221. ungszustand Einfl sse auf die Zusammensetzung der zellul ren Bestandteile des peripheren Blutes von Hunden und damit auch auf die Isolierung von Lymphozyten 2 4 Stimulation von kaninen Lymphozyten IL 2 wird in erster Linie von Tyl Lymphozyten nach deren Stimulation sezerniert Mosmann et al 1986 Diese Aktivierung kann polyklonal durch Mitogene erzielt werden zu welchen neben bakteriellen auch pflanzliche Extrakte die sogenannten Lektine z hlen Bei Lektinen handelt es sich um Proteine die an Karbohydratgruppen nicht kovalent binden und diese chemisch modifizieren Brown und Hunt 1978 Als T Zell aktivierende Lektine sind Concanavalin A Con A und Phytoh magglutinin PHA bekannt Con A ist ein reines 14 Literatur bersicht Protein aus der Schwertbohne Concanavalia ensiformis und hat neben mitogenen auch erythrozyten und leukozytenagglutinierende Eigenschaften Lis und Sharon 1973 Bei PHA handelt es sich um ein Glykoproteinextrakt der roten Stangenbohne Phaseolus vulgaris das aus den zwei Spezies Erythroagglutinin PHA E und Leukoagglutinin PHA L besteht Yachnin und Svenson 1972 Zur Stimulation von kaninen Lymphozyten gibt es zahlreiche Untersuchungen bez glich verwendeter Kulturmedien Serumgehalt Mitogenkonzentration sowie eingesetzter Zellzahl Inkubationstemperatur und dauer bersicht bei Wagner 1998 Wagner 1998 untersuchte die optimalen Bedingungen f r die Lymphozytenstimulation durch Con A und
222. uppies J Vet Med Sci 57 899 904 Taylor D D Gercel Taylor C 2005 Tumour derived exosomes and their role in cancer associated T cell signalling defects Br J Cancer 92 305 311 Temin H M Mizutani S 1970 RNA dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus Nature 226 1211 1213 Textor S C Margolin K Blayney D Carlson J Doroshow J 1987 Renal volume and hormonal changes during therapeutic administration of recombinant interleukin 2 in man Am J Med 83 1055 1061 Thamm D H Kurzman I D Macewen E G Feinmehl R Towell T L Longhofer S L Johnson C M Geoly F J Stinchcomb D T 2003 Intralesional lipid complexed cytokine superantigen immunogene therapy for spontaneous canine tumors Cancer Immunol Immunother 52 473 480 Twentyman P R Luscombe M 1987 A study of some variables in a tetrazolium dye MTT based assay for cell growth and chemosensitivity Br J Cancer 56 279 285 von der Maase H Geertsen P Thatcher N Jasmin C Mercatello A Fossa S D Symann M Stoter G Nagel G Israel L et al 1991 Recombinant interleukin 2 in metastatic renal cell carcinoma a European multicentre phase II study Eur J Cancer 27 1583 1589 Voss S D Leary T P Sondel P M Robb R J 1993 Identification of a direct interaction between interleukin 2 and the p64 interleukin 2 receptor gamma chain Proc Natl Acad Sci U S A 90 2428 2432 Voss S D Robb R J
223. ut isoliert wurden Deren spontane Zytotoxizit t wurde durch ein Rose Bengal Assay RBA ermittelt 3 4 1 Testprinzip des RBA Der RBA basiert auf der Abl sung lysierter Zielzellen durch aktive NK Zellen und der kolorimetrischen Quantifizierung der auf dem Plattenboden verbliebenen lebenden Zellen Gondolf 1994 Gondolf et al 1996 Daher kommt also eine adh rente Zielzelllinie in diesem Fall CTAC Zellen zum Einsatz 3 4 1 1 Zielzelllinie CTAC Bei der gegen ber kaninen NK Zellen sensitiven Zelllinie CTAC handelt es sich um kanine Schilddr senadenokarzinom Zellen Sie wurden in sterilen 25 cm Gewebekulturflaschen Dunn Labortechnik GmbH Asbach in einem CO gt Brutschrank Heraeus UB 6060 EK CO Heraeus Hanau bei 37 C in 5 iger CO gt Atmosph re kultiviert Als Kulturmedium diente steriles Minimum Essential Medium Eagle s mit Earl s Salzen MEME ICN Biomedicals Costa Mesa USA mit einem Zusatz von 10 FKS PAA Laboratories GmbH C lbe 1 Penicillin 10 000 U ml und 1 Streptomycin 10 000 ug ml beides Biochrom KG Berlin Material und Methoden 67 MEME FKS Die Zellen wurden etwa alle 3 bis 4 Tage mit frischem Medium versorgt und einmal w chentlich passagiert Dazu wurde der Zellrasen zun chst mit MEME zur Entfernung von Serumresten gewaschen Anschlie end erfolgte die Zugabe von 3 ml Trypsin EDTA L sung ICN Biomedicals Costa Mesa USA und die Inkubation im Brutschrank f r etwa 5 min Danach wurde
