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Der gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät

1. AT5G20150 MKFGKSLSNOIEOTLPEWODKFLSYKELKKRLKLIGSKTADRPVKRLRLDEFS AT2G26660 MKFGKSLSNOIEETLPEWRDKFLSYKELKKKLKLMEPRSVENRPNKRSRSDSNSVDTDPT AT2G45130 MKFGKRIKEQIOESLPEWRDKFLRYKELKNLISSPAPV EE AT5G15330 MKFGKEFRTHLEETLPEWRDKFLCYKPLKKLLKYYPYYSADFGPANSDHNDSRPVFADTT AIL 1 MKFWKILKSHIEETLPEWODKFLSYKDLKKELKLIYPO DDRPIKKORLNNDE kkk de 1 kk kk Se de kk D AT5G20150 VGISKEEINFIOLLEDELEKFNNFFVEKEEEYIIRLKEFRDRIAK AT2G26660 VGMTKEELDFISLLEDELEKFNSFFVEOEEEYIIRLKELKDOVAK AT2G45130 7722222222222 ESIFVGLLNAEIDKFNAFFVEOEEDFIIHHKELOYRIOR AT5G15330 NISSAADDGGVVPGVRPSEDLOGSFVRILNDELEKFNDFYVDKEEDFVIRLOELKERIEO AIL 53 o LAKEVNDFVKLLEEEIDKFNTFFVEKEEDYIIHLKVLKERVAE Ks zk Kr kK Ree EPR peeks D AT5G20150 AKDSM EKMIKIRKEIVDFHGEMVLLENYSALNYTGLVKILKKYDKRTGDL AT2G26660 AKNSN EEMINIKKEIVDFHGEMVLLMNYSALNYTGLAKILKKYDKRTGAL AT2G45130 LVEKCGHNDEMS RENISEIRKDIVNFHGEMVLLVNYSNINYTGLAKILKKYDKRTRGG AT5G15330 VKEKNGEFASESEFSE
2. LeACol MENFPIINLEKLNGDERANTMEMIKDACENWGFFELVNHGIPHEVMDTVEKMTKGHYKK LeACO2 MENFPIINLEKLNGAERVATMEKINDACENWGFFELVNHGIPHEVMDTVEKLTKGHYKK LeACO3 MENFP I INLENLNGDERAKTMEMIKDACENWGEFELVNHGI PHEVMDTVEKLTKGHYKK LeACO4 ME SNEPVVDMGLLOTEKRPEAMDK IKDACENWGF FELVNHGI SHELLDAVENLTKGHYKK LeACO5 1 MEMPV I DF SKLEGEERCATMSLLHOACEKWGFFMIENHGI DSYLMDNVKOFVNOHYEA frescoes ER Ge MER a EMEA RAR EN ENER PET RS E LeACol CMEQRFKELVASKGLEAVOAEVTDLDWESTFFLRHLPTSNISOVPDLDEEYREVMRDFAK LeACO2 CMEORFKELVAKKGLEGVEVEVTDMDWESTFFLRHLPSSNISQOLPDLDDVYREVMRDFRK LeACO3 CMEQRFRKELVASKGLEAVOAEVTDLDWESTFFLRHLPTSNISOVPDLDEEYREVMRDFAK LeACo4 CMEORFKEMVASKGLEAVOTEIDDLDWESTFFLKHLPVSNVYEVPDLDDEYRKVMKDFAL LeACO5 59 NMKKRFYESELPMSLE KNGNISNTDWESTFFVWHRPASNIYEIOGLSKELCKAVDDYID Kp kr Fr D D KKKKKKK s zk xk Ks SS Bee SS Ks LeACol RLEKLAEELLDLLCENLGLEKGYLKNAFYGSKGPNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTD LeACO2 RLEKLAEELLDLLCENLGLEKSYLKNTFYGSKGPNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTD LeACO3 RLEKLAEELLDLLCENLGLEKGYLKNAFYGSKGPNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTD LeACO4 KLEKLAENLLDLLCENLGLEKGYLKKAFYGSKGPTFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTD LeACO5 118 QLIKLAENLSELMCENLGLAKSYIKEAFSGSKGPSVGTKVAIYPQCPRPDLVRGLREHTD KKKKS peek KK KKK KKK k KKKKK XXX kk kk kkk xxx k k LeACol AGGIILLFODDKVSGLOLLKDEOWIDVPPMRHS IVVNLGD
3. uk 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGGGTTGAI GGGAAGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCCTAGGACAGCCCAACT CCCTTCTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5 Die Bindungsstudien von ANA sowie von ABZ1 an den CaMV 35S Promotor wurden mit einem 118 bp gro en 35S Promotorfragment CaMV 35S siehe unten das drei ACGT Core Sequenzen graue Buchstaben enthalt als Sonde durchgefuhrt Fur die Analyse der DNA Bindung mit ANA wurde das unmarkierte CaMV 35S Fragment als spezifischer Kompetitor eingesetzt w hrend ein 93 bp gro es Fragment uK93 siehe unten als unspezifischer Kompetitor verwendet wurde uK93 entspricht einer Sequenz des vollstandigen cDNA Klons von ABZ1 die keine ACGT Sites enthalt Fragment Sequenz CaMV 35S 5 TATGTCGACCGAGGAACAT CGTGGAAAAAGAAGAC GT TCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGA 3 ATACAGCTGGCTCCTTGTAGCACCTTTTTCTTCTGCAAGGTTGGTGCAGAAGTTTCGTTCACCT TTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCAGTCGACTAT 3 AACTACACTATAGAGGTGACTGCATTCCCTACTGCGTGTTAGGGTCAGCTGATA 5 PCR Primer 355 5 3464 5 TATGTCGACCGAGGAACATAGTGGAAAAAG 3 Sal 359 3 3465 5 ATAGTCGACTGGGATTGTGCGTCATCCCTT 3 Sah Fragment Sequenz uK93 5 TATACTCGAGATGTCACCTTTAAGGCAGAGTGCTAGTTCATCTGCATCAGATGATGATCAAAGG 3 ATATGAGCTCTACAGTGGAAATTCCGTCTCACGATCAAGTAGACGTAGTCTACTACTAGTTTCC TATGCAGGAATGGATGAGACCATGGATAT 3 ATACGTCCTTACCTACTCTGGTACCTATA 5
4. 4 Diskussion 91 4 Diskussion 4 1 Effizienz der SSH Methode Durch die Methode der Suppression Subtractive Hybridization SSH wurden cDNA Fragmente solcher Gene aus Tomate isoliert deren Expression Anaerobiose spezifisch induziert wird Von 238 untersuchten Klonen die Fragmente der Forward Subtraktion enthielten konnten 41 Fragmente unterschiedlicher Gene isoliert werden die putativ unter Anaerobiose hochreguliert werden Kapitel 3 1 Das entspricht einer Ausbeute an anaerob induzierten Zielgenen von ca 17 Dies ist z B mit dem Ergebnis einer SSH vergleichbar bei der mit einer Ausbeute von ca 14 transkriptionell induzierte Gene der Wurzel Primordien von Sesbania rostrata nach berflutung identifiziert wurden Caturla et al 2002 Die differentielle Genexpression in Arabidopsis Wurzeln die geringen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt wurden wurde mit Hilfe der Microarray Technologie analysiert 210 nicht redundante Gene der 3500 untersuchten Klone weisen ein differentielles Expressionsprofil auf 157 dieser differentiell exprimierten Gene sind transkriptionell hochreguliert was einer 4 5 igen Ausbeute an Zielgenen entspricht Klok ef ai 2002 Damit zeigt die durchgef hrte SSH des Tomaten Genoms im Vergleich zur angef hrten Microarray Analyse eine ca 4 fach h here Effizienz Die anaerob spezifische Expression von 8 der 41 isolierten SSH Fragmente deren transkriptionelle Induktion durch eine Northern Blot Analyse verif
5. Galactosidasegens aus Saccharomyces cerevisiae GAL4AD wurde durch PCR amplifiziert wobei die Annealingtemperatur 60 C betrug Kapitel 2 13 1 Als Template diente pGADT7 Rec Kapitel 2 8 Die Sequenzen der eingesetzten Primer sind mit Bezeichnung und interner DNA Nummer nachfolgend aufgef hrt Template Primer DNA Nr Primersequenz pGADT7 Rec 5 Gal4 3466 5 TATAGGATCCATGGCCAATTTTAATCAAAGTGGGA 3 BamHI 3 Gal4 3467 5 ATATGGATCCCTCTTTTTTTGGGTTTGGTGGGGT 3 BamHI Das BamHI geschnittene PCR Fragment wurde in den ebenfalls BamHI geschnittenen und dephosphorylierten pVKH 35S ABZ1 pA1 Vektor siehe oben kloniert Die korrekte Orientierung des klonierten GAD4AD Inserts wurde durch eine Testspaltung mit Zen sichergestellt und der Leseraster durch Sequenzierung berpr ft So entstand eine translationale Fusion zwischen der GAL4 Aktivierungsdom ne und ABZ1 Dieses Konstrukt diente als Effektor pVKH 35S ANA pA1 3781 Der kodierende Bereich des NAC Transkriptionsfaktors ANA wurde zun chst durch PCR unter Verwendung des Templates pSport1 MT172 sowie der Primer MT172 5 und MT172 3 amplifiziert Kapitel 2 13 1 Tab 1 in pCR 2 1 kloniert und sequenziert Das mit BamHI und Sal gespaltene Fragment wurde in pVKH 35S pA1 BamHI Sail CIAP subkloniert Dieses Konstrukt wurde als Effektor verwendet pBT10 35S GUS 3148 Dieses Reporterplasmid verf gt ber den CaMV 35S Promotor der die Expression des R
6. PCR Primer Xhol Ncol Die Kompetitorfragmente wurden durch PCR wie in Kapitel 2 13 1 beschrieben mit einer Annealingtemperatur von 60 C amplifiziert Als Templates fur CaMV 35S bzw uK93 dienten pRT103 GUS bzw pSport1 MT74 Die entsprechenden PCR Primer sind oben aufgef hrt einschlie lich ihrer Labor internen Nummerierung in Klammern Die Aufreinigung der Kompetitoren erfolgte durch Extraktion aus einem Agarosegel mittels 2 Material und Methoden 28 QlAquick Gel Extraction Kit von Qiagen entsprechend den Herstellerangaben Die Bindungsspezifitat von ABZ1 an den CaMV 35S Promotor wurde durch Kompetition mit den oben aufgef hrten Fragmenten sK1 und uK1 untersucht Nachfolgend sind die PCR Bedingungen zur Amplifikation des radioaktiv markierten CaMV 35S Fragmentes aus pRT103 GUS aufgef hrt PCR Ansaiz 2 ul Template DNA 100 ng ul pRT103 GUS 5 ul 10x Advantage 2 Puffer Clontech Zu 1mM 3dNTP Mix dCTP Au 40 uM dCTP 2 ul 80 ng ul 5 Primer 2 ul 80 ng ul 3 Primer 4ul a 32P JdCTP 27 ul ddH2O 2 ul 5 U ul Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 50 ul Gesamtvolumen Temperaturprogramm 6 Minuten 94 C 3 Minuten 60 C 9 Minuten 72 C 2 ul 1 mM dCTP 9 Minuten 72 C 2 14 3 Native Polyacrylamidgelelektrophorese der Protein DNA Bindungsreaktionen Die Durchf hrung der Gelshift Experimente erfolgte im Wesentlichen nach Current Protocols Ausubel et ai 1988 Dazu wurden in Abh ngigkeit des verwendeten rad
7. ele les le el el ee ele T ESR ES EE EE EH Sonde 1 1 1 2 1 5 8 9 6 1 10 1 Abb 12 Elektrophoretische Gelshift Experimente zur Verifizierung der Bindungsspezifitat von ABZ1 an einige der selektierten RBSS Fragmente F r die Bindungsreaktion wurden 0 1 ng des entsprechenden radioaktiv markierten Fragmentes 1 ug rekombinantes ABZ1 und 10 ug sK1 spezifischer Kompetitor RBSS1 oder uK1 unspezifischer Kompetitor RBSS1 mit mutierter Core Sequenz eingesetzt bzw nicht zugesetzt K retardierter Protein DNA Komplex S freie Sonde 3 Ergebnisse 71 3 3 5 ABZ1 bindet spezifisch an den CaMV 35S Promotor Der CaMV 35S Promotor stelt eine bekannte Zielsequenz f r bZIP Transkriptionsfaktoren dar Lam ef a 1995 Daher wurde untersucht ob ABZ1 ebenfalls an den CaMV 35S Promotor bindet Ein 118 bp gro es Fragment das einen 100 bp langen Sequenzbereich des CaMV 35S Promotors mit drei potentiellen bZIP Faktorbindungsstellen enthalt wurde als Sonde im Gelshift Experiment verwendet Kapitel 2 14 2 Die Auftrennung der Bindungsreaktionen mit rekombinantem ABZ1 35S Promotorfragment sowie ggf spezifischem bzw unspezifischem Kompetitor erfolgte im 5 igen nativen Polyacrylamidgel Kapitel 2 14 3 Als spezifischer Kompetitor sK1 wurde eine selektierte ABZ1 Zielsequenz aus dem Random Binding Site Selection Assay verwendet RBSS1 Kapitel 2 14 2 1 Der unspezifische Kompetitor uK1 ist innerhalb der Core Sequenz von RBSS1 m
8. nicht translatierten Bereichen 7 Einleitung 6 abh ngig und nicht auf eine ver nderte Transkriptstabilit t bei Hypoxia zur ckzuf hren Bailey Serres und Dawe 1996 Die unter Oz Defizit differentiell exprimierten Arabidopsis Gene die durch eine Microarray Analyse identifiziert wurden lassen sich entsprechend ihres zeitlichen Expressionsprofils in 6 Klassen einteilen Klok et a 2002 So werden unterschiedliche Gensets in zwei Phasen aktiviert oder reprimiert Einerseits gibt es Gene deren Expression innerhalb der ersten halben Stunde w hrend O2 Mangels hoch oder runterreguliert wird Andererseits wurden Gene identifiziert deren Expression erst nach 2 20 Stunden auf hypoxische Bedingungen antwortet Dennis et ai 2000 teilen die pflanzliche Antwort auf O2 Mangel anhand von ANPs in drei Phasen ein In der ersten Phase 0 4 Stunden erfolgt die schnelle Induktion bzw Aktivierung von Signaltransduktionskomponenten um das zweite Stadium 4 24 Stunden der metabolischen Adaption einschie lich der Glykolyse und Fermentation zu aktivieren Die dritte Phase 24 48 Stunden ist f r das berleben der Pflanzen unter l nger andauernder Oz gt Limitierung n tig Es kommt zur Expression von Enzymen die zur Aerenchym Bildung beitragen Die Analyse der nicht codierenden 5 Bereiche von Genen die eine hnliche Expressionsinduktion wie ADH1 zeigen ergab gemeinsame cis regulatorische Motive Diese entsprechen zum Gro teil den regula
9. 261 2001 2000 eege oesere ree en a o se LE 16s 90 L2z DIER ven ezze izzz ator seo zg terzt zuauel geg 091 sno sse gees Sr 90e sr 90e 6S C6L6 erte en 902 zoe 001 rz ozaor ba zbber zs6 eg Lenger gv ee 12 1521 ve or sez 91 19S vun svaz cert o o zegoe ees sno sse 10 ant So s IS LLLL zo eroz z v96 Voss s vz so o arz rz g0 or0r sno sse 11 256 DI oeeco gecest Leoelroe gea so o ee serz gezu sno sse DEn ser eee z er 08 8501 Siomuen Lut zig esz ru erizo allouoy 09 609 Less DEI ED au asp cat 9s 0 zoiszogz ee sitzz ave oe Se Zav avr Wo sse d SNO SSE mois Sos 952659 ema aize erz em so o reueg ty s6zr at au ava tg e f N h E sno sse BI e6 92z 12 1089 sroeg care les ezer os o srzecez przoeez gei 22 ease ee ee l t 3 l i no sse S LO0L mort ab razz eat zreses gross avez goat zas s00 or stae ze sear ory get sees 18 0981 gert o0 eg Lieser zese z zz ec 200 zoue szoler ees zrz sno sse izav sse aere ges ze osol siert szog ess gesz eco szzzzs vuz es geiz ez sno sse izav sse 11881 KOL BL LELS ees zoge sone cezt zz o gzsior aezer zazi ozz sno sse Lzav sse regs een SC res mg zegege OAI Lor ersz Amt sro oreeza go ezes sos 81 Sno sse lzav sce 18 9SbZ mag 686616 19 086 wea zser viv zio rovees oo veaa 806 res sno sse ETA
10. 4 6 Aspekte der Homo und Heterodimerisierung von ABZ1 In der der vorliegenden Arbeit konnte der Leucin Zipper von ABZ1 durch EMSA mit einer N bzw C terminalen ABZ1 Mutante experimentell als Dimerisierungsdom ne best tigt und auf die Aminos uren 47 bis 100 als Interaktionsdom ne eingeschr nkt werden Kapitel 3 3 7 Abb 14 Kapitel 3 3 8 Abb 15 ABZ1 kann also in vitro Homodimere bilden Au erdem wurde im Yeast Two Hybrid Screen kein anderer bZIP Transkriptionsfaktor selektiert Dieses Ergebnis k nnte darin begr ndet sein dass die meisten bZIP Faktoren unter anaeroben Bedingungen unter denen die mRNA zur Erstellung der Expressionsbank isoliert wurde selbst transkriptionell reprimiert sind Diese Hypothese wird indirekt durch die Beobachtung unterst tzt dass die Transaktivit t des CaMV 35S Promotors unter anaeroben Bedingungen in Tabak deutlich st rker reduziert wird als unter Normoxia in Gegenwart von ABZ1 vgl Abb 17A mit Abb 16 Zusammenfassend kann also festgestellt werden dass ABZ1 m glicherweise in planta ebenfalls homodimerisiert Allerdings gibt es auch Anhaltspunkte die f r eine Heterodimerisierung von ABZ1 sprechen Z B bildet BZI 4 der n chste Verwandte von ABZ1 mit BZI 1 Heterodimere Strathmann ef a 2001 Desweiteren wurde eine Interaktion zwischen bZIP911 und bZIP910 nachgewiesen die dem ABZ1 strukturell relativ nah verwandt sind und hnliche DNA Bindungsspezifit ten wie ABZ1 besitzen Martinez Garcia ef
11. 489 505 Meier I und Gruissem W 1994 Novel conserved sequence motifs in plant G box binding proteins and implications for interactive domains Nucleic Acids Res 22 470 478 Meissner R Jacobson Y Melamed S Levyatuv S Shalev G Ashri A Elkind Y Levy A 1997 A new model system for tomato genetics Plant J 12 1465 1472 Menegus F Cattaruzza L Chersi A Fronza G 1989 Differences in the anaerobic lactat succinate production and the changes of cell sap pH for plants with high and low resistance to anoxia Plant Physiol 90 29 32 6 Literaturverzeichnis 121 Meyer Gauen G Herbrand H Pahnke J Cerff R Martin W 1998 Gene structure expression in Escherichia coli and biochemical properties of the NAD dependent glyceraldehyd 3 phosphate dehydrogenase from Pinus sylvestris chloroplasts Gene 209 167 174 Nakanishi H Okumura N Umehara Y Nishizawa N K Chino M Mori S 1993 Expression of a gene specific for iron deficiency ds3 in the roots of Hordeum vulgare Plant Cell Physiol 34 401 410 Nakatsuka A Murachi S Okunishi H Shiomi S Nakano R Kubo Y Inaba A 1998 Differential expression and internal feedback regulation of 1 aminocyclopropane 1 carboxylate synthase 1 aminocyclopropane 1 carboxylate oxidase and ethylene receptor genes in tomato fruit during development and ripening Plant Pysiol 118 1295 1305 Ober E S Sharp
12. In Abbildung 6 sind die relativen B Galactosidase Aktivit ten in einem S ulendiagramm wiedergegeben Dabei wurde der Mittelwert der gemessenen Galactosidase Einheiten von pCL1 auf 100 gesetzt und die Aktivit t der beiden getesteten Konstrukte relativ zur Positivkontrolle dargestellt Aus dem Diagramm geht hervor dass die B Galactosidase Aktivit t des Hefestammes der das Fusionsprotein aus dem 301 Aminos uren langen ANA und der GALA DNA BD exprimiert ANAj 301 ca 23 der Aktivit t des Kontrollstammes zeigt w hrend die Galactosidase Aktivit t des Stammes mit dem ANA1 166 Fusionskonstrukt lediglich 0 5 betr gt Das ANA on GALA DNA BD Fusionsprotein verursacht offensichtlich eine erh hte Galactosidase Aktivit t im Vergleich zum ANA1 Ass Fusionsprotein was auf eine Transkriptionsaktivierung des Reportergens durch das ANA14 s01 Konstrukt zur ckgef hrt werden kann Daraus resultiert dass in Folge einer C terminalen Deletion des ANA um 135 Aminos uren die transaktivierende Wirkung des ANA nahezu vollst ndig aufgehoben wird In Hefe konnte also die Annahme einer funktionellen C terminalen Aktivierungsdom ne innerhalb des ANA best tigt werden 3 Ergebnisse 57 140 5 16 69 120 100 100 80 60 40 2 76 23 Galactosiddase Aktivit t 0 02 0 5 pCL1 ANA 01 ANA 166 Abb 6 Quantitative Bestimmung der Galactosidase Aktivit ten zweier ANA GAL4BD Fusions
13. 1 kb Abb 21 Anaerob spezifische Transkriptionsinduktion der ACC Oxidase und des IDS4 like Proteins Gesamt RNA aus unterschiedlichen Geweben Blatt Frucht Wurzel bzw einem Gemisch aller Gewebetypen aerober und anaerob inkubierter Tomatenpflanzen wurde mit radioaktiv markierten PCR Fragmenten der selektierten Prey Klone ACC Oxidase und IDS4 like hybridisiert Die Gr e der hybridisierenden Transkripte ist in Kilobasenpaaren kb angegeben Die aufgetragenen RNA Mengen wurden durch Ethidiumbromid F rbung der rRNA berpr ft und waren vergleichbar Daten nicht gezeigt 3 3 14 AlL ist ein potentieller Interaktionspartner von ABZ1 und enth lt eine SPX Dom ne Ein Peptid das homolog zu einem IDS4 like Protein ist wurde im Yeast Two Hybrid Screen als potentieller Interaktionspartner von ABZ1 identifiziert Kapitel 3 3 12 Da dieses IDS4 like Protein aus Tomate anaerob spezifisch exprimiert wird AlL Kapitel 3 3 13 und vermutlich ein Mitglied einer Familie von Proteinen mit SPX Dom ne ist 3 Ergebnisse 86 konnte AIL eine Rolle in der anaeroben Signaltransduktion spielen Deshalb wurde ein vollst ndiger cDNA Klon dieses Proteins isoliert Dazu wurden ca 200000 Kolonien einer cDNA Bank 5x10 cfu ml aus anaerob inkubierten Tomatenpflanzen mit dem AIL cDNA Fragment Kapitel 2 17 3 das aus dem Hefe Two Hybrid Screen hervorgegangen war gescreent Von 24 positiven Klonen des ersten Screens wurden 8 in einem zweiten
14. 2 und 4 Die entstehenden Protein DNA Komplexe K1 und K2 zeigen aufgrund der unterschiedlichen molaren Massen und Ladung der beiden Proteine ein unterschiedliches Laufverhalten im nativen Polyacrylamidgel Nach gemeinsamer Inkubation des Wildtyp und des mutierten ABZ1 mit dem RBSS1 Fragment wird neben den beiden Komplexen K1 und K2 ein dritter Protein DNA Komplex K3 detektiert der im Polyacrylamidgel schneller als K1 aber langsamer als K2 l uft Diese Beobachtung ist auf eine Bindung von Dimeren aus ABZ1 und ABZ11 100 Monomeren an RBSS1 zur ckzuf hren Folglich wurde durch dieses Gelshift Experiment demonstriert dass ABZ1 in vitro dimerisieren kann 12 3 4 Kik K3 gt K2 gt Abb 15 Autoradiogramm einer Gelshift Analyse zum Nachweis der Dimerbildung von ABZ1 Es wurden 0 1 ng radioaktiv markiertes RBSS1 Fragment 4x103 cpm 1ug ABZ1 bzw 770 ng der ABZ11 100 f r die e onor Bindungsreaktionen eingesetzt bzw nicht zugef gt Die Protein DNA Komplexe ABZ1 RBSS1 K2 ABZ1 ABZ14400 RBSS1 K1 und ABZ1 ABZ11 100 RBSS1 K3 ABZ11 100 werden entsprechend ihrer Gr e und Ladung retardiert 3 Ergebnisse 76 3 3 9 Coexpression von ABZ1 f hrt zu reduzierter Aktivit t des CaMV 35S Promotors ABZ1 besitzt basierend auf der in silico Sequenzanalyse keine Dom ne zur Transkriptionsaktivierung bindet aber spezifisch an den CaMV 35S Promotor Kapitel 3 3 1 und 3
15. ANP APS ATP BD bp CaMV cDNA cfu CIAP CTAB DAPI dC dCTP DEPC dG DMSO DNA ds DTT EDTA EMSA GABA GapC GBF GUS anaerobe ACC Oxidase Abscisins ure anaerobes bZIP Protein Aminocyclopropan 1 carboxyls ure ACGT Element Aktivierungsdom ne Alkoholdehydrogenase Adenosindiphosphat anaerobes IDS4 like Protein Automated Laser Fluorescence anaerobes NAC Protein anaerobes Protein Ammoniumpersulfat Adenosintriphosphat Bindungsdom ne Basenpaare Cauliflower Mosaic Virus complementary DNA colony forming unit Calf Intestine Alkaline Phosphatase Cetyltrimethylammoniumbromid 4 6 Diamidino 2 phenylindol Desoxycytidin Desoxycytidintriphosphat Diethylpyrocarbonat Desoxyguanosin Dimethylsulfoxid Desoxyribonucleinsaure doppelstrangig Dithiothreitol Ethylendiamintetraacetat elektrophoretischer Mobilitatsshift Assay y Aminobuttersaure Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase G Box Bindungsfaktor B Glucuronidase IDS IPTG kb kDa lacZ LB LD PCR LDH LUC mRNA MS MUG NCBI NLS OD ONPG PCR PDC PMSF PPi QDO RNA SAM SD SDS SSH Stabw SuSy TAIR T DNA uORF UTR viv wiv xg X Gluc iron deficiency specific Isopropyl D thiogalactopyranosid Kilobase Kilodalton Gen der B Galactosidase Luria Broth Long Distance Polymerase Chain Reaction Lactatdehydrogenase Luciferase messenger RNA Murashige Skoog 4 Methyl umbelliferyl B D glucuronid National Center for Biotechnology Information Kern
16. Abb 4 Nucleotid und daraus abgeleitete Aminos uresequenz sowie die Domanenstruktur von ANA Das SSH Fragment unterstrichene Nucleotidsequenz die NAC Dom ne Fettdruck mit ihren f nf konservierten Subdom nen gelb orange rot blau gr n und die potentielle Aktivierungsdom ne Kursivdruck sind gekennzeichnet 3 Ergebnisse 54 3 2 2 ANA wird in den Nucleus transportiert Das ANA Protein ist aufgrund seiner Sequenzanalyse ein potentieller Transkriptionsfaktor Kapitel 3 2 1 Obwohl Transkriptionsfaktoren funktionell im Zellkern aktiv sind konnte durch in silico Analyse der Aminos uresequenz von ANA kein Kernlokalisierungssignal detektiert werden Deshalb wurde in einem transienten Experiment untersucht ob ANA dennoch in den Zellkern transportiert wird Zun chst wurden drei unterschiedlich gro e Bereiche der ANA codierenden Sequenz translational mit dem B Glucuronidasegen des pRT103 GUS Vektors fusioniert Kapitel 2 15 1 1 Nach transienter Transformation dieser Konstrukte mit der Partikelkanone in Zwiebelepidermiszellen wurden folglich ANA GUS Fusionsproteine exprimiert Kapitel 2 15 1 2 Das Konstrukt ANAj 301 GUS enth lt neben dem Glucuronidasegen die gesamte codierende ANA Sequenz w hrend die Konstrukte ANA 136 GUS bzw ANA ze GUS C terminale Deletionskonstrukte des ANA darstellen Der Blast Homologievergleich f r ANA ergab eine konservierte NAM Dom ne im Bereich der Aminos uren 13 bis 138 Unter Ber cksicht
17. Arabidopsis thaliana Proc Natl Acad Sci USA 99 17197 17202 Igarashi D Ispida S Frkazawa J Takahashi Y 2001 14 3 3 proteins regulate intracellular localization of the bZIP transcriptional activator RSG Plant Cell 13 2483 2497 Isono K Yamamoto H Satoh K Kobayashi H 1999 An Arabidopsis cDNA encoding a DNA binding protein that is highly similar the the DEAH family of RNA DNA helicase genes Nucleic Acids Res 27 18 3728 3735 IUPAC IUB Commission on Biochemical Nomenclature 1971 Abbreviations and symbols for nucleic acids polynucleotides and their constituents Arch Biochem Biophys 145 425 436 Ito O Ella E Kawano N 1999 Physiological basis of submergence tolerance in rainfed lowland rice ecosystem Field Crop Res 64 75 90 Izawa T Foster R Chua NH 1993 Plant bZIP protein DNA binding spezifity J Mol Biol 230 1131 1144 Jakoby M Weisshaar B Dr ge Laser W Vincente Carbajosa J Tiedemann J Kroj T Parcy F 2002 bZIP transcription factors in Arabidopsis Trends in Plant Science 7 106 111 Jefferson R A 1987 Assaying chimeric genes in plants the GUS gene fusion system Plant Mol Biol Rep 5 387 405 Jefferson R A Kavanagh T A Bevan M W 1987 GUS fusions glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants EMBO J 6 3901 3907 Kato Noguchi H 2000 Abscisic acid and hypoxic induction of an
18. Da bei Oz Mangel jedoch die Glykolyse herunterreguliert ist steigt die 3 Phosphoglyceratkonzentration an Geigenberger ef ai 2000 Dadurch dass 3 Phosphoglycerat als allosterischer Aktivator der ADP Glucosepyrophosphorylase wirkt wird die Limitierung der ADP Glucosepyrophosphorylase Aktivitat kompensiert Eine Strategie um Metabolismus einzuschr nken stellt die Umstellung auf Stoffwechselwege dar die weniger ATP verbrauchen und Sauerstoff effizienter nutzen Abb 1 Zum Beispiel besitzen Pflanzen zwei alternative biochemische Stoffwechsel wege die Saccharose zu Hexosephosphaten abbauen und sich in ihrem Energiebedarf unterscheiden Die Degradation eines Molek ls Saccharose durch Invertase und Hexokinase ben tigt zwei Molek le ATP w hrend der Saccharoseabbau durch Sucrosesynthase SuSy und UDP Glucose Pyrophosphorylase nur ein Molek l anorganischen Pyrophosphats PPi erfordert Stitt 1998 Folglich ist der Energiebedarf des SuSy Stoffwechselweges geringer Au erdem wird PPi recycelt das als Abfallprodukt bei vielen biosynthetischen Reaktionen entsteht In Mais Kartoffel und Arabidopsis konnte gezeigt werden dass die Expression der SuSy Gene bei wenig O2 hochreguliert wird Zeng et al 1998 und 1999 Klok ef al 2002 w hrend Invertase Gene stark reprimiert sind Zeng ef a 1998 und 1999 Abb 1 Durch Microarray Analyse wurden unter O2 Defizit induzierte Gene identifiziert die auch bislang f r die anaerobe Antwort unbek
19. Die Nummerierung der transgenen Tomatenlinien erfolgte entsprechend der Labor internen Bezeichnungen In Abbildung 18 sind die Autoradiogramme der Expressionsanalyse des GUS Reportergens zusammengestellt Die Linien 2 und 4 zeigen entgegen den Ergebnissen 3 Ergebnisse 80 im transienten System eine Induktion der Genexpression unter anaeroben Bedingungen wahrend die GUS Transkriptmengen der Linie 3 nach aerober und anaerober Inkubation vergleichbar sind und f r Linie 8 keine Expression detektiert werden kann Lediglich Linie 5 zeigt einen R ckgang der Reportergenexpression infolge anaerober Inkubation In der GapC4 GUS Kontrollpflanze wird wie erwartet erst durch anaerobe Inkubation die GUS Expression induziert Zusammenfassend wird festgestellt dass der Aktivit tsvergleich des CaMV 35S Promotors unter aeroben und anaeroben Bedingungen in transgenen Tomatenpflanzen heterogen ausf llt Im Gegensatz zum transienten System wurde lediglich eine von f nf transgenen Linien beobachtet die unter anaeroben Bedingungen eine herunterregulierte 35S Promotor Aktivit t aufweist GapC4 Konstrukt 35S GUS GUS Linie 2 3 4 5 8 3 O2 GUS rRNA Abb 18 Untersuchung der Aktivit t des CaMV 35S Promotors in transgenen 35S GUS Tomatenpflanzen unter aeroben Bedingungen sowie unter Anaerobiose Gesamt RNA aus aerobem und anaerob inkubiertem Pflanzenge
20. H J Baumlein H Stephan U W 1996 lron an copper nutrition dependent changes in protein expression in a tomato wild type and the nicotianamine free mutant chloronerva Plant Physiol 111 533 540 Hoeren F U Dolferus R Wu Y Peacock W J Dennis E S 1998 Evidence for a role of AtMYB32 in the induction of the Arabidopsis alcohol dehydrogenase gene ADH1 by low oxygen Genetics 149 479 490 Holdsworth M J Bird C R Ray J Schuch W Grierson D 1987a Structure and expression of an ethylene related mRNA from tomato Nucl Acids Res 15 731 739 Holdsworth M J Schuch W Gierson D 1987b Nucleotide sequence of an ethylene related gene from tomato Nucleic Acids Res 15 10600 Homna M A Baker B J Waddell C S 1993 High frequency transposition of Ds ALS in Arabidopsis Proc Natl Acad Sci USA 90 6242 6246 6 Literaturverzeichnis 118 Hood E E Gelvin S B Melchers L S Hoekema A 1993 New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants 7ransgen Res 2 208 218 Huang S Jeffery D A Anthony M D O Shea E K 2001 Functional analysis of the cyclin dependent kinase inhibitor Pho81 identifies a novel inhibitory domain Mol Cell Biol 21 6695 6705 Hunt P W Klok E J Trevaskis B Watts R A Ellis M H Peacock W J Dennis E S 2002 Increased level of hemoglobin 1 enhances survival of hypoxic stress and promotes early growth in
21. Ir pzeze 021 goJeeue syegeL Orgel geng oroz OFZ 18 602 091 est golse al i 698881 80502 00 Jet 008801 00 1F5 90 Legrez TE EZZ98z Zeg oz golse zyegel SC ent SC eo L Leze Loge 00 00ZL 00 982 oo oze LE OgSZLF oueegeir 02992 Et golse gyegeL Pers LE SE Cen CeercL 09 292 og szs otgr ps lezse Lr pzez6 sero enz qoae syegeL S602 8r TZE ZEZ Jop GL goJSeUB alen EE EE teg cpeez TI reese goe ostor oret roo ezeigcee Zecerseh esy goiseueyegel S6 LL SCOL EEN og zee oree oerg los 280 es g0sr9s zo Lgoso9 OCL qouaeue eyegeL gUge SO bz Ov LA Se Z6L o2 sz 0028 oz 99 0 rz 99ZLEr BEEZZF Gen qouseue zyeqeL KS KS 0 66E PO OI orte orze 00 L rgiosgerg 22 zzz2069 Le goJseue LyegeL 7676 YIZO eeze 281 go se Sl NUOY i wzus ZE SESL t9 0 ezelgsee Ze serger 90862 ZET game pedel 27 LEST LZ 0E9Z 00 Z9 L 00 898 oo esr z8 o ge gosr9s zo Leosog ezzzs CAL goJee eyegeL 65 8651 Ce Leg os er6 06 999 09 26z 99 0 pz 99zLer ge ecezzy Bersr Sei qoiee zyegeL pS Z1L9z gv OL6Z oo sz z OO pSeL 00 212 oo h P9 OSI6P9 zu zzzosg Ss9ce ze goJse LyegeL J ZE ZSI oS zyz 09821 0596 Te 260 SREL ae e IT esw IT tose T oszt 00 201 oces 950 g2 esise eco Opg golseue gayewol 10 02 0 SNE ACAL os eez oo ozt oz ve se o se orizz sz eesez oer qolseue sojewoL
22. Plant J 10 175 183 Kohler U Donath M Mendel R R Cerff R Hehl R 1996 Intron specific stimulation of anaerobic gene expression and splicing efficiency in maize cells Mol Gen Genet 251 252 258 Krawczyk S Thurow C Niggeweg R Gatz C 2002 Analysis of the spacing between the two palindromes of activation sequence 1 with respect to binding to different TGA factors and transcriptional activation potential Nucleic Acids Res 30 775 781 Kuhlmann M Horvay K Strathmann A Heinekamp T Fischer U Bottner S Dr ge Laser W 2003 The alpha helical D1 domain of the tobacco bZIP transcription factor BZI 1 interacts with the ankyrin repeat protein ANK1 and is important for BZI 1 function both in auxin signaling and pathogen response J Biol Chem 278 8786 8794 Kusano T Berberich T Harada M Suzuki N Sugawara K 1995 A maize DNA binding factor with a bZIP motif is induced by low temperature Mol Gen Genet 248 507 517 Kusano T Sugawara K Harada M Berberich T 1998 Molecular cloning and partial characterization of a tabacco cDNA encoding a small bZIP protein Biochim Biophys Acta 1395 171 175 6 Literaturverzeichnis 120 Lam E Lam Y K 1995 Binding site requirements and differential representation of TGF factors in nuclear ASF 1 activity Nucleic Acids Res 23 3778 3785 Lasserre E Bouquin T Hernandez J A Bull J Pech J C Ba
23. berschu an unspezifischem Kompetitor zum Reaktionsansatz aus Protein und Sonde wird ein retardierter Komplex detektiert der in Wanderungsgeschwindigkeit und Intensit t mit dem auf Spur 2 vergleichbar ist Spur 4 Folglich bindet ANA nicht oder mit einer deutlich geringeren Affinit t an das DNA Fragment uK93 als an das 118 bp Fragment des 35S Promotors Zusammenfassend ist festzustellen dass das rekombinante ANA im Gelshift Experiment spezifisch an das untersuchte Fragment des CaMV 35S Promotors bindet Abb 7 Gelshift Experiment zur Untersuchung der Bindungsspezifit t von ANA an den CaMV 35S Promotor Spur 1 0 3 ng radioaktiv markiertes 118 bp CaMV 35S Promotorfragment ohne Protein Spur 2 4 wie Spur 1 zusatzlich mit 500 ng rekombinatem 6xHis ANA Spur 1 und 2 ohne Kompetitor Spur 3 300 ng spezifischer Kompetitor CaMV 35S Spur 4 300 ng unspezifischer Kompetitor uK93 S freie Sonde K retardierter Protein DNA Komplex 3 Ergebnisse 59 3 2 5 Im transienten System bewirkt ANA keine Aktivierung des CaMV 35S Promotors ANA wirkt in Hefe transkriptionsaktivierend Kapitel 3 2 3 Dieses Ergebnis sowie die Lokalisierung der Aktivierungsdomane im C terminalen Bereich des NAC Proteins Kapitel 3 2 3 entsprechen den Erwartungen aufgrund von Literaturdaten Duval et al 2002 Um die Funktion von ANA im pflanzlichen System zu analysieren wurde ein Cotransformations Experiment in Tabak durchgef hrt Da die Bindung von ANA
24. dass das NAC Protein AtNAM aus Arabidopsis thaliana eine DNA Bindungsdomane innerhalb der beiden letzen Subdom nen blau und gr n enth lt Da Duval ef ai 2002 Xie ef al 2000 und Ren ef at 2000 eine Aktivierung der Reportergenexpression durch carboxyterminale Bereiche von NAC Proteinen in Hefe nachweisen konnten wird angenommen dass der C Terminus von ANA eine transkriptionelle Aktivierungsdom ne besitzen k nnte Kursivdruck Obwohl ANA als Mitglied der NAC Familie potentiell als Transkriptionsfaktor im Zellkern aktiv ist konnte weder mit dem Programm Psort noch mit ScanProsite der SwissProt Datenbank ein Signalpeptid zur Kernlokalisierung detektiert werden 1 GAAACTAACACAAAGCA 18 GGAGCAGGAGCAGCAACAAACAGAGAGAAGAAAACAGAGGAAGATAAGAGGAAAATTTAT 78 CGAATTCGAATCGAGAGAAAAGGGGAAGTGAAGTTGCGAAGAGTGAGAATTTCAAAGGAA 138 ATGAACAAAGGAGCAAACGGAAATCAGCAATTGGAGT TACCGGCGGGATTCAGATTCCAT 1 MN K GAN G NQ Q L EL PA GF R FH 198 CCGACAGACGACGAATTGGTGCAGCACTATCTCTGCAGGAAAT GCGCCGGACAGTCGATT 21 P T D D E L V Q H Y L C R K C AG Q E I 258 GCTGTATCAATTATAGCTGAAATTGATCTTTACAAGTTTGATCCATGGCAGTTGCCTGAG 41 A V S I IAE ID LZ K F DPW OL P SR 318 AAGGCTTTGTACGGTGAAAAAGAGTGGTATTTTTTCTCACCAAGGGATAGAAAATATCCG 61 K A L Y G E KEW Y F F S P R DR K Y P 378 AACGGTTCACGGCCGAACCGAGCAGCAGGAACCGGTTAT TGGAAGGCAACCGGAGCTGAT 81 N G S R P N R A A G T GY W K AT GA D 438 AAACCGGTGGGAAAACCCAAAACCTTAGGGATAAAGAAGGCACTTGTGTTCTATGCCGGA 101 K P V G KPKT L GI KKAL VE YAG 498 AAAGCACCCAG
25. higkeit zur Phosphorylierung besitzen de Vetten und Ferl 1995 eine m gliche Verbindung zwischen anaerober Genexpression und Ca Signaltransduktion her 1 6 Anaerobe Stoffwechsel Umstellungen Die energetische Ausbeute aus der Veratmung eines Molek ls Hexose betr gt 39 Molek le ATP w hrend die Fermentation lediglich 3 Molek le ATP hervorbringt Diese Gegen berstellung verdeutlicht dass die ineffiziente ATP Produktion unter anaeroben Bedingungen eine Umstellung des Stoffwechsels erforderlich macht Um sowohl den ATP als auch den Sauerstoffverbrauch bei reduzierter Oz Verf gbarkeit zu verringern erfolgt eine umfassende Suppression biosynthetischer Aktivit ten Abb 1 So f hren sukzessiv abnehmende O2 Konzentrationen von 21 bis 0 innerhalb von 2 Stunden zu fortschreitender Inhibierung der Biosynthese von Saccharose Aminos uren Proteinen und Lipiden Geigenberger ef ai 2000 Unter hypoxischen Bedingungen wird z B die Saccharose Degradation im Vergleich zur optimalen O2 Versorgung um die H lfte reduziert wobei die Degradation bei 0 O2 wegen der fortschreitenden Fermentation wieder ansteigt Germain ef al 1987 Interessanterweise bleibt die St rkesyntheserate mit einem Optimum bei 12 O2 relativ hoch Geigenberger et al 2000 Aufgrund der geringen ATP Konzentration ist die ADP Glucosepyrophosphorylase Aktivit t die den ersten Schritt der St rkesynthese katalysiert limitiert Loef ef a 2001 7 Einleitung 8
26. 1 3101 RBSS9 RBSS Fragment in pCR2 1 3102 RBSS11 RBSS Fragment in pCR2 1 3103 RBSS1 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3104 RBSS2 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3105 RBSS3 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3106 RBSS4 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3107 RBSS5 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3108 RBSS6 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3109 RBSS7 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3110 RBSS8 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3111 RBSS9 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3112 RBSS10 1 RBSS Fragment in pCR2 1 3114 pBT10 TATA GUS TATA uch c 1 25 3130 pVKH 35S ABZ1 pA1 Effektorkonstrukt f r Cotransfektion c 1 57 3148 pBT10 35S GUS Reporterkonstrukt f r Cotransfektion c 1 96 7 Anhang 136 3161 pRT103 ANA 1 301 GUS NLS Konstrukt c 1 05 3162 pRT103 ANA1 136 GUS NLS Konstrukt c 1 11 3163 pRT103 ANA1 76 GUS NLS Konstrukt c 1 05 3265 T7 Primer Sequenzierprimer 3266 M13 Reverse Sequenzierprimer 3270 pGBKT7 Bait Vektor c 2 78 3271 pGBKT7 53 Bait Vektor als Positivkontrolle c 2 51 3272 pGADT7 T Prey Vektor als Positivkontrolle c 2 11 3273 pGADT7 Prey Vektor c 2 37 3274 pCL1 Positivkontrolle f B Galactosidase Assay c 0 89 3346 pVKH 35S Gal4AD ABZ1 pA1 Effektorkonstrukt f r Cotransfektion c 2 51 3348 pGBKT7 ABZ 147 138 Bait Konstrukt c 3 37 3391 pGBKT7 ANA 1 301 Bait Konstrukt c 1 53 3462 pGBKT7 ANA 166 Bait
27. 150 N terminalen Aminos uren von AIL aus Tomate entsprechen mit einer 35 igen Sequenzidentit t dem Aminoterminus der 180 Aminos uren langen SPX Dom ne graue Unterlegung Der putative Leucin Zipper beginnt mit dem Leucin an Position 106 endet mit dem Leucin an Position 155 und besteht aus 6 Leucinen sowie einem Isoleucin die im Abstand von sieben Aminos uren auftreten rot Fettdruck Mit Ausnahme des Leucins an Position 155 liegt der Leucin Zipper von AIL der potentiell mit ABZ1 interagiert innerhalb der SPX Dom ne Ein zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal des AIL Proteins konnte mit Hilfe des Psort Computerprogrammes identifiziert werden und umfasst die Aminos uren 29 bis 45 Kursivdruck Au erdem zeigt Abbildung 22 ein Aminos ure Alignment von AIL und vier Homologen aus Arabidopsis thaliana loci AT5G20150 AT5G15330 AT2G45130 AT2G26660 Identische Aminosauren an bestimmten Positionen sind mit einem Stern und ahnliche mit einem Doppelpunkt bzw einem Punkt gekennzeichnet ClustalW Kapitel 2 18 3 Ergebnisse 87 Aus dem Alignment geht hervor dass AIL im Vergleich zu seinen Homologen aus Arabidopsis mit 6 Leucinen und einem Isoleucin den l ngsten Leucin Zipper besitzt wobei das Leucin an Position 141 spezifisch in AIL auftritt Zus tzlich wird deutlich dass die meisten hoch konservierten Bereiche innerhalb der SPX Dom ne zu liegen scheinen
28. 2 Material und Methoden 22 Medium mit 100 ug ml Carbenicillin 50 ug ml Kanamycin und gegebenenfalls 50 pg ml Chloramphenicol Uberimpft Nach einer ca 1 st ndigen Inkubation bei 37 C unter Sch tteln wurde 1 ml Kultur die bei 600 nm eine optische Dichte von 0 6 0 8 aufweisen sollte als nicht induzierte Proteinextrakt Probe zum Zeitpunkt t 0 abgenommen Die Hauptkultur wurde f nf weitere Stunden mit 1 mM IPTG zur Induktion der Proteinexpression bei 37 C inkubiert Die Zellen wurden 20 Minuten bei 4 C und 2500xg pelletiert in fl ssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei 20 C aufbewahrt 2 13 2 De und renaturierende Aufreinigung von rekombinantem ABZ1 und ANA Die Aufgreinigung 6xHis getaggter Proteine erfolge ber die Ni NTA Affinit tschromatographie ANA ABZ1 sowie dessen Deletionsmutanten waren unter den gew hlten Expressionsbedingungen ausschlie lich bzw berwiegend unl slich Daher wurden sie zun chst denaturiert und nach mehreren Renaturierungsschritten auf der S ule eluiert Dazu wurde nach einem modifizierten Protokoll von Schmitz und Baeuerle 1997 verfahren Die Zellyse erfolgte in 5 ml des stark denaturierenden Puffers A 100 mM NaH2PQ 10 mM Tris HCl 6 M Guanidin Hydrochlorid pH 8 0 5 mM B Mercaptoethanol pro Gramm Zellpellet durch 1 st ndige Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Rollenmischer Nach 30 min tiger Zentrifugation bei 12000xg und 4 C wurde der Uberstand
29. 3 5 Um Aufschlu dar ber zu erlangen ob ABZ1 transkriptionsaktivierend oder reprimierend auf den CaMV 35S Promotor wirkt wurde dieser anaerob induzierte bZIP Faktor in einem Cotransformations Experiment unter aeroben Bedingungen funktionell analysiert Tabakbl tter wurden unter Verwendung der Partikelkanone mit einem ABZ1 Konstrukt als Effektor sowie dem Promotor Reportergen Konstrukt 35S GUS cotransformiert Kapitel 2 15 2 Als Transformationskontrolle wurde ein Konstrukt aus C1 Promotor und Luciferasegen verwendet C1 ist der Promotor des cab11 Gens aus der Zuckerr be der in Tabakbl ttern Reportergenexpression vermittelt Acc No EP 1 207 204 A1 Dietmar Stahl Einbeck pers Mitteilung Der C1 Promotor besitzt keine ACGT Core Sequenz und stellt folglich keine Zielsequenz fur ABZ1 dar Diese Eigenschaften des C1 Promotors sind wichtig da das C1 LUC Konstrukt als Transformationskontrolle dient und unabh ngig vom m glicherweise trans regulatorischen ABZ1 exprimiert werden soll In einem ersten Versuchsansatz wurde ein Effektorkonstrukt eingesetzt dessen ABZ1 Expression durch den CaMV 35S Promotor reguliert wurde Da diese transienten Expressionsuntersuchungen jedoch auf einen reprimierenden Effekt des ABZ1 hindeuteten wurde in einem zweiten Versuchsansatz der CaMV 35S Promotor upstream des ABZ1 Gens durch den C1 Promotor ersetzt Dadurch sollte eine m gliche Autoregulation der ABZ1 Expression unterbunden werden In Abbildung 16 sind d
