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1. 100 m 80 x 2 60 i O CCR7 T Zellen 3 CCR7 T Zellen 404 20 4 0 T w o OKT3 15E8 AK Abbildung 4 18 CCR7 T Zellen haben eine geringere Viabilitat als CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wurden in die CCR7 leere Balken und CCR7 T Zell Subpopulationen gestreifte Balken getrennt und in RPMI 1640 Medium ohne weitere Zus tze oder unter Zugabe des anti CD3 agonistischen Antik r pers OKT3 und des anti CD28 agonistischen Antik rpers 15E8 je 100 ng ml inkubiert Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit Annexin V und 7 AAD gef rbt und durchflusszytometrisch analysiert Zellen die mit Antik rpern irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps markiert wurden dienten als Kontrolle Abgebil det sind die Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen p lt 0 05 T Test w o ohne without Stimulation 71 Ergebnisse tik rper OKT3 und 15E8 kultiviert Zus tzlich wurde rekombinantes IL 2 IL 7 IL 15 IFN y TNF a oder TGF zugegeben T Zellen die ohne Zugabe eines Zytokins kul tiviert wurden dienten als Kontrolle Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit Annexin V sowie 7 AAD gef rbt und die Verteilung der Marker mittels Durchflusszytometrie ana lysiert IL 7 und IL 15 erh hten die Viabilit t von sowohl CCR7 als auch CCR7 T Zellen un abh ngig von der Gegenwart oder Abwesenheit der Antik rper OKT3 und 15E8 Da hingegen schr nkte TGF die Lebensf higkeit von sowohl unstimulierten als auch stimul
2. Die aufgef hrten Rezeptoren mit den in Abbildung 2 1 schematisch dargestellten Kon strukten wurden verwendet um T Zellen Spezifit t f r Tumor assoziierte Antigene zu verleihen Die variablen Fragmente der Rezeptoren sind spezifisch f r CEA BW431 26 oder CD30 HRS3 Die Antigen spezifische Dom ne der Rezeptoren ist durch einen Spacer aus der konstanten Region eines human IgG Antik rpers von der transmem branen und der intrazellul ren Dom ne des Rezeptors getrennt Zur Signalgebung die 22 Material nen die intrazellul re CD3Z Kette sowie zus tzliche kostimulatorische Signaldom nen wie CD28 und OX40 Die Rezeptoren wurden mit Hilfe retroviralen Gentransfers Ka pitel 3 3 8 unter Verwendung der Helferplasmide 392 und 393 in die T Zellen ein gebracht 439 BW431 26 scFv 523 ta HRS3 scFv 607 En 926 He 848 a CD32 975 A 5 0X40 Abbildung 2 1 Schematische Darstellung der Konstrukte in den verwendeten Rezeptoren Die variablen Fragmente scFv BW431 26 und HRS3 sind spezifisch f r die Antigene CEA und CD30 Es folgt als Spacer die konstante Region eines humanen IgG Antik rpers Fc die Transmembrandom ne TM sowie bis zu drei intrazellul re Dom nen pro Konstrukt Als intrazellul re Dom nen dienen CD3 CD28 und OX40 2 6 Antik rper Prim re AK Eigenschaften Klon Herstel unmarkiert ler Referenz Anti human CD197 monoklonaler Maus IgM Antik rper BD Biosciences sp
3. CEA und Tag72 humane Kolonkarzinom Zelllinie CD30 humane Hodgkinlymphom Zelllinie CD30 humane Hodgkinlymphom Zelllinie CEA murine Kolonkarzinom Zelllinie Derivat von MC38 CEA murine Kolomkarzinom Zelllinie Murine Hybridoma Zelllinie sezerniert den momoklonalen Maus IgG Antik rper OKT3 mit Spezifit t f r humanes CD3 Murine Hybridoma Zelllinie sezerniert den monoklonalen Maus IgG Antik rper 15E8 mit Spezifitat fiir humanes CD28 CD30 humane CTCL Zelllinie ATCC CL 188 ATCC CLL 220 1 Diehl et al 1982 Wolf et al 1996 Kanzler et al 1996 J Shively Duarte CA USA Corbett et al 1975 ATCC CRL 8001 R van Lier NCB Amsterdam NL Kaltoft et al 1992 21 Material 2 5 Plasmide Nr Vektor Konstrukt Referenz 392 pCOLI GALV retrovirales Helferplasmid Weijtens et al 1998 enth lt die Expressionskassette f r das GALV Gen env 393 pHIT60 retrovirales Helferplasmid enth lt Weijtens et al 1998 die Expressionskassette f r die MoMLV Gene gag und pol Protein 439 pSTITCH BW431 26scFv Fc CD3C Hombach et al 2000 523 pBullet HRS3scFv Fc CD3C unver ffentlicht 607 pBullet BW431 26scFv Fc CD28 CD3 C Hombach et al 2001 926 pBullet HRS3scFv Fc CD28 CD3 unver ffentlicht 848 pBullet BW431 26scFv Fc CD4 CD3L OX40 unver ffentlicht 975 _ pBullet BW431 26scFv Fc CD28 CD3L OX40 unver ffentlicht interne Labor Nummer
4. In der physiologischen anti Tumor Immunantwort sind zytotoxische T Zellen in Form von Tumor infiltrierenden Lymphozyten TILs an der Kontrolle des Tumorwachstums beteiligt Adoptiver Transfer ex vivo expandierter TILs von Tumorpatienten wird erfolgreich zur Therapie von Tumoren eingesetzt Allerdings ist die Anwendungsm glichkeit dieses Ansatzes durch den gro en Aufwand der Pr paration von TILs sowie der mangelnden Anzahl dieser Zellen in Tumorbiopsien be schr nkt Topalian et al 1989 Lewko et al 2000 Eine weitere immuntherapeutische Strategie unter Vermeidung der individuellen Pr paration von TILs und der Nutzung der Vorteile gewebepenetrierender zytotoxischer T Lymphozyten ist die genetische Modifikation von T Zellen mit Tumor spezifischen rekombinanten T Zell Rezeptoren definierter Spezifit t Dabei wird T Zellen un ter Erhaltung ihres Effektor und Homing Potenzials die Spezifit t f r ein Tumor assoziiertes Antigen TAA verliehen Einleitung TAAs wurden bei zahlreichen Tumoren nachgewiesen Das karzinoembryonale Anti gen CEA ist beispielsweise mit gastrointestinalen Karzinomen assoziiert Goldstein und Mitchell 2005 w hrend CD30 spezifisch auf Hodgkin Reed Sternberg HRS Zel len des Hodgkin Lymphoms hochexprimiert wird Schwab et al 1982 Obwohl TAAs nicht ausschlie lich auf Tumorzellen zu finden sind sondern physiologisch in gerin ger Konzentration auf normalem Gewebe exprimiert werden gelten sie al
5. Press O W Adoptive immunotherapy for indolent 118 Literaturverzeichnis non Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma using genetically modified au tologous CD20 specific T cells Blood 112 6 2261 2271 2008 Topalian S L Solomon D Rosenberg S A Tumor specific cytolysis by lymphocytes infiltrating human melanomas J Immunol 142 10 3714 3725 1989 Trapani J A Granzymes a family of lymphocyte granule serine proteases Genome Biol 2 12 REVIEWS3014 2001 Trapani J A Smyth M J Functional significance of the perforin granzyme cell death pathway Nat Rev Immunol 2 10 735 747 2002 Ueno T Saito E Gray D H D Kuse S Hieshima K Nakano H Kakiuchi T Lipp M Boyd R L Takahama Y CCR7 signals are essential for cortex medulla migra tion of developing thymocytes J Exp Med 200 4 493 505 2004 van Leeuwen E M Gamadia L E Baars P A Remmerswaal E B ten Berge I J van Lier R A Proliferation requirements of cytomegalovirus specific effector type human CD8 T cells J Immunol 169 10 5838 43 2002 Viola A Luster A D Chemokines and their receptors drug targets in immunity and inflammation Annu Rev Pharmacol Toxicol 48 171 197 2008 Wang J Jensen M Lin Y Sui X Chen E Lindgren C G Till B Raubitschek A Forman S J Qian X James S Greenberg P Riddell S Press O W Optimi zing adoptive polyclonal T cell immunotherapy of lymphomas usin
6. ber die f r die Immuntherapie am besten geeignete Effektorzellpopulation bekannt Da der CC Chemokinrezeptor 7 CCR7 die molekulare Basis f r die Auswanderung von T Zellen aus peripheren Geweben bildet haben wir untersucht ob durch die Ver wendung CCR7 T Zellen aufgrund ihrer gesteigerten Persistenz in peripheren Tumor l sionen eine h here Effektivit t adoptiv transferierter T Zellen erzielt werden kann CCR7 T Zellen verf gen ber zahlreiche Eigenschaften die sie als viel versprechen de Kandidaten f r einen zytolytischen T Zell Angriff auszeichnen Dazu z hlt die Ex pression gro er Mengen zytolytischer Effektormolek le erh hte IFN y Sekretion in Folge der Stimulation durch Immunrezeptoren wodurch eine anti Tumor Immunant wort durch Rekrutierung von Makrophagen verst rkt werden kann sowie schwache IL 2 Sekretion welche das berleben der Effektorzellen durch die Abwesenheit sti mulativer Bedingungen f r regulatorische T Zellen beg nstigt Genetisch modifizier te Antigen spezifische CCR7 T Zellen werden in vitro besser durch Immunrezeptor vermittelte Signalgebung zur Lyse von Tumorzellen aktiviert als CCR7 T Zellen Al lerdings zeichnen sich CCR7 T Zellen wie beispielsweise sp te Effektor T Zellen Effektor Ged chtnis T Zellen und terminal differenzierte T Zellen durch eine er h hte Apoptosefrequenz aus Rezeptor vermittelte Kostimulation mit CD28 CD3C OX40 nicht jedoch mit nur CD28 CD3 verhindert die Apopto
7. fl chenmarker detektiert werden sollten wurden diese zuerst gef rbt wie in Abschnitt 3 4 1 beschrieben Es wurde dann 250 ul Cytofix Cytoperm Solution BD Bios ciences Heidelberg Deutschland zu jedem FACS R hrchen gegeben Nach 20 min Inkubation bei 4 C wurden die Zellen zweimal mit BD Perm Wash Buffer BD Biosciences Heidelberg Deutschland gewaschen Anschlie end wurde der f r den gew nschten intrazellul ren Marker spezifische Antik rper zugegeben und 30 min bei 4 C inkubiert Nach zwei weiteren Waschschritten mit BD Perm Wash Buffer er folgte die Aufnahme der Zellen in PBS und deren Analyse mittels Durchflusszytome trie 3 5 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA ELISAs nach Engvall und Perlman 1971 wurden zum Nachweis sekretierter Zytoki ne wie IL 2 IL 10 und IFN y beispielsweise im berstand von XTT Assays verwen det Hierf r wurden zun chst 50 ul Well eines Fangantik rpers in Coating Buffer 1 7 ml 0 2M Na gt CO 0 8 ml 0 2M NaHCOs ad 10 ml H2Ogest auf 96 Well Mikro titerplatten mit Maxi oder Polysorp Eigenschaften Nunc Wiesbaden Deutschland aufgetragen Nach mindestens 2 h Inkubation bei Raumtemperatur auf dem Sch ttler wurde die Fl ssigkeit in den Platten verworfen und durch 200 ul Well Block Reagenz 3 w v BSA in PBS ersetzt Der anschlie ende Inkubationsschritt erfolgte wahl weise f r mindestens 2h bei Raumtemperatur auf dem Sch
8. 1 20 1 10 15 125 1 20 1 10 15 125 iO Verhaltnis Effektor Targetzellen CD3 T Zellen w o m CD3 CCR7 agra 4 CD3 CCR7 T Zellen 439 Abbildung 4 15 CEA spezifische CD3 CCR7 T Zellen lysieren CEA Tumorzellen effektiver als CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wurden zur Expression des anti CEA Rezeptors BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert und in die CCR7 und CCR7 4 T Zell Subpopulationen getrennt Die Koinkubation mit CEA LS174T Zellen oder CEAT Colo320 Zellen erfolgte f r 48 h in 96 Well Mi krotiterplatten Schein transduzierte CD3 T Zellen dienten als Kontrolle Es wurden bei 1 25 x 10 bis 1x 10 Effektorzellen Well konstant 2 5x 104 Tumorzellen Well eingesetzt Die Viabilitat der Tu morzellen wurde aus den nach Zugabe von XTT Reagenz gemessenen Absorptionen bei OD450 650 nm errechnet A Die IFN y Konzentration der Kultur berst nde wurde mittels ELISA ermittelt B Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen w o ohne without Immunrezeptor Ergebnisse gt 95 und anschlie end mit CD30 CEAT MyLa Zellen oder CD30 CEA LS174T Zellen koinkubiert CD30 spezifische CCR7 T Zellen lysierten CD30 MyLa Tumorzellen effizienter als CCR7 T Zellen mit demselben Immunrezeptor Auch CEA LS174T Tumorzellen wur den durch CCR7 T Zellen mit dem anti CEA Immunrezeptor besser lysiert als durch CCR7 T Zellen gleicher Spezifit t Die T Zell Aktivierung wurde sp
9. Anti human IFN y Anti human IgG monoklonaler Maus Antik rper spezifisch fiir humanes CCR7 Klon 150503 monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch fiir humanes CCR7 Klon 3D12 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch fiir humanes Karzinoembryonales Antigen Klon B1 1 CD66 monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch fiir humanes kutanes Lymphozyten Antigen Klon HECA 452 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Granzym A Klon CB9 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Granzym B Klon GB11 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Interferon y Klon 4S B3 F ab 2 polyklonales Ziegen Serum 27 R amp D Systems BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences Serotec Biolegend Southern Biotech Material Anti human IL 2 Anti human IL 10 Anti human Perforin Anti human TNF monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch fiir humanes IL 2 Klon MQ1 17H12 monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch fiir humanes IL 10 Klon JES3 19F1 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Perforin Klon 8G9 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanen Tumor Nekrose Faktor amp Klon MAb11 Biolegend Biolegend Ancell Biolegend Prim re AK Biotin markiert Eigenschaften Klon Hersteller Anti human IFN y Biotin Anti human IL 2 Biotin Anti huma
