MutaCHIP TOXO - bei Immundiagnostik
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1. 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 11 Evaluation and Interpretation of Results The evaluation is performed using the MAAT and the TOXO Genotyping Software The results are compiled with help of the software into a report For the evaluation of the chip follow the short instructions below For further and detailed information please refer to the TOXO Genotyping Software handbook Step 1 Create a new project Click on the button New experiment Assign an arbitrary name for the experiment and Subsequently save it by clicking on the button save egga a nem pre beet Fe r E FL ee i Be O Coa H Moral Dek fe Documents POD yem e Poth Projects 4 rginzr Fira Vth ctl ET fh ME 7 Pirna lami Wi gt Fest lami u E Pearl Pe a gt Peet ard gt Poteet dar E e o aii 7 orl l PT i E Bi Be T a Foe hate Potrero Tieni Type Esters Meru Language Dates ern Hide FH Step 2 Start the analysis Click on the Start button to initiate data analysis 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Evaluation and Interpretation of Results 11 Step 3 Quality check of the MutaCHIP eeereerse8e ee sepe EEES EES EN Please check the quality of he chipimage If there are dust or dirt particles on the chip surface clean the the bottom of the reaction tube carefully with a cloth and destlled2. MutaCHIP TOXO DNA Makroarray Testkit f r die Untersuchung von Genetischen Variationen im Zusammenhang mit Entgiftung und Arzneimittel Nebenwirkungen Nur f r in vitro Diagnostik C SN ke39101 Y 40 SN KF390011 We Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 Wehe SS Inhaltsverzeichnis h Verwendungszweck Testprinzip Kitbestandteile Erforderliche Materialien Lagerung und Haltbarkeit Arbeitsbedingungen Hinweise und Vorsichtsma nahmen Probengewinnung N OO 0 oa A OW Testdurchfuhrung PCR ProGukinerste WONG os u 7 Probenzusammenf hrung und Verdunnung ccceceeeeceeeeeseceeeeeneeeeeeneesensescnsesonseeeeenees 8 MUTSERIP PFOIOKOl Le ee ee ee el 8 O on O OA N O A A W N h Auswertung 10 h h Troubleshooting 14 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 Verwendungszweck 3 1 Verwendungszweck Der MutaCHIP TOXO Test ist ein molekularbiologischer Test zur Detektion von Mutationen in Genen die den K rper vor Nebenwirkungen und Vergiftungen ausgel st durch Medikamente oder k rperfremde Stoffe sch tzen Die untersuchten Genvarianten stehen im Zusammenhang mit dem Metabolismus von Xenobiotika und deren Transport aus der K rperzelle dem Abbau oder Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies und der Wirksamkeit und den damit verbundenen Nebenwirkun
3. r das Experiment und speichern Sie es anschlie end indem Sie auf die Schaltfl che Speichern klicken Neues Projekt anlegen a aA ts ieren Name A FORNER atum Patient 1 xml Mi Computer Patient 2 xml E Dokumente Ei Bilder Pipiena MR Musik Patient 6 ml Zuletzt ge ndert Patient 3 xml Patient 7 xml E Suchvorg nge di ffentlich Ordner A Dateiname Neues Experiment Dateityp Extended Markup Language Daten xml Ordner ausblenden Schritt 2 Analyseprozess starten Klicken Sie auf die Schaltflache Start um die Datenanalyse zu starten 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 Auswertung 11 Schritt 3 Qualit ts pr fung des MutaCHIPs berpr fen Sie die Bildqualit t En Sn nn en ee Bee Bitte berpr fen Sie die Qualit t des Bildes Falls Staubpartikel auf dem Bild zu erkennen sind entfernen sie diese bitte da sonst m glicherweise die Auswertung beeintr chtigt werden k nnte Um Staubpartikel zu entfernen s ubern Sie bitte die Unterseite des Chips mit einem weichen und feuchten Tuch Dr cken Sie anschlie end auf Bild erneut aufnehmen um den Aufnahmevorgang zu wiederholen Klicken Sie auf Analyse fortsetzen wenn Sie ein qualitativ einwandfreies Bild sehen Neues Bild Um ein einwandfreies Analyseergebnis zu erhalten muss zun chst die Bildqualit t des MutaCHIPs berpr ft werden Staubpartikel auf der Unte