30. ABZ1 und anderen Proteinen ber ihre Leucin Zipper Regionen erfolgt ABZ1 LTGEVSRLOGANKNIVSKIDETTERYAICAAONNVLRAOAMELTDRLRYL TRANSDUCIN TNLISNCLNKDMPGLMEKLMKKELAAVGQAVARSITPAIEKTISSAILEA ATP SYNTHASE LSPOEVNEHSDREIASLGISSMALASRLLSRSTROLXAGOVVLRPEHAVP IDS4 LIKE LGRDIVDLHGEMVLLXNYSALNYTGVVKILKKYDKLSGELLRLPFIOKVL ACC OXIDASE PASNIYEIOGLSKELCKAVDDYIDOLIKLAENLSELMCENLGLAKSYIKE EX070 VEREISKKPTOGGEIHPLTRYVMNYVKLLVDYSDTLNGLLEKLESDTEYG UNKNOWN KPSKKVREOTKVSALVKSVAEVSNMRIKIVRLKWVLTLLOONSSCEKSIV Abb 20 Alignment der ABZ1 Leucin Zipper Dom ne mit den putativen Leucin Zipper Regionen seiner interagierenden Peptide Leucine und Isoleucine im Zipper Motiv sind rot hervorgehoben Aminos uren die im Zipper Motiv auftreten aber keine Leucine oder Isoleucine sind sind fett dargestellt Zusammenfassend wird festgestellt dass ABZ1 mit verschiedenen Proteinen die in die Signaltransduktion involviert sind wie z B mit einem IDS4 like Protein oder mit einem Transducin Homolog interagieren kann 3 3 13 Untersuchung der transkriptionellen Induktion von potentiellen ABZ1 Interaktionspartnern unter Anaerobiose Die ACC Oxidase und das IDS4 like Protein wurden durch einen Hefe Two Hybrid Screen aus einer anaeroben Expressionsbank als potentielle Interaktionspartner des Anaerobiose spezifischen bZIP Transkriptionsfaktors ABZ1 isoliert U
31. Diese Beobachtungen unterst tzen die Annahme einer 7 Einleitung 7 koordinierten Regulation von Genen die zu bestimmten Zeitpunkten der anaeroben Antwort exprimiert werden Singer et ai 2001 Offensichtlich werden diese Gene durch eine Kombination hnlicher Transfaktoren kontrolliert Klok et ai 2002 Bei koordinierter Transkriptionsregulation der ANPs beruht ihre modifizierte Genexpression also wahrscheinlich auf post transkriptionellem Processing und der Transkript Stabilit t der unterschiedlichen mRNA Spezies Drew 1997 Folglich sind anaerobe Trans kriptionsfaktoren die unterschiedliche Expressionsprofile aufweisen wahrscheinlich in diverse Kontrollprozesse involviert Klok ef ai 2002 Ihre Bedeutung f r die Signaltransduktion unter hypoxischen oder anaeroben Bedingungen muss jedoch noch untersucht werden Mit dem sauerstoffabh ngigen Wechsel der induzierten bzw reprimierten Transkriptionsfaktoren ist auch eine Umstellung in der Expression anderer Komponenten der Signaltransduktion wie z B von Kinasen und des Ethylenrezeptors ETR2 assoziiert nderungen in der cytosolischen Ca Subbaiah ef al 1994 der ABA Kato Noguchi 2000 und der Ethylen Konzentration Peng et al 2001 deuten auf eine Beteiligung an der Signaltransduktion die nachfolgend zu Umstellungen in der Genexpression f hrt hin So stellt die Interaktion von G Box Bindungsfaktoren GBF mit 14 3 3 Proteinen die sowohl Ca binden k nnen als auch die F
32. Experimente demonstriert Kapitel 3 2 4 Abb 7 ANA bindet wie bereits f r verschiedene NAC Proteine berichtet wurde spezifisch an den CaMV 35S Promotor Duval et al 2002 Xie ef al 2000 Eine Kompetition des Komplexes aus ANA und Promotorfragment mit RBSS1 einer spezifischen Zielsequenz des bZIP Transkriptionsfaktors ABZ1 war nicht m glich Daten nicht gezeigt Auch Xie ef al 2000 konnten zwar eine Interaktion von NAC1 mit dem 35S Promotor zeigen jedoch f hrte eine Mutation innerhalb der as 1 Sequenz des Promotors die von vielen Tabak bZIP Faktoren gebunden wird lediglich zu einer partiellen Beeintr chtigung der Bindung Die Interaktion des bZIP Faktors ASF 1 mit dem 35S Promotorfragment wurde jedoch aufgrund der mutierten Sequenz aufgehoben Diese Beobachtungen weisen darauf hin dass NAC Proteine und bZIP Transkriptionsfaktoren unterschiedliche Bindungsspezifit ten besitzen Mit der Methode des DNase Footprinting wurde eine 4 Diskussion 95 Bindungsstelle f r AINAM AGGGATG Duval et ai 2002 einen NAC Faktor aus Arabidopsis im Bereich von 70 bis 76 bp des 35S Promotors identifiziert Diese liegt zwar innerhalb des as 1 Elements des CaMV 35S Promotors aber sie betrifft weder die palindromische noch die unvollst ndige Core Sequenz des as 1 Elements Obwohl ANA also eine Aktivierungsdom ne besitzt und an den CaMV 35S Promotor bindet konnte im transienten Expressionssystem von Tabak unter aeroben Bedingungen keine e
33. Holsters M 2002 Suppression subtractive hybridization to enrich low abundance and submergence enhanced transcripts of adventitious root primordia of Sesbania rostrata Plant Science 162 915 921 Cavener D R 1987 Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila an vertebrates Nucleic Acids Res 15 1351 1361 Chang W W Huang L Shen M Webster C Burlingame A L Roberts J K 2000 Patterns of protein synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a low oxygen environment and identification of proteins by mass spectrometry Plant Physiol 122 295 318 Chen W et al 2002 Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses Plant Cell 14 559 574 Collinge M Boller T 2001 Differential induction of two potato genes Stprx2 and StNAC in response to infection by Phythophtora infestans and to wounding Plant Mol Biol 46 521 529 Cox M C Millenaar F F van Berkel Y E Peeters A J Voesenek L A 2003 Plant movement Submergence induced petiole elongation in Rumex palustris depends on hyponastic growth Plant Physiol 132 282 291 6 Literaturverzeichnis 115 Davies J M Poole R J Sanders D 1993 The computed free energy change of hydrolysis of inorganic pyrophosphate and ATP apparent significance for inorganic pyrophosp
34. INVaF 2332 pCR2 1 RBSS9 INVaF 2333 pCR2 1 RBSS11 INVaF 2336 pCR2 1 RBSS1 1 INVoF 2337 pCR2 1 RBSS2 1 INVoF 2338 pCR2 1 RBSS3 1 INVaF 2339 pCR2 1 RBSS 4 1 INVaF 2340 pCR2 1 RBSS 5 1 INVaF 2341 pCR2 1 RBSS6 1 INVaF 2343 pCR2 1 RBSS 8 1 INVaF 2344 pCR2 1 RBSS 9 1 INVaF 2384 pRT103 ABZ145 13s GUS XL1 blue 2385 pSport1 MT172 Full size cDNA von ANA DH 10B 2390 pCR2 1 ANA INVoF 2394 pCR2 1 RBSS10 1 INVaF 2395 pSport1 MT74 Full size cDNA von ABZ1 DH 10B 2413 pRT103 ANA1 301 GUS XL1 blue 2414 pRT103 ANA1 136 GUS XL1 blue 2415 pRT103 ANA1 76 GUS XL1 blue 2453 pVKH 35S Gal4AD ABZ1 pA1 XL1 blue 7 Anhang 139 2455 pGBKT7 ZIP XL1 blue 2456 pQE 30 ANA pREP4 M15 2463 pCR2 1 ANAbait INVaF 2466 PGBKT7 ANA 1 301 XL1 blue 2545 pCR2 1 ANA1 166 INVaF 2571 pGBKT7 ANA1 166 XL1 blue 2573 pCL1 AH109 2574 pGBKT7 AH109 2575 PGBKT7 ANA 1 301 AH109 2576 PGBKT7 ANA1 166 AH109 2577 pGBKT7 ZIP AH109 2582 pCR2 1 35S INVaF 2644 pC1L 1097 XL1 blue 2645 pVKH C1 pA1 XL1 blue 2646 pVKH C 1 ABZ1 pA1 XL1 blue 2647 pVKH C1 GAL4AD ABZ1 pA1 XL1 blue 2679 pVKH 35S ANA pA1 XL1 blue 2697 pQE 30 ANA pREP4 BL21 DE3 RIL Codon Plus pACYC 2748 pSport1 LeACO5 Full size cDNA in DH 10B 2749 pSport1 AlL Full size cDNA in DH 10B 2760 pQE 30 ABZ1 Mu2 pREP4 BL21 DE3 RIL Codon Plus pACYC 2
35. In Wurzeln ohne Aerenchym ist der Widerstand f r Sauerstoffoewegung in den gasgef llten Interzellularr umen relativ gro Deshalb ist f r die Sauerstoffversorgung ber weitere Strecken aerenchymatisches Gewebe notwendig und effektiv weil es die metabolische Aktivit t in Geweben unterbindet und dadurch die O2z Versorgung verbessert van Dongen ef a 2003 Drew et al 2000 Dann ist die Anzahl O2 verbrauchender Zellen und die Respirationsrate pro Volumeneinheit Gewebe reduziert und der Widerstand f r die Gasdiffusion oder Konvektion ist geringer Die Bildung von Aerenchym stellt also eine langfristige adaptive Antwort auf O2 Mangel dar Dennoch wird auch in Pflanzen mit aerenchymatischen Wurzeln aufgrund eines erniedrigten Energiemetabolismus und gesteigerter Produktion von Ethanol Alanin sowie Lactat eine begrenzte Sauerstoffversorgung festgestellt Gibbs ef ai 1995 In hypoxischen Maiswurzeln in denen eine h here Ethylenkonzentration als in normoxischen Wurzeln vorliegt wird die Ausbildung Iysogenen Aerenchyms induziert Drew ef al 2000 Au erdem wird die Aktivit t einer Ca abh ngige Cellulase die f r die Zellyse verantwortlich ist durch Ethylen stimuliert He ef ai 1996 Basierend auf diesen Beobachtung wird eine Hypoxia stimulierte Ethylen Biosynthese und eine 7 Einleitung 11 anschlie ende Ethylen vermittelte Signaltransduktion die den Zelltod und die Aerenchymbildung bei O gt Mangel ausl st postuliert Drew
36. Konstrukte in Saccharomyces cerevisiae Die Mittelwerte der gemessenen Reportergen Aktivitaten sowie die entsprechenden Standardabweichungen sind relativ zur Positivkontrolle p53 T in Prozent angegeben Bait Konstrukte wurden in den Vektor pGBKT7 und Prey Konstrukte in pGADT7 kloniert Die einzelnen Konstrukte sind im Text erlautert bZIP Transkriptionsfaktoren interagieren Uber ihren Leucin Zipper mit anderen Proteinen Daher lag die Annahme nahe dass auch die im Yeast Two Hybrid Screen selektierten Peptide deren Interaktion mit ABZ1 durch den quantitativen B Galactosidase Assay 3 Ergebnisse 84 verifiziert worden war eine Leucin Zipper Dom ne besitzen m ssten Dies wurde anhand einer vergleichenden Sequenzanalyse berpr ft In Abbildung 20 ist ein Alignment des ABZ1 Leucin Zippers sowie der putativen Leucin Zipper Dom nen seiner interagierenden Peptide dargestellt Leucine und Isoleucine die in einem Abstand von 7 Aminos uren auftreten also dem Zipper Motiv entsprechen sind rot hervorgehoben Andere Aminos uren im korrekten Abstand des Leucin Zippers sind fett dargestellt Die interagierenden Peptide enthalten drei bis sieben Leucine bzw Isoleucine im korrekten Abstand Die Leucin Zipper von ABZ1 und seiner interagierenden Peptide sind mindestens durch eine aber h chstens durch drei Aminos uren unterbrochen die nicht Leucine oder Isoleucine sind Diese Beobachtungen unterst tzen die Annahme dass die Interaktion zwischen
37. LE 1642 1849 szer LLLZ oo h Ss seoe zo Lels 894 967 SNO SSE LZAV LO 86 697 EES 82 9219 ZVELEY 8029 rer ostz 6r o ge sos ezissse 68t zzz SNO SSE LZAV IO ST zer 97 v5 RECH Zi PSL gozt 222 84r bro Zegozl r eeec sce 107 sno sse AU LorLL 6L OZYE gS 909 e60z cool ess sr o gL 96cL co sgre bze erz sno sse LZ 8S9 9L SOZ HRZ LU Lreg ozsr zeoe egr Le o ss zg6 reen sor z9 z sno sse GER 26 9LL Z0 60SE Lp eege 6857 sezt sez Leo oeipel Jong 69 erz sno sse L2 0ZL oo OS rZ oner greet 99z zg e SI NUOY 69229 7 eseese 0 07 77 TI L gcgg Ir geck 0022 Tt aco ez Zoos 69 e669 108 ece SNO SSe LZav avr VO LE ZIF EC 80Z 6 9PZ9 eg 1gE9 s66 sez Are os o Le er6z Zeiores Les vrl SnO SS e LZav GvPIVO LO 96 989 SU gel L enpe ZE IZSS 9122 OLZL 162 Le o zr zegr ze ezz9 zus HL SNO SSe LZaV GVPIVO LO 9 S6L sos 69 SSP GH 20 8ELL 82 8S81 9LoL 019 tiz ero zg Looz go eeee 99e grz SnO Sse LZav awrIVO 19 espe SKI 99191 JE ce ooz org Ooze vz o 6 622 egeoite 025 oz SNO SSE LZAV IO r6 04r 6 901 Ir B0ZE aUeCEE ezg 886 ozp ez o ge rise Lager oer SL SNO SSE LZAV LO 60 SAL 96 ZL8BLEL er 6erl ove is Loz sz o g zsse Lo eres ers eoz SNO SSE LZAV LO Lvl gee 80 LES 10 6EL DK gece ez9z ozz 928 gz o g zz r zyieiss 225 60 z SNO SSE LZAV IO LE TZE 16 9
38. RE 1996 A microsensor for direct measurement of O2 partial pressure within plant tissues J Exp Bot 47 447 457 Okumura N Nishizawa Nk Umehara Y Mori S 1991 An iron deficiency specific cDNA from barley roots having two homologous cystein rich MT domains Plant Mol Biol 17 531 533 Okumura N Nishizawa N K Umehara Y Ohata T Nakanishi H Yamaguchi T Chino M Mori S 1994 A dioxygenase gene ds2 expressed under iron deficiency conditions in the roots of Hordeum vulgare Plant Mol Biol 25 705 719 Olive M R Peacock W J Dennis E S 1991 The anaerobic responsive element contains two GC rich sequences essential for binding a nuclear protein and hypoxic activation of the maize Adh7 promoter Nucli Acids Res 19 7053 7060 Olson D C Oetiker J H Yang S F 1995 Analysis of LE ACS3 a 1 aminocyclopropane 1 carboxylic acid synthase gene expressed during flooding in the roots of tomato plants J Biol Chem 270 14056 14061 Palmgren M G 2001 Plant plasma membrane H ATPases powerhouses for nutrient uptake Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52 817 845 Paul A L Ferl R J 1991 In vivo footprinting reveals unique cis elements and different modes of hypoxic induction in maize Adh1 and Adh2 Plant Cell 3 159 168 Paul A L Ferl R J 1997 The hypoxic response of three alcohol dehydrogenase genes n vivo and in vitro footprinting of DNA protein interactio
39. Sie katalysiert sowohl die ATP Synthese als auch die reversible Hydrolyse von ATP zu ADP und einem Phosphatrest Zwei weitere potentielle ABZ1 Interaktionspartner das IDS4 like Protein AlL sowie die ACC Oxidase LeACO5 Ihre funktionellen Bedeutungen werden in den folgenden Kapiteln eingehender diskutiert AlL k nnte ein realer Interaktionspartner des ABZ1 sein da das interagierende Peptid 170 Aminos uren umfasst und somit einem gro en Anteil des vollst ndigen AIL aus Tomate mit 266 Aminos uren entspricht Aufgrund seiner SPX Dom ne und der daraus resultierenden Beteiligung an Signaltransduktions Vorg ngen k nnte das IDS4 like Protein interessant sein Die beiden mit ABZ1 interagierenden Peptide die Homologien zur 312 Aminos uren langen ACC Oxidase LE ACO4 BAA34924 Nakatsuka ef al 1998 aufweisen stellen mit 128 bzw 161 Aminos uren ebenfalls einen relativ hohen Anteil des Gesamtproteins LeACO5 mit 301 Aminos uren dar Au erdem wurden zwei unabh ngige Klone dieser ACC Oxidase im Hefe Two Hybrid Screen isoliert Aus diesen Gr nden liegt die Vermutung nahe dass ABZ1 tats chlich mit dieser LeACO5 interagiert Andererseits liegt ihr Leucin Zipper innerhalb des katalytischen Zentrums so dass eine reale Interaktion mit ABZ1 in planta eher unwahrscheinlich ist Schlie lich stellt sie ein neues Mitglied der Oxidoreduktase Familie dar die f r die Ethylensynthese von Bedeutung ist Somit steht sie indirekt mit der anaeroben Signal
40. Vorkenntnisse sollte auch das anaerob induzierte Protein ANA auf eine potentiell vorhandene Aktivierungsdom ne in Hefe analysiert werden F r diese Untersuchungen wurden Komponenten aus dem MATCHMAKER Library Construction amp Screening Kit Clontech verwendet Zun chst wurden zwei Fusionskonstrukte aus ANA und der DNA Bindungsdom ne DNA BD des GAL4 Proteins aus Saccharomyces cerevisiae kloniert Einerseits wurde die gesamte ANA codierende Sequenz die 903 Basenpaare bzw 301 Aminos uren umfasst ANA zou und andererseits der N Terminus von ANA mit 498 Basenpaaren bzw 166 Aminos uren ANA ee so in pGBKT7 kloniert dass translationale Fusionen mit der GALA DNA BD entstanden Anschlie end wurde die Aktivit t eines durch sie 3 Ergebnisse 56 kontrollierten Reportergens in einem quantitativen Test bestimmt Kapitel 2 17 7 Als Kontrollplasmid wurde pCL1 eingesetzt das den vollst ndigen transkriptionellen Aktivator GAL4 aus Hefe exprimiert Im Hefereporterstamm AH109 binden die Fusionsproteine bzw das Kontrollprotein mit ihrer GALA DNA BD an ein GAL4 responsives Minimalpromotorelement Verf gt das gebundene Protein ber eine Aktivierungsdomane so wird die Transkription des downstream gelegenen acZ Reportergens aktiviert In einem FlUssigkultur B Galactosidase Test kann der enzymatische Umsatz von ONPG zu o Nitrophenol und D Galactose durch die exprimierte B Galactosidase quantifiziert werden Kapitel 2 17 7 Anhang 7 1
41. Weitere Probenentnahmen erfolgten durch Abstoppen der Reaktion nach 20 40 und 60 Minuten 2 Material und Methoden 37 GUSz20 60 Im Spektralphotometer Kontron Instruments SFM 25 Exikation 365 nm Emission 455 nm wurden in Abhangigkeit der Konzentration an fluoreszierendem Reaktionsprodukt 4 MU Fluoreszenzeinheiten FU pro Zeiteinheit gemessen Durch Umrechnung und Standardisierung konnte auf die B Glucuronidaseaktivit t geschlossen werden Kapitel 2 15 2 6 2 15 2 5 Quantitativer LUC Test Die Luciferase Aktivit t wurde nach de Wet ef al 1987 bestimmt 50 ul des Proteinextraktes Kapitel 2 15 2 3 wurden zu 350 ul Luciferasepuffer 25 mM Glycylglycin 15 mM MgSO 1 mM ATP pH 7 8 hinzugef gt Nach Injektion von 150 ul Substratl sung 0 2 mM Luciferin in 25 mM Gycylglycin pH 7 8 wurden im Luminometer Berthold Lumat 9501 die emittierten Photonen ber ein Zeitintervall von 10 Sekunden gez hlt und in LUC Einheiten angegeben 2 15 2 6 Berechnung der Reportergen Aktivit t Die Bestimmung der relativen GUS Aktivit t erfolgte modifiziert nach Sprenger Haussels und Weisshaar 2000 sowie Schledzewski und Mendel 1994 Die spezifische LUC Aktivit t LUC wurde als LUC Einheit bezogen auf die Proteinmenge angegeben wobei anschlie end die spezifische LUC Aktivit t der nicht transformierten Kontrolle subtrahiert wurde LUC veel Durch Division der einzelnen LUC ke Werte durch die h chste korrigierte spezifische LU
42. _ bett 1 1 kb Abb 3 Transkriptionelle Analyse der anaeroben Induktion forward subtrahierter Gene Gesamt RNA aus unterschiedlichen Geweben Blatt Frucht Wurzel bzw einem Gemisch aller Gewebe rechts aerober und anaerob inkubierter Tomatenpflanzen wurde mit entsprechenden SSH Fragmenten hybridisiert Die Gr e der hybridisierten mRNA Molektle ist in Kilobasenpaaren kb angegeben Die aufgetragenen RNA Mengen wurden durch Ethidiumbromid Farbung der rRNA berpr ft und waren vergleichbar Daten nicht gezeigt Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Komponenten der anaeroben Genexpression und Signaltransduktion Deshalb wurden basierend auf den isolierten SSH Fragmenten SSH 74 und SSH 172 die beiden anaerob induzierten Gene n her untersucht die f r einen bZIP Transkriptionsfaktor SSH 74 sowie einen Transkriptionsfaktor mit NAC Dom ne SSH 172 codieren Nachfolgend werden diese Gene mit Abz7 und Ana bzw ihre Genprodukte als ABZ1 f r anaerob induzierter bZIP Faktor und ANA f r anaerob induziertes NAC Protein bezeichnet 3 2 Strukturelle und funktionelle Analyse von ANA 3 2 1 ANA geh rt zur Familie der NAC Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktoren werden aufgrund ihrer Dom nen die an spezifische DNA Sequenzen binden in unterschiedliche Klassen eingeteilt Eine solche DNA bindende Dom ne stellt die hoch konservierte N terminale Aminos uresequenz der sog NAC Proteine dar Gene die Proteine mit NAC Dom
43. ai 1998 4 Diskussion 100 4 7 ABZ1 ein anaerob spezifischer Repressor der Transkription Nachdem in vitro eine spezifische Bindungsaktivit t des bZIP Transkriptionsfaktors ABZ1 an den CaMV 35S Promotor nachgewiesen werden konnte Kapitel 3 3 6 Abb 13B wurde die Aktivit t des 35S Promotors in Abh ngigkeit von ABZ1 in transient transformiertem Tabak untersucht Diese Cotransformationsexperimente zeigten dass die Aktivitat des CaMV 35S Promotors nach Coexpression von ABZ1 unter aeroben Bedingungen schwacher ist Kapitel 3 3 9 Abb 16 Da ABZ1 keine Prolin reiche Aktivierungsdomane besitzt wird angenommen dass ABZ1 reprimierend auf den 35S Promotor wirkt Au erdem f hrt Anaerobiose sowohl in Tabak als auch in Tomatenbl ttern zu einer im Vergleich zu aeroben Bedingungen reduzierten Aktivit t des CaMV 35S Promotors Kapitel 3 3 10 Abb 17 Folglich k nnte ABZ1 dessen Expression unter anaeroben Bedingungen induziert wird f r die reduzierte Aktivit t des CaMV 35S Promotors bei Anaerobiose verantwortlich sein In transgenen Tomatenpflanzen die stabil mit einem CaMV 35S Promotor Reportergen Konstrukt transformiert worden waren spiegeln die Transkriptmengen des Reportergens eine heterogene Expressionsregulation unter aeroben bzw anaeroben Bedingungen wieder Kapitel 3 3 11 Abb 18 Diese Beobachtung k nnte aus der Transkriptstabilit t des GUS Gens auch unter anaeroben Bedingungen resultieren Weiterhin k nnten Positio
44. dehydrogenase gene Plant Mol Biol 19 693 697 6 Literaturverzeichnis 117 Gout E Boisson A M Aubert S Douce R Bligny R 2001 Origin of the cytoplasmic pH changes during anaerobic stress in higher plant cells carbon 13 and phosphorous 31 nuclear magnetic resonance studies Plant Physiol 125 912 925 Haas B J Volfovsky N Town C D Troukhan M Alexandrov N Feldmann K A Flavell R B White O Salzberg S L 2002 Full lengh messenger RNA sequences greatly improve genome annotation Genome Biol 3 RESEARCH0029 Halliday K J and Frankhauser C 2003 Phytochrome hormonal signalling networks New Phytologist 157 449 463 Harter K Kirchner S Frohnmeyer H Krenz M Nagy F Schafer E 1994 Light regulated modification and nuclear translocation of cytosolic G box binding factors in parsley Plant Cell 5 545 559 He C J Morgan P W Drew M C 1996 Transduction of an ethylene signal is required for cell death an lysis in the root cortex of maize during aerenchyma formation induced by hypoxia Plant Physiol 112 463 472 Heinekamp T Kuhlmann M Lenk A Strathmann A Dr ge Laser W 2002 The tobacco bZIP transcription factor BZI 1 binds to G box elements in the promotors of phenylpropanoid pathway genes in vitro but it is not involved in their regulation in vivo Mol Genet Genomics 267 16 26 Herbik A Giritch A Horstmann C Becker R Balzer
45. denen aufgrund der Datenbank Recherche eine putative Funktion zugeordnet werden konnte Tab 6 Durch Suppression Subtractive Hybridization isolierte cDNA Fragmente SSH Klon Nr anaerob induzierter Gene die H ufigkeit mit der sie isoliert wurden und ihre h chsten Homologien SSH Fragment Anzahl Homologievergleich SSH 6 3 Pyruvat Decarboxylase Solanum tuberosum BAC23043 SSH 7 2 dnaK Typ molekulares Chaperon hsc70 3 Lycopersicon esculentum JC4786 SSH 11 10 NADH abh ngige Glutamatsynthase Arabidopsis thaliana BAA97323 1 SSH 33 1 Glycerinaldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase Lycopersicon esculentum AAB54003 SSH 34 3 Samen spezifisches Protein Bn15D17A Brassica napus AAP37970 SSH 35 6 Ethylen responsives Protein Arabidopsis thaliana NP_850562 1 SSH 36 4 PHO85 ahnliches Protein Oryza sativa BADO1222 1 3 Ergebnisse 49 SSH 55 4 Heat shock Protein 90 Lycopersicon esculentum AAD30456 SSH 59 3 Triosephosphat lsomerase Petunia x hybrida CAA58230 SSH 61 2 Sucrose Synthase Lycopersicon esculentum CAA09681 SSH 62 3 Enolase Lycopersicon esculentum CAA41115 SSH 73 1 Phosphoenolpyruvat Carboxykinase Lycopersicon esculentum AAG01894 SSH 74 1 bZIP Transkriptionsfaktor BZI 4 Nicotiana tabacum AAK92215 SSH 76 1 Calmodulin bindendes Protein TCB60 Mcotiana tabacum T03793 SSH 87 1 Seneszenz assoziiertes
46. die Zwiebelepidermiszellen in 50 mM NaPO pH 7 0 berf hrt Durch die Zugabe von 1 ug ml 4 6 Diamidino 2 phenylindol DAPI und 15 min tige Inkubation bei Raumtemperatur konnten die Zellkerne im Fluoreszenzmikroskop Axioplan 2 Zeiss mit einem Filter der Wellenl nge 360 370 nm sichtbar gemacht werden 2 15 2 Funktionelle Untersuchung von ABZ1 und ANA im transienten System 2 15 2 1 DNA Konstrukte f r Cotransformations Untersuchungen Nachfolgend sind die Konstrukte beschrieben deren transiente Expression in Blattmaterial von Tabak und Tomate untersucht wurde Den Konstruktbezeichnungen sind die Labor internen DNA Nummern in Klammern angef gt pVKH 35S pA1 3578 Alle Effektorkonstrukte basieren auf diesem T DNA Vektor der den CaMV 35S Promotor einen Klonierungslinker sowie ein Polyadenylierungsignal 2 Material und Methoden 33 besitzt pVKH 35S pA1 wurde als Effektorplasmid zur Bestimmung der Hintergrund Aktivitat eingesetzt pVKH 35S ABZ1 pA1 3130 Der kodierende Bereich des bZIP Transkriptionsfaktors ABZ1 wurde zun chst durch PCR unter Verwendung des Templates pSport1 MT74 sowie der Primer 74 5 und 74 3 amplifiziert Kapitel 2 13 1 Tab 1 in pCR 2 1 kloniert Kapitel 2 11 und sequenziert Das mit BamHI und Smal gespaltene Fragment wurde in pVKH 35S pA1 Hindlll fill in BamHI CIAP subkloniert Dieses Konstrukt wurde als Effektor verwendet pVKH 35S Gal4AD ABZ1 pA1 3346 Die Aktivierungsdom ne des B
47. eh eS Primer F 25 nt Zunachst wurden diese Oligonucleotide als Template eingesetzt um durch eine Zweitstrangsynthese radioaktiv markierte doppelstrangige Zufallsfragmente dsR64 zu erhalten 2 ul 50 ng ul Oligonucleotid R64 2 ul 10x Advantage 2 Puffer Clontech 2 ul 0 5 mM 3dNTP Mix dCTP 2 ul 40 uM dCTP 2 ul 80 ng ul Primer F 2 ul a 32P ICTP 7 ul ddH20 1 ul 5 U ul Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 20 ul Gesamtvolumen Einer 1 min tigen Vordenaturierung bei 94 C schlossen sich ein 3 min tiger Annealingschritt bei 62 C und eine 9 Minuten andauernde Elongationsphase bei 72 C an Nach der Zugabe von 2 ul 0 5 mM dCTP erfolgte nochmals eine 9 min tige Synthesephase bei 72 C Um die doppelstr ngigen DNA Fragmente von Primermolek len und nicht inkorporierten Nucleotiden abzutrennen sowie aufgrund der geringen Molekulargewichtsdifferenz zwischen dsR64 und Primer F wurde eine Aufreinigung ber ein Polyacrylamidgel 2 Material und Methoden 25 durchgef hrt Nach einem ca 1 st ndigen Gelvorlauf in 1x TBE Puffer 10x TBE 0 9 M Tris Base 0 9 M Borat 10 mM EDTA pH 8 0 bei 5 V cm erfolgte die Auftrennung der dsR64 Fragmente Uber ein 10 iges nicht denaturierendes Polyacrylamidgel 3 3 ml Acrylamid Rotiphorese 30 Gel 37 5 1 Roth 1 ml 10x TBE 10 ul TEMED 18 ul 30 iges APS ad 10 ml ddH2O unter den beschriebenen Bedingungen Durch eine anschlie ende Exposition von 90 Sekunden konnten die radioak
48. f r erh hte Toleranz essentiell ist Hunt ef a 2002 So besitzen die meisten pflanzlichen H moglobine eine um ein Vielfaches h here Affinit t f r Sauerstoff als die Cytochromoxidase Trevaskis et ai 1997 Daher erscheint es unwahrscheinlich dass Hamoglobine direkt als O2 Sensoren agieren sondern vielmehr als Modulatoren der hypoxischen Antwort wirken GLB1 interagiert offensichtlich mit einem Os gt detektierenden System das auf Ham basiert Das f hrt zur Induktion von Mechanismen die einen erh hten O2 Eintrag erlauben um interner Anoxia vorzubeugen sofern externer Sauerstoff zur Verf gung steht Andererseits wird trotz hypoxischer Bedingungen das berleben gef rdern Geigenberger 2003 Abb 1 Au erdem sind Ver nderungen in der cytosolischen Ca Konzentration an der anaeroben Signaltransduktion in Maiswurzelzellen beteiligt Subbaiah et ai 1994 Abb 1 In Folge von Anaerobiose erfolgt ein schneller Anstieg der cytosolischen Ca Konzentration Wahrscheinlich ist dieser schnelle Anstieg eine Antwort auf den Abfall des pH Wertes oder des verringerten Energiemetabolismus unter anaeroben Bedingungen Drew 1997 In Arabidopsis konnte gezeigt werden dass f r die Induktion des Alkoholdehydrogenase ADH Gens ein G Protein assoziierter Signaltransduktionsweg verantwortlich ist der durch O2 Mangel stimuliert wird Baxter Burrell et at 2002 Die sog Rop RHO like small G protein of plants vermittelte Signalweiterleitung aktiv
49. gt Nach transienter Coexpression von ABZ1 unter aeroben Bedingungen kompetiert ABZ1 vermutlich mit endogenen Transfaktoren aus Tabak um die Zielsequenzen innerhalb des CaMV 35S Promotors Daraus resultiert zwar eine verringerte Expression des 35S Promotors jedoch keine vollstandige Inhibierung Modell A vgl ABZ1 mit ABZ1 Transformation Konstrukt ABZ1 ABZ1 Bedingungen A transient 355 GUS _ Ca 02 ABZ1 02 O2 Hz transient B 35S GUS O2 O2 02 O2 transgen gt m gt C 3 35S GUS I O2 O2 Abb 25 Gegen berstellungen der Regulation des CaMV 35S Promotors hellblau durch aktvierende gr n und reprimierende rot Transfaktoren unter diversen Versuchsbedingungen Die Pfeilgr e korreliert mit der Expressionsstarke des GUS Gens blau Kreuze bZIP Faktoren rotes Kreuz ABZ1 gr ne Kugel ANA Ein weiteres Beispiel f r eukaryotische Transkriptionsrepressoren stellt das aus der Maus isolierte Jun Dimerisierungsprotein 2 JDP2 dar Es ist mit 163 Aminos uren ein ebenfalls relativ kleines bZIP Protein JDP2 bindet entweder als Homo oder als Heterodimer mit dem Transkriptionsaktivator ATF 2 an das cAMP Response Element CRE Dadurch reprimiert es die CRE abh ngige und durch ATF 2 vermittelte Transkription Jin ef a 2001 Weiterhin interagiert JDP2 auch mit einem Histon Deacetylase Komplex HDAC und inhibiert nach Bindung an ein Differentiation Response Element innerhalb des Promotors des c
50. handelt es sich um bZIP Transkriptionsfaktoren ein Calmodulin bindendes Protein eine Proteinkinase sowie ein Zink RING Finger Protein Allerdings wurden in Arabidopsis keine bZIP Faktoren identifiziert die dem aus Tomate isolierten bZIP Protein ABZ1 strukturell hnlich sind sondern anderen Subfamilien angeh ren Bisher ist lediglich der Mais bZIP Faktor mLIP15 bekannt der sowohl eine hnliche Struktur wie der bZIP Transkriptionsfaktor aus Tomate besitzt als auch unter anaeroben Bedingungen eine schwach hochregulierte Transkriptionsrate zeigt Kusano ef a 1995 Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal ein Transkriptionsfaktor der NAC Familie als Anaerobiose spezifisch identifiziert ANA Das durch SSH isolierte Ethylen responsive Protein SSH 35 k nnte m glicherweise eine Rolle in der anaeroben Signaltransduktion spielen da auch ein Ethylen Rezeptor ETR2 dessen Transkription unter Sauerstoff armen Bedingungen in Arabidopsis hochreguliert ist in die Signaltransduktion involviert ist Klok et al 2002 Weitere induzierte Gene wurden aufgrund des DNA Microarray Screens der cDNA Bank aus Arabidopsis als Antwort auf Anaerobiose erwartet Diese codieren Enzyme des Zuckermetabolismus der Glykolyse bzw des fermentativen Stoffwechsels und wurden auch durch SSH als anaerob hochregulierte Gene aus der Tomate isoliert Pyruvat Decarboxylase SSH 6 Glycerinaldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase SSH 33 Sucrose Synthase SSH 61 und 12
51. leucin zipper motif Mol Gen Genet 240 1 8 Aida M Ishida T Fukaki H Fujisawa H Tasaka M 1997 Genes involved in organ separation in Arabidopsis an analysis of the cup shaped cotyledon mutant Plant Cell 9 841 857 Altschul S F Madden T L Sch ffer A A Zhang J Zhang Z Miller W Lipman D J 1997 Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs Nucl Acids Res 25 3389 3402 Andrews D L McAlpine D M Cobb B G Johnson J R Drew M C 1994 Differential induction of MRNAs for the glycolytic and ethanolic fermentative pathways by hypoxia and anoxia in maize seedlings Plant Physiol 106 1575 1582 Armstrong W 1979 Aeration in higher plants In Woolhouse HW ed Advances in botanical research 7 New York Academic Press 225 232 Ausubel F M Brent R Kingston R E Moore D D Seldman J G Smith J A Struhl K 1988 Current protocols in molecular biology Green and Wiley Interscience New York Bailey Serres J Dawe R K 1996 Both 5 and 3 sequences of maize adh1 mRNA are required for enhanced translation under low oxygen conditions Plant Physiol 112 685 695 Bailey Serres J Freeling M 1990 Hypoxic stress induced changes in ribosomes of maize seedling roots Plant Physiol 94 1237 1243 Barry C S Blume B Bouzayen M Cooper W Hamilton A J Gierson D 1996 Differential expression of the 1 amin
52. mit 1 ml 50 iger Ni NTA Agarose Suspension pro 4 ml Lysat versetzt und zur Bindung der 6xHis getaggten Proteine an die Matrix eine Stunde bei 4 C auf einem Rollenmischer inkubiert Anschlie end wurde diese Suspension auf eine S ule geladen und bei 4 C zun chst jeweils zweimal mit je 4 ml Puffer B 100 mM NaH gt PO 10 mM Tris HCl 8 M Harnstoff pH 8 0 5 mM Mercaptoethanol denaturiert sowie mit Puffer C entspricht Puffer B mit einem pH Wert von 6 3 gewaschen Die Renaturierung erfolgte mit jeweils 2x 5 ml folgender Puffer abnehmender Harnstoff Konzentration 6 M 4 M 2 M 0 M Urea 20 mM Tris HCl 200 mM KCI 2 mM EDTA 20 Glycerin pH 7 5 1 mM B Mercaptoethanol 1 mM PMSF Abschlie end wurde 4x mit je 500 ul nativem Elutionspuffer 50 mM NaH gt PO4 300 mM NaCl 250 mM Imidazol pH 8 0 5 mM B Mercaptoethanol 1 mM PMSF eluiert Die Elutionsfraktionen des 6xHis ANA wurden zus tzlich vereinigt und Uber eine Microcon YM 10 S ule Millipore aufkonzentriert Aufgereinigte Proteine wurden aliquotiert in fl ssigem Stickstoff eingefroren und bei 80 C aufbewahrt Ein Aliquot der aufgereinigten Proteinfraktionen wurde mittels SDS Polyacrylamidgelelektrophorese auf qualitativen Proteingehalt berpr ft Kapitel 2 13 3 2 Material und Methoden 23 Quantitativ wurde die Proteinkonzentration nach Bradford 1976 bestimmt Kapitel 2 13 4 2 13 3 SDS PAGE Die SDS PAGE ist ein Verfahren bei dem Proteine in Gegenwart von Natr
53. ne codieren spielen eine essentielle 3 Ergebnisse 52 Rolle in der Pflanzenentwicklung und sind fur die Bildung und Erhaltung des SAM Shoot Apical Meristem sowie f r die Bl tenmorphogenese verantwortlich Souer et al 1996 Entdeckt wurde diese Genklasse durch Mutanten der Petunie die kein Apikalmeristem nam no apical meristem Souer ef ai 1996 ausbilden und Arabidopsis Mutanten die fusionierte Kotyledonen zeigen cuc7 und cuc2 cup shaped cotyledon Aida et ai 1997 In Folge der Identifizierung eines cDNA Fragments das Homologien zur mRNA eines Proteins mit NAC Domane aufweist Tab 6 SSH 172 wurde zunachst ein vollstandiger cDNA Klon f r ANA isoliert werden So wurden Sequenzinformationen Uber den codierenden Bereich des ANA Proteins sowie seine 5 und 3 UTR untranslated region erhalten Es wurden ca 200000 Klone einer cDNA Bank 5x105 cfu ml aus anaerob inkubierten Tomatenpflanzen Kapitel 2 12 mit dem isolierten cDNA Fragment SSH 172 als Hybridisierungssonde gescreent Im ersten Screen konnten 85 potentiell Positive detektiert werden 10 dieser positiven Klone wurden in einer zweiten Screeningrunde vereinzelt und verifiziert Nach einer Nof SaA Testspaltung der isolierten Plasmid DNA wurde ein Klon mit einem m glichst gro en cDNA Insert identifiziert und sequenziert Abbildung 4 zeigt die isolierte cDNA Sequenz die 1309 Basenpaare umfasst wovon 22 Adeninreste den PolyA Schwanz bilden 903 Basenpaare 138 1040 w
54. transformierendem Pflanzengewebe betrug 7 5 cm Nach 24 st ndiger Inkubation des transformierten Gewebes bei 24 C im Tag Nacht Rhythmus wurden Proteinextrakte hergestellt und quantitative Proteinbestimmungen sowie LUC und GUS Aktivit tsmessungen vorgenommen Kapitel 2 15 2 3 2 15 2 5 F r die Untersuchungen zur Aktivit t des CaMV 35S Promotors unter aeroben und anaeroben Bedingungen wurde das zu transformierende Pflanzenmaterial wurde wie 2 Material und Methoden 36 folgt pr pariert Vier ausgestanzte Tabakblattscheiben mit einem Durchmesser von je 2 cm bzw vier Tomaten Fiederbl ttchen vergleichbarer Gr e wurden um das Zentrum der Petrischale in der sie zur Transformation durch die Partikelkanone auslagen angeordnet Das eingesetzte Blattmaterial stammte von 2 4 Monate alten Tabak bzw 3 4 Monate alten Tomatenpflanzen Bei den cotransformierten Konstrukten handelte es sich um 3 92 ug des Reporterplasmids pBT10 35S GUS und 4 22 ug des Kontrollplasmids pRT101 LUC Die Transformationsbedingungen entsprachen den oben aufgef hrten Parametern Sowohl mit Tabak als auch mit Tomaten Blattmaterial wurden jeweils acht Transformationen durchgef hrt Nach der Transformation wurde das Blattmaterial jedes einzelnen Schusses aufgeteilt Je zwei ber Kreuz liegende Explantate wurden zusammen unter normalen Normoxia und die beiden anderen Blattst cke unter anaeroben Bedingungen 24 Stunden lang im Tag Nacht Rhythmus bei 24 C inkubie
55. uterten Bedingungen in der Pflanzenkammer wurden die Kotyledonen auf selektives Sprossregenerationsmedium 4 6 g l MS Salze 30 g l Saccharose pH 5 7 mit KOH 6 g l Agar autoklavieren 10 ml 100x B5 Vitamine 20 mg l Zeatin 100 mg l Kanamycin 500 mg l Carbenicillin umgelegt und weiterhin wie oben kultiviert Die Explantate wurden w chentlich auf frisches Medium transferiert Zun chst bildeten sich Kalli die vereinzelt wurden Sobald aus Kallusgewebe wachsende Sprosse auftraten die eine L nge von ca 1 cm aufwiesen wurden diese abgeschnitten und auf selektivem Medium zur Wurzelregeneration kultiviert Die Zusammensetzung des Wurzelmediums entspricht der des Sprossmediums jedoch ohne Zusatz von Zeatinribosid Bewurzelte Sprosse wurden in Erde ausgesetzt und im Gew chshaus herangezogen 2 17 Yeast Two Hybrid System Die Methode des Yeast Two Hybrid Systems kann f r die Identifizierung neuer Proteininteraktionen die Best tigung postulierter Interaktionen und die Bestimmung interagierender Dom nen eingesetzt werden Die Methode basiert auf dem modularen Aufbau vieler eukaryotischer Transkriptionsfaktoren Diese setzen sich einerseits aus einer DNA Bindungs und andererseits aus einer Aktivierungsdom ne zusammen die funktionell und strukturell distinkt sind Im MATCHMAKER System von CLONTECH wird dieses Prinzip so umgesetzt dass ein sog Bait K der Gen als Fusion mit der GAL4 DNA Bindungsdom ne DNA BD aus Saccharomyces cerevis
56. 003 Abb 1 Der gro en Zahl an transkriptionell induzierten Genen steht eine vergleichsweise begrenzte Anzahl an anaeroben Proteinen gegen ber was die Bedeutung der posttranskriptionellen Regulation verdeutlicht Germain et al 1997 Klok et al 2002 Russell und Sachs 1992 Sachs et al 1980 Diese Beobachtung ist auf eine inhibierte Translation vieler mRNAs aufgrund von Polysomen Dissoziation bei Anaerobiose zur ckzuf hren Allerdings wurden auch relativ kleine Polysomen entdeckt die spezifisch anaerobe mRNAs translatieren Bailey Serres und Freeling 1990 Fennoy und Bailey Serres 1995 Sachs ef at 1980 und 1996 konnten zun chst 20 anaerobe Proteine ANP identifizieren deren Expression in Mais Keimlingswurzeln auch unter anaeroben Bedingungen fortgesetzt bzw induziert wird Die meisten dieser ANPs sind Enzyme der Glykolyse und Fermentation Eine Ausnahme bildet ein Homolog der Xyloglucan Endotransglycosylase das an der Zellwandaufl sung zur Aerenchymbildung beteiligt sein k nnte In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl weiterer ANPs identifiziert die in andere metabolische Prozesse involviert sind Chang ef a 2000 Die anaerobe Induktion des eingehend untersuchten Alkoholdehydrogenase Gens ADH7 aus Mais und Arabidopsis beruht u a auf Ver nderungen in der Chromatinstruktur Paul und Ferl 1997 und eine damit verbundene Transkriptionsaktivierung Dolferus ef al 1994 Seine verst rkte Translation ist von den 5 und 3
57. 1099 1107 Rook F Gerrits N Kortstel A van Kampen M Borrias M Weisbeek P Smeekens S 1998 Sucrose specific signalling represses translation of the Arabidopsis ATB2 bZIP transcription factor gene Plant J 15 253 263 R gner A Frohnmeyer H N ke C Wellmer F Kircher S Sch fer E Harter K 2001 Isolation and charakterization of four novel parsley proteins that interact with the transcriptional regulators CPRF1 and CPRF2 Mol Genet Genomics 265 964 976 Ruiz Medrano R Xononostle C zares B Lucas W J 1999 Phloem long distance transport of CmNACP mRNA implications for supracellular regulation in plants Development 126 4405 4419 Sachs M M Freeling M Okimoto R 1980 The anaerobic proteins of maize Cell 20 761 767 Sachs M Subbaiah C Saab 1996 Anaerobic gene expression and flooding tolerance in maize J Exp Bot 47 1 15 Sambrook J Fritsch E F Maniatis T 1989 Molecular cloning A laboratory manual New York Cold Spring Harbor Laboratory Press Sanford J C 1988 The biolistic process 7rends in Biotechnology 6 229 302 Sanger F Nicklen S Coulsen A R 1977 DNA sequencing with chain termination inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 74 5463 5467 Sauter M Rzewuski G Marwedel T Lorbiecke R 2002 The novel ethylen regulated gene OsUsp1 from rice encodes a member of a plant protein family related to prokaryotic un
58. 2 Desweiteren wurden in Ubereinstimmung mit den Ergebnissen von Klok et at 2002 ein Tonoplast intrinsisches Transportprotein SSH 143 eine NADH abhangige Glutamatsynthase der Photorespiration SSH 11 ein Xyloglucan Inhibitor der fungiziden Pathogenabwehr SSH 136 ein Seneszenz assoziiertes Protein SSH 87 und eine Glucosyltransferase SSH 224 aus Tomate als Faktoren der pflanzlichen Antwort auf Sauerstoffmangel identifiziert Im Gegensatz dazu treten einige anaerob induzierte Gene deren cDNA Fragmente durch SSH isoliert wurden in der Microarray Analyse der Arabidopsis Wurzeln nicht auf Zu diesen z hlen die Triosephosphat Isomerase die Enolase die Phosphoenolpyruvat Carboxykinase sowie die Aldo Keto Reduktase als Enzyme des Kohlenstoffmetabolismus SSH 59 62 73 und 88 Heat shock Proteine als Komponenten der Proteinsynthese SSH 7 55 101 und 126 ein PHO85 hnliches Protein mit Funktion im Phosphatmetabolismus und als Transkriptionsregulator SSH 36 sowie ein Samen spezifisches Protein SSH 34 Diese Beobachtung k nnte unterschiedliche Ursachen haben Einerseits w re es m glich dass 4 Diskussion 93 die entsprechenden cDNA Fragmente nicht auf dem Microarray Chip vorlagen und somit nicht untersucht wurden Andererseits k nnten voneinander abweichende Versuchsbedingungen die Ursache sein In diesem Fall k nnten Unterschiede in der Genexpression aus gewebespezifischen Antworten auf Anaerobiose Stress resultieren W hr