10. Methoden 30 mM Kaliumacetat 100 mM CaCl 15 v v Glycerin 50 mM MnCl pro 100ml LB Medium resuspendiert Die Suspension wurde 10min bei 4 C inku biert Anschlie end wurden die Zellen erneut sedimentiert 10min bei 1000xg und 4 C Nach Verwerfen des Uberstandes und Resuspension des Sediments in 4ml TfbII 10 mM MOPS 75 mM CaCl 10 mM KCI 15 v v Glycerin pro 30 ml TfbI wurde die Zellsuspension in Eppendorf Gef e aliquotiert und in fl s sigem Stickstoff schockgefroren Die Lagerung der kompetenten Bakterien erfolgte bei 80 C 3 1 3 Einbringen von DNS in kompetente E coli DH5a Transformation Kompetente Bakterien wurden auf Eis aufgetaut Nach Zugabe eines Ligationsansatzes oder 1 ug Plasmid DNA erfolgten 30 min Inkubation auf Eis Anschlie end wurden die Bakterien f r 90 s im Wasserbad bei 42 C inkubiert Nach einem weiteren Inkubations schritt f r 1 min auf Eis wurden 900 ul antibiotikafreies LB Medium zugegeben und der Ansatz 60 min bei 37 C und 200 UpM inkubiert Die Bakterien wurden sedimen tiert in 100 ul LB Medium resuspendiert und aufeiner ein Antibiotikum zur Selektion Plasmid tragender Bakterien enthaltende LB Agarplatte ausplattiert Die Kultivierung Plasmid tragender Klone erfolgte bei 37 C ber Nacht 3 2 Molekularbiologische Methoden 3 2 1 Isolation von Plasmid DNS aus E coli DH5 Die Isolierung von Plasmid DNS erfolgte mittels AnionenaustauschChromatographie nach Anleitung der Herst
11. T Zellen ist Weiterhin stellt sich die Frage nach den zu erwartenden Nebenwirkungen im Zusam menhang mit der Verwendung von CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen vermitteln starke zytolytische Aktivit t die nicht nur am Tumorort greift In dieser Arbeit wurde beob achtet dass bei intraven ser Injektion der T Zellen nekrotische L sionen an der Injek tionsstelle sowie an der Schwanzspitze der Versuchstiere auftraten M glicherweise ist die systemische Applikation CCR7 T Zellen daher mit starken autoimmunen Neben wirkungen verbunden Dies m sste jedoch zun chst durch Verwendung von CCR7 T Zellen mit Immunrezeptoren anderer Spezifit t aber gleicher Signalkette best tigt werden Auf Grund der limitierten F higkeit von CCR7 T Zellen aus peripherem Ge webe auszuwandern bietet sich jedoch eine intratumorale Applikation dieser Zellen an 104 Zusammenfassung Adoptiver Transfer ex vivo aktivierter und expandierter autologer Tumor reaktiver T Zellen ist gegenw rtig eine der Strategien mit der objektive Therapieerfolge in Pa tienten mit metastasierenden Tumoren erzielt werden k nnen Allerdings ist die Effek tivit t der adoptiven Immuntherapie h ufig eingeschr nkt durch das Unverm gen der ex vivo expandierten Zellen in vivo zu persistieren W hrend die modulare Komposi tion chim rer Immunrezeptoren die verwendet werden um Effektorzellen Spezifit t f r den Tumor zu verleihen immer weiter optimiert wird ist bisher nur wenig
12. anti IL 10 Klon JES3 19F1 oder anti IFN y Klon 4S B3 intrazellul r gef rbt und durchflusszytometrisch analysiert Ans tze die mit Antik rpern irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps markiert wurden dienten als Kontrolle Der Versuch wurde dreimal mit T Zellen unterschiedlicher Spender durchgef hrt Die Daten stellen Mittelwerte Standardabweichungen der Mittelwerte dar p lt 0 05 T Test 61 Ergebnisse 0 16 0 124 J x S 0 08 O CCR7 T Zellen O m CCR7 T Zellen 0 04 0 00 T T T T 1 0 1 2 3 4 5 Zeit Tage Abbildung 4 13 Isolierte CCR7 T Zellen sekretieren mehr IL 10 als CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wurden hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt und in RPMI 1640 Medium ohne weitere Zus tze kultiviert An Tag 1 2 3 und 5 wurden berst nde entnommen und deren IL 10 Konzentrati on mittels ELISA gemessen Abgebildet ist die von CCR7 O und CCR7 T Zellen sekretierte IL 10 Menge Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen p S0 05 T Test tiviert An Tag 1 2 3 und 5 wurden berst nde entnommen und deren IL 10 Konzen tration mittels ELISA gemessen Wie schon zuvor beobachtet sekretierten CCR7 T Zellen signifikant mehr IL 10 als CCR7 Zellen Abbildung 4 13 Diese Ergebnisse best tigen die bereits in vorhergegangenen Versuchen mit Rezeptor aktivierten Subpopulationen beobachtete Expression der drei Zytokine auch f r
13. ttler oder bei 4 C ber Nacht im K hlschrank Anschlie end wurde das Block Reagenz in den Platten ver worfen und diese wurden vier bis f nfmal mit PBS T PBS 0 1 v v Tween 20 gewaschen Nach Entfernung von Fl ssigkeitsresten auf den Platten durch Ausklop fen wurden dann 50 ul Well der zu testenden Fl ssigkeiten aufgetragen Es erfolgte 41 Methoden das Auftragen des Standards durch Titration einer bekannten Menge des zu untersu chenden Zytokins Die folgende Inkubation wurde f r mindestens 1 h bei Raumtem peratur auf dem Sch ttler durchgef hrt Nach Verwerfen der zu testenden Fl ssigkei ten wurden die Platten erneut vier bis f nfmal mit PBS T gewaschen und anschlie Bend mit 50 ul Well eines Biotin konjugierten Detektionsanktik rpers 0 5 ug ml versehen Nach einer weiteren einst ndigen Inkubation bei Raumtemperatur auf dem Sch ttler und anschlie endem Waschen mit PBS T wurde die Platten unter Zuga be von 50 ul Well 1 10000 verd nntem Streptavidin POD Roche Diagnostics Ba sel Schweiz f r 30 min inkubiert Die Platten wurden danach gr ndlich mit PBS T gewaschen und r ckstandslos ausgeschlagen Schlie lich wurden 50 ul Well ei ner ABTS L sung 1 mg ml ABTS in ABTS Puffer Roche Diagnostics auf die Plat ten gegeben Die darauf folgende Signalentwicklung wurde bei ODy05 490 nm gemes sen 3 6 Tumorinduktion in der Maus F r in vivo Experimente wurden M use des CD1 Stammes
14. 2 0 2 0 nnn 0 120 1 10 1 5 1 2 5 124 112 16 13 Verh ltnis Effektor Targetzellen Abbildung 4 11 Antigen spezifische CCR7 T Zellen sezernieren weniger IL 2 aber mehr IL 10 und IFN y als CCR7 T Zellen CD3 Zellen wurden zur Expression des CEA spezifischen Immunre zeptors BW431 26scFv Fc CD28 CD3 607 volle Symbole oder des CD30 spezifischen Immun rezeptors HRS3 scFv Fe CD28 CD3 926 leere Symbole transduziert und anschlie end in die CCR7 Quadrate und CCR7 Dreiecke T Zell Subpopulationen getrennt Die T Zellen wurden f r 48h mit CEA CD30 LS174T Zellen oder mit CEA CD30 L540 Zellen koinkubiert Mittels ELISA wurde die IL 2 A IL 10 B und IFN y C Konzentration in den berst nden gemessen Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen 60 Ergebnisse 100 x 80 je 2 60 1 g O CCR7 T Zellen 40 CCR7 T Zellen B a a 0 T m T Isotyp IL 2 IL 10 IFN y Abbildung 4 12 Isolierte CCR7 T Zellen sekretieren weniger IL 2 und mehr IFN y als CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wurden in die CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen getrennt und 2h mit PMA 20 ng ml und lonomycin 500 ng ml stimuliert Nach Zugabe von Brefeldin A 1 1000 wur den die Zellen erneut 16 h inkubiert Die Zellen wurden unter Verwendung des BD Cytofix Cytoperm Fixation Permeabilisation Kit permeabilisiert mit einem der Antik rper anti IL 2 Klon MQ1 17H12
15. 3 3 4 Gewinnung von peripheren blutmononukle ren Zellen 35 3 3 5 Magnetic Activated Cell Sorting MACS 36 3 3 6 Stimulation von Lymphozyten durch Zytokine und Antik rper 37 3 3 7 Transfektion von 293T Zellen mittels Lipofektion 37 3 3 8 Retrovirale Transduktion humaner T Lymphozyten 38 3 3 9 XTT basierter Viabili tstest 2 222 oo oem 39 3 3 10 BrdU Proliferationstest 22m onen 39 3 3 11 Detektion apoptotischer Zellen oonan 40 3 4 Durchflusszytometrische Analysen 2 2 22 222 aaa 40 3 4 1 Detektion von Oberflachenmarkern 40 3 4 2 Detektion intrazellul rer Marker 2 2 2 2m onen 40 3 5 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA 41 3 6 Tumorinduktion in der Maus 0 00200 nen 42 Ergebnisse 43 4 1 Isolierung und Charakterisierung von CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulavianen v s ae et ace ee ei era 43 4 1 1 Isolierung von CCR7 und CCR7 T Zellen aus dem peripheren Blut 43 4 1 2 Stimulation der Proliferation CCR7 und CCR7 T Zellen 49 4 1 3 Expression von Immunrezeptoren auf CCR7 und CCR7 T Zellen 52 4 1 4 Expression von Homing Rezeptoren auf CCR7 und CCR7 T Zellen 55 4 1 5 Differenzierungsstatus von CCR7 und CCR7 T Zellen 57 4 1 6 Zytokin Expression der CCR7 und CCR7 T Zellen 57 Inhaltsverzeichnis 4 1 7 CCR7 T Zellen besitzen ein h heres zytolytisches Potenzia
16. 5 3 CD28 OX40 kostimulierte CCR7 T Zellen wirken bei systemi scher Applikation effektiver gegen einen etablierten Tumor als CGR 1 Zellen arati desea Dh ee ew oh ay tc A en 93 5 Diskussion 96 Zusammenfassung 105 Abk rzungsverzeichnis 106 Literaturverzeichnis 108 vi 1 Einleitung Neoplasien sind eine der h ufigsten Todesursachen weltweit Sie werden durch die unstimulierte Proliferation einer maligne transformierten somatischen Zelle verur sacht Ein weiteres Charakteristikum maligner Neoplasien ist deren F higkeit zu meta stasieren Unterschiedliche molekulare Mechanismen erm glichen es einzelnen Zel len sich aus dem Prim rtumor zu l sen in das umgebende Gewebe zu infiltrie ren von dort in Blutgef e und Lymphe berzutreten um dann das Blut an einer anderen Stelle im K rper zu verlassen und dort einen sekund ren Tumor zu bil den Die Beseitigung einer Krebserkrankung erfordert die Eliminierung aller malignen Zel len Zahlreiche Prim rtumore k nnen nach heutigen Standards durch chirurgische Entfernung Bestrahlung zytostatische Chemotherapie oder eine Kombination die ser Methoden erfolgreich therapiert werden Die Haupttodesursache bei Krebserkran kungen sind jedoch Metastasen die gegen diese konventionellen Therapien resistent sind Fidler 2002 2003 Abgesehen von den genannten Standardtherapien werden auch Therapeutika verwendet die Tumor spezifische Proteine gezielt deaktivieren Hierzu z hlen beispiel
17. 5x10 Zellen mit anti CD4 Klon MT310 oder CD8 Klon DK25 Antik rpern und dem anti human CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 sowie dem anti murin IgM Sekund rantik rper gef rbt Die Zellen wurden unter Verwen dung des BD Cytofix Cytoperm Fixation Permeabilisation Kit permeabilisiert und mit Antik rpern spezifisch f r die Effektormolek le Perforin Klon 8G9 GranzymA Klon CB9 oder GranzymB Klon GB11 intrazellul r gef rbt Die Markierung von PBMCs mit Antik rpern irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps diente als Kontrolle Die Analyse der Fluoreszenzen erfolgte durchflusszytometrisch Abgebil det ist der Anteil der Effektormolek l exprimierenden CCR7 und CCR7 Zellen der CD4 oder CD8t T Zell Subpopulationen der jeweiligen Spender p Werte wurden durch den T Test ermittelt und beziehen sich auf den Unterschied der Expression des jeweils abgebildeten Markers auf CCR7 im Vergleich zu CCR7 T Zellen innerhalb der Spendergruppe 64 Ergebnisse 4 2 CCR7 T Zellen sind in vitro zytolytisch aktiver als CCR7 T Zellen 4 2 1 Aktivierung von CD3 CCR7 T Zellen in vitro Unter Verwendung rekombinanter Immunrezeptoren wurde untersucht mit welcher Effizienz CCR7 und CCR7 T Zellen ihre anti Tumor Effektor Funktion ausf hren T Zellen wurden hierf r zun chst zur Expression des CEA spezifischen Immunrezep tors BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert mittels magnetischer Zellsortierung hinsichtlich der CCR7 Expression get
18. 7 IL 15 IL 15 unstimuliert TNF a TNF a TGF TGF IFN y IFNy Kontrolle Kontrolle IL 2 IL 2 IL 7 IL 7 IL 15 IL 15 CD3 CD28 J Stimulation TNF a TNF a TGF B TGF B IFNy IFNy 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 m Viabilit t Abbildung 4 19 IL 7 und IL 15 senken die Apoptoserate von CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wur den zun chst hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Anschlie end wurden je 5x 104 Zellen Well auf einer 96 Well Mikrotiterplatte in Gegenwart oder Abwesenheit der Antik rper anti human CD3 OKT3 und anti human CD28 15E8 je 100 ng ml stimuliert und unter Zugabe von jeweils einem der Zytokine IL 2 400 U ml IL 7 IL 15 TNF amp TGF oder IFN y je 10 ng ml kultiviert T Zellen die ohne Zugabe von Zytokinen kultiviert wurden dienten als Kontrolle Nach 5 Tagen Inkubation wurden die T Zellen mit Annexin V sowie 7 AAD gef rbt und der Anteil apoptotischer Zellen durchflusszytome trisch ermittelt Alle Ans tze wurden in dreifacher Ausf hrung angefertigt p 0 05 T Test im Vergleich zur Kontrolle ohne Zytokin 73 Ergebnisse CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen 5 800 400 0 N 600 300 2 g 400 200 Cc gt Cc 5 200 100 lt 0 0 607 975 607 975 O Isotyp mAb EI BW2064 36 mAb Abbildung 4 20 CD28 OX40 Kostimulation erh ht die Viabilitat der CCR7 T Zellen Frisch isolier te CD3 T
19. E J Butcher E C Chemokines and the tissue specific migration of lympho cytes Immunity 16 1 1 4 2002 Kurobe H Liu C Ueno T Saito E Ohigashi I Seach N Arakaki R Hayashi Y Kitagawa T Lipp M Boyd R L Takahama Y CCR7 dependent cortex to medulla migration of positively selected thymocytes is essential for establishing cen tral tolerance Immunity 24 2 165 177 2006 Laux I Khoshnan A Tindell C Bae D Zhu X June C H Effros R B Nel A Response differences between human CD4 and CD8 T cells during CD28 co stimulation implications for immune cell based therapies and studies related to the expansion of double positive T cells during aging Clin Immunol 96 3 187 197 2000 Lewko W M Hall P B Oldham R K Growth of tumor derived activated T cells for the treatment of advanced cancer Cancer Biother Radiopharm 15 4 357 366 2000 Marshall N A Christie L E Munro L R Culligan D J Johnston P W Barker R N Vickers M A Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma Blood 103 5 1755 1762 2004 Maus M V Thomas A K Leonard D G B Allman D Addya K Schlienger K Ri ley J L June C H Ex vivo expansion of polyclonal and antigen specific cytotoxic T 114 Literaturverzeichnis lymphocytes by artificial APCs expressing ligands for the T cell receptor CD28 and 4 1BB Nat Biotechnol 20