4. 30 ng max 60 ng 4 0 uL PCR Mix A gr ner Deckel 20 8 uL PCR Mix B DNA min 30 ng max 60 ng 4 0 uL PCR Mx B gelber Deckel 20 8 uL PCR Mix C DNA min 30 ng max 60 ng 4 0 uL PCR Mix B roter Deckel 20 8 uL PCR Mix D DNA min 30 ng max 60 ng 4 0 uL PCR Mix B blauer Deckel 20 8 uL PCR Mix E DNA min 30 ng max 60 ng 4 0 uL PCR Mix B wei er Deckel 20 8 uL Die Proben in den Thermocycler stellen und das in 10 2 beschriebene PCR Protokoll verwenden 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 9 2 9 3 Probenzusammenf hrung und Verd nnung Das PCR Protokoll muss f r jedes Labor erneut etabliert werden da die verschiedenen Thermocycler unterschiedliche Heizraten haben Diese Etablierung entf llt wenn der empfohlene Thermocycler verwendet wird Peqlab Primus 25 advanced F r die Etablierung kann mit dem folgenden Standard Protokoll begonnen werden Temperatur EI Panerio m _ EEE Elongation Finale Elongation MutaChip Protokoll A Vorbereitung des Hybridisierungspuffers Zyklen Zeit min 2 0 5 0 5 1 5 0 5 0 5 1 5 5 Falls der Hybridisation Buffer tr b oder flockig geworden ist kann dieser f r wenige Sekunden in der Mikrowelle 240 W oder in einem Wasserbad erw rmt und durch Schwenken homogenisiert werden bis er wieder klar ist Vor dem Verwenden muss der Puffer auf Raumtemperatur RT abgek hlt werden
5. B Vorbereitung der DNA Proben e Thermoshaker auf 51 C vorheizen e 5 wl PCR Produkt A 5 uL PCR Produkt B 5 uL PCR Produkt C 5 uL PCR Produkt D und 5 uL PCR Produkt E in ein frisches PCR Reaktionsgef berf hren und kurz vortexen e Die so vorbereitete Probe f r 2 min bei 95 C denaturieren e Anschlie end die denaturierte Probe mit 100 uL Hybridisation Buffer auff llen und durch auf und abpipettieren mischen e Das Gemisch vollst ndig in den MutaCHIP berf hren ohne dabei den Boden des MutaCHIPs zu ber hren C Hybridisierung e Hybridisieren der Probe bei 51 C 550rpm f r 30 min D Waschschritte nach der Hybridisierung Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Hybridisation Buffer aus Schritt C vollst ndig entfernen e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 51 C 550 rpm f r 5 min 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 Testdurchf hrung 9 E Konjugationsschritt Den Thermoshaker auf 21 C temperieren Achtung W hrend des Herunterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Washing Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Washing Buffer aus Schritt D vollst ndig entfernen e 100 uL Conjugation Mix vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Konjugation des Muta
6. If the problem persists check the PCR protocol according to chapter 10 2 or contact PharmGenomics customer service The reader is not plugged in properly Keep Esc pressed for 3 seconds and plug in the reader in the right manner please refer to the user manual of the PGDx System Clean the bottom side of the MutaCHIP using a cotton swab or a cloth wet with disinfectant Repeat the photograph it can be necessary to repeat this procedure several times Carefully clean the camera with a cotton swab 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013
7. by polymorphisms and other genetic variations severe complications can develop Foreign substances accumulate in the body potentially leading to serious side effects or diseases as for example cancer Consequently also pro drugs are not activated and are not fully functional and efficient Reactive oxygen species ROS are damaging to all kinds of biomolecules During biotransformation as well as by drugs and environmental toxins ROS can be produced inside the body The antioxidative system is engineered to eliminate ROS and protect cells before they are damaged Among others cancer and neurodegenerative diseases can be the consequence of impaired ROS clearing e g by dysfunctional enzymes A number of polymorphisms and gene variations with relation to detoxification have been identified so far see section 1 Genotyping detects these mutations and identifies such persons who are at a higher risk for developing the above mentioned conditions References Coleman M D Human Drug Metabolism An Introduction 2 Edition 2010 Hoboken NJ USA Wiley Blackwell Ernst B V gtli A Moderne Pharmakokinetik Transport durch Membranen 1 Edition 2010 Weinheim Germany Wiley VCH Verlag GmbH amp Co KGaA e Karlson P Doenecke D Koolman J Fuchs G Gerok W Karlsons Biochemie und Pathobiochemie 5 Edition 2005 Stuttgart Germany Thieme Verlagsgruppe 3 Concept of the Assay To analyse the mutations a PCR is performed which
