Simplexa™ Flu A/B & RSV
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1. Die Leistung dieses Assays wurde mit m glicherweise interferierenden und in Nasenrachenabstrichen ggf vorhandenen Substanzen in den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Konzentrationen getestet Die m glicherweise interferierenden Substanzen wurden mit Influenza A Influenza A Hong Kong 8 68 und Influenza B Influenza B Malaysia 2506 2004 in einer Konzentration von 50 TCIDso ml und mit RSV A2 in einer Konzentration von 5 TCIDso ml untersucht Es ergaben sich keine Hinweise auf eine Interferenz aufgrund der getesteten Substanzen Konzentration der Potenziell interferierende Substanz Wirkstoff Interferierenden Substanz Afrin Nasenspray Oxymetazolin 15 Vol Vol Virostatikum Relenza Zanamivir 3 3 mg ml Virostatikum Tamiflu Oseltamivir 25 mg ml Antibiotikum systemisch Tobramycin 4 0 ug ml Antibiotikum Nasensalbe Mupirocin 6 6 mg ml SimplexaTM Flu A B amp RSV Seite 14 Gocus Konzentration der Potenziell interferierende Substanz Wirkstoff Interferierenden Substanz Blut n z 2 Vol Vol Bovines submaxillares Muzin Typ l S Gereinigtes Muzin Protein 60 ug ml Nasen Corticosteroid Beconase AQ Beclomethason 5 Vol Vol Nasen Corticosteroid Fluticason Fluticason 5 Vol Vol Zicam Nasengel Luffa Opperculata Galphimia glauca 5 Vol Vol histaminum hydrochloricum KOMPETITIVE INTERFERENZEN Die Studie der kompetitiven Interferenz untersuchte2. Influenza B Panama 45 90 RSV A Long Flu B detektiert RSV detektiert RSV B Wash 18537 62 RSV detektiert RSV B WVV 14617 85 RSV detektiert RSV B 9320 Kreuzreaktivit t analytische Spezifit t RSV detektiert Die analytische Spezifit t des Simplexa Tests wurde untersucht indem getestet wurde ob ausschlie lich Influenza A Virus und oder Influenza B Virus und oder RSV identifiziert werden ohne Kreuzreaktivit t auf nah verwandte Keime oder Keime die die gleichen klinischen Symptome verursachen oder Keime die als normale Flora in den zu untersuchenden Proben vorkommen Eine Serie von zweiunddrei ig 32 m glichen Kreuzreagenzien wurde einzeln in klinisch relevanten Konzentrationen in eine Abstrichmatrix geimpft Die unbeimpfte Matrix wurde ebenfalls getestet um Ausgangswerte zu erhalten Die Proben wurden dreifach getestet um Kreuzreaktivit t zu erkennen Falls in einem der Detektionskan le Flu A Flu B RSV in einem der drei Replikate ein Signal detektiert wurde wurden weitere 5 Replikate zur Best tigung getestet Weder f r Flu A noch f r Flu B oder RSV wurde Kreuzreaktivit t festgestellt SimplexaTM Flu A B amp RSV Seite 13 Gocus Simplexa Flu A B amp RSV Kreuzreaktivit t Kreuzreagenz Testkonzentration Einheiten Adenovirus 1 1 02 x10 TCIDso ml Adenovirus 7A 4 57 x10 TCIDso ml Bordetella pertussis 5 80 x10 KBE mI Chlamydia pneumoniae 1 52 x10 IFU mI Coronavirus 229
3. amp RSV Positive 2 Rot REF MOL2602 Lot EXP Control PC Beschreibung der Kit Komponenten Reaktionen Kit Komponente pro e Beschreibung der Komponente Kit Gef p Mit Fluoreszierendem Farbstoff markierte Primer die Influenza A Influenza B und RSV und die Interne Kontrolle spezifisch erkennen Sonden Anregung Emission i Target Fluorophore nm nm Zielgen Flu A FAM 495 520 matrix Simplexa Flu A B amp RSV 100 50 30 Primer Mix PM Flu B JOE 520 548 matrix RSV CFR610 590 610 M Gen Interne Kontrolle Q670 644 670 n z AR IC i Er i m MasterMe 100 50 200 DNA Polymerase Puffer und dNTPs RT Mix RT 100 100 50 Enzym Reverse Transkriptase Puffer Simplexa RNA Internal Control RNA IC 100 50 250 Verkapselte RNA Matritze Simplexa No Template Control NTC 8 4 800 Nukleasefreies Wasser i TM Simplexa SF lu AB SRS 8 4 800 Inaktiviertes Influenza A Virus Inaktiviertes Influenza B Virus Inaktiviertes RSV Positive Control PC i TM Simplexa a AB amp RSV n Z n Z Testspezifische Parameter Barcode Karte Simplexa Flu A B amp RSV Seite 3 fous ERFORDERLICHES JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL oo NDIPONZ 3M Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio Software Version 2 1 oder h her Universal Discs zur Verwendung auf dem Integrated Cycler Abdeckfolie f r Universal Discs Roche MagNA Pure LC und zugeh riges Verbr
4. 90 90 100 95 9 100 0 Flu A schwach positiv 90 90 100 95 9 100 0 Flu A medium positiv 90 90 100 95 9 100 0 Flu B hoch negativ 95 9 100 0 Flu B schwach positiv 90 90 100 95 9 100 0 Flu B medium positiv 90 90 100 95 9 100 0 RSV hoch negativ 90 90 100 95 9 100 0 RSV schwach positiv 90 90 100 95 9 100 0 RSV medium positiv Gesamt bereinstimmu ng 330 330 100 0 330 330 100 0 330 330 100 0 90 90 100 90 90 100 990 990 100 0 95 9 100 0 99 6 100 0 Focus Leerwert Kontrolle Pr fzentrum 1 SimplexaTM Flu A B amp RSV Seite 11 Reproduzierbarkeit Flu B Pr fzentrum 2 Pr fzentrum 3 berein stimmung mit den erwarteten Ergebnissen berein stimmung mit Durchs den erwartetei chn Ct Ergebnissen berein stimmung mit den erwarteten Ergebnissen Durc hsch n Ct Gesamt berein stimmung mit den erwarteten Ergebnissen 90 90 100 95 CI 95 9 100 0 Positivkontrolle 90 90 100 95 9 100 0 Flu A hoch negativ 90 90 100 95 9 100 0 Flu A schwach positiv 90 90 100 95 9 100 0 Flu A medium positiv 90 90 100 95 9 100 0 Flu B hoch negativ 89 90 98 9 94 0 100 0 Fl
5. Kits bis zum Ende des im Verfallsdatum auf der Verpackung genannten Monats stabil Den Grippe A B amp RSV Primer Mix Flu A B amp RSV Primer Mix den Master Mix die Grippe A B amp RSV Positivkontrolle Flu A B amp RSV Positive Control die interne RNA Kontrolle RNA Internal Control und die Leerwert Kontrolle No Template Control nach dem Auftauen und nach der ersten Verwendung nicht l nger als 30 Tage oder bis zum Verfallsdatum bei 2 C bis 8 C aufbewahren je nachdem was zuerst eintritt Den RT Mix bis zum Verfallsdatum bei 10 C bis 30 C aufbewahren Beschreibung der Beschriftung des Kits und der Kit Komponenten Kit Aufschrift ENGLISCH Simplexa Flu A B amp RSV Primer Mix SimplexaTM Master Mix RT Mix SimplexaTM RNA Internal Control SimplexaTM No Template Control Simplexa TM Flu A B amp RSV Positive Control REF EGSYMBOL MOL2601 REAG A MoL200 REAG B MoL9103 REAG C Focus Diagnostics Simplexa Flu A B amp RSV Teilenummer MOL2600 Anzahl der Komponenten R hrchen Farbcode Aufschrift pro Kit ne Flu A B amp RSV Primer Mix Braun REF MOL2601 Lot EXP Simplexa Master Mix MM 2 Gr n REF MOL2000 Lot EXP RT Mix RT 1 Gelb REF MOL9103 Lot EXP i TM T RNA Internal Control RNA 2 Blau REF MOL2004 Lot EXP Simplexa No Template Control NTC 2 Neutral REF MOL2001 Lot EXP m Simplexa Flu A B