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21. Lunge asth matischer M use bertreten CCR7 T Zellen wandern in die afferente Lymphe weiter w hrend CCR7 T Zellen akkumulieren In einem homologen Ansatz von Debes etal 2005 wurde nachgewiesen dass beim Vergleich der Injektion von Splenozyten einer CCR7 Maus oder einer Wildtyp Maus in die Peripherie von Empf nger M usen le diglich Wildtyp Splenozyten nicht aber die CCR7 Splenozyten in die drainierenden Lymphknoten auswandern CCR7 T Zellen sind offenbar nicht in der Lage wieder in die Zirkulation einzutreten CCR7 scheint daher die molekulare Basis f r den Austritt von T Lymphozyten aus peripheren Geweben in die afferente Lymphe und drainieren de Lymphknoten darzustellen Dieser Befund ist die Grundlage f r die Annahme dass die Verwendung CCR7 T Zellen in der adoptiven Immuntherapie zu einer Akkumu lation dieser Zellen am Tumorort f hrt CCR7 wird von T B und dentritischen Zellen exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der zielgerichteten Wanderung dieser Zellen Cyster 1999 Moser und Loet scher 2001 Die Liganden von CCR7 CCL19 Synonyme ELC MIP 3 und CCL21 Synonym SLC werden auf Endothel und Stromazellen innerhalb der T Zell Zonen in Milz Lymphknoten und Peyers Patches konstitutiv exprimiert Cyster 1999 Die physiologische Funktion von CCR7 wird in CCR7 M usen Forster et al 1999 so wie M usen mit einem Defekt in der Expression der CCR7 Liganden CCL19 und CCL21 plt plt Muta
22. Zellen diesen Ph notyps in der CCR7 T Zell Subpopulation beobachtet wurden In der unstimulierten Subpo pulation der CCR7 T Zellen wurde CD45RO Expression auf 43 der Zellen detektiert Nach 4 t giger Stimulation exprimierten 94 der CCR7 T Zellen CD45RO Bei CCR7 T Zellen l sst die Abwesenheit von CD45RO auf den enddifferenzierten Ph notyp der Temra Zellen schlie en Dieser Versuch zeigte dass die in dieser Arbeit verwendeten aktivierten T Zell Populationen vernachl ssigbare Zahlen naiver T Zellen beinhalteten 4 1 6 Zytokin Expression der CCR7 und CCR7 T Zellen Zur weiteren Charakterisierung der Subpopulationen wurde die IFN y IL 2 und IL 10 Sekretion der CCR7 und CCR7 T Zellen nach Aktivierung untersucht Hierf r wur den zwei Rezeptoren gleicher Bauart f r zwei unterschiedliche Tumor assoziierte Anti gene durch retroviralen Gentransfer in den T Zellen exprimiert CD3 T Zellen wurden entweder zur Expression des anti CD30 Rezeptors HRS3 scFv Fc CD28 CD3 926 57 Ergebnisse CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen N gt gt Zellzahl Zellzahl oO oO CD45RO CD45RO Isotyp Kontrolle unstimuliert nach 4 t giger Stimulation Abbildung 4 10 CD45RO Expression auf unstimulierten und stimulierten CCR7 und CCR7 T Zellen PBMCs wurden unstimuliert graue Linie oder nach 4 t giger Stimulation durch die immo bilisierten Antik rper OKT3 und 15E8 je 5 ug ml schwarze Linie m
23. Zellen wurden zur Expression der CEA spezifischen Immunrezeptoren BW431 26scFv Fc CD28 CD3 607 oder BW431 26scFv Fc CD28 CD3 OX40 975 transduziert und mit dem immo bilisiertem anti idiotypischem Antik rper BW2064 36 spezifisch f r das CEA scFv gepunktete Balken stimuliert Als Kontrolle dienten Zellen die mit einem immobilisierten Antik rper irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps inkubiert wurden leere Balken Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit den Antik r pern F ab 2 anti human IgG anti human CCR7 IgM Klon 2H4 dem Sekund rantik rper anti murin IgM sowie Annexin V gef rbt und die Verteilung der Marker durchflusszytometrisch analysiert Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen durch CD28 Kostimulation allein keinen berlebensvorteil erhielten Abbildung 4 20 Hier wurde gezeigt dass die Viabilit t CCR7 T Zellen durch die Rezeptor vermittelte CD28 CD3 C OX40 Stimulation nicht aber durch CD28 CD3 Stimulation erh ht wer denkann Die berleben f rdernde Wirkung der OX40 Kostimulation k nnte durch die Induk tion der Expression des anti apoptotischen Proteins Bcl 2 begr ndet sein Zur Pr fung dieser Hypothese wurden CD3 T Zellen zur Expression der Immunrezepto ren 607 BW431 26scFv Fc CD28 CD3 C oder 975 BW431 26scFv Fc CD28 CD3C 74 Ergebnisse OX40 transduziert Es folgte die Isolation der Rezeptor positiven T Zellen mittels magnetischer Zel
24. ben tigen die kombinierte CD28 CD3C OX40 Stimulation f r ihre anti Tumor Effektivit t in vivo In einem weiteren Tierversuch wurde untersucht ob CCR7 T Zellen auch ohne die kombinierte CD28 und OX40 Stimulation effektiv gegen Tumorzellen wirken k n nen Hierf r wurden T Zellen zun chst zur Expression des Immunrezeptors 607 BW431 26scFv Fc CD28 CD3 C oder des Immunrezeptors 975 BW431 26 scFv Fc CD28 CD3C OX40 transduziert und CCR7 T Zellen anhand magnetischer Zellsepa ration isoliert Reinheiten gt 98 CD1 Nacktm usen 6 Tiere Gruppe wurden je weils 975 oder 607 Rezeptor tragende CCR7 T Zellen zusammen mit CEA C15A3 Tumorzellen subkutan koinjiziert Das Tumorwachstum wurde ber 18 Tage beobach tet Tumore von M usen die mit CCR7 T Zellen mit dem 607 Immunrezeptor behan delt wurden waren gr er als in mit CCR7 T Zellen mit dem 975 Immunrezeptor behandelten M usen Abbildung 4 30 Hier wurde gezeigt dass CCR7 T Zellen die kombinierte Kostimulation durch CD28 CD3 OX40 f r ihre anti Tumor Effektivit t in vivo ben tigen 90 Ergebnisse C15A3 CEA MC38 CEA 100 100 80 80 604 60 N Z 40 40 2 20 20 N 0 T T T 1 0 T T T 1 1 20 1 10 1 5 1 2 5 1 20 1 10 1 5 1 2 5 1 5 1 5 E 14 14 oO gt 2 05 0 5 u 0 0 B a 1 1 20 1 10 15 12 5 1 20 1 10 15 12 5 Verh ltnis Effektor Targetzellen CCR7 T Zell
25. beobachtet dass die anti Tumor Aktivit t von T Zellen mit Rezeptor vermittelter Stimulation durch CD3 und zwei kostimulatorischen Signalketten in vi tro unver ndert ist gegen ber T Zellen mit Immunrezeptoren der zweiten Generati on mit der kombinierten CD28 CD3Z Signaldom ne CCR7 T Zellen weisen in vivo sowohl bei lokaler als auch bei systemischer Applikati on eine h here anti Tumor Aktivit t auf als CCR7 T Zellen Allerdings war die Effekti 102 Diskussion Early Late Naive effector Effector effector oO oO y on eal oO IL 2 production Access to homeostatic cytokines Apoptosis 2 i 5 no S x 2 wr a A A Q Relative in vivo antitumor efficacy nN oa UORSUN 109348 OINA Ui GANE BY Replicative senescence Progressive differentiation Abbildung 5 1 Inverse Beziehung von in vitro und in vivo Effektorfunktion adoptiv transferierter T Zell Subpopulationen Aus Gattinoni et al 2005 entnommen und nach Erkenntnissen aus dieser Arbeit modifiziert vit t der CCR7 T Zellen abh ngig von der kombinierten Kostimulation durch CD28 CD3C OX40 Mit CD28 CD3Z stimulierte CCR7 T Zellen unterdr ckten dahingegen das Tumorwachstum weniger stark als CCR7 T Zellen mit dem gleichen Rezeptor Dies mag durch die geringere Viabilit t der CCR7 T Zellen nach CD28 CD3 Stimu lation bedingt sein Die Viabilit t der Zellen kann jedoch durch das zus tzliche OX4
26. counterpoint J Leukoc Biol 78 5 1043 1051 2005 Mora J R von Andrian U H T cell homing specificity and plasticity new concepts and future challenges Trends Immunol 27 5 235 243 2006 Morgan R A Dudley M E Wunderlich J R Hughes M S Yang J C Sherry R M Royal R E Topalian S L Kammula U S Restifo N P Zheng Z Nahvi A de Vries C R Rogers Freezer L J Mavroukakis S A Rosenberg S A Cancer re gression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes Science 314 5796 126 9 2006 Moser B Loetscher P Lymphocyte traffic control by chemokines Nat Immunol 2 2 123 128 2001 115 Literaturverzeichnis Murphy W J Back T C Conlon K C Komschlies K L Ortaldo J R Sayers T J Wiltrout R H Longo D L Antitumor effects of interleukin 7 and adoptive immu notherapy on human colon carcinoma xenografts J Clin Invest 92 4 1918 1924 1993 Nakano H Mori S Yonekawa H Nariuchi H Matsuzawa A Kakiuchi T A novel mutant gene involved in T lymphocyte specific homing into peripheral lymphoid organs on mouse chromosome 4 Blood 91 8 2886 2895 1998 Newcom S R Gu L Transforming growth factor beta 1 messenger RNA in Reed Sternberg cells in nodular sclerosing Hodgkin s disease J Clin Pathol 48 2 160 163 1995 Newcom S R Kadin M E Ansari A A Diehl V L 428 nodular sclerosing Hodgkin s cell secretes a unique transforming grow
27. die entsprechenden Subpopulationen isolierter T Zellen 4 1 7 CCR7 T Zellen besitzen ein h heres zytolytisches Potenzial als CCR7 T Zellen Zur Analyse des zytolytischen Potenzials von CCR7 und CCR7 T Zellen wurden PBMCs aus frischem Blut von 6 gesunden Spendern isoliert und die Expression 62 Ergebnisse von Perforin GranzymA und GranzymB der Subpopulationen getestet Zur Be stimmung der Expression der Effektormolek le in CCR7 und CCR7 T Zellen der CD4 und CD8 Subpopulationen wurden die PBMCs zun chst mit den entspre chenden Antik rpern gegen die Oberfl chenmarker gef rbt Anschlie end erfolg te die F rbung mit dem intrazellul r bindenden Antik rper mit Spezifit t f r das jeweilige Effektormolek l bevor die Zellen durchflusszytometrisch analysiert wur den Ein deutlich gr erer Anteil der CCR7 Zellen sowohl der CD4 als auch der CD8 Population exprimierte sehr viel gr ere Mengen zytolytischer Effektormolek le im Vergleich zu CCR7 Zellen des gleichen Spenders Die prozentualen Verh ltnisse von T Zellen mit und ohne Effektormolek len waren von Spender zu Spender zum Teil sehr unterschiedlich Abgesehen von der Perforin und GranzymA Expression in der CD4 Population bestanden signifikante Unterschiede zwischen dem Anteil der Effektormolek l tragenden Zellen in den CCR7 und CCR7 Subpopulationen inner halb der Spendergruppe Abbildung 4 14 Die Expressionsst rke von Perforin und Granzym B war zude
28. f r die adoptive Immun therapie gegen Tumore zu priifen wurden im Rahmen dieser Arbeit folgende Schritte gew hlt 1 Humane CCR7 vs CCR7 T Zellen wurden hinsichtlich der Expression zytoly tischer Effektormolek le Zytokine und Homing Rezeptoren charakterisiert 16 Einleitung 2 Es wurde ein Protokoll zur pr parativen Isolierung von humanen CCR7 T Zellen der CD3 Population mit Hilfe magnetischer Zellseparationstech nologie erarbeitet 3 Die Antigen spezifische Aktivierung und zytolytische Aktivit t der CCR7 vs CCR7 T Zellen in vitro wurde nach Stimulation durch einen rekombinanten Immunrezeptor analysiert 4 Die optimale Stimulation der CCR7 T Zellen wurde durch einen Vergleich von Rezeptoren mit unterschiedlichen kostimulatorischen Signalketten ermittelt 5 Die Kinetik der Immunrezeptor vermittelten Tumoreliminierung in vivo wurde nach lokaler oder systemischer Applikation von CCR7 vs CCR7 T Zellen ana lysiert Durch die Verwendung von CCR7 T Zellen sollte gepr ft werden ob sich diese Sub population anhand der viel versprechenden Eigenschaften als eine wirksame Effek torpopulation f r die Immuntherapie erweist 17 2 Material 2 1 Enzyme und Reaktionskits Methode Enzyme Kits Hersteller Apoptose Annexin V Apoptosis BD Biosciences Detektion Detection Kit I Heidelberg Deutschland Proliferationstest Cell Proliferation ELISA BrdU Roche Diagnostics colorimetric B
29. ist Bromley et al 2005 Debes et al 2005 Die Konsequenz aus diesen Daten ist dass adoptiv transferierte CCR7 T Zellen einmal in der Peripherie ange kommen nur eine begrenzte M glichkeit besitzen das periphere Gewebe wieder zu verlassen Aufgrund dieser speziellen Eigenschaft nehmen wir an dass adoptiv trans ferierte CCR7 T Zellen bessere Voraussetzungen zur Kolokalisation mit dem Tumor erf llen als CCR7 T Zellen Zielsetzung dieser Arbeit war daher die Untersuchung des anti Tumor Effektorpotenzials CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen unter Verwendung chim rer Immunrezeptoren Als Voraussetzung f r den Vergleich der Subpopulationen mussten diese mit m glichst gro er Reinheit isoliert werden In diesem Rahmen wurde ein Verfahren zur magneti schen Separation humaner CCR7 und CCR7 T Zellen etabliert und in bereinstim mung mit publizierten Daten Miranda Carus et al 2005 unter Zuhilfenahme eines anti human CCR7 IgM Antik rpers optimiert 97 Diskussion Die Trennung von T Zellen hinsichtlich ihrer CCR7 Expression beeintr chtigt die Zel len in ihren Effektorfunktionen und f rdert ihre Apoptosefrequenz wie in dieser Ar beit gezeigt wurde Getrennte T Zell Populationen eignen sich daher zur Untersu chung der Eigenschaften der Subpopulationen sind jedoch benachteiligt im Ver gleich zur ungetrennten CD3 Gesamtpopulation Ein Vergleich der Funktionalit t der T Zell Gesamtpopulation mit den CCR7 u