8. k nnen optimale Ergebnisse sichergestellt werden e Mischen Sie keine Reagenzien aus unterschiedlichen Lots e Die MutaCHIPs sind o nur f r den Einmalgebrauch bestimmt o nur zur in vitro Diagnostik zu verwenden e Der MutaCHIP darf w hrend den Arbeitsschritten nicht austrocken e Der MutaCHIP ist f r den Gebrauch mit dem MAAT und der dazugeh rigen Software von PharmGenomics ausgelegt e Die Arbeitsschritte z gig durchf hren e Alle Ausgangsl sungen w hrend des Arbeitens k hlen e Das MutaCHlIP Gef mit zwei H nden ffnen Dabei ist darauf zu achten dass kein Druck auf den MutaCHIP ausge bt wird 8 Probengewinnung Als Matrize fur die PCR Amplifikation dient genomische DNA aus EDTA Vollblut Die DNA Konzentration sollte zwischen 15 30 ng ul liegen Die Reinheit OD560 280 der DNA sollte h her als 1 8 sein F r den Assay darf nur hochmolekulare frisch extrahierte DNA verwendet werden 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 Probengewinnung 9 Testdurchf hrung 9 1 PCR Produktherstellung e Vor Beginn der Arbeiten sollte sichergestellt sein dass die Arbeitsfl chen und eingesetzten Ger te dekontaminiert sind e Die Komponenten des Kits die zur Durchf hrung der PCR ben tigt werden bereitstellen Zur Amplifikation der Ziel DNA werden f nf PCR Ansatze pro Probe ben tigt f r jeden Primer Mix einer Diese werden wie in folgenden Tabellen beschrieben pipettiert PCR Mix A DNA min
9. 0 uL e 0 2 mL PCR tubes sterile 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 je je 6 Storage and Shelf life The Polymerase has to be stored at 20 C All other components are stored at 2 8 C The substrate has to be strictly protected against light exposure The bags contain each 5x MutaCHlPs with open lids After unsealing a bag the lids of the remaining MutaCHIPs have to remain open as the protection gas escapes The MutaCHIPs can be stored in the loosely not airtight closed do not use tape light protection bag up to several weeks and room temperature RT For storage choose a dry and dark place To avoid even minimal loss of performance we recommend using up one bag of MutaCHIPs within two weeks The MutaCHIPs have to be protected against direct exposure to sunlight and dust and dust 7 Working Conditions Never centrifuge the MutaCHIPs Do not touch the surface of the MutaCHIPs with a pipette Use only substances that are mentioned in the protocol 8 Considerations and Precautions The guidelines and principles for working in a biomolecular laboratory have to be followed The test is suitable for genomic DNA freshly extracted from whole EDTA blood as starting material Only then optimal results are guaranteed Do not mix reagents from different lots The MutaCHIPs are o for single use only o only for in vitro diagnostics Do not let the MutaCHIP dry out while performing the analysis The MutaC
10. CHIPs bei 21 C 550 rpm f r 15 min F Zweiter Waschschritt Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten e Den Conjugation Mix aus Schritt E vollst ndig entfernen e 500 uL Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren e Waschen des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 5 min G F rbung Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Der Chip darf w hrend und nach dem F rben nicht gesch ttelt werden e Den Washing Buffer aus Schritt F vollst ndig entfernen e 100 uL Substrate in den MutaCHIP geben und f r 5 min bei 21 C inkubieren Dazu den MutaCHIP in den Thermoshaker berf hren keine Schuttelfunktion aktivieren e Danach das Substrate wieder vollst ndig entfernen Pipette und umgehend 500 ul Washing Buffer hinzugeben MutaCHIP in den Imagereader berf hren auf korrekte Platzierung achten Bild erstellen und mit der Analyse Auswertung beginnen siehe folgendes Kapitel 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 10 Auswertung Die Auswertung erfolgt ber das MAAT und die TOXO Genomics Software Die Ergebnisse werden mit Hilfe der Software in einem Report zusammengestellt F r die Auswertung des Chips folgen Sie der folgenden kurzen Anleitung F r weitere und detailliertere Informationen sehen Sie bitte im ARTERO Genomics Software Handbuch nach Schritt 1 Ein neues Projekt erstellen Klicken Sie auf die Schaltfl che Neues Experiment Vergeben Sie einen beliebigen Namen f