6. Nucleic Acid Isolation Kit mit dem Ger t verwendet werden damit eine sachgerechte Leistung des Simplexa Flu A B amp RSV Assays sichergestellt ist Die Verwendung von Chargen die nicht von Focus Diagnostics f r die Verwendung mit dem Simplexa Flu A B amp RSV Test freigegeben sind ist nicht validiert und kann zu fehlerhaften Ergebnissen f hren Eine Liste der freigegeben Extraktionsreagenzien ist auf www focusdx com erh ltlich Bitte informieren Sie den Hersteller der zus tzlichen Reagenzien bei auftretenden Problemen mit diesen Reagenzien und Focus Diagnostics ber die Auswirkungen dieser Probleme auf die Leistungsf higkeit des Simplexa Kits HALTBARKEIT UND HANDHABUNG No 1 N ow Reagenzien bei 10 bis 30 C aufbewahren keine Gefrierger te mit Abtauautomatik verwenden Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden Primer Mix Master Mix Positivkontrolle Interne RNA Kontrolle und Leerwertkontrolle vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C Das Reaktionsgemisch nach Zugabe des RT Mix innerhalb einer Stunde verwenden Falls das PCR Setup nicht sofort nach Herstellung des Reaktionsgemisches durchgef hrt wird kann die Reaktionsmischung bei 2 C bis 8 C gelagert werden bis das PCR Setup innerhalb einer Stunde durchgef hrt werden kann Den RT Mix nach jedem Gebrauch bis zum Verfallsdatum einfrieren 10 C bis 30 C Primer Mix Mast
7. als Elutionsvolumen 50 ul eingestellt sein 5 Das Verd nnungsvolumen sollte f r alle Proben auf Null eingestellt sein 6 Das Post Elution Protocol muss auf None eingestellt sein 7 berpr fen Sie ob Proben und Kontrollen sich auf der Probenkartusche in der richtigen Position befinden 8 Jede Probe und die Positivkontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 9 200 ul von jeder Probe Positiv und Leerwert Kontrolle in die entsprechende Position in der Probenkartusche pipettieren 10 Den F llpegel der Proben und Kontrollen in der Probenkartusche einer Sichtpr fung unterziehen um sicherzustellen dass Probe n zugegeben wurde n 11 Die Interne RNA Kontrolle 2 Mal kurz vortexen und zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen Focus 12 13 14 Simplexa Flu A B amp RSV Seite 5 In jede Proben und alle Kontroll Kavit ten 5 ul Interne RNA Kontrolle pipettieren Zwischen den Proben die Pipettenspitze wechseln Die Probenkartusche mit den Proben in das MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extraktionsger t berf hren und die Extraktion starten Nach Abschluss der Nukleins ureextraktion kann die Kartusche mit den extrahierten Kontrollen und Patientenproben aus dem MagNA Pure Extraktor herausgenommen und verschlossen werden Die extrahierte RNA vor der Verwendung bei 2 8 C aufbewahren Die Langzeitaufbewa
8. die Auswirkungen klinisch relevanter Begleitinfektionen bei jedem der vom Assay nachgewiesenen Analyten Es wurde gepr ft ob eine hohe Konzentration eines Virus in der Probe die Leistung des Simplexa Assays hinsichtlich eines anderen niedrig konzentrierten Targets im Multiplex Assay m glicherweise beeinflussen k nnte Es wurde f r jedes Target Influenza A Influenza B und RSV eine schwach konzentrierte Probe etwa das 4 bis 6 Fache der Nachweisgrenze zubereitet und f r jede Probe ein Ct Baselinewert ermittelt Die schwach konzentrierte Probe wurde mit einer hohen Konzentration eines jeden m glicherweise bei einer Begleitinfektion vorhandenen Virus beimpft siehe nachstehende Tabelle Baseline Stamm Konzentration Kompetitiver Stamm Konzentration Influenza A PR 8 34 8 80 x 10 TCIDso ml RSV A2 1 60 x 104 TCIDso ml Influenza B Malaysia 2506 2004 1 29 x 10 TCIDso mi RSV A2 1 60 x 10 TCIDso ml Influenza A PR 8 34 2 50 x 10 TCIDso ml RSV A2 lt 10 TCIDso mi Influenza B Malaysia 2506 2004 2 58 x 10 TCIDso ml In dem seltenen Fall wenn sehr hohe Konzentrationen von Influenza A aber niedrige Konzentrationen von RSV vorhanden sind ist das Signal der RSV Reaktion aufgrund einer kompetitiven Interferenz unter Umst nden nicht stark genug um detektiert zu werden Es ist zu beachten dass keine Hinweise auf eine kompetitive Interferenz bei Vorhandensein aller drei Viren in moderaten Konzentrationen w
9. die H ufigkeit der Qualit tskontrollen ermitteln Erwartete Kontrollbereiche Simplexa Flu A B amp Simplexa Flu A B amp Simplexa Flu A B amp Simplexa interne Art der Kontrolle RSV Positivkontrolle RSV Positivkontrolle RSV Positivkontrolle RNA Kontrolle Flu A Ct Wert Flu B Ct Wert RSV Ct Wert RNA IK Positivkontrolle Ct lt 40 0 Ct lt 40 0 Ct lt 40 0 nicht zutreffend Eine Detektion der Simplexa internen RNA Kontrolle RNA IK ist f r ein g ltiges Ergebnis nicht erforderlich EINSCHR NKUNGEN 1 Die Personen die die Analyse durchf hren sollten sich f r der Durchf hrung des Assays eingehend mit den Testverfahren und der Ergebnisinterpretation vertraut gemacht haben 2 Die Detektion der viralen Nukleins uren h ngt von der ordnungsgem en Entnahme Handhabung Aufbewahrung und dem Transport der Proben sowie von der Probenvorbereitung einschlie lich der Extraktion ab Mangelnde Beachtung der ordnungsgem en Vorgehensweise bei einem dieser Schritte kann zu fehlerhaften Ergebnissen f hren 3 Alle Testergebnisse aus diesen und anderen Tests m ssen mit der klinischen Anamnese den epidemiologischen Daten und allen anderen Daten die dem zust ndigen Arzt vorliegen korrelieren 4 Die Pr valenz der Infektion beeinflusst den pr diktiven Wert des Assays 5 Wie bei anderen Tests auch schlie en negative Ergebnisse eine Infektion mit Influenza A Influenza B oder RSV nicht aus und d rfen
10. rkere Symptome auftreten die mit einer Infektion der unteren Atemwege wie Pneumonie einhergehen GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Bei dem Test handelt es sich um ein Echtzeit RT PCR System zur Amplifikation und Detektion Es verwendet eine bifunktionelle fluoreszierende Primersonde f r die Erkennung von RNA des menschlichen Influenza A Virus von RNA des menschlichen Simplexa TM Flu A B amp RSV Seite 2 Focus Influenza B Virus und von RNA des Respiratory Syncytial Virus in Nasenrachenabstrichen NPS Der Test besteht im Wesentlichen aus zwei Schritten 1 Extraktion von RNA aus Patientenproben 2 Amplifizierung eines spezifischen Zielmolek ls in jedem Analyt und in der internen RNA Kontrolle mithilfe einer bifunktionellen Fluoreszierenden Primersonde und eines R ckw rts Primers Der Assay liefert drei Ergebnisse zur Identifizierung dieser Viren in den Proben dienen als Zielmolek le konservierte Regionen der Influenza A Viren Matrix Gen der Influenza B Viren Matrix Gen und von RSV M Gen Zur berpr fung der Extraktion und zur Erkennung einer Hemmung der RT PCR wird eine interne RNA Kontrolle mitgef hrt MITGELIEFERTES MATERIAL Das Simplexa Flu A B amp RSV Kit von Focus Diagnostics enth lt ausreichend Reagenzien f r 100 Bestimmungen Nach Erhalt alle Komponenten des Kits bei 10 C bis 30 C aufbewahren Gefrierger te mit Abtauautomatik sind nicht geeignet Bei Lagerung zwischen 10 und 30 C sind die Komponenten des