30. mM NaCl 2 6 mM KCl 10 mM Naz2HPOg 1 8 mM KH zPO pH 7 4 gewaschen Anschlie end wurde die gesamte Zellschicht mit 1x Trypsin EDTA L sung Sigma Aldrich M nchen leicht be deckt Die Zellen wurden bis zu ihrer Abl sung bei 37 C inkubiert Nach Abl sung al ler Zellen wurde sofort serumhaltiges Medium zugegeben um die Trypsin Aktivit t zu blockieren Die Zellen wurden zu einer Einzelzellsuspension resuspendiert und konnten nun f r Versuche verwendet oder zur weiteren Kultivierung ausged nnt wer den 3 3 4 Gewinnung von peripheren blutmononukle ren Zellen Peripheral Blood Mononuclear Cells PBMCs wurden nach der Methode von B yum 1968 durch Dichtegradientenzentrifugation mit Hilfe von Lymphoprep AXIS 35 Methoden SHIELD Oslo Norwegen isoliert Hierf r wurden je 15 ml des Inhalts eines Buffy Coats zun chst mit 15ml PBS verd nnt und anschlie end auf 15 ml Lympho prep geschichtet Nach Zentrifugation bei 600xg und 20 C f r 20 min wurden die Lymphozyten die in der Interphase zwischen Serum und Lymphoprep sedi mentieren mit einer Pipette abgenommen Die Zellen wurden daraufhin dreimal mit PBS gewaschen und danach entweder wie in Kapitel 3 3 6 beschrieben stimuliert oder mittels magnetischer Zellsortierung einzelne Zellpopulationen isoliert Kapitel 3 3 5 3 3 5 Magnetic Activated Cell Sorting MACS Isolation humaner CD3 Lymphozyten CD3 T Zellen wurden auf zwei Arten mittels mag
31. ml oder mit IL 2 400 U ml und anti CD3 OKT3 100 ng ml oder mit anti CD3 100 ng ml und anti CD28 15E8 100 ng ml stimuliert Nach der F rbung sowie alle zwei Tage wur de die CCR7 Expression sowie der CFSE Gehalt der Zellen durchflusszytometrisch bestimmt Abgebildet sind die Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen 83 Ergebnisse 4 4 4 Durch Proliferation in vitro generierte CCR7 T Zellen entsprechen isolierten CCR7 T Zellen in Zytokin und Effektormolekul Expression Um zu tiberpriifen ob T Zellen die CCR7 nach Proliferation verloren haben den isolierten CCR7 T Zellen in wichtigen Eigenschaften entsprechen wurden isolierte und ber einen l ngeren Zeitraum stimulierte T Zellen anhand ihres Zytokin und Effektormolek l Musters charakterisiert Hierf r wurden CD3 T Zellen zun chst hin sichtlich der Expression von CCR7 getrennt Reinheiten 98 und der intrazellul re IL 2 IFN y TNF a Perforin Granzym A und GranzymB Gehalt der Subpopulationen untersucht CCR7 T Zellen aus derselben Trennung sowie ungetrennte CD3 wurden in Gegenwart von IL 2 und anti CD3 Antik rper OKT3 10 Tage stimuliert Anschlie Bend wurde die Expression der oben genannten Zytokine und Effektormolek le der Zellen untersucht Der Anteil CCR7 T Zellen in der urspr nglich zu 98 CCR7 Frak tion betrug nach 10 Tagen 84 In der CD3 T Zell Fraktion hatten nach 10 Tagen 92 der Zellen die CCR7 Expression eingestellt Der Anteil
32. to high Rare cells or the target cells frequency cells purity increase Program Normal Possel Posseld Deplete to high positive selection double positive selection depletion antigen expression Posseld2 double positive selection for cord blood application Low Possel_s Posselds Depletes antigen sensitive positive sensitive double sensitive depletion expression selection positive selection Depl05 Depl025 special program for very sensitive depletion Abbildung 3 1 autoMACSTM cell separation programs quick reference table Entnommen aus dem Benutzerhandbuch f r den autoMACS Zellseparator 3 3 6 Stimulation von Lymphozyten durch Zytokine und Antikorper Die Zellen wurden in RPMI1640 Medium aufgenommen und mit 400 U ml IL 2 Chiron GmbH Ratingen und 100ng ml OKT3 Antik rper stimuliert Je nach Anforderungen wurden auch IL 7 IL 15 TNF a TGF IFN y alle von ImmunoTools GmbH Friesoythe Deutschland oder 15E8 Antik rper einge setzt 3 3 7 Transfektion von 293T Zellen mittels Lipofektion 293T Zellen wurden auf Zellkulturplatten mit 6 Wells in einer Dichte von 1x10 Zellen Well in 3ml DMEM Medium ausplattiert Am Folgetag wurden 100 ul se rumfreies DMEM Medium mit 2ug DNS und 20 ul Polyfect Quiagen Hilden Deutschland versetzt gemischt und 10min bei Raumtemperatur inkubiert An schlie end wurde zu dem Ansatz 600 ul serumhaltiges DMEM Medium zugegeben gemischt und der Ansatz gleichm ig
33. vivo Persistenz von aus zentralen Ge 12 Einleitung d chtnis T Zellen Tcm gewonnenen Effektor T Zellen im Vergleich zu aus Effektor Ged chtnis T Zellen Tgm generierten Effektor T Zellen Da die in vivo Persistenz ad optiv transferierter T Zellen unmittelbar mit dem Tumorr ckgang korreliert Robbins et al 2004 werden Tcm Zellen als m gliche Effektorpopulation f r die adoptive Im muntherapie favorisiert T Zell Subpopulationen werden durch die Expression von Oberfl chenmarkern cha rakterisiert Sp te Effektor T Zellen Effektor Ged chtnis T Zellen sowie enddifferen zierte T Zellen zeichnen sich durch die Abwesenheit des CC Chemokinrezeptors 7 CCR7 und eine Reihe weiterer Eigenschaften aus die sie zu attraktiven Effektoren f r eine adoptive Immuntherapie macht 1 6 CC Chemokin Rezeptor 7 CCR7 Chemokine sind chemotaktisch wirkende Cytokine und vermitteln Chemotaxis von Lymphozyten und phagozytischen Zellen Durch Koordination der Lokalisation von Immunzellen im K rper bernehmen sie eine zentrale Rolle bei der Generierung von Immunantworten an Entz ndungsorten Viola und Luster 2008 Rot und von Andri an 2004 Allen et al 2007 Chemokine wirken durch ihre Bindung an spezifische Rezeptoren Chemokinrezeptoren bestehen aus 7 die Zellmembran durchspannen de Helices Diese Rezeptoren interagieren mit G Proteinen wodurch ein Signal in die Zelle geleitet wird CC und CXC Chemokine bilden die beiden Haupt
34. wie in Abbildung 1 2 f r CD8 T Zellen dargestellt ist Da unter schiedliche T Zell Subpopulationen unterschiedliches zytolytisches Potenzial besit zen stellt sich die Frage ob eine anti Tumor Immuntherapie durch die Verwendung einer T Zell Subpopulation mit besonders hohem zytolytischen Potenzial optimiert werden kann In diesem Zusammenhang m sste eine Vorgehensweise zur Identifi zierung und Isolierung der betreffenden Population entwickelt werden Dieses erfor dert jedoch eine besondere Ber cksichtigung spezifischer Eigenschaften der jeweili gen T Zell Subpopulationen 1 4 T Zell Subpopulationen T Zell vermittelte Immunantworten werden in den T Zell Regionen der sekund ren lymphatischen Gewebe initiiert Naive T Zellen exprimieren unter anderem CD62L L Selektin welches mit CD34 und GlyCAM auf Endothelzellen der Lymphknoten und der Milz interagiert und die Mirgration der Zellen in diese Gewebe f rdert Mebius etal 1993 Dort treffen naive T Zellen weiterhin auch gekennzeichnet durch die Expression von CCR7 Campbell et al 1998 sowie des RA Isotyps von CD45 Mer kenschlager et al 1988 auf Antigen beladene professionelle Antigen pr sentierende Zellen APCs und werden bei Kontakt mit ihrem spezifischen Antigen unter geeigneter Kostimulation aktiviert Die Antigen vermittelte Aktivierung naiver T Zellen f hrt zur ihrer klonalen Expansion sowie zur Differenzierung in Effektor T Zellen Butcher und Picker 1996 Die Fun
35. z hlen unter ande rem CD103 dessen Expression zur Einwanderung in den Darm f hrt CCR10 vermit telt Darm und Haut Homing und CCR4 und CLA die Migration der Zellen in die Haut Sigmundsdottir und Butcher 2008 Nach Antigen vermittelter klonaler Expansion und Differenzierung stirbt die Mehr zahl der an der prim ren Immunantwort beteiligten T Zellen Nur eine kleine Popu lation bleibt in Form von Ged chtniszellen zur ck Callan et al 2000 Harari et al 2002 Die ausgesprochene Langlebigkeit dieser Zellen beruht auf der Expression ber lebensf rdernder Proteine wie beispielsweise Bcl 2 Grayson et al 2000 Ph noty pisch sind Ged chtnis T Zellen zun chst durch die Expression des RO Isotyps von CD45 auf der Oberfl che gekennzeichnet Merkenschlager et al 1988 Es gibt zwei Gruppen von Ged chtnis T Zellen eine protektive und eine reaktive Subpopulation die anhand von Homing und Effektoreigenschaften unterschieden werden k nnen Die reaktive Fraktion wird durch die zentralen Ged chtniszellen Tcm gebildet Sie exprimieren die f r das Homing in Lymphknoten notwendigen Rezeptoren CD62L sowie CCR7 haben eingeschr nkte Effektorfunktion und die F higkeit bei Antigen kontakt effektiv zu expandieren Butcher und Picker 1996 Tcm Zellen wandern auf der Suche nach ihrem spezifischen Antigen bevorzugt durch die T Zell Zonen der se kund ren lymphatischen Gewebe Bei Antigenkontakt erfolgt Proliferation sowie die Differenzier
36. 0 Signal erh ht werden was eine effektivere Tumorlyse durch CCR7 T Zellen erm g licht Im Gegensatz zu Beobachtungen von Gattinoni et al 2005 die reifere und sp te T Zellen mit CCR7 Ph notyp mit einer schlechten in vivo Aktivit t assoziieren wurde in dieser Arbeit gezeigt dass CCR7 T Zellen Tumore in vivo dann effektiver zytoly sieren als CCR7 T Zellen wenn sie die kombinierte CD28 CD3C OX40 Stimulation erhalten Abbildung 5 1 Naive sowie junge T Zell Subpopulationen die als bevorzugte Effektorpopulationen f r eine adoptive Immuntherapie gelten exprimieren CCR7 Diese Zellpopulationen 103 Diskussion erlangen wie in dieser Arbeit gezeigt wurde durch Proliferation einen CCR7 Ph notyp was darauf schlie en l sst dass die am Tumorort akkumulierenden T Zellen CCR7 Ph notyp aufweisen Da sich gezeigt hat dass CCR7 T Zellen in vivo nur un ter CD28 OX40 Kostimulation effektiv sind gibt es einen guten Grund diesen Rezeptor auch bei naiven und jungen T Zellen einzusetzen Durch CD28 CD3C OX40 stimulierte CCR7 T Zellen sind hochpotente Effektorzellen zur Tumoreleminierung in vivo Die Zellen sind gezwungen am Tumorort zu persis tieren und ihre erh hte Anf lligkeit f r Aktivierungs induzierten Zelltod wird durch die kombinierte Rezeptor vermittelte CD28 CD3C OX40 Stimulation unterdr ckt Of fen bleibt jedoch wie anhaltend die anti Tumor Reaktivit t der auf diese Weise stimu lierten CCR7
37. 2 143 148 2002 Maxwell J R Weinberg A Prell R A Vella A T Danger and OX40 receptor signaling synergize to enhance memory T cell survival by inhibiting peripheral deletion J Immunol 164 1 107 112 2000 Mebius R E Dowbenko D Williams A Fennie C Lasky L A Watson S R Ex pression of GlyCAM 1 an endothelial ligand for L selectin is affected by afferent lymphatic flow J Immunol 151 12 6769 6776 1993 Merkenschlager M Terry L Edwards R Beverley P C Limiting dilution analysis of proliferative responses in human lymphocyte populations defined by the monoclo nal antibody UCHLI implications for differential CD45 expression in T cell memory formation Eur J Immunol 18 11 1653 1661 1988 Miranda Carus M E Benito Miguel M Llamas M A Balsa A Martin Mola E Human T cells constitutively express IL 15 that promotes ex vivo T cell homeostatic proliferation through autocrine juxtacrine loops J Immunol 175 6 3656 62 2005 Misslitz A Bernhardt G F rster R Trafficking on serpentines molecular insight on how maturating T cells find their winding paths in the thymus Jmmunol Rev 209 115 128 2006 Misslitz A Pabst O Hintzen G Ohl L Kremmer E Petrie H T F rster R Thy mic T cell development and progenitor localization depend on CCR7 J Exp Med 200 4 481 491 2004 Mocellin S Marincola EM Young H A Interleukin 10 and the immune response against cancer a
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39. 7 Hier wurde gezeigt dass Immunrezeptor stimulierte CD4 CCR7 Zellen effektiver ak tiviert werden als CD4 CCR7 Zellen 4 3 Die hohe Apoptosefrequenz der CCR7 T Zellen kann unterdr ckt werden Isolierte CCR7 T Zellen zeigen in vitro ein stagnierendes Wachstum welches durch eine zunehmende Frequenz apoptotischer Zellen begr ndet sein k nnte Zur Verifizie rung dieser Hypothese wurden frisch isolierte CD3 T Zellen hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Reinheiten gt 95 und in Gegenwart oder Abwesenheit der Anti k rper OKT3 und 15E8 kultiviert Nach 5 Tagen wurden die Anzahl apoptotischer Zel len durch F rbung mit Annexin V und 7 AAD und anschlie ender durchflusszytome trischer Analyse gepr ft Sowohl unstimulierte als auch stimulierte CCR7 T Zellen wiesen eine st rke re Bindung von AnnexinV sowie eine erh hte Aufnahme von 7 AAD und somit eine geringere Viabilit t als die jeweilige CCR7 T Zell Population auf Abbil dung 4 18 Hier wurde gezeigt dass CCR7 T Zellen eine h here Anf lligkeit f r den Aktivierungs induzierten Zelltod aufweisen als CCR7 T Zellen 4 3 1 IL 7 und IL 15 erh hen die Viabilit t CCR7 T Zellen Um der Apoptose von CCR7 Zellen entgegenzuwirken wurden die Zytokine IL 2 IL 7 IL 15 IFN y TNF und TGF bez glich ihrer anti apoptotischen Aktivit t gepr ft Hierf r wurden CD3 T Zellen hinsichtlich der Expression von CCR7 getrennt Rein heiten gt 95 und CC