59. 2 14 3 2 15 2 15 1 2 15 1 1 2 15 1 2 2 15 1 3 2 15 2 2 15 2 1 2 15 2 2 2 15 2 3 2 15 2 4 2 15 2 5 2 15 2 6 2 16 2 17 2 17 1 2 17 2 2 17 3 2 17 4 2 17 5 2 17 6 2 17 7 2 18 Rekombinante Expression anaerob induzierter Proteine aus Tomate 20 De und renaturierende Aufreinigung von rekombinantem ABZ1 und ANA 22 RE E ER Quantitative Proteinbestimmung nach Bradiord nennen 23 Analyse von Proteim DNA Jnterzktonen ne nnnnnnnennnnn nenn 24 Random Binding Site Selection RBSS ASSay nn 24 Elektrophoretische Gelshift Experimente nennen 26 DNA Fragmente Sonden und Kompetitoren ernennen 26 Native Polyacrylamidgelelektrophorese der Protein DNA Bindungsreaktionen 44444444en nennen nnnnnnnnnnnnnnnn nennen 28 Transiente Transformation von Pilanzenmaieral een nen 29 Untersuchung der Kernlokalisation von ABZ1 und ANA in Zwiebelepidermiszellen 0440440000000000nennnnnnnennnennnnnnennnnnnnenn nn 29 DNA Konstr kte aa teen une ESER 29 Transformation von ZwiebelepidermisZellen nen 31 Histochemischer GUS Test Zwiebelepidermis nennen 32 Funktionelle Untersuchung von ABZ1 und ANA im transienten System 32 DNA Konstrukte f r Cotransformations Untersuchungen gt 32 Transformation von Tabak und Tomaten Blattmaterial 34 Proteinextrakt Herstellung f r GUS und LUC Aktivitatsmessungen 36 QuantitaliverGUS TEst EE 36 Quantitat
60. 4 2 1 Als unspezifischer Kompetitor uK1 wurde ein RBSS1 Fragment mit mutierter Core Sequenz eingesetzt ACGT gt ATTA Kapitel 2 14 2 1 Die Kompetitoren wurden in 100000 fach molarem berschu eingesetzt und die 3 Ergebnisse 69 elektrophoretische Auftrennung der Bindungsreaktionen erfolgte in einem 6 5 igen nicht denaturierenden Polyacrylamidgel Kapitel 2 14 3 In Abbildung 12 sind die Autoradiogramme der elektrophoretischen Gelshift Assays dargestellt Exemplarisch fur alle Negativkontroll Reaktionen ohne Protein wird beim Ansatz ohne ABZ1 unter Verwendung des Fragmentes RBSS1 als Sonde lediglich die freie Sonde S detektiert Spur 1 Nach Zugabe von ABZ1 aber ohne Einsatz von Kompetitoren tritt ein retardierter Komplex K auf der auf eine Bindung des rekombinanten ABZ1 an die RBSS1 Sonde zur ckzuf hren ist Spur 2 Wird der Reaktion spezifischer Kompetitor in 100000 fach molarem berschu zugesetzt so bindet ABZ1 bevorzugt an das nicht radioaktiv markierte RBSS1 Fragment und es wird kein radioaktiver Protein DNA Komplex detektiert Spur 3 Bei Zugabe von 100000 fach molarem berschu unspezifischen statt spezifischen Kompetitors wird wieder das radioaktive Signal des retardierten ABZ1 RBSS1 Komplexes beobachtet Spur 4 Daraus folgt dass es zwischen ABZ1 und der halben G Box Sequenz des RBSS1 Fragmentes zu einer spezifischen Bindung kommt die nicht mit einer mutierten Core Sequenz der halben G Box kompetiert werden k
61. 4 like Protein handelt das keine konservierte Oxidoreduktase Dom ne besitzt unterscheidet es sich wahrscheinlich funktionell von den bekannten IDS Proteinen In Tomatenwurzeln mit Eisen Defizit wurde gezeigt dass die Expression der Glycerinaldehyd 3 Phosphat Dehydrogenase erh ht ist Ob dieser Anstieg aus einer verringerten oxidativen Respiration resultiert oder durch Ausschleusen von Kohlenstoff aus der Glykolyse als Folge der gesteigerten Phosphoenolpyruvat Carboxylase Aktivit t zustande kommt ist unklar Herbik et ai 1996 Die Analyse der Genexpression als Antwort auf Eisen Mangel in Arabidopsis f hrte zu einer gesteigerten Expression von Genen der Respiration In Wurzeln wurden allerdings auch Gene der anaeroben Respiration induziert w hrend in Sprossen u a eine Induktion verschiedener Gene der Glucogenese beobachtet wurden Thimm ef ai 2001 Da Eisen u a fur Komponenten des Redoxsystems der oxidativen Phosphorylierung essentiell ist induzieren Anaerobiose und Eisendefizit offensichtlich teilweise dieselben Stoffwechselenzyme als 4 Diskussion 106 Stress Antwort Durch eine Northern Blot Analyse wurde gezeigt dass AIL anaerob spezifisch transkribiert wird Kapitel 3 3 13 Abb 21 Folglich konnte auch in der vorliegenden Arbeit ein molekularer Zusammenhang zwischen Anaerobiose Stress und fehlenden Eisens aufgezeigt werden AIL besitzt im Vergleich zu seinen Arabidopsis Homologen den l ngsten Leucin Zipper Abb 22 Ein
62. 5 aufgrund seiner sp teren Expression bei andauerndem O Mangel reprimierend auf die anaerobe Genexpression wirkt Zusammen mit der Beobachtung dass ABZ1 die Genexpression herunterreguliert k nnte angenommen werden dass kleine bZIP Faktoren ohne Prolin reiche Aktivierungsdom ne in die anaerob herunterregulierte Genexpression involviert sind 4 8 ABZ1 Interaktionspartner Zur weiteren funktionellen Charakterisierung von ABZ1 wurden durch einen Yeast Two Hybrid Screen einer anaeroben Expressionsbank potentielle Interaktionspartner des bZIP Transkriptionsfaktors isoliert und identifiziert Alle mit ABZ1 interagierenden Peptide besitzen einen putativen Leucin Zipper der eine m gliche Protein Protein Bindung mit dem ABZ1 bZIP Transkriptionsfaktor vermitteln k nnte Kapitel 3 3 12 Abb 20 Von 1x105 gescreenten Klonen der Prey Expressionsbank wurden lediglich f r einen potentiellen Interaktionspartner n mlich eine ACC Oxidase zwei unabh ngige Klone isoliert Daher w re es m glich dass die anaerobe Expressionsbank nicht alle Gene repasentiert Das interagierende Peptid das homolog zu einer Untereinheit des Exocytosekomplexes ist und 90 Aminosauren umfasst stellt offensichtlich nur ein kurzes Peptid eines deutlich gr eren Proteins von 637 Aminos uren aus Arabidopsis thaliana dar AT5G50380 1 Die Exo70 Dom ne dieses Proteins aus Arabidopsis beinhaltet 550 Aminosauren Pfam domain PF03081 Folglich handelt es sich vermutlich ehe
63. 73 pSport1 AlL Full size cDNA von AIL in pSport1 3974 pQE 30 ABZ1 1 100 pPREP4 ABZ 11 100 Expressionskonstrukt 3975 pQE 30 ABZ1 47 138 PREPA4 ABZ 147 133 Expressionskonstrukt 3976 YTH16 PCR Fragment c 0 03 3977 YTH42 PCR Fragment c 0 1 3978 pGADT7 Rec3 Exo70 Selektiertes Prey Plasmid 3979 pGADT7 Rec16 AIL Selektiertes Prey Plasmid c 0 77 3980 pGADT7 Rec25 Transducin Selektiertes Prey Plasmid c 1 11 3981 pGADT7 Rec34 ATP Synth Selektiertes Prey Plasmid c 0 87 3982 pGADT7 Rec42 LeACOS5 Selektiertes Prey Plasmid c 1 32 3983 pGADT7 Rec84 LeACO5 Selektiertes Prey Plasmid 7 Anhang 138 7 7 Katalogisierte Glycerinkulturen Glycerin Bezeichnung Bemerkung kultur Nr 1799 pRH608 l2 Agro EHA 101 pUK 4030 1803 pOCA28 35S GUS Agro EHA 101 2081 cDNA Bank pSport1 ElectroMax DH 10B 2082 cDNA Bank pSport1 ElectroMax DH 10B 2083 cDNA Bank pSport1 ElectroMax DH 10B 2158 pQE 30 ABZ1 pREP4 BL21 DE3 RIL Codon Plus pACYC 2189 pCR2 1 SSH172 INVaF 2201 BL21 DE3 RIL Codon Plus E coliExpressionsstamm 2322 pRT 103 ABZ111 138 GUS XL1 blue 2323 pRT103 ABZ1144 GUS XL1 blue 2324 pRT103 ABZ111 24 GUS XL1 blue 2325 pCR2 1 RBSS1 INVaF 2326 pCR2 1 RBSS2 INVaF 2328 pCR2 1 RBSS4 INVaF 2329 pCR2 1 RBSS5 INVaF 2330 pCR2 1 RBSS6 INVaF 2331 pCR2 1 RBSS8
64. 761 pQE 30 ABZ1 Mu1 pREP4 BL21 DE3 RIL Codon Plus pACYC 2787 pSport1 LeACO5 Full size cDNA DH 10B 2788 pGADT7 Rec16 XL1 blue 2789 pGADT7 Rec42 XL1 blue 2790 pGADT7 Rec34 XL1 blue 2791 pSport1 AlL Full size cDNA DH 10B Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof Dr Reinhard Hehl meinem Mentor fur die Bereitstellung des interessanten Themas seine standige Diskussionsbereitschaft und seine konstruktiven Vorschlage die wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben Insbesondere m chte ich ihm f r die M glichkeit der Teilnahme an zwei internationalen Kongressen danken Herrn Prof Dr Ralf Rainer Mendel danke ich f r das Interesse an dieser Arbeit und die Bereitschaft das Koreferat zu bernehmen Au erdem m chte ich ihm f r die M glichkeit danken die Einrichtungen seines Instituts zu nutzen Herrn Dr Robert H nsch danke ich f r die Betreuung im Umgang mit der Partikelkanone sowie seine jederzeit geduldige Diskussionsbereitschaft bei der Auswertung der transienten Transformationsexperimente Allen Mitarbeitern des Instituts f r Genetik m chte ich einen ganz besonderen Dank f r die wirklich beraus angenehme und freundschaftliche Arbeitsatmosph re aussprechen Insbesondere gilt mein Dank meinen Kollegen der Arbeitsgruppe Hehl f r ihre motivierenden Diskussionen wichtigen Anregungen und Hilfsbereitschaft Dr J rn Petersen m chte ich f r die Hilfe bei der Erstellung des phylogeneti
65. 8 7 0 wurde der Transformationsansatz eine Stunde bei 37 C unter Sch tteln inkubiert 200 ul des Transformationsansatzes wurden auf entsprechendem LB Selektionsmedium 10 g Bactotrypton 5 g Hefeextrakt 10 g NaCl 2 4 g MgSO4 7H20 14 g Agar ad 1000 ml deion H20 supplementiert z B mit 100 pg ml Carbenicillin fur pSport1 ausplattiert 2 Material und Methoden 20 2 13 Rekombinante Proteinexpression und Aufreinigung 2 13 1 Rekombinante Expression anaerob induzierter Proteine aus Tomate Mit Hilfe des Expressionsvektors pQE 30 von Qiagen der Uber einen N terminalen 6xHis Tag verf gt wurden folgende Proteine aus Tomate in E coli nach dem Herstellerprotokoll berexprimiert ABZ1 ANA sowie zwei ABZ1 Deletionsmutanten ABZ 14 100 ABZ147 138 Zun chst wurden die entsprechenden codierenden Sequenzen durch PCR amplifiziert Als Template wurden die full size CDNA Klone von ABZ1 bzw ANA die in pSport1 kloniert vorliegen Kapitel 2 12 eingesetzt In Spalte 1 der Tabelle 1 sind die Bezeichnungen der rekombinanten Proteine aufgef hrt Spalte 2 gibt die Bezeichnung des vollst ndigen cDNA Klons sowie dessen Labor interne Nummerierung an Die f r die PCR verwendeten Primer inklusive ihrer Labor internen DNA Nr sowie ihre Sequenzen sind in den Spalten 3 und 4 aufgef hrt Dabei sind genspezifische Sequenzbereiche durch fette Schreibweise und eingebaute Restriktionsschnittstellen durch Unterstreichung kenntlich gemacht Tab 1 Bezeichn
66. 9 Nucleotid und daraus abgeleitete Aminos uresequenz von ABZ1 einschlie lich des konservierten Sequenzmotivs im 5 uUORF Fettdruck des SSH Fragmentes Unterstreichung der basischen Dom ne Unterlegung mit zweigeteilter NLS Kursivdruck und des heptameren Leucin Zippers rot Fettdruck 3 Ergebnisse 63 3 3 2 ABZ1 geh rt einer Familie kleiner bZIP Transkriptionsfaktoren an Anhand einer phylogenetischen Analyse sollte dargestellt werden wie nah die ABZ1 Aminos uresequenz mit Sequenzen bekannter bZIP Transkriptionsfaktoren deren Funktion bereits untersucht wurde verwandt ist Ausgehend von einem multiplen Alignment ClustalX Kapitel 2 18 der basischen und der Leucin Zipper Dom nen 16 unterschiedlicher bZIP Faktoren wurde ein phylogenetischer Stammbaum nach der Neighbor Joining Methode erstellt Der phylogenetische Baum ist in Abbildung 10 dargestellt Den Bezeichnungen der einzelnen Transkriptionsfaktoren sind die Abk rzungen der jeweiligen Speziesbezeichnungen nachgestellt Zm steht f r Zea mays Os f r Oryza sativa Nt f r Nicotiana tabacum Le f r Lycopersicon esculentum Am f r Antirrhinum majus und Pc f r Petroselinum crispus Die horizontalen Astl ngen sind proportional zur Austauschfrequenz der Aminos uren wobei der angegebene Ma stab von 0 1 zehn Austauschen pro hundert Aminos uren entspricht und ein Ma f r die verwandtschaftliche N he zwischen den Proteinen einer Verzweigung ist Die phylogenetische An
67. ABZ1 ma geblich verantwortlich ist zwischen Aminos ure 25 und 44 liegt Allerdings wird eine vollst ndige Kernlokalisation erst durch das Konstrukt ABZ11 138 GUS erzielt Daher wurde das Konstrukt ABZ145 138 3 Ergebnisse 66 GUS das den ABZ1 C Terminus mit den Aminos uren 45 bis 138 enth lt auf eine evil weitere essentielle Peptidsequenz zur Kernlokalisierung analysiert Nach Transformation dieses Konstruktes konnte jedoch lediglich eine gleichm ige Verteilung des ABZ145 138 GUS Fusionsproteins im Cytoplasma detektiert werden Somit deutet diese Beobachtung auf kein weiteres eigenst ndiges Signalpeptid im C Terminus hin GUS ABZ1 24 GUS ABZ1 4 GUS ABZ1 413 GUS ABZ14513 GUS Za Bes GUS ee d T Abb 11 Untersuchungen zur Kernlokalisierung von ABZ1 GUS und DAPI Anf rbung von DAPI Zwiebelepidermiszellen nach transienter Expression unterschiedlicher ABZ1 GUS Fusionsproteine Die tiefergestellten Zahlen innerhalb der Konstruktbezeichnungen geben die klonierten Bereiche des ABZ1 in Aminos uren wieder Die Negativkontrolle exprimiert Glucuronidase alleine GUS Die Transformation erfolgte durch Goldpartikelbeschu mit der Partikelkanone 3 3 4 ABZ1 bindet sequenzspezifisch an die G Box Core Sequenz Aus der Analyse der ABZ1 codierenden DNA und Aminos uresequenz ging hervor dass ABZ1 innerhalb seiner hoch konservierten bZIP Dom ne eine basische Region besitzt Kapitel 3 3 1 Solche basisch
68. AGGTATAAAAACAAATTGGATTATGCACGAGTACCGCCTCGCCAACGTG 121 K A P R G I K T N W I M H E Y R LAN V 598 GACCGCTCTGCTGGCAAGAACAATAACTTGAGGCTTGATGATTGGGTATTGTGTCGAATA 141 D R S A G KNNN L R L D D W V L C R I 618 TACAACAAGAAAGGCACACTTGAGAAGCATTACAATGTGGACAACAAGGAAACTACAAGC 161 Y N K K G T L E K H Y N V DON K E TTS 678 TTTGGAGAATT TGAT GAAGAAATAAAACCAAAAATAT TGCCCACACAATTAGCACCGATG 181 F G EEE DEE I K P K L BG PIP 0 E A POM 738 CCACCACGGCCTCGATCGACACCAGCAAACGACTACTTTTATTTCGAGTCATCAGAGTCG 201 P P R PRET P A N DE EF Y E E SS ES 798 ATGACTAGAATGCACACGACAAACTCGAGCTCTGGCTCAGAGCATGTCTTGTCGCCATGT 221 M T R M HETT N S S S G S HE H VL S amp S PC 858 GACAAGGAGGT TCAGAGCGCGCCCAAATGGGACGAAGACCACAGAAACACCCTTGATTTT 241 D K E V O S A P SM DE D H R N T L DF 918 CAGCTAAACTATTTGGATGGTTTACTAAATGAACCATTTGAAACCCAAATGCAGCAGCAA 261 O L N Y L D GL AN E P FE T O0 M QQ Q 978 ATTTGCAACTTTGACCAGTTCAACAATTTCCAAGACATGTTCCTATACATGCAAAAACCT 281 I C N F D Q F N N F Q D M F L Y M Q KP 1038 TACTAAAATTGTATAAATTCATTGGATCTAAATTGAGTGTGATCCATGACATTTTCTTTG 301 N 1 0 9 8 TTICTTTGGTGGTGTAGGTCAACTTTTTATTAAGTAGTTTAGAGAAGTACAAAATGCTAGT 1158 CAAATTTGGTGGGCTACAGCACAAATGAGCCTTGATAAGCATAGCCAAAGAGTCGTATAG 1218 AAGGGCTTATTATTATTGTAAGGTATGTAAAAACAAATGAAAATTTGTTAATATCAAGTT 1278 ATCATTCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
69. C Aktivit t einer Messreihe wurden relative LUC Einheiten RLU erhalten Diese Faktoren wurden sp ter als Ma f r die Transformationseffizienz zur Korrektur der berechneten GUS Aktivit t herangezogen Von jedem GUS Fluoreszenzwert der unterschiedlichen Reaktionszeiten GUS20 GUS40 und GUSso wurde der Nullwert des entsprechenden Proteinextraktes GUSo subtrahiert die Fluoreszenzeinheiten pro Minute bestimmt und anschlie end auf die enthaltene Proteinmenge bezogen FU FU min 1 mg Protein Von diesen FU e Werten wurde der Wert der unbeschossenen Kontrolle abgezogen und es resultierte FUkor Da 300 FU einer 4 MU Konzentration von 10 nM entsprechen B low pers Mitteilung mussten die korrigierten relativen Fluoreszenzwerte mit dem Faktor 1 30 multipliziert werden um den enzymatischen Substratumsatz in pmol 4 MU min mg Protein anzugeben GUS Durch Multiplikation des Substratumsatzes mit dem jeweiligen relativen LUC Faktor RLU erhielt man standardisierte GUS Aktivit tswerte GUS die untereinander vergleichbar sind Es wurden Durchschnittswerte und Standardabweichungen der einzelnen Cotransformations Experimente ermittelt 2 Material und Methoden 38 2 16 Stabile Transformation von Tomate Die Transformation von Lycopersicon esculentum erfolgte durch Cokultivierung von Kotyledonen mit rekombinanten Agrobacterium tumefaciens Stammen EHA 101 Pfitzner 1998 Hood et al 1993 Folgende Promotor Reportergen Konstrukte wur
70. CG 8 G C I Cc T T JA C 6 T 6 c6 6 CT 2 1rc G T I C T T JA C 6 TIG G AI IC IA Arc AIJ AJA T IG JA Cc 6 TI G 6 c A A 1 1 G G I 6 C c A cC 6G T 6 C T C T 11 TIGJ A G G A C 6 T 6 GC TI A T 6 TIGCG T A c A cCc 6 T 6 6 T C6 T 4 1 G T IC 6 TJA C 6 TI G G C A G 5 1 A IT IG c c A C 6 TIG G I AI A G 6 1 G G J A T 6G J A C 6 T IG T IAI IG amp G 7 4 TIG G T J G JA C 6 T I G6 TI IG C A 9 1 TIGcG c A TJA Cc 6 T 6 T C cC 6G 5 TIG C A J C j A cCc 6 T 6 T IcC cC CC 9 TITIATJA ITJA I CcC 6 T I6 T Ic c6c cC 8 1 G G J A T G6G J A C 6 T J A G IG C 6G 10 1 TITI IG TJ JG JA T G6G T IG6G 6 6G6 T A B 6 5 4 3 2 1 O 0 1 2 3 4 5 6 A 2 1 4 4 148 1 3 6 5 C 1 5 4 17 5 5 3 G 7 10 5 2 9 18 17 13 7 5 6 T 9 6 4 10 5 1 18 5 3 2 4 Consensus K K N T K A C G T G G N N N Nach Isolierung und Identifizierung potentieller Zielsequenzen f r ABZ1 wurden Gelshift Experimente durchgef hrt um die Bindungsspezifit t von ABZ1 an einige dieser selektierten DNA Sequenzen zu verifizieren Dazu wurden die potentiellen Zielsequenzen RBSS 1 1 1 2 1 5 8 9 und 6 1 sowie 10 1 in Gelshift Experimenten als Sonden eingesetzt Tab 6A Fettdruck Kapitel 2 14 2 Als spezifischer Kompetitor sK1 diente ein Fragment dessen Sequenz der von RBSS1 entsprach Kapitel 2 1
71. CGTTCCAA CCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATC TCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCA 3 oe S ABZ1 SKARI ll KE E uK1 Abb 13 A 100 bp Fragment des CaMV 35S Promotors das als Sonde f r das Gelshift Experiment zur Analyse der Bindungsspezifitat von ABZ1 eingesetzt wurde Die ACGT Core Sequenzen als putative Bindungsstellen sind unterstrichen wobei die Activation Sequence 1 doppelt unterstrichen ist B Gelshift Experiment zum Nachweis der spezifischen ABZ1 Bindung an den CaMV 35S Promotor Fur die Bindungsreaktion wurden 0 3 ng des radioaktiv markierten 118 bp Promotorfragmentes 0 5 ug 6x His ABZ1 und 4000 fach molarer berschu an sK1 spezifischer Kompetitor RBSS1 oder uK1 unspezifischer Kompetitor RBSS1 mit mutierter Core Sequenz eingesetzt bzw nicht zugef gt CL K1 und K2 gro er und kleiner Protein DNA Komplex S Freie Sonde 3 3 6 Die DNA Bindungsdom ne von ABZ1 ist im N Terminus lokalisiert Nachdem die spezifische DNA Bindungsaktivit t von ABZ1 gezeigt worden war sollte die daf r verantwortliche Dom ne des bZIP Transkriptionsfaktors lokalisiert werden Aufgrund von Literaturdaten war bekannt dass die basische Region innerhalb der bZIP Dom ne DNA Bindung vermittelt Deshalb wurde ein Gelshift Experiment durchgef hrt um die Bindungsaktivit t des rekombinanten ABZ1 Wildtyp Proteins mit der einer ABZ1 Deletionsmutante ABZ147 133 zu vergleichen Das deletiert
72. CR2 1 3xACGT 3522 Oligo RBSS1 1 Oligo f r spezifischen EMSA Kompetitor 3523 Oligo RBSS1 2 Oligo f r spezifischen EMSA Kompetitor 7 Anhang 137 3524 Oligo RBSS1 3 Oligo fur unspezifischen EMSA Kompetitor uK1 3525 Oligo RBSS1 4 Oligo fur unspezifischen EMSA Kompetitor uK1 3578 pVKH 35S pA1 c 1 75 3666 pC1L 1097 Transformationskontrolle f r Cotransformation c 2 25 3767 M13 Forward Sequenzierprimer 3776 pVKH C1 pA1 c 2 38 3777 pVKH C1 ABZ1 pA1 Effektorkonstrukt f r Cotransfektion c 2 45 3778 pVKH C1 Gal4AD ABZ1 pA1 Effektorkonstrukt f r Cotransfektion c 3 48 3781 pVKH 35S ANA pA1 Effektorkonstrukt f r Cotransfektion c 1 76 3825 uidA Sequenzierprimer aus uh in D Richtung Cy5 24pmol ul 3889 pQE 30 ANA pREP4 ANA Expressionskonstrukt Bam HU Sail 3931 YTH42 5 5 Primer z Amplifikation d LeACO5 Peptids 3932 YTH42 3 3 Primer z Amplifikation d LeACO5 Peptids 3933 YTH16 5 5 Primer z Amplifikation d AIL Peptids 3934 YTH16 3 3 Primer z Amplifikation d AIL Peptids 3935 ABZ1 Mu2 5 5 Primer z Amplifikation v ABZ1 Mu2 3936 ABZ1 Mu1 3 3 Primer z Amplifikation v ABZ1 Mu1 3959 IDS intern2 Sequenzierprimer des AIL cDNA Klons 3971 pCR2 1 ABZ1 1 100 ABZ 11 100 Expressionskonstrukt 3972 pCR2 1 ABZ1 47 138 ABZ 147 133 Expressionskonstrukt 39
73. EMMDIRRDLVTIHGEMVLLKNYSSLNFAGLVKILKKYDKRTGGL AIL 96 MGKSN EEVNRLGRD I VDLHGEMVLLENY SALNYTGVVKILKKYDKLSGEL Kes zoak pK KK KKK kkk korko kk kk AT5G20150 MRLPFIOKVLOOPFYTTDLLFKLVKESEAMLDOIFPAN AT2G26660 IRLPFIOKVLOEPFFTTDLLNTFVKECEAMLDRLFPSNKSRNLDEEGEPTTSGMVKTGTD AT2G45130 LRSPFIOKVLHOPFFKTDLVSRLVREWETTMDAVDPVK V AT5G15330 LRLPFTOLVLHOPFFTTEPLTRLVRECEANLELLFPSEAEVVESSSAVOAHS SSHO AIL 146 LRLPEHPKVLAEPFFETEVLNKLVKECDTLLSHLLYOTEPLKVAGGGG GGG 2 kk kk tke Ks H kk D D AT5G20150 ETESEIIQOAELSEHKFMESLHMKSTIAALRVLKEIRSGSSTVSVFSLPPLOLNGLDET AT2G26660 DSELLRVPKELSEIEYMESLYMKSTVSALKVLKEIRSGSSTVSVFSLPPLPASGLEDDSW AT2G45130 AEAEGYERCAAVTSAAAGEGIFRNTVAALLTMKEMRRGSSTYSAFSLPPLNISDSDNVLR AT5G15330 HNSPRISAETSSTLGNENLDIYKSTLAAMRAIRGLOKASSTYNPLSFSSLLONEDDETVT AIL 197 GERPVKVPOELAEIKNMENMYLRLTYSALRVLOEMRSGSSTVSIFSLPPMKTNALDNV A a RE gy EE 28 AT5G20150 WKKIPLLEOEAK AT2G26660 KKKVGVLEOVAK AT2G45130 SLHLSSPLPIP gt AT5G15330 AENSPNSGNKDDSEKEDTGPSH AIL 255 WKNAPVVIOEAK Abb 22 Alignment der Aminos uresequenz von AIL aus Tomate und vier IDS4 like Homologen aus Arabidopsis Identische und hnliche oder Aminos uren sind gekennzeichnet Das isolierte Hefe Two Hybrid Peptid Unterstreichung die SPX Dom ne Unterlegung der Leucin Zipper rot Fettdruck und das zweigeteilte Kernlokalisierungssignal Kursivdruck sind hervorgehoben 3
74. Ergebnisse 88 3 3 15 LeACOS5 ein neues Mitglied der ACC Oxidase Genfamilie aus Tomate Im Hefe Two Hybrid Screen wurden zwei Klone als Interaktionspartner des ABZ1 isoliert die eine hohe Homologie zu einer ACC Oxidase aus Kartoffel aufweisen Kapitel 3 3 12 Da ein Vergleich ihrer Aminos uresequenzen mit denen der vier aus Tomate bekannten ACC Oxidasen auf ein neues Mitglied der ACC Oxidase Familie in Tomate hinweisen wurde ein vollst ndiger CDNA Klon dieser anaerob induzierten ACC Oxidase LeACO5 isoliert Ca 200000 Kolonien einer anaeroben cDNA Bank 5x105 cfu ml aus Tomate wurden mit dem im Hefe Two Hybrid selektierten cDNA Fragment der LeACO5 als Sonde gescreent Kapitel 2 17 3 Acht der 105 positiven Klone wurden in einem zweiten Screen vereinzelt und verifiziert Nach Spaltung der isolierten Plasmide mit Moi Sal wurde der Klon der das gr te cCDNA Insert trug sequenziert Abbildung 23 unterste Zeile zeigt die von der cDNA Sequenz abgeleitete Aminos uresequenz von LeACOS5 Die vollst ndige cDNA Sequenz umfasst inkusive des Poly A Schwanzes mit 119 Adenosinresten 1109 Basenpaare Daten nicht gezeigt Die 5 UTR besteht aus 25 Basenpaaren w hrend 181 Basenpaare die 3 UTR bilden Die Basenpaare 26 bis einschlie lich 928 codieren die LeACO5 die sich aus 301 Aminos uren zusammensetzt Ihr berechnetes Molekulargewicht betr gt 34 4 kDa und ihr pKi Wert 6 49 Das rekonstruierte Peptid das sich aus den Sequenzen der bei
75. FY DF s 477 TATTTTTTTTCTAAAAAAAGAAAAAATTGTTGAAGAATAGACTTTTTTATTTTATTTGTG 537 TTGGCACTCTTGAAATCATAGATTTGGGGTACTGTTGATTTATATTGGAGAGAAAAAAAA 597 ATGTCACCTTTAAGGCAGAGTGCTAGTTCATCTGCATCAGATGATGATCAAAGGTATGCA 1M ab LB o SA SS SA SD DD op A 657 GGAATGGATGAGAAGAAGAGGAAAAGGATGATT TCCAACAGGGAATCTGCGAGGCGATCG 21 G MD E MMT 717 AGGATGAAGAAGCAGAAGCTTCTGCAAGATTTGACAGGGGAAGTGAGCAGATTACAGGGT 1 Bs L 5 co DL TG EV SR LO G 777 GCAAATAAGAATATTGTGTCTAAGATTGATGAGACAACAGAAAGATATGCAATTTGTGCG 61 A N KN IV S K ID E Dr ER A IC A 837 GCACAGAACAATGTGTTGAGGGCACAAGCAATGGAATTGACTGATAGGCTCAGGTATTTA 81 A Q N NV LRA QAM EL TOD RLR Y L 897 AATGATGTTATTGACAGTACTGGTTTGGCTGCTGATGTTGCTGATCCTTTGTTGAAGCCA 101 N DV I D S T G L AA D v AD PLL K P 957 TTGCAGAATCCTTGTGCAATGCAGCCTATTGCTTCATCAGGATTGTTTAAATTTTAATCG 121 L Q N P C AMQ P IA GL FE F 1017 TTGTAATGGCTTGTTTGCATAGCGTTGCTTCCATTAGTCTATATTCTAGTAGTTTCCTTG 1077 GATGGTAATGTCATGTTAGTTATGCCTTITGTTGGTTATCTTTTAGTGTCTGCTTACTCTT 1137 TTTTAACCATGTAAATACCAAGAATTAGCTTGGAGTTGTTGAATCGGATGTTTGTATCTT 1197 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Abb
76. GapC4 minimal promoter in tobacco Biochimica et Biophysica Acta 1521 120 125 Kaiser A Sell S Hehl R 2002 Heterologous expression of a bacterial homospermidine synthase gene in transgenic tobacco effects on the polyamine pathway Arch Pharm Pharm Med Chem 4 1 9
77. H 35S ABZ1 pA1 und pVKH 35S GAL4AD ABZ1 pA1 untersucht bzw die entsprechenden Konstrukte die statt des CaMV 35S Promotors den C1 Promotor enthalten Als Reporterplasmid wurde pBT10 35S GUS verwendet Die Reportergenaktivitat des pC1L 1097 Kontrollplasmids erlaubte R ckschl sse auf die Transformationseffizienz Zum Beladen von 3 mg Goldpartikeln wurden die drei Plasmidtypen die cotransformiert werden sollten in quimolaren Mengenverhaltnissen in einem Gesamtvolumen von 7 ul eingesetzt Tab 3b Die Ans tze in denen ABZ1 durch den 35S Promotor reguliert wird wurden dreimal mit je 4 Transformationsereignissen durchgef hrt Die Experimente in denen C1 ABZ1 als Effektor eingesetzt wurde wurden zweimal analysiert wobei jede Versuchsreihe 4 Transformationsans tze umfasste Tab 3b Bezeichnungen und Mengenangaben der Konstrukte die zur transienten Analyse der CaMV 35S Promotor Regulation durch ABZ1 eingesetzt wurden Effektor pVKH 35S pA1 6 66 ug pVKH C1 pA1 8 64 ug pVKH 35S ABZ1 pA1 6 91 ug pVKH C1 ABZ1 pA1 8 95 ug pVKH 35S GAL4AD ABZ1 7 11 ug pVKH C1 GAL4AD ABZI1 9 21 ug pA1 pA1 Reporter pBT10 35S GUS 2 83 ug pBT10 35S GUS 3 51 ug Kontrolle pC1L 1097 3 73 ug pC1L 1097 4 63 ug 3 mg beladene Goldpartikel wurden auf 4 Transformationsereignisse aufgeteilt Die Transformation erfolgte mit 1100 psi in einem Vakuum von 25 mm Quecksilbersaule Der Abstand zwischen Makrocarrier und zu
78. H 8 0 50 mM Tris HCl pH 8 0 50 v v Glycerin 12 5 mg 10 ml Bromphenolblau 12 5 mg 10 ml Xylencyanol wurde die Bindereaktion gestoppt und auf ein natives Polyacrylamidgel aufgetragen Entsprechend der zu erwartenden Protein DNA Komplexe wurden 5 9 ige native Polyacrylamidgele 1 ml 10x Tris Glycin Puffer 1 7 3 ml Acrylamid Rotiphorese 30 Gel 37 5 1 Roth 10 ul TEMED 18 ul 30 iges APS ad 10 ml ddH2O von 0 5 0 75 mm Dicke verwendet Die Elektrophorese erfolgte nach einem ca 60 min tigen Vorlauf bei 5 6 V cm und 4 C drei bis vier Stunden lang in einer PAGE Kammer der Fa Serva Blue Vertical 101 bzw acht Stunden lang in einer PHASE Kammer 18 x 20 cm bis die Bromphenolblaubande ca 1 cm vom unteren Gelrand entfernt war Als Elektrophoresepuffer wurde 1x Tris Glycin Puffer eingesetzt Nach Trocknen des Gels auf einer Vakuum Warmeplatte der Fa Biotec Fischer wurde es autoradiografiert 2 15 Transiente Transformation von Pflanzenmaterial 2 15 1 Untersuchung der Kernlokalisation von ABZ1 und ANA in Zwiebelepidermiszellen 2 15 1 1 DNA Konstrukte Die auf Kernlokalisation zu untersuchenden Proteinbereiche von ABZ1 und ANA wurden mittels PCR amplifiziert Als Template wurde je 1 ng des vollstandigen cDNA Klons von ABZ1 bzw von ANA eingesetzt Die verwendeten Primer Labor interne DNA Nummern und Sequenzen sind in Tabelle 2 Spalte 2 und 3 aufgefuhrt wobei die cDNA spezifischen Sequenzen durch Fettdruck gekennzeichnet sind Sie
79. H16 3 3934 5 TCCATACATTGTCGAGGGCGT 3 pGADT7 Rec42 3982 YTH42 5 3931 5 GGACAATGTGAAGCAGTTCGT 3 rs In om YTH42 3 3932 5 GGTGGAATGTTCACCCAATGC 3 2 17 4 Herstellung kompetenter Hefezellen Kompetente Saccharomyces cerevisiae Zellen wurden entsprechend dem Yeast Protocols Handbook der Firma Clontech PT3024 1 hergestellt Eine Einzelkolonie wurde in 1 ml YPDA Medium 20 g l Pepton 10 g l Hefeextrakt 2 g l Adeninhemisulfat pH 6 5 2 v v Glucose bzw SD Medium 6 7 g l Yeast nitrogen base without amino acids 100 ml l entsprechende 10x Dropout DO L sung pH 5 8 2 v v Glucose sorgfaltig resuspendiert Vortex in 50 ml des entsprechenden Mediums berf hrt und 16 18 Stunden bei 30 C unter Sch tteln inkubiert Durch berimpfen von 20 30 ml der ber Nacht Kultur in 300 ml frisches Medium wurde die optische Dichte X 600 nm dieser Startkultur auf 0 2 0 3 eingestellt Nach weiteren 4 Stunden Inkubation bei 30 C sollte die Kultur eine ODeoo von 0 4 0 6 erreicht haben Durch 5 min tige Zentrifugation bei 1000xg und Raumtemperatur wurden die Zellen geerntet Das Pellet wurde durch vorsichtiges Resuspendieren in 25 50 ml ddH2O0 gewaschen und erneut zentrifugiert Schlie lich wurden die Hefezellen in 1 5 ml frisch angesetztem 1x TE 1x LiAc 10x TE 100 mM Tris HCI 10 mM EDTA pH 7 5 10x LiAc 1 M Lithiumacetat pH 7 5 aufgenommen Die Transformation der frischen kompetenten Hefezellen s
80. IDS4 like 0 82 90 0 33 8 91 7 09 2 12 61 18 1 0 34 9 13 134 7 Anhang 0 33 9 02 oe 120 of8 518 0 17 5 07 0 18 5 21 ZIP Transducin 0 88 90 0 30 7 59 5 84 1 89 50 16 2 0 30 7 62 0 30 7 47 056 120 o14 o 42 0 14 3 95 0 14 4 19 7 Anhang 135 7 6 Katalogisierte DNA Proben DNA Bezeichnung Bemerkung Nr 2738 pSport1 MT74 Full size cDNA von ABZ1 in pSport1 2818 pRT103 GUS CaMV 35S uidA c 1 1 2821 pRT101 LUC Transformationskontrolle fur Cotransformation c 2 11 2827 pQE 30 E coliExpressionsvektor mit 6xHis Tag 2844 pQE 30 ABZ1 pREP4 ABZ1 Expressionskonstrukt Bam HI Sma 2882 pCR2 1 SSH74 Rsa Fragment in pCR2 1 2888 pCR2 1 SSH172 Rsa Fragment in pCR2 1 2927 pBluescript SK Klonierungsvektor c 3 2940 pRT103 ABZ11 13s GUS NLS Konstrukt c 1 2 2941 pRT103 ABZ11 44 GUS NLS Konstrukt c 1 4 2942 pRT103 ABZ11 24 GUS NLS Konstrukt c 1 3 3051 SSH74 Rsa Fragment c 10 ng ul 3077 pRT103 ABZ145 13 GUS NLS Konstrukt c 1 22 3091 pSport1 MT172 Full size cDNA von ANA in pSport1 3093 SSH172 Rsa Fragment c 5 10 ng ul 3095 RBSS1 RBSS Fragment in pCR2 1 sK1 3096 RBSS2 RBSS Fragment in pCR2 1 3097 RBSS4 RBSS Fragment in pCR2 1 3098 RBSS5 RBSS Fragment in pCR2 1 3099 RBSS6 RBSS Fragment in pCR2 1 3100 RBSS8 RBSS Fragment in pCR2
81. Konstrukt c 2 79 3464 358 5 Primer z Amplifikation d 100 bp CaMV 35S 3465 35S 3 Promotorfragmentes aus pRT103 GUS 3xACGT 3466 5 Gal4 Primer z Amplifikation d GAL4 Aktivierungsdom ne 3467 3 Gal4 aus pGADT7 3468 74 5 Primer 5 Primer z Amplifikation v ABZ1 Bam HI 3469 74 3 Primer 3 Primer z Amplifikation v ABZ1 Smal 3470 5 ZIP Ndel 5 Primer z Amplifikation v ABZ147 13s als Bait Mae I 3476 74 5 Xhol 5 Primer z Amplifikation v ABZ1 NLS Konstrukten 3477 74 3 Ncol 3 Primer z Amplifikation v ABZ1 NLS Konstrukten 3478 74 3 NLS Ncol 3 Primer z Amplifikation d ABZ11 44 NLS Konstrukts 3479 74 3 oNLS Ncol 3 Primer z Amplifikation d ABZ11 24 NLS Konstrukts 3480 74 5 oNLS Xhol 5 Primer z Amplifikation d ABZ11 24 NLS Konstrukts 3490 ANA 3 Pagl 1 3 Primer z Amplifikation d ANA1 7e NLS Konstrukts 3491 ANA 3 Pagl 2 3 Primer z Amplifikation d ANA1 136 NLS Konstrukts 3492 ANA 3 Padgl 3 3 Primer z Amplifikation d ANA1 301 NLS Konstrukts 3493 MT172 5 5 Primer z Amplifikation v ANA Bam HI 3494 MT172 3 3 Primer z Amplifikation v ANA Sa l 3495 ANA 5 Sai 5 Primer z Amplifikation v ANA NLS Konstrukten 3496 ANA 5 Nael 5 Primer z Amplifikation v ANA za als Bait Adel 3497 ANA 3 Sad 3 Primer z Amplifikation v ANA1 166 als Bait Sa l 3498 35S 3 Sequenzierprimer aus CaMV 35S Promotor in 3 Richtung 3519 CaMV 35S Ca 100bp Fragment in p
82. Molekulare Untersuchung anaerob induzierter Transkriptionsfaktoren aus Tomate Lycopersicon esculentum Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultat der Technischen Universitat Carolo Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften Dr rer nat genehmigte Dissertation von Simone Sell aus Kassel 1 Referent 2 Referent eingereicht am m ndliche Pr fung Disputation am Prof Dr Reinhard Hehl Prof Dr Ralf Rainer Mendel 11 M rz 2004 19 Mai 2004 2004 Vorver ffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultat vertreten durch den Mentor in folgenden Beitragen vorab ve ffentlicht Publikationen Sell S amp Hehl R ABZ1 an anaerobically induced repressor interacts with a SPX domain protein possibly involved in anaerobic signal transduction Eingereicht Tagungsbeitr ge Sell S Geffers R Bulow L Cerff R During K amp Hehl R Expression of the maize GapC4 promoter in solanaceous host plants Poster 7 Conference of the International Society for Plant Anaerobiosis ISPA Nijmegen The Netherlands 2001 Sell S amp Hehl R Anaerobic transcription factors of tomato Poster 7t International Congress of Plant Molecular Biology Barcelona Spain 2003 Abk rzungsverzeichnis AACO ABA ABZ ACC ACE AD ADH ADP AIL ALF ANA
83. NTERFEECHERUEHPRFEREGEREEN 12 2 Material und Methoden eeccecceeseeeceeeeeeeeeeeeeeeneneeseeeeesseeeseeeeeeesseenees 13 2 1 Chemikalien aaa 13 2 2 Filtermaterialien und Membranen A 13 2 3 E ee 13 2 4 Autoradio und Fotografiematerialien ccccccecceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeennaeeeeeeenee 13 2 5 Enzymsysteme und Reagenzsatze its 13 2 6 Verwendete Bakterien und Heiest mme cee eeeeeeeeeeeteeeeeeeeenteeeeeeeeeeeee 14 2 7 Verwendete Pflanzenlinien _ u 4 4444444 4 4404 HHRR RR RHHHR Hansen nnnnnnnnnnnnrnnn nen 15 2 8 Verwendete Plasmide u a 404mm en ek 15 2 9 Molekularbiologische Techniken 2222 444444444444 44444 RHR Rn Rn nn nHananennr 16 2 10 Arbeiten mit Ribonucleins ure 2 2 4 s44s00044444080400nRnner HH nannnnnnnnn nenn 16 2 10 1 Extraktion von Gesamt RNA aus Pilanzenmatera ee 16 2 10 2 POolyA MRNA ISoller ng nastaset Herne en 17 2 10 3 Konzentrationsbestimmung von RNA ann 17 2 10 4 Northern Blot Analyse umunnnessnnsnnnnnnennnnnnnnnnnsnn nnnnnnnnnnnnnnannnnnnannnnnnnnnnnnnenn nen 17 2 11 Suppression Subtractive Hybridization GH 18 2 12 CDNA Bank Synthese 2222 cccceeeeeseeceeeeeeecceeneeeensseceeneceeeeeeeseneeeneeeemeeenenneees 19 2 12 1 Elektrotransformation der CDNA Bank in Escherichia coh 19 2 13 Rekombinante Proteinexpression und Aufreinigung nen 20 2 13 1 2 13 2 2 13 3 2 13 4 2 14 2 14 1 2 14 2 2 14 2 1
84. OLEVITNGKYKSVLHRVIA LeACO2 AGGIILLFQDDKVSGLOLLKDGRWIDVPPMRHS IVVNLGDOLEVITNGKYKSVMHRVIA LeACO3 AGGIILLFQDDKVSGLOLLKDEQWIDVPPMRHS IVVNLGDOLEVITNGKYKSVMHRVIA LeACO4 AGGIILLFODDKVSGLOLLKDGNWIDVPPMKHS IVINLGDOLEVITNGRYKSIEHRVIA LeACO5 178 AGGIILLLODEOVPGLEFFKDGHWVNIPPSKNNRLFVNIGDOIEILTNGMYKSIRHRVMA KKAKKKKK SKK SK KK KK ee ee SC 2 1K KARA KL RK kk KKK SK LeACol OTDGTRMSLASFYNPGSDAVIYPAKTLVEKEAEES TOVYP KFVFDDYMKLYAGLKFOA LeACO2 OKDGTRMSLASFYNPGNDALIYPAPALVDKEAEEHNKOVYP KFMFDDYMKLYANLKFOA LeACO3 OTDGTRMSLASFYNPGNDAVIYPAPSLIE ES KOVYP KFVFDDYMKLYAGLKFOP LeACO4 OODGTRMSIASFYNPGSDAVIFPAPELIEKT EEDIKLKYP KFVFEDYMKLYAGLKFOA LeACO5 238 EKDGNRLSIATFYNPAGEAIISPA S KLLYPCHLRFODYLNLYSKTKFAE kk kek eke KKKK ake k kk kk kekke e kk e kk 3 Ergebnisse 90 LeACol LeACO2 LeACO3 LeACo4 LeACO5 287 KEPRFEAMKAMES DPIASA KEPRFEAMKAMES DPIAIA KEPRFEAMKAMEANVELVDOIASA KEPRFEAMKAVETTVN LGPIETV KGPRFESAKRLAN GH 7 7 A KKKK D Abb 23 Aminos uresequenz Alignment der f nf ACC Oxidasen aus Tomate Identische und ahnliche oder Aminosauren sind gekennzeichnet Der Sequenzbereich der im Hefe Two Hybrid Screen mit ABZ1 interagiert Unterstreichung der putative Leucin Zipper Fettdruck L und I rot und Aminos uren die in allen Mitgliedern der Fe II Ascorbat Familie der Dioxygenasen konserviert sind Unterlegung sind markiert
85. Peptid mit einer 52 igen Sequenzidentit t zu einem 224 Aminos uren umfassenden 3 Ergebnisse 82 IDS4 like Protein aus Castanea sativa AAL17697 Schafleitner und Wilhelm 2002 Der N Terminus des IDS4 like Peptids aus Tomate von Aminos ure 9 bis 66 ist einer 180 Aminos uren langen SPX Dom ne sehr hnlich Pfam Acc No PF03105 Das Hefeprotein SYG1 das die SPX Dom ne enth lt bindet mit seinem N Terminus direkt an eine G Protein Untereinheit und inhibiert die Signaltransduktion eines Paarungspheromons Spain 1995 Es wird vermutet dass alle Proteine dieser Familie mit SPX Dom ne in die G Protein assoziierte Signaltransduktion involviert sind Au erdem sind die N Termini verschiedener Proteine der Familie mit SPX Dom ne an der Regulation des Phosphat Transports beteiligt Zwei der im Hefe Two Hybrid Screen selektierten Klone weisen Homolgien zu 1 Aminocyclopropan 1 carboxylat ACC Oxidasen auf Ein Alignment ihrer Nucleotidsequenzen best tigt dass sie Klone derselben ACC Oxidase sind Der mit 128 Aminos uren kleinere der beiden Klone besitzt an seinem N Terminus 9 zus tzliche Aminos uren im Vergleich zum 161 Aminos uren langen ACC Oxidase Peptid Das rekonstruierte 170 Aminos uren umfassende Peptid zeigt eine 92 ige Sequenzidentit t mit einer 312 Aminos uren langen ACC Oxidase aus Solanum tuberosum AAM29183 Zanetti ef a 2002 Die ACC Oxidasen aus Tomate geh ren einer Genfamilie an von der bereits 4 Mitglieder beka
86. Protein Arabidopsis thaliana AAM64406 SSH 88 1 Protein der Aldo Keto Reduktase Familie Arabidopsis thaliana AAB71981 SSH 101 1 Heat shock Protein 70 Lycopersicon esculentum L41253 SSH 106 1 Proteinkinase Malus x domestica AAQ54539 1 SSH 122 2 Sucrose Synthase Lycopersicon esculentum AAA34196 SSH 126 2 Heat shock Protein 70 Salix gilgiana BAA34919 SSH 136 3 Putativer Xyloglucan Inhibitor Lycopersicon esculentum AAN87262 1 SSH 143 1 Delta Tonoplast intrinsisches Protein Gossypium hirsutum AAB04557 1 SSH 172 2 Putatives NAC Dom nen Protein Solanum tuberosum CAC42087 SSH 174 1 Zink Finger C3HC4 Typ RING Finger Protein Arabidopsis thaliana NP_568264 SSH 224 1 K lte induzierte Glucosyltransferase Solanum sogarandium AAK54465 Alle SSH Fragmente deren abgeleitete Aminos uresequenzen Homologien zu Proteinen aus der Tomate zeigen k nnen aufgrund der Identit t der Nucleotidsequenz zwischen SSH Fragment und homologem Tomatengen von gt 97 als Fragmente dieser entsprechenden Gene bezeichnet werden SSH 7 33 55 61 62 73 101 und 136 Lediglich das Fragment SSH 122 ist offensichtlich nur ein Homolog des aufgef hrten Saccharose Synthase Gens Zusammenfassend wird festgestellt dass ein Gro teil der isolierten SSH Fragmente Homologien zu Genen aufweisen die Enzyme des Kohlenstoff Metabolismus codieren SSH 6 11 33 59 61 62 73 88 122 und 224 Von diesen sind die Enzyme die Homologe zu
87. RNA aus 20 Stunden anaerob induziertem Pflanzengewebe Kapitel 2 11 wurden f r die cDNA Synthese eingesetzt Lediglich cDNAs von mehr als 500 bp Gr e wurden direktionell in den Vektor pSport1 kloniert Die Transformation in ElectroMAX DH10B Competent Cells Invitrogen erfolgte durch Elektroporation Die Anzahl der Prim rklone der synthetisierten cDNA Bank betrug 5x105 cfu ml Das Screening nach vollst ndigen cDNA Klonen erfolgte nach Sambrook ef ai 1989 Als Sonden wurden die entsprechenden cDNA Fragmente die durch SSH isoliert und identifiziert werden konnten eingesetzt 2 12 1 Elektrotransformation der cDNA Bank in Escherichia coli Die Transformation von DNA durch Elektroporation erfordert besonders salzarme Bedingungen Daher wurden die Ligationsans tze zun chst einer Phenol Chloroform Extraktion unterzogen die DNA mit Ethanol pr zipitiert anschlie end dreimal mit 70 igem Ethanol gewaschen getrocknet und in ddH20 resuspendiert In vorgek hlten Elektroporationsk vetten peqlab wurden 25 ul elektrokompetente Zellen DH10B Invitrogen mit 1 ul 100 ng DNA vermischt und f nf Minuten auf Eis inkubiert Die Elektroporation erfolgte bei 2 5 kV 25 uF und 200 Ohm im Gene Pulser von Bio Rad wobei die Zeitkonstante f r einen Impuls 4 8 bis 5 Millisekunden betragen sollte Nach sofortiger Zugabe von 1 ml SOC Medium 2 w v Bactotrypton 0 5 w v Hefeextrakt 10 mM NaCl 2 5 mM KCI 10 mM MgCle 10 mM MgSO pH 6
88. Robertson s mutator transposons in A thaliana are regulated by the chromatin remodeling gene decrease in DNA methylation DDM1 Genes Dev 15 591 602 Smith M K Day D A Whelan J 1994 Isolation of a novel soybean gene encoding a mitochondrial ATP Synthase subunit Arch Biochem Biophys 313 235 240 Souer E van Houwelingen A Kloos D Mol J Koes R 1996 The no apical meristem gene of petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem an primordia boundaries Ce 85 159 170 Spain B H Koo D Ramakrishnan M Dzudzor B Colicelli J 1995 Truncated forms of a novel yeast protein suppress the lethality of a G protein alpha subunit deficiency by interacting with the beta subunit J Biol Chem 270 25435 25444 Spanu P Reinhardt D Boller T 1991 Analysis and cloning of the ethylen forming enzyme from tomato by functional expression of its mRNA in Xenopus laevis oocytes EMBO J 10 2007 2013 6 Literaturverzeichnis 125 Sprenger Haussels M Weisshaar B 2000 Transactivation properties of parsley proline rich bZIP transcription factors Plant J 22 1 1 8 Strahtmann A Kuhlmann M Heinekamp T Dr ge Laser W 2001 BZI 1 specifically heterodimerises with the tobacco bZIP transcription factors BZI 2 BZI 3 TBZF and BZI 4 and is functionally involved in flower development Plant J 28 397 408 Stitt M 1998 Pyrophosphate
89. Screen jedoch zwei unabh ngige Klone von LeACO5 als ABZ1 Interaktionspartner isoliert wurden k nnte dies f r die Evidenz dieser Interaktion sprechen Desweiteren besitzt LeACO5 im Vergleich zu den bisher beschriebenen ACC Oxidasen aus Tomate den l ngsten Leucin Zipper Aufgrund dieser Beobachtungen k nnte das neue anaerob induzierte Mitglied der ACC Oxidase Familie aus Tomate LeACO5 m glicherweise Interaktionen eingehen die der Regulation der Ethylensynthese unter Anaerobiose dienen Weitere Untersuchungen mit dem vollst ndigen LeACO5 Protein k nnten Aufschlu ber seine funktionelle Bedeutung liefern 5 Zusammenfassung 110 5 Zusammenfassung Pflanzen reagieren mit einer Vielzahl von Adaptionsmechanismen um unter anaeroben Bedingungen berleben zu k nnen und internem Sauerstoffmangel entgegen zu wirken Ein verringerter und effizienterer Sauerstoffverbrauch morphologische Ver nderungen die eine gesteigerte Sauerstoffaufnahme erm glichen sowie die Umstellung des Metabolismus auf Stoffwechselwege die die ATP Gewinnung aufrecht erhalten und der Sch digung der Pflanze entgegenwirken basieren gr tenteils auf ver nderter Genexpression Allerdings sind viele Aspekte der anaeroben Stress Antwort noch unklar insbesondere im Hinblick auf die Regulation anaerob reprimierter Gene Deshalb besteht ein gro es Interesse an der weiteren Aufkl rung der komplexen Zusammenh nge der anaeroben Signaltransduktion sowie der different