11. HIP is designed for the use with the MAAT and the software provided by PharmGenomics Perform all steps in a timely manner Keep all stock solutions cooled while working Always open the MutaCHIP with both hands Do not apply pressure to the tube 9 Sample Collection The template for PCR amplification is genomic DNA from EDTA whole blood The DNA concentration should be between 15 and 30 ng uL The minimum DNA purity A260 A280 ratio should be higher than OD 260 280 1 8 For the assay high molecular freshly extracted DNA has to be used 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Sample Collection 10 Test Procedure 10 1 PCR Product Generation e Before starting make sure that all working surfaces and utilized devices are decontaminated e Prepare all components of the kit required for the procedure of the PCR e Subsequenily perform the PCR according to the protocol listed below e For the amplification of target DNA five PCR reactions per sample are required one for each mastermix Those are pipetted as described in the following tables PCR Mix A DNA min 60 ng max 120 ng 4 0 uL PCR Mix A green lid 20 8 uL PCR Mix B PCR Mix C PCR Mix D PCR Mix E DNA min 60 ng max 120 ng 4 0 uL PCR Mix C white lid 20 8 uL Place the samples in the Thermocycler and continue with chapter 10 2 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 10 2 PCR Protocol
12. The PCR protocol has to be established anew for each laboratory as different thermocyclers have different heating rates This establishment can be omitted when using the recommended thermocycler Peglab Primus 25 advanced The following standard protocol can be used to start the establishing process Primer Hybridisation 10x Primer Hybridisation 60 05 2x o Storeat 8 Forever gt 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Test Procedure 9 10 3 MutaCHIP Protocol A Preparation of the Hybridisation Buffer lf the Hybridisation Buffer is turbid or a precipitate can be seen it has to be heated in a microwave for several seconds 240 W or in a water bath Gently shake the Hybridisation Buffer until it gets clear to homogenise it again Before usage it has to be cooled to room temperature RT B Preparation of DNAsamples e Preheat the thermoshaker to 51 C e Add 5 uL PCR product A 5 uL PCR product B 5 uL PCR product C 5 uL PCR product D und 5 uL PCR product E in a separate tube and mix by brief vortexing e Denature the mixture for 2 min at 95 C in a thermocycler e After denaturation add 100 uL Hybridisation Buffer e Pipette the denatured mixture into the MutaCHIP without touching the bottom of the tube C Hybridisation e Perform the hybridisation at 51 C 550rpm for 30 min D Washing steps after Hybridisation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove t
13. altbarkeit e Alle Komponenten sind bei 2 8 C zu lagern e Das Substrat ist unbedingt vor Lichteinwirkung zu sch tzen e Im Inneren des Beutels befinden sich 5x MutaCHIPs mit jeweils ge ffnetem Deckel Wenn ein Lichtschutzfolien Beutel ge ffnet wurde m ssen die Deckel der darin verbleibenden MutaCHIPs unbedingt ge ffnet bleiben da das Schutzgas entweicht e Die MutaCHIPs k nnen im wieder lose nicht luftdicht verschlossenen keine Klebestreifen verwenden Lichtschutzfolien Beutel mehrere Wochen bei Raumtemperatur RT gelagert werden Dabei einen dunklen und trockenen vor Feuchtigkeit sch tzen Ort zur Aufbewahrung ausw hlen e Um selbst minimale Performanceverluste zu vermeiden empfehlen wir jedoch den Verbrauch eines ge ffneten MutaCHIP Beutels m glichst innerhalb von zwei Wochen e Die MutaCHIPs sind gegen direkte Sonneneinstrahlung und Staub zu sch tzen 6 Arbeitsbedingungen e Die MutaCHIPs d rfen niemals zentrifugiert werden e Die Oberfl che des MutaCHIPs darf nicht mit der Pipettenspitze ber hrt werden e Der MutaCHIP darf nur mit den im Protokoll erw hnten Substanzen verwendet werden 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 sss ee 7 Hinweise und Vorsichtsma nahmen Die Vorschriften und Grunds tze f r molekularbiologisches Arbeiten m ssen eingehalten werden e Der Test ist zur Verwendung mit frisch extrahierter genomischer DNA aus EDTA Vollblut als Ausgangsmaterial geeignet Nur dann