40. 7 T cells Rejuvenation Res 11 3 543 56 2008 116 Literaturverzeichnis Reif K Ekland E H Ohl L Nakano H Lipp M F rster R Cyster J G Balanced responsiveness to chemoattractants from adjacent zones determines B cell positi on Nature 416 6876 94 99 2002 Robbins P E Dudley M E Wunderlich J El Gamil M Li Y E Zhou J Huang J Powell D J Rosenberg S A Cutting edge persistence of transferred lymphocyte clonotypes correlates with cancer regression in patients receiving cell transfer the rapy J Immunol 173 12 7125 7130 2004 Rogers P R Song J Gramaglia I Killeen N Croft M OX40 promotes Bcl xL and Bcl 2 expression and is essential for long term survival of CD4 T cells Immunity 15 3 445 455 2001 Rosenberg S A Development of cancer immunotherapies based on identification of the genes encoding cancer regression antigens J Natl Cancer Inst 88 22 1635 1644 1996 Rot A von Andrian U H Chemokines in innate and adaptive host defense basic chemokinese grammar for immune cells Annu Rev Immunol 22 891 928 2004 Russell J H Ley T J Lymphocyte mediated cytotoxicity Annu Rev Immunol 20 323 370 2002 Sallusto F Geginat J Lanzavecchia A Central memory and effector memory T cell subsets function generation and maintenance Annu Rev Immunol 22 745 63 2004 Sallusto F Kremmer E Palermo B Hoy A Ponath P Qin S Forster R Lipp
41. A Rezeptor tragende CCR7 T Zellen eliminiert wurden Die Schein transduzierten CCR7 und CCR7 T Zellen f hrten nicht zur Inhibition der Tumorbildung durch koinjizierte CEA Tumorzellen Abbil dung 4 28 Diese Beobachtungen demonstrieren die gr ere zytolytische Aktivit t von CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen in vivo Das zytolytische Potenzial der im Tierversuch verwendeten T Zell Subpopulationen 87 Ergebnisse Tumorvolumen mm CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen 600 600 400 400 CEA C15A3 Tumorzellen 2 ug T Zellen 975 0 0 0 10 20 0 10 20 600 600 400 400 CEA MC38 Tumorzellen 200 200 T Zellen 975 0 g T 0 L T 0 10 20 0 10 20 600 600 400 400 CEAt C15A3 Tumorzellen 200 200 T Zellen w o 0 T T 0 T T 0 10 20 0 10 20 _ b Zeit nach Injektion Tage 88 Ergebnisse B z 300 amp 2504 E 200 4 je Q o 100 4 E gt F 50 4 0 T T T T l CCR7 CCR77 CCR7 CCR77 CCR7 CCR7 a 975 975 w o C15A3 MC38 C15A3 Abbildung 4 28 CCR7 T Zellen mit CD28 CD3C OX40 aktivierendem Immunrezeptor zeigen in vi vo eine effektivere anti Tumor Antwort als CCR7 T Zellen CD1 Nacktm usen 7 Tiere Gruppe wurden subkutan CEA C15A3 oder CEAT MC38 Tumorzellen je 5x 10 Zellen zusammen mit CCR7 oder CCR7 T Zellen mit BW431 26scFv Fc CD28 CD3 OX40 975 Rezeptor je 5x 10 Zellen ko injiziert Koinjekti
42. BW2064 36 stimuliert Als Kontrolle dienten Zellen die mit einem immobilisierten Antik rper irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps inkubiert wurden Nach zwei Tagen wurden die T Zellen mit dem anti human CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 dem anti murin IgM Sekund rantik rper und dem anti human Bel 2 Antik rper Klon 100 gef rbt und durchflusszytometrisch analysiert Abgebildet sind Mittel werte der mittleren Fluoreszenz Intensit ten MFIs von Triplikaten Standardabweichungen p 0 05 T Test 76 Ergebnisse CD3 T Zellen sezernierten am meisten IFN y w hrend im berstand der getrennten und anschlie end wiedervereinigten Zellen sehr viel weniger IFN y auch weniger als in der CCR7 T Zell Subpopulation detektiert wurde Noch schw chere IFN y Sekre tion wurde bei CCR7 T Zellen beobachtet Die zur Kontrolle mitgef hrten Schein transduzierten T Zellen produzierten kein IFN y ebenso wie alle T Zell Populationen die zusammen mit Antigen negativen Colo320 Zellen inkubiert wurden Abbildung 4 22 Dieser Versuch zeigte dass die Aktivit t von Zellpopulationen durch magnetische Se paration beeintr chtigt wird 4 4 1 Proliferation f rdert die Entstehung von CCR7 T Zellen Um festzustellen ob die Generierung CCR7 T Zellen von den Stimulationsbedingun gen abh ngig ist wurden CD3 T Zellen entweder mit dem anti CD3 Antik rper OKT3 oder mit den anti CD3 und anti CD28 15E8 Antik rpern in Gegenwart von IL 2 od
43. CCR7 T Zellen ben tigen CD28 OX40 Kostimulation fiir die Immunrezeptor vermittelte Tumorlyse Inaugural Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakultat der Universit t zu K ln vorgelegt von Claudia Ederer aus M nchen K ln April 2009 Berichterstatter Prof Dr Hinrich Abken Prof Dr Thomas Langer Pr fungsvorsitzender Prof Dr Ansgar B schges Tag der Disputation 22 06 2009 Abstract Adoptive administration of ex vivo activated and expanded autologous tumor reactive T cells is currently one of the most powerful immuno therapeutic strategies that can induce objective clinical responses in patients with metastatic tumors However the efficacy of adoptive immunotherapy is often limited by the failure of ex vivo expanded T cells to persist in vivo While recombinant single chain T cell receptors to graft tumor specificity to effector cells get more and more improved little progress has been made in identifying the effector cell population that performs best in redirected tumor cell elimination Since CCR7 determines T cell exit from peripheral tissues we have explored whether CCR7 T cells display enhanced efficacy in redirected immunotherapy due to their maintenance at the tumor site CCR7 T cells in comparison to CCR7 T cells exhibit a number of properties which make them favorable candidates for a cytolytic T cell at tack These include the expression of large numbers of cy
44. CD 1 oder T B und NK Zell defiziente NIH III Nude M use Charles River Laboratories Sulzfeld Deutsch land verwendet Alle Tierversuche wurden entsprechend der nationalen und regio nalen Bestimmungen durchgef hrt und durch die Bezirksregierung K ln Genehmi gungsnummer K17 35 05 bewilligt Zur Tumorinduktion wurden 5x10 C15A3 Tumorzellen mit 5x104 Rezeptor tragen den T Zellen subkutan in eine Flanke der Maus koinjiziert T Zellen ohne rekombi nanten Rezeptor dienten als Kontrolle Das Tumorwachstum wurde unter Zuhilfenah me einer Schieblehre t glich beobachtet Um die systemische Wirkung von T Zellen zu untersuchen wurden 8x 10 C15A3 Tu morzellen subkutan injiziert Bei Erreichen eines Tumorvolumens von 20 40 mm wurde den M usen 1 x 10 Rezeptor tragende T Zellen intraven s in die Schwanzvene verabreicht Das Tumorwachstum wurde unter Zuhilfenahme einer Schieblehre t g lich beobachtet 42 4 Ergebnisse 4 1 Isolierung und Charakterisierung von CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen 4 1 1 Isolierung von CCR7 und CCR7 T Zellen aus dem peripheren Blut Die Frequenz CCR7 T Zellen im peripheren Blut wurde in einer Pr paration mono nukle rer Zellen gesunder Spender durch F rbung mit dem anti human CCR7 IgM An tik rper dem FITC konjugierten anti murin IgM Sekund rantik rper sowie dem PE konjugiertem anti human CD3 Antik rper und anschlie ender durchflusszytometri scher Analyse untersucht T Z
45. Invest 118 1 294 305 2008 109 Literaturverzeichnis Bolhuis R L Willemsen R A Lamers C H Stam K Gratama J W Weijtens M E Preparation for a phase I II study using autologous gene modified T lymphocytes for treatment of metastatic renal cancer patients Adv Exp Med Biol 451 547 555 1998 Bromley S K Mempel T R Luster A D Orchestrating the orchestrators chemokines in control of T cell traffic Nat Immunol 9 9 970 80 2008 Bromley S K Thomas S Y Luster A D Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics Nat Immunol 6 9 895 901 2005 Butcher E C Picker L J Lymphocyte homing and homeostasis Science 272 5258 60 66 1996 B yum A Separation of leukocytes from blood and bone marrow Introduction Scand J Clin Lab Invest Suppl 97 7 1968 Callan M F Fazou C Yang H Rostron T Poon K Hatton C McMichael A J CD8 T cell selection function and death in the primary immune response in vivo J Clin Invest 106 10 1251 1261 2000 Campbell J J Bowman E P Murphy K Youngman K R Siani M A Thompson D A Wu L Zlotnik A Butcher E C 6 C kine SLC a lymphocyte adhesion triggering chemokine expressed by high endothelium is an agonist for the MIP 3beta receptor CCR7 J Cell Biol 141 4 1053 1059 1998 Carpenito C Milone M C Hassan R Simonet J C Lakhal M Suhoski M M Varela Rohe
46. M Lanzavecchia A Switch in chemokine receptor expression upon TCR stimula tion reveals novel homing potential for recently activated T cells Eur J Immunol 29 6 2037 45 1999a Sallusto E Lenig D Forster R Lipp M Lanzavecchia A Two subsets of memo ry T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions Nature 401 6754 708 12 1999b Sambrook J Fritsch E Maniatis T Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor New York 3 ed 1996 Schluns K S Kieper W C Jameson S C Lefrancois L Interleukin 7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo Nat Immunol 1 5 426 432 2000 117 Literaturverzeichnis Schober S L Kuo C T Schluns K S Lefrancois L Leiden J M Jameson S C Ex pression of the transcription factor lung Kr ppel like factor is regulated by cytoki nes and correlates with survival of memory T cells in vitro and in vivo J Immunol 163 7 3662 3667 1999 Schroder K Hertzog BJ Ravasi T Hume D A Interferon gamma an overview of signals mechanisms and functions J Leukoc Biol 75 2 163 189 2004 Schwab U Stein H Gerdes J Lemke H Kirchner H Schaadt M Diehl V Pro duction of a monoclonal antibody specific for Hodgkin and Sternberg Reed cells of Hodgkin s disease and a subset of normal lymphoid cells Nature 299 5878 65 67 1982 Shankaran V Ikeda H Bruce A T White J M Swanson
47. PE Old L J Schreiber R D IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity Nature 410 6832 1107 1111 2001 Shevach E M CD4 CD25 suppressor T cells more questions than answers Nat Rev Immunol 2 6 389 400 2002 Shimizu J Yamazaki S Sakaguchi S Induction of tumor immunity by removing CD25 CD4 T cells a common basis between tumor immunity and autoimmunity J Immunol 163 10 5211 5218 1999 Siegel P M Massagu J Cytostatic and apoptotic actions of TGF beta in homeostasis and cancer Nat Rev Cancer 3 11 807 821 2003 Sigmundsdottir H Butcher E C Environmental cues dendritic cells and the pro gramming of tissue selective lymphocyte trafficking Nat Immunol 9 9 981 987 2008 Song E Chen J Ouyang N Su F Wang M Heemann U Soluble Fas ligand re leased by colon adenocarcinoma cells induces host lymphocyte apoptosis an active mode of immune evasion in colon cancer Br J Cancer 85 7 1047 1054 2001 Suzuki T Tahara H Narula S Moore K W Robbins P D Lotze M T Viral inter leukin 10 IL 10 the human herpes virus 4 cellular IL 10 homologue induces local anergy to allogeneic and syngeneic tumors J Exp Med 182 2 477 486 1995 Till B G Jensen M C Wang J Chen E Y Wood B L Greisman H A Qian X Ja mes S E Raubitschek A Forman S J Gopal A K Pagel J M Lindgren C G Greenberg P D Riddell S R
48. R7 und CCR7 T Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit der An 69 Ergebnisse A LS174T CEAt Colo 320 CEA 140 140 120 120 J x 100 100 0 z a 80 60 60 Q amp 40 40 4 gt 20 20 4 0 T T T 1 0 T T T 1 128 1 14 1 7 1 35 128 1 14 1 7 1 35 u 0 8 5 0 8 0 6 0 6 oO S 0 4 5 0 4 4 T 0 2 5 0 2 4 0 r r 0 B 128 1 14 1 7 135 128 1 14 1 7 135 ss Verhaltnis Effektor Targetzellen CD4 T Zellen w o m CD4 CCR7 T Zellen 439 4 CD4 CCR7 T Zellen Abbildung 4 17 CEA spezifische CD4 CCR7 T Zellen lysieren CEA Tumorzellen effektiver als CD4 CCR7 T Zellen CD4 T Zellen wurden zur Expression des anti CEA Rezeptors BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert und in die CCR7 und CCR7 4 T Zell Subpopulationen getrennt Die Koinkubation mit CEA LS174T Zellen oder CEAT Colo320 Zellen erfolgte f r 48h in 96 Well Mikrotiterplatten Schein transduzierte CD3 T Zellen dienten als Kontrolle Es wurden bei 1 25x 10 bis 1x 104 Effektorzellen Well konstant 2 5x10 Tumorzellen Well eingesetzt Die Via bilit t der Tumorzellen wurde aus den nach Zugabe von XTT Reagenz gemessenen Absorptionen bei OD450 650 nm errechnet A Die IFN y Konzentration der Kultur berst nde wurde mittels ELISA ermittelt B Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen w o ohne without Immunrezeptor Ergebnisse
49. Studien wurde als Folge der Immuntherapie mit T Zellen mit rekombinanten Rezeptoren wie zum Beispiel in Morgan et al 2006 beschrieben ist ein Tumorr ckgang bis hin zur totalen Remission erzielt 1 2 Anspr che an eine Effektorzellpopulation F r eine effektive anti Tumor Antwort m ssen Effektorzellen zum Tumor migrieren am Tumorort persistieren und inhibitorische Einfl sse des Tumormillieus berwin den Weiterhin m ssen sie anschlie end noch in der Lage sein ihre Effektorfunktion auszuf hren um den Tumor zu eliminieren Die Migration der T Zellen zum Tumor erfordert spezifische Homing Marker auf der Zelloberfl che welche die Wanderung der T Zellen in die Peripherie entlang eines Chemokin Gradienten vermitteln Um am Tumorort zu persistieren wird neben mi gratorischen Eigenschaften auch die Resistenz der Effektorzellen gegen ber negativen Einfl ssen der Tumorumgebung als Voraussetzung f r eine erfolgreiche anti Tumor Antwort ben tigt Tumore zeichnen sich unter anderem durch die F higkeit zur Ver meidung der Immunantwort aus Die dabei angewandten Mechanismen beinhalten die Herabregulation von Tumor spezifischen Oberfl chenantigenen und kostimulato rischen Markern sowie die Expression von Fas Ligand und anderen pro apoptotischen Molek len auf der Oberfl che Niehans et al 1997 Song et al 2001 Weiterhin sezer nieren Tumore inhibitorische Zytokine wie IL 10 Wang et al 1994 Suzuki et al 1995 und TGF New