11. 330 100 0 ANALYSEEMPFINDLICHKEIT NACHWEISGRENZE Die Nachweisgrenze Limit of Detection LoD des Simplexa Flu A B amp RSV Assays wurde mit quantifizierten Proben von Influenza A Influenza B und RSV Virusst mmen in Verd nnungsreihen in einer negativen Abstrichmatrix ermittelt Bei jedem Stamm wurde die Extraktion sowohl mit dem Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit als auch mit NucliiSENS easyMAG von bioM rieux durchgef hrt Als Nachweisgrenze f r jeden Assay wurde die niedrigste Konzentration mit einer Erkennung von 295 mindestens 19 von 20 Replikaten festgelegt 330 330 100 0 90 90 100 0 90 90 100 0 990 990 100 0 95 9 100 0 99 6 100 0 SimplexaTM Flu A B amp RSV Seite 12 Focus Simplexa Flu A B amp RSV Nachweisgrenze Virusstamm LoD MagNA Pure Extraktion LoD NucliSENS easyMAG TCID 5o ml Extraktion TCIDso mI Influenza A PR 8 34 H1N1 1 0x 10 1 0x 10 Influenza A Hong Kong 8 68 H3N2 Influenza B Great Lakes 1739 54 1 0x 10 1 0x 10 1 0x 10 5 0x 10 Influenza B Malaysia 2506 2004 RSV A2 1 0x 10 1 0x 10 1 0x 10 1 0x 10 RSV B1 1 0x 10 5 0x 10 ANALYTISCHE REAKTIVIT T KREUZREAKTIVIT T Analytische Reaktivit t Es wurden verschiedene St mme von Influenza A einschlie lich der Subtypen H1 und H3 von Influenza B und von RSV einsc
12. 4 15 16 17 18 19 Simplexa TM Flu A B amp RSV Seite 4 e Am Anfang steht die Probenextraktion gefolgt von der Einstellung des Ger ts zur Durchf hrung der Echtzeit PCR der Zubereitung der Reagenzien und schlie lich der Amplifizierung mittels Echtzeit PCR e Die Verbrauchsmaterialien und Instrumente d rfen nicht bereichs bergreifend zwischen den speziellen Probenextraktions und Probenvorbereitungsbereichen verwendet werden Sie sollten auch nicht zwischen den verschiedenen Bereichen ausgetauscht werden e Verbrauchsmaterial und technische Ausstattung f r die Probenvorbereitung d rfen nicht f r die Reagenzienzubereitung oder zum Bearbeiten amplifizierter DNA oder anderer Quellen der Zielnukleins ure verwendet werden e S mtliches Verbrauchsmaterial und s mtliche technische Vorrichtungen f r die Amplifikation m ssen die ganze Zeit ber im Bereich des Echtzeit PCR Ger ts verbleiben e Auch die pers nliche Schutzausr stung wie z B Laborkittel und Einmalhandschuhe sollten bereichsspezifisch gehandhabt werden Die Kontamination von Reagenzien bzw Patientenproben kann zu einer Verf lschung der Testergebnisse f hren Unter aseptischen Bedingungen arbeiten Die Reagenzien vorsichtig pipettieren und handhaben um eine Kontamination mit Material aus benachbarten Kavit ten zu verhindern Geeignete Pipettiertechniken anwenden und f r die Dauer des Tests das gleiche Pipettierschema einhalten um optimale und reproduzie
13. E 2 45 x10 TCIDso ml Coronavirus OC43 1 70 x10 TCIDso ml Corynebacterium diphtheriae 2 87 x10 KBE mI Cytomegalievirus 3 55 x10 TCIDso ml Enterovirus 71 1 41 x10 TCIDso ml Epstein Barr Virus 6 04 x10 Kopien mi Escherichia coli 0157H7 2 34 x10 KBE ml Haemophilus influenzae 2 60 x10 KBE ml Lactobacillus plantarum 17 5 1 75 x10 KBE ml Legionella longbeachae 7 10 x10 KBE ml Masern 1 26 x10 TCIDso ml Metapneumovirus 5 01 x10 TCIDso ml Moraxella catarrhalis Ne 11 6 83 x10 KBE ml Mumps 8 51 x10 TCIDso ml Mycobacterium tuberculosis 2 20 x10 KBE ml Mycoplasma pneumoniae Stamm M129 5 63 x10 TCIDso ml Neisseria elongata 1 99 x10 KBE mI Neisseria meningitidis 1 63 x10 KBE ml Parainfluenza 1 6 61 x10 TCIDso ml Parainfluenza 2 5 89 x10 TCIDso ml Parainfluenza 3 6 61 x10 TCIDso ml Pseudomonas aeruginosa 1 05 x10 KBE ml Rhinovirus 1A 3 16 x10 TCIDso ml Staphylococcus aureus COL 8 40 x10 KBE ml Staphylococcus epidermidis 3 80 x10 KBE ml Streptococcus pneumoniae 5 54 x10 KBE ml Streptococcus pyogenes 1 55 x10 KBE ml Streptococcus salivarius 1 14 x10 KBE ml 1 Das EBV Virus wird auf einer transformierten Zelllinie Marmoset Leukozyten vermehrt Transformierte Zellen eignen sich als Zelllinie nicht f r die Quantifizierung mit TCID ml deshalb wurden mit einem quantitativen PCR Verfahren Kopien ml berechnet INTERFERENZ
14. Hole Quencher CAL Fluor und Quasar sind Handelsmarken der Biosearch Technologies Inc BTI Die Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar Farbstofftechnologie ist im Rahmen eines Vertrags mit BTI lizenziert und diese Produkte werden ausschlie lich f r klinische diagnostische oder Forschungs und Entwicklungszwecke verkauft VERTRIEB DURCH mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Deutschland BESTELLINFORMATION Telefon 800 838 4548 nur USA Fax 562 240 6510 TECHNISCHE HILFE Telefon 800 838 4548 nur USA Fax 652 240 6526 Besuchen Sie unsere Webseite www focusdx com 562 240 6500 international 562 240 6500 international CE PI MOL2600 IVD Rev D Erstellungsdatum 16 Juni 2011 Focus Diagnostics Cypress Kalifornien 90630 USA
15. Nicht 100 50 50 detektiert 97 95 CI 94 4 99 8 detektiert 50 95 CI 92 9 100 Detektiert 79 0 Influenza B Zusammenfassung der klinischen bereinstimmung Retrospektive Proben SimplexaTM Flu A B amp RSV Seite 10 Gocus NAT mit hoher z Kultur DFA Leistung Simplexa Simplexa Nicht detektiert Sensitivit t Spezifit t 100 50 50 95 CI 92 9 100 100 93 93 95 C1 96 100 Nicht detektiert Detektiert Detektiert bereinstimmung 100 50 50 95 C1 92 9 100 100 127 127 Nicht a 95 CI 97 1 100 detektiert Detektiert 50 0 Detektiert 50 0 Nicht detektiert RSV Zusammenfassung der klinischen bereinstimmung Retrospektive Proben Simplexa Kultur DFA Simplexa Nicht detektiert Nicht detektiert Sensitivit t Spezifit t 100 22 22 95 CI 85 1 100 96 24 25 95 CI 80 5 99 3 Detektiert bereinstimmung Detektiert 100 22 22 95 CI 85 1 100 99 4 154 155 95 CI 96 4 99 9 Detektiert 22 0 Detektiert Nicht detektiert Nicht detektiert Leistungsf higer NAT Von der FDA freigegebener leistungsf higer Nukleins uretest Referenzmethode zur Untersuchung der klinischen Leistung zur Freigabe nach 510 k REPRODUZIERBARKEIT Drei Pr fzentren bestimmten die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit dem Ger t zwischen Labors Inter Labor
16. Normal Matrix Other Andere Nach den Angaben im Benutzerhandbuch in der NucliSENS easyMAGTM Software einen Extraction Run Extraktionslauf erstellen Jede Probe und die Positivkontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 200 ul der Probe der Positiv und der Leerwertkontrolle in die Probengef e pipettieren Die Interne RNA Kontrolle 2 Mal kurz vortexen und zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In jede Proben und alle Kontroll Kavit ten 5 ul Interne RNA Kontrolle pipettieren Zwischen den Proben die Pipettenspitze wechseln Nach den Angaben im Benutzerhandbuch das die Probengef e neue Verbrauchsmaterialien f r den Aspirator und Reagenzien in das easyMAG Ger t laden Die Lyse im Ger t starten und die Iysierten Proben 10 Minuten inkubieren bevor das magnetische Silica Gemisch zugegeben wird Das magnetische Silica Gemisch w hrend der Lyse Inkubation vorbereiten Silica mischen und mit nukleasefreiem Wasser verd nnen indem 1 Teil magnetisches Silica zu 3 Teilen nukleasefreiem Wasser gegeben wird z B 270 ul magnetisches Silica 810 ul nukleasefreies Wasser Je Probe mindestens 135 ul magnetisches Silica Gemisch vorbereiten Zum bertragen des magnetischen Silica Gemisches in die Kavit ten der ELISA Teststreifen das magnetische Silica Gemisch mischen und 1 Spitze sowie den Betriebsmodus P2 der Biohit P