224. ven Tumorimmuntherapie beim Hund eingesetzt werden Weiterhin k nnte das so erzeugte cIL 2 ber eine lokale Infusion kontinuierlich in Tumorgewebe oder nach chirurgischer Entfernung zur Verhinderung von Tumorrezidiven am Exzisionsort appliziert werden Auch w re der Einsatz des cIL 2 Plasmids im Rahmen einer Gentherapie bei Tumorpatienten denkbar Zusammenfassung 129 6 ZUSAMMENFASSUNG 1 Der Literaturteil gibt zun chst eine kurze bersicht ber die M glichkeiten der Immuntherapie und der adoptiven Immuntherapie von Tumoren beim Menschen und beim Hund wobei insbesondere auf eine Anwendung von Interleukin 2 IL 2 und den Einsatz von Lymphokin aktivierten Killerzellen LAK eingegangen wird Ziel dieser Arbeit war es n mlich die mesenchymale Zellliniie BHK mit molekularbiologischen Methoden Tet on System so zu ver ndern dass sie in der Lage ist biologisch aktives IL 2 vom Hund cIL 2 kontinuierlich zu produzieren Dieses soll dann f r eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund f r die klinische Anwendung zur Verf gung gestellt werden 2 Dazu wurde zun chst eine cDNA f r cIL 2 aus mit Percoll isolierten Con A stimulierten Hundeblutlymphozyten in einer RT PCR gem der Publikation von Dunham et al 1995 amplifiziert Die Sequenzierung der gewonnenen cDNA ergab eine hundertprozentige bereinstimmung mit der publizierten Sequenz Dunham et al 1995 3 Die Expression des cIL 2 Proteins sollte in BHK Zellen
225. von denen 3 eine komplette und einer eine teilweise Tumorremission zeigten Auch die Inhalationstherapie mit IL 2 Liposomen erwies sich als wirksam Khanna et al 1997 setzten ein Aerosol das hIL 2 Liposomen in vernebelter Form enthielt bei neun Hunden ein von denen zwei unter prim ren Lungentumoren litten und sieben Lungenmetastasen anderer Tumore aufwiesen Zwei Hunde mit Lungenmetastasen eines Osteosarkoms zeigten eine komplette Remission der Metastasen und wiesen ein bzw zwei Jahre lang keine Rezidive auf Das prim re Lungenkarzinom eines Hundes nahm ber neun Monate nicht an Gr e zu zeigte jedoch auch keine Regression Nebenwirkungen der Therapie beschr nkten sich auf vor bergehenden Husten in drei F llen unmittelbar nach der Inhalation Auch bei Hunden konnte eine erniedrigte spontane Zytotoxizit t von NK Zellen festgestellt werden Untersuchungen zeigten dass bei Hunden mit Mammakarzinomen die spontane zytotoxische Aktivit t von isolierten NK Zellen angereicherten Blutlymphozyten gegen ber der von Tumorpatienten mit anderen Tumoren und der einer gesunden Kontrollgruppe signifikant vermindert war Funk et al 2003 Funk et al 2005 Trotz dieser Ergebnisse liegen zur Zeit keine klinischen Studien ber eine adoptive Tumorimmuntherapie mit LAK beim Hund vor Untersuchungen zeigten jedoch dass in vitro stimulierte LAK eine zytotoxische Aktivit t gegen ber kaninen Tumorzellen aufweisen und deren Einsatz in der Tumorimmunthera
226. xpression auf als im nicht induzierten Versuchsansatz Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt allerdings unklar Weitere Luciferase Assays auch von reklonierten BHK Linien best tigten die Induzierbarkeit des Tet on Systems nach der stabilen Transfektion Die Existenz der mRNA f r cIL 2 in den transfizierten BHK Klonen wurde anschlie end in einer RT PCR nachgewiesen Weiterhin wurde berpr ft ob nicht transfizierte native BHK Zellen eventuell Faktoren abgeben die die Aktivit t von Effektorzellen mit spontaner zytotoxischer Aktivit t stimulieren oder blockieren Dazu wurden Lymphozyten unter Anreicherung von NK Zellen aus Hundeblut ber einen 57 5 igen Percoll Gradienten isoliert in den berst nden von nativen BHK Zellen inkubiert und ihre