50. Zell Aktivierung 10 1 6 CC Chemokin Rezeptor 7 CCR7 22 00 eee eee 13 1 Zielsetzung rn ara epee ce Be de ee hc a FE are 15 2 Material 18 2 1 Enzyme und Reaktionskits 404 22a be be ade athe 18 2 2 L sungen und Medien 222 64 eee a 2 EEE aan aaa 19 2 3 Bakterienstamme u a 4 0 wen Re tea el Geo 20 2 4 Zelllinien und prim re Zellen 4 24 aa Ge 2 2 se ae aa oe de 20 2 4 1 Humane periphere blutmononukle re Zellen PBMCs 20 24 2 Tumorzelllmien 04 2 sans ar OR u 20 2 9 Dlasmider ana 2a EN EDEL 22 20 Antik rper AN SE Bade EEE EN EEE he eM SR 23 3 Methoden 31 3 1 Mikrobiologische Methoden 2 2 22m nennen 31 3 1 1 Kultivierung und Lagerung von E coliDH5a Bakterien 31 3 1 2 Herstellung chemisch kompetenter E coliDH5a 31 iv Inhaltsverzeichnis 3 1 3 Einbringen von DNS in kompetente E coli DH5 Transformation 32 3 2 Molekularbiologische Methoden 0 20085 32 3 2 1 Isolation von Plasmid DNS aus E coliDH5a 32 3 2 2 Agarosegelelektrophorese geno a Ge Oa rent 33 3 2 3 DNSKonzentrationsbestimmung 4 33 3 2 4 Restriktion von DNS za 2 saw rear 34 3 3 Bukaryontische Zellk lt r 4 te a yh 2034 sr 22202 mia 34 3 3 1 Kultivierung eukaryontischer Zellen 2 222222 34 3 3 2 Kryokonservierung eukaryontischer Zellen 2 2 35 3 3 3 Passage adharenter Zellen an 8 oh Baa nr 35
51. ads pro 1x 10 CD3 Zellen wurden schlie lich Reinheiten von gt 95 in beiden Fraktionen erreicht Abbildung 4 4 Um den Einfluss des Chelatbildners EDTA sowie von Azid w hrend der Zellseparation auf die Viabilit t der Zellen zu untersuchen wurden CD3 T Zellen hinsichtlich ih rer CCR7 Expression unter Verwendung des kommerziell erh ltlichen Puffer Systems f r das autoMACSTM Ger t bestehend aus autoMACSTM Rinsing Solution PBS 2 mM EDTA pH 7 2 und autoMACSTM Running Buffer PBS 2 mM EDTA 0 5 w v BSA 0 09 w v Azid pH 7 2 getrennt Zum Vergleich wurde eine Trennung durchge f hrt bei der Puffer ohne EDTA und ohne Azid eingesetzt wurden Reinheiten jeweils gt 95 Die Viabilit t der getrennten Zellen wurde direkt nach der Trennung sowie nach 24 48 und 96 h durch F rbung mit Annexin V und 7 AAD durchflusszytometrisch bestimmt Nach der Trennung in EDTA und Azid haltigen Puffern wiesen sowohl CCR7 als auch CCR7 T Zell Populationen im Vergleich zu der EDTA und Azid freien Trennung einen gr eren Anteil apoptotischer Zellen auf Abbildung 4 5 Als Konsequenz wur 46 Ergebnisse CD3 T Zellen Zellzahl 10 101 102 10 104 CCR7 FI autoMACS Trennung zur Anreicherung CCR7 T Zellen 64 CCR7 T Zell s Fraktion N N 0 To Oz o ot 0 oo FOF To To CCR7 FI CCR7 FI autoMACS Trennung zur Anreicherung CCR7 T Zellen bi 64 CCR7 T Zell Fraktion N N gq MN Q T
52. asel Schweiz Zellfixierung und BD Cytofix Cytoperm BD Biosciences permeabi lisierung DNS Amplifikation DNS Restriktion DNS Sequenzierung Fixation Permeabilisation Kit Taq DNA Polymerase Restriktionsenzyme BigDye Terminator v3 1 Cycle Sequencing Kit 18 Heidelberg Deutschland Roche Diagnostics Basel Schweiz Fermentas St Leon Rot Deutschland Roche Diagnostics Basel Schweiz Applied Biosystems Warrington England Material Plasmid pr paration Transfektion Viabilit tstest Zellsortierung Plasmid Miniprep Kit I Qiagen Midiprep Kit Qiagen Maxiprep Kit PolyFect SuperFect Cell Proliferation Kit II XTT Cell Proliferation ELISA Pan T Cell Isolation Kit II CD3 CD4 und CD8 Isolation Kits Rat anti Maus IgM MicroBeads anti FITC anti APC und anti PE MicroBeads PeqLab Erlangen Deutschland Qiagen Hilden Deutschland Qiagen Hilden Deutschland Roche Diagnostics Basel Schweiz Miltenyi Biotech Bergisch Gladbach Deutschland 2 2 L sungen und Medien Die Zusammensetzung der verwendeten Standardl sungen und medien ist in Sam brook et al 1996 Ausubel et al 1995 und Coligan et al 1995 beschrieben und wird in den jeweiligen Methoden detailliert aufgef hrt Alle L sungen und Medien wurden mit ddH2O angesetzt und der pH Wert gegebenenfalls mit 1 M HCl oder 1 M NaOH eingestellt Zur Sterilisation wurden
53. ber die Zellen verteilt Nach 48h wurden 37 Methoden die Zellen abgel st und die Transfektionsrate wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt 3 3 8 Retrovirale Transduktion humaner T Lymphozyten Zur retroviralen Transduktion wurde die DNS eines retroviralen Vektors zusammen mit der DNS der Helferplasmide pColt GALV 392 und pHit60 393 mittels Lipofektion in Zellen der Linie 293T transfiziert pColt kodiert f r das GALV Gibbon Ape Leukemia Virus Gen env und pHit60 f r die MoMLV Moloney Murine Leukemia Virus Gene gag und pol Weijtens et al 1998 Auf Zellkulturplatten mit 6 Wells wurden 1x 10 293T Zellen in 3ml DMEM Medi um Well ausges t und ber Nacht bei 37 C und 5 CO inkubiert Nach 24h wur de jeweils 0 5 ug DNS der Helferplasmide 392 392 und 1 ug DNS des gew nsch ten Plasmids mit dem Rezeptorkonstrukt mit 10 ul Polyfect in 48 5 ul serumfrei en DMEM Medium gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert Nach an schlie ender Zugabe von 350 ul DMEM Medium 10 FCS Antibiotika und erneu tem Mischen wurde der gesamte Ansatz auf die Zellen getropft Nach 24h Inkuba tion bei 37 C und 5 CO wurde das Medium vorsichtig abgenommen Pro Well wurden 1 5x10 mit 400 U ml IL 2 und 100ng ml OKT3 Antik rper vorstimulierte T Zellen in 5ml RPMI 1640 Medium mit 1000 U ml IL 2 und 100 ng ml OKT3 zuge geben Die Zellen wurden erneut bei 37 C und 5 CO inkubiert Nach 48h wur den die T Zelle
54. ceptors provi 111 Literaturverzeichnis ding both primary and costimulatory signaling in T cells from a single gene product J Immunol 161 6 2791 2797 1998 Finney H M Akbar A N Lawson A D G Activation of resting human primary T cells with chimeric receptors costimulation from CD28 inducible costimulator CD134 and CD137 in series with signals from the TCR zeta chain J Immunol 172 1 104 113 2004 Forster R Schubel A Breitfeld D Kremmer E Renner Muller I Wolf E Lipp M CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional mi croenvironments in secondary lymphoid organs Cell 99 1 23 33 1999 Gattinoni L Powell D J J Rosenberg S A Restifo N P Adoptive immunotherapy for cancer building on success Nat Rev Immunol 6 5 383 93 2006 Gattinoni L Klebanoff C A Palmer D C Wrzesinski C Kerstann K Yu Z Fin kelstein S E Theoret M R Rosenberg S A Restifo N P Acquisition of full effec tor function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptive ly transferred CD8 T cells J Clin Invest 115 6 1616 1626 2005 Goldstein M J Mitchell E P Carcinoembryonic antigen in the staging and follow up of patients with colorectal cancer Cancer Invest 23 4 338 351 2005 Gramaglia I Weinberg A D Lemon M Croft M Ox 40 ligand a potent costimula tory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses J Immu
55. com et al 1988 Newcom und Gu 1995 und rekrutieren regulato rische T Zellen Treg zum Tumorort Marshall et al 2004 All diese Faktoren m ssen von adoptiv transferierten T Zellen f r eine effektive anti Tumor Antwort berwunden werden Einleitung 1 3 T Zell Effektorfunktionen Eine optimale anti Tumor Immunreaktion ist abh ngig vom Potenzial der ap plizierten Immunzellen die bei Antigenkontakt durch den rekombinanten Im munrezeptor zur Ausf hrung von Effektorfunktionen stimuliert werden Zytotoxi sche T Zellen besitzen unterschiedliche Mechanismen um Zielzellen zu eliminie ren 1 Die Aussch ttung zytotoxischer Granula spielt eine herausragende Rolle bei der Beseitigung von virusinfizierten oder Tumorzellen durch T Zellen Russell und Ley 2002 Trapani und Smyth 2002 Dabei polymerisiert Perforin in der Zell membran der Zielzelle was zur Bildung von Poren f hrt durch die Granzyme eindringen k nnen Granzyme sind Serinproteasen die im Zytoplasma von Ziel zellen die Aktivierung von Caspasen ausl sen was schlie lich zum program mierten Zelltod der Zelle f hrt Humane T Zellen exprimieren 5 Subtypen von denen die Subtypen Granzym A und B f r diese Arbeit relevant sind Granzym A ist eine Tryptase die Proteine an der Position eines Lysins oder Arginins spaltet GranzymB ist das potenteste pro apoptotische Mitglied der Granzymfamilie da es Caspase artige Eigenschaften besitzt und Substrate an zentralen Aspara
56. den T Zellen aus frischem Blut von vier verschiedenen gesunden Spendern hinsichtlich der Expression verschiedener Homing Rezeptoren auf der Zelloberfl che getestet Hier f r wurden PBMCs mit den anti human CD4 oder CD8 Antik rpern dem anti human CCR7 IgM Antik rper und dem anti murin IgM Sekund rantik rper sowie mit jeweils einem der Antik rper anti CD62L anti CCR10 anti CD103 anti CCR4 anti CLA oder anti CD11la amp Kette von LFA 1 gef rbt Bei CD4 oder CD8 T Zellen wurde die Fx pression der entsprechenden Homing Rezeptoren auf den CCR7 und CCR7 Subfrak tionen gemessen L Selektin wurde von einer gr eren Anzahl von CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen von sowohl der CD4 als auch der CD8 Populationen exprimiert Zudem wurde L Selektin in gr eren Mengen auf der Oberfl che dieser Zellen detek tiert Bei CD8 T Zellen bestanden keine weiteren Unterschiede in der prozentualen Verteilung der Homing Rezeptoren zwischen CCR7 und CCR7 Zellen Jedoch ex primierten CD8 CCR7 T Zellen gr ere Mengen CCR10 und CCR4 als CD8 CCR7 T Zellen w hrend CD8 CCR7 T Zellen signifikant mehr der LFA 1 Kette CD11a exprimierten als CD8 CCR7 T Zellen CD4 T Zellen waren durch einen h heren Anteil an CCR10 CCR4 und CLA Zellen innerhalb der CCR7 T Zell Subpopulation im Vergleich zur CD4 CCR7 T Zell Subpopulation gekennzeichnet CD4 CCR7 T Zellen zeichneten sich auch durch eine gr ere Expressionsst rke
57. den als Immunrezeptoren erster Generation bezeichnet Immunrezeptoren zweiter Ge neration besitzen eine und Immunrezeptoren dritter Generation besitzen zwei ko stimulatorische Signalketten zus tzlich zur CD3 Kette Die Verwendung von Immun rezeptoren erster Generation wurde in ersten klinischen Studien als sicher einge stuft Allerdings wurde eine geringe Persistenz der Rezeptor tragenden Zellen in vi vo festgestellt Korrelierend damit wurde bei nur wenigen Patienten ein objektiver R ckgang der Tumorlast beobachtet Kershaw et al 2006 Park et al 2007 Till et al 2008 Um den Therapieerfolg zu steigern werden unterschiedliche Strategien verfolgt Der zeitig durchgef hrte klinische Studien verwenden Rezeptoren zweiter Generation mit den Signalketten von CD28 und CD3 zur kombinierten Stimulation der adoptiv transferierten T Zellen Vorarbeiten demonstrieren die bessere Eignung dieser Rezep toren in einem CEA Tumormodell Emtage et al 2008 Dar ber hinaus wird der Ver wendung von Immunrezeptoren dritter Generation hohes Potenzial beigemessen In diesem Zusammenhang wurde in einem pr klinischen Modell von der Eliminie rung gro er etablierter Tumore durch T Zellen mit Rezeptor vermittelten Signalen von CD28 4 1BB und CD3C berichtet Carpenito et al 2009 Weitere Strategien sehen den Einsatz besonders effektiver T Zell Subpopulationen vor Berger et al 2008 beschreiben eine bessere in
58. den ausschlie lich aktivierte T Zellen verglichen Die Anwesenheit von nai ven T Zellen innerhalb der stimulierten CCR7 T Zell Subpopulation wurde mit tels durchflusszytometrischer Analyse der CD45RO Expression ausgeschlossen CD45RO gt 98 Dieses Vorgehen wurde gew hlt da naive T Zellen sich durch einen CD45RA CD45RO Ph notyp auszeichnen w hrend Antigen erfahrene T Zellen einen CD45RA CD45RO Ph notyp aufweisen Merkenschlager et al 1988 Young et al 1997 Eine Ausnahme besteht f r Antigen erfahrene enddifferenzier 98 Diskussion te T Zellen die wieder zum CD45RA Isotyp wechseln jedoch au erdem durch die Abwesenheit von CCR7 gekennzeichnet sind Hamann et al 1997 Sallusto et al 1999b Die CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen exprimieren verschiedene Homing Rezeptoren W hrend mehr CCR7 T Zellen Molek le wie CLA CCR10 CCR4 und CD103 auf der Oberfl che exprimieren die an der Migration in peripheres Gewe be beteiligt sind exprimieren mehr CCR7 T Zellen gr ere Mengen an CD62L wo durch Migration in die sekund ren lymphatischen Gewebe vermittelt wird Da gene tisch modifizierte T Zellen mit rekombinantem Immunrezeptor kein Priming durch APCs in den sekund ren lymphatischen Geweben ben tigen ist bei Tumoren in der Peripherie die unmittelbare Migration mittels CLA und CCR10 in die Haut oder mit tels CD103 in den Darm erw nscht Die beobachtete Verteilung der Homing Marker steht in berein