17. RNA IK nicht erforderlich 2 berpr fung von Patientenprobenergebnissen Die berpr fung von Ergebnissen klinischer Proben muss erfolgen nachdem die Positiv und die Leerwert Kontrolle berpr ft und f r valide und akzeptabel befunden worden sind F r jede Patientenprobe m ssen die Flu A Flu B RSV Ergebnisse und die Ergebnisse der internen RNA Kontrolle berpr ft werden a Bei jedem Ergebnis mit einer Data Quality Meldung sind die Amplifizierungsdiagramme zu berpr fen W hlen Sie in der Registerkarte Data Daten die Kurve aus die Sie berpr fen m chten und klicken Sie auf Refresh Aktualisieren Die Software zeichnet die ausgew hlten Kurven und passt die Skala des Diagramms an Eine g ltige Amplifizierungskurve zeigt einen glatten exponentiellen Anstieg Eine ung ltige Amplifizierungskurve kann einen nicht exponentiellen oder linearen Anstieg mit Spitzen zeigen die m glicherweise die Grenzwerte berschreiten Falls die Kurve als g ltig beurteilt wird kann der ausgegebene Ct Wert verwendet werden um wie in Abschnitt 3 unten beschrieben zu beurteilen ob die Flu A Flu B oder RSV Targets detektiert wurden b Wenn die Amplifizierungskurve f r Flu A Flu B oder RSV valide ist ist eine Erkennung der internen RNA Kontrolle nicht erforderlich um ein positives Ergebnis angeben zu k nnen Interpretation der Ergebnisse Ct Wert der Beispiel Internen Interpretation RNA Kontr Flu A Flu B und RSV nic
18. Reproduzierbarkeit sowie die Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb von Tests Inter Intra Assay Reproduzierbarkeit Jedes der drei Laboratorien untersuchte neun Proben die Positivkontrolle und die Leerwert Kontrolle an f nf verschiedenen Tagen in dreifacher Ausfertigung An jedem Pr fzentrum gab es zwei Personen Operators von denen jede den Test einmal pro Tag durchf hrte d h insgesamt fanden pro Tag 2 L ufe statt Zwei Pr fzentren f hrten die Extraktion mit dem MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit durch zwei Pr fzentren f hrten den Extraktionsschritt mit dem NucliSENS easyMAGT M von bioM rieux durch Die zusammengefassten Ergebnisse aller drei Pr fzentren sind in den folgenden Tabellen aufgelistet Zur Berechnung der Mittelwerte und Streuungskomponenten wurde Proben die ein negatives Ergebnis Ct 0 aufwiesen ein Wert von 40 0 zugewiesen da ein Wert von 40 0 eher negativen Proben mit Ct Werten am oberen Grenzwert des Bereichs entspricht Reproduzierbarkeit Flu A Pr fzentrum 1 Pr fzentrum 2 Pr fzentrum 3 berein stimmung mit den berein stimmung mit den Gesamt berein stimmung mit den berein A Dur stimmung mi 2 hsch 95 CI Leerwert Kontrolle erwarteten Ergebnissen den erwartete Ergebnissen erwarteten n Ct Ergebnissen erwarteten Ergebnissen 90 90 100 95 9 100 0 Positivkontrolle 90 90 100 95 9 100 0 Flu A hoch negativ
19. Simplexa Flu A B amp RSV MOL2600 Rev D Echtzeit RT PCR Test zum qualitativen Nachweis und zur Differenzierung viraler RNA von Influenza A Influenza B amp RSV in vitro OCUS Diagnostics In vitro Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Der SimplexaTM Flu A B amp RSV Assay von Focus Diagnostics ist f r die Anwendung auf dem Integrated Cycler von 3M f r den qualitativen Nachweis und die Differenzierung von RNA zwischen dem Influenza A dem Influenza B und dem Respiratory Syncytial Virus RSV in vitro in Nasenrachenabstrichen NPS aus menschlichen Patienten mit Anzeichen und Symptomen einer viralen Atemwegsinfektion in Verbindung mit dem Vorliegen klinischer und epidemiologischer Risikofaktoren bestimmt Der Test ist als Hilfsmittel zur Differentialdiagnose bei Infektionen mit dem Influenza A dem Influenza B und dem RS Virus beim Menschen und nicht zur Erkennung einer Infektion mit dem Influenza C Virus bestimmt Negative Ergebnisse schlie en eine Infektion mit Influenza oder RS Virus nicht aus und d rfen nicht als alleinige Grundlage f r die Behandlung oder andere Entscheidungen bez glich der Versorgung des Patienten herangezogen werden Die Leistungscharakteristika f r Influenza A wurden w hrend der Grippesaison 2010 als H1N1 Influenza 2009 das vorherrschende Influenza A Virus war Wenn andere Influenza A Viren auftreten k nnen sich die Leistungscharakteristika ndern Wenn basierend auf den von den Gesundh
20. aktionsgemisch Reaktionsgemisch Reagens Volumen 1 Volumen 10 Reaktion Reaktionen Simplexa Master Mix 4 0 ul 40 ul Simplexa Flu A B amp RSV Primer Mix 0 5 pl zu RT Mix 0 5 ul 5 ul Gesamtvolumen 5 0 ul 50 ul Das Reaktionsgemisch durch Umdrehen des R hrchens oder durch 8 bis 10 maliges Pipettieren vorsichtig mischen Kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen Mit der Vorbereitung der PCR fortfahren Das Reaktionsgemisch nach der Zubereitung innerhalb von einer Stunde verwenden Falls das PCR Setup nicht sofort nach Herstellung des Reaktionsgemisches durchgef hrt wird kann die Reaktionsmischung bei 2 C bis 8 C gelagert werden bis das PCR Setup innerhalb einer Stunde durchgef hrt werden kann E BEREICH F R DIE ECHTZEIT PCR AMPLIFIKATION In einem speziellen der Vorbereitung der Universal Disc mit 96 Kavit ten f r den Simplexa Flu A B amp RSV Assay vorbehaltenen Bereich arbeiten oD 29 PUEN A 4 5 In jede Kavit t 5 0 ul des Reaktionsgemischs geben Der mit PC markierten Kavit t auf der Disc 5 0 ul der extrahierten Positivkontrolle hinzuf gen Der mit S markierten Kavit t auf der Disc 5 0 ul der extrahierten Patientenprobe hinzuf gen Der mit NTC markierten Kavit t auf der Disc 5 0 uL der extrahierten Leerwert Kontrolle hinzuf gen Die Disc mit dem Universal Disc Cover Tape abdecken Die Universal Disc in den Integrated Cy
21. auchsmaterial aT Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Kat Nr 3038505001 P NucliSENS easyMAG Ger t von bioM rieux und dazugeh rige s Verbrauchsmaterial und Reagenzien P Biohit bioMerieux Mehrkanalpipette a ELISA Teststreifenplatte Ein Mehrkanalmikropipette n und oder Repetiermikropipette n mit einem Genauigkeitsbereich von 1 10 ul 10 100 ul und 100 1000 ui Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Kit Komponenten Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Proben K hlschrank mit 2 C bis 8 C f r aufgetaute Kit Komponenten Biologische Sicherheitswerkbank Laminarflow Haube f r die Durchf hrung der Extraktionen Mikrozentrifuge Vortex Mischer Sterile RNase DNase freie Einmalpipettenspitzen mit Aerosolbarriere 1 5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen und St nder RNase DNase freie R hrchen werden empfohlen sind aber nicht vorgeschrieben Einweg Schutzhandschuhe ungepudert Nukleasefreies Wasser K hlst nder f r 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen Zur Verwendung beim Roche MagNA Pure LC Extraktionsverfahren Zur Verwendung mit dem bioM rieux easyMAG Extraktionsverfahren HINWEIS f r US Kunden Wenn Sie sich f r die Anwendung des MagNA Pure Extraktionsverfahrens entscheiden d rfen nur qualifizierte Herstellerschargen des MagNA Pure LC Total