14. amplifies the relevant genes using freshly extracted genomic DNA as template The amplification product is transferred to the MutaCHIP where it binds to the immobilized probes During the washing step not perfectly bound fragments are removed Subsequently the enzyme is added which binds to the remaining probe fragment complexes After adding the substrate the precipitation reaction occurs only at those spots at which DNA is still attached The colored precipitation pattern is then detected by the image reader and analyzed as well as interpreted by the associated software The analysis via precipitation reaction allows a distinct genotyping of all alleles spotted on the MutaCHIP 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Concept of the Assay 5 4 Components Each test kit contains the following components for 10 20 MutaCHIP assays and the instruction manual Size of Reaction Tube or Flask IE Substrate 2 mL Reaction Tube brown blue lid DNA Ref 2 mL Reaction Tube orange lid MutaC HIPs 1 5 mL Reaction Tube Instruction manual 1 5 Materials Required materials that can be ordered separately from PharmGenomics e Macroarray Analysing Tools MAAT o Notebook TOXO Genotyping Software o MutaCHIP image reader o Thermocycler Peglab Primus 25 advanced o Thermoshaker with cooling function BIOR Mixing Block MB 102 Required Materials not provided e pipettes o 0 1 2 5uL o 0 5 10uL o 10 200uL o 100 50
15. ations are analysed by the MutaCHIP TOXO CYPIA1 2A a CYP1A2 Fe CYP2C9 Phase Biotransformation CYP2C19 3 17948G gt A CYP3A5 GSTM1 14kb Deletion 2 2 GSTT 50kb Deletion 0000 GSTP1 A gt G Ile105Val cout ea sso Phase Ill Biotransformation MDR1 Antioxidative System Efficacy and Side Effects VKORC1 1639G gt A rs9923231 of Warfarin 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Ma 2 Introduction The human body is continuously confronted with foreign and to some extent toxic substances These xenobiotics include drugs stimulants and chemicals A great many of these foreign substances cannot be readily excreted as they are lipophilic i e poorly or not at all water soluble Biotransformation prevents accumulation of xenobiotics by transforming lipophilic compounds into more hydrophilic ones that can be excreted from the body Additionally biotransformational processes are involved in converting pro drugs inactive medication precursors into their active forms There are three phases of biotransformation During phase functional groups are attached either via oxidation reduction or hydrolysis Whilst phase Il the intermediate products from phase are coupled to endogenous mostly highly hydrophilic functional groups conjugation reaction The last phase phase Ill encompasses export of now water soluble substances from the cells If this process is hampered by enzymatic deficiencies e g caused
16. dukt wird auf den MutaCHIP gegeben und bindet an den dort immobilisierten Sonden Durch einen Waschschritt werden unspezifisch gebundene Fragmente wieder entfernt Im Anschluss wird das Enzym hinzugegeben welches an den Sonden Fragment Komplex bindet Nach Zugabe des Subsirats tritt eine Fallungsreaktion an den Stellen an denen noch DNA gebunden ist auf Das farbige Pr zipitat wird mit dem Imagereader detektiert und von der dazugeh rigen Software ausgelesen und bewertet 3 Kitbestandteile Jedes Testkit enth lt die folgenden Reagenzien zur Durchf hrung von 20 MutaCHIP Assays sowie eine Gebrauchsanweisung 1 Polymerase 2 mL Schraubr hre mit Einsatz Hybridisation Buffer 30 mL Plastikgef Washing Buffer 60 mL Plastikgef Conjugation Mix 4 mL Plastikgef Substrate 30 mL Plastikgef braun DNA Ref 2 mL Schraubgef MutaC HIPs 1 5 mL GefaB 20 Gebrauchsanweisung 1 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 Kitbestandteile 5 4 Erforderliche Materialien Ben tigte Ger te von PharmGenomics erh ltlich e Macroarray Analysing Tool MAAT Notebook TOXO Genomics Software o MutaCHIP Imagereader o Thermocycler f r PCR Peglab Primus 25 advanced o Thermomixer mit K hlfunktion BIOR Mixing Block MB 102 O Ben tigte Ger te und Verbrauchsmaterialien nicht mitgeliefert e Pipetten o 0 1 25yuL o 0 5 10uL o 10 200 uL o 100 500 uL e 0 2 ml PCR Gef e steril 5 Lagerung und H