zytotoxische Aktivit t in einem kolorimetrischen Farbstofftest dem Rose Bengal Assay RBA gemessen Durch die Behandlung mit diesen berst nden war keine Ver nderung der zytotoxischen Aktivit t nachweisbar F r den Nachweis der biologischen Aktivit t des von den transfizierten BHK Zellen sezernierten cIL 2 wurden Bioassays mit der IL 2 sensitiven Zelllinie CTLL 2 durchgef hrt Bei allen untersuchten BHK Klonen war eine Produktion von biologisch aktivem cIL 2 nachweisbar Die Menge des im induzierten Zustand sezernierten cIL 2 lie sich jedoch schwer bestimmen da die cIL 2 Produktion je nach Kulturbedingungen Inkubationsdauer Zellkonzentration der eingesetzten Klone stark schwankte
227. yklin induziert Nach weiteren 24 h wurde ein Luciferase Assay wie unter 3 2 6 3 durchgef hrt und die Aktivit t der Luciferase im Luminometer gemessen siehe 3 2 6 4 Anschlie end wurde f r jeden der 12 Klone der Stimulationsindex SI nach folgender Formel ermittelt SI Luciferase Aktivitdituninduziert Luciferase Aktivit tinduziert 3 2 7 6 Reklonierung Anhand der ermittelten Werte wurden drei der 12 Klone Al A5 A8 rekloniert Dabei handelte es sich um den Klon mit dem h chsten SI Al den Klon mit der h chsten Luciferase Aktivit t im induzierten Zustand A5 und den Klon mit der niedrigsten Luciferase Aktivit t im uninduzierten Zustand A8 F r die weitere Kultivierung sollten so homogenere Zellpopulationen der ausgew hlten Klone gewonnen werden Die Reklonierung wurde nach den unter 3 2 7 4 genannten Schritten durchgef hrt F r die weiteren Untersuchungen wurde der Schwerpunkt auf A5 und insgesamt 9 Reklone A5 1 A5 2 A5 3 A5 4 A5 5 A5 6 A5 7 A5 8 und A5 9 dieser Linie gelegt die zum Teil sp ter noch hergestellt wurden 3 2 8 Kryokonservierung der gewonnenen Zell Klone Zur dauerhaften Lagerung wurden von jeder der 12 Klon Linien sowie von allen Reklonen mehrere Kryokulturen in fl ssigem Stickstoff angelegt die bei Bedarf aufgetaut wurden Dazu wurden zun chst die Zellen in einer 10 cm Kulturschale kultiviert bis sich eine Konfluenz des Monolayers von 90 100 gebildet hatte Nach dem
228. ys 2u2220224020esnnnnneennennnennnennnnnnennnennnennnennnennen 74 3 5 2 1 Das Standard Bi6assay 0 u 2 2 seen snnnkunenae sim sin sp sinn 74 3 5 2 2 Koinkubation von CTLL 2 Zellen und transfizierten BHK Zellen in Transwell Eins tzen 3 3 2 3 Zus tzliche Bioassays 3 5 2 3 1 Zeitlicher Verlauf der rcIL 2 Produktion ber 72 hw eeeeeeeesesesesesesesssssesessseseeeseeeeees 76 Inhaltsverzeichnis 3 5 2 3 2 3 3 2 3 3 3 5 3 4 1 4 1 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 1 6 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 2 6 4 2 7 4 3 4 4 4 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 rcIL 2 Produktion in serumfreiem Kulturmedium uessessessessnessnessnesnnennnennennennnennennnn nen 76 Induktion durch verschiedene Doxyzyklin Konzentrationen eeeceesceceseeeeneeeeneeceneeeeaeeesaee 77 Berechnung der rcIL 2 Konzentration 22u222404224022snnnsnnensnnensnensnnensnnennnnnsnsnennnennenennnnennann 77 Ergebnisse eesoesossesnesnsesnesnsnesnesnsnssnsnnsnssnsnnsnesnsnssnssnsnnsnsnnsnnsnssnsnssnssnsnssnssnsnssnesnsnssnssnsnssnssnsnnsnsnnn 80 Gewinnung der cDNA f r cIE2 2 2202 este neben 80 Lymphozytenisolierung und Stimulation 2u022020002s0ssnesnnnsnensnensennnennnennnennnennennnennnennn nen 80 Gewinnung der T tal RNA 2 2 28 amp 28 assa resora sp ten essen 81 RT PCR zur Gewinnung der CDNA uunsesssessnesnnssnossnessesnnennnennonsnennnennnensnennnennennnensne