22. cler laden und den Lauf starten ATENANALYSE Nach Beendigung des Laufs auf Analyze Analysieren klicken Die Kan le nacheinander oder alle Kan le auf einmal pr fen Die Schaltfl che Print Preview Druckvorschau unten rechts dr cken dann die Auswahlk stchen Include Graphs Diagramme einschlie en und Include Ct Values Ct Werte aufnehmen markieren um eine bersicht der Ct Werte und die Amplifikationsdiagramme zu erhalten Die Seiten mithilfe der Pfeiltasten oben links im Fenster Print Preview Druckvorschau durchsehen Den Bericht nach Bedarf ausdrucken oder abspeichern Die Ct Werte ggf exportieren ERSTELLUNG VON ERGEBNISBERICHTEN Die Erstellung von Ergebnisberichten ist ein dreistufiger Prozess 1 berpr fung der Kontrollen um festzustellen ob der Lauf g ltig ist Die Integrated Cycler Studio Software unterdr ckt die Interpretation der Patientenergebnisse falls die als Kontrollen programmierten Proben ung ltig sind 2 berpr fung der Validit t von Patientenprobenergebnissen 3 Interpretation der Patientenergebnisse Wenn die Kontrollen nicht valide sind k nnen die Patientenergebnisse nicht ausgewertet werden 4 Durch berpr fung der Flu A B und RSV Positivkontrollen der Leerwert Kontrolle und der internen RNA Kontrolle die Validit t des Laufs ermitteln Simplexa TM Flu A B amp RSV Seite 7 Kriterien f r eine valide Kontrolle vereinfacht ____ Kontrolle Flu ACt Flu B Ct RSV Ct RNA IK C
23. duelle R hrchen berf hren um die Chance dass magnetisches Silica zur ck in die Probe f llt zu minimieren Die extrahierte RNA bis zum Gebrauch bei 2 8 C aufbewahren Die Langzeitaufbewahrung extrahierter Proben bei lags Simplexa Flu A B amp RSV Seite 6 dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte RNA Proben beim Laden der Disc auf einem K hlblock aufbewahren C EINSTELLUNG DES GER TS F R DIE ECHTZEIT PCR 1 Im Bedienungshandbuch f r den Integrated Cycler wird detailliert beschrieben wie die Integrated Cycler Studio Software im einzelnen zu konfigurieren ist um auf dem Integrated Cycler Assays zu definieren sowie L ufe einzurichten und zu analysieren D REAGENZIENZUBEREITUNGSBEREICH Spezieller Bereich welcher der Zubereitung des Simplexa Flu A B amp RSV Assay Reaktionsgemisches vorbehalten ist 1 Dan Bw Primer Mix und Master Mix bei Raumtemperatur etwa 18 C bis 25 C auftauen Jedes R hrchen im Kit enth lt eine f r 50 Reaktionen ausreichende Reagenzienmenge Vor jedem Gebrauch Primer Mix und Master Mix Komponenten 6 bis 8 mal vorsichtig umdrehen um sie zu durchmischen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In ein Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen jede Komponente in dem in der folgenden Tabelle angegebenen Volumen pipettieren um das erforderliche Volumen des Reaktionsgemisches zuzubereiten Reaktionsgemischvolumen Re
24. eitsbeh rden empfohlenen aktuellen klinischen und epidemiologischen Screening Kriterien eine Infektion mit einem neuartigen Influenza A Virus vermutet wird sollten unter f r neuartige virulente Influenza Viren geeigneten Infektionsschutzma nahmen Proben entnommen werden und an die lokalen oder nationalen Gesundheitsbeh rden zur Untersuchung eingeschickt werden Falls keine BSL 3 Einrichtung zur Verf gung steht die die Proben verarbeitet und kultiviert d rfen in diesen F llen keine Viruskulturen angelegt werden ZUSAMMENFASSUNG UND ERL UTERUNG Influenza wird von drei immunologischen Typen A B und C von RNA Viren aus der Familie der Orthomyxoviridae verursacht Die weitere Klassifizierung von Influenza A st tzt sich auf die Beschreibung von zwei auf der Virusoberfl che exprimierten Virusproteinen H magglutinin und Neuraminidase H magglutinin erm glicht die Bindung des Virus an die Epithelzellen der Atemwege w hrend Neuraminidase diese Bindungen an die Wirtszelle l st sodass neue Virionen freigesetzt werden k nnen Saisonale Influenza wird blicherweise durch Viren verursacht die einen der drei h ufigsten H magglutininsubtypen H1 H2 oder H3 und zwei Neuraminidasesubtypen N1 oder N2 enthalten Influenza B wird nicht in Subtypen klassifiziert Influenza u ert sich in der Regel in einer Kombination von Anzeichen und Symptomen der oberen und unteren Atemwege sowie Fieber Kopfschmerzen Muskelschmerzen und allgemeinem Unw
25. ektiert bereinstimmung Detektiert detektiert Spezifit t 100 25 25 100 22 22 95 CI 86 7 100 Petektiert 95 CI 85 1 100 Nicht 99 8 527 528 Nicht 99 3 530 534 detektiert 95 C1 98 9 100 detektiert 95 C1 98 1 99 7 Detektiert Leistungsf hi ger NAT Simplexa Nicht Nicht Sensitivit t Detektiert detektiert bereinstimmung detektiert Spezifit t 50 1 2 100 1 1 95 CI 9 5 90 5 Detektiert 95 CI 20 7 100 Nicht 99 8 550 551 Nicht 99 8 554 555 detektiert 95 C1 99 100 detektiert 95 C1 99 100 Detektiert 1 1 RSV Zusammenfassung der klinischen bereinstimmung Prospektive Proben hoher Leistung Simplexa Kultur DFA Simplexa n Nicht Nicht Sensitivit t Detektiert detektiert bereinstimmung Detektiert detektiert Spezifit t 99 1 110 111 98 98 100 95 CI 95 1 99 8 Detektiert 98 2 95 CI 93 99 4 Nicht 99 5 440 442 Nicht 96 9 441 455 detektiert 95 C1 98 4 99 9 detektiert 14 95 C1 94 9 98 2 Detektiert 111 110 1 Influenza A Zusammenfassung der klinischen bereinstimmung Retrospektive Proben NAT mit hoher z 3 Leistung Simplexa Kultur DFA Simplexa Nicht Nicht Sensitivit t Detektiert detektiert bereinstimmung Detektiert detektiert Spezifit t 100 79 79 100 80 80 95 CI 95 4 100 Detektiert 80 0 95 CI 95 4 100 Nicht 99 97 98
26. enentnahme die Handhabung und der Transport der Proben die Jahreszeit das Alter der Patienten und die lokale Krankheitspr valenz Die prospektiven Proben die wir in unserer klinischen Studie verwendeten stammten aus den USA und aus Australien Die Pr valenz aller Influenzaviren in den USA w hrend des Zeitraums der Probensammlung von Februar bis M rz 2010 lag im Bereich von 3 5 bis 6 4 Von den Influenza Positiven waren 97 bis 99 6 f r Influenza A und O bis 1 5 f r Influenza B positiv In jedem Herbst Winter und oder in den Fr hlingsmonaten treten RSV Epidemien auf die in der Regel 3 4 Monate anhalten Wann genau die RSV Epidemien jeweils auftreten kann je nach Region verschieden sein Die Pr valenz von RSV in den USA w hrend des Zeitraums der Probensammlung von Februar bis M rz 2010 lag im Bereich von 5 bis 12 4 Die im Rahmen unserer klinischen Studie festgestellte Pr valenz ist in der nachstehenden Tabelle angegeben Region o o ooa ru B nv LITERATUR 1 http www cdc gov rsv clinical description html 2 http www cdc gov Flu weekly Fluactivity htm 3 http www cdc gov Features dsRSV 4 http www cdc gov surveillance nrevss rsv state html Focus Simplexa Flu A B amp RSV Seite 16 Die Anwendung von Scorpions Sonden f r Zwecke in Zusammenhang mit der In vitro Diagnostik beim Menschen ist durch eine Lizenz gesch tzt die Focus Diagnostics Inc von DxS Ltd erworben hat Die Farbstoffe Black