90. Screen vereinzelt und verifiziert Nach No l Sal Spaltung wurde der Klon mit dem gr ten cDNA Insert sequenziert In Abbildung 22 ist die aus der Nucleotidsequenz resultierende Aminos uresequenz des AIL Proteins dargestellt unterste Zeile Die vollst ndige cDNA umfasst 950 Basenpaare und schlie t einen Poly A Tail von 20 Adenosinresten ein Daten nicht gezeigt 798 Basenpaare 2 799 bilden den codierenden Bereich und werden in das AlL Protein mit 266 Aminos uren translatiert Das Molekulargewicht des AlL betr gt 30 8 kDa und es hat einen pKi Wert von 6 22 Die 5 nicht translatierte Sequenz besteht aus lediglich einem Basenpaar w hrend die 3 UTR 151 Basenpaare beinhaltet Durch Homologievergleich konnte sicher gestellt werden dass das erste ATG dieses offenen Leserasters tats chlich das Startcodon darstellt Das selektierte mit ABZ1 interagierende Peptid entspricht den Aminos uren 90 bis 259 der vollst ndigen Aminos uresequenz von AIL Unterstreichung Die h chste Homologie mit einer Sequenzidentitat von 53 zeigt die vollstandige Aminosauresequenz mit einem 256 Aminos uren langen IDS4 like Protein aus Arabidopsis thaliana AT5G20150 Abb 22 AMM64762 Haas ef at 2002 Von Aminos ure 1 bis 255 zeigt AIL eine 37 ige Sequenzidentitat mit der konservierten Domane eines Proteins das in die vakuolare Polyphosphat Akkumulation involviert ist eine SPX Dom ne besitzt und f r den Transport anorganischer lonen verantwortlich ist Die
91. TATACTCGAGATGTCACCTTTAAGGCAGAG 3 p CTCGAG Xh 2942 g 74 3 oNLS Necol 3479 5 ATATCCATGGTCTCATCCATTCCTGCATAC 3 Nco 2 Material und Methoden 31 oa TATACTCGAGATGCAGAAGCTTCTGCAAGATTTGAC 3 Xho ATATCCATGGAAAATTTAAACAATCCTGATG 3 Nco pRT103 ABZ 145 138 74 5 oONLS Xhol 3480 GUS 3077 a 74 3 Ncol 3477 Si TATAGTCGACATGAACAAAGGAGCAAACGG 3 Sal ATATTCATGAAGTAAGGTTTTTGCATGTATAGGAACAT 3 Pag pRT103 ANA1 301 GUS_ ANA 5 Sal 3495 3161 a ANA 3 Pagl 3 3492 a TATAGTCGACATGAACAAAGGAGCAAACGG 3 Sal ATATTCATGAAGCGGTACTCGTGCATAATCCA 3 Pag pRT103 ANA1 136 GUS ANA 5 Sad 3495 3162 a ANA 3 Pagl 2 3491 a pRT103 ANA1 76 GUS ANA 5 Saf 3495 3163 TATAGTCGACATGAACAAAGGAGCAAACGG 3 Sal ATATTCATGAAATCCCTTGGTGAGAAAAAATACC 3 Pag a ANA 3 Pagi 1 3490 2 15 1 2 Transformation von Zwiebelepidermiszellen Zwiebelepidermen liegen in ein zelligen Schichten vor die eine einfache mikroskopische Untersuchung dieser Pflanzenzellen erm glichen Deshalb wurden f r die Analyse der Kernlokalisation von ABZ1 und ANA Zwiebelepidermiszellen eingesetzt Die Epidermis wurde von der Innenseite der einzelnen Zwiebelschichten mit einer Pinzette abgezogen ca 2x 3 cm gro e St cke auf 3 igem MS Medium 4 3 g Murashige Skoog Medium 180 mg KH gt PO4 30 g Saccharose pH 5 7 mit KOH ad 1000 ml d
92. Triose Phosphat Translokators sind ebenfalls reduziert Menegus et a 1989 1 7 Zellsch digung durch cytoplasmatische Ans uerung Sch digung und Zelltod der nicht der Anoxia Toleranz durch Aerenchym Bildung dient resultieren vermutlich aus toxischen Endprodukten des anaeroben Stoffwechsels einem verringerten Energiemetabolismus oder fehlenden Substraten f r die Respiration Drew 1997 Au erdem scheint die Regulation des cytoplasmatischen pH Wertes von gro er Bedeutung f r die Zellvitalitat zu sein Roberts et al 1984 Abb 1 Aufgrund der Milchsaure Bildung bei Anaerobiose fallt namlich der pH Wert im Cytoplasma ab Da ein Gro teil des gebildeten Lactats jedoch aus der Zelle heraustransportiert wird erfolgt kein weiterer R ckgang des cytosolischen pH Wertes sondern es stellt sich ein konstanter pH Wert ein Offensichtlich wird in Folge dieses sauren pH Wertes die Lactatdehydrogenase LDH inhibiert und die Pyruvatdecarboxylase PDC aktiviert was zu einer Umstellung von der Milchs ure G rung zur bevorzugten alkoholischen Fermentation f hrt Drew 1997 Dadurch dass Ethanol im Lipid Bilayer l slich ist kann es leicht aus Geweben herausdiffundieren und stellt somit keinen kritischen Faktor f r das berleben von Zellen unter anaeroben Bedingungen dar Drew 1997 Bei saurem pH Wert schlie t sich eine zweite Phase der cytoplasmatischen Ans uerung an die aus 7 Einleitung 10 einem Protonenverlust der Vakuole resu
93. ZIP Proteine angeh ren festzustellen Tab 8 Die Zielsequenzen von bZIP910 und 911 wurden ebenfalls mit Hilfe eines PCR unterstutzten Selektionsassays_ isoliert Zus tzlich zur ACGT Core Sequenz Tab 8 1 bis 1 werden sowohl von bZIP910 und 911 als auch von ABZ1 an der Position 3 ein T an der Position 2 ein G und an den Positionen 2 und 3 entweder ein G oder T pr ferentiell gebunden Au erdem beinhalten die selektierten bZIP910 und 911 Sequenzen wie die verifizierten Fragmente RBSS1 und 6 1 ein asymmetrisches ACGT Element ACE das aus einer halben C Box G Box besteht GACGTG Martinez Garcia ef a 1998 Tab 8 Consensus Zielsequenzen von ABZ1 bZIP910 und bZIP911 Die Nucleotidpositionen sind mit 6 bis 0 und von 0 bis 6 angegeben Die Gr e der IUPAC Code Buchstaben korreliert mit ihrer Bedeutung f r die DNA Bindungsspezifit t der bZIP Faktoren 6 5 4 3 2 4 0 0 ai 2 43 4 5 6 ABZ1 KK N T K A C G T G G N N N bZIP910 G R T G A C G T G G C bZIP911 R R T G A C G T G K MC ABZ1 bindet in vitro spezifisch an den CaMV 35S Promotor der drei putative ABZ1 Zielsequenzen mit palindromischer ACGT Coresequenz beinhaltet Es werden zwei Protein DNA Komplexe gebildet die auf ihrer unterschiedlichen Anzahl der gebundenen ABZ1 Proteine beruht Kapitel 3 3 5 Abb 13 Durch Vergleich mit der f r ABZ1 erstellten Consensus Zielsequenz k nnte der Bereich um die zweite Core Sequenz vgl Abb 13A die st rkste und spezifischst
94. abidopsis R72 gene encodes a root periphery iron transporter Plant J 26 181 189 Wellmer F Schafer E Harter K 2001 The DNA binding properties of the parsley bZIP transcription factor CPRF4a are regulated by light J Biol Chem 276 6274 6279 Xie Q Frugis G Colgan D Chua NH 2000 Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development Genes and Development 14 3024 3036 Zanetti M E Terrile M C Arce D Godoy A V Segundo B S Casalongue C 2002 Isolation and characterization a potato cDNA corresponding to a 1 aminocyclopropane 1 carboxylate ACC oxidase gene differentially activated by stress J Exp Bot 53 2455 2457 Zeng Y Wu Y Avigne W T Koch K E 1998 Differential regulation of sugar sensitive sucrose synthases by hypoxia and anoxia indicate complementary transcriptional and posttranscriptional regulation Plant Physiol 116 1573 1583 Zeng Y Wu Y Avigne W T Koch K E 1999 Rapid repression of maize invertases by low oxygen Invertase sucrose synthase balance sugar signaling potentional and seedling survival Plant Physiol 121 599 608 Zhang J Van Toai T Huynh L Preiszner J 2000 Development of flooding tolerant Arabidopsis thaliana by autoregulated cytokinin production Mol Breeding 6 135 144 6 Literaturverzeichnis 127 Zitomer R S Lowry C V 1992 Regulation of gene expression by ox
95. alyse von ANA auf ein Signalpeptid zur Kernlokalisierung Ausschlie lich das gesamte 301 Aminos uren umfassende ANA Protein ist in der Lage in den Zellkern zu gelangen Diese Beobachtung l sst darauf schlie en dass im C terminalen Bereich zwischen 3 Ergebnisse 55 Aminos ure 137 und 301 ein untypisches Kernlokalisierungssignal vorliegt das nicht durch Computerprogramme identifiziert werden konnte Der nur teilweise Transport von ANA in den Nucleus deutet m glicherweise darauf hin dass anaerobe Bedingungen oder andere Proteine n tig sind um ANA vollst ndig in den Zellkern zu transportieren GUS ANA1 76 GUS ANA1 136 GUS ANA zu GUS 8 LA n Abb 5 Untersuchungen zur Kernlokalisierung von ANA GUS und DAPI Anfarbung von GUS Zwiebelepidermiszellen nach transienter Expression unterschiedlicher ANA GUS Fusionsproteine Die tiefergestellten Zahlen innerhalb der Konstruktbezeichnungen geben die klonierte ANA Sequenz in Aminos uren wieder Die Negativkontrolle exprimiert B Glucuronidase alleine GUS Die Transformation erfolgte durch Goldpartikelbeschu mit der Partikelkanone 3 2 3 ANA besitzt eine Transkriptionsaktivierungsdom ne Die meisten bisher funktionell untersuchten pflanzlichen Proteine die eine NAC Dom ne besitzen wirken als Transkriptionsaktivatoren Duval et ai 2002 Xie et al 2000 Ren ef al 2000 Diese Faktoren tragen ihre transaktivierende Dom ne im C Terminus Aufgrund dieser
96. alyse zeigt dass ABZ1 am n chsten mit BZI 4 aus Tabak Strathmann et ai 2001 AAK92215 verwandt ist ABZ1 und BZI 4 k nnen zusammen mit bZIP911 und bZIP910 aus dem L wenm ulchen Martinez Garcia ef al 1998 CAA74023 und CAA74022 CPRF6 aus Petersilie R gner ef ai 2001 CAC00657 BZI 3 tbz17 und BZI 2 aus Tabak AAK92214 Strathmann ef ai 2001 T02016 Kusano ef al 1998 AAK92213 Strathmann et a 2001 sowie mLIP15 aus Mais Kusano ef al 1995 BAA05617 und LIP19 aus Reis Aguan ef al 1993 CAA40596 in eine Subfamilie kleiner bZIP Transkriptionsfaktoren eingeteilt werden Sie sind alle relativ nah miteinander verwandt und bestehen aus 133 170 Aminos uren w hrend die verwandtschaftlich weiter entfernten bZIP Transkriptionsfaktoren BZI 1 aus Tabak Heinekamp ef al 2002 AAL27150 GBF1 aus Mais de Vetten und Ferl 1995 AAA80169 GBF12 GBF4 und GBF9 aus Tomate Meier und Gruissem 1994 CAA52895 CAA52896 und CAA52897 sowie CPRF1 aus Petersilie Feldbrugge et al 1996 Q99089 232 450 Aminos uren umfassen 3 Ergebnisse 64 mLIP15Zm LIP190s BZI4Nt ABZ1 bZIP911Am bZIP910Am CPRF6Pc BZI3Nt tbz17Nt BZI2Nt BZIiNt GBF1Zm GBF12Le GBF4Le GBF9Le CPRF1Pc 0 1 changes Abb 10 Phylogenetischer Stammbaum der anhand der bZIP Domanen von ABZ1 und anderen pflanzlichen bZIP Transkriptionsfaktoren unter Einsatz der Neighbor Joining Methode erstellt wurde Aufgrund des Primarstruktu
97. an den CaMV 35S Promotor gezeigt wurde Kapitel 3 2 4 sollte die Aktivit t eines Glucuronidase Reportergens das durch den CaMV 35S Promotor kontrolliert wird bei Coexpression von ANA untersucht werden Die funktionelle Analyse von ANA erfolgte durch Cotransformation folgender Konstrukte mittels Partikelkanone Kapitel 2 15 2 Das Effektorplasmid exprimiert den funktionell zu untersuchenden ANA Transkriptionsfaktor unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors 35S ANA bzw enth lt keine ANA codierende Sequenz als Kontrolle Das Reporterplasmid stellt das Promotor Reportergenkonstrukt 35S GUS bereit und als Transformationskontrolle wird ein durch den C1 Promotor reguliertes Luciferasegen eingesetzt C1 LUC Das S ulendiagramm in Abbildung 8 stellt die Reportergenaktivit t der beiden vergleichenden Versuchsans tze die sich lediglich im transformierten Effektorplasmid unterscheiden dar Die Mittelwerte und Standardabweichungen der GUS Aktivit t ohne bzw mit coexprimiertem Effektor wurden aus 3 bzw 4 Me werten von insgesamt je 4 Transformationsereignissen errechnet Anhang 7 2 Die transiente Transformation von 35S GUS ohne Effektor ergab eine GUS Aktivit t von 737 pmol 4 MU min 1 mg 1 Protein wobei die Standardabweichung 213 pmol 4 MU min mg Protein betrug Durch Coexpression von ANA als Effektor wurde eine um ca 50 reduzierte GUS Aktivit t gemessen Offensichtlich f hrt ANA im transienten System zu einer Reduktion der Repo
98. ann Unter Verwendung der RBSS Sonden 1 1 Spur 5 7 5 Spur 11 13 und 6 1 Spur 20 22 wurden mit RBSS1 als Sonde vergleichbare Ergebnisse erzielt Folglich stellen neben halben G Boxen RBSS1 und RBSS6 1 auch palindromische G Boxen RBSS1 1 und RBSS5 spezifische Zielsequenzen f r ABZ1 dar Jede dieser Zielsequenzen tr gt Guanin an Position 5 sowie Guanin oder Thymin an Position 6 Zus tzlich enthalten RBSS1 und 6 1 Thymin an Position 3 F r den retardierten Komplex aus ABZ1 und RBSS2 1 Sonde wird ein auffallend starkes Signal detektiert Spur 8 Die Zugabe von sK1 f hrt lediglich zu einer vergleichsweise geringen Kompetition des ABZ1 RBSS2 1 Komplexes Spur 9 w hrend uK1 keinen Einflu auf die Bindung von ABZ1 an das RBSS2 1 Fragment hat Spur 10 Daraus resultiert dass au er einer halben G Box und einem Thymin an Position 3 auch Sequenzen von ABZ1 gebunden werden die statt eines Guanins an Position 5 ein Thymin besitzen Die unvollst ndige Kompetition dieses Komplexes mit dem RBSS1 Fragment als spezifischem Kompetitor resultiert vermutlich aus einer spezifischeren Bindung von ABZ1 an RBSS2 1 im Vergleich zu seiner Interaktion mit RBSS1 Die Untersuchung der spezifischen Bindung von ABZ1 an die DNA Fragmente RBSS8 und RBSS9 Spuren 14 19 f hrte zu relativ schwachen Signalen der retardierten Komplexe Spuren 14 und 17 Diese Komplexe konnten mit sK1 vollst ndig kompetiert werden Spuren 15 und 18 Allerdings trat auch nach Zu
99. annte Enzyme und Signaltransduktions komponenten codieren Klok ef al 2002 Desweiteren belegen diese Expressionsanalysen eine erh hte Transkription von Genen die in die alkoholische und Milchs ure Fermentation involviert sind wenn die O2 Konzentration auf 5 abf llt Abb 1 Im Gegensatz zur schnellen Induktion der mRNAs der Alkoholdehydrogenase ADH und der Lactatdehydrogenase LDH wird kein deutlicher Anstieg der Transkriptmengen glykolytischer Enzyme bei 5 O2 detektiert was der unterdr ckten Glykolyse und Respiration unter diesen hypoxischen Bedingungen entspricht Daher kann die Induktion dieser ANPs als Pr Adaption interpretiert werden damit die Energieproduktion w hrend der anschlie enden Anaerobiose gew hrleistet ist Weitere prominente Genen die adaptive Funktionen aus ben sind solche die f r Enzyme der Detoxifikation reaktiver Sauerstoffspezies codieren Klok et ai 2002 und somit eine Rolle beim Schutz vor anoxischen sowie post anoxischen Sch digungen spielen k nnten Drew 1997 Abb 1 Erneuter Eintritt von O2 in anaerobes Gewebe f hrt zur Bildung gef hrlicher Sauer stoffradikale und anderer toxischer Stoffwechselprodukte die dann eine oxidative Sch digung der Pflanze verursachen Im Gegensatz dazu sind die kurzzeitig induzierten Gene der Glutamat Decarboxylase und Alanin Aminotransferase f r die Synthese von 4 Aminobutters ure und Alanin verantwortlich die der cytosolischen Ans uerung w hrend Anaerobios
100. as an alternative energy donor in the cytosol of plant cells an enigmatic alternative to ATP Bot Acta 111 167 175 Subbaiah C C Bush D S Sachs M M 1994 Elevation of cytosolic calcium precedes anoxic gene expression in maize suspension cultured cells Plant Cell 6 1747 1762 Subbaiah C C Zhang J Sachs M M 1994 Involvement of intracellular calcium in anaerobic gene expression and survival of maize seedlings Plant Physiol 105 369 376 Subbaiah C C Kollipara K P Sachs MM 2000 A Ca2 dependent cystein protease is associated with anoxia induced root tip death in maize J Exp Bot 51 721 730 Susin S Abian J Sanchez Baera F Peleato J L Abadia A Gelpi E Abadia J 1993 Riboflavin 3 and 5 sulfate two novel flavins accumulating in the roots of iron deficient sugar beet Bela vulgaris J Biol Chem 268 20958 20965 Taylor E R Nie X Z MacGregor A W Hill R D 1994 A cereal hemoglobin gene is expressed in seed and root tissues under anaerobic conditions Plant Mol Biol 24 853 862 Terai H Tsuchida H Mizuno M Matsui N 1998 Influence of short term treatment with high CO and N on ethylene biosynthesis in tomato fruit Hort Science 33 103 104 TerBush D R Maurice T Roth D Novick P 1996 The Exocyst is a multiprotein complex required for exocytosis in Saccharomyces cerevisiae EMBO J 15 6483 6494 Thimm O Essigmann B Kl
101. aus resultierenden Signaltransduktion dienen Eine Feinregulation der Eisenaufnahme unter Anaerobiose w re die Folge Zwar verf gt AlL ber ein zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal das f r den Nucleus als eigentlichen Wirkungsort spricht Jedoch scheint eine Funktion zusammen mit ABZ1 als Transkriptionsfaktor eher unwahrscheinlich da AIL keine DNA Bindungsdom ne besitzt Diese w re jedoch die Voraussetzung f r eine Bindung des ABZ1 AIL Heterodimers an DNA Kapitel 3 3 7 Abb 14 4 8 2 AlL als Komponente der anaeroben Signaltransduktion AIL besitzt wie seine vier h chsten Homologen aus Arabisopsis eine N terminale SPX Dom ne Abb 22 Locus AT5G20150 AT5G15330 AT2G45130 AT2G26660 Die Expression des IDS4 like Proteins das die h chste Sequenzidentit t mit AIL aufweist locus AT5G20150 wird durch gesteigerte COz Konzentrationen induziert TAIR 4 Diskussion 107 Datenbank Kapitel 2 18 Da das Pflanzenmaterial aus dem die RNA fur die anaerobe cDNA und Hefeexpressionbank Synthese isoliert worden war ebenfalls unter anaeroben Bedingungen mit erh htem CO Gehalt inkubiert worden war Anaerobcult scheint die Expression von AlL und seinem Arabidopsis Homolog hnlich reguliert zu sein Die Bezeichnung der SPX Dom ne setzt sich aus den Proteinen SYG1 PHO31 und XPR1 zusammen Der N Terminus des Hefeproteins SYG1 bindet direkt an die Untereinheit von G Proteinen und inhibiert die Signaltransduktion eines Paarungsphe
102. chenden Gens f hrt Martinez Garcia ef a 1998 Der lange 5 Leader von ATB2 aus Arabidopsis ist in die Translationsrepression von ATB2 durch Saccharose involviert Rook ef al 1998 M glicherweise wirkt also auch ABZ1 auf Transkript Ebene regulierend auf seine eigene Expression oder wird post transkriptionell kontrolliert Die postulierte Funktion des basischen Bereichs als DNA Bindungsdom ne von ABZ1 wurde in Gelshift Experimenten belegt Kapitel 3 3 6 und 3 3 7 Abb 14 Interessanterweise wird die ABZ1 Bindung an seine Zielsequenz durch steigende Mengen eines N terminal verk rzten ABZ1 dem die DNA Bindungsdom ne fehlt sukzessiv aufgehoben Um eine effektive DNA Bindung zu erm glichen muss ein potentieller ABZ1 Interaktionspartner folglich ber eine basische Bindungsdom ne verf gen Au erdem verf gt ABZ1 ber weitere charakteristische S Gruppen Merkmale Dazu geh ren die L nge seines Leucin Zippers Abb 9 seine Codierung durch ein einziges 4 Diskussion 97 Exon Daten nicht gezeigt seine DNA Bindungsspezifitat Tab 7 und Abb 12 sowie seine Induzierbarkeit durch abiotischen Anaerobiose Stress Kapitel 3 1 1 Abb 3 4 5 DNA Bindungsspezifitat von ABZ1 Durch eine PCR unterst tzte Zufallsselektion auf Zielsequenzen wurde festgestellt dass ABZ1 sowohl an halbe als auch an vollstandige G Boxen bindet Dabei ist die Core Sequenz essentiell Die flankierenden Positionen denen aufgrund des IUPAC Mehrdeutigke
103. cherichia coli BL21 CodonPlus DE3 RIL Genotyp E coliB F ompT hsdS rB mb dem tet galh DE3 endA Hte argU dek leuw am DH10B E merA A mrr hsdRMS mcrBC 680d acZAM15 AlacX74 dech rech endA1 araD139 A ara eu 7697 gal gaK A rps nupG INVoF FE endAT recAT hsdR17 rc m supE44 thi 7 gyrA96 relAT d80 acZAMT5 A lacZ YA argF U1691 M15 pREP4 nak str rif thi lac arat gal mtt F recA uvr lon kan ch XL1 Blue MRF supE44 hsdR17 recAT endAT gyrA46 thi relA7 lac F proAB lack lacZAM15 Tn 10 tet Kat No 740588 250 740590 250 740573 100 18248 013 19625 011 K2000 J10 27 2690 02 1 13829 K1804 1 K1615 1 28106 70042 70042 27106 28704 230245 Referenz Invitrogen Invitrogen Invitrogen Qiagen Stratagene 2 Material und Methoden 15 Saccharomyces cerevisiae AH109 Genotyp MATa trp1 901 leu2 3 112 ura3 52 his3 200 Referenz Clontech gal4 galBON LYS2 GAL 1uas GAL Trara HIS3 MELT GAL2uAs GALZrAra ADE2Z URA3 MEL Tuas MEL Trara lacZ 2 7 Verwendete Pflanzenlinien Lycopersicon esculentum cultivar Micro Tom Meissner ef at 1997 Nicotiana tabacum cultivar Petit Havanna SRI Maliga ef at 1975 2 8 Verwendete Plasmide Plasmid pCR 2 1 pBluescript SK pRT103 GUS pVKH 35S pA1 pQE 30 pSport1 pGBKT7 pGBKT 53 pGBKT7 Lam pGADT7 pGADT T pGADT7 Rec DCL pBT10 TATA GUS PRT101 LUC pC1L 1097 pUK4030 pOCA28 35S GUS Beschreibung TA Klonier
104. d 2 Material und Methoden 32 erneute ungebremste Zentrifugation bei 22xg gewaschen Das Pellet wurde in 50 ul 98 igem Ethanol aufgenommen und die Zentrifugation bei 22xg wiederholt Schlie lich wurden die mit DNA beladenen Goldpartikel in 35 ul 98 igem Ethanol resuspendiert Pro Makrocarrier wurden 5 7 ul dieser Suspension die direkt vor dem Auftragen 2 3 Sekunden mit Ultraschall behandelt wurde aufgegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet Die Transformation der Zwiebelepidermiszellen erfolgte nach Sanford 1988 in der Partikelkanone Du Pont PDS 1000 mit 600 700 psi in einem Vakuum von 25 mm Quecksilbersaule Dabei betrug der Abstand zwischen Makrocarrier und zu transformierendem Pflanzengewebe 7 5 cm Die transiente Expression der ABZ1 bzw ANA GUS Fusionsproteine erfolgte 20 24 Stunden bei 24 C unter Tag Nacht Bedingungen bevor die Zwiebelepidermiszellen dann im histochemischen GUS Test auf Kernlokalisation der Fusionskonstrukte untersucht wurden Kapitel 2 15 1 3 2 15 1 3 Histochemischer GUS Test Zwiebelepidermis Das transformierte Zwiebelepidermisgewebe Kapitel 2 15 1 2 wurde in eine 1 ug ml 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl B glucuronic acid X Gluc enthaltende GUS F rbel sung nach Isono ef al 1999 50 mM NaPO pH 7 0 1 mM EDTA 0 1 v v Triton X 100 1 mM K ferrocyanid 1 mM K ferricyanid gegeben und vier Stunden bei 37 C inkubiert um die blaue GUS F rbung zu entwickeln Zum Mikroskopieren wurden
105. den ber bin re Vektoren stabil in Tomate eingebracht 35S GUS B low ef ai 1999 und GapC4 GUS K hler et al 1996 Zun chst wurden die Tomatensamen von Lycopersicon esculentum cv Mirco Tom durch 30 sek ndige Behandlung mit Ethanol und 20 min tiges Baden in NaOCl Tween 20 L sung 1 5 NaOCl 0 1 Tween 20 sterilisiert Nach drei Waschschritten in sterilem ddH20 wurden die Samen auf Keimmedium 4 6 g l Murashige Skoog MS Salze pH 5 7 mit KOH einstellen 6 g l Agar in sterilen Pflanzencontainern 10 x 10 cm ca 20 30 Samen pro Container ausgelegt Zum Keimen wurden die Samen 3 5 Tage bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und anschlie end in eine Pflanzenkammer mit 24 C und einem Tag Nacht Rhythmus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit transferiert F r die Transformation wurden Kotyledonen 8 Tage alter Keimlinge eingesetzt Der Agrobakterienstamme deren Plasmide pOCA28 355 GUS bzw pUK4030 GapC4 GUS in das Tomatengenom integriert werden sollten wurden jeweils in 5 ml Min A Medium 10 ml 5x Min A 52 5 g K2HPO 22 5 g KH2POq 5 g NH4 SO 2 5 g Natriumcitrat ad 1 ddH2O 40 ml ddH20 autoklavieren 50 ul 20 w v MgSO4 und 500 ul 20 Glucose sterilfiltriert supplementiert mit 100 pg ml Streptomycin 100 ug ml Spectinomycin 50 pg ml Kanamycin inokuliert und bei 30 C unter Sch tteln inkubiert Nach 48 Stunden wurden die Agrobakterien durch eine 10 min tige Zentrifugation bei 4300xg pelletiert in 3 ml Ind
106. den SSH Fragmenten 6 33 62 und 59 darstellen an der alkoholischen G rung beteiligt Die Heat shock Protein Homologen sind als Chaperone in die Proteinsynthese involviert SSH 7 55 101 und 126 Besonderes Interesse gilt den SSH Fragmenten deren Homologe eine putative Funktion in der anaeroben Genregulation 3 Ergebnisse 50 und Signaltransduktion haben SSH 35 36 74 76 106 143 172 und 174 Da SSH 74 und 172 homolog zu Transkriptionsfaktoren der bZIP Familie bzw zu solchen mit einer sog NAC Dom ne sind wurden sie in dieser Arbeit naher analysiert 3 1 1 Untersuchung der transkriptionellen Induktion einiger differentiell exprimierter Gene unter Anaerobiose Einige Gene die anhand ihrer isolierten SSH Fragmente identifiziert werden konnten wurden durch Northern Blot Analysen auf ihre anaerob spezifische Expression berpr ft Gesamt RNA die aus einem Gewebegemisch aus aeroben und anaerob inkubierten Tomatenpflanzen isoliert worden war wurde mit den cDNA Fragmenten SSH 11 SSH 33 SSH 76 SSH 84 und SSH 143 hybridisiert Tab 6 Kapitel 2 10 4 Das SSH Fragment 84 zeigt Homologie zu einem exprimierten Protein aus Arabidopsis mit unbekannter Funktion und ist deshalb nicht in Tabelle 6 aufgef hrt Die transkriptionelle Induktion des bZIP Transkriptionsfaktors SSH 74 des Ethylen responsiven Proteins SSH 35 sowie des Proteins mit NAC Dom ne SSH 172 wurden durch Hybridisierung gewebespezifischer Northern Blots mit de
107. den mit ABZ1 interagierenden Klone zusammensetzt erstreckt sich ber die Aminos uren 37 bis 206 der vollst ndigen LeACO5 Unterstreichung Der mit ABZ1 interagierende Leucin Zipper umfasst die Aminos uren 101 bis 136 und enth lt 4 Leucine und ein Isoleucin rote Buchstaben wobei das Motiv an Position 115 durch ein Tyrosin Y unterbrochen ist Fettdruck ber einen Sequenzbereich von Aminos ure 1 bis 292 besteht eine Identit t von 31 zur konservierten Dom ne der Eisen Ascorbat Oxidoreduktase Familie Mitglieder dieser Familie sind in die Biosynthese den Transport und den Katabolismus von Sekund rmetaboliten involviert Die Aminos uresequenz des vollst ndigen cDNA Klons weist eine 93 ige Identit t mit einer ACC Oxidase aus Solanum tuberosum auf die 312 Aminos uren lang ist und durch Pathogeninfektion in der Kartoffel induziert wird AAM29183 Zanetti et a 2002 Bisher wurden vier ACC Oxidasen aus Tomate isoliert Im Folgenden werden die bekannten ACC Oxidasen mit LeACO1 4 P05116 und P07920 Holdsworth ef al 1987 P24157 Spanu ef al 1991 BAA34924 Nakatsuka ef ai 1998 bezeichnet Abbildung 23 zeigt weiterhin ein Alignment der Aminos uresequenzen von LeACO5d und den vier bekannten ACC Oxidasen aus Tomate Hoch konservierte Aminosauren an 3 Ergebnisse 89 bestimmten Positionen der analysierten Sequenzen sind im Alignment mit einem Stern und hnliche Aminos uren mit einem Doppelpunkt bzw einem Punkt
108. der Version 1 81 eingesetzt wurde Thompson ef ai 1997 Mit Hilfe des Programmes DNA Strider 1 3f15 konnte sowohl das theoretische Molekulargewicht als auch der pKi Wert anhand von Aminos uresequenzen bestimmt werden 3 Ergebnisse 47 3 Ergebnisse 3 1 Anaerob exprimierte Gene aus der Tomate Um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren wurde die Methode der Suppression Subtractive Hybridization SSH angewandt Kapitel 2 11 Dabei war das Ziel Gene zu identifizieren die im Vergleich zu Pflanzen die unter normalen Sauerstoffbedingungen gehalten wurden ausschlie lich bzw deutlich st rker unter Anaerobiose exprimiert werden Diese Gene werden nachfolgend als forward subtrahiert bezeichnet w hrend reverse subtrahierte Gene unter aeroben aber nicht unter anaeroben Bedingungen exprimiert werden Um anaerob spezifische cDNA Fragmente zu identifizieren wurden die forward subtrahierten CDNA Fragmente der SSH in pCR 2 1 kloniert Die isolierte Plasmid DNA wurde mit Asal gespalten und die Restriktionsans tze in Duplika Agarosegelen aufgetrennt und geblottet Die Nylonmembranen auf denen die Rsal Fragmente fixiert vorlagen wurden mit der Gesamtheit einerseits der forward subtrahierten und andererseits der reverse subtrahierten cDNA Fragmente hybridisiert Kapitel 2 11 In Abbildung 2 sind exemplarisch die Autoradiogramme der Southern Blots einiger anaerob spezifischer cDNA Fragmente der Forward Subtraktion nach Hybri
109. des CaMV 35S Promotors im transienten Expressionsystem von Tabak und Tomate unter Anaerobiose deutlich schw cher ist als unter normoxischen Bedingungen Daraus resultiert die Annahme dass ABZ1 unter Anaerobiose induziert wird um die Expression anderer Gene zu reprimieren Im Yeast Two Hybrid System wurden anaerob induzierte Peptide isoliert die 5 Zusammenfassung 112 mit ABZ1 heterodimerisieren Sie alle zeichnen sich durch einen Leucin Zipper aus der f r die Interaktion mit ABZ1 wichtig ist Zus tzlich sind sie teilweise in die Signaltransduktion involviert so wie z B das anaerob induzierte IDS4 like Protein AlL AIL besitzt N terminal eine SPX Dom ne ber die es mit G Proteinen die f r die Signalweiterleitung von Bedeutung sind interagieren k nnte Au erdem interagiert ABZ1 potentiell mit einem neuen Mitglied der ACC Oxidase Familie LeACO5 die ein wichtiges Enzym der Ethylensynthese darstellt Die Bedeutung sowie m gliche Konsequenzen dieser Interaktionen f r die Antwort auf Anaerobiose Stress werden diskutiert 6 Literaturverzeichnis 113 6 Literaturverzeichnis Abe H Urao T Ito T Seki M Shinozaki K Yamaguchi Shinozaki K 2003 Arabidopsis ATMYC2 bHLH and AtMYB2 MYB function as transcriptional activators in abscisic acid signaling Plant Cell 15 63 78 Aguan K Sugawara K Suzuki N Kusano T 1993 Low temperature dependent expression of a rice gene encoding a protein with a
110. diese zu untersuchenden und auf Goldpartikeln fixierten Konstrukte transient in Zwiebelepidermiszellen transformiert Kapitel 2 15 1 2 Als Negativkontrolle der Kernlokalisierung wurde pRT103 GUS transformiert Nach GUS und DAPI F rbung wurden die Epidermiszellen mikroskopiert und fotografiert Abbildung 11 gibt die Ergebnisse des transienten Experimentes wieder Die Negativkontrolle GUS zeigt dass ohne ein Kernlokalisierungssignal das GUS Protein gleichm ig im gesamten Cytoplasma verteilt vorliegt Vergleichbare Ergebnisse liefert die Transformation von Zwiebelepidermiszellen mit dem Konstrukt ABZ11 24 GUS das lediglich die 24 N terminalen Aminos uren ohne Signalpeptid exprimiert Das Fusionsprotein das jedoch die 44 N terminalen Aminos uren von ABZ1 einschlie lich des vorausgesagten Kernlokalisierungssignals enth lt wird teilweise in den Zellkern transportiert was neben einer cytoplasmatischen GUS F rbung durch eine Konzentration der GUS F rbung im Zellkern sichtbar wird Werden Zwiebelepidermiszellen mit dem Konstrukt ABZ11 133 GUS transformiert wird die GUS F rbung ausschlie lich im Zellkern detektiert Dass die Fusionsproteine ABZ11 44 GUS und ABZ11 13 GUS im Zellkern vorliegen wird durch die Aufnahme derselben Zellen nach Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes DAPI bei 360 370 nm wodurch die Zellkerne hell erscheinen deutlich Aus den bisherigen Ergebnissen resultiert dass das Signalpeptid das f r die Kernlokalisierung des
111. disierung mit den forward und reverse subtrahierten cDNA Fragmenten dargestellt Von 238 untersuchten Klonen enthielten 81 forward spezifisch hybridisierende Fragmente Nach Sequenzierung aller 81 Fragmente wurden 46 unterschiedliche SSH Fragmente identifiziert 16 unterschiedlichen SSH Fragmenten wovon ein Fragment viermal und 2 Fragmente doppelt isoliert wurden konnte keine Funktion zugeordnet werden Von den verbleibenden 30 Fragmenten erwiesen sich 5 als Asal Fragmente die Homologien zu Genen zeigten zu denen andere Fragmente ebenfalls homolog waren und die m glicherweise unterschiedliche SSH Fragmente der gleichen cDNA sind 3 Ergebnisse 48 Forward Reverse 33 34 35 36 3 34 35 36 Abb 2 Autoradiogramm eines Southern Blots der forward subtrahierten SSH Fragmente 33 36 Die Asal gespaltenen rekombinanten Plasmide wurden einerseits mit dem cDNA Pool der Forward Subtraktion Forward und andererseits mit den cDNA Fragmenten der Reverse Subtraktion Reverse hybridisiert In Tabelle 6 sind die differentiell hybridisierenden SSH Fragmente der Forward Subtraktion mit ihrer Labor internen Fragment Nummer Spalte 1 der Angabe wieviele identische Fragmente bzw Fragmente eines Gens identifiziert wurden Spalte 2 und die Ergebnisse des Homologievergleichs inklusive der Accession Number derjenigen Homologen die die h chste Sequenzidentit t aufwiesen Spalte 3 wiedergegeben Es sind nur die 25 cDNA Fragmente aufgef hrt
112. dom ne ns 55 ANA bindet sequenzspezifisch an den CaMV 35S Promotor 57 Im transienten System bewirkt ANA keine Aktivierung des CaMV 35S lat 59 Strukturelle und funktionelle Analyse von ABZ1 sssssseeeeseeeeeeerreesrrrerrreeeee 61 ABZ1 ist ein bZIP Transkriptionsfaktor cccecceeeeeeeeeeee eee eeeeeeeeteeeteeteneeeees 61 ABZ1 geh rt einer Familie kleiner bZIP Transkriptionsfaktoren an 63 Die basische Dom ne vermittelt die Kernlokalisierung von AR ZT 65 ABZ1 bindet sequenzspezifisch an die G Box Core Sequenz sssssessseessee 66 ABZ1 bindet spezifisch an den CaMV 35S Promotor 71 Die DNA Bindungsdom ne von ABZ 1ist im N Terminus lokalisiert 72 Die DNA Bindung durch ABZ1 erfordert ein Dimer dessen Monomere ber funktionsf hige basische Dom nen verf gen eee eeeeteteeeeeeeeeettnneeeeeeees 73 ABZ1 bildet jn vitro Dimere ann 74 Coexpression von ABZ1 f hrt zu reduzierter Aktivit t des CaMV 35S bromotors nenn nennen nennen nenn ennennnen 76 Der CaMV 35S Promotor wird unter Anaerobiose schw cher exprimiert als unter aeroben Bedingungen nen nnnnnnnnnnnnn ern 78 Die Effekte der Anaerobiose auf den CaMV 35S Promotor in transgenen Tomatenpflanzen sind heterogen 79 Selektion von potentiellen Interaktionspartnern des ABZ1 sseni 81 Untersuchung der transkriptionellen Induktion von potentiellen ABZ1 Interaktionspartnern unter Anaerobiose ernennen 84 AIL ist ein potentiell
113. e 62 Bindungsdomane Arginin R und Lysin K Innerhalb der basischen Domane konnte durch n silico Analyse mit Hilfe sowohl des Psort als auch des ScanProsite Programmes der SwissProt Datenbank eine zweigeteilte Kernlokalisierungsstelle NLS nach einem Kriterium von Robbins ef ai 1991 identifiziert werden Kapitel 2 18 Abb 9 Kursivdruck Diese enth lt zwei basische Aminos uren denen sich ein 10 Aminos uren langer Spacer und mindestens 3 basische Aminos uren innerhalb der folgenden 5 Positionen anschlie t Der Leucin Zipper der die Aminos uren 47 bis 100 umfasst fungiert als Protein Protein Interaktionsdom ne Er zeichnet sich durch f nf Leucine und ein Isoleucin aus rot Fettdruck die in einem Abstand von exakt 7 Aminos uren auftreten wobei das Leucin Zipper Motiv durch zwei Aminos uren Threonin T und Cystein C unterbrochen ist Die Prim rstuktur liefert keinen Hinweis auf eine transkriptionsaktivierende Dom ne des ABZ1 1 CGTAATCTTCTTCTTCTTCTCCGCCTCCAAATAAATAAATAAATATAAACTTTCTG 57 GTTTCCCCATATTAATCTCTTCCTTAATCGTCTCTACCTACCATTTTTGTICTTTTCACCT ITF PETICTTCATTCTTTITTCCCCCCTTCTTTCATCANTOCAC TTTGTTOATTCTCACAAA de EE EE EE 237 TIGTTTGTACTATTTATTTTGAGAAATTTTCAAGGTGGCTAATTTACTTTCTGGGGTTGT 297 TGCTGATTTTGATTTTTTCAATGACAATGAATTTGGGGTTTCTTTAGTTAGGAATCAATC 357 TATGATCTCTGCCATTTCCATCACTITITTTTAGGCGATTGITITCGTCAATCTTTCTCIGT M IS AIS ITF LGoODcC cFRoQs P SV 417 GCTGTTTCTCTACCATTTTTATGATTTTTCATGAATAGAAATAAATATCCACTGAAAAAG L FLY H
114. e Bindung des bZIP Transkriptionsfaktors und somit den schneller wandernden Komplex K2 hervorrufen Diese Interaktion scheint spezifischer zu sein als die Bindung von ABZ1 an den spezifischen Kompetitor RBSS1 oder die anderen potentiellen Bindestellen innerhalb des 35S Promotors Der Gegenstrang stellt n mlich im Gegensatz zu den beiden anderen putativen Bindungsstellen eine halbe C Box G Box dar Au erdem zeigt diese putative 4 Diskussion 99 Zielsequenz lediglich an Position 3 eine Abweichung von der Consensus Sequenz Offensichtlich bindet ABZ1 zusatzlich an eine oder beide weiteren Promotorregionen die die palindromische Coresequenz enthalten Dabei entsteht ein weiterer langsamer wandernder Komplex K1 mit ABZ1 das simultan an verschiede DNA Sequenzen bindet Die im Vergleich zu K2 zus tzliche Komplexbildung ist allerdings weniger spezifisch Abb 13B Die F higkeit von Transkriptionsfaktoren multiple DNA Interaktionen einzugehen sowie die Tatsache dass eine Bindungsstelle Zielsequenz f r unterschiedliche rans Faktoren sein kann h ngt offensichtlich von verschiedenen Faktoren ab So nehmen z B Entwicklungsstadien u ere Bedingungen die Verf gbarkeit anderer interagierender Proteine die relative Affinit t von Transkriptionsfaktoren zu ACE s sowie die relative Auftrittsh ufigkeit bestimmter Faktoren Einflu auf die tats chliche Bindung eines Transkriptionsfaktors an DNA Sequenzen Martinez Garcia et at 1998
115. e Protein umfasst die Aminos uren 47 bis 138 des Wildtyp ABZ1 Kapitel 2 13 1 Folglich verf gt es nicht mehr ber den 46 Aminos ure langen N Terminus der die basische Dom ne beinhaltet Als radioaktiv markiertes DNA Fragment wurde RBSS1 das als Zielsequenz f r ABZ1 aus dem Random Binding Site Selection Assay 3 Ergebnisse 73 hervorgegangen war eingesetzt Kapitel 2 14 2 1 Die Protein DNA Bindungsansatze wurden in einem 9 igen nicht denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt Kapitel 2 14 3 Abbildung 14 zeigt die Ergebnisse der Protein DNA Interaktionen der einzelnen Reaktionsans tze Fehlt Protein kann kein retardierter Komplex detektiert werden Spur 1 Nach Zugabe von ABZ1 tritt wie erwartet ein retardierter Komplex aus ABZ1 und RBSS1 Sonde auf K Spur 2 Die Zugabe von ABZ147 133 statt des Wildtyp ABZ1 f hrt zu keinem geshifteten Komplex Spur 3 Offensichtlich kann ABZ147 133 aufgrund seiner N terminalen Deletion nicht an das RBSS1 Fragment binden Folglich konnte die DNA Bindungsdom ne von ABZ1 im Bereich der 46 N terminalen Aminos uren experimentell lokalisiert werden 3 3 7 Die DNA Bindung durch ABZ1 erfordert ein Dimer dessen Monomere ber funktionsf hige basische Dom nen verf gen ABZ1 bindet spezifisch an DNA Sequenzen Kapitel 3 3 4 und 3 3 5 Nach Deletion des N Terminus der die basische DNA Bindungsdom ne des bZIP Transkriptionsfaktors einschlie t zeigt ABZ1 keine Interaktion mit DNA Kapite
116. e entgegenwirken Shelp et ai 1999 Menegus F ef al 1989 Gout E ef 7 Einleitung 9 al 2001 Abb 1 Die Transkription von Genen die in die Ethylensynthese die Ethylensignaltransduktion den programmierten Zelltod und den Zellwandabbau involviert sind wird durch geringe O2 Konzentrationen induziert Klok et ai 2002 Olson et al 1995 Ethylen ist eine Komponente der Signalkaskade die zu Zelltod und zur Bildung von lysogenem Aerenchym im Wurzelcortex f hrt Drew 2000 Abb 1 Au erdem wurde ein gesteigertes Expressionslevel fur Gene des Stickstoffmetabolismus und der Photorespiration detektiert die Substrate f r die Lipidbiosynthese zur Verf gung stellen Klok era 2002 Viele der anaerob induzierten Gene spielen auch in der Antwort auf andere biotische und abiotischen Stressfaktoren eine Rolle Chen ef al 2002 Seki et al 2001 Durch Inhibierung der Respiration und Biosynthese sollen anaerobe Bedingungen m glichst verhindert werden Abb 1 In Arabidopsiswurzeln sind unter O2 Mangel diverse Gene reprimiert die die Enzyme der Zellwand Lipid und Flavanoid Biosynthese sowie der Pathogenabwehr codieren Klok et at 2002 Da der Abbau von Proteinen ein ATP verbrauchender Proze ist werden auch Gene der Proteindegra dation infolge von O2 Mangel reprimiert Klok et at 2002 Die Transkriptmengen eines bZIP Transkriptionsfaktors der in die Zucker induzierte Antwort involviert ist einer Plasmamemban ATPase und eines
117. e spekulative Funktionsweise eines potentiellen ABZ1 AIL Heterodimers konnte auf der Fahigkeit der SPX Domane von AIL beruhen Interaktionen mit unterschiedlichen Partnern eingehen zu k nnen Unter Ber cksichtigung einer potentiellen Funktion des AIL im Eisenmetabolismus w re folgendes Modell m glich Die unter anaeroben Bedingungen in hohen Konzentrationen aufgenommenen Fei lonen k nnten direkt oder indirekt als Signalmolek le vom Rezeptor gebunden werden Die dadurch aktivierte a Untereinheit des G Proteins k nnte dann mit AIL als Effektor interagieren und dessen Aktivierung oder Inaktivierung bewirken Nachfolgend k nnte AIL so auf die Signaltransduktion einwirken dass eine Aufnahme toxischer Mengen an Eisenionen unterbunden wird Kommt es jedoch zu einer Interaktion des putativen Leucin Zippers von AIL mit ABZ1 so w rde die Bindung von AIL an Ga ber seine SPX Dom ne sterisch behindert werden Die nachgeschaltete G Protein vermittelte Aktivierung oder Inaktivierung des IDS4 like Proteins w rde unterdr ckt werden und die a Untereinheit h tte nun die M glichkeit mit einem anderen Effektor der z B die Eisenaufnahme f rdert entsprechend auf die Signaltransduktion einzuwirken Folglich w rde durch die regulatorische Interaktion mit ABZ1 die Aufnahme geringer Mengen an Eisenionen die als Cofaktoren f r Enzyme n tig sind aufrechterhalten werden In diesem Fall w rde IDS4 like sowohl als lonen Sensor als auch als Komponente der dar