17. e armGenomics GenoChip Tam A PDFCreator Save as Ctrl S Close tab Ctrl W ee Status Ready Print to file Print Ctrl P C i OU Print preview Sample P Send gt age Range on Number of copies 1 nur Type of sample Selection Current Page ie Draw date FE En Work offline Processing date Enter either a single page number or a single 23 23 az Report date 05 07 2011 page range For example 5 12 Results and Interpretation Defective CYP2D6 alleles detected 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 11 Troubleshooting Software Meldung Warnung Die Pr fen Sie das Enzym und oder Substrat Signale des Biotinreferenzmarkers sind zu Wiederholen Sie den Assay mit neuem niedrig Dies kann ein Zeichen f r einen Enzym Substrat fehlgeschlagenen oder nicht ausgef hrten Konjugationsschritt sein oder das Enzym ist nicht mehr funktional Das System muss gestoppt werden Software Meldung keine Fehlerangabe Der Reader ist nicht richtig angeschlossen ErrorCode 3011 Halten Sie Esc f r 3 Sekunden gedr ckt und schlie en Sie den Reader in der richtigen Art und Weise an bitte wenden Sie sich an das Benutzerhandbuch des PGDx Systems Schlechte Bildqualit t Reinigen Sie die Bodenunterseite des Arraygef es Benutzen Sie ein weichesTuch das mit Desinfektionsmittel angefeuchtet ist Wiederholen Sie das Foto es kann notwendig sein diesen Schritt mehr
18. fach zu wiederholen Unscharfes Bild Reinigen Sie vorsichtig die Kamera mit einem Tuch oder einem Wattst bchen 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 MutaCHIP TOXO DNA Macroarray Test Kit for the Analysis of Genetic Variations Associated with Detoxification For in vitro diagnostics only C Oe Yo SN KF390011 WY on Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 Beh Content mh Application Introduction Concept of the Assay Components Materials Storage and Shelf life Working Conditions Considerations and Precautions Sample Collection J O 9 a oa A A W Test Procedure PCR Product Generation anne ei 7 PER PrOLlOCOl ee aaa Bene Eee een 8 MUIACHIP Proto Col u E E EEA 9 on O O O N O OO FP WO N mh Evaluation and Interpretation of Results 10 oh NO Trouble shooting 14 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 Application 3 1 Application The MutaCHIP TOXO kit is a biomolecular test for the detection of mutations in genes responsible for the detoxification of the body The genetic variations examined are associated with the biotransformation of xenobiotics and the antioxidative system Genomic DNA is used for the analysis by means of a DNA macroarray The following single nucleotide polymorphisms SNP and mut
19. gen von Warfarin F r diesen Test wird genomische DNA mittels DNA Makroarray Technologie untersucht Folgende Einzelnukleotid Polymorphismen engl single nucleotide polymorphisms SNP und Mutationen werden auf dem MutaCHIP TOXO untersucht CYPIAT 2A 3798T gt C TO 3660658 CYP1A2 F 169066 UCT CYP2C9 3 1075A gt C rs1057910 Phase Biotransformation 2 19154G gt A rs4244285 CYP2C19 3 17948G gt A rs4986893 17 806C gt T Rs12248560 2 TESA CYP3A5 3 6986G gt A 1776746 GSTMI 14kb Deletion 000 GSTT1 50kb Deletion G Phase Il Biotransformation 481C gt T rs1799929 NAT2 590G gt A rs1799930 85 G gt A rs1 99931 T Transport von Xenobiotica np 3435 C gt T rs1045642 aus der Korperzellen SOD2 gt rs4880 Sauerstofispezies CYBA 242C gt T 754673 NOS3 786C gt T rs2070744 Wirksamkeit und Nebenwirkungen von VKORC1 2 1689G gt A rs9923231 Warfarin 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 SE 2 2 Testprinzip Zur Analyse der Mutationen werden die variablen Bereiche der unterschiedlichen Gene mittels PCR amplifiziert wobei frisch extrahierte genomische DNA des Patienten als Matrize dient Das Amplifikationsprodukt wird anschlie end auf den MutaCHIP gegeben und nach mitgeliefertem Protokoll bearbeitet Die Analyse mittels Pr zipitationsreaktion l sst eine eindeutige Genotypisierung aller auf den MutaCHIP gespotteten Allele der verschiedenen Gene zu Das amplifizierte Pro