27. er Mix Positivkontrolle Interne RNA Kontrolle und Leerwert Kontrolle aufgetaut nicht l nger als 30 Tage bei 2 C bis 8 C aufbewahren Primer Mix Master Mix Interne RNA Kontrolle oder Positivkontrolle nicht wieder einfrieren Keine Reagenzien aus verschiedenen Kitchargen kombinieren WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1 2 3 In vitro Diagnostikum Befolgen Sie die allgemein anerkannten Vorsichtsma nahmen S mtliche Patientenproben und Positivkontrollen sind als potenziell infekti s zu betrachten und dementsprechend zu handhaben Beim Umgang mit den Kit Reagenzien pers nliche Schutzausr stung wie jedoch nicht beschr nkt auf Handschuhe und Laborkittel tragen H nde nach der Durchf hrung des Tests gr ndlich waschen Nicht mit dem Mund pipettieren In Bereichen in denen Kit Reagenzien und oder Humanproben gehandhabt werden nicht rauchen trinken und essen nicht erlaubt In diesen Bereichen sollten auch keine Kontaktlinsen eingesetzt herausgenommen und kein Make up aufgetragen werden Nicht verwendete Kit Reagenzien bzw Humanproben gem den rtlichen und nationalen Bestimmungen entsorgen Der Arbeitsablauf im Labor sollte nur in einer Richtung erfolgen ausgehend vom von den Pr Amplifikationsbereich en in Richtung Amplifikations Detektionsbereich Im folgenden Abschnitt wird der Ablauf der Arbeitsschritte von der Probenextraktion bis zur Amplifizierung mittels Echtzeit PCR beschrieben 10 11 12 13 1
28. hlie lich der Subtypen A und B untersucht Gew hlt wurden die St mme die j ngst im Umlauf waren sowie geografisch unterschiedliche St mme Von quantifiziertem Virusmaterial wurde in einer negativen Abstrichmatrix eine einzige Verd nnung in der N he der Nachweisgrenze mit einer Konzentration von etwa 1 0 x 10 TCIDso ml hergestellt und in dreifacher Ausf hrung getestet Analytische Reaktivit t mit zus tzlichen Virusst mmen Virusstamm Geringste detektierte Konzentration Influenza A Wisconsin 67 05 H3 TCIDso ml Ergebnis Flu A detektiert Influenza A New Caledonia 10 07 H1N1 Flu A detektiert Influenza A Brisbane 10 07 H3 Flu A detektiert Influenza A Solomon Island 03 06 H1 Flu A detektiert Influenza A Taiwan 42 06 H1N1 Flu A detektiert Influenza A Brisbane 59 07 H1 Flu A detektiert Influenza A Swine NY 02 2009 H1 Flu A detektiert Influenza A WS 33 H1N1 Flu A detektiert Influenza A Port Chalmers 1 73 H3N2 Flu A detektiert Influenza A California 7 2009 NYMC X 179A Influenza B Florida 02 06 Flu A detektiert Flu B detektiert Influenza B Florida 04 06 Flu B detektiert Influenza B Florida 07 04 Flu B detektiert Influenza B Lee 40 Flu B detektiert Influenza B Maryland 1 59 Flu B detektiert Influenza B Hong Kong 5 72 Flu B detektiert Influenza B Allen 45 Flu B detektiert Influenza B Taiwan 2 62 Flu B detektiert
29. hrung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte RNA Proben beim Beschicken der Disc auf einem K hlblock aufbewahren Extraktion mit dem NucliSENS easyMAGTM Extraktionsverfahren von bioM rieux 1 2 10 11 12 13 14 15 16 17 Zur Bedienung von Ger t und Software ist das Benutzerhandbuch des NucliSENS easyMAG zu beachten In der NucliSENS easyMAGT Software die Vorlage Generic Allgemein mit folgenden Einstellungen w hlen Default Request Standardanfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Run Name Prefix Vorsilbe der Laufbezeichnung beliebig Sample ID prefix Vorsilbe der Proben ID beliebig Sample Type Probentyp Primary Prim r Workflow Defaults Standardarbeitsabl ufe On board Iysis Incubation Lyse Inkubation im Ger t On board Silica Incubation Inkubation mit Silica im Ger t Sample Addition Guidance Off Hinweise zur Zugabe von Proben aus Reagent Tracking R ckverfolgung der Reagenzien Lysis Silica Internal Control reagent tracking disabled R ckverfolgung von Lyse Reagenz Silica und interner Kontrolle deaktiviert Die individuellen Probendaten im Bildschirm Extraction Request Extraktionsanforderung folgenderweise eingeben Sample ID Proben ID Probenbezeichnung eingeben Request Anfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Volume Volumen mL 0 200 Eluate Eluat pl 50 Type Typ Primary Prim r Priority Priorit t
30. ht detektiert Flu A detektiert Flu B detektiert RSV detektiert Flu A und Flu B detektiert Flu B und RSV detektiert Flu A und RSV detektiert DINIDILAAN Flu A Flu B und RSV detektiert Ung ltig erneut extrahieren und Test wiederholen Ct Zyklus Schwellenwert Detektiert ist Ct lt 40 0 Nicht detektiert ist Ct 0 Eine Detektion der Simplexa internen RNA Kontrolle ist nicht erforderlich um ein positives Ergebnis angeben zu k nnen Aufgrund der niedrigen Inzidenz einer Dreifachlnfektion mit Influenza A Influenza B und RSV wird empfohlen Proben in denen Nukleins uren aller drei Analyte nachgewiesen werden noch einmal zu testen MESSBEREICH Die Proben aus den klinischen Studien die positiv getestet wurden wiesen Ct Werte f r Flu A im Bereich von 14 9 31 2 Ct Werte f r Flu B im Bereich von 15 9 33 5 und Ct Werte f r RSV im Bereich von 14 4 35 3 auf Bei den meisten Proben ergeben sich f r jedes Target Ct Werte lt 35 Simplexa Flu A B amp RSV Seite 8 fous QUALIT TSKONTROLLE Qualit tskontrollbereiche wurden wie in der folgenden Tabelle angegeben ermittelt Weichen die Kontrollen von diesen Parametern ab so sollten die Patientenprobenergebnisse als ung ltig angesehen und der Test wiederholt werden Jedes Labor sollte ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen Bestimmungen und der blichen guten Laborpraxis eigene Qualit tskontrollbereiche wie auch
31. ie in unserer Positivkontrolle vorliegen HEMMUNG DURCH ANDERE MIKROORGANISMEN Der SimplexaTY Assay wurde auf seine F higkeit zur Erkennung von Influenza A Virus Influenza B Virus und RSV im Beisein potenziell inhibitorischer Organismen untersucht Das Panel von zweiunddrei ig 32 potenziellen inhibitorischen Organismen wurde einzeln in einen Pool mit niedriger Konzentration etwa doppelte Nachweisgrenze von Influenza A Influenza A PR 8 34 Influenza B Influenza B Malaysia 2506 2004 und RSV A2 geimpft Die Proben wurden dreifach getestet um eine Hemmung zu erkennen Falls in einem der Detektionskan le Flu A Flu B RSV in einem der drei Replikate kein Signal detektiert wurde wurden weitere 5 Replikate zur Best tigung getestet Weder f r Influenza A noch f r Influenza B oder RSV wurde eine hemmende Wirkung festgestellt Konzentration des Konzentrationseinheite Mikroorganismus n BET Toba Adenovirus 7A 1 1x10 TCIDso mI Bordetella pertussis 1 1 x10 KBE mI EzEZ Chlamydia pneumoniae 1 1x10 Kopien ml Mikroorganismus EET Team Coronavirus 229E 1 1 x10 TCIDso ml Coronavirus OC43 1 1 x10 TCIDso ml EAEJ Corynebacterium diphtheriae 1 1x10 KBE mI E coli 0157 1 1 x10 KBE mI EBV 1 1x10 Kopien ml Enterovirus 71 1 1x10 TCIDso mI g E Simplexa Flu A B amp RSV Seite 15 Gocus Konzentration des Konzent