118. echendem Promotor 3 Ergebnisse 78 3 3 10 Der CaMV 35S Promotor wird unter Anaerobiose schwacher exprimiert als unter aeroben Bedingungen ABZ1 ist ein bZIP Transkriptionsfaktor dessen Expression infolge von Anaerobiose induziert wird an den CaMV 35S Promotor bindet und diesen unter aeroben Bedingungen herunterreguliert Kapitel 3 1 1 3 3 5 und 3 3 9 Aufgrund dieser Beobachtungen wurde angenommen dass der CaMV 35S Promotor bei Anaerobiose schwacher exprimiert wird als unter aeroben Bedingungen Daher sollte die Aktivitat eines Promotor Reportergen Konstruktes 35S GUS nach transienter Transformation in Tabak bzw Tomatenblatter unter anaeroben Bedingungen untersucht werden Blattmaterial von Tabak und Tomate wurde mit einem Reporterkonstrukt 35S GUS und einem Plasmid zur Transformationskontrolle 35S LUC cotransformiert Ein Teil des durch die Partikelkanone transformierten Pflanzenmaterials wurde zur transienten Proteinexpression aerob und der andere Teil anaerob inkubiert Kapitel 2 15 2 Die GUS Aktivitat unter normalen Sauerstoffbedingungen wurde mit der unter Anaerobiose verglichen Als Ma fur die Effizienz jedes einzelnen Transformationsereignisses wurden ausschlie lich die gemessenen Luciferase Einheiten der aerob inkubierten Explantate herangezogen Dadurch blieb eine anaerobe LUC Expression die ebenfalls durch einen 35S Promotor kontrolliert und so evtl bei Anaerobiose herunterreguliert wird f r die Berechnung der Repor
119. ef al 2000 Durch Reagenzien die G Proteine aktivieren cytosolische Ca Konzentration steigern oder Proteinphosphatasen inhibieren ist es m glich Zelltod im Cortex normoxischer und hypoxischer Wurzeln auszul sen Folglich spielen G Proteine die cytosolische Ca Konzentration sowie Proteinkinasen vermutlich eine Rolle in der Ethylen assoziierten Signaltransduktion Drew ef at 2000 Au erdem wurde entdeckt dass die Transkriptmenge der Phospholipase D PLD sowie ihre enzymatische Aktivit t fr h in der Aerenchymbildung durch Hypoxia gef rdert wird Drew 1997 Unter anaeroben Bedingungen wird keine Zellyse und Aerenchymbildung durch Ethylen induziert weil der f r die Ethylensynthese erforderliche Sauerstoff fehlt Bleecker und Kende 2000 Obwohl die Ca Konzentration auch die Signaltransduktion in anaeroben Wurzeln beeinflusst sind die Konsequenzen in hypoxischen und anaeroben Zellen weitgehend unterschiedlich W hrend eine gesteigerte Ca Konzentration im Allgemeinen zur Akklimatisierung und somit zu einer Verl ngerung der Lebensf higkeit anaerober Zellen f hrt tr gt sie in hypoxischen Geweben zum Zelltod bei Drew 1997 Im Zusammenhang mit anaerob induziertem Zelltod in Maiswurzelspitzen wurde eine Ca abhangige Cysteinprotease identifiziert Subbaiah ef ai 2000 In Folge des Abschneidens der Wurzelspitzen vor anaerober Behandlung wurde eine geringere Wurzelsch digung und eine verst rkte Ausbildung von Lateralwurzeln fe
120. eh T F Kim S Y Thomas T L 2002 Molecular characterization of A NAM a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily Plant Mol Biol 50 237 248 Eckhard U Mas Marques A Buckhout T J 2001 Two iron regulated cation transporters from tomato complement metal uptake deficient yeast mutants Plant Mol Biol 45 437 448 Ellis M H Dennis E S Peacock W J 1999 Arabidopsis roots and shoots have different mechanisms for hypoxic stress tolerance Plant Physiol 119 57 64 Feldbrugge M Hahlbrock K Weisshaar B 1996 The transcriptional regulator CPRF 1 expression analysis and gene structure Mol Gen Genet 251 619 627 6 Literaturverzeichnis 116 Fennoy S L Bailey Serres J 1995 Post transcriptional regulation of gene expression in oxygen deprived roots of maize Plant J 7 287 295 Fennoy S L Nong T Bailey Serres J 1998 Transcriptional and post transcriptional processes regulate gene expression in oxygen deprived roots of maize Plant J 15 727 735 Fox T C Guerinot M L 1998 Molecular biology of cation transport in plants Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49 669 696 Franco Obregon A Urena J Lopez Barneo J 1995 Oxygen sensitive calcium channels in vascular smooth muscle and their possibile role in hypoxic arterial relaxation Proc Natl Acad Sci USA 92 4715 4719 Geffers R Cerff R Hehl R 2000 Anaerobiosis specific interactio
121. eichungen der analysierten Interaktionen basiert auf mindestens 6 aber h chstens 9 Messwerten 2 18 Computer gest tzte Analysen Sofern in silico Analysen online durchgef hrt wurden sind die entsprechenden Links der verwendeten Programme nachfolgend aufgef hrt Homologievergleiche wurden mit Hilfe des Blast Programmes der NCBI Datenbank durchgef hrt http www ncbi nim nih gov BLAST wobei Nucleotidsequenzen mit blastn oder blastx und Aminos uresequenzen mit blastp bearbeitet wurden Altschul et ai 1997 Durch 2 Material und Methoden 46 einen Blast Homologievergleich in der TAIR Datenbank http www arabidopsis org Blast wurden IDS4 like Homologe aus Arabidopsis thaliana identifiziert Durch ihre verlinkte Locus Bezeichnung kann mit Hilfe des TAIR Expression Viewers das Expressionsprofil bei abiotischem Stress sofern vorhanden eingesehen werden Die Identifizierung von Signalpeptiden innerhalb der Aminosauresequenzen von ABZ1 und ANA erfolgte durch das Computerprogramm Scanprosite http us expasy org tools scanprosite Um Voraussagen ber die subzellul re Lokalisierung von ABZ1 und ANA treffen zu k nnen wurden ihre Aminos uresequenzen mittels Psort untersucht http psort nibb ac jp form html Multiple Alignments wurden mit ClustalW durchgef hrt http www ch embnet org software ClustaW html w hrend f r die Erstellung des phylogenetischen Stammbaumes von ABZ1 das Programm ClustalX in
122. eion H20 1 mg l Thiamin 10 mg l Myoinositol ausgelegt und mit den entsprechenden Konstrukten Kapitel 2 15 1 1 durch die Partikelkanone transformiert Dazu mussten die Plasmide die die Reportergenfusionskonstrukte tragen auf Goldpartikeln fixiert werden Das Beladen der Goldpartikel erfolgte nach einem Protokoll von Klein et ai 1988 3 mg Goldpartikel Chempur 0 3 3 um wurden mit 100 ul 70 igem Ethanol versetzt resuspendiert Vortex und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Die Goldpartikel wurden 1 Minute bei 1790xg pelletiert Nach Abziehen des berstandes wurden die Goldpartikel in 50 ul ddH20 aufgenommen Vortex und 10 min tige Inkubation bei Raumtemperatur gewaschen Anschie end wurde 1 Minute bei 22xg ungebremst zentrifugiert und die Goldpartikel in 50 ul 50 igem Glycerin resuspendiert Vortex und 10 Sekunden lang im Ultraschallbad behandelt Auf Eis wurden 10 wg der unterschiedlichen NLS Konstrukte Kapitel 2 15 1 1 zugef gt und vorsichtig durchmischt Nach 15 min tiger Inkubation auf Eis wurden 50 ul 2 5 M Cat zum Pr zipitieren der DNA hinzugef gt durchmischt und nach einer weiteren Minute erfolgte die Zugabe von 20 ul kaltem 0 1 M Spermidin zum Schutz der gef llten DNA Nach Durchmischen und 10 min tiger Inkubation auf Eis wurde 15 Sekunden ungebremst bei 22xg zentrifugiert Der berstand wurde abgezogen und die beladenen Goldpartikel wurden zun chst durch vorsichtiges Resuspendieren in 100 ul 70 igem Ethanol un
123. eisten Es w re denkbar dass solche Prozesse im heterologen Zwiebelsystem unter aeroben Bedingungen nur unzureichend ablaufen und ANA deshalb nur teilweise im Nucleus lokalisiert ist Wie in Hefe gezeigt wurde besitzt ANA eine carboxyterminale Aktivierungsdom ne Kapitel 3 2 3 Abb 6 Daher k nnte auf eine Funktion als Transkriptionsaktivator geschlossen werden was auf die meisten der bisher beschriebenen NAC Proteine zutrifft Duval ef at 2002 Ren et al 2000 Allerdings zeigt ANA im Vergleich zur GALA Positivkontrolle eine deutlich geringere Transkriptionsaktivierung des Hefereportergens Diese Beobachtung k nnte auf eine generell relativ schwache transkriptionsaktivierende Wirkung von ANA hindeuten Andererseits k nnte ANA wie CPRF4a dessen DNA Bindungsaktivit t durch Licht beeinflusst wird Wellmer et al 2001 auf Anaerobiose angewiesen sein um eine erh hte Affinit t zu seiner Zielsequenz ausbilden zu k nnen und transkriptionsaktivierend zu wirken Nach transienter Transformation des vollst ndigen NAC1 Proteins in Zwiebelepidermiszellen wird ebenfalls nur eine sehr geringe Aktivierung beobachtet Xie ef ai 2000 w hrend die Aktivierungsdom ne alleine jedoch eine hnlich starke transkriptionelle Aktivierung wie die VP16 Dom ne bewirkt Zus tzlich konnte gezeigt werden dass NAC1 die Expression zweier Auxin responsiver Gene aktiviert Die DNA Bindungsaktivit t und spezifit t von ANA wurde in vitro durch Gelshift
124. ellen durch eine 1 min tige Zentrifugation bei 20000xg geerntet jeweils mit 1 5 ml Z Puffer 16 1 g Na2HPO4 7H20 5 5 g NaH2PO 4 H20 0 75 g KCI 0 246 g MgSO 7H gt 0O pH 7 0 ad 1000 ml ddH20 durch Mischen Vortex und erneute Zentrifugation gewaschen und schlie lich in je 300 ul Z Puffer resuspendiert wodurch eine 5 fache Aufkonzentrierung der Zelldichte erfolgte 100 ul der Zellsuspension wurden abgenommen und die Hefezellen durch 3 maliges Einfrieren in fl ssigem Stickstoff und Auftauen im 37 C Wasserbad aufgeschlossen Als Nullwertprobe wurden 100 ul Z Puffer nachfolgend wie die Proben behandelt Nach Zugabe von 700 ul Z Puffer mit 37 8 mM Mercaptoethanol wurde begonnen die Reaktionszeit zu messen Sofort wurden 160 ul ONPG in Z Puffer 4 mg ml zu den Reaktionen und Blindproben zugef gt und bei 30 C inkubiert bis eine Gelbf rbung der Reaktionen auftrat Solche Reaktionsans tze sowie jeweils eine Blindprobe wurden durch Zugabe von 400 ul 1M NazCO3 abgestoppt und die Reaktionsdauer vermerkt Zum Entfernen der Zelldebris schloss sich eine 10 min tige Zentrifugation bei 20000xg an Nachfolgend wurden die Proben bei einer Wellenl nge von 420 nm in Einmalplastikk vetten gegen die Blindprobe vermessen Die Berechnung der Galactosidaseeinheiten erfolgte nach der Formel B Galactosidaseeinheit 1000 x OD420 t x V x ODeoo t Reaktionszeit min V 0 1 ml x Konzentrierungsfaktor 5 Die Berechnung der Mittelwerte und Standardabw
125. en Dom nen dienen der Bindung von Transkriptionsfaktoren an spezifische DNA Sequenzen Um eine Sequenz spezifische DNA Bindung von ABZ1 nachzuweisen wurde ein sog Random Binding Site Selection RBSS Assay durchgef hrt Kapitel 2 14 1 Unter Verwendung der RBSS Methode sollten ausgehend von einer Population zuf lliger Oligonucleotide diejenigen DNA Sequenzen selektiert und identifiziert werden die potentielle Zielsequenzen f r ABZ1 darstellen Die eingesetzten Oligonucleotide enthielten eine G Box Core Sequenz ACGT sowie 10 flankierende zuf llige Nucleotide Als Annealingsites f r PCR Primer waren 5 und 3 flankierende Linkersequenzen notwendig Nach Zweitstrangsynthese der 3 Ergebnisse 67 Oligonucleotide wodurch gleichzeitig eine radioaktive Markierung der resultierenden Zufallsfragmente erfolgte wurden die DNA Fragmente in einer Bindungsreaktion mit rekombinantem ABZ1 inkubiert Die gebildeten Protein DNA Komplexe wurden in einem nativen 6 5 igen Polyacrylamidgel isoliert die gebundenen DNA Fragmente extrahiert und in einer radioaktiven Polymerasekettenreaktion PCR amplifiziert Die PCR Produkte wurden als Ausgangsmaterial f r eine neue Runde bestehend aus selektiver Bindungsreaktion Aufreinigung und Amplifikation eingesetzt Nach f nf Selektionsrunden wurden die potentiellen Zielsequenzen f r ABZ1 kloniert und sequenziert In Tabelle 7A sind die Sequenzen von 18 der selektierten DNA Bindungsstellen f r ABZ1 sowie
126. en Geweben relativ aktiv Deshalb ist der R ckgang der O2 Konzentration und des Energiestatus unter hypoxischen Bedingungen 7 Einleitung 5 nicht mit der Akkumulation von Lactat oder Ethanol verbunden Geigenberger et al 2000 Die drohende interne Anaerobiose wird durch den adaptiven R ckgang des O2 Verbrauchs verhindert Erst bei einem Oz2 Gehalt von unter 1 ist die Glykolyse stimuliert um der geringen ATP Ausbeute die aus der Fermentation resultiert entgegenzuwirken Die Aktivit t der Cytochromoxidase ist unter Anaerobiose eingeschr nkt die ATP Produktion mittels oxidativer Phosphorylierung inhibiert und ATP muss durch Glykolyse gebildet werden Ricard er a 1994 Offensichtlich verlaufen die Stress Antworten der Pflanzen auf Hypoxia und Anaerobiose entgegengesetzt wobei die Glykolyse bei relativ geringem O2 Defizit zun chst reprimiert unter anaeroben Bedingungen jedoch hochreguliert wird Es ist unwahrscheinlich dass das O2 Defizit direkt inhibierend auf den Elektronentransport der oxidativen Phosphorylierung wirkt da die Oz Konzentration die die koordinierte Runterregulation von Krebszyklus und Glykolyse bewirkt noch oberhalb des Km Wertes der Cytochromoxidase liegt 1 5 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese unter anaeroben Bedingungen Als Antwort auf O2 Mangel reagieren Pflanzen mit einer Umstellung der Genexpression die vermutlich durch ein System zur O2 Signalaufnahme ausgel st wird Geigenberger 2
127. en bzw mit Heterodimeren aus ABZ1 und ABZ 147 138 n mlich ein 3 Ergebnisse 74 schnelleres Laufverhalten zeigen als das an DNA gebundene ABZ1 Homodimer Die mit steigender ABZ147 133 Konzentration abnehmende Signalstarke des ABZ1 RBSS1 Komplexes Spuren 4 6 deutet auf eine Interaktion zwischen Wildtyp und deletiertem Protein hin Dadurch werden ABZ1 Molek le aus der Bindungsreaktion heraustitriert und es werden weniger ABZ1 ABZ1 Dimere gebildet die an die Zielsequenz binden k nnen Dieses Experiment liefert indirekte Hinweise auf eine Dimerbildung von ABZ1 Aus diesen Beobachtungen resultiert einerseits dass der 46 Aminos uren lange N terminale Bereich von ABZ1 nicht an der Protein Protein Interaktion beteiligt ist Andererseits scheint f r eine ABZ1 DNA Interaktion in vitro ein ABZ1 Dimer essentiell zu sein dessen Monomere beide ber die basische DNA Bindungsdom ne verf gen m ssen 12 3 4 5 6 K we e Abb 14 Elektrophoretischer Gelshift Assay zur Identifizierung der DNA Bindungsdom ne von ABZ1 0 05 ng radioaktiv markiertes RBSS1 Fragmente wurde entweder mit oder ohne Zusatz von rekombinantem Protein Spur 1 inkubiert Spur 2 wie Spur 1 nach Zusatz von 1 ug ABZ1 Spur 3 wie e a b ige Spur 1 mit 1 5 ug ABZ147 138 Spuren 4 6 wie Spur 2 nach Zusatz von 1 5 ug 2 1 ug und 2 5 ug ABZ1 E ABZ1147 138 K retardierter Protein DNA Komplex S ABZ147 138 fre
128. en konnte jedoch ein teilweiser Transport von ANA in den Nucleus nachgewiesen werden In Hefe zeigt ANA einen transaktivierenden Effekt der auf eine C terminale Aktivierungsdom ne zur ckzuf hren ist Allerdings betr gt seine transkriptionsaktivierende Wirkung nur ca 23 der Aktivit t des GALA Aktivators was eine relativ schwache Aktivierungswirkung von ANA vermuten l sst 5 Zusammenfassung 111 Obwohl im Gelshift Experiment eine sequenzspezifische Bindungsaktivit t von rekombinantem ANA an den CaMV 35S Promotor nachgewiesen werden konnte f hrt ANA nach Cotransformation mit dem Promotor Reportergen Konstrukt 35S GUS in Tabak unter aeroben Bedingungen nicht zur erwarteten Hochregulation der Aktivit t des 35S Promotors Stattdessen wird bei Coexpression von ANA ein R ckgang der Reportergenaktivit t beobachtet Die Ursachen daf r werden diskutiert und bed rfen weiterer Analysen Die Expression des ABZ1 Gens wird unter anaeroben Bedingungen in Bl ttern Fr chten und Wurzeln gleicherma en stark induziert Sein Transkript verf gt ber einen auffallend langen 5 Leader von 596 Nucleotiden w hrend ABZ1 ein mit 138 Aminos uren relativ kleiner bZIP Faktor ist Die mit 86 h chste Sequenzidentit t zeigt ABZ1 zu BZI 4 einem bZIP Transkriptionsfaktor aus Tabak Durch in silico Analyse der ABZ1 Primarstruktur wurde die charakteristische bZIP Dom ne an zentraler Position im Protein identifiziert Die bZIP Dom ne setzt sich aus e
129. end f r die Subtraktion auf anaerob spezifische Gene aus Tomate Gewebe der gesamten Pflanze eingesetzt wurde einschlie lich Fr chten Bl ttern und Wurzeln wurde die Analyse der Genexpression in Arabidopsis auf die Wurzeln beschr nkt Au erdem wurden unterschiedliche Randbedingungen des Sauerstoffdefizits gew hlt Die f r die SSH eingesetzten Tomatenpflanzen wurden ca 20 Stunden in einer Atmosph re von lt 1 O2 und 20 CO2 inkubiert Im Gegensatz dazu waren die Arabidopsis Wurzelkulturen 30 Minuten 2 4 und 20 Stunden einem Sauerstoffmangel von 5 Ozin Stickstoff ausgesetzt Daher k nnten bestimmte Sauerstoffkonzentrationen der Gehalt der Atmosph re an Kohlendioxid bzw Stickstoff sowie die Dauer der Sauerstoffmangel Bedingungen Gr nde f r eine teilweise unterschiedliche Genexpression sein 4 3 ANA ein Anaerobiose spezifischer Aktivator der Transkription Ein neuer durch Anaerobiose induzierter Transkriptionsfaktor aus Tomate der zur Familie der Proteine mit NAC Dom ne geh rt wurde mittels SSH isoliert ANA Kapitel 3 1 NAC Proteine k nnen in die drei Subfamilien NAM OsNAC3 und ATAF eingeteilt werden die vermutlich unterschiedliche Funktionen haben Kikuchi ef ai 2000 Die ANA Prim rstruktur zeigt starke hnlichkeiten zu bereits untersuchten NAC Faktoren insbesondere zu dem durch Pathogen Befall induzierten Transkriptionsfaktor StNAC aus Kartoffel Collinge und Boller 2001 So verf gt ANA ber eine hoch konservier
130. enthalten eine Schnittstelle f r eine Restriktionsendonuclease Unterstreichung Xhol oder Ncol bzw Sal oder Pagl und sind so konzipiert dass eine translationale Fusion zwischen den 2 Material und Methoden 30 klonierten Proteinfragmenten und der Glucuronidase entsteht Die PCR Ansatze setzten sich grunds tzlich wie in Kapitel 2 13 1 aufgef hrt zusammen Das verwendete Temperaturprogramm bestand nach einer 5 min tigen Vordenaturierung bei 94 C aus 30 Zyklen mit je 1 min tiger Denaturierung bei 94 C und Annealingphase bei 60 C sowie einem 1 Minute und 30 Sekunden andauernden Elongationsschritt bei 72 C bevor eine 10 min tige Endelongation bei 72 C erfolgte Anschlie end wurden die ABZ1 PCR Fragmente mit Xhol Ncol bzw die ANA PCR Fragmente mit SaA Pagl gespalten und unter Einsatz des NucleoSpin Extract Kits von Macherey Nagel aus einem Agarosegel aufgereinigt Die entstanden Fragmente konnten direktionell so in den Xhol Ncol gespaltenen pRT103 GUS Vektor kloniert werden dass ein offener Leseraster mit dem Glucuronidasegen entstand Dabei ist zu beachten dass sowohl Sail und Xhol als auch Pagi und Ncol kompartible Enden aufweisen Um eine korrekte Expression der Fusionsproteine die sich aus einem N terminalen ABZ1 bzw ANA sowie einem C terminalen GUS Anteil zusammensetzen sicherzustellen wurden alle Konstrukte sequenziert In Tabelle 2 sind alle Konstrukte die zur Kernlokalisierungsuntersuchung eingesetz
131. eportergens Glucuronidase GUS kontrolliert Das ca 500 bp gro e CaMV 35S Promotorfragment wurde mit Ncol und Gei aus pRT103 GUS herausgeschnitten und in den ebenso geschnittenen pBT10 TATA GUS Vektor Sprenger Haussels und Weisshaar 2000 kloniert Dadurch wurde der Minimalpromotor des pBT10 TATA GUS Vektors durch den CaMV 35S Promotor ersetzt 2 Material und Methoden 34 pRT101 LUC 2821 Dieser Vektor besitzt ein durch den CaMV 35S Promotor kontrolliertes Luciferasegen und diente der Transformationskontrolle pC1L 1097 3666 Dieser Vektor wurde freundlicher Weise von Dietmar Stahl der Planta GmbH in Einbeck zur Verf gung gestellt Ein 1151 bp gro es genomisches Fragment des cab11 Gens aus der Zuckerr be wurde translational mit dem Luciferasegen aus pluc nos2 fusioniert Das genomische Fragment enth lt eine 1097 bp lange nicht transkribierte Promotorsequenz C1 Promotor die keine G Box core Sequenzen aufweist GenBank Acc No AX449166 pC1L 1097 diente als Plasmid zur Transformationskontrolle pVKH C1 pA1 pVKH C1 ABZ1 pA1 pVKH C1 GAL4AD ABZ1 pA1 3776 3777 3778 Zun chst wurde der C1 Promotor durch Hinalll Spaltung von pC1L 1097 Auff llen der Enden und eine anschlie ende Spaltung mit BamHI aus pC1L 1097 herausgeschnitten Das C1 Fragment konnte direktionell in pVKH 35S pA1 pVKH 35S ABZ1 pA1 und pVKH 35S GAL4AD ABZ1 pA1 Sad Auff llen der Enden SamHl kloniert werden wodurch der 35S Promotor der Effekto
132. er Interaktionspartner von ABZ1 und enth lt eine Gs Dom ne 85 LeACO5 ein neues Mitglied der ACC Oxidase Genfamilie aus Tomate 88 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 4 8 4 8 1 4 8 2 4 8 3 7 1 7 2 7 3 1 7 3 2 7 4 7 5 7 6 7 7 DISKUSSION DEE 91 Effizienz der SSH Methode anced aaa eed nee 91 Gegen berstellung anaerob induzierter Gene aus Tomate und Arabidopsis 91 ANA ein Anaerobiose spezifischer Aktivator der Transkription 93 ABZ1 ein Mitglied der S Klasse von bZIP Faktoren 96 DNA Bindungsspezifit t von ABZ1 A 97 Aspekte der Homo und Heterodimerisierung von ART 99 ABZ1 ein anaerob spezifischer Repressor der Transkription 100 ABZ1 InteraktionSPartner none nee 102 AIL ein potentiell durch Eisenmangel induziertes Protein und seine Bedeutung f r Anaderobiose uses die 105 AIL als Komponente der anaeroben Signaltransduktion gt 106 Eine neue anaerob spezifische ACC Oxidase aus Tomate nsseeneeeeeeeeeen 107 ZUsammenfassung EEN 110 Literaturverzeichnis u 0 ea 113 Anhand EET E 128 Yeast Two Hybrid Analyse der ANA Aktivierungsdom ne nen 128 Funktionelle Analyse von ANA durch transiente Coexpression 129 Funktionelle Analyse von ABZ1 im transienten System unter CaMV 35S Kontrolle se ia 130 Funktionelle Analyse von ABZ1 im transienten System unter C1 Kontrolle 131 Vergleich der aeroben und anaerobe
133. erden in ein 301 Aminos uren gro es Protein translatiert ANA Mit Hilfe des entsprechenden DNA Strider 1 3f15 Computer Tools konnte das theoretische Molekulargewicht von ANA mit 34 8 kDa und sein pKi Wert mit 8 22 bestimmt werden Die 5 UTR besteht aus 137 Basenpaaren w hrend sich die 3 UTR aus 269 Basenpaaren zusammensetzt Das SSH Fragment ist 355 Basenpaare lang 802 1156 unterstrichene Nucleotidsequenz und entspricht den C terminalen 239 Basenpaaren der codierenden Sequenz und den in A Richtung angrenzenden 116 Basenpaaren der nicht translatierten Region Mittels BLAST Search wurde ein Homologievergleich der ANA codierenden Sequenz sowohl auf Nucleotid als auch auf Aminos ureebene durchgef hrt Diese Analyse best tige das Ergebnis des mit dem SSH Fragment 172 durchgef hrten Homologievergleichs Kapitel 3 1 Die 301 Aminos uren lange Sequenz weist eine 97 ige Identit t zu einem putativen Protein mit NAC Dom ne aus Solanum tuberosum auf Collinge und Boller 2001 Accession number CAC42037 1 Abbildung 4 stellt au erdem den aus der Aminos uresequenz resultierenden strukturellen Aufbau von ANA dar Die NAC Dom ne befindet sich im N terminalen Bereich des ANA Fettdruck umfasst die Aminos uren 11 bis einschlie lich 164 und kann in f nf hoch konservierte Subdom nen Farbdruck unterteilt werden Collinge und Boller 2001 In einem DNA Bindungsaktivitatstest in Hefe konnten Duval ef a 2002 3 Ergebnisse 53 zeigen
134. ersuchsans tze resultiert dass der ABZ1 Transkriptionsfaktor reprimierend auf den CaMV 35S Promotor im transienten Tabaksystem Jo vivo k nnte ABZ1 also als Repressor wirken der die Genexpression unter Anaerobiose herunterreguliert A 3000 B 1000 T 998 5 900 3256 5 10015 3 2500 amp 800 o E 1056 E 700 2000 t 1670 568 1 D i 5 600 550 es s05 7 43 1500 5 500 O 5 1039 Se 00 338 5 1000 a004 3 3 lt d 200 2 500 z oO 100 0 0 Effektor 35S ABZ1 35S GAL4 ABZ1 Effektor C1 ABZ1 C1 GAL4 ABZ1 Reporter 35S GUS 35S GUS 35S GUS Reporter 35S GUS 35S GUS 35S GUS Anz Me w 10 10 12 Anz Me w 8 7 8 Abb 16 Cotransformations Experiment zur Untersuchung des Einflusses von ABZ1 auf den CaMV 35S Promotor Blattmaterial von Tabak wurde transient durch die Partikelkanone mit einem Effektor einem Reporter und einem Kontrollplasmid cotransformiert Die Expression des Effektors wird durch den 35S Promotor A oder den C1 Promotor B reguliert Nach aerober Inkubation wurde die Reportergen Aktivit t in einem quantitativen B Glucuronidase Test bestimmt und relativ zur Expression des Kontrollplasmids quantifiziert Die Anzahl der zur Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichungen einbezogenen Me werte ist angegeben Die Mittelwerte der gemessenen GUS Aktivit ten sowie ihre Standardabweichungen sind in pmol 4 MU min 1 mg Protein aufgetragen Plasmid ohne Effektor aber mit entspr
135. g PCD ele eer Prozesse entgegenwirken Erhalt der Schutz vor post Bildung von Optimierter anaeroben ATP anoxischer Lentizellen u reduzierter Produktion Sch digung Aerenchym Metabolismus III Uberleben von Anaerobiose Vermeiden von Anaerobiose Abb 1 Schematische Darstellung der pflanzlichen Antworten auf O2 Mangel nach Geigenberger Effizientere Energienutzung 2003 ver ndert Der R ckgang der internen O2 Konzentration wird von Pflanzen aufgenommen und f hrt zu adaptiven Reaktionen die entweder zum berleben unter anaeroben Bedingungen oder zur Vermeidung von Anaerobiose beitragen ROS reactive oxygen species PCD programmed cell death 1 4 Energiemetabolismus unter geringen Sauerstoffkonzentrationen Parallel zum R ckgang der internen O2 Konzentration bis zu 1 sinkt das ATP ADP Verh ltnis in Pflanzengeweben Geigenberger ef ai 2000 van Dongen ef al 2003 Gibon ef ai 2002 Dies ist die Folge eingeschr nkter Respiration und f hrt somit zur Restriktion der ATP verbrauchenden metabolischen Aktivit t sowie zu r ckl ufigem Sauerstoffbedarf unter Hypoxia Abb 1 Allerdings steigt der Redox Zustand NADH NAD bei sinkenden intrazellul ren O2 Konzentrationen von Uber 1 die also noch oberhalb derer liegen die zu Fermentation f hren nicht an Geigenberger ef al 2003 Offensichtlich bleibt der aerobe Metabolismus bei verringerten intrazellularen O2 Konzentrationen bis zu 1 O2 in verschieden
136. g ezez p9 9ror zsz zz e SNn9 SS YNY SSE EZ Age eC eg 66 700S ZZ L80S Zzoz esr seiz vr o ge ezoz eg 969 ep L t SN9 SSE YNY SSE 6 677 See ENT ST LG ZEZL vg riel ezi ese ec so o 8zs e 6s eeez vzs er SNO SSE YNY SSE v6Z19 90877 019929 ES 1989 eZee pres ogec ZEO ve rzes SZ 929 Ber SNO SSE 98 788 95 987 500202 229602 Jeng zees zzez z o gerzoer eszes poz cot sno sse KEN IP LOL ve IELE LO p2ZE elle zoel vse oro ago ze ceee ves ose sno sse LZZ EE 18 787 66 OLL oo esze Cer Zesp gooe 90rl ez o gz oege zs eges rezi ezr SNO SSE mgejs pamp l bu uw Dw uw LB HA bu UAT Seng ene Seng niy ont on ont Dir aqold NIN F owd Dt oudl a ny Ping ula 01d sno sno Juuee6 JepueUIe uoa ou eyeddop eule Yyounp pulis UepinAn pynzabyonp uebe ueyolipelyossejun ue of ejuewuedxg 197 67 dey Veto epinm yeynppy esepiuoinonig g ad JE Ce 7 dey Lelwucysuenos jeuereupeijg yege ul euoueyjeypleg ap YoINp YNW SGE Jopfeyg Hu Jepo euyo Jepemyue epinm SNO Sge Pingsuoylenodey up UdISseldx90D eeteugI YOJNP YNY UOA SsAleuy ajjeuonyuny Z 7 130 7 Anhang S9 Lor L6bL ve ral SZ AL SL llonuoy Vaz vas VEL LL9z6Z 6LL L 0 Slonuo Sno sno HOH ny D eem Seat ore sz zzes veze vezi vossene pts mi salles e b EI 3 d sno
137. gabe von unspezifischem Kompetitor in 100000 fach molarem berschu ebenfalls eine reduzierte Bindungsaffinit t von ABZ1 an RBSS8 und RBSS9 auf Spuren 16 und 19 Die potentiellen Zielsequenzen RBSS8 und RBSS9 enthalten eine halbe G Box wobei RBSS8 zus tzlich sogar ein Thymin an 3 Ergebnisse 70 Position 3 und RBSS9 ein Thymin an Position 5 tr gt Allerdings besitzt RBSS8 kein Guanin oder Thymin an Position 5 und RBSS9 weist kein Thymin an Position 3 auf Daraus wird geschlossen dass das Thymin an Position 3 sowie ein Guanin oder Thymin an Position 5 eine wichtige Rolle f r die Sequenz spezifische Bindung von ABZ1 an halbe G Box Sequenzen spielen Liegen hingegen palindromische G Boxen vor scheint ABZ1 kein Thymin an Position 3 f r eine Sequenz spezifische DNA Bindung zu ben tigen RBSS1 1 und RBSS5 RBSS10 1 wurde als Kontrollfragment eingesetzt um zu zeigen dass ABZ1 nicht mit DNA Fragmenten interagiert die keine ACGT Core Sequenz enthalten Spuren 23 25 Zusammenfassend ist festzustellen dass das rekombinante ABZ1 im Gelshift Experiment spezifisch an verschiedene G Box Sequenzen bindet Dabei variiert die Bindungsaffinit t und spezifit t mit den die Core Sequenz flankierenden Nucleotiden Neben der ACGT Core Sequenz scheinen auch ein Guanin oder Thymin an Position 5 sowie ein Thymin an Position 3 f r eine Interaktion wichtig aber nicht essentiell zu sein 13 14 15 16 17 18 19 23 24 25 ai wa P a tle ela
138. gation bei 6500xg und 4 C denaturiert und entfernt Nach langsamer Zugabe des 0 25 fachen Volumens an Ethanol und Extraktion mit einem Volumen Chloroform Isoamylalkohol 24 1 wurde erneut bei 6500xg und 4 C zentrifugiert Die RNA wurde durch den Zusatz von einem 0 25 fachem Volumen an 10 M LiCl zum 2 Material und Methoden 17 Uberstand ber Nacht bei 0 C pr zipitiert Durch eine 30 min tige Zentrifugation bei 6500xg und 4 C wurde die RNA pelletiert im 0 25 fachen Volumen der ursprunglichen Pflanzenmaterialeinwaage an 50 C warmem SSTE Puffer 1 M NaCl 0 5 v v SDS 10 mM Tris HCI pH 8 0 1 mM EDTA pH 8 0 resuspendiert und erneut durch Zugabe des 2 fachen Volumens an Ethanol zwei Stunden bei 20 C pr zipitiert Abschie end wurde die RNA 40 Minuten bei 38000xg und 4 C pelletiert mit 7O igem Ethanol gewaschen getrocknet und in ddH20 aufgenommen Die Lagerung der RNA erfolgte bei 80 C 2 10 2 PolyA mRNA Isolierung F r die Isolierung von PolyA mRNA wurde 1 mg Gesamt RNA unter Verwendung des Oligotex mRNA Midi Kits von Qiagen eingesetzt Die Durchf hrung der PolyA mRNA Aufreinigung erfolgte gem dem Herstellerprotokoll Die Ausbeute an isolierter PolyA mRNA betrug 5 ug 2 10 3 Konzentrationsbestimmung von RNA Die Konzentration isolierter RNA wurde bei einer Wellenl nge von 260 nm gegen eine Nullwertprobe photometrisch bestimmt Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech Dabei entspricht 1 OD einer RNA Konze
139. gekennzeichnet ClustalW Kapitel 2 18 Alle Mitglieder der Fe ll Ascorbat Familie der Dioxygenasen besitzen neun Aminos urereste die hoch konserviert sind Unterlegung Lasserre et ai 1996 Es wird deutlich dass sich LeACOS5 neben ihrer Gr e auch hinsichtlich ihrer Primarstruktur am st rksten von den anderen ACC Oxidasen unterscheidet Die h chste Sequenzidentit t 50 erreicht sie im Vergleich mit LeACO4 Der putative Leucin Zipper von LeACO5 der vermutlich zu ihrer Interaktion mit ABZ1 beitr gt liegt im Bereich von Aminos ure 101 bis 136 der vollst ndigen codierenden Sequenz Fettdruck Durch Vergleich dieser Region mit den entsprechenden Aminos uren der anderen ACC Oxidasen wird festgestellt dass das erste Isoleucin und das im Abstand von 7 Aminos uren folgende Leucin spezifisch f r LeACOS sind Die drei Leucine die nach einem 13 Aminos uren langen Spacer im Leucin Zipper Motiv auftreten sind jedoch in allen f nf ACC Oxidasen hoch konserviert rot Fettdruck Die vergleichende Sequenzanalyse zeigt dass es sich bei LeACO5 um eine f nfte ACC Oxidase aus Tomate handelt
140. h ngigkeit vom eingesetzten Template und den verwendeten Primern Die einzelnen Annealingtemperaturen betrugen f r ABZ1 und ABZ11 100 55 C f r ANA 62 C und f r ABZ 147 138 65 C Die PCR Produkte wurden in pCR 2 1 kloniert Kapitel 2 11 sequenziert und anschlie end ber geeignete Restriktionsschnittstellen so in pQE 30 subkloniert dass ein offenes Leseraster mit dem 6xHis Tag entstand In Tabelle 1 sind die eingesetzten Restriktionsendonucleasen deren Schnittstellen mit den PCR Primern eingef hrt worden waren aufgef hrt Die Transformation der rekombinanten pQE 30 Plasmide in M15 pREP4 E coli Zellen erfolgte gem dem The QlAexpressionist Handbuch von Qiagen Aufgrund eines in E coliselten auftretenden Codons AGG Arginin 0 2 o das mit einer H ufigkeit von 72 f r die Expression von ABZ1 sowie seiner beiden Deletionsmutanten ben tigt wird mussten diese Proteine in einem anderen E coli Wirtsstamm exprimiert werden Die entsprechenden rekombinanten pQE 30 Plasmide wurden also zusammen mit dem Repressorplasmid pREP4 in BL21 CodonPlus DE3 RIL E coli Zellen Stratagene cotransformiert Dieser Stamm verf gt ber das pACYC Plasmid das eine Resistenz gegen Chloramphenicol vermittelt und zus tzliche Kopien der argU ileY und leuW tRNA Gene enth lt Die Induktionsbedingungen f r ABZ1 ANA ABZ11 100 und ABZ147 133 entsprachen den Empfehlungen von Qiagen 5 ml einer ber Nacht Kultur wurden in 100 ml frisches LB
141. h induziert Die Bedeutung der LeACO5 als neuem Mitglied der ACC Oxidase Familie in Tomate ist noch ungeklart Aufgrund seiner h chsten Homologie zu LeACO4 k nnte LeACO5 m glicherweise funktionell hnlich wie LeACO4 wirken Sollte die Transkription von LeACO5 ebenfalls durch positive Feedback Regulation des Ethylens kontrolliert werden so k nnte die Interaktion von ABZ1 mit LeACO5 der Feinregulation der Ethylensynthese dienen Nach Interaktion mit ABZ1 w re LeACO5 nicht mehr in der Lage mit seinem katalytischen Zentrum an ACC zu binden Als Folge w rde die Ethylensynthese reduziert und die positive Feedback Regulation unterbrochen werden ABZ1 w rde dann als Regulator der 4 Diskussion 109 Ethylensynthese im Cytosol aktiv sein Demnach ware der ABZ1 Faktor zusatzlich zur Transkriptionskontrolle unerwarteterweise auch in die Regulation der Synthese von Sekund rmetaboliten involviert Dieser spekulative Regulationsmechanismus w rde auf einer Protein Protein Interaktion beruhen die durch die Leucin Zipper Dom nen von ABZ1 und LeACO5 vermittelt wird In zahlreichen 2 Oxoglutarat abh ngigen Dioxygenasen bilden putative Leucin Zipper einen Teil ihrer konservierten amphipatischen o Helix Lukacin et a 2000 Allerdings stellen diese das katalytische Zentrum des Enzyms dar und in Cross linking Experimenten wurde gezeigt dass sie nicht zur Interaktion mit anderen Peptiden zur Verf gung stehen Roach ef ai 1995 Da im Yeast Two Hybrid
142. hate driven reactions of intermediary metabolism Biochm Biophys Acta 1141 29 36 Dennis E S Dolferus R Ellis M Rahman M Wu Y Hoeren F U Grover A Ismond K P Good A G Peacock W J 2000 Molecular strategies for improving waterlogging tolerance in plants J Exp Bot 51 89 97 De Vetten N C Ferl R J 1995 Characterization of a maize G box binding factor that is induced by hypoxia Plant J 7 589 601 De Wet J R Wood K V DeLuca M Helinski D R Subramani 1987 Firefly luciferase gene structure and expression in mammalian cells Mol Cell Biol 7 725 737 Diatchenko L Lau Y F C Campell A P Chenchik A Mogadam F Huang B Lukyanov S Lukyanov K Gurskaya N Sverdlov E D Siebert P D 1996 Suppression subtractive hybridization A method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries Proc Natl Acad Sci USA 93 6025 6030 Dolferus R Jacobs M Peacock W J Dennis E S 1994 Differential interactions of promoter elements in stress responses of the Arabidopsis Adh gene Plant Physiol 105 1075 1087 Drew M 1997 Oxygen deficiency and root metabolism injury and acclimation under hypoxia and anoxia Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 223 250 Drew M C He C J Morgan P W 2000 Programmed cell death and aerenchyma formation in roots 7rends Plant Sci 5 123 127 Duval M Hsi
143. iae exprimiert wird w hrend ein anderes Gen oder cDNA Fragmente Prey Beute mit der GALA Aktivierungsdomane AD fusioniert werden Interagieren Bait und Prey Fusionsproteine in einem Hefereporterstamm geraten DNA BD und AD in raumliche Nahe zueinander und aktivieren die Transkription der folgenden vier Reportergene den beiden Nahrstoffmarkern ADE2 und H S3 sowie den zwei Enzym codierenden Genen MEL7 und lacZ 2 Material und Methoden 40 2 17 1 Konstrukte der Yeast Two Hybrid Untersuchungen Die Plasmidbezeichnungen sowie die entsprechenden Labor internen DNA Nummern der Yeast Two Hybrid Konstrukte sind in Tabelle 4 Spalte 1 aufgef hrt Dabei geben die tiefergestellten Zahlen die Aminos urepositionen der klonierten Proteinbereiche von ABZ1 und ANA an Die Bait und Prey Fragmente wurden mittels PCR mit den vollst ndigen cDNA Klonen von ABZ1 und ANA als Template amplifiziert Kapitel 2 13 1 Die verwendeten Primerpaare sind mit Bezeichnung Labor interner DNA Nummer und Sequenz in Tabelle 4 Spalte 2 und 3 aufgef hrt Die eingef hrten Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen w hrend die cDNA spezifischen Sequenzbereiche fett gedruckt sind Die Annealingtemperatur betrug f r das ABZ147 138 Fragment 50 C w hrend die Primer zur Amplifikation des ANA za Konstruktes bei 62 C und die der ANA ee Sequenz bei 66 C annealten Mit Hilfe des T A Klonierungskits von Invitrogen wurden die PCR Produkte zun chst in pCR 2 1 klo
144. iagen Invitrogen Sephadex G 50 Medium Pharmacia Biotech 2 3 Radiochemikalien a 32P dCTP 3000Ci mmol Hartmann Analytic 2 4 Autoradio und Fotografiematerialien R ntgenfilme X OMAT AR Kodak Pharmacia Biotech R ntgenfilme Hyperfilm MP Pharmacia Biotech 2 5 Enzymsysteme und Reagenzs tze Kits Alle eingesetzten Restriktionsendonucleasen und DNA modifizierenden Enzyme CIAP Klenow Fragment T4 DNA Ligase T4 DNA Polymerase wurden sofern nicht gesondert beschrieben von der Firma MBI Fermentas bezogen Nachfolgend sind die verwendeten Kits mit Herstellerangabe und Katalognummer aufgef hrt 2 Material und Methoden 14 Kit NucleoSpin Plasmid NucleoSpin Extract NucleoBond AX 100 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning with Gateway Technology ElectroMAXT DH10B Competent Cells TA Cloning Kit AutoRead Sequencing Kit Anaerocult CLONTECH PCR Select cDNA Subtraction Kit MATCHMAKER Library Construction amp Screening Kit QlAquick PCR Purification Kit Oligotex mRNA Midi Kit HexaLabel DNA Labeling Kit QlAprep Spin Miniprep Kit QlAquick Gel Extraction Kit BL21 CodonPlus Competent Cells Hersteller Macherey Nagel Macherey Nagel Macherey Nagel Invitrogen Invitrogen Invitrogen Pharmacia Biotech Merck Clontech Clontech Qiagen Qiagen MBI Fermentas Qiagen Qiagen Stratagene 2 6 Verwendete Bakterien und Hefestamme Es
145. iche Sequenz dient in der nachfolgenden LD PCR long distance PCR als eine der beiden universellen Primerbindungsstellen SMART Ill CDS Ill um die cDNA Sequenzen zu amplifizieren Die Zyklenzahl der LD PCR betrug 23 Nachfolgend wurden die PCR Produkte ber eine S ule chromatographisch aufgereinigt Dadurch wurde auf cDNA Molek le selektiert die gr er als 200 bp waren 2 17 3 Screen auf ABZ1 Interaktionspartner Der Screen der Yeast Two Hybrid Bank auf ABZ1 interagierende Proteine bzw Dom nen erfolgte durch Cotransformation im Wesentlichen gem dem MATCHMAKER Library Construction amp Screening Kit Handbuch PT3529 1 von Clontech Zun chst wurden kompetente AH109 Hefezellen die bereits das Bait Plasmid PGBKT7 ABZ 147 138 enthielten vorbereitet Kapitel 2 17 1 und 2 17 4 Dann wurde die gesamte 2 Material und Methoden 42 doppelstrangige cDNA mit 3 ug Sma linearisiertem pGADT7 Rec Vektor unter Zugabe von 200 ug denaturierter Heringssperma DNA in 600 ul kompetente Zellen cotransformiert Reparaturenzyme der Hefe zirkularisiieren das GAL4 AD Expressionsplasmid durch Rekombination der cDNA SMART III und CDS Ill Enden mit homologen Vektorsequenzen 200 ul Aliquots des Transformationsansatzes wurden auf QDO Platten Quadruple Dropout Medium SD Ade His Leu Trp gem Yeast Protocols Handbook von Clontech die einen Durchmesser von 15 cm hatten ausplattiert und 5 Tage lang bei 30 C inkubiert Um die Transformat
146. ie Glucuronidase Aktivit ten der Cotransformations Versuche zusammengefa t Die Anzahl der Me werte die zur Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichungen herangezogen wurden sind f r jedes einzelne Experiment aufgef hrt Anhang 7 3 1 und 7 3 2 Die Cotransformation der 35S ABZ1 und 35S GUS Konstrukte f hrt zu einer verringerten GUS Expression im Vergleich zur Transformation ohne Effektor Abb 16A vgl 35S GUS mit 35S ABZ1 35S GUS In Gegenwart von ABZ1 zeigt der 35S Promotor eine um ca 40 reduzierte Aktivit t Wird ein Fusionskonstrukt aus der GAL4 Aktivierungsdom ne aus Saccharomyces cerevisiae und ABZ1 als Effektor 35S GAL4 ABZ1 cotransformiert wird eine gesteigerte GUS Expression im Vergleich zum Ansatz mit 35S ABZ1 beobachtet Abb 16A vgl 35S GAL4 ABZ1 35S GUS mit 35S ABZ1 35S GUS Abbildung 16B zeigt die Ergebnisse des zweiten Cotransformations Experimentes in dem die Expression des Effektors durch den C1 Promotor kontrolliert wird Die Coexpression von C1 ABZ1 und 35S GUS 3 Ergebnisse 77 verursacht im Vergleich zum Ansatz ohne Effektor wiederum eine Abnahme der Reportergenexpression Abb 16B vgl 35S GUS mit C1 ABZ1 35S GUS Infolge der Cotransformation des 35S GUS Konstrukts mit einem Fusionskonstrukt zwischen der GAL4 Aktivierungsdomane und ABZ1 wird ein Anstieg der GUS Aktivitat verzeichnet Abb 16B vgl C1 ABZ1 35S GUS mit C1 GAL4 ABZ1 35S GUS Aus den Ergebnissen dieser beiden unabh ngigen V