20. he Hybridisation Buffer from step C e Add carefully 500 uL of Washing Buffer onto the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 51 C for 5 min E Conjugation step Set the thermoshaker to 21 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the thermoshaker The Washing Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Washing Buffer from step D e Add 100 uL of Conjugation Mix to the MutaCHIP e Incubate the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 15 min F Washing step after conjugation step Caution Pay attention to the correct adjustment of volume e Completely remove the Conjugation Mix from step E e Add of 500 uL Washing Buffer to the MutaCHIP e Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 5 min G Precipitation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Do not shake the MutaCHIP during the precipitation e Completely remove the Washing Buffer from step F e Add 100 uL of Substrate to the MutaCHIP and incubate for 5 min at 21 C To do so put the MutaCHIP into the thermoshaker Do not activate shaking function e Thereafter remove the Substrate completely pipette and immediately add 500 uL of Washing Buffer e Place the MutaCHIP into the image reader pay attention to the correct orientation take a picture and start with the analysis evaluation of the results see following chapter
21. n Edit View Favorites Tools Help New tab Ctrl T Duplicate tab Ctrl K New window Ctrl N New session Open Ctrl O Select Printer Ele meth Notepad Add Printer Save r PDFCreator Save as Ctrl Close tab Ctrl W Page setup Status Ready Print to file Print Ctrl P rn Print preview Er 7 Sample Page Range Import and export s we oe Type of sample Selection Current Page Properties Draw date Pages 1 Collate Work offline Processing date Enter either a single page number or a single Bit Report date 05 07 2011 sh ec Results and Interpretation Defective CYP2D6 alleles detected 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 12 Trouble shooting en een Software Message Warning The signals of the biotin reference markers are too low This could be a sign of a failed or missed conjugation step Alternatively the enzyme could be degraded The system will be stopped Software Message Warning The signals of the DNA probes indicate a failed amplification No bands on agarose gel Software Message No error description ErrorCode 3011 Poor image quality Blurred picture Check enzyme and or substrate Repeat the assay with new enzyme substrate Check the PCR products on a 2 agarose gel If the gel is empty please perform the amplification again and check on a gel before performing a chip Perform the DNA extraction again
22. rseite des MutaCHIPs k nnen die Analyse beintr chtigen Diese k nnen durch das s ubern mit einem weichen und feuchten Tuch entfernt werden Klicken Sie auf die Schaltfl che Analyse fortsetzen falls die Bildqualit t der in der oberen Abbildung entspricht 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 ES Schritt 4 Genotypisierungsergebnisse i Phim Csaqnerta Syiir Ss CYP2D6 Genotypisierungstest Hamarrgot Het Homiy Walallyps wii Mutat 3 e 4 di 6 6 h iH i o 10 o 1 Anahseprotokell 17 o rY Wikkommen beim PhanmGenonues Dregnoshe Syste 20 gt gt gt 17 OAT 1 id 2 o Wechsle Analysemodus gt Flahdatananalyse 3 27 Neve Rohdeien GOON Cy Pome Bilder Charge E gt Becpome Bildanahse 5 Kame Gan Delebon delaklarl gt gt Stade Transformation 7 207 Sots arfassl xh Keine Gen Duplikation detektiert Spots zugeadnet Erlasse Segnalstake ae Rohdaten i 2 5 E FF lie Pat A gt gt Stane Mormalisberung Genolymserung abgeschossen Nonmelisierung abgeschlossen Slane Gonabyossierung ba a m F Anahrelsstschrili Nach der vollst ndigen Datenanalyse k nnen Sie die Ergebnisse im Analysemodul Genotypisierungsmodul oder im Diagnosebericht abrufen Die dabei verwendete Symbole werden in der unten stehenden Tabelle erl utert Symbole der Software und ihre Bedeutung Der Patient tr gt auf beiden Allelen die gesunde Variante der