59. der IL 2 exprimierenden Zellen war in isolierten CCR7 T Zellen deutlich gr er als in isolierten CCR7 T Zellen Die isolierte CCR7 T Zell Subpopulation wies zudem eine h here Expressionsst rke des Zytokins auf Die Anteile der IL 2 exprimie renden Zellen in den proliferierten Populationen waren niedriger als in der urspr ng lichen CCR7 Population Die st rkere Expression von IL 2 in den kultivierten im Ver gleich zu den durch Isolation gewonnenen CCR7 T Zellen ist m glicherweise zum Teil auf die verbliebenen CCR7 T Zellen innerhalb dieser Populationen zur ckzuf h ren Ein gr erer Anteil isolierter CCR7 T Zellen exprimierte mehr IFN y Perforin und Granzyme als isolierte CCR7 T Zellen Die ber 10 Tage stimulierten Populationen exprimierten IFN y und Effektormolek l Konzentrationen auf dem Niveau isolierter CCR7 T Zellen In den kultivierten Zellen wurde eine Zunahme an Effektormolek l positiven Zellen bei Perforin und GranzymA bis hin zum 10 fachen der urspr nglich detektierten Menge festgestellt 84 Ergebnisse TNF Expression wurde in weniger als 70 der isolierten CCR7 T Zellen und auf mehr als 90 der isolierten CCR7 T Zellen nachgewiesen Die Anteile der TNF po sitiven Zellen in den proliferierten Populationen betrugen jeweils um die 90 Abbil dung 4 26 Hier wurde gezeigt dass sich isolierte und durch Proliferation generierte CCR7 T Zellen in der Expression von Zytokinen und Effektormol
60. dgkin s lym phoma patient Blood 87 8 3429 3436 1996 Kaplan D H Shankaran V Dighe A S Stockert E Aguet M Old L J Schreiber R D Demonstration of an interferon gamma dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice Proc Natl Acad Sci U S A 95 13 7556 7561 1998 Kaulen H Seemann G Bosslet K Schwaeble W Dippold W Humanized anti 113 Literaturverzeichnis carcinoembryonic antigen antibody strategies to enhance human tumor cell killing Year Immunol 7 106 109 1993 Kershaw M H Westwood J A Parker L L Wang G Eshhar Z Mavroukakis S A White D E Wunderlich J R Canevari S Rogers Freezer L Chen C C Yang J C Rosenberg S A Hwu P A phase I study on adoptive immunotherapy using gene modified T cells for ovarian cancer Clin Cancer Res 12 20 Pt 1 6106 15 2006 Klebanoff C A Finkelstein S E Surman D R Lichtman M K Gattinoni L Theo ret M R Grewal N Spiess J Antony BA Palmer D C Tagaya Y Rosenberg S A Waldmann T A Restifo N P IL 15 enhances the in vivo antitumor activity of tumor reactive CD8 T cells Proc Natl Acad Sci U S A 101 7 1969 1974 2004 Koehler H Kofler D Hombach A Abken H CD28 costimulation overcomes trans forming growth factor beta mediated repression of proliferation of redirected hu man CD4 and CD8 T cells in an antitumor cell attack Cancer Res 67 5 2265 73 2007 Kunkel
61. die L sungen und Medien vor ihrer Verwendung bei 121 C und 1 bar f r 25 min autoklaviert Thermolabile Substanzen wurden durch eine Membran mit 0 2 um Porengr e sterilfiltriert 19 Material 2 3 Bakterienst mme Zur Amplifikation von Plasmiden wurde der E coli Stamm DH5 F7 endA hsdR17 supE44 thi 1 recAl gyrA relAl AllacZYA argF p 80d lacZAM15 verwendet Aus ubel etal 1995 2 4 Zelllinien und prim re Zellen 2 4 1 Humane periphere blutmononukle re Zellen PBMCs Humane periphere blutmononukle re Zellen wurden aus Buffy Coats die bei der Erythrozyten und Thrombozyten Gewinnung erhalten werden isoliert Die Buffy Coats wurden aus der Tansfusionsmedizin der Uniklinik K ln bezogen und ent standen im Rahmen der Fraktionierung des Blutes gesunder Spender In Kapitel 3 3 4 ist die Vorgehensweise zur Isolation von PBMCs aus Buffy Coats beschrie ben 2 4 2 Tumorzelllinien Name Eigenschaften Referenz 293T Derivat der humanen Nierenkarzinom Pear et al 1993 Zelllinie 293 exprimiert das SV40 large Bolhuis et al 1998 T Antigen G418 resistent BW2064 Murine Hybridoma Zelllinie sezerniert Kaulen et al 1993 36 monoklonalen mIgG Antik rper mit Spezifit t f r die Bndedom ne des CEA spezifischen BW431 26 Antik rpers 20 Material LS174T Colo320 L540 L1236 C15A3 MC38 OKT3 15E8 Myla CEA und Tag72 humane Kolonkarzinom Zelllinie
62. e Apoptosefrequenz der CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulation induziert werden Der durch IL 7 vermittelte anti apoptotische Effekt beruht auf der Steigerung der Bcl 2 Expression Schluns er al 2000 und f hrt so wohl in naiven wie auch Ged chtnis T Zellen zur Expression des berlebensfaktors lung krupple like factor Schober etal 1999 Der positive Einfluss von IL 15 bewirkt das berleben CD8 T Zellen und spielt eine Rolle bei der Antigen unabh ngigen Expansion von naiven und Ged chtniszellen Berard et al 2003 Alves et al 2003 Die Verwendung von T Zellen und wie in dieser Arbeit gezeigt wurde die Gene rierung von CCR7 T Zellen f r die adoptive Immuntherapie erfordert eine starke Expansion der Zellen Diese sollte als Konsequenz der beschriebenen Beobachtun 101 Diskussion gen unter Einfluss von IL 7 und IL 15 erfolgen In bereinkunft damit stehen Er kenntnisse von Chen et al 2006 die eine geringere Sensitivit t f r den Entzug von Zytokinen f r TGF und f r Aktivierungs induzierten Zelltod von unter IL 7 und IL 15 Stimulation expandierten T Zellen beschreiben In Tiermodellen unter adop tiv transferierter T Zellen f hrte die Gabe von IL 7 Murphy et al 1993 oder IL 15 Klebanoff er al 2004 zu verst rkter anti Tumor Reaktivit t Dies ist m glicherwei se auf die F rderung des berlebens weit differenzierter T Zellen zur ckzuf hren da diese das gr te zytolytische Potenzial innerhalb e
63. eceptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues Nat Immunol 6 9 889 94 2005 Deeths M J Kedl R M Mescher M F CD8 T cells become nonresponsive anergic following activation in the presence of costimulation J Immunol 163 1 102 110 1999 Diehl V Kirchner H H Burrichter H Stein H Fonatsch C Gerdes J Schaadt M Heit W Uchanska Ziegler B Ziegler A Heintz F Sueno K Characteristics of Hodgkin s disease derived cell lines Cancer Treat Rep 66 4 615 632 1982 Emtage P C R Lo A S Y Gomes E M Liu D L Gonzalo Daganzo R M Jung hans R P Second generation anti carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation induced cell death proliferate on tumor contact secrete cytokines and exhibit superior antitumor activity in vivo a preclinical evaluation Clin Cancer Res 14 24 8112 8122 2008 Engvall E Perlman P Enzyme linked immunosorbent assay ELISA Quantitative assay of immunoglobulin G Immunochemistry 8 9 871 874 1971 Eshhar Z The T body approach redirecting T cells with antibody specificity Handb Exp Pharmacol 181 329 42 2008 Fidler I J The organ microenvironment and cancer metastasis Differentiation 70 9 10 498 505 2002 Fidler I J The pathogenesis of cancer metastasis the seed and soil hypothesis revisi ted Nat Rev Cancer 3 6 453 458 2003 Finney H M Lawson A D Bebbington C R Weir A N Chimeric re
64. ek len glei chen 4 5 CD28 0X40 kostimulierte CCR7 T Zellen sind bessere anti Tumor Effektoren in vivo In Tierversuchen wurde die Wirksamkeit von T Zellen mit anti CEA Immunrezepto ren gegen ber Tumoren der murinen CEA Kolonkarzinom Zelllinie C15A3 gepr ft Eine CEA exprimierende Population von C15A3 Tumorzellen stellt mit zunehmenden Proliferationszyklen die Oberfl chenexpression von CEA ein Da eine m glichst ho mogene Expression von CEA auf der Targetzellpopulation erw nscht war wurde eine Subklonierung durch Einzelzellaussaat von C15A3 Zellen durchgef hrt Die Kolonien wurden mittels Durchflusszytometrie auf CEA Expression berpr ft Abbildung 4 27 Klone mit hoher CEA Expression wurden expandiert und f r nachfolgende Versuche verwendet 4 5 1 In vivo weisen CCR7 T Zellen mit CD28 OX40 Kostimulation bessere anti Tumor Aktivit t auf als CCR7 T Zellen Um die in vivo Relevanz der in vitro erh hten zytolytischen Aktivit t der CCR7 T Zellen zu berpr fen wurden BW431 26scFv Fc CD28 CD3C OX40 975 expri mierende CCR7 oder CCR7 T Zellen Reinheit der Subpopulationen 2 97 zu sammen mit CEA C15A3 oder CEAT MC38 Tumorzellen subkutan in CD1 Nackt m use 7 Tiere Gruppe koinjiziert Als Kontrolle dienten M use denen Schein 85 Ergebnisse 100 positive Zellen S gt 5 lt m 5 2 E E DE Zr Ze E O O O CCR7 T Zell Subpopulation 7 EI CCR7 T Zell Subpopulatio
65. ell Populationen verschiedener Spender exprimierten CCR7 in unterschiedlicher Frequenz Der Anteil der CCR7 T Zellen an der Gesamtzahl von T Zellen lag zwi schen 82 und 54 Abbildung 4 1 Es bestand keine Abh ngigkeit der Anzahl CCR7 T Zellen vom Alter des Spenders Abbildung 4 2 Als Voraussetzung zur Untersuchung funktioneller Attribute von CCR7 und CCR7 T Zellen musste ein Verfahren entwickelt werden das beide T Zell Populationen mit m glichst gro er Reinheit unter Erhalt ihrer Vitalit t trennt Es wurden hierf r drei Strategien auf ihre Eignung gepr ft 1 Zun chst wurden mittels negativer Selektion isolierte CD3 T Zellen mit dem 43 Ergebnisse 32 66 54 0 ser 32 10 10 102 10 10 10 101 102 10 10 10 101 102 10 10 T N 80 N a2 10 101 102 70 104109 107 102 10 10410 410 102 10 104 80 68 62 10 10 10 10 104409 101 102 10 10410 101 102 10 10 CCR7 FI Abbildung 4 1 Physiologische CCR7 Expression Je 2x 10 PBMCs aus frischem Blut von 9 gesun den Spendern wurden mit dem anti human CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 dem FITC konjugierten sekund ren Antik rper anti murin IgM sowie dem PE konjugierten anti human CD3 Antik rper Klon UCHT 1 gef rbt und durchflusszytometrisch analysiert Als Kontrollen wurden die PBMCs mit einem FITC konjugierten Antik rper irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps gef rbt Abgebildet ist die Expres sion
66. eller der verwendeten Mini PEQLAB Biotechnologie GMBH Erlangen Deutschland oder Midiprep Kits Quiagen Hilden Deutschland F r Minipreps wurden 5 ml f r Midipreps 25 ml einer bernachtkultur verwen det Die gewonnenen Produkte der Minipreps wurden in 30 ul die der Midipreps 32 Methoden in 100 ul ddH20O aufgenommen und die DNA Konzentration photometrisch oder mit tels Agarose Gelelektrophorese bestimmt Kapitel 3 2 3 Die Plasmid L6sungen wur den bei 20 C gelagert 3 2 2 Agarosegelelektrophorese Agarosegelelektrophorese Sambrook et al 1996 mit 1 igen w v Agarosegelen 1 w v UltraPure Agarose Invitrogen Karlsruhe Deutschland in 1 x TAE 40mM Tris Acetat 1 mM EDTA 20 mM Essigs ure pH 8 3 0 5 ug ml EthBr wurde zur Iden tifizierung und Quantifizierung von PCR Produkten sowie zur Aufreinigung von DNS verwendet Die Wahl der auf das Gel aufgetragenen Volumina der DNS Proben gesch ah abh ngig von der Beschaffenheit sowie dem Verwendungszweck der DNS Als Stan dard wurden jeweils 5 ul des GeneRuler lkb DNA Ladder Fermentas St Leon Rot Deutschland eingesetzt Die DNS in den mit Ethidium Bromid gefarbten Gelen wurde mittels eines UV Transilluminators bei 254 nm sichtbar gemacht und photogra phiert 3 2 3 DNS Konzentrationsbestimmung Photometrische Konzentrationsbestimmung DNS wurde in Wasser gel st und die Konzentration im Photometer bei 260
67. elte Sti mulation weniger IL 2 aber mehr IL 10 und IFN y sekretieren als CCR7 T Zellen Um die IL 2 IL 10 und IFN y Expression isolierter CCR7 und CCR7 T Zellen zu un tersuchen wurden frisch isolierte CD3 T Zellen hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Reinheiten gt 95 und in RPMI 1640 Medium f r 2h mit PMA Ionomycin stimuliert Anschlie end wurden IL 2 IL 10 oder IFN y produzierende Zellen durch flusszytometrisch bestimmt Ein gr erer Anteil der CCR7 T Zellen exprimierte IL 2 als bei Zellen der CCR7 T Zell Subpopulation Genau umgekehrt verhielt sich die Expression von intrazellu l rem IFN y Abbildung 4 12 Dieses Verh ltnis spiegelte sich auch in der Expressi onsst rke der Zytokine wider nicht abgebildet Zur Analyse der Expression von IL 10 auf nicht aktivierten CCR7 und CCR7 T Zellen wurden CD3 T Zellen isoliert mittels magnetischer Zellsortierung in CCR7 und CCR7 T Zellen getrennt Reinheiten gt 95 und die Zellen ohne weitere Zus tze kul 59 Ergebnisse LS174T L540 CEAt CD30 CEA CD30 160 160 140 140 120 120 100 100 S 80 80 a 604 60 y 40 40 20 20 o inne a ee B 1 20 110 15 125 1 24 1 12 1 6 1 3 2 z m CCR7 Rael eae 15 6 J 4 CCR7 T Zellen rezeptor S 1 41 o CCR7 T Zellen gt Pl n A CCR7 T Zellen rezeptor 0 0 C 120 110 15 125 1 24 1 12 1 6 1 3 1 i os 0 8 0 6 0 6 Cc S 04 0 4 Z 0
68. en CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen CCR7 oie neue bo gt ff Abbildung 4 29 Zytolytisches Potenzial der im Mausversuch eingesetzten 975 Rezeptor tragenden CCR7 und CCR7 T Zellen in vitro Die CD3 CCR7 O und CCR7 A T Zellen mit BW431 26 scFv Fc CD28 CD3C OX40 975 wurden zur Analyse ihres zytolytischen Potenzials mit den CEA C15A3 oder CEA MC38 48 h auf Mikrotiterplatten mit 96 Wells koinkubiert Schein transduzierte CCR7 und CCR7 4 T Zellen dienten als Kontrolle Es wurden bei 1 25x 10 bis 1x 10 Effektorzellen Well konstant 2 5x 10 Tumorzellen Well eingesetzt Die Zytotoxizit t der T Zellen wurde mit Hilfe des XTT basierten Viabilit tstests bestimmt Die berst nde wurden mittels ELISA auf ihre IFN y Konzentration berpr ft Alle Ans tze wurden in Triplikaten angefertigt Abgebildet sind die Mittelwerte Standardabweichungen der Mittelwerte w o ohne without Immunrezeptor 91 Ergebnisse gt CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen 607 975 5 300 5 300 E E amp 200 5 200 E E S 100 S 100 O oO E E gt gt H 0 0 0 10 20 0 10 Tage nach Injektion Tage nach Injektion p 0 028 80 Te a fe E 60 o 5 404 9 To 0 204 gt F o 8 O 607 975 CCR77 T Zellen Abbildung 4 30 CCR7 T Zellen ben tigen CD28 OX40 Kostimulation f r eine effektive anti Tumor Antwort in vivo CD1 Nacktm usen 6 Tiere Grup