147. ie Partikelkanone mit einem Reporter und einem Kontrollplasmid transformiert Nach aerober bzw anaerober Inkubation wurde die Reportergen Aktivitat in einem quantitativen B Glucuronidase Test bestimmt und relativ zur Expression des Kontrollplasmids quantifiziert Die GUS Aktivitat des anaerob inkubierten Blattmaterials ist relativ zur Aktivitat des aeroben Blattmaterials in Prozent sowie unter Angabe der entsprechenden Standardabweichungen aufgetragen 3 3 11 Die Effekte der Anaerobiose auf den CaMV 35S Promotor in transgenen Tomatenpflanzen sind heterogen Der reprimierende Effekt der Anaerobiose auf den 35S Pomotor der in transient transformiertem Blattmaterial von Tabak und Tomate beobachtet wurde Kapitel 3 3 10 sollte im transgenen System untersucht werden Gesamt RNA aus aerob und anaerob inkubierten transgenen Tomatenpflanzen die das Glucuronidasegen unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors enthielten 35S GUS wurde mit einem 540 bp gro en Hindi Fragment des GUS Gens aus pRT103 GUS als Sonde hybridisiert Kapitel 2 10 Es wurden f nf transgene Linien die das Konstrukt 35S GUS trugen sowie eine Linie mit einem transformierten GapC4 GUS Konstrukt als Kontrolle untersucht In transient transformierten Mais Suspensionszellen sowie in stabil transformierten Kartoffel und Tabakpflanzen vermittelt der GapC4 Promotor aus Mais eine starke anaerob spezifische Genexpression K hler et at 1995 B low ef al 1999 Geffers ef ai 2000
148. ie Sonde 3 3 8 ABZ1 bildet n vitro Dimere Bisher konnten nur indirekte Hinweise auf eine Dimerisierung von ABZ1 erhalten werden Kapitel 3 3 7 Die Experimente zur DNA Bindung von ABZ1 setzen jedoch eine Dimerbildung voraus Kapitel 3 3 4 Daher sollte die Fahigkeit von ABZ1 zur Dimerisierung n vitro durch ein weiteres Gelshift Experiment gezeigt werden in dem das gebildete Dimer direkt nachgewiesen wird Kapitel 2 14 3 Fur diese Analyse auf Dimerbildung wurde rekombinantes und aufgereinigtes Wildtyp ABZ1 sowie eine Mutante von ABZ1 eingesetzt ABZ11 100 Kapitel 2 13 Die Mutante 3 Ergebnisse 75 zeichnet sich durch die Deletion des C Terminus von ABZ1 aus wodurch ein Protein entsteht das die 100 N terminalen Aminos uren von ABZ1 enth lt ABZ11 100 verf gt also ber die basische DNA Bindungsdom ne sowie den Leucin Zipper zur Protein Protein Interaktion Als radioaktiv markiertes DNA Fragment wurde RBSS1 eingesetzt das als Zielsequenz f r ABZ1 aus dem Random Binding Site Selection Assay hervorgegangen war Kapitel 3 3 4 Die Auftrennung der Reaktionsans tze erfolgte im nativen 9 igen Polyacrylamidgel Abbildung 15 zeigt das Autoradiogramm der aufgetrennten Protein DNA Bindungsans tze Der Reaktionsansatz der lediglich die Sonde ohne Zusatz von Proteinen enth lt f hrt zu keinem retardierten Komplex so dass ausschlie lich die freie Sonde detektiert wird S ABZ1 und ABZ11 100 binden an das RBSS1 Fragment Spuren
149. iellen Transkriptions und Translationsvorg nge unter Sauerstoffmangel Durch Einsatz der Suppression Subtractive Hybridization SSH wurden Gene identifiziert deren Transkription unter anaeroben Bedingungen induziert ist Unter den anaerob aktivierten und isolierten Genen sind viele deren Funktion als Proteine des anaeroben Metabolismus bereits bekannt ist Diese sind berwiegend in den Kohlenstoffmetabolismus der Glykolyse und der Fermentation involviert Au erdem konnten Komponenten der Signaltransduktion und der Genexpression identifiziert werden So wurden u a zum ersten Mal ein anaerob induzierter Transkriptionsfaktor mit NAC Dom ne ANA sowie ein anaerob spezifischer bZIP Transkriptionsfaktor ABZ1 aus Tomate isoliert Diese wurden strukturell und funktionell analysiert wobei der Schwerpunkt auf den Untersuchungen von ABZ1 lag Die Expression des ANA Gens wird anaerob spezifisch pr ferentiell in den Bl ttern von Tomatenpflanzen induziert Das 301 Aminos uren gro e NAC Protein ANA weist im Homologievergleich eine 97 ige Sequenzidentit t zu StNAC auf einem NAC Protein aus Kartoffel das durch Pathogeninfektion induziert wird Die in silico Analyse zeigt dass die hoch konservierte und charakteristische NAC Dom ne den N Terminus von ANA umfasst und ANA kein typisches Signalpeptid zur Kernlokalisierung besitzt Durch histochemische Untersuchungen von Zwiebelepidermiszellen nach transienter Expression von ANA GUS Fusionsprotein
150. iert eine Oxidase die die Produktion von H gt O katalysiert H202 stellt einen Second messenger der induzierten ADH Expression dar Dabei scheint eine erh hte Konzentration an Ca wichtig zu sein das vermutlich von der Oxidase gebunden wird Die Ethylensynthese ist in Wurzeln durch Hypoxia stark gef rdert wird aber durch anaerobe Bedingungen blockiert weil f r die Reaktion von ACC zu Ethylen Sauerstoff ben tigt wird He et ai 1996 Die Rolle von Ethylen in der Signalweiterleitung die w hrend der Aerenchym Bildung zum Zelltod f hrt impliziert ebenfalls Ca als Second messenger Drew ef a 2000 In tierischen Zellen existiert eine Vielzahl von Mechanismen zur O2 Signalaufnahme Diese verf gen ber ATP sensitive K Kan le die auch in Arabidopsis gefunden wurden Thomine ef ai 1995 sowie O gt sensitive Kt und Ca Kan le Franco Obregon ef al 1995 Eine m gliche Bedeutung dieser Sensoren f r die Reaktionen auf geringe O2 Verf gbarkeit ist in h heren Pflanzen noch unklar 7 Einleitung 4 Sinkende interne Sauerstoffkonzentration Oxy Hypothetischer Apo Protein Sensor oe a Deoxy Promotor yea o elemente Kane Inhibierung der 2 TGGTTT Respiration Mitochondrium mstellung der Genexpression S Induktion von Induktion Enzymen die E ibi f thylen F Inhibierung ATP fermentativer ROS und anstieg Eet dere verbrauchender Enzyme Ansauerun
151. igung des Primerdesigns zur Amplifikation der ANA NAM Dom ne wurde der N Terminus von Aminos ure 1 bis 136 mit dem GUS Gen translational fusioniert ANA4 136 GUS Zur Kontrolle auf nicht vorhandene Kernlokalisierung wurde pRT103 GUS transformiert Nach GUS Anf rbung der transformierten Zwiebelepidermiszellen konnte die Lokalisierung der Fusionsproteine im Mikroskop festgestellt und aufgenommen werden Kapitel 2 15 1 3 Durch eine zus tzliche DAPI F rbung und Anregung des Fluorochroms bei einer Wellenl nge von 360 370 nm wurden die Zellkerne nachgewiesen um eine eventuelle Lokalisierung der Fusionsproteine im Zellkern zu best tigen Abbildung 5 zeigt dass das GUS Protein allein zu einer gleichm igen Verteilung der GUS F rbung innerhalb des Cytoplasmas f hrt Nach Transformation der beiden ANA Deletionskonstrukte die GUS Fusionsproteine mit 76 ANA1 76 GUS bzw 136 ANA ze GUS N teminalen Aminos uren des ANA exprimieren wird wie bei der Negativkontrolle GUS eine cytoplasmatische GUS F rbung beobachtet Wird jedoch eine mit ANA1 301 GUS transformierte Epidermiszelle betrachtet so f llt zus tzlich zur cytoplasmatischen GUS F rbung eine Konzentrierung des Fusionsproteins im Zellkern auf Dieses Ergebnis deutet darauf hin dass ANA im N terminalen Bereich bis einschie lich Aminos ure 136 kein Signalpeptid besitzt das f r eine Kernlokalisierung ausreichend w re Diese Beobachtung deckt sich mit dem Ergebnis der in silico An
152. ihre Labor internen Bezeichnungen aufgef hrt Spalte 1 RBSS Nr Ausgehend vom Zentrum der palindromischen Core Sequenz sind die einzelnen Nucleotidpositionen in 5 bzw 3 Richtung von 0 bis 6 bzw von 0 bis 6 durchnummeriert Martinez Garcia ef a 1998 Alle potentiellen ABZ1 Zielsequenzen au er Sequenz RBSS 10 1 verf gen ber die zentrale G Box Core Sequenz Tab 6A rot Die flankierenden Sequenzen spiegeln die Bindungsspezifit t des ABZ1 Transkriptionsfaktors wieder Besonders h uftig tritt an der Position 2 oder an den Positionen 2 und 3 Guanin auf das zusammen mit der Core Sequenz halbe G Boxen darstellt Die Sequenzen der Klone RBSS1 1 6 5 1 und 5 weisen zus tzlich an der Position 2 oder den Positionen 2 und 3 Cytosin auf so dass palindromische G Box Sequenzen vorliegen Weiterhin ist Thymin h ufig an Position 3 sowie Guanin an Position 5 vertreten Anhand der H ufigkeit mit der jedes Nucleotid an jeder einzelnen Position des betrachteten Sequenzabschnittes auftritt kann eine Matrize erstellt werden Die f r die Zielsequenzen von ABZ1 berechnete Matrize ist in Tabelle 7B dargestellt Die Matrize bildet die Grundlage zur Erstellung der Consensus Sequenz Das Vorgehen beim Aufstellen der Consensus Sequenz entspach folgenden Richtlinien unter Einsatz des IUPAC Codes Cavener 1987 IUPAC IUB Commission on Biochemical Nomenclature 1971 Kommt ein Nucleotid an einer Position mit einer Frequenz von mindestens 50 u
153. inem Bereich mit einem hohen Anteil basischer Aminos uren und einem C terminal benachbarten Leucin Zipper zusammen Der Leucin Zipper besteht aus 5 Leucinen und einem Isoleucin die in einem Abstand von exakt 7 Aminos uren auftreten Ein zweigeteiltes Signalpeptid zur Kernlokalisierung konnte experimentell auf die Aminos uren 25 bis 44 die innerhalb der basischen Region liegen eingeschr nkt werden Die aus einem Random Binding Site Selection Assay hervorgegangenen 18 putativen Zielsequenzen f r ABZ1 f hren zu folgender Consensus Sequenz KKNTKACGTGGNNN Gelshift Experimente mit einigen der selektierten Zielsequenzen demonstrieren dass ABZ1 G Box hnliche Motive bindet wobei die ACGT Core Sequenz essentiell ist Die flankierenden Nucleotide wirken sich auf Bindungsst rke und spezifit t aus ABZ1 bindet als Dimer ber seine DNA Bindungsdom ne die innerhalb der 46 N terminalen Aminos uren liegt an Zielsequenzen Dieser N Terminus beinhaltet die basische Dom ne spielt jedoch f r die Protein Protein Interaktion von ABZ1 keine Rolle n vitro konnte gezeigt werden dass die DNA Bindung des Dimers das Vorhandensein der DNA Bindungsdom ne in beiden interagierenden Monomeren erforderlich ist Au erdem konnte eine spezifische Bindung von ABZ1 an den CaMV 35S Promotor nachgewiesen werden dessen Aktivit t nach transienter Coexpression von ABZ1 in Tabakbl ttern reduziert ist Dieses Ergebnis korreliert mit der Beobachtung dass die Aktivit t
154. ioaktiv markierten Fragmentes unterschiedliche Protein und DNA Mengen eingesetzt Im elektrophoretischen Gelshift Experiment zur Verifizierung der selektierten DNA Bindungsstellen von ABZ1 wurden 1 ug rekombinantes de und renaturierend aufgereinigtes ABZ1 sowie jeweils 0 1 ng 4x103 cpm eines selektierten 64 bp langen DNA Fragmentes eingesetzt Kapitel 2 14 2 1 F r die Bindungsstudien sowohl des rekombinanten ABZ1 als auch des rekombinanten ANA wurden jeweils 500 ng Protein mit 0 3 ng 2x10 cpm des 118 bp gro en 35S CaMV Promotors Fragmentes inkubiert 2 Material und Methoden 29 1 ug ABZ1 oder bzw und 770 ng 2 5 ug der ABZ1 Mutanten ABZ1 1 100 und ABZ 147 138 wurden zusammen mit 0 05 ng 2x10 cpm bzw 0 1 ng 4x10 cpm des RBSS1 Fragmentes zur in vitro Untersuchung der DNA Bindungsdom ne bzw der ABZ1 Dimerisierung eingesetzt Alle Bindungsreaktionen verliefen in einem Gesamtvolumen von 15 ul unter Verwendung eines Bindepuffers nach Schindler und Cashmore 1990 10 mM Tris HCI pH 7 5 40 mM NaCl 1 mM EDTA 4 v v Glycerin 10 mM B Mercaptoethanol 10 mM DTT 5 mM PMSF 2 ug 15 ul poly di dC Die Inkubationsdauer betrug 30 Minuten bei Raumtemperatur Fur Kompetitionsversuche wurde der Kompetitor vor Zugabe des radioaktiv markierten Fragmentes in 1000 bis 100000 fach molarem berschu mit Bindepuffer und Proteinextrakt 15 Minuten lang inkubiert Durch Zugabe von 3 ul nicht denaturierenden 5x Ladepuffers 50 mM EDTA p
155. ionseffizienz des cDNA Bankvektors zu berpr fen bzw die Anzahl der gescreenten cDNA Bankklone zu ermitteln wurde eine 1 1000 Verd nnung des Transformationsansatzes auf SD Leu bzw SD Leu Trp ausplattiert Der pGADT7 Vektor vermittelt Leucin Prototrophie w hrend AH109 Hefest mme mit pGBKT7 auf Medium ohne Tryptophan wachsen k nnen Die fehlenden Aminos uren Adenin und Histidin selektieren auf Klone deren Bait und Prey Fusionsproteine interagieren und so die Transkription der N hrstoffreportergene f r Adenin und Histidin aktivieren Als Positivkontrolle wurde ein AH109 pGBKT7 53 Stamm mit pGADT7 Rec und dem SV40 Large T PCR Fragment cotransformiert w hrend die Transformation des Stammes AH109 pGBKT7 Lam mit pGADT7 Rec und dem SV40 Large T PCR Fragment als Negativkontrolle diente Die Kontrolltransformationen erfolgten im kleinen Ma stab d h es wurden 50 ul Zellen mit 250 ng Vektor und 125 ng Fragment cotransformiert Da putativ positive Banktransformanten mehr als ein AD cDNA Bank Plasmid enthalten k nnen wurden die gewachsenen Hefeklone 2 mal erneut auf QDO Medium ausgestrichen So wurde der Selektionsdruck sowohl auf den Bait und Prey Vektor als auch auf den korrekten Ph notyp aufrechterhalten Neben der N hrstoffselektion wurde zur Analyse potentieller Proteininteraktionen auch ein quantitativer B Galactosidase Test durchgef hrt Kapitel 2 17 7 Um gr ere Mengen der Prey Plasmide die mit ABZ1 interagierende Peptide codie
156. itscodes ein bestimmtes Nucleotid zugeordnet werden kann kommt eine gro e Bedeutung f r die Bindungsspezifit t zu G an Positionen 2 und 3 T an Position 3 Kapitel 3 3 4 Tab 7 Im Vergleich dazu haben die Positionen 6 5 und 3 an denen entweder G oder T bevorzugt werden eine geringere Priorit t Allerdings sind diese wichtiger f r die Affinit t und Spezifit t der DNA Bindung als die Positionen an denen jedes beliebige Nucleotid vertreten sein kann N an Positionen 4 4 5 und 6 Kapitel 3 3 4 Bei dem hier durchgef hrten Random Binding Site Selection Assay wurden allerdings keine vollst ndig zuf lligen Oligonucleotide eingesetzt sondern eine 4 Nucleotide umfassende Coresequenz war vorgegeben Dennoch wurde unerwarteterweise eine potentielle Bindungsstelle isoliert deren Coresequenz mutiert ist Tab 7A RBSS10 1 Wie im Gelshift Experiment gezeigt wurde bindet ABZ1 allerdings nicht an die putative Zielsequenz RBSS10 1 Abb 12 Daher scheint eine berpr fung der selektierten Zielsequenzen erforderlich zu sein um zuverl ssige Aussagen ber die Bindungsspezifit t von ABZ1 treffen zu k nnen Von den selektierten Sequenzen die im elektrophoretischen Mobilitatsshift Assay EMSA untersucht wurden Tab 7A Fettdruck entsprechen lediglich RBSS1 und RBSS2 1 vollst ndig der ermittelten Consensus Sequenz RBSS1 wird wie erwartet spezifisch von ABZ1 gebunden Die Affinit t von ABZ1 zu RBSS2 1 scheint gr er zu sein al
157. iumdodecylsulfat SDS in Polyacrylamidgelen entsprechend ihrer molaren Masse aufgetrennt werden Die SDS Gelelektrophorese wurde in einem diskontinuierlichen Puffersystem unter Verwendung des Gelkammersystems der Firma Phase 17x9 cm durchgef hrt Das SDS Polyacrylamidgel setzte sich aus einem 12 bzw 15 igen Trenn 6 ml Acrylamid Rotiphorese 40 Gel 29 1 Roth 5 ml 1 5 M Tris pH 8 8 200 ul 10 SDS 66 7 ul 30 APS 8 ul TEMED ad 20 ml ddH gt 0 und einem 4 igen Sammelgel 1 ml Acrylamid Rotiphorese 40 Gel 29 1 Roth 2 5 ml 1 M Tris pH 6 8 100 ul 10 SDS 25 ul 30 APS 10 ul TEMED ad 10 ml ddH gt 0 zusammen Als Laufpuffer wurde 1x Tris Puffer 25 mM Tris 250 mM Glycin 0 1 v v SDS verwendet Die Proteinproben wurden mit 2x Proteinladepuffer 20 mM Tris HCl pH 6 8 0 03 w v Bromphenolblau 6 5 v v Glycerin 0 75 v v SDS 139 mM Mercaptoethanol versetzt und ebenso wie der Molekulargewichtsstandard Biorad bzw MBI Fermentas 5 Minuten bei 95 C denaturiert bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden Die angelegte Spannung betrug zum Einlaufen ins Sammelgel 80 Volt und im Trenngel maximal 100 Volt Das Gel wurde eine Stunde unter leichtem Schwenken in Coomassie F rbel sung 0 125 g Brilliant Blue 45 v v Methanol 10 v v Essigs ure ad 500 ml deion H20 angefarbt und der Hintergrund unter mehrfachem Wechsel des Entfarbers 30 v v Methanol 10 v v Essigsaure entfarbt 2 13 4 Quantitative Proteinbes
158. iver ER e EE 37 Berechnung der Reportergen Aktivit t ueseesssssssssnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 37 Stabile Transformation von Tomate uuunnennennennnennnnnnnnn nennen nn 38 Yeast Two Hybrid System un ee 39 Konstrukte der Yeast Two Hybrid Untersuchungen ss nennen 40 Herstellung einer CDNA AD Fusionsbank nennen 41 Screen auf ABZ1 Interaktionspartner sssesseeesterrttertrrtterrenrrtnrrennrennnnn nee 41 Herstellung kompetenter Hefezellen ccccccccccccccecccecceeeceececeeeceeeteeeeeeeeeees 43 He tfetransftormatiO meseros eins hs 44 Plasmidminipr paration aus Hefe Saccharomyces cerevisiae 44 Quantitativer Galactosidase Test 44 Computer gest tzte Analysen eeeEEEEEEEREEEEREREEEEEEENEEERRNEEEEEEENEENRNEEEEEEN Neen 45 3 1 3 1 1 3 2 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 2 4 3 2 5 3 3 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 3 6 3 3 7 3 3 8 3 3 9 3 3 10 3 3 11 3 3 12 3 3 13 3 3 14 3 3 15 e el 47 Anaerob exprimierte Gene aus der Tomate nase 47 Untersuchung der transkriptionellen Induktion einiger differentiell exprimierter Gene unter Anaerobiose 2222 ccccceesseceeceeeeeeeeeceeeeescceneneeeeeeessneceaneeesneeseetiaes 50 Strukturelle und funktionelle Analyse von ANA 51 ANA geh rt zur Familie der NAC Transkriptionsfaktoren 4444 51 ANA wird in den Nucleus transportiert ern e 54 ANA besitzt eine Transkriptionsaktivierungs
159. iversal stress proteins J Exp Bot 53 2325 2331 6 Literaturverzeichnis 124 Schafleitner R Wilhelm E 2002 Isolation of wound responsive genes from chesnut Castanea sativa microstems by mRNA display and their differential expression upon wounding and infection with the chesnut blight fungus Cryphonectria parasitica Physiol Mol Plant Pathol 61 339 348 Schindler U Cashmore A R 1990 Photoregulated gene expression may involve ubiquitous DNA binding proteins EMBO J 9 3415 3427 Schledzewski K Mendel R R 1994 Quantitative transient gene expression comparison of the promoter for maize polyubiquitin1 rice actin1 maize derived Emu and CaMV 35S in cells of barley maize and tobacco Transgenic Res 3 249 255 Schmitz M L Baeuerle P A 1997 Bacterial expression purification and potential use of His tagged GAL4 fusion proteins Recombinant protein protocols detection and isolation Methods of molecular biology 63 129 137 Humana Press Seki M Narusaka M Abe H Kasuga M Yamaguchi Shinozaki K Carnici P Hayashizaki Y Shinozaki K 2001 Monitoring the expression pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought and cold stresses by using a full length cDNA microarray Plant Cell 13 61 72 Shelp B J Bown A W McLead M D 1999 Metabolism and functions of gamma aminobutyric acid Trends Plant Sci 4 446 451 Singer T Yordan C Martienssen R A 2001
160. iziert worden war konnte best tigt werden Kapitel 3 1 1 Abb 3 In der oben erw hnten Arbeit von Caturla et al 2002 wurde von 26 putativ Uberflutungs induzierten cDNA Fragmenten lediglich eines als falsch positiv identifiziert F r hoch komplexe cDNA Proben z B aus Vertebraten Gehirn traten nach SSH jedoch starke Redundanzen der Zielklone in subtrahierten cDNA Banken auf Rebrikov et ai 2000 Aus diesen Beobachtungen resultiert dass die Methode der SSH f r pflanzliche Proben wie z B das im Vergleich zum Maus Genom relativ gering komplexe Genom der Tomate praktikabel ist 4 2 Gegen berstellung anaerob induzierter Gene aus Tomate und Arabidopsis Aufgrund von Homologievergleichen konnten 25 der isolierten forward subtrahierten SSH Fragmente putative Funktionen zugeordnet werden Tab 6 Klok et al 2002 haben unter Verwendung der DNA Microarray Technologie unter 3500 cDNA Klonen aus Arabidopsis Wurzelkulturen Gene identifiziert die unter geringen Sauerstoff 4 Diskussion 92 Konzentrationen 5 O2 und 95 Nz induziert werden Durch Vergleich der m glichen Funktionen der anaerob induzierten SSH Fragmente aus Tomate mit den spezifisch unter geringen Sauerstoffbedingungen exprimierten cDNA Klonen aus Arabidopsis ergaben sich sowohl Ubereinstimmungen als auch Unterschiede im Expressionsmuster So wurden in beiden Fallen Gene identifiziert die potentielle Komponenten der Genexpression und Signaltransduktion codieren Dabei
161. jun Gens dessen Transkription die sonst durch ATF 2 aktiviert wird Dieses Beispiel macht deutlich dass auch Interaktionsreaktionen bekannt sind bei denen ein Transkriptionsfaktor nicht mit anderen Transkriptionsfaktoren sondern mit Enzym Komplexen interagiert Kommt es zur 4 Diskussion 102 kompetitiven Bindung solcher Proteinkomplexe an Promotorbereiche kann dadurch die Transkription der betroffenen Gene reprimiert werden So sind einige Beispiele transkriptioneller Repressoren in Eukaryoten bekannt jedoch ware ABZ1 der erste pflanzliche Repressor der durch Anaerobiose induziert wird Die Bedeutung zahlreicher pflanzlicher bZIP Transkriptionsfaktoren die in die anaerobe Genexpression involviert sind ist weitgehend unerforscht Das G Box bindende Protein GBF1 aus Mais ist zwar wie ABZ1 anaerob induziert besitzt aber eine N terminale Aktivierungsdomane de Vetten und Ferl 1995 Im Gegensatz dazu weist ein anderer anaerob induzierter bZIP Faktor aus Mais mLIP15 strukturelle hnlichkeiten zu ABZ1 auf Er ist hnlich wie ABZ1 nur 135 Aminos uren lang und besitzt keine Prolin reiche Aktivierungsdomane Kusano ef at 1995 Obwohl beide bZIP Faktoren aus Mais an den Mais ADH Promotor binden zeigen sie ein zeitlich unterschiedliches Expressionsprofil unter anaeroben Bedingungen Folglich w re es denkbar dass GBF1 relativ schnell nach Auftreten geringer O gt Konzentrationen als Aktivator der ADH Expression wirkt w hrend mLIP1
162. l 3 3 6 Da das deletierte Protein jedoch noch einen Leucin Zipper besitzt der eine Protein Protein Interaktion erm glicht soll untersucht werden ob die ABZ1 Mutante eine Protein Interaktion eingeht und welchen Einflu diese dann auf die DNA Bindung hat Daher sollte in einem Gelshift Experiment die DNA Bindung durch gemeinsamen Zusatz von Wildtyp Protein ABZ1 und Deletionsmutante ABZ 147 138 analysiert werden Rekombinantes ABZ1 wurde zusammen mit ansteigenden Konzentrationen an rekombinantem ABZ147 133 in einer DNA Bindungsreaktion inkubiert Anschlie end wurden die Ans tze in einem 9 igen nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt Als Sonde diente das RBSS1 Fragment das als Zielsequenz f r ABZ1 aus dem Random Binding Site Selection Assay hervorgegangen war Kapitel 2 14 In Abbildung 14 auf den Spuren 4 bis 6 sind Reaktionsans tze aufgetrennt die den ABZ1 Wildtyp Protein sowie das deletierte Protein enthalten wobei das deletierte Protein in steigender Konzentration zugegeben wurde Es wird ein Protein DNA Komplex retardiert dessen Laufverhalten mit dem des ABZ1 RBSS1 Komplexes vergleichbar ist und folglich auf Bindung von ABZ1 an die Sonde zur ckgef hrt werden kann Abb 14 vgl Spur 2 und 4 W re ABZ147 133 an der DNA Bindung beteiligt w ren zus tzliche Komplexe zu erwarten Aufgrund der unterschiedlichen Molekulargewichte und Nettoladungen von ABZ1 und ABZ147 133 w rden m gliche Protein DNA Komplexe mit ABZ147 133 Homodimer
163. l wurde Uber Nacht exponiert und die durch ABZ1 gebundenen dsR64 Sequenzen der retardierten Komplexe wie oben beschrieben aus dem Gel extrahiert Nachfolgend wurden die selektierten DNA Sequenzen in einem hnlichen Ansatz wie oben aufgef hrt durch PCR amplifiziert Die Abweichungen sind im Folgenden erl utert Statt R64 wurden 10 ng der selektierten DNA Fragmente der vorangegangenen Bindungsreaktion als Template eingesetzt zus tzlich wurden 2 ul 80 ng ul Primer R zugef gt und es wurde lediglich 1 ul a P dCTP zur Markierung verwendet Das Temperaturprogramm umfasste 20 Zyklen 1 Minute 94 C 1 Minute 62 C und 1 Minute 72 C Daran schloss sich die Aufreinigung der Sonde wie f r dsR64 beschrieben an Diese aufgereinigten Fragmente wurden in einer neuen Bindungsreaktion eingesetzt Insgesamt wurden f nf solcher Runden bestehend aus Bindungsstellenselektion und amplifikation durchgef hrt Die _selektierten Bindungsstellen wurden in pCR 2 1 kloniert Kapitel 2 11 und sequenziert 2 Material und Methoden 26 2 14 2 Elektrophoretische Gelshift Experimente In den durchgef hrten Gelshift Experimenten wurden die Bindungsspezifitaten von DNA bindenden Proteinen wie dem rekombinanten ABZ1 den rekombinanten ABZ1 Deletionsmutanten oder dem rekombinanten ANA an ihre potentiellen DNA Zielsequenzen untersucht 2 14 2 1 DNA Fragmente Sonden und Kompetitoren Als DNA Fragmente f r die elektrophoretischen Mobilit tsshift Experi
164. lague C 1996 Structure and expression of three genes encoding ACC oxidase homologs from melon Cucumis melo L Mol Gen Genet 251 81 90 Lee M O Regan S Moreau J L Johnston L H Godine C R 2000 Regulation of the Pcl7 Pho85 cyclin cdk complex by Pho81 Mol Microbiol 38 411 422 Loef l Stitt M Geigenberger P 2001 Increased adenine nucleotide levels modify the interaction between respiration and starch synthesis when adenine is fed to discs of growing potato tubers Planta 212 782 791 L pez Barneo J Pardal R Ortega Saenz P 2001 Cellular mechanisms of oxygen sensing Annu Rev Physiol 63 259 287 Lukacin R Urbanke C Gr ning l Matern U 2000 The monomeric polypeptide comprises the functional flavanone 3b hydroxylase from Petunia hybrida FEBS Letters 467 353 358 Magaraggia F Solinas G Valle G Giovinazzo G Coraggio 1997 Maturation and translation mechanisms involved in the expression of a myb gene of rice Plant Mol Biol 35 1003 1008 Maliga P Sz Brenovits A Marton L Joo F 1975 Non Mendelian streptomycin resistant tobacco mutant with altered chloroplasts and mitochondria Nature 255 401 402 Martinez Garcia J F Moyano E Alcocer M J C Martin C 1998 Two bZIP proteins from Antirrhinum flowers preferentially bind a hybrid C bos G box motif and help to define a new sub family of bZIP transcription factors Plant J 13
165. lokalisierungssequenz optische Dichte o Nitrophenyl B D galactopyranosid Polymerase Kettenreaktion Pyruvatdecarboxylase Phenylmethansulfons urefluorid Pyrophosphat Quadruple Dropout Hefeselektivmedium Ribonucleins ure Shoot Apical Meristem Synthetic Dropout Hefeminimalmedium Sodiumdodecylsulfat Suppression Subtractive Hybridization Standardabweichung Saccharosesynthase The Arabidopsis Information Resource Transfer DNA upstream open reading frame untranslated region nicht translatierter Bereich Volumen Volumen Gewicht Volume gravity Erdbeschleunigung 5 Brom 4 chlor 3 indolyl B D glucuronid Lambda Wellenlange Inhaltsverzeichnis ele ee EE 1 Einleitung asien eig woes neue eat 1 1 1 Exogener Sauerstoffmangel 2 2 una 1 1 2 Endogener Sauerstoffmangel 22 22240 4004044004H0HHRnnn nenn ne nnnnnennne een nn 2 1 3 Signalaufnahme und weiterleitung bei Hypoxia und Anaerobiose 2 1 4 Energiemetabolismus unter geringen Sauerstoffkonzentrationen 4 1 5 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese unter anaeroben Siet tele EE 5 1 6 Anaerobe Stoffwechsel Umstellungen nn nn nenn nennen nenne 7 1 7 Zellsch digung durch cytoplasmatische Ans uerung nenn 9 1 8 Morphologische Anpassung an sauerstoffarme Bedingungen 10 1 9 Hypoxische Akklimatisierung an Anaerobiose nn 11 1 10 Ziele dieser Arbeit SRORIENPEREEBERERPEPERETHETERFEELRPERTREERFERFHERHESDEECBERSEREFE
166. ls Prey Konstrukt cotransformierter Hefestamm verwendet Lam T Die Hintergrund Aktivit t die durch das eingesetzte Bait Konstrukt ZIP 3 Ergebnisse 83 verursacht wird liegt bei 7 23 der Aktivitat der Positivkontrolle Die selektierten Prey Konstrukte zeigen nach Transformation in Hefe ebenfalls eine vernachlassigbar geringe Hintergrund Aktivitat Daten nicht gezeigt Fur die Klone die die Leucin Zipper Domane von ABZ1 als Bait und eines der selektierten Prey Konstrukte coexprimieren ATP Synth unknown ACC Oxid Exo70 IDS4 like und Transducin wird eine B Galactosidase Aktivitat von 50 82 im Vergleich zur Positivkontrolle gemessen Die Mittelwerte der prozentualen Reportergenaktivitaten beruhen auf mindestens 6 Me werten und sind gemeinsam mit den errechneten Standardabweichungen aufgef hrt Anhang 7 5 Daraus folgt dass die im Two Hybrid Screen selektierten Pepide in Hefe mit der Leucin Zipper Dom ne von ABZ1 interagieren und so die Expression des Reportergens aktivieren 160 140 33 6 120 28 7 100 23 6 23 4 80 9 3 65 65 16 2 60 50 40 Galactosidase Aktivit t 20 2 3 a 0 c E Bait PGBKT7 p53 Lam ZIP ZIP ZIP ZIP ZIP ZIP ZIP Prey PGADT7 T T ATP unknown ACC Exo70 IDS4 like Trans Synth Oxid ducin 7 Abb 19 Quantitative Bestimmung der Galactosidase Aktivit t als Ma f r die Interaktionsst rke cotransformierter Bait und Prey
167. lt sind RBSS1 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGGGT TGACGTGGGAAGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 Fever 3 GTCCAGTCAAGTCGCCT d TCTCCGCT TAAGTCACGTTGACGTCG 5 RBSS1 1 5 CAGGTCAGTTCAGCGGAT 3 GTCCAGTCAAGTCGCCT ACGTGGTGTGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 TGCACCACACTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5 RBSS2 1 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGTGTCCACGTAAGACGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCCTAGGACAGCACAGGTGCATTCTGCTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5 RBSSS 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGSTCGTGCACACGTGTCGCGAGGCGAATTCAGTGCAACTGSCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCCTAGGACAGCACGTGTGCACAGCGCTCCSCTTAAGTCACGTTGACGTCTG 5 RBSS6 1 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGGGATGACGTGTAGGGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCCTAGGACAGCCCTAC TGCACATCCCTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5 2 Material und Methoden 27 RBSS8 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCEGCCTTACGTGEGCTGAGGCGAATTCAGTGCAACTSCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCC TAGGACAGCCGGAA TGCACCCGACTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5 RBSS9 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGTTTATACGTGTCGCGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCCTAGGACAGCAAATATGCACAGCGCTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5 RBSS10 1 5 caGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGTTGTGABGTGGGTAGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 3 GTCCAGTCAAGTCGCCTAGGACAGCAACAC TACACCCATCTCCGCTTAAGTCACGTTGACGTCG 5
168. ltiert und zu Zelltod f hrt Unter normoxischen Bedingungen sorgen ATPasen f r die Aufrechterhaltung eines Protonengradienten zwischen Tonoplast und Vakuole Steht aber aufgrund des fehlenden O2 weniger Energie zur Verf gung ist die Aktivit t der Protonenpumpen beeintr chtigt und es kommt zu einem passiven H Ruckfluss ins Cytoplasma Drew 1997 Andererseits stellt der niedrige cytoplasmatische pH Wert eine Voraussetzung f r einige wichtige Stoffwechselumstellungen unter Anaerobiose dar Die Succinat Synthese und die Decarboxylierung von Glutamat zu GABA basieren z B auf Protonen verbrauchenden Prozessen Menegus et a 1989 Au erdem k nnte ein saurer pH Wert dazu f hren dass Pyrophosphat PPi als Energiequelle im Vergleich zu ATP bevorzugt wird Denn niedrige pH Werte erh hen die freie Energie der PPi Hydrolyse w hrend die Energieausbeute aus ATP Hydrolyse verringert wird Davies ef a 1993 1 8 Morphologische Anpassung an sauerstoffarme Bedingungen In Stengeln und Wurzeln aquatischer und berflutungstoleranter Pflanzen kommt es durch Zellseparation w hrend der Entwicklung Schizogenie oder durch Zelltod Lysogenie zur Bildung von aerenchymatischem Gewebe Die F higkeit lysogenes Aerenchym zu bilden ist auch bei Pflanzen trockener Standorte weit verbreitet und wird insbesondere bei verminderter O Versorgung induziert Zus tzlich dient z B in Kartoffelknollen die Ausbildung von Lentizellen der O2 Versorgung Abb 1
169. m ihre transkriptionelle Induktion durch Anaerobiose zu untersuchen wurden Northern Blot Analysen durchgef hrt Kapitel 2 10 4 3 Ergebnisse 85 Gesamt RNA aus Gewebe anaerob induzierter Tomatenpflanzen wurde mit radioaktiv markierten cDNA Fragmenten der ACC Oxidase bzw des IDS4 like Proteins die im Hefe Two Hybrid Screen selektiert worden waren hybridisiert Kapitel 2 17 3 Das Autoradiogramm der Northern Blot Hybridisierungen ist in Abbildung 21 dargestellt Sowohl die ACC Oxidase als auch das IDS4 like Protein werden ausschlie lich unter anaeroben Bedingungen exprimiert Die Transkriptgr en liegen bei ca 1 kb Der gewebespezifische Northern Blot zur Expressionsanalyse der ACC Oxidase zeigt dass die ACC Oxidase bevorzugt in den Tomatenfr chten durch Anaerobiose induziert wird Ihre Expressionsst rke ist im Blattmaterial deutlich geringer und im Wurzelgewebe kann nahezu kein Transkript des ACC Oxidasegens detektiert werden Daraus resultiert dass es sich sowohl bei der ACC Oxidase als auch dem IDS4 like Protein um Proteine handelt die wie ihr potentieller Interaktionspartner ABZ1 anaerob spezifisch exprimiert werden Deshalb wird das IDS4 like Protein als AlL anaerobes IDS4 like Protein bezeichnet w hrend LeACOS verdeutlicht dass es sich hierbei um ein f nftes Mitglied der ACC Oxidase Familie aus Lycopersicon esculentum handelt Sonde ACC Oxidase IDS4 like Gewebe Blatt Frucht Wurzel Sauerstoff ca
170. mente wurden folgende Fragmente mittels PCR radioaktiv markiert aus einem Polyacrylamidgel extrahiert und als Sonde eingesetzt Kompetitor Fragmente blieben unmarkiert Alle Fragmente die als potentielle Zielsequenzen f r ABZ1 aus dem Random Binding Site Selection Assay Kapitel 3 3 3 Tab 5 hervorgegangen sind werden nachfolgend mit RBSS und der entsprechenden Klon Nummer bezeichnet Die PCR Bedingungen zur Amplifikation der radioaktiv markierten RBSS Sonden entsprachen denen zur Amplifikation der selektierten Fragmente Kapitel 2 14 1 Als Template wurden die in pCR 2 1 subklonierten RBSS Fragmente eingesetzt pCR2 1 RBSS und eine zus tzliche 5 min tige Vordenaturierung bei 94 C durchgef hrt Als Kompetitoren wurden chemisch synthetisierte Oligonucleotide eingesetzt die in quimolaren Mengen vereinigt 5 Minuten bei 95 C denaturiert 15 Minuten bei 65 C annealt 20 Minuten bei 37 C und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden Die Sequenz des spezifischen Kompetitor Fragmentes sK1 entspricht der von RBSS1 w hrend der unspezifische Kompetitor uK1 eine Mutation innerhalb der G Box core Sequenz von RBSS1 enth lt ACGT gt ATTA Die 5 und 3 flankierenden 25 Basenpaare sind f r alle RBSS Fragmente identisch Die unterstrichenen Sequenzen heben die zuf lligen bzw selektierten Basenpaare hervor w hrend die G Box Core Sequenz als graue bzw Mutationen innerhalb dieser Sequenz als grau unterlegte Buchstaben dargestel
171. n mg Protein aufgetragen Plasmid ohne Effektor aber mit entsprechendem Promotor 3 Ergebnisse 61 3 3 Strukturelle und funktionelle Analyse von ABZ1 3 3 1 ABZ1 ist ein bZIP Transkriptionsfaktor Fur das SSH Fragment 74 das Homologien zur mRNA von bZIP Transkriptionsfaktoren aufweist Kapitel 3 1 wurde ein vollst ndiger cDNA Klon aus einer anaeroben cDNA Bank aus Tomatenpflanzen isoliert Kapitel 2 12 Ca 200000 Kolonien einer anaeroben cDNA Bank 5x105 cfu ml wurden gescreent von denen 32 ein positives Hybridisierungssignal in der ersten Screeningrunde zeigten 10 der potentiell positiven Klone wurden in einem zweiten Screen vereinzelt und verifiziert Durch Testspaltung mit Mo EcoRI wurde ein Klon mit m glichst gro em cDNA Insert identifiziert und sequenziert Der Homologievergleich sowohl der cDNA Sequenz als auch der daraus resultierenden Aminos uresequenz best tigte die Annahme dass es sich bei ABZ1 um einen bZIP Transkriptionsfaktor handelt Die h chste Sequenzidentit t von 86 trat im BLAST Search auf Aminos ureebene mit dem bZIP Transkriptionsfaktor BZI 4 aus Nicotiana tabacum auf Strahtmann et al 2001 In Abbildung 9 ist die Nucleotid sowie die resultierende Aminos uresequenz des vollst ndigen cDNA Klons aufgef hrt Die cDNA besteht aus 1216 Basenpaaren die mit 20 Adenosinresten den PolyA Schwanz einschlie t 414 Basenpaare 597 1010 stellen die codierende Region dar die in 138 Aminos uren t
172. n CaMV 35S Promotor Aktivit t im EEN E BE 132 Yeast Two Hybrid Analyse auf ABZ1 Interaktionspartner ssssesssesseeeeeenseene 133 Katalogisierte DNA Proben 2 c ccceececeeeeseedeeeeeeseueeceneeseedececeneeeeneeneneneenene 135 Katalogisierte Glycerinkulturen ccccccccceceeceeeeeseneeceeeeeeeeeeeeneneeeedeneeseeeee 138 7 Einleitung 1 1 Einleitung Pflanzen sind wie Tiere obligat aerobe Organismen und sind auf externe Sauerstoffversorgung angewiesen Im Gegensatz zu Tieren die u a spezialisierte Atmungsorgane besitzen verf gen Pflanzen ber kein effizientes System zur Bereitstellung von Sauerstoff und sind au erdem Standort gebunden Dennis et al 2000 Sauerstoff O gt ist jedoch als terminaler Elektronenakzeptor der oxidativen Phosphorylierung die den gr ten Teil des ATP f r zellul re Stoffwechselwege durch Regenerierung von NAD aus NADH zur Verf gung stellt essentiell Zus tzlich ist Sauerstoff in die Synthese von H m Sterol und Fetts uren durch die Cytochromoxidase involviert Bei einem Defizit an O2 ist allerdings die Aktivit t der Cytochromoxidase beeintr chtigt und die oxidative Phosphorylierung wird inhibiert Geigenberger 2003 Deshalb haben Pflanzen sowohl morphologische als auch metabolische Mechanismen entwickelt die es ihnen erm glichen kurze O2 arme Perioden zu berleben oder zu umgehen In Abbildung 1 sind die unterschiedlichen Mechanismen die im Folgenden erl ute
173. n Klonen der Prey Expressionsbank wuchsen 154 Klone auf 4 fachem Selektionsmedium QDO SD Trp Leu His Ade Zur Eliminierung falscher Positiver wurden diese Klone noch zweimal auf QDO Medium ausgestrichen und auf Aktivit t des dritten Reportergens acZ durch qualitative B Galactosidase Assays untersucht PCR Analysen der Inserts und Retransformationsuntersuchungen der isolierten Prey Plasmide dienten ebenfalls der Verifizierung der interagierenden Peptide Daten nicht gezeigt Schlie lich wurden 6 Klone identifiziert die reproduzierbar die Genexpression der beiden N hrstoffselektionsmarker Adenin und Histidin sowie des Galactosidase Reportergens in Hefe aktivierten Die Sequenzierung der 6 isolierten Prey Konstrukte best tigte dass diese tats chlich Fusionsproteine mit der GAL4 Aktivierungsdom ne exprimieren Nachfolgend werden die Aminos uresequenzen Daten nicht gezeigt und die resultierenden Homologien der selektierten Prey Peptide kurz erl utert Das erste Peptid umfasst 90 Aminos uren und zeigt die h chste Homologie mit einer Sequenzidentit t von 53 zu einem EXO70 Protein aus Arabidopsis thaliana das eine Untereinheit des Exocytosekomplexes darstellt locus AT5G50380 1 Zuerst in Saccharomyces cerevisiae entdeckt TerBush ef at 1996 wurde die Exocytose Untereinheit Exo70 auch in anderen Eukaryoten untersucht Kee ef al 1997 Ein zweiter im Hefe Two Hybrid Screen selektierter Klon codiert ein 170 Aminos uren langes
174. n entsprechenden Asal Fragmenten analysiert Dazu erfolgte die RNA Isolierung aus aeroben und anaerob inkubierten Tomatenpflanzen nach Gewebetypen getrennt Fr chte Bl tter Wurzeln Abbildung 3 zeigt dass alle untersuchten Gene im Vergleich zu ihrer Expressionsst rke unter aeroben Bedingungen ausschlie lich oder deutlich st rker unter Anaerobiose exprimiert werden Die Expression des bZIP Faktor codierenden Gens SSH 74 wird in allen drei untersuchten anaerob inkubierten Gewebetypen gleich stark induziert F r das Gen das ein Ethylen responsives Protein codiert SSH 35 wird unter anaeroben Bedingungen in den Fr chten die gr te Transkriptmenge beobachtet Blatt und Wurzelgewebe zeigen eine geringere Expressionsst rke des Ethylen responsiven Gens Das Gen das ein Protein mit NAC Dom ne codiert SSH 172 wird haupts chlich in anaerob inkubiertem Blattgewebe exprimiert w hrend in den Fr chten und Wurzeln unter Anaerobiose eine relativ geringe Transkriptmenge detektiert wird Dadurch konnte gezeigt werden dass die forward subtrahierten SSH Fragmente die durch Northern Blot Hybridisierung untersucht wurden tats chlich auf anaerob induzierte Gene zur ckzuf hren sind 3 Ergebnisse 51 Gewebe Frucht Blatt Wurzel Sauerstoff SSH 74 m SSH 11 1 2 kb 7 0 kb SSH 33 s e 1 4 kb SSH 35 EN De SSH 76 2 4 kb Gewebe Blatt Frucht Wurzel SSH 84 a Sauerstoff 1 0 kb SSH 172 SSH 143 1 4 kb
175. n of tobacco nuclear factors with cis regulatory sequences in the maize GapC4 promoter Plant Mol Biol 43 11 21 Geigenberger P 2003 Response of plant metabolism to too little oxygen Curr Opinion Plant Biol 6 247 256 Geigenberger P Fernie A R Gibon Y Christ M Stitt M 2000 Metabolic activity decreases as an adaptive response to low internal oxygen in growing potato tubers Biol Chem 381 723 740 Germain V Ricard B Raymond P Saglio P H 1997 The role of sugars hexokinase and sucrose synthase in the determination of hypoxically induced tolerance to anoxia in tomato roots Plant Physiol 114 167 175 Gibbs J de Bruxelle G Armstrong W Greenway H 1995 Evidence for anoxic zones in 2 3 mm tips of aerenchymatous maize roots under low O2 supply Aust J Plant Physiol 22 723 730 Gibon Y Vigeolas H Tiessen A Geigenberger P Stitt M 2002 Sensitive and high throughput metabolite assays for inorganic pyrophosphate ADPGlc nucleotide phosphates and glycolytic intermediates based on a novel enzymic cycling system Plant J 30 221 235 Gong W Tao B Mansy S S Gonzalez G Gilles Gonzalez MA Chan M K 1998 Structure of a biological oxygen sensor a new mechanism for heme driven signal transduction Proc Natl Acad Sci USA 95 15177 15182 Good A G Paetkau D H 1992 Identification and characterization of a hypoxically induced maize lactate