32. ipette verwenden Auf Start dr cken um 1050 WI des magnetischen Silica Gemisches anzusaugen und nochmals auf Start dr cken um das erste Volumen zur ck in das R hrchen mit Silica Gemisch auszuwerfen Auf Start dr cken um 125 ul des magnetischen Silica Gemisches in 8 einzelne Kavit ten des ELISA Teststreifens zu pipettieren Nach Bedarf f r weitere ELISA Teststreifen wiederholenNach der 10 min tigen Lyseinkubation 8 Spitzen je ELISA Teststreifen und den Betriebsmodus P3 der Biohit Pipette verwenden um jeder Probe in dem Probengef 100 ul des magnetischen Silica Gemisches zuzugeben Die Spitzen in die Kavit ten der ELISA Teststreifen geben und Start dr cken um das magnetische Silica Gemisch zu mischen und anzusaugen Das magnetische Silica Gemisch in das jeweilige Probengef geben und die Pipettenspitzen n in die Proben abwerfen Sie sollten sich unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels befinden Auf Start dr cken um das magnetische Silica anzusaugen zu pipettieren und mit den Proben zu mischen 3x Die Pipettenspitzen m ssen unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels bleiben damit der Mischvorgang korrekt ausgef hrt wird Schritt 11 und 12 f r weitere Probengef e wiederholen dabei jeweils neue Spitzen verwenden Nach Zugabe des magnetischen Silica Gemisches zu allen Probengef en den Extraktionslauf starten Nach Abschluss des Laufs die Probengef e aus dem Ger t nehmen Werden die Proben nicht sofort weiterverwendet in indivi
33. ktiv archivierten Proben von Patienten mit Anzeichen und Symptomen einer Virusinfektion der Atemwege wurden insgesamt 735 Nasenrachenabstrichproben verwendet Die Zusammenstellung der prospektiven Proben erfolgte in Bundesstaaten im S den der USA vom 26 Februar 2010 bis 24 M rz 2010 und in Australien vom 4 Juli 2010 bis 17 August 2010 Drei 3 Proben wurden wegen des Status Nicht eindeutig im G Simplexa Flu A B amp RSV Seite 9 FOCUS Referenz Nukleins uretest aus der prospektiven Analyse ausgeschlossen und zwei 2 Proben wurden wegen des Status ung ltig im Simplexa Assay ausgeschlossen Die Proben waren auch nach Testwiederholung entweder nicht eindeutig oder ung ltig Eine 1 Probe wurde aufgrund nicht vorliegender Kultur DFA Ergebnisse f r RSV aus der prospektiven Analyse ausgeschlossen Aufgrund der niedrigen Pr valenzrate von Influenza w hrend der Probensammlung und der Seltenheit von RSV bei Erwachsenen wurden au erdem retrospektiv gesammelte Proben aus der Grippe und RSV Saison 2008 2009 und Anfang 2010 von Patienten mit Anzeichen und Symptomen einer viralen Atemwegsinfektion in Bundestaaten im Osten und mittleren Westen der USA untersucht n 177 Von den 177 gesammelten Proben wurden 47 nicht per Kultur DFA auf Influenza A oder Influenza B untersucht Influenza A Zusammenfassung der klinischen bereinstimmung Prospektive Proben a Simplexa Kultur DFA Simplexa Nicht Nicht Sensitivit t Detektiert det
34. nicht als alleinige Grundlage f r die Behandlung oder andere Entscheidungen bez glich der Versorgung des Patienten herangezogen werden 6 Falls der die Infektion verursachende Organismus Genmutationen Insertionen Deletionen oder Rearrangements aufweist oder wenn die Testung fr h im Krankheitsverlauf vorgenommen wird kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen 7 Falsch negative Ergebnisse k nnen auftreten wenn in der Probe aufgrund falscher Entnahme falschen Transports oder falscher Handhabung zu wenig Organismen vorhanden sind 8 Es k nnen falsch positive Ergebnisse auftreten Eine Wiederholung des Tests oder die Durchf hrung des Tests mit einem anderen Instrument k nnte in manchen F llen indiziert sein 9 Virale Nukleins uren k nnen in vivo auch unabh ngig von lebensf higen Viren erhalten bleiben Die Detektion eines Targets bedeutet nicht dass die entsprechenden Viren infekti s sind oder dass Sie die Ursache f r die klinischen Symptome sind 10 Bei dem Assay handelt es sich um ein qualitatives Testverfahren das keine Aussage ber die Gesamtmenge der detektierten Erreger erlaubt 11 Die Leistungsf higkeit dieses Tests wurde nur mit Humanproben untersucht 12 Die Leistungsf higkeit dieses Tests wurde f r keine anderen Probentypen au er f r Nasenrachenabstriche bestimmt 13 Die Leistungsf higkeit dieses Tests wurde bei Personen mit eingeschr nktem Immunsystem nicht untersucht 14 Die Leistungsf higkeit dieses A
35. ohlsein Das Krankheitsbild kann unterschiedlich ausfallen das Spektrum reicht von isolierten erk ltungs hnlichen Atemwegsbeschwerden bis hin zu schwerer Lungenentz ndung die station r behandelt werden muss Personen bei denen ein h heres Risiko f r station re Behandlungen besteht sind Kinder unter 2 Jahren Erwachsene jenseits des 65 Lebensjahres und Patienten mit signifikanten Begleitkrankheiten Eine Grippe kann zu einer Verschlechterung von medizinischen Basiserkrankungen f hren Die Dauer der Krankheit betr gt in der Regel 2 5 Tage jedoch k nnen die Symptome auch eine Woche oder l nger anhalten Eine Infektion mit dem Respiratory Syncytial Virus RSV ist bei S uglingen und Kleinkindern pr valenter kommt aber auch bei Erwachsenen vor insbesondere in Seniorenheimen oder bei Patienten mit beeintr chtigtem Immunsystem RSV verursacht verschiedene Atemwegssymptome Bei S uglingen und kleinen Kindern kann RSV erk ltungsartige Symptome Bronchitis Krupphusten und oder Infektionen der unteren Atemwege wie Bronchiolitis und Pneumonie hervorrufen Eine symptomatische Infektion bei Erwachsenen geht in der Regel mit einer Infektion der oberen Atemwege einher und kann sich durch eine laufende Nase Rhinorrh Halsschmerzen Pharyngitis Husten Kopfschmerzen Abgeschlagenheit und Fieber u ern Bei manchen Hochrisikopersonen beispielsweise solchen mit bestimmten chronischen Krankheiten oder unter Immunsuppression k nnen allerdings st
36. rationseinheite Mikroorganismus n Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum 17 5 Legionella longbeachae Masem Metapneumovirus Moraxella catarrhalis Ne11 Mumps Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae M129 Neisseria elongata Neisseria meningitidis Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Pseudomonas aeruginosa Rhinovirus 1A Staphylococcus aureus COL Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius 1 Der Test schien anfangs auf eine m gliche Hemmung hinzudeuten was sich bei Testwiederholung nicht best tigte Mikroorganismus KONTAMINATION DURCH VERSCHLEPPUNG Die Studie auf Amplifikation von Verschleppungen zielte darauf ab Kontaminationen in hoch negativen Proben festzustellen Die Studie bestand daraus eine hoch positive und eine hoch negative Probe abwechselnd auf jeder Disc zu platzieren Der Verschleppungseffekt wurde durch Vergleich der beobachteten Negativrate f r die hoch negative Probe mit der erwarteten Rate unter normalen Bedingungen der Testwiederholung bestimmt Weder f r Flu A noch f r Flu B oder RSV wurde eine Kontamination durch Verschleppung festgestellt ERWARTETE WERTE Die Pr valenz der Influenza ndert sich jedes Jahr eine Grippesaison tritt in den USA im Herbst und Winter auf Zu den Variablen die die Anzahl der positiven F lle aus Atemwegsproben beeinflussen geh ren die Effizienz und die Auswahl des Zeitpunktes der Prob