23. schlossen ype de ea gt Slane Gonabyoesierung z a m F After the complete data analysis the results can be access in the analysis module genotyping module or in the diagnostic report example picture The used icons are explained in the following table Symbole der Software und ihre Bedeutung The patient carries on both alleles the healthy variant of the investigated genetic variants The patient carries on one allele the healthy and on the other allele the mutated genetic variant The patient carries on both alleles the mutated genetic variation in homozygous form The signal values of the probes for this genetic variation are too weak for a valid result This could be caused by other sequence variations in close proximity to the investigated variant The remaining signals of the assay are not influenced Both probes for this genetic variant show an invalid signal This might be caused by impurities or dust particles on the MutaCHIP surface The remaining signals of the assay are not influenced 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Evaluation and Interpretation of Results 13 Step 5 Diagnostic report To evaluate the results open the diagnostic Report Main Therefore click on the button Report Additionally a odf document can be created or the report can be directly printed S amp S Bad http localhost PGDx_System_diag_Rep Tamox Rep O BO X PGDx System Diagnostic R X n
24. untersuchten genetischen Variation Der Patient tr gt auf einem Allel die gesunde und auf dem anderen Allel die mutierte genetische Variation Der Patient tr gt auf beiden Allelen die mutierte genetische Variation in homozygoter Form Die Signalwerte der Sonden f r diese genetische Variation sind zu gering um ein valides Ergebnis zu erzeugen Dies k nnte auf Sequenzver nderungen in direkter N he zur untersuchten Variation hindeuten Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt Beide Sonden f r diese genetische Variation erzeugen ein nicht g ltiges Signal Dies k nnte auf eine Verschmutzung auf der Chipoberfl che zur ckzuf hren sein Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 05 04 2013 Auswertung 13 Schritt 5 Diagnostischer Report Um die Daten auszuwerten lassen Sie sich den diagnostischen Report anzeigen Klicken Sie hierf r auf die Schaltfl che Report Zus tzlich k nnen Sie auch ein pdf Dokument erstellen oder den Report direkt ausdrucken PGDx System Diagnostic R X m j gt gt http localhost PGDx_System_diag_Rep Tamox Rep O B X Edit View Favorites Tools Help New tab Ctrl T Duplicate tab Ctrl K New window Ctrl N New session Open Ctrl O Select Printer Edit with Notepad Add Printer I PDFC Sav
25. water and click on the Take a new picture button Take anew picture To ensure a correct analysis result the picture quality of the MutaCHIP has to be checked Particles of dust on the bottom side of the MutaCHIP can affect the analysis These can be removed by cleaning with a soft and wet tissue Follow the instructions given in the screen shown here Press Continue analysis if the quality of the picture is comparable to the figure above 2013 Immundiagnostik AG Version 1 0 06 08 2013 Ss 2 Step 4 Genotyping results i Phim Chagrin et Srrlern i R kanal ee Kennen i Eai File E Praire end Fanart Feen F Fiese Ea Paii Sun Pa stent Goon P gt i aber Tal miri Gam ser Gam patient E xml wh 5 CYP2D6 Genotypisierungstest Hamazroot Hai Homo WilePiyp 3 a Mutaiean 3 4 als 6 o 7 gi o i 10 11 Anahseprotakesll 17 1 r kommen bem Fharmlbengmes ssgnosbe Syste 20 o gt gt 17 03 2011 1459309 44 e o Wechsle Anal pemodus R hdatananalyse Neve Rohdeien OCOMO VC YP ome Bilder Charge E Begining Bildanahse 2 Keune Gen Delahon celaklsarl gt gt Siani Translormahon z r u 207 Spots erfasst zN Keine Gen Duplikation detektiert 1 z x Spots migaardnei gt gt Erlasse Segnalstaike 1 gt G th Roahdatn gt gt Stane Mormalishcung Genolymsierung abgeschlossen Mormelisierung abge
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