229. ze ohne Effektorzellen Berechnet wurde sie nach folgender Formel Zytotoxische Aktivit t 100 er 100 OD kontroll Ansatz 3 5 Quantifizierung des sezernierten rekombinanten kaninen Interleukin 2 im Bioassay MTT Test 3 5 1 IL 2 Bioassay mit CTLL 2 Zellen 3 5 1 1 CTLL 2 Zelllinie Zum Nachweis von biologisch aktivem rcIL 2 in den berst nden transfizierter und induzierter BHK Zellen diente die IL 2 abh ngige Zelllinie CTLL 2 eine murine T Zelllinie Es handelt sich dem Ursprungszelltyp entsprechend um Suspension Zellen die kein adh rentes Wachstum zeigen siehe Abbildungen 5 und 6 Abbildung 5 CTLL 2 Zellen Suspensionskultur Gewebekulturmikroskop 10 x gro e und kleinere Kolonien sowie Einzelzellen zu erkennen Material und Methoden 71 d 3 95 oa ag E s A p i D Abbildung 6 CTLL 2 Zellen Zytozentrifugenpr parat May Gr nwald Giemsa 40 x Runde lymphatische Zellen mit mehr oder weniger deutlich erkennbarem Zytoplasmahof Die Expression des T Zell Marker Antigens CD3 kann immunhistologisch nachgewiesen werden siehe Abbildung 7 Da es sich bei dieser Zelllinie um lymphatische Tumorzellen handelt ist das CD3 Antigen nicht nur auf der Oberfl che exprimiert wie dies bei ausdifferenzierten reifen T Zellen zu beobachten ist Wegen der st rkeren Proliferation und der dadurch bedingten mangelhaften Ausdifferenzierung ist bei CTLL 2 Zellen das CD3 Antigen auch noch deutlich im Zytopl
230. zentration berechnet mit X s Standardverd nnungsreihe B Tabelle 35 OD 0 004 0 002 0 001 0 002 0 000 uninduziert rcIL 2 Konzentration 1 103 0 883 0 000 0 883 0 000 0 574 0 532 OD 0 005 0 002 0 001 0 001 0 000 induziert rcIL 2 Konzentration 1 186 0 883 0 707 0 707 0 000 0 697 0 436 A5 3 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe C Tabelle 36 OD 0 004 0 002 0 003 0 002 0 002 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 559 0 407 0 490 0 407 0 407 0 454 0 069 OD 0 027 0 020 0 024 0 021 0 021 induziert rcIL 2 Konzentration 1 433 1 219 1 343 1 251 1 251 1 299 0 088 A5 4 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe C Tabelle 36 OD 0 005 0 003 0 002 0 003 0 002 uninduziert rcIL 2 Konzentration 0 620 0 490 0 407 0 490 0 407 0 483 0 087 OD 0 031 0 033 0 031 0 034 0 033 induziert rcIL 2 Konzentration 1 549 1 606 1 549 1 634 1 606 1 589 0 038 152 Anhang Tabelle 26a Optische Dichten im MTT Test und daraus berechnete produzierte rcIL 2 Mengen verschiedener BHK Linien in ng ml eingesetzte Zellkonzentration 0 75 x 10 Zellen ml Dauer der rcIL 2 Produktion 72 h Originalmesswerte siehe Tabelle 43a d A5 BHK Linie rcIL 2 Konzentration berechnet mit x s Standardverd nnungsreihe D Tabelle 37 OD 0 004 0 004 0 004 0 004 0 004 uninduziert rcIL 2 Konzentration 3 402 3 402 3 402 3 402 3 016 3 325 0 173 OD 0 147 0 140 0 150 0 148 0 074
231. zwischen induziert und nicht induziert produzierter cIL 2 Konzentration Die produzierte cIL 2 Menge der induzierten Ans tze lag nur geringf gig ber der der nicht induzierten Die Ursache k nnte in einer Mutation des Tetrazyklinoperons im Response Plasmid liegen so dass der Doxyzyklin 126 Diskussion gekoppelte reverse tetrazyklinkontrollierte Transaktivator nicht an dieses Element binden konnte um damit eine Doxyzyklin induzierte cIL 2 Produktion anzuschalten Bei der Koinkubation in Transwell Eins tzen wurde die cIL 2 produzierenden BHK Zellen mit den IL2 sensitiven CTLL 2 Zellen gleichzeitig inkubiert Hier konnten die cIL 2 Effekte direkt gemessen werden So zeigte sich insgesamt eine geringere Differenz zwischen basaler und induzierter cIL 2 Produktion Die basale cIL 2 Produktion nicht induzierter Klone wirkte sich hier deutlicher auf die CTLL 2 Proliferation aus Aufgrund der geringen Gr e der Eins tze konnte mit 1 x 10 Zellen nur eine relativ geringe Anzahl an Klon Zellen eingesetzt werden Daher lagen die hier im Zeitraum von 72 h produzierten Konzentrationen an cIL 2 unter den in anderen Versuchen erzielten Konzentrationen Im Gegensatz zu anderen Versuchen wies der Klon A5 3 bei der Koinkubation keine Induzierbarkeit der cIL 2 Produktion auf Hingegen lag sogar die cIL 2 Konzentration des nicht induzierten A5 3 Ansatzes etwas ber der des induzierten Ansatzes Auch hier ist m glicherweise eine ungleichm ige Zellsus

Herstellung von kaninem Interleukin-2

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