37. rbare Werte zu erhalten Die Reagenzien nicht gegen Reagenzien anderer Kit Chargen oder anderer Hersteller austauschen oder mit diesen mischen Die Verschlusskappen der Reagenzr hrchen nicht vertauschen Dies k nnte zu Kontaminationen und zur Beeintr chtigung der Testergebnisse f hren Nur das in diesem Beipackzettel beschriebene Protokoll verwenden Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der angegebenen Zeiten oder Temperaturen kann es fehlerhaften Testergebnissen kommen Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C erfolgen Beim Mischen der Reagenzien die Enzyme gek hlt halten indem ein K hlblock verwendet wird Universal Discs die bereits in Kontakt mit Patientenproben oder Reagenzien gekommen sind nicht wieder verwenden Gebrauchte Discs ohne Abnehmen oder Entfernen der Abdeckfolie entsorgen Wenn verschiedene Simplexa Kits auf der gleichen Disc angesetzt werden m ssen die Positiv und Leerwert Kontrollen aus jedem verwendeten Kit getestet werden Master Mix und RT Mix enthalten gt 1 Glycerin welches bei Inhalation oder Hautkontakt zu Reizungen f hren kann Nach Einatmen oder Ber hrung sollten Erste Hilfe Ma nahmen eingeleitet werden Eine l ngere Aufbewahrung extrahierter Proben bei 2 C bis 8 C wird nicht empfohlen es wurde keine Pr fung der Leistung unter solchen Bedingungen durchgef hrt GEBRAUCHSANWEISUNG A PROBENGEWINNUNG Geeignete Probentypen sind beispiels
38. ssays wurde nicht f r Patienten ermittelt die asymptomatisch f r eine Virusinfektion der Atemwege sind 15 Die Leistungsf higkeit dieses Assays zur berwachung einer Therapie bei einer Infektion mit Influenza A Influenza B oder RSV wurde nicht bestimmt 16 Die Leistungsf higkeit dieses Assays f r die Testung von Blut oder Blutprodukten f r den Nachweis von Influenza A Influenza B oder RSV wurde nicht bestimmt 17 Die Leistungsf higkeit dieses Assays wurde nicht in Bezug auf Medikamente zur Behandlung von Influenza oder Erk ltungsviren ermittelt mit denen sich potenzielle Wechselwirkungen ergeben k nnen 18 Die Leistungsf higkeit dieses Assays wurde nicht f r Patienten ermittelt die den Influenza Impfstoff erhalten haben 19 Dieser Assay kann keine Atemwegserkrankung ausschlie en die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN METHODENVERGLEICH An der Studie der klinischen bereinstimmung nahmen drei externe Pr fstellen teil Referenzergebnisse f r Influenza A und Influenza B Viren wurden mithilfe eines von der FDA freigegeben leistungsf higen Nukleins uretests NAT erstellt Die Referenzergebnisse f r RSV wurden mithilfe von Kulturen DFA erstellt Die Kultur DFA Ergebnisse stammten aus Tests zum Zeitpunkt der Probennahme oder Probenarchivierung Aus prospektiv gesammelten Proben n 558 von Patienten mit Anzeichen und Symptomen einer Virusinfektion der Atemwege und retrospe
39. t Leerwert Kontrolle 0 0 lt 40 0 Positivkontrolle lt 40 0 lt 40 0 lt 40 0 Nicht zutreffend N A Siehe vollst ndige Beschreibung in den nachstehenden Anmerkungen a No Template Control Leerwert Kontrolle i Wenn die Leerwert Kontrolle ein positives Ergebnis zeigt Ct Wert lt 40 0 f r Flu A Flu B oder RSV weist dies darauf hin dass die vorbereiteten Proben m glicherweise kontaminiert sind Die Kontrolle ist ung ltig und alle Patientenproben m ssen erneut getestet werden ii Wenn die RNA IK bei der Leerwert Kontrolle nicht nachgewiesen wird ist der Assay Lauf ung ltig und alle Patientenproben m ssen erneut getestet werden ii Wenn die Leerwert Kontrolle f r Flu A Flu B und RSV Detektor ein negatives Ergebnis zeigt Ct 0 UND wenn die RNA IK bei der Leerwert Kontrolle nachgewiesen wird ist diese Kontrolle g ltig und akzeptabel b Positivkontrolle i Wenn das Ergebnis der Positivkontrolle f r Flu A Flu B oder RSV Ct 0 lautet so gilt der Assay Lauf als ung ltig und nicht akzeptabel Alle Patientenproben m ssen erneut getestet werden ii Wenn die Ct Werte f r Flu A Flu B und RSV lt 40 und 0 sind gilt der Assay Lauf als valide und akzeptabel c Interne RNA Kontrolle i Zur Angabe eines negativen Ergebnisses ist eine Detektion der Simplexa internen RNA Kontrolle RNA IK erforderlich ii Zur Angabe eines positiven Ergebnisses ist eine Detektion der Simplexa internen RNA Kontrolle
40. u B schwach positiv 81 90 90 0 82 1 100 0 Flu B medium positiv 90 90 100 95 9 100 0 RSV hoch negativ 90 90 100 95 9 100 0 RSV schwach positiv 90 90 100 95 9 100 0 RSV medium positiv Gesamt bereinstimmu ng Leerwert Kontrolle 330 330 100 0 Pr fzentrum 1 325 330 98 5 Pr fzentrum 2 325 330 98 5 Reproduzierbarkeit RSV Pr fzentrum 3 90 90 100 980 990 99 0 95 9 100 0 98 2 99 5 berein stimmung mit den erwarteten Ergebnissen berein stimmung mit den erwarteten Ergebnissen berein stimmung mit Durc den hsch erwarteten n Ct Ergebnissen Gesamt berein stimmung mit den erwarteten Ergebnissen 90 90 100 0 95 CI 95 9 100 0 Positivkontrolle 90 90 100 0 95 9 100 0 Flu A hoch negativ 90 90 100 0 95 9 100 0 Flu A schwach positiv 90 90 100 0 95 9 100 0 Flu A medium positiv 90 90 100 0 95 9 100 0 Flu B hoch negativ 95 9 100 0 Flu B schwach positiv 90 90 100 0 95 9 100 0 Flu B medium positiv 90 90 100 0 95 9 100 0 RSV hoch negativ 90 90 100 0 95 9 100 0 RSV schwach positiv 90 90 100 0 95 9 100 0 RSV medium positiv Gesamt bereinstimmu ng 330 330 100 0 330
41. weise Abstriche aus dem Nasenrachenraum NPS in sterilem Virustransportmedium mit Proteinstabilisator Antibiotika gegen Wachstum von Bakterien und Pilzen und Pufferl sung z B UTM VCM M4 M5 M6 und andere Medien die f r den Transport von Chlamydien Mykoplasmen und Viren bestimmt sind Nur Abstrichtupfer mit synthetischer Spitze z B Dacron Nylon oder Rayon und einem Schaft aus Aluminium oder Kunststoff verwenden Keine Kalziumalginattupfer verwenden da diese Stoffe enthalten k nnen welche die PCR hemmen PROBENEXTRAKTIONSBEREICH In einem speziellen der Extraktion von Proben und Kontrollen vorbehaltenen Bereich arbeiten Die Vorbereitung der Proben f r die Extraktion wird auf einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgef hrt Extraktion mit dem MagNA Pure LC Extraktionsverfahren von Roche 1 Die Extraktion von Nukleins uren aus Patientenproben und Assaykontrollen erfolgt mit dem MagNA Pure Total Nucleic Acid Kit von Roche und dem MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Ger t von Roche Hinsichtlich der Nukleins ureextraktion mit diesem Kit die Gebrauchsanweisungen des Herstellers beachten 2 Im Dropdownmen Protocol des MagNA Pure LC Systems die Optionen Total NA und anschlie end Total NA Variable_elution_volume blk w hlen Damit werden die passenden Einstellungen f r den Lauf geladen 3 Das Probenprotokoll sollte Total NA Variable_elution_volume sein 4 Als Probenvolumen sollte 200 ul und
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