176. n und gehen bei bergang zu anaeroben Bedingungen nur langsam zur ck Andrew et ai 1994 w hrend sie in anaeroben nicht akklimatisierten Wurzeln zwar gebildet aber relativ schnell wieder abgebaut werden Drew 1997 Andere Hypoxia induzierte Gene codieren u a Glutamat Decarboxylase und Alanin Aminotransferase die wahrscheinlich der cytosolischen Ans uerung entgegenwirken Gout et ai 2001 Au erdem findet in akklimatisierten Wurzeln ein verbesserter Lactattransoprt aus dem Cytoplasma in die externe Umgebung statt wodurch die cytoplasmatische Ans uerung zus tzlich eingeschr nkt wird Rivoal und Hanson 1994 Von 10 untersuchten Enzymen der Glykolyse und Fermentation zeigt lediglich die Glucokinase eine reduzierte Aktivit t bei erniedrigtem pH Wert und Inhibition bei geringem ATP ADP Verh ltnis Daher k nnte der Glucokinase Aktivit t eine Schl sselrolle bei der hypoxischen Akklimatisierung zukommen Bouny und Saglio 1996 1 10 Ziele dieser Arbeit Ziel dieser Arbeit war es einen Beitrag zur Aufkl rung der komplexen Stress Antwort von Pflanzen auf anaerobe Umgebungsbedingungen zu leisten Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen eines Forschungsprojektes mit agrarbiotechnologischem Schwerpunkt erstellt Daher konzentrieren sich die Untersuchungen auf Tomate Lycopersicon esculentum die nah mit der Kartoffel So anum tuberosum als wirtschaftlich relevanter Nutzpflanze verwandt ist und deren Genotyp Micro Tom g nstige Modell Eigen
177. nd mindestens doppelt so h ufig vor wie das zweith ufigste Nucleotid so wird das h ufigste Nucleotid an dieser Position f r die Consensus Sequenz bernommen Tab 7B G an Positionen 2 und 3 sowie T an Position 3 Ein Doppelt Mehrdeutigkeitsbuchstabe wird verwendet wenn zwei Nuclotide an einer Position zusammen mindestens mit einer H ufigkeit von 75 auftreten und die zuvor beschriebene Regel nicht zutrifft Tab 7B K an Positionen 6 5 und 2 Kommt an einer Position ein bestimmtes Nucleotid nicht vor und trifft keine der zuvor erl uterten Regen zu so wird ein Dreifach Mehrdeutigkeitsbuchstabe eingesetzt Alle Positionen auf die keine der oben stehenden Regeln zutrifft werden mit einem N f r ein beliebiges Nucleotid versehen Tab 7B Positionen 4 4 5 und 6 3 Ergebnisse 68 Tab 7 Random Binding Site Selection Assay A Mit rekombinantem ABZ1 selektierte Bindungsstellen Fettdruck Potentielle Zielsequenzen die in Gelshift Experimenten berpr ft wurden rc revers komplement re Sequenz B Matrize die aus 18 in vitro mit rekombinantem ABZ1 selektierten Bindungsstellen erstellt wurde einschlie lich der resultierenden Consensus Sequenz A RBSS 6 5 4 3 2 4 0 0 1 2 3 4 5 6 1 G G T IT 6 J A C 6 TIG G G A A 2 TIG T T G J A Cc 6 TI 6 6 cc A C 3 1 TITI 6G TJ G JA Cc 6 T I 6 6 C TI
178. ngenz 4x SSC 0 1 SDS 2x SSC 0 1 SDS 1x SSC 0 1 SDS 0 5x SSC 0 1 SDS gewaschen und mit R ntgenfilm bei 80 C unter Verwendung einer Verst rkerfolie exponiert Die Hybridisierungssonden wurden unter Verwendung des HexaLabel DNA Labeling Kits von MBI Fermentas gem dem Herstellerprotokoll mit jeweils 9 pmol a 2P dCTP radioaktiv markiert Uber eine Sephadex G 50 S ule wurden nicht inkorporierte Nucleotide vom markierten DNA Fragment abgetrennt 2 11 Suppression Subtractive Hybridization SSH Die subtraktive Hybridisierung nach Diatschenko ef ai 1996 ist eine Methode die den Vergleich zweier mRNA Populationen erm glicht Diese Technik wurde eingesetzt um Gene zu identifizieren die unter anaeroben jedoch nicht unter aeroben Bedingungen induziert d h differentiell exprimiert werden Die cDNA Fragmente solcher anaerob induzierter Gene wurden durch die sog Forward Subtraktion isoliert wahrend durch die Reverse Subtraktion ausschlie lich bzw st rker aerob exprimierte cDNA Fragmente angereichert wurden Zun chst wurde die cDNA Synthese sowie die anschlie ende subtraktive Hybridisierung unter Verwendung des CLONTECH PCR Select cDNA Subtraction Kits der Firma Clontech entsprechend dem Benutzerhandbuch PT1117 1 durchgefuhrt Fur jede Synthese wurden 2 ug PolyA mRNA aus Tomatenpflanzen Lycopersicon esculentum cv Micro Tom inklusive Bl ttern Fr chten und Wurzeln eingesetzt Die PolyA mRNA wurde einer
179. niert sequenziert mit den entsprechenden Restriktionsenzymen siehe Tab 4 Primersequenz herausgeschnitten und in pGBKT7 subkloniert Der Hefeexpressionsvektor pGBKT wurde f r die Klonierung von ABZ1 mit Ndel Smal gespalten Die ANA Konstrukte wurden im Adel Sai gespaltenen pGBKT7 Vektor mit der DNA BD fusioniert Tab 4 Yeast Two Hybrid Konstrukte und die zu ihrer Herstellung verwendeten PCR Primer Plasmid PCR Primer Primersequenz DNA Nr DNA Nr GBKT7 ABZ147 TATACATATGCTTCTGCAAGATTTGACAGGGGA 3 P 138 5 7IP Ndel 3470 EE pGBKT7 ZIP Neel 3348 ATAT TTAAAATTTAAACAATCCTG 3 74 3 Primer 3469 3 GE Smal GBKT7 ANAi TATACATATGAACAAAGGAGCAAACGGAA 3 en TT ANA 5 Ndel 3496 gt ie eet el S ATATGTCGACTTAGTAAGGTTTTTGCATGTATAGG 3 MT172 3 3494 Se a GBKT7 ANA4 TATACATATGAACAAAGGAGCAAACGGAA 3 ms ANA 5 Ndel 3496 gt a 3462 Neel 5 TATGTCGACCTATGTGCCTTTCTTGTTGTATATTC 3 Sal ANA 3 Sail 3497 Zur Klonierung der Bait Proteine wurden sowohl die vollstandige codierende Sequenz von ANA pGBKT7 ANAj 301 als auch verk rzte Proteinbereiche von ABZ1 und ANA mit der GALA DNA Bindungsdom ne fusioniert So resultierte aus der Deletion der 2 Material und Methoden 41 N terminalen basischen Dom ne des ABZ1 das Konstrukt pGBKT7 ABZ147 138 das lediglich den C terminalen 92 Aminos uren langen Leucin Zipper als Bait enth lt Das
180. nnt sind Das hier isolierte ACC Oxidase Peptid zeigt mit 53 iger Sequenzidentit t die h chste Homologie zu LE ACO4 BAA34924 Nakatsuka ef a 1998 und stellt somit ein f nftes Mitglied dieser Genfamilie dar Ein viertes mit ABZ1 interagierendes Peptid enth lt 202 Aminos uren und zeigt eine 64 ige Sequenzidentit t zum C Terminus AS 932 1133 eines Transducins aus Arabidopsis thaliana Dieses Protein geh rt zur WD40 Repeat Protein Familie und umfasst 1344 Aminos uren NP_187938 Ein weiterer im Hefe Two Hybrid Screen selektierter Klon exprimiert ein 148 Aminos uren langes Peptid Seine 102 C terminalen Aminos uren weisen eine 67 ige Sequenzidentit t zu einer putativen Untereinheit der ATP Synthase aus G ycine max auf die 179 Aminos uren umfasst CAA52349 Smith et ai 1994 Ein relativ kurzes Peptid das mit ABZ1 im Hefe Two Hybrid System interagiert umfasst lediglich 59 Aminos uren und zeigt keine signifikante Homologie in der Datenbank Zur Quantifizierung der Interaktionsst rke zwischen ABZ1 und den selektierten Peptiden wurde ein B Galactosidase Assay durchgef hrt Kapitel 2 17 7 In Abbildung 19 ist die quantitative Aktivit t des Galactosidase Reportergens der untersuchten Klone relativ zur Positivkontrolle in Prozent dargestellt Der als Positivkontrolle eingesetzte Hefestamm exprimiert die interagierenden Proteine Murin p53 und SV40 large T Antigen p53 T Als Negativkontrolle wurde ein mit Lamin C als Bait und T Antigen a
181. ns describes multiple signalling connections Annals of Botany 79 Supplement A 33 37 6 Literaturverzeichnis 122 Peng H P Chang C S Shih M C Yang S F 2001 Signaling events in the hypoxic induction of alcohol dehydrogenase gene in Arabidopsis Plant Physiol 126 742 749 Pfitzner A J P 1998 Transformation of tomato Methods Mol Biol 81 359 363 Piper P 1996 Isolation of yeast DNA Methods Mol Biol 53 103 107 Quinn J M Eriksson M Moseley J L Merchant S 2002 Oxygen deficiency responsive gene expression in Chlamydomonas reinhardtiithrough a copper sensing signal transduction pathway Plant Physiol 128 463 471 Rebrikov D V Britanova O V Gurskaya N G Lukyanov K A Tarabykin V S Lukyanov S A 2000 Mirror orientation selection MOS a method for eliminating false positive clones from libraries generated by suppression subtractive hybridization Nucleic Acids Res 28 No 20 e90 Reintanz B 1997 Funktionelle Charakterisierung der Kaliumkanal a Untereinheit AtKC1 aus Arabidopsis thaliana Ph D Thesis Cologne Germany University of Cologne Ren T Qu F Morris T J 2000 HR7 gene function requires interaction between a NAC protein and viral capsid protein to confer resistance to turnip crinkle virus Plant Cell 12 1917 1925 Ricard B Cou e l Raymond P Saglio P H Saint Ges V Pradet A 1994 Plant metabolism under hypoxia and an
182. nseffekte in transgenen Pflanzen f r die unterschiedliche Expression der einzelnen Linien verantwortlich sein Die Modelle A C in Abbildung 25 fassen die in der vorliegenden Arbeit erzielten Versuchsergebnisse zusammen und stellen m gliche Funktionsweisen von ABZ1 im Hinblick auf seine Regulation des CaMV 35S Promotors im transienten und im transgenen System gegen ber Die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen die im stabil und transient transformierten System erzielt wurden k nnten auf den f r ABZ1 unterschiedlichen Bindungsvoraussetzungen beruhen In transgenen Pflanzen sind unter aeroben Bedingungen bereits Transkriptionsfaktoren an den CaMV 35S Promotor gebunden Modell C 02 Da die ABZ1 Expression erst durch Anaerobiose induziert wird mu ABZ1 dann vermutlich mit anderen frans Faktoren u a auch mit ANA um die entsprechenden cis regulatorischen Elemente kompetieren Modell C O gt Das f hrt wahrscheinlich zum beobachteten heterogenen Effekt Kapitel 3 3 11 Abb 18 Weil sowohl anaerobe Transkriptionsrepressoren als auch aktivatoren binden k nnen ist eine verst rkte unver nderte oder verringerte Expression des CaMV35S Promotors die Folge In transient transformiertem Blattmaterial kommt es hingegen zu einer de novo Bindung von Transkriptionsfaktoren an den 35S Promotor Dadurch kann die Bindung von ABZ1 an den 35S Promotor im Vergleich zum transgenen System vermutlich 4 Diskussion 101 leichter erfolgen Modell B O
183. ntration von 40 ug ml Um Verunreinigungen der RNA mit Polysacchariden bzw Proteinen beurteilen zu k nnen wurde ein Extinktionsverh ltnis von 230 nm zu 260 nm zu 280 nm erstellt das bei sauberer RNA 1 2 1 betragen sollte 2 10 4 Northern Blot Analyse 10 ug Gesamt RNA wurden mit einem Volumen 2x RNA Ladepuffer 197 ul deion Formamid 64 ul Formaldehyd 39 ul 20x RNA Borat Puffer 0 4 mg Bromphenolblau 0 4 mg Xylencyanol 2 ul Ethidiumbromid c 10 ad 390 ul ddH2Operc versetzt 10 Minuten bei 70 C denaturiert und in einem 0 8 1 igen Formaldehyd Agarosegel 0 8 1 w v Agarose 5 ml 20x RNA Borat Puffer 16 7 ml 37 iges Formaldehyd ddH2Operc ad 100 ml aufgetrennt Als Laufpuffer wurde 1x RNA Borat Puffer 20x RNA Borat Puffer 0 06M Tetraborat 0 6 M Borat 4 mM EDTA pH 8 0 eingesetzt Der Transfer der RNA auf Nylonmembran erfolgte nach dem Standardprotokoll von Sambrook ef ai 1989 wobei als Blotpuffer 20x SSC 2 M NaCl 12 M NaOCzHs verwendet wurde Die geblottete RNA wurde durch 2 st ndiges Backen der Membran bei 80 C fixiert 2 Material und Methoden 18 Die Vorhybridisierung der Northern Blot Membranen erfolgte 3 6 Stunden bei 65 C in Church Puffer 0 25 M NaPO Puffer pH 7 0 7 v v SDS 50 ug ml Heringssperma DNA Nach Zugabe der entsprechenden radioaktiv markierten Sonde wurde Uber Nacht bei 65 C hybridisiert Anschlie end wurden die Membranen je 15 Minuten bei 65 C mit vier Waschl sungen ansteigender Stri
184. ocyclopropane 1 carboxylate oxidase gene family of tomato Plant J 9 525 535 Battini J L Rasko J E Miller A D 1999 A human cell surface receptor for xenotropic and polytropic murine leukaemia viruses possible role in G protein coupled signal transduction Proc Natl Acad Sci USA 96 1385 1390 6 Literaturverzeichnis 114 Baxter Burrell A Yang Z Springer P S Bailey Serres J 2002 RopGAP4 dependent Rop GTPase rheostat control of Arabidopsis oxygen deprivation tolerance Science 296 2026 2028 Bleecker A B Kende H 2000 Ethylene a gaseous signal molecule in plants Annu Rev Cell Dev Biol 16 1 18 Bouny J M Saglio P H 1996 Glycolytic flux and hexokinase activities in anoxic maize root tips acclimated by hypoxic pretreatment Plant Physiol 111 187 194 Bradford M M 1976 A rapid and sensitive method quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal Biochem 72 248 254 Bucher M Brandle R Kuhlemeier C 1994 Ethanolic fermentation in transgenic tobacco expressing Zymomonas mobilis pyruvat decarboxylase EMBO J 13 2755 2763 Bulow L K hler U Cerff R Hehl R During K 1999 Induction of the maize GapC4 promoter in transgenic potato under anaerobiosis and in Erwinia carotovora inoculated tuber tissue Molecular Plant Microbe Interactions 12 182 188 Caturla M Chaparro C Schroeyers K
185. ollte innerhalb einer Stunde erfolgen 2 Material und Methoden 44 2 17 5 Hefetransformation Kompetente Saccharomyces cerevisiae Zellen wurden entsprechend dem Yeast Protocols Handbook von Clontech PT3024 1 transformiert Dazu wurden 1 ug des zu transformierenden Plasmids mit 0 1 mg denaturierter Heringssperma DNA und 100 ul kompetenten Hefezellen vereinigt Nach Zugabe von 600 ul PEG LiAc L sung 40 v v PEG 4000 1x TE 1x LiAc folgte 10 Sekunden langes Mischen Vortex und eine 30 min tige Inkubation bei 30 C unter Sch tteln 70 ul zugef gtes DMSO wurden durch Invertieren mit dem Transformationsansatz vermischt bevor die Hefezellen einem 15 min tigen Hitzeschock bei 42 C ausgesetzt wurden Der Transformationsansatz wurde 1 2 Minuten auf Eis abgek hlt die Zellen 5 Sekunden pelletiert in 500 ul 1x TE resuspendiert und auf entsprechendem Selektionsmedium ausplattiert Nach 2 4 t giger Inkubation bei 30 C traten Transformanten auf 2 17 6 Plasmidminipr paration aus Hefe Saccharomyces cerevisiae Die Plasmidisolierung aus Hefe wurde nach einem Protokoll von Piper 1996 durchgef hrt Die Hefezellen aus insgesamt 3 ml einer ber Nacht Kultur wurden pelletiert und in 100 ul LiCl Triton X 100 Puffer 2 5 M LiCl 50 mM Tris HCI pH 8 0 4 v v Triton X 100 62 5 mM EDTA resuspendiert Zum Zellaufschlu wurden 0 2 g Glasperlen 0 45 um und 100 ul Phenol Chloroform Isoamylalkohol 25 24 1 zugef gt und
186. ologievergleich und Sequenzanalyse konnte LeACO5 aufgrund ihrer konservierten Dom ne der Fe II Ascorbat Oxidoreduktase Familie als eine neue funfte ACC Oxidase aus Tomate bestatigt werden Kapitel 3 3 15 Abb 23 ACC Oxidasen spielen eine wichtige Rolle im Ethylen Stoffwechsel Ethylen ist als pflanzliches Hormon f r Wachstum Entwicklung und f r die Stressantwort von Bedeutung Halliday et ai 2003 Insbesondere bei der Fruchtreifung spielt Ethylen eine gro e Rolle H ufig f hrt Ethylen zur Aktivierung von Genen Sauter et a 2002 Infolge hoher CO2 und niedriger O2z Konzentration wird die ACC Oxidase Aktivit t in Tomatenfr chten stimuliert wodurch der Ethylen Gehalt ansteigt Terai et a 1998 4 Diskussion 108 Dem entsprechend wurde in der gewebespezifischen Northern Blot Analyse eine besonders gro e Transkriptmenge der isolierten ACC Oxidase in anaerob lt 1 O2 20 CO inkubiertem Fruchtgewebe nachgewiesen Abb 21 S Adenosyl L Methionin wird durch die ACC Synthase in die zyklische Aminos ure 1 Aminocyclopropan 1 carboxyls ure ACC umgewandelt und anschlie end durch die ACC Oxidase zu Ethylen oxidiert F r diese oxidative Ringspaltung von ACC zu Ethylen Cyanid und CO ben tigt die ACC Oxidase Fei als Cofaktor Ascorbat als Cosubstrat und molekularen Sauerstoff Thrower ef a 2001 Da diese Reaktion also Sauerstoff abh ngig ist kann unter Anaerobiose keine Ethylensynthese erfolgen Sowohl in Enzym Assa
187. oska S Altmann T Buckhout T J 2001 Response of Arabidopsis to iron deficiency stress as revealed by microarray analysis Plant Physiol 127 1030 1043 Thomine S Zimmermann S Guern J Barbier Brygoo H 1995 ATP dependent regulation of an anion channel at the plasma membrane of protoplasts from epidermal cells of Arabidopsis hypocotyls Plant Cell 7 2091 2100 6 Literaturverzeichnis 126 Thompson J D Gibson T J Plewniak F Jeanmougin F Higgins D G 1997 The ClustalX windows interface flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucl Acid Res 24 4876 4882 Thrower J S Blalock R Klinman J P 2001 Steady state kinetics of substrate binding and iron release in tomato ACC oxidase Biochemistry 40 9717 9724 T pfer R Schell J Steinbiss H H 1988 Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells Nucl Acid Res 16 8725 Trevaskis B Watts R A Andersson C R llewellyn D J Hargrove M S Olson J S Dennis E S Peacock W J 1997 Two hemoglobin genes in Arabodopsis thaliana the evolutionary origins of leghemoglobins Proc Natl Acad Sci USA 94 12230 12234 van Dongen J T Schurr U Pfister M Geigenberger P 2003 Phloem metabolism and function have to cope with low internal oxygen Plant Physiol 131 1529 1543 Vert G Briat J F Curie C 2002 Ar
188. osphorylierung durch die Kinase aktiviert und stimuliert als Antwort auf die verringerte O gt Konzentration die Expression Stickstoff fixierender Gene Auch in Hefe ist H m f r die Aktivierung und Repression von Genen wichtig die als Antwort auf Oz Konzentrations nderungen erfolgen Zitomer und Lowry 1992 Bei S ugetieren basiert die O2 Signalaufnahme auf reversibler O gt Bindung durch H moproteine oder auf der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch NAD P H Oxidasen in den Mitochondrien L pez Barneo et al 2001 Zus tzlich gibt es wahrscheinlich auch andere Sauerstoffsensoren in eukaryotischen Zellen die Eisen unabh ngig funktionieren Quinn et at 2002 In Maiswurzeln wurde eine Induktion von H moglobingenen infolge von berflutung detektiert wodurch H m auch in h heren Pflanzen eine Rolle in der Wahrnehmung von O2 Konzentrationsanderungen spielen k nnte Nie ef al 1996 Durch geringe O2 Konzentrationen wird das Klasse 1 H moglobingen GZ amp 7 in Arabidopsis Klok ef al 2002 und in Gerste Taylor et al 1994 induziert Die Uberexpression von GLB1 aus Arabidopsis f hrt zu einem gesteigerten Wachstum unter normalen Sauerstoff 7 Einleitung 3 bedingungen sowie zu gesteigerter Toleranz gegen ber Hypoxia Hunt et ai 2002 Bei Uberexpression von mutiertem GLB1 geht Hypoxia Toleranz jedoch aufgrund der reduzierten O2 Bindungsaffinitat verloren Diese Beobachtung zeigt dass eine hohe Liganden Bindungsaffinit t
189. owie eine Leucin Zipper Dom ne die charakteristisch f r bZIP Transkriptionsfaktoren ist Kapitel 3 3 1 Abb 9 Aufgrund einer phylogenetischen Analyse der bZIP Dom ne von ABZ1 konnten besonders hohe Verwandtschaftsbeziehungen zu ebenfalls relativ kleinen bZIP Faktoren aus Mais Reis Tabak L wenm ulchen und Petersilie aufgezeigt werden die aus 133 bis 170 Aminos uren bestehen Kapitel 3 3 2 Abb 10 Von diesen konnte f r mLIP15 aus Mais ebenfalls eine Induzierbarkeit durch Anaerobiose nachgewiesen werden w hrend ABZ1 die h chste Sequenzidentit t mit BZI 4 der spezifisch in der Tabakbl te transkibiert wird zeigt bZIP Transkriptionsfaktoren aus Arabidopsis wurden aufgrund struktureller und funktioneller Merkmale in 10 Klassen eingeteilt Jakoby et al 2002 Gem dieser Gliederung kann ABZ1 der Subfamilie S small besonders kleiner bZIP Faktoren zugeordnet werden Die S Klasse stellt die Gruppe der die meisten Transkriptionsfaktoren angeh ren dar ABZ1 besitzt wie andere Mitglieder dieser Subfamilie relativ kurze amino und carboxyterminale Enden die keine strukturellen Homologien aufweisen Au erdem verf gt ABZ1 ber einen langen nicht translatierten 5 Bereich der ein offenes Leseraster mit hoch konserviertem Aminos uremotiv beinhaltet Kapitel 3 3 1 Abb 9 F r bZIP910 und bZIP911 wurde gezeigt dass die Anwesenheit ihrer 5 UTRs mit einem solchen uORF zu einer um ca 60 reduzierten Transkriptmenge des entspre
190. oxia Plant Physiol Biochem 32 1 10 Rivoal J Hanson A D 1994 Metabolic control of anaerobic glycolysis overexpression of lactate dehydrogenase in transgenic tomato roots supports the Davies Roberts hypothesis and points to a critical role for lactate secretion Plant Physiol 106 1179 1185 Roach P L Clifton 1 J F l p V Harlos K Barton G J Hajdu J Andersson l Schofield C J Baldwin J E 1995 Crystal structure of isopenicillin N synthase is the first from a new structural family of enzymes Nature 375 700 704 Robbins J Dilworth S M Laskey R A Dingwall C 1991 Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence Cell 64 615 623 Roberts J K M Callis J Jardetzky O Walbot V Freeling M 1984 Cytoplasmic acidosis as a determinant of flooding intolerance in plants Proc Natl Acad Sci USA 81 6029 6033 6 Literaturverzeichnis 123 Robinson N J Procter C M Connolly E L Guerinot M L 1999 A ferric chelate reductase for iron uptake from soils Mature 397 694 697 R mheld V Muller C Marschner H 1984 Localization and capacity of proton pumps in roots of intact sunflower plants Plant Physiol 76 603 606 Rolletscheck H Borisjuk L Koshcorreck M Wobus U Weber H 2002 Legume embryos develop in a hypoxic environment J Exp Bot 53
191. oxia tolerance in roots of lettuce seedlings J Exp Bot 51 1939 1944 Kee Y Yoo J S Hazuka C D Peterson K E Hsu S C Scheller R H 1997 Subunit structure of the mammalian exocyst complex Proc Natl Acad Sci USA 94 14438 14443 6 Literaturverzeichnis 119 Kikuchi K Ueguchi Tanaka M Yoshida K T Nagato Y Matsusoka M Hirano H Y 2000 Molecular analysis of the NAC gene family in rice Mol Gen Genet 262 1047 1051 Kircher S Wellmer F Nick P R gner A Sch fer E Harter K 1999 Nuclear import of the parsley bZIP transcription factor CPRF2 is regulated by phytochrome photoreceptors J Cell Biol 144 201 211 Klein T M Gradziel T Fromm M E Sanford J C 1988 Factors influencing gene delivery into Zea mays cells by high velocity microprojectiles Bio Tech 6 559 563 Klok E J Wilson I W Wilson D Chapman S Ewing R M Somerville S C Peacock W J Dolferus R Dennis E S 2002 Expression profile analysis of the low oxygen response in arabidopsis root cultures Plant Cell 14 2481 2494 K hler U Liaud M F Mendel R R Cerff R Hehl R 1995 The maize GapC4 promoter confers anaerobic reporter gene expression and shows homology to the maize anthocyanin regulatory locus C1 Plant Mol Biol 29 1293 1298 K hler U Mendel R Cerff R Hehl R 1996 A promoter for strong and ubiquitous anaerobic gene expression in tobacco
192. proteine inklusive potentieller ANA Aktivierungsdom ne ANA zo bzw ohne potentielle Aktivierungsdom ne ANA ee relativ zur GAL4 exprimierenden Positivkontrolle pCL1 im Yeast Two Hybrid System Die tiefergestellten Zahlen geben die klonierte ANA Sequenz in Aminos uren wieder Es sind die Mittelwerte der prozentualen Galactosidase Aktivit ten einschie lich ihrer Standardabweichungen angegeben 3 2 4 ANA bindet sequenzspezifisch an den CaMV 35S Promotor Da Transkriptionsfaktoren sequenzspezifisch an c s Elemente innerhalb von Promotoren binden wurde die DNA Bindungsaffinitat und spezifitat des Transkriptionsfaktors ANA anhand eines 118 Basenpaar langen DNA Fragmentes untersucht Die zentralen 100 Basenpaare dieses Fragmentes entsprechen der Sequenz des CaMV 35S Promotors von Basenpaar 159 bis 57 Das CaMV 35S Promotorfragment wurde als potentielle Zielsequenz fur ANA ausgew hlt da bereits durch DNA Footprint Experimente eine Bindungsaktivit t an das 162 bis 60 bp Fragment des CaMV 35S Promotors durch AtNAM gezeigt wurde Duval et a 2002 Bei AANAM handelt es sich um ein Protein der NAC Familie aus Arabidopsis thaliana das aus sich entwickelnden Samen isoliert wurde Die DNA Bindungsaktivitat von ANA wurde n vitro durch Gelshift Experimente analysiert Dazu wurde rekombinantes und aufgereinigtes 6xHis tagged ANA Protein eingesetzt Kapitel 2 13 ANA wurde zusammen mit radioaktiv markiertem CaMV 35S Promotorfragment zur Bind
193. r um ein zuf llig interagierendes Peptid als um eine Dom ne eines tats chlichen Interaktionspartners 4 Diskussion 103 Funktionell ist das Exo70 Protein in die Sekretion den Vesikel sowie den intrazellularen Transport involviert Mit einem Transducin homologen Peptid scheint ebenfalls nur ein kurzer Sequenzabschnitt von 202 Aminos uren eines deutlich gr eren Proteins der WD40 Repeat Familie das 1344 Aminos uren besitzt selektiert worden zu sein NP_187938 Die Homologie des interagierenden Peptids aus Tomate erstreckt sich nicht auf die WD40 Repeat Dom ne ber die Protein Protein Interaktionen erfolgen Aufgrund der geringen Gr e des klonierten Prey Fragmentes und der nicht enthaltenen bekannten Interaktionsdom ne stellt das selektierte Peptid m glicherweise ebenfalls nur ein Zufallspeptid dar das mit ABZ1 interagiert Transducin ist funktionell an der Signaltransduktion beteiligt Ein drittes mit ABZ1 interagierendes Peptid umfasst 148 Aminos uren Dieses klonierte Fragment ist homolog zu einer 179 Aminos uren langen putativen Untereinheit der ATP Synthase aus G ycine max CAA52349 Smith ef ai 1994 Aufgrund der hnlichen Gr en von selektiertem Peptid und Homolog besteht eine relativ gro e Wahrscheinlichkeit dass ABZ1 tats chlich mit dieser ATP Synthase Untereinheit aus Tomate interagiert Die ATP Synthase ist in Mitochondrien und Thylakoidmembranen lokalisiert und ist an der Photophosphorylierung beteiligt
194. r1 EC 60H v6 62S ezez Serl 8r9 91 0 09 S0SZ go Zese LZE oe sno sse 92 1201 76 707 L2 1809 L7 8029 zsiz 6221 22 oz o OL ezoe egent gcse ee sno sse 08 829 aaa 8Z EZ9E 66 C6ZE 8897 21 692 gL o ze ecez zeoeck ses esz sno sse g sze oss 66 LEE 98 SEL L2 S2OP Ly 96 brez Ian 008 Or o ce zzeg 62 84L22 012 rg sno sse Buu uw Bu um maeis Homann sie oe sve jou nl sno ene eene niu Le am am 907 ulag SE uusSNoB JepueUIe uoa yo ysjeddoq Ueue ys np puis uepinm pYyNebyounp uebe USSI Pelydsse UN Ue SIP e UEWEdXy uaau NZ pzgy uoa gey eyosuo EinBeJojne wn sio OWOld 39 sep e jOUOY Jop Je UN UsYE s eP NJSUOMOPEYA o 77S joydey Yerwudxeco weyejqyeqe ul ZGV P1VO 1D seg euewops unleiapgy ejjeuondimsueg eule sep yNJsuoysuoIsny 17g weu pw Jepo LZIV L9 LZIV Ww uewwesnz SNH SGE 104243 euyo Jepemjus epinm Uefietiodei ene seq SI 0 4UOY LO Jeun wEIS S u zu jsue WI Zgy uoa s jeuy a jeuOIyUN SEI 132 7 Anhang US FL 00 LZ OL 20 SZ 9 51 6S VOL SCH 0625 0821 O68 goJseUR SIE Re EH EH ag RE CT s P o oL oror Togo 960 90 Legre Cer qolseue 7yeqe SO 9L BEI 6S L t 68 99 os gze os 60z 00901 00 Lelogsz r sr esgetr gg golseue gyeqeL Cer go i es oe T ELZ or ve 0995 oo zz ez o rs tezse
195. ranslatiert wird ABZ1 Das berechnete Molekulargewicht des ABZ1 Proteins betr gt 15 4 kDa und hat einen pKi Wert von 9 84 596 Basenpaare bilden die auffallend lange 5 UTR w hrend der 3 nicht translatierte Bereich 186 Basenpaare umfasst Innerhalb der 5 Leaderregion tritt ein konservierter upstream gelegenes offenes Leseraster UORF auf der die Basenpaare 358 bis 447 umfasst Dieser enth lt ein den uUORFs anderer pflanzlicher bZIP Faktoren hnliches Aminos uresequenzmotiv das vermutlich eine post transkriptionelle Kontrolle impliziert Martinez Garcia ef a 1998 Jakoby ef ai 2002 Innerhalb des UORF von ABZ1 treten hoch konservierte Aminos uren dieses Sequenzmotivs auf Fettdruck Das 352 bp lange SSH Fragment ist ber 320 bp identisch mit dem D Bereich der ABZ1 codierenden Sequenz und 32 bp entsprechen der 5 gelegenen Sequenz der nicht translatierten Region Unterstreichung Der N terminale Bereich der keine Struktur Homologien aufweist besteht aus 24 Aminosauren wahrend der C Terminus ohne strukturelle Homologien 38 Aminos uren lang ist An relativ zentraler Position innerhalb des Proteins ist die sog bZIP Dom ne von ABZ1 lokalisiert die 76 Aminos uren umfasst Die bZIP Dom ne wird in eine basische sowie eine Leucinzipper Dom ne unterteilt Die basische Dom ne beinhaltet die Aminos uren 25 bis 46 Unterlegung ist durch einen hohen Anteil an basischen Aminos uren charakterisiert und dient als DNA 3 Ergebniss
196. ren zu gewinnen wurden isolierte Hefeplasmide durch Hitzeschock in XL1 Blue Zellen transformiert Dazu wurden 3 ul der Plasmid DNA Kapitel 2 17 6 und 50 ul kompetente E coli Zellen eingesetzt und auf LB Platten die mit 100 ug ml Carbenicillin supplementiert waren ausplattier pGADT7 Rec besitzt n mlich als bakteriellen Selektionsmarker das Ampicillin Resistenzgen Die aus E coli aufgereinigten Plasmide wurden f r Retransformationen eingesetzt Kapitel 2 17 5 und ihre cDNA Inserts sequenziert Die Nucleotidsequenzen zweier isolierter und aus E co isolierter Prey Peptide wurden durch PCR amplifiziert Kapitel 2 13 1 wobei die Annealingtemperatur 65 C betrug Die verwendeten Templates und Primer sind in Tabelle 5 aufgef hrt PGADT7 Rec16 tr gt 2 Material und Methoden 43 ein cDNA Insert das Homologien zu einem IDS4 like Protein aufweist w hrend pGADTT7 Rec42 ein ACC Oxidase Peptid exprimiert Die PCR Produkte wurden mittels QlAquick PCR Purification Kit von Qiagen aufgereinigt und unter Verwendung des HexaLabel DNA Labeling Kits von MBI Fermentas radioaktiv markiert Die Sonden wurden zum Screenen der anaeroben cDNA Bank aus Tomate sowie f r Northern Blot Hybridisierungen eingesetzt Tab 5 Template DNA und PCR Primer die zur Amplifikation der Nucleotidsequenz der Prey Peptide eingesetzt wurden Plasmid DNA Nr Primer DNA Nr Sequenz pGADT7 Rec16 3979 YTH16 5 3933 5 AAAGAGAGGGTAGCTGAGATG 3 YT
197. rh hte Expression des CaMV 35S Promotors durch ANA gezeigt werden Kapitel 3 2 5 Abb 8 Die Abbildung 24 fasst die Ergebnisse der funktionellen Analyse von ANA in einem Modell zusammen das auf den Ergebnissen des transienten Cotransformations Experiments mit ANA beruht M glicherweise kompetiert ANA trotz unterschiedlicher Bindungsspezifit ten mit endogenen bZIP Transkriptionsfaktoren aus Tabak um das as 1 Element im CaMV 35S Promotor Diese Hypothese wird durch die Beobachtung unterst tzt dass ANA nach transienter Coexpression mit dem 35S GUS Konstrukt nicht wie erwartet zu verst rkter GUS Aktivit t im Vergleich zur GUS Expression allein f hrt Da ANA eine relativ geringe transaktivierende Wirkung unter Aerobiose aus bt resultiert in Folge des Verdr ngens st rkerer Tabak bZIP Aktivatoren durch ANA sogar eine verringerte CaMV 35S Promotoraktivit t r Transkription ANA w gt Transkription ANA Se Abb 24 Modellvorstellung der Regulation des CaMV 35S Promotors hellblau nach transienter Coexpression von ANA gr ne Kugel unter aeroben Bedingungen Gr ne Kreuze bZIP Transaktivatoren Fettdruck Zielsequenzen innerhalb des as 1 Elements der jeweils bindenden Faktoren 4 Diskussion 96 4 4 ABZ1 ein Mitglied der S Klasse von bZIP Faktoren ABZ1 konnte zun chst durch in silico Analyse seiner Prim rstruktur als bZIP Transkriptionsfaktor identifiziert werden und besitzt eine basische s
198. romons Spain et a 1995 Daher wird angenommen dass alle Proteine dieser Familie in die G Protein assoziierte Signaltransduktion involviert sind Wenn AlL wie SYG1 ber seine SPX Dom ne an die Untereinheit von G Proteinen binden w rde k nnte es solche Signaltransduktionswege die unter Anaerobiose nicht ben tigt werden inhibieren Andere Proteine die an der Regulation des Phosphattransports beteiligt sind besitzen ebenfalls eine SPX Dom ne Dazu z hlen PHO81 aus Hefe Lee et al 2000 und das menschliche XPR1 Protein die als putative Phosphatsensoren Komponenten der G Protein assoziierten Signaltransduktion darstellen k nnten Battini et al 1999 PHO81 bildet n mlich stabile Komplexe mit Cyclin und einer Cyclin abh ngigen Kinase und inhibiert die Kinase in Zellen in denen Phosphatmangel auftritt Huang et at 2001 In Analogie k nnte das anaerob induzierte AIL den Zellzyklus inhibieren und dadurch f r den Zelltod anaerober Wurzelspitzen Subbaiah et ai 2000 sowie die damit verbundene Wachstumshemmung verantwortlich sein 4 8 3 Eine neue anaerob spezifische ACC Oxidase Die anaerob induzierte und mit ABZ1 interagierende ACC Oxidase aus Lycopersicon esculentum LeACO5 ist ein Homolog einer ACC Oxidase aus Solanum tuberosum AAM29183 Zanetti ef a 2002 Die ACC Oxidase aus Kartoffel umfasst 312 Aminos uren und ist wie LeACO5 Stress induziert Ihre Expression wird infolge von Pathogeninfektion hochreguliert Nach Hom
199. rplasmide durch C1 ersetzt wurde 2 15 2 2 Transformation von Tabak und Tomaten Blattmaterial Im Folgenden werden die Untersuchungen an transient transformiertem Pflanzengewebe beschrieben die an Blattmaterial sowohl von Tabak als auch von Tomatenpflanzen vorgenommen wurden F r die transienten Assays zur Analyse der Regulation des CaMV 35S Promotors durch ANA bzw ABZ1 wurden Blatt Explantate 2 4 Monate alter Tabakpflanzen ausgestanzt die einen Durchmesser von 4 cm aufwiesen Das zu transformierende Blattmaterial wurde auf feuchtem 3MM Whatmanpapier ausgelegt Um die Auswirkungen von ANA auf den CaMV 35S Promotor zu analysieren wurde ein Reporter pRT10 35S GUS zusammen mit einem Effektor pVKH 35S ANA pA1 bzw ohne Effektor pVKH 35S pA1 sowie einer Transformationskontrolle pC1L 1097 coexprimiert Dazu wurden 3 mg Gold mit quimolaren Mengen der entsprechenden Konstrukte beladen Tab 3a Es wurde eine Versuchsreihe mit 4 Transformations ereignissen durchgef hrt 2 Material und Methoden 35 Tab 3a Bezeichnungen und Mengenangaben der Konstrukte die zur transienten Analyse der CaMV 35S Promotor Regulation durch ANA eingesetzt wurden Effektor pVKH 35S ANA pA1 8 93 ug pVKH 35S pA1 8 25 ug Reporter pBT10 35S GUS 3 51 ug Kontrolle pC1L 1097 4 63 ug Um die Regulation des CaMV 35S Promotors durch ABZ1 zu untersuchen wurde vergleichbar verfahren Als Effektorkonstrukte wurden pVKH 35S pA1 pVK
200. rt Die Proteinextraktion aus transient transformiertem Blattmaterial erfolgte nach Transformationsereignissen und ggf nach Inkubationsbedingungen getrennt 2 15 2 3 Proteinextrakt Herstellung fur GUS und LUC Aktivitatsmessungen Das transient transformierte Blattmaterial das ein Frischgewicht von ca 0 3 g hatte wurde in fl ssigem Stickstoff mit M rser und Pistill zerkleinert in vorgek hlte Eppendorfgef e berf hrt und zun chst in fl ssigem Stickstoff aufbewahrt Nach Zugabe von 100 ul Extraktionspuffer 0 1 M NaH gt PO4 pH 7 8 1 mM DTT wurden die Proben auf Eis aufgetaut und gr ndlich homogenisiert Vortex Das Pflanzenmaterial wurde 10 Minuten bei 25500xg und 4 C pelletiert und der berstand f r quantitative GUS und LUC Aktivit tsbestimmungen sowie Proteinkonzentrationsmessungen eingesetzt Kapitel 2 15 2 4 2 15 2 5 und 2 13 4 2 15 2 4 Quantitativer GUS Test Die GUS Aktivit tsmessung erfolgte nach Jefferson 1987 und Jefferson et al 1987 450 ul GUS Reaktionspuffer 1 mM 4 Methyl umbelliferyl B D glucuronid MUG 50 mM NaPO pH7 0 10 mM EDTA 0 1 v v Triton X 100 0 1 v v N Laurylsarkosin 10 mM Mercaptoethanol wurden auf 37 C temperiert bevor die Reaktion durch die Zugabe von 50 ul Proteinextrakt Kapitel 2 15 2 3 und Inkubation bei 37 C gestartet wurde Fur die Nullwertprobe wurde ein 50 ul Aliquot des Reaktionsansatzes nach einer Minute in 950 ul Stop Puffer 0 2 M Na2CO berf hrt GUSo
201. rt werden zusammengefasst Geigenberger 2003 1 1 Exogener Sauerstoffmangel Sauerstoffarme Bedingungen treten f r Pflanzen als Folge von berflutung und komprimierter B den auf Es werden zwei berflutungsarten unterschieden Entweder tritt ein berschu an Wasser ausschlie lich im Bereich der Wurzeln Rhizosph re auf oder die gesamte Pflanze einschlie lich ihrer oberirdischen Teile wird Uberschwemmt Zhang ef at 2000 Da die Diffusion von Gasen in Wasser ca 10000 fach langsamer verl uft als in Luft ist der Gasaustausch zwischen Pflanzengewebe und Atmosph re reduziert und es entstehen hypoxische oder anaerobe Bedingungen f r die Pflanze Armstrong 1979 Bei mikrobieller Respiration im Boden kann der Sauerstoff in der Rhizosph re innerhalb von weniger als 24 Stunden vollst ndig verbraucht sein Good und Paetkau 1992 Dann ist das Redoxpotential im Boden erniedrigt und reduzierte Substanzen wie NOz Mn Fei und H2S sowie Essig und Butters ure als Intermediate aus dem mikrobiellen Kohlenstoffmetabolismus werden akkumuliert Drew 1997 In phytotoxischen Konzentrationen k nnen diese Substanzen u a zur Sch digung von Pflanzen beitragen Wachstumsstop und verfr hte Seneszenz sind die Folge was zu betr chtlichen Einbu en im Ernteertrag wirtschaftlich relevanter Nutzpflanzen f hren kann Zhang ef ai 2000 Dennis et a 2000 Ito et a 1999 7 Einleitung 2 1 2 Endogener Sauerstoffmangel Neben externer Unte
202. rtergen Aktivit t im Vergleich zur GUS Aktivit t die nicht durch einen coexprimierten Effektor beeinflusst wird Dieses Ergebnis widerspricht scheinbar den Erwartungen Trotz einer potentiellen Aktivierungsdom ne die in Hefe nachgewiesen wurde Kapitel 3 2 3 zeigt ANA nach transienter Transformation in Tabakbl tter keine transkriptionsaktivierende Funktion Diese Beobachtung k nnte auf eine Kompetiton von ANA mit anderen Transkriptionsfaktoren um Bindungsstellen des Promotors zur ckzuf hren sein M glicherweise zeigt ANA zwar einen transkriptionsaktivierenden Effekt der jedoch nicht so stark ist wie die Wirkung anderer bekannter Transkriptionsaktivatoren 3 Ergebnisse 60 1000 00 213 900 00 800 00 700 00 600 00 500 00 400 00 300 00 200 00 GUS Aktivit t p gt mol4 MU min mg Protein 100 00 0 00 Effektor 35S ANA Reporter 35S GUS 35S GUS Kontrolle C1 LUC C1 LUC Abb 8 Cotransformationsexperiment zur Untersuchung des Effekts von ANA auf den CaMV 35S Promotor Tabakblattmaterial wurde transient durch die Partikelkanone mit einem Effektor einem Reporter und einem Kontrollplasmid cotransformiert Nach aerober Inkubation wurde die Reportergen Aktivit t in einem quantitativen Glucuronidase Test bestimmt und relativ zur Expression des Kontrollplasmids quantifiziert Die Mittelwerte und Standardabweichungen der gemessenen GUS Aktivit ten sind in pmol 4 MU mi
203. rvergleichs der bZIP Dom ne wird festgestellt dass ABZ1 einer Subfamilie kleiner bZIP Transkriptionsfaktoren angeh rt Eine funktionelle Gemeinsamkeit dieser kleinen Transkriptionsfaktoren besteht darin dass sie oft durch Stress transkriptionell induziert werden Jakoby et al 2002 3 Ergebnisse 65 3 3 3 Die basische Dom ne vermittelt die Kernlokalisierung von ABZ1 ABZ1 sollte als bZIP Transkriptionsfaktor funktionell im Zellkern aktiv sein Diese Annahme wurde bereits durch eine in silico Analyse der Aminos uresequenz auf ein Signalpeptid zur Kernlokalisierung unterst tzt Kapitel 3 3 1 und sollte experimentell verifiziert werden Da das Kernlokalisierungssignal gem der in silico Analyse in einem Bereich der Aminos ure 25 bis 44 lag wurden translationale Fusionskonstrukte zwischen ABZ1 Peptidsequenzen und dem GUS Reporterprotein hergestellt Kapitel 2 15 1 1 Einerseits wurde die gesamte codierende Sequenz von ABZ1 die 138 Aminos uren einschlie t in pRT103 kloniert ABZ11 13s GUS Andererseits wurden C oder N terminale Deletionskonstrukte des ABZ1 kloniert Die verk rzten Konstrukte ABZ11 24 GUS und ABZ145 138 GUS enthalten das vorausgesagte Signalpeptid nicht w hrend das Konstrukt ABZ11 44 GUS die 44 N terminalen Aminos uren inklusive des Kernlokalisierungssignals beinhaltet Die tiefergestellten Zahlen der Konstruktbezeichnungen geben die klonierte Sequenz in Aminos uren wieder Durch die Partikelkanone wurden
204. rversorgung mit O2 wird auch eine ausschlie lich endogen limitierte Sauerstoffversorgung in Pflanzen beobachtet obwohl sie unter normalen Sauerstoffbedingungen 21 v v stehen In Wurzelmeristem Ober und Sharp 1996 und Phloemgewebe van Dongen ef ai 2003 f llt der O2 Gehalt ab weil es sich um metabolisch besonders aktives Gewebe mit hohem O2 Verbrauch und ohne gro e interzellulare Luftraume handelt Au erdem sind Zellen betroffen die nur wenige Vakuolen besitzen oder die im Zentrum eines Organs lokalisiert sind Geigenberger 2003 In Erbsensamen ist der Sauerstoffeintritt durch kutinisierte Zellschichten der Samenh lle behindert Rolletscheck ef at 2002 1 3 Signalaufnahme und weiterleitung bei Hypoxia und Anaerobiose Wie nehmen Pflanzen Ver nderungen der Sauerstoff Konzentration wahr Wird der R ckgang des O2 Gehaltes in anaeroben Zellen durch ein niedriges ATP Level oder durch cytoplasmatische Ans uerung signalisiert Untersuchungen in Tabak Bucher et al 1994 und die Beobachtung dass bereits O2 Konzentrationen die noch oberhalb des Km Wertes der Cytochromoxidase liegen eine hypoxische Antwort verursachen deuten vielmehr auf eine Beteiligung von Rezeptormechanismen zur Signalaufnahme hin Abb 1 Rhizobium meliloti besitzt z B ein Zweikomponenten Regulationssystem Gong ef al 1998 Dieses besteht aus einer O2 bindenden Hamoproteinkinase als Sensor und einem Transkriptionsfaktor Dieser Transkriptionsfaktor wird nach Ph
205. s die zu RBSS1 da keine vollst ndige Kompetition mit RBSS1 als spezifischem Kompetitor m glich ist Abb 12 Bei allen anderen im EMSA berpr ften potentiellen Zielsequenzen die nicht vollst ndig der Consensus Sequenz entsprechen scheint das Nucleotid an Position 5 eine wichtige Rolle zu spielen Ein C an dieser Position f hrt offensichtlich zu einer stark reduzierten Bindungsspezifit t auch wenn alle anderen Positionen mit Nucleotiden der Consensus Sequenz belegt sind RBSS8 vgl Abb 12 und Tab 7 Weichen die gem des IUPAC Codes eindeutigen Nucleotide an den Positionen 3 und 3 von der Consensus Sequenz ab so ist vermutlich das T an Position 5 f r die geringe Bindungsspezifit t im EMSA verantwortlich RBSS 9 vgl Abb 12 und Tab 7 Denn bei Vergleich von RBSS9 mit 4 Diskussion 98 RBSS5 wird festgestellt dass Position 5 eine h here Priorit t f r die DNA Bindung haben mu als die einzige weitere relevante Position 2 Die ermittelte Consensus Sequenz erhebt keinen Anspruch auf Vollst ndigkeit Die Anzahl der sequenzierten putativen Zielsequenzen ist unter Ber cksichtigung der Anzahl der selektierten Nucleotidpositionen zu gering um ein signifikantes Ergebnis zu erhalten Au erdem wurde nicht die DNA Bindung aller selektierten Zielsequenzen im EMSA verifiziert Dennoch sind deutliche Parallelen zu den Consensus Bindesequenzen der Faktoren bZIP910 und bZIP911 aus Antirrhinum majus die ebefalls der S Klasse der b
206. schaften besitzt Da zahreiche Adaptionsmechanismen der Pflanzen bei Anaerobiose auf eine Umstellung der Genexpression zur ckzuf hren sind sind anaerob spezifische Transkriptionsfaktoren als Komponenten der Genregulation besonders interessant W hrend einige Transkriptionsaktivatoren isoliert und analysiert wurden die in die anaerobe Signaltransduktion involviert sind ist nur wenig ber die transkriptionelle Repression bei Sauerstoffmangel bekannt Deshalb wurde einerseits ein NAC Transkriptionsfaktor und andererseits ein potentiell reprimierend wirkender bZIP Faktor funktionell untersucht Basierend auf den Erkenntnissen welche Reaktionen und Mechanismen in h heren Pflanzen unter Anaerobiose ablaufen k nnten Strategien entwickelt werden um Nutz pflanzen eine erh hte Toleranz gegen ber abiotischem Sauerstoff Stress zu verleihen 2 Material und Methoden 13 2 Material und Methoden 2 1 Chemikalien Alle nicht naher erlauterten Chemikalien wurden von den Firmen BD Biosciences Bio Rad Biozym Duchefa Fluka Merck Serva Sigma Pharmacia Biotech Riedel De Haen und Roth bezogen Medien bzw L sungen wurden sofern nicht anders beschrieben mit deionisiertem bzw doppelt destilliertem Wasser angesetzt 2 2 Filtermaterialien und Membranen BioTrace NT 0 45 um Pure Nitrocellulose Transfer PALL GelmanSciences Membran 82 mm discs Hybond N Nylonmembran Microcon YM 10 Ni NTA Agarose Pharmacia Biotech Millipore Q
207. schen Stammbaums danken F r Rat und Tat bei den Fluoreszenz mikroskopischen Aufnahmen Western Blot Analysen und f r Tipps im Umgang mit Hefen m chte ich Claudia Bottner danken Kristin Schnettler danke ich f r die Erstellung einer genomischen Bank aus Tomate Ein ganz besonders herzlicher Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden f r ihr Verst ndnis und ihre Unterst tzung in jeglicher Hinsicht Lebenslauf Name Geburtsdatum Geburtsort Staatsangeh rigkeit Familienstand Schulbildung 1980 1984 1984 1993 1993 Berufsausbildung 1993 1995 Studium 1995 2000 1997 1998 1999 1999 2000 Dissertation seit Juli 2000 Ver ffentlichungen Simone Sell 16 07 1973 Kassel deutsch ledig Grundschule Br der Grimm Schule Baunatal Rengershausen Gymnasium Wilhelmschule Kassel Abitur Ausbildung zur Biologisch Technischen Assistentin Berufliche Schulen des Hochsauerlandkreises Olsberg Diplomstudiengang Biotechnologie an der TU Braunschweig Vordiplom TU Braunschweig Studienarbeit am Institut f r Pharmazeutische Biologie TU BS Diplomarbeit am Institut f r Genetik TU Braunschweig Studienabschluss Diplom Biotechnologin am 28 06 2000 Beginn der experimentellen Arbeiten am Institut f r Genetik AG Prof Dr Hehl TU Braunschweig Geffers R Sell S Cerff R Hehl R 2001 The TATA box and a Myb binding site are essential for anaerobic expression of a maize
208. seits aus Pflanzenmaterial das unter aeroben Bedingungen gehalten worden war und andererseits aus Pflanzen die 20 Stunden lang in einem luftdichten Plexiglascontainer Merck zusammen mit Anaerocult A Merck anaerob inkubiert worden waren isoliert Kapitel 2 10 2 Die cDNA Fragmente der Forward und Reverse Subtraktion wurden nach Zusatz von je 0 5 ul dATP 10 mM und Taq Polymerase 5U ul Qbiogene eine Stunde bei 72 C inkubiert um an den 3 Enden der PCR Produkte jeweils ein Adenosin anzuh ngen 30 ng der amplifizierten und modifizierten cDNA Fragmente wurden in den Plasmidvektor pCR 2 1 kloniert Dazu wurde der TA Cloning Kit von Invitrogen entsprechend dem Herstellerprotokoll eingesetzt 2 Material und Methoden 19 Die subklonierten cDNA Fragmente der Forward Subtraktion wurden mit Asal gespalten die Duplikagele der Restriktionsansatze geblottet und die Southern Blot Membranen mit den forward bzw reverse subtrahierten PCR Produkten bei 60 C hybridisiert Dabei erfolgte die radioaktive Markierung der PCR Produkte die Abtrennung der nicht inkorporierten Nucleotide die Hybridisierung und das Waschen der Filter wie in Kapitel 2 10 4 dargestellt 2 12 cDNA Bank Synthese F r die Herstellung einer anaeroben cDNA Bank aus Tomate wurde das SuperScript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning Invitrogen verwendet Die Durchf hrung entsprach dem Protokoll des Herstellers 5 ug PolyA m
209. sse Zi Lad mEoet Lem ege szer ozor ver eo zr reok uenl oc mei nee ess i e sno sse zo 1821 Le sel rege seeses osse iser see pro po ozzo er aeos zeor ezz a o ere 00 696 Sp 088262 wozzz orc sez ose roo oserei reztl oge og sno sse gees 20 165 geziz Geen co veae zie lmescslem ueglucece go szoiz oger ae Sno sse zav sse s6 218 og reg rg ver orz eet br o eege os szrz 809 wt sno sse izav sse 16 161 269 19 1082 aen ge ear soz oro euer zeiszes oze ont sno sse izav sse 06 264 EH DEE sg eg0z 02601 ooos ogsz logo Le ago0r azerzxlazrl 102 sno sse a oect or 999 Ce 16661 wrgecoz 00001 coeg eze zvo zs o9s61 zeiges z goal ei sno sse 61581 Lag Er Eg6El zeit 02601 orks ozge es o ze zzzzz ze ebLoe esee es sno sse 01 988 vos Oz LLL seg zuz cor see o o ze se9 zv ezez osz siz sno sse DE Ze va zer zozeel ver onuoy BS 1 2 voz ras rer 118981 901 siomuen eure ven DICH egen evoe egez on 200 auer sien ei ero DES Lzav dvrwo sse i 8 SNO SSE 6 061 gazsiz ceesto es 0629 ei vezi s09 ro se cezs usizea ese zor Leaks ee ee i S e S i d e SN SSE DIE 1628 Ze 1892 az eosz zgor ser vor 6000 age zone mt ro OS ce f e i R SN SSE DE dE 199208 regen 1202 over eze 200 geng angel tor eg anne ae f R sno sse Be zz9e 19892 1E 7508 envzes eure
210. stgestellt Insofern vermittelt der anaerobe Wurzelspitzentod m glicherweise einen adaptiven Vorteil und tr gt zu verbessertem berleben unter Anaerobiose bei Subbaiah er a 2000 Eine andere Form der morphologischen Antwort auf berflutung ist das hyponastische Wachstum von Pflanzen Cox ef a 2003 Innerhalb weniger Stunden richtet Rumex palustris seine Bl tter vertikal auf und bringt durch Elongation seiner j ngsten Petiolen seine vitalen Organe ber die Wasseroberfl che Die Folge ist eine Umstellung des Metabolismus von anaerob auf aerob so dass die Pflanze langfristig berflutung berleben kann 1 9 Hypoxische Akklimatisierung an Anaerobiose Unter nat rlichen Bedingungen ist es relativ unwahrscheinlich dass Wurzeln pl tzlich anaeroben Bedingungen ausgesetzt sind Eine graduelle Umstellung von Normoxia ber Hypoxia zu Anaerobiose erm glicht eine Akklimatisierung der Pflanze Ellis et ai 1999 Germain ef al 1997 Dann ist die Pflanze in der Lage nachfolgend anaeroben Bedingungen eine h here Toleranz entgegenzusetzen Zum Beispiel scheint Hypoxia 7 Einleitung 12 durch fruhe Expression anaerober Gene die Enzyme der alkoholischen Fermentation und der Milchs ureg rung codieren Adaption zu vermitteln Klok ef al 2002 Geigenberger 2003 Dadurch wird die Energieproduktion auch bei anschlie ender Anaerobiose gew hrleistet Die Transkriptmengen der erforderlichen Enzyme steigen unter hypoxischen Bedingungen a
211. t Demnach w re eine cytoplasmatische Interaktion mit Proteinen die der posttranslationalen Modifikation von ABZ1 dienen denkbar berraschenderweise scheint keiner der potentiellen ABZ1 Interaktionspartner direkt in die Transkription von Zielgenen involviert zu sein BZI 1 ein bZIP Transkriptionfaktor aus Tabak interagiert au er mit anderen Faktoren der bZIP Familie auch spezifisch mit dem cytosolischen Ankyrin Repeat Protein ANK1 Kuhlmann et al 2003 Diese Interaktion wird durch die hoch konservierte a helikale D1 Dom ne von BZI 1 und die vier C terminalen Ankyrin Repeats von ANK1 vermittelt ANK1 besitzt weder eine DNA Bindungsdom ne noch wirkt es als Co Aktivator der BZI 1 vermittelten Transkription n vitro inhibiert ANK1 jedoch die DNA Bindung von BZI 1 Daher wird angenommen dass ANK1 die Funktion von BZI 1 im Auxin Stoffwechsel sowie in der Pathogenabwehr reguliert Kuhlmann et ai 2003 hnlich wie ANK1 k nnten die in dieser Arbeit im Hefe Two Hybrid Screen identifizierten Proteine ebenfalls die Funktion von ABZ1 in der anaeroben Signaltransduktion beeinflussen und regulierend auf dessen Aktivit t einwirken 4 Diskussion 105 4 8 1 AIL ein potentiell durch Eisenmangel induziertes Protein und seine Bedeutung fur Anaerobiose Eisen ist ein essentielles Element f r Pflanzen Es wirkt als Cofaktor f r viele Enzyme wie z B f r die ACC Oxidase und katalysiert den Elektronentransfer in Mitochondrien und Chloroplas
212. t wurden einschlie lich ihrer internen DNA Nummer aufgef hrt wobei die tiefergestellten Zahlen die klonierten Sequenzen der codierenden Bereiche in Aminos uren angeben Spalte 1 pRT103 ABZ11 13s GUS und pRT103 ANAi1 301 GUS enthalten jeweils die gesamte codierende Sequenz der entsprechenden Proteine w hrend pRT103 ABZ11 44 GUS und pRT103 ANA4 136 GUS C terminal verk rzte Proteinfragmente enthalten Die N Termini der untersuchten Proteine die mit der B Glucuronidase fusioniert worden waren sind als pRT103 ABZ1 24 GUS das das potentielle Kernlokalisierungssignal NLS nicht mehr enth lt bzw pRT103 ANA1 76 GUS bezeichnet Das Konstrukt pRT103 ABZ145 138s GUS verf gt Uber ein C terminales ABZ1 Fragment ohne NLS pRT103 GUS wurde als Kontrollplasmid fur eine fehlende Kernlokalisation der B Glucuronidase eingesetzt Tab 2 Konstruktbezeichnungen die entsprechenden PCR Primerbezeichnungen sowie deren Sequenz die f r die Kernlokalisierungsstudien von ABZ1 und ANA eingesetzt wurden Plasmid DNA Nr Primer DNA Nr PCR Primer Sequenz RT103 ABZ11 138 74 5 Xhol 3476 5 TATACTCGAGATGTCACCTT TAAGGCAGAG 3 p Xho cus 2940 74 3 Ncol 3477 5 ATATCCATGGAAAATTTAAACAATCCTGATG 3 Nco RT103 ABZ11 44 GUS 74 5 Xhol 3476 5 TATACTCGAGATGTCACCTTTAAGGCAGAG 3 p Xh 2941 f S j 74 3 NLS Ncol 3478 5 ATATCCATGGGCTTCTTCATCCTCGATCGC 3 Nco RT103 ABZ11 24 GUS 74 5 Xhol 3476 5
213. te N terminale NAC Dom ne zur DNA Bindung sowie eine in Hefe nachgewiesene Aktivierungsdom ne im C Terminus Abb 4 und 6 Aufgrund seiner Homologie zu StNAC und den beiden NAC Faktoren aus Arabidopsis ATAF1 und 2 Acc No CAA52771 CAA52772 geh rt ANA wahrscheinlich zur ATAF Subfamilie die eine wichtige Rolle in der Stressantwort spielt Collinge und Boller 2001 Obwohl der NAC Transkriptionsfaktor ANA kein in silico nachweisbares Kernlokalisierungssignal besitzt kann er unter aeroben Bedingungen teilweise im Nucleus detektiert werden Kapitel 3 2 2 Abb 5 Auch CmNACP ein NAC Protein aus K rbis wird trotz fehlenden Kernlokalisierungssignals in den Zellkern transportiert Ruiz Medrano et al 1999 Im Gegensatz dazu verf gen andere Transkriptionsfaktoren der NAC Familie ber ein Signalpeptid zur Kernlokalisierung wie z B NAC1 das aus Arabidopsis isoliert wurde und in den Auxinstoffwechsel involviert ist Xie e a 2000 4 Diskussion 94 Untersuchungen an G Box Bindungsproteinen aus Petersilie ergaben dass die Translokation von CPRF4a in den Nucleus im Anschlu an seine cytosolische Phosphorylierung Licht abh ngig erfolgt Wellmer et ai 2001 Harter ef ai 1994 In Analogie zu CPRF4a ben tigt ANA m glicherweise anaerobe Bedingungen um vollst ndig in den Zellkern zu gelangen Desweiteren k nnten post translationale Modifikationsprozesse notwendig sein um eine Translokation von ANA in den Nucleus zu gew hrl
214. ten Eisen liegt h ufig im Boden vor Unter Sauerstoffmangel sinkt das Redoxpotential des Bodens und es kommt zur Akkumulation von reduzierten u a anorganischen Substanzen wie z B Fe Die Aufnahme solcher l slichen Eisenionen kann zu einem phytotoxischen Eisen Level in der Pflanze f hren Drew 1997 Im Gegensatz dazu bildet Eisen unter aeroben Bedingungen oft schwer l sliche Oxid oder Hydroxid Pr zipitate Fox und Guerinot 1998 Dann ist seine Verf gbarkeit f r Pflanzen limitiert Deshalb besitzen Pflanzen Mechanismen die es ihnen erlauben Eisen aus seiner unl slichen in seine l sliche Form zu berf hren um es aufzunehmen Jedoch m ssen diese Mechanismen sehr exakt reguliert werden damit kein oxidativer Schaden durch berm ige Eisenaufnahme f r die Pflanzen entsteht ds Iron deficiency specific Gene werden spezifisch bei Eisenmangel exprimiert Zuerst wurden solche Gene in Hordeum vulgare als h heren Pflanzen entdeckt IDS1 ein putativ Metall bindendes Protein Okumura et ai 1991 sowie IDS2 Okumura et al 1994 und IDS3 Nakanishi ef ai 1993 2 Oxoglutarat abh ngige Dioxygenasen wurden aus der Gerste isoliert Ihre Expression wird spezifisch bei Eisenmangelbedingungen in den Wurzeln induziert Es wird angenommen dass sie funktionell in die Synthese und Sekretion von Eisen Chelaten die als Phytosiderophore z B MA wirken sowie in die Absorption von Fe3 MA involviert sind Da es sich bei AIL jedoch um ein IDS
215. tergen Aktivit t unber cksichtigt Die S ulendiagramme in Abbildung 17 zeigen die Ergebnisse der vergleichenden Analysen in Tabak A und Tomate B Die GUS Aktivit t des anaerob inkubierten Blattmaterials ist in prozentualer Relation zur GUS Aktivit t unter aeroben Bedingungen die auf 100 gesetzt wurde dargestellt Den Mittelwerten und Standardabweichungen lagen bei Tabak 7 und bei Tomate 6 Me werte von jeweils 8 Transformationsereignissen zugrunde Anhang 7 4 In transient transformiertem Tabakblattmaterial sinkt die GUS Aktivit t unter anaeroben Bedingungen um ca 86 auf 14 Die GUS Aktivit t des transient transformierten Tomatenblattmaterials betr gt nach anaerober Inkubation noch ca 50 des aerob inkubierten Pflanzenmaterials Daraus wird geschlossen dass die Aktivit t des CaMV 35S Promotors sowohl in Tabak als auch in Tomate unter anaeroben Bedingungen schw cher ist Daher w re es m glich dass anaerob induzierte Transkriptionsfaktoren wie z B ABZ1 in die negative Regulation des CaMV 35S Promotors involviert sind 3 Ergebnisse 79 A 140 B 180 24 0 64 1 E 160 4 120 4 140 4 100 4 e Si 120 4 80 400 2 2 Ze e lt lt 80 4 21 2 a 650 d Oo oO 60 4 40 9 8 40 0 0 aerob anaerob aerob anaerob Abb 17 Experiment zur Untersuchung des Einflusses von Anaerobiose auf den CaMV 35S Promotor Blattmaterial von Tabak A und Tomate B wurde transient durch d
216. timmung nach Bradford Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Bradford 1976 vorgenommen Die Bradford Reagenz Roti Quant Roth wurde 1 5 mit deion H2O verd nnt Nach Vermischen von 1 ml dieser L sung mit 3 10 ul Proteinl sung und 10 min tiger Reaktionszeit wurde die Extinktion in Einmal Plastikk vetten bei einer Wellenl nge von 595 nm gegen eine entsprechende Nullwertl sung gemessen Die Eichgerade wurde aus einer BSA Stamml sung c 1 mg ml in Konzentrationen von 1 20 ug ml Protein pro Verd nnungsstufe erstellt und weiterhin wie die Proben behandelt 2 Material und Methoden 24 2 14 Analyse von Protein DNA Interaktionen 2 14 1 Random Binding Site Selection RBSS Assay Die Methode der PCR unterst tzten Bindungsstellenselektion wurde angewandt um die Spezifit t mit der ein Protein an eine DNA Zielsequenz bindet zu bestimmen Auf diese Weise sollte eine Consensus Zielsequenz f r den in dieser Arbeit isolierten Transkriptionsfaktor ABZ1 identifiziert werden Das Vorgehen erfolgte nach einem Standardprotokoll der Current protocols Ausubel 1988 Ausgangsmaterial war eine Oligonucleotidpopulation R64 die aus 10 zuf lligen Nucleotiden mit einer zentralen G Box core Sequenz ACGT besteht und von jeweils 25 bekannten Nucleotiden die als Primer Annealingsites notwendig sind flankiert werden Primer R 25 nt 5 CAGGTCAGTTCAGCGGATCCTGTCGN ACGT NSGAGGCGAATTCAGTGCAACTGCAGC 3 ja
217. tiv markierten Zufallsfragmente autoradiografisch visualisiert und aus dem Gel ausgeschnitten werden Die dsR64 Fragmente wurden in 250 ul Elutionspuffer 0 5 M Ammoniumacetat 1 mM EDTA 0 1 SDS ber Nacht bei 55 C eluiert Der Uberstand wurde mit 1 ug Glycogen und 500 ul Ethanol versetzt die DNA vier Stunden lang bei 20 C gef llt und anschlie end durch eine 1 st ndige Zentrifugation bei 15000xg pelletiert Nach Waschen der dsR64 Fragmente wurde das Pellet getrocknet und in 10 ul LTE 10 mM Tris pH 7 6 0 1 mM EDTA pH 8 0 aufgenommen F r die Bindungsreaktion wurden radioaktiv markierte dsR64 Fragmente mit einer spezifischen Aktivit t von 1x104 cpm 1 4 ug rekombinantes und aufgereinigtes ABZ1 sowie 0 2 2 ug Poly dl dC in einem Gesamtvolumen von 15 ul 1x Bindepuffer 10 mM Tris HCl pH 7 5 40 mM NaCl 1 mM EDTA 4 v v Glycerin 10 mM B Mercaptoethanol 10 mM DTT 5 mM PMSF Schindler und Cashmoore 1990 eingesetzt Die Reaktion verlief 30 Minuten lang bei Raumtemperatur Nach Zusatz von nicht denaturierendem 5x Ladepuffer 50 mM EDTA pH 8 0 50 mM Tris HCl pH 8 0 12 5 mg 10 ml Bromphenolblau 12 5 mg 10 ml Xylencyanol wurde der Bindungsansatz in einem nicht denaturierenden 6 5 igen Polyacrylamidgel 2 2 ml Acrylamid Rotiphorese 30 Gel 37 5 1 Roth 1 ml 10x Tris Glycin Puffer 10 ul TEMED 18 ul 30 iges APS ad 10 ml ddH20 in 1x Tris Glycin Puffer 25 mM Tris HCl 190 mM Glycin 1 mM EDTA pH 8 3 bei 4 C aufgetrennt Das Ge
218. torischen Elementen des ADH1 Promotors und sind somit offensichtlich f r die Genexpression unter Anaerobiose verantwortlich Klok ef ai 2002 Dazu z hlen u a das GC und GT Motiv innerhalb des ARE Anaerobic Response Element Die Abst nde zwischen diesen beiden Motiven variieren in Abh ngigkeit des betrachteten Gens von 26 bis 240 Basenpaare Auch der anaerob spezifische Promotor der Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase aus Mais besitzt typische Motive wie eine halbe G Box eine GC Box sowie drei GT Boxen die f r die anaerobe Expression verantwortlich sind Geffers ef ai 2000 AtMYB2 ein Transkriptionsfaktor der durch Trocken und Sauerstoff Stress sowie ABA induziert wird und an das GT Motiv des ADH1 Promotors bindet transaktiviert diesen wahrscheinlich zusammen mit AtMYC2 Hoeren et al 1998 Abe et al 2003 Weiterhin wurden ein G Box like Motiv ein 45 Motiv des ADH1 Promotors sowie ein Motiv das bereits durch DNA Footprinting Analyse entdeckt worden war als spezifische cis regulatorische Elemente von Genen eines bestimmten Expressionsprofils identifiziert Ferl und Laughner 1989 Au erdem konnte durch eine Footprinting Analyse gezeigt werden dass die Mais ADH1 und ADH2 Promotoren die beide durch Anoxia induzierbar sind sehr unterschiedliche Muster der Kernproteinbindung aufweisen Paul und Ferl 1991 Daher scheint das Vorhandensein von ARE like Elementen f r eine anaerobe Induktion allein nicht ausreichend zu sein
219. transduktion in Zusammenhang 4 Diskussion 104 Obwohl ABZ1 als Transkriptionsfaktor funktionell im Zellkern aktiv ist sind seine potentiellen Interaktionspartner mit Ausnahme des AIL vermutlich nicht im Nucleus lokalisiert Diese Annahme geht aus ihrer putativen Funktion hervor Demnach musste eine Interaktion mit diesen potentiellen Partnern im Cytoplasma erfolgen bevor ABZ1 in den Zellkern transportiert wird In einem hnlichen Vorgang dessen funktionelle Bedeutung allerdings unklar ist wird die intrazellul re Lokalisierung des bZIP Faktors RSG im Cytopasma sowie ihr Kerntransport durch ein 14 3 3 Protein reguliert Igarashi et al 2001 Das zweigeteilte Kernlokalisierungsignal von ABZ1 dessen Lage innerhalb der basischen Dom ne experimentell bestimmt werden konnte vermittelt jedoch den vollst ndigen Transport des bZIP Transkriptionsfaktors unter aeroben Bedingungen in den Nucleus Kapitel 3 3 3 Abb 11 Die Kernlokalisierung von ABZ1 bietet also keinen direkten Hinweis auf eine cytoplasmatische Retention Andererseits wird eine ABZ1 Mutante die lediglich ber den 44 Aminos uren langen N Terminus einschlie lich des NLS verf gt sowohl im Zellkern als auch im Cytoplasma detektiert Abb 11 Diese Beobachtung k nnte daraus resultieren dass z B entsprechende Phosphorylierungsstellen des C Terminus fehlen wodurch keine ausreichende Phosphorylierung erfolgen kann und kein vollst ndiger Transport in den Zellkern m glich is
220. ueqoseeue pun UeqoJee Jeun uogeqnyuj Je6ipu MmS pz YEN Zzs z eudeul HEIULLIOISUEH SNY SGE Hnysuoy UB IEIOdey 10 0 WOIZ Wep pw JueIsue EpiNM elejeugejg gt jege pun usfewo Wa SAS USJUSISULAN WI JEYAIPIY JOJOWOJd SGE AWED USgoleeue pun usgoJse Jap yplel leN EJ 7 Anhang 133 7 5 Yeast Two Hybrid Analyse auf ABZ1 Interaktionspartner Probe ODeoo t min ODa20 B Gal Einheiten Mittelwert Stabw B Gal Aktivitat Stabw P53 T 0 40 90 0 29 16 34 11 67 3 92 100 33 6 0 29 16 40 0 31 17 18 404 35 oto 10 29 0 17 9 52 0 21 11 34 0 60 120 o27 3 776 0 30 8 73 0 26 7 47 Lam T 1 20 845 0 33 0 65 0 40 0 18 3 1 6 0 32 0 64 0 31 0 62 092 1050 o16 02 0 18 0 37 0 17 0 35 057 1290 00 0o23 0 08 0 23 0 08 0 23 ZIP 1 90 845 0 92 1 14 0 84 0 27 7 2 3 0 90 1 12 oan 1050 025 oa 0 26 0 57 0 25 0 54 051 1290 o38 104 0 38 1 04 0 27 0 74 ZIP ATP Synth 0 77 90 0 44 12 68 9 63 3 35 83 28 7 0 45 12 85 0 44 12 53 ose 120 023 659 0 22 6 56 0 23 6 59 ZIP unknown 0 43 90 0 17 9 05 7 59 2 75 65 23 6 0 18 9 15 0 22 11 66 oan 120 ots san 0 18 5 27 0 18 5 13 ZIP ACC Oxid 0 84 90 0 38 10 11 7 54 2 73 65 23 4 0 37 9 79 0 39 10 19 058 120 o17 amp 5 07 0 17 5 04 0 17 5 07 Exo70 0 91 75 0 18 5 18 7 08 1 09 61 9 3 0 28 8 17 0 28 8 05 oe 105 023 674 0 24 7 03 0 25 7 33 ZIP
221. ukten Plasmidpr parationen aus E coli radioaktive Markierung von DNA Fragmenten ALF Sequenzreaktionen wurde nach Hersteller Protokollen verfahren Au erdem wurden Sequenzierungen mittels Cycle Sequencing entsprechend der Didesoxy Methode nach Sanger et ai 1977 extern bei Seqlab G ttingen durchgef hrt 2 10 Arbeiten mit Ribonucleins ure 2 10 1 Extraktion von Gesamt RNA aus Pflanzenmaterial Die RNA Isolierung aus pflanzlichem Gewebe erfolgte entsprechend einem Protokoll von Meyer Gauen et a 1998 Alle im Folgenden eingesetzten w ssrigen L sungen zur RNA Isolierung wurden mit 0 1 v v DEPC versetzt kr ftig durchmischt und nach ca 16 Stunden autoklaviert Den Puffern wurde RNAse freies Tris HCl erst nach der DEPC Behandlung zugesetzt um eine kovalente Bindung des DEPC an prim re und sekund re Amine zu vemeiden und so ihre Pufferwirkung zu gew hrleisten Das Pflanzenmaterial wurde durch M rsern unter fl ssigem Stickstoff aufgeschlossen und im 5 fachen Volumen bezogen auf die Materialeinwaage an 65 C warmem Extraktionspuffer 2 w v CTAB 100 mM Tris HCI pH 8 0 25 mM EDTA pH 8 0 2 M NaCl 8 w v Polyclar AT 2 v v 0 14 M B Mercaptoethanol homogenisiert Durch eine 5 min tige Zentrifugation bei 5500xg und 4 C wurden Zelltrummer und Polyphenole pelletiert Proteine wurden durch zweimalige Extraktion des Uberstandes mit jeweils einem Volumen Phenol Chloroform Isoamylalkohol 25 24 1 und 10 min tige Zentrifu
222. uktionsmedium 5 ml 2x MS Salzl sung 9 2 g l pH 5 4 1 25 ml 100 mM NaPO pH 5 4 5 ul 10 mM Acetosyringonl sung 10 ul Streptomycin c 10 10 ul Spectinomycin 10 ul Kanamycin c 50 ad 10 ml ddH20 resuspendiert und weitere 12 Stunden bei 30 C inkubiert Unterdessen wurden die Kotyledonen geerntet die Keimblattspitzen abgeschnitten und das verbleibende Blatt senkrecht zur Blattachse geteilt Die Explantate wurden mit der Blattoberseite nach oben auf MSOZR Medium MSO Medium mit 5 uM Acetosyringon und 20 mg l Zeatinribosid mit 0 6 Agar gelegt MSO Medium setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen 4 6 MS Salze 30 g l Saccharose pH 5 4 mit KOH autoklavieren 10 ml l 100x B5 Vitamine 10 mg Nikotinsaure 100 mg Thiaminhydrochlorid 10 mg Pyridoxinhydrochlorid 1 g Myoinositol ad 100 ml ddH O sterilfiltrieren Die Tomatenexplantate wurden 12 Stunden lang bei 24 C und unter Tag Nacht Bedingungen inkubiert Schlie lich wurden die induzierten Agrobakterien durch Zentrifugation bei 4300xg geerntet in 3 ml MSO Medium aufgenommen und durch 2 Material und Methoden 39 Zugabe von weiteren 15 ml MSO Medium verd nnt In dieser Bakteriensuspension wurden die Keimblattst cke 5 Minuten lang gebadet bersch ssige Fl ssigkeit wurde durch kurzes Trocknen der Explantate auf sterilem 3MM Whatmanpapier entfernt bevor das Pflanzenmaterial zur ck auf die MSOZR Platten transferiert wurde Nach einer 2 t gigen Inkubation unter den oben erl
223. ung des Proteins an die Promotorsequenz inkubiert Kapitel 2 14 Die Spezifit t eines potentiellen Protein DNA Komplexes wurde durch Einsatz eines spezifischen bzw unspezifischen Kompetitors berpr ft Als spezifischer Kompetitor wurde das 118 bp lange Fragment des 35S Promotors unmarkiert in 1000 3 Ergebnisse 58 fach molarem berschu eingesetzt Das 93 bp lange zuf llig ausgew hlte DNA Fragment uK93 Kapitel 2 14 1 1 diente in ca 1000 fach molarem berschu als unspezifischer Kompetitor Anschlie end wurden die Bindungsreaktionen in einem 5 igen nicht denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt Kapitel 2 14 3 Abbildung 7 zeigt das Autoradiogramm der im Polyacrylamidgel aufgetrennten Protein DNA Bindungsreaktionen Beim Kontrollansatz ohne Protein ist lediglich das Signal der freien Sonde S zu sehen Spur 1 Wird das radioaktiv markierte 35S Promotorfragment zusammen mit ANA in der Bindereaktion eingesetzt so tritt zus tzlich zur freien Sonde S ein retardierter Komplex K auf Spur 2 Dieser ist offensichtlich auf eine Interaktion zwischen Protein und radioaktiv markiertem Promotorfragment zur ckzuf hren Wird dem Protein spezifischer Kompetitor in 1000 fach molarem berschu im Vergleich zur Sonde zugef gt so bindet ANA pr ferentiell an das nicht radioaktiv markierte 35S Promotorfragment Daraus resultiert eine deutlich reduzierte Signalst rke des ANA 35S Komplexes Spur 3 Bei Zugabe von 1000 fach molarem
224. ungen der in E coli exprimierten Proteine sowie die Bezeichnungen der f r die PCR eingesetzten Templates Primer und Primersequenzen Protein Template Primer Sequenz DNA Nr DNA Nr ABZ1 pSport1 74 5 Primer 3468 5 TATAGGATCCATGTCACCTTTAAGGCAGAG 3 MT74 SEN A2 Primer 3469 5 ATATCCCGGGTTAAAATTTAAACAATCCTG 2 2738 Smal ANA pSport1 MT172 5 Primer 5 TATAGGATCCATGAACAAAGGAGCAAACGG 3 MT172 3493 Banua 3091 MT172 3 Primer 5 ATATGTCGACTTAGTAAGGTTTTTGCATGTATAGG 3 3494 SS ABZ11 100 pSport1 74 5 Primer 3468 5 TATAGGATCCATGTCACCTTTAAGGCAGAG 3 MT74 en ABZ1 Mu1 3 3936 5 ATACCCGGGTTATAAATACCTGAGCCTATCAGTC 3 2738 Sma Stop ABZ147 138 pSport1 ABZ1 Mu2 5 3935 5 TATGGATCCATGCTTCTGCAAGATTTGACAGG 3 MT74 BamH Start 2738 74 3 Primer 3469 5 ATATCCCGGGTTAAAATTTAAACAATCCTG 3 Smal 2 Material und Methoden 21 Nachfolgend sind die Zusammensetzung der PCR Reaktionen und das verwendete Temperaturprogramm aufgef hrt 1 ul Template 1 ng ul 2 ul 10x Advantage 2 Puffer Clontech 1 ul 5 Primer 100 pmol ul 1 ul 3 Primer 100 pmol ul 1 ul 10 mM dNTP 0 5 ul 5 U ul Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 13 5 ul ddH20 20 ul Gesamtvolumen 2 Minuten 94 C 30 Sekunden 94 C 1 Minute X C Annealing 30 Zyklen 2 Minuten 72 C 10 Minuten 72 C Die Annealingtemperaturen unterschieden sich in Ab
225. ungsvektor Klonierungsvektor CaMV 35S uwidA T DNA Vektor E coli Expressionsvektor cDNA Bank Vektor DNA BD Vektor Bait DNA BD Positivkontrollvektor DNA BD Negativkontrollvektor AD Vektor Prey AD Kontrollvektor Sma linearisierter AD Vektor Prey Positivkontrollvektor f r B Gal Test TATA uidA CaMV 35S uc C1 uc Bin rer Vektor GapC4 uidA Bin rer Vektor CaMV 35S uidA Referenz Invitrogen Stratagene T pfer ef al 1988 Reintanz 1997 Klaus Palme MDL K ln pers Mitteilung Qiagen Invitrogen Clontech Clontech Clontech Clontech Clontech Clontech Clontech Sprenger Haussels und Weisshaar 2000 T pfer et al 1988 Dietmar Stahl Planta GmbH Einbeck pers Mitteilung K hler et al 1996 B low ef al 1999 2 Material und Methoden 16 2 9 Molekularbiologische Techniken Allgemeine molekularbiologische Methoden Screening von cDNA Banken Kultivierungsbedingungen f r E col Herstellung kompetenter coli Zellen Hitzeschocktransformation von E coli Zellen Plasmidisolierung aus E col Gelelektrophorese und Southern Blot wurden nach Standardprotokollen von Sambrook et al 1989 durchgef hrt Restriktionsans tze und DNA Modifikationen wie Dephosphorylierung Generierung von glatten Enden sowie Ligationen erfolgten entsprechend den Hersteller Hinweisen der eingesetzten Enzyme Bei der Verwendung von Kits DNA Extraktion aus Agarosegelen Aufreinigung von PCR Prod
226. utiert In Abbildung 13A ist die Sequenz des 100 bp langen CaMV 35S Promotorfragmentes aufgef hrt Die drei putativen Bindestellen zeichnen sich durch palindromische Core Sequenzen aus Unterstreichung Eine der drei putativen Zielsequenzen ist die sog Activation Sequence 1 as 1 doppelte Unterstreichung die von diversen bZIP Transkriptionsfaktoren aus Tabak erkannt wird Krawczyk ef a 2002 Diese setzt sich aus einem vollst ndigen und einem unvollst ndigen Palindrom zusammen deren Zentren 12 Basenpaare von einander entfernt liegen Abbildung 13B zeigt dass die Gelshift Analyse zu zwei retardierten Protein DNA Komplexen f hrt Spur 2 von denen der gr ere Komplex K1 vollst ndig durch 4000 fach molaren berschu an sK1 kompetiert werden kann Spur 3 Der schneller wandernde Komplex K2 wurde dagegen nicht vollst ndig durch RBSS1 kompetiert Spur 3 Durch Zusatz des uK1 Fragmentes in 4000 fach molarem berschu wurde die ABZ1 Bindung an den 35S Promotor nicht beeinflusst und es wurden wieder zwei Protein DNA Komplexe ausgebildet Spur 4 Offensichtlich kommt K1 dadurch zustande dass ABZ1 zus tzlich zur Zielsequenzbindung die zu K2 f hrt weitere Zielsequenzen des 35S Promotorfragmentes mit geringerer Affinit t bindet Zusammenfassend wird festgestellt dass der rekombinante ABZ1 Transkriptionsfaktor sequenzspezifisch an den CaMV 35S Promotor bindet 3 Ergebnisse 72 A B 1 2 3 4 5 CGAGGAACATCGTGGAAAAAGAAGA
227. v6 0 e 8182 Lem os gsz os eg os se lol ov sezea ee ezov9 ver qoieeue porewol sc en 62 bz 19 921 orate oo szz oo ett zs o zeisasze oz locve soe qoieeue gojewoL et er ez Sz S6l ee Togo mei 98 o se sszps erger pre qoieue Zeie zie zo seo e ee e oe sz SC oz eze eaczloeecloenlogeea OezuiI 82 5 qoleeue oyewoL rot ors c 09502 06121 eezecr see Ier qoe aime REH eo ever a ecesh sze o8 06l oeee 950 gues se Go zssec oeze ele qose gewo eer se i os or vs 0zz osos os siz ona se o se gpizz ez eesez eps sgy qose soreuoL ve ez 9158 02 592 oa oeisez ogzz oo h ov gezea ee ezaro Sigel Le qose yaruo 99 op t ee 66 Lzz os szy 020g oeos zs o zeisasze oz tacve vzz0r geg qose gereuo DN rr tezel gezie o6 zee os zsz orsz 98 o eege eege erizi ser qose zereuoL va oor osz oss 90 8 807 ec zg erc geen os rze o0 zz oz o ogeen oezui zeer pos goe Leeuel KA Su um 6w um EIER Maas ENEE A wy Fra A ny Fra WE El tag ee sera osno asno nmu tem om oni eier aqosd J p UENEUUIWBESEIEHON UEANEIOI oi USPINM oos EI nelb NT4 uebozebupieu usgolg UEqoJee u pu yo idszu PIV SND ueqoleeue Jep Bunieisipiepugjs nz Juueyo Jepueule uoa yYoLysjeddoq ueule ys np puis uepinMm Hynmje ys np ue e ueys lpeiyssietun ue ap eege r cz GL zZ eidel use IEN Ge ap epinm us un upeg
228. verk rzte ANA Konstrukt besteht aus den 166 N terminalen Aminos uren von ANA pGBKT7 ANAj 166 und verf gt nicht mehr Uber seine eigene potentielle C terminale Aktivierungsdom ne 2 17 2 Herstellung einer cDNA AD Fusionsbank F r die cDNA Synthese wurde die SMART Switching Mechanism at D end of RNA Transcript Technologie von Clontech angewandt Dabei wurde nach dem MATCHMAKER Library Construction amp Screening Kit Handbuch PT3529 1 des Herstellers vorgegangen Als Ausgangsmaterial wurden 1 15 ug PolyA mRNA eingesetzt Kapitel 2 10 2 die aus 16 Stunden lang anaerob inkubiertem Tomatenpflanzengewebe Blatter Stengel Fuchte Wurzeln isoliert worden waren Die cDNA Erststrangsynthese mittels reverser Transkription erfolgte unter Verwendung der MMLV RT Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase und eines Random Primers CDS III 6 Dieser kann an viele unterschiedliche Sequenzen des mRNA Templates hybridisieren so dass eine cDNA Bank entsteht die eine Vielzahl an 5 und 3 Sequenzen in nahezu gleichen Verh ltnissen repr sentiert Am 2 Ende der cDNA werden aufgrund der terminalen Transferaseaktivitat der MMLV RT einige Desoxycytidine angeh ngt Durch Basenpaarung des SMART III Oligonucleotids das an seinem 3 Ende eine Oligo dG Sequenz enth lt mit dem dC Bereich entsteht ein verl ngertes Template Die RT f llt das um SMART IIITY verl ngerte D Ende der mRNA bis zum Ende des Oligonucleotids auf Diese zus tzl
229. webe wurde mit einem 540 bp gro en Hindll Fragment des GUS Gens als Sonde hybridisiert GUS Als Expressionskontrolle wurde eine transgene GapC4 GUS Pflanze analysiert Die Beladung des Gels ist durch Ethidiumbromid F rbung der ribosomalen RNA gezeigt rRNA 3 Ergebnisse 81 3 3 12 Selektion von potentiellen Interaktionspartnern des ABZ1 bZIP Transkriptionsfaktoren binden als Dimere spezifisch an DNA Zielsequenzen Kapitel 3 3 7 und 3 3 8 Dabei k nnen sie ber ihren Leucin Zipper Homo oder Heterodimere bilden Durch einen Screen nach interagierenden Peptidsequenzen sollen potentielle Interaktionspartner des ABZ1 im Hefe Two Hybrid System identifiziert werden Kapitel 2 17 Die mit ABZ1 interagierenden Proteine m ssen wie ABZ1 selbst unter Anaerobiose exprimiert werden Daher wurde in einem sog Prey Vektor eine Expressionsbank aus cDNA Fragmenten die aus mRNA anaerob inkubierter Tomatenpflanzen gewonnen wurden synthetisiert Kapitel 2 17 2 Der Prey Vektor exprimiert bei Klonierung der cDNA Fragmente im richtigen Leseraster Fusionsproteine mit der GAL4 Aktivierungsdom ne aus Saccharomyces cerevisiae Als Bait Konstrukt diente ein Fusionsprotein aus der GAL4 DNA Bindungsdomane und einem ABZ1 Peptid von Aminos ure 47 bis 138 das den Leucin Zipper aber nicht die basische Dom ne umfasst ZIP Kapitel 2 17 1 Seine Expression in Hefe wurde durch eine Western Blot Analyse nachgewiesen Daten nicht gezeigt Von 1x105 gescreente
230. ygen in Saccharomyces cerevisiae Microbiol Rev 56 1 11 7 Anhang 128 7 Anhang 7 1 Yeast Two Hybrid Analyse der ANA Aktivierungsdom ne B Gal Einheiten Mittelwert B Gal Aktivit t Stabw pCL1 1 103 6 0 213 0 197 0 753 8 0266 8631 0 28 0 275 417 5 0229 mam 0 209 0 201 ANA 301 0 959 30 0 277 19 26 17 34 2 12 23 2 76 0 276 19 19 0 268 18 63 0 854 35 0214 12 0 261 17 46 0 227 15 19 ANAt 166 1 012 1100 0 241 0 43 0 41 0 02 0 5 0 02 0 231 0 42 0 22 0 40 129 7 Anhang 206 er ec l 08850 ot SET SIE2UOY LZ OLL L9 9z At errzor LOL 861 SIE NUOY zes 009 zeree I nieozeoc I 69g z vol oro reeg reoi eer IT StL SNI STE VNV STE 90 191 oC r 88 6Z81 09 0 61 Iss z9z zur ovo zeis rg zs scpz et zit Sno Sse vive Co SI EL EI SC CL gea erz zse cro ugoe Leeoez 60g soz sno Sse WN Sse 08158 ZO OLE 686616 19 00 6 Geo zS ply 960 OOrres OOree9 806 97 SNO SSE 09 187 09 287 Zr LzSPl DEED 0 821 oess orra oo t zu gsog Agent one ezz SNO SSE 29 862 60 815 zo ZurS1 Zara pecz sgos pzez s9 o s giror LS 9SpLL pie osi SNO SSE 292 96 tZ IE lgczor e9e ver S1ENUOY eos op IT ele SES izel Te TU Tool el eee erecei a OCL SNO SSE VNV SSE FOE zs 801 RH LI SSZE vive gizz vee s o e
231. ys als auch in Western Blots wurde gezeigt dass die Proteinmengen der drei ACC Oxidasen aus Tomate pTOM13 GTOMA pHTOM5 sowie ihre Enzymaktivit t mit der Transkriptmenge ansteigen LeACO1 3 Holdsworth et al 1987a b Barry ef ai 1996 D h ihre Genexpression wird transkriptionell reguliert Dabei umfasst die Induktion verschiedene Gewebetypen und zahlreiche Entwicklungsstadien der Pflanzen Die Transkripte aller drei ACC Oxidasen werden allerdings mit Unterschieden in ihrer zeitlichen Kinetik w hrend der Bl tenentwicklung detektiert Seneszenz der Bl tter Fr chte und Bl ten f hrt zur mRNA Akkumulation von LeACO1 und LeACO3 Barry et al 1996 Transkriptionelle Induktion der LeACO1 wurde auch nach Verwundung von Bl ttern und gr nen Fr chten beobachtet Holdsworth et al 1987 Die LeACO4 wurde aus reifen Tomatenfr chten isoliert Nakatsuka ef a 1998 Sie wird ebenso wie LeACO1 in jungen Fr chten in denen noch keine erh hte Ethylenproduktion stattfindet transkribiert In reifenden Fr chten steigt ihre Transkriptmenge stark an Durch Behandlung mit MCP 1 Methylcyclopropen einem Ethyleninhibitor kann diese Zunahme jedoch zu einem gro en Anteil unterdr ckt werden was auf eine positive Feedback Regulation der LeACO4 Transkription durch Ethylen hinweist Nakatsuka et ai 1998 LeACOS ist wie die anderen ACC Oxidasen ein Enzym zur Synthese des pflanzlichen Hormons Ethylen Allerdings wird inre Expression Anaerobiose spezifisc
232. zeg rier vos ouez oses org ve o legen een soc ees sno sse Ce 0201 gees Sieg Co zteet ven veez seos paez ZZO pS 9LpOL oer vre mei sno sse Sw u L But uw mgeis uomen dur kung Aw y buet PUUN 6u uun osno osno sno om 2 am zm am IO eqold nd Ul 01d Luut JepueUIe uoa yo ysjeddoq uaua yo np puts Uepinm JYyNeByounp ue e ueya peryosiejun ue ap azuawnedxg Hane JOoJOWOlg SSE ANED UEP yoinp pum usioyeyg Jop uoisseidky oi zez jeydey peuudxeoo uiegeiiegel u LZAV PIVH SSE ZIseq euewopsbuneinpyy eleuogduysuey eue sep pinysuoysuoisny LZ8V Aw uewwesnz SN9 SSE Joeya euyo Jepemjus ep nM uebleyodey snd seq S10NU0Y SSE AWED Jeun Wa skg us usIsueN LUI ZG UOA as jeuy Sjlauonyung pE Zav weu yw spo JZAV SgE 131 7 Anhang Or 981 287602 091 EST SO NUOY le pepe cre E Ir wie Sck cp 8zz9 ogor 0221 Ego scerel SH lbp Tab Bee SASSSE avarya ZZ SSE Der 96 C6rZ gE 0892 pri zoer gizz oz o gries z eeigrer pzz Lre SNO SSe LZaV GWPIVD LO 01 628 Cer 6288101 BL SZEOL s 9 ezor ozel 6e 0 so es L ze seze see o z Sno Sse Lzav avrIVO 19 LS pez pr 06L ZVELZS Je eege 2162 iz6L t28 g o tg zosz 12 0097 olt 821 SNO SSe LZaV GVPIVO LO 16 677 DOC 86 1629 ge 8269 LL ovge Tra 860 Zeoroc F erL srz 167 SNO SSE LL LS eSz LS ESZ 2E 5092
233. zwei Minuten lang gr ndlich gemischt Vortex Nach 1 min tiger Zentrifugation bei 20000xg wurde der Uberstand mit 2 Volumen Ethanol versetzt die DNA 5 Minuten auf Eis pr zipitiert und schlie lich 10 Minuten bei 20000xg zentrifugiert Das DNA Pellet wurde mit 70 igem Ethanol gewaschen getrocknet und in 20 ul LTE aufgenommen Abschlie end wurde die DNA Konzentration photometrisch bestimmt Die isolierten Plasmide wurden zur Transformation durch Hitzeschock in E coli Zellen eingesetzt 2 17 7 Quantitativer B Galactosidase Test Die Untersuchungen zur quantitativen B Galactosidase Aktivitat erfolgten in Fl ssigkultur Als Substrat wurde o Nitrophenyl B D galactopyranosid ONPG das durch B Galactosidase in o Nitrophenol und D Galactose hydrolysiert wird eingesetzt Die enzymatische Aktivit t wird durch die resultierende Farbreaktion quantifiziert Das Versuchsvorgehen entsprach im Wesentlichen dem Yeast Protocols Handbook von Clontech 2 Material und Methoden 45 In 5 ml des entsprechenden SD Mediums wurden Hefe Uber Nacht Kulturen inokuliert und bei 30 C unter Schutteln inkubiert Ein Aliquot der Uber Nacht Kultur wurde in frisches Selektivmedium berf hrt so dass eine optische Dichte bei 600 nm von 0 2 0 3 gemessen wurde Die frische Kultur wurde weiterhin bei 30 C inkubiert bis sie eine ODso zwischen 0 5 und 0 8 aufwies und die exakte optische Dichte wurde notiert Es wurden 3x 1 5 ml der Kultur abgenommen und die Hefez

Der gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät

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