69. en der gemessenen optischen Dichten in folgende Formel errechnet ner Effektorzellen Tumorzellen Effektorzellen Viabilit t x 100 Tumorzellen Medium 3 3 10 BrdU Proliferationstest Die Proliferation von Lymphozyten wurde mittels Cell Proliferation ELISA BrdU Ro che Applied Science Mannheim Deutschland nach Herstellerangaben getestet Hier f r wurden Ans tze von 1 4x10 Zellen auf einer 96 Well Mikrotiterplatte unter Stimulations Bedingungen kultiviert die in Abh ngigkeit von den Versuchsanforde rungen variierten Nach Inkubation mit BrdU wurden die Zellen getrocknet und fixiert Abweichend vom Protokoll wurden nur 100 ul FixDenat L sung und 50 ul BrdU POD verwendet Als Substrat wurde schlie lich ABTS zugegeben Die Messung der Ab sorption erfolgte bei OD405 490 nm 39 Methoden 3 3 11 Detektion apoptotischer Zellen Apoptotische Zellen in frisch isolierten oder in Kultur vorliegenden Lymphozyten wur den durch F rbung mit Annexin V und 7 AAD oder Propidium Iodid und anschlie en der Analyse mittels Durchflusszytometrie identifiziert Annexin V bindet an Phosphati dylserin das bei apoptotischen Zellen an die Zelloberfl che tritt 7 AAD und PI dringen in apoptotische Zellen ein und binden an Nukleins uren 3 4 Durchflusszytometrische Analysen 3 4 1 Detektion von Oberfl chenmarkern In einem Polystyrol FACS R hrchen wurden 1 5x10 Zellen zun chst zweima
70. er IL 7 stimuliert Die Zellen wurden in regelm igen Abst nden gez hlt sowie ihre CCR7 Expression mittels Durchflusszytometrie ermittelt In Gegenwart von IL 2 proliferierten Zellen weit st rker als unter Einfluss von IL 7 Gleiches galt f r Zellen die mit anti CD3 anti CD28 Stimulation und IL 2 kultiviert wurden im Gegensatz zu den mit anti CD3 und IL 2 stimulierten Zellen Der Anteil an CCR7 T Zellen an der Gesamtpopulation verhielt sich in allen Ans tzen entspre chend zur Zellzahl Starke Proliferation ging mit einer starken Zunahme an CCR7 T Zellen einher w hrend die Abwesenheit von Proliferation eine unver nderte CCR7 Expression zur Folge hatte IL 7 wies kein Potenzial zur Induktion CCR7 T Zellen auf Diese Ergebnisse demonstrieren dass Proliferation einer T Zell Population die Gene rierung CCR7 T Zellen bedingt 77 Ergebnisse 4 4 34 3 bes S 24 2 a Z 1 1 0 0 i i 1 20 1 10 1 5 125 1 20 1 10 1 5 125 Verh ltnis Effektor Targetzellen CD3 T Zellen w o m CD3 T Zellen O CCR7 amp CCR7 T Zellen x CCR7 T Zellen A CCR7 T Zellen 439 Abbildung 4 22 Trennung hinsichtlich der CCR7 Expression vermindert die Aktivierbarkeit von T Zellen Frisch isolierte CD3 T Zellen wurden zur Expression des CEA spezifischen Immunrezep tor BW431 26scFv Fc CD3 439 transduziert und anschlie end hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Es erfolgte eine Koinkubation vo
71. erte T Zellen Temra bezeichnet Abbildung 1 3 Sie akkumulieren im normalen Alterungsprozess in der CD8 T Zell Population Hamann et al 1997 Sallusto et al 1999b 1 5 Bedeutung von Kostimulation in der T Zell Aktivierung Die Aktivierung von T Zellen erfolgt durch die bermittlung von Signalen durch pro fessionelle Antigen pr sentierende Zellen APCs Hierbei wird zwischen prim ren Si gnalen die ber die Interaktion des T Zell Rezeptors mit einem durch MHC pr sentierten Antigen induziert werden und sekund ren so genannten kostimulato rischen Signalen unterschieden Kostimulatorische Signale werden unter anderem durch CD28 CD40L PD 1 OX40 und 4 1BB und deren jeweilige Liganden vermit telt Die Abwesenheit kostimulatorischer Signale f hrt zur Anergie und schlie lich zur Apoptose von T Zellen 10 Einleitung F r die Immuntherapie eingesetzte Immunrezeptoren k nnen den T Zellen abh n gig von den in den Rezeptor integrierten intrazellul ren Signaldom nen verschiedene Signale vermitteln T Zellen die lediglich das prim re Signal in Form einer CD3 Ket te erhalten sind in der Lage effektiv Zytotoxizit t zu vermitteln Diese Zellen sind je doch durch eine erh hte Anf lligkeit f r den Aktivierungs induzierten Zelltod AICD und geringe in vivo Persistenz gekennzeichnet Wang et al 2007 Durch Integrati on intrazellul rer kostimulatorischer Signaldom nen in den chim ren CD3 Rezep tor bekomm
72. eschrittenen Entwicklungsstadium befindlichen T Zellen f r die adoptive Im muntherapie spricht dass T Zellen mit steigendem Alter und zunehmenden Prolife rationszyklen zwar an Effektorfunktionen gewinnen deren Aktivierungs induzierte Apoptosefrequenz aber ansteigt wodurch die in vivo Effektivit t dieser T Zellen ein geschr nkt ist Gattinoni et al 2005 Zhou etal 2005 Dies steht in bereinstimmung mit den in dieser Arbeit erworbenen Erkenntnissen da CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen zwar eine gr ere in vitro Effektivit t aufwiesen diese Zellen jedoch weniger stark proliferierten und durch eine h here Anf lligkeit f r Apoptose gekenn zeichnet waren als CCR7 T Zellen CD8 CD7 T Zellen die eine Subpopulation der CCR7 T Zellen bilden werden ebenfalls mit einem gr eren zytolytischen Potenzial Aandahl er al 2003 und einer h heren Sensitivit t gegen ber Aktivierungs induziertem Zelltod im Vergleich zu CD8 CD7 T Zellen Rappl etal 2008 assoziiert Aus diesen Beobachtungen ergibt sich dass die Nutzung des gro en Potenzials dieser T Zellen in fortgeschrittenen Differenzierungsstadien f r einen erfolgreichen Ein satz in der adoptiven Immuntherapie Ma nahmen zur Unterdr ckung der erh hten Apoptoserate erfordert In diesem Zusammenhang wurden unterschiedliche Strategien verfolgt um das ber leben von CCR7 T Zellen zu f rdern Unter Verwendung der Zytokine IL 7 so wie IL 15 konnte eine geringer
73. ezifisch durch den Immunrezeptor vermittelt da T Zellen mit dem anti CEA Immunrezeptor 439 aus schlie lich durch Koinkubation mit CEA CD307 LS174T Zellen aktiviert wurden aber nicht durch CEA CD30 MyLa Zellen w hrend T Zellen mit anti CD30 Rezeptor 523 durch MyLa Zellen aber nicht durch LS174T Zellen aktiviert wurden Abbildung 4 16 Hier wurde die Spezifit t der Immunrezeptor vermittelten Tumorzell Lyse durch CCR7 T Zellen gezeigt 4 2 3 Aktivierung von CD4 CCR7 T Zellen in vitro In der CD8 Population ist der Anteil der CCR7 Zellen gr er als in der CD4 Po pulation Um auszuschlie en dass die gr ere Effektivit t CCR7 T Zellen durch den gr eren Anteil der CD8 T Zellen in dieser Population begr ndet ist wurde die Ak tivierung von CD4 CCR7 im Vergleich zu CD4 CCR7 Zellen untersucht Hierf r wurden CD4 T Zellen mittels negativer Selektion aus PBMCs isoliert Diese T Zellen wurden zur Expression des CEA spezifischen Immunrezeptors BW431 26 scFv Fc CD3Z 439 transduziert durch magnetische Zellsortierung in die CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen getrennt Reinheiten gt 95 und f r 48h mit CEA LS174T Tumorzellen koinkubiert CD4 CCR7 T Zellen mit Immunrezeptor lysierten CEA Tumorzellen mit h he rer Effizienz als Rezeptor tragende CD4 CCR7 T Zellen CD4 CCR7 T Zellen wurden st rker aktiviert angezeigt durch erh hte IFN y Sekretion dieser Po pulation Als Kontrolle dienten Schein transd
74. ezifisch f r humanes CCR7 Klon 2H4 23 Material Anti human IFN y Anti human IL 2 Anti human IL10 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Interferon y Klon NIB42 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Interleukin 2 Klon 5344 111 monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch f r humanes Interleukin 10 Klon JES3 9D7 BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences BW2064 36 monoklonaler Maus Antik rper mit Kaulen et al 1993 idiotypischer Spezifit t f r den anti CEA Antik rper BW431 26 der spezifisch an CEA bindet OKT3 monoklonaler Maus Antik rper ATCC spezifisch fiir humanes CD3 CRL 8001 15E8 monoklonaler Maus Antik rper R van Lier NCB gegen humanes CD28 Amsterdam NL Prim re AK Eigenschaften Klon Hersteller Fluorochrom markiert Anti human Bcl 2 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Bcl 2 Klon 100 24 BD Biosciences Material Anti human CCR4 Anti human CCR10 Anti human CD3 Anti human CD4 Anti human CD8 Anti human CD11la Anti humann CD25 Anti human CD27 monoklonaler Maus Antik rper R amp D Systems spezifisch f r humanes CCR4 Klon 205410 monoklonaler Ratten Antik rper Biolegend spezifisch f r humanes CCR10 Klon 314305 monoklonaler Maus Antik rper Dako spezifisch f r humanes CD3 Klon UCHT 1 monoklonaler Maus Antik rper Dako spezifisch f r humanes CD4 Klon MT310 mono
75. g a chimeric T cell receptor possessing CD28 and CD137 costimulatory domains Hum Gene Ther 18 8 712 725 2007 Wang L Goillot E Tepper R I IL 10 inhibits alloreactive cytotoxic T lymphocyte generation in vivo Cell Immunol 159 2 152 169 1994 Ward S G Marelli Berg EM Mechanisms of chemokine and antigen dependent T lymphocyte navigation Biochem J 418 1 13 27 2009 Weijtens M E Willemsen R A Hart E H Bolhuis R L A retroviral vector system STITCH in combination with an optimized single chain antibody chimeric receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression in human T lym phocytes Gene Ther 5 9 1195 203 1998 Wherry E J Teichgr ber V Becker T C Masopust D Kaech S M Antia R von 119 Literaturverzeichnis Andrian U H Ahmed R Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets Nat Immunol 4 3 225 234 2003 Wolf J Kapp U Bohlen H Kornacker M Schoch C Stahl B Miicke S von Kalle C Fonatsch C Schaefer H E Hansmann M L Diehl V Peripheral blood mononuclear cells of a patient with advanced Hodgkin s lymphoma give rise to per manently growing Hodgkin Reed Sternberg cells Blood 87 8 3418 3428 1996 Yazdi A S Morstedt K Puchta U Ghoreschi K Flaig M J Rocken M Sander C A Heterogeneity of T cell clones infiltrating primary malignant melanomas J Invest Dermatol 126 2 393
76. gin s ureresten spaltet So ist GranzymB in der Lage mehrere Procaspasen sowie iCAD Inhibitor of Caspase activated DNAse durch proteolytische Spaltung zu aktivieren Trapani 2001 2 Ein weiterer Mechanismus ist die Bindung des auf der T Zell Oberfl che expri mierten Fas Ligand CD178 an den Fas Rezeptor CD95 auf der Oberfl che einer Zielzelle Die Bindung f hrt zur Trimerisierung des Fas Rezeptors und l st in der Zielzelle eine Kaskade von apoptotischen Molekiilen aus die den programmier ten Zelltod einleitet Fas FasL Interaktion f hrt nicht nur zur Eliminierung von Zielzellen einer T Zell Antwort Auch T und B Zellen werden im Rahmen der Lymphozyten Homeostase auf diese Weise eliminiert Russell und Ley 2002 3 Die Sekretion von IFN y verleiht T Zellen neben der exekutiven Funktion an hand zytolytischer Effektormolek le oder FasL zus tzlich ein indirektes Potenzi al zur Einflussnahme auf Immunantworten IFN y kann durch die Aktivierung Einleitung von Makrophagen in physiologischen Immunantworten antiviral immunregu latorisch oder antitumoral wirken Schroder et al 2004 Die Funktion von IFN y M usen deutlich da in endogenen anti Tumor Mechanismen wird in IFN y diese anf lliger f r chemisch induzierte Sarkome Kaplan et al 1998 sowie f r spontane epitheliale Tumore sind Shankaran et al 2001 Die Expression von IFN y Perforin und Granzymen nimmt im Lauf der T Zell Entwicklung zu
77. gruppen innerhalb der Chemokin Familie Bei CC Chemokinen liegen in der N he des Ami noterminus zwei Cysteine nebeneinander w hrend bei CXC Chemokinen die entspre chenden zwei Cysteine durch eine einzelne andere Aminos ure getrennt sind Bisher wurden ber 50 Chemokine und 20 Chemokinrezeptoren identifiziert Bromley et al 2008 Nach der Selektion im Thymus differenzieren nur solche naiven T Zellen zu Effek torzellen die ihrem spezifischen Antigen in einem definierten molekularen Kontext begegnen Chemokine sind in diesem Zusammenhang ma geblich verantwortlich f r die Rekrutierung von Lymphozyten und APCs aus dem peripheren Blut deren 13 Einleitung zielgerichtete Migration durch die unterschiedlichen Zonen der sekund ren lympha tischen Gewebe und schlie lich f r die Auswanderung und Migration zu weiteren sekund ren lymphatischen Geweben W hrend naive T Lymphozyten durch die se kund ren lymphatischen Organe zirkulieren exprimieren Antigen erfahrene T Zellen im Rahmen ihrer Differenzierung Chemokinrezeptoren welche die T Lymphozyten zur Immun berwachung sowie zur Antwort auf Entz ndungsfaktoren in spezifi sche Gewebe hineinf hren und innerhalb dieser Gewebe leiten Bromley et al 2008 Die Abwesenheit des CC Chemokin Rezeptors 7 CCR7 auf der Oberfl che von T Zellen geht mit besonderen migratorischen Eigenschaften einher Bromley et al 2005 zeigten dass sowohl CCR7 als auch CCR7 Effektor T Zellen in die
78. h Gladbach Deutschland 29 Material R amp D Systems Minneapolis USA Southern Biotech Birmingham Alabama USA Se rotec Martinsried Deutschland 30 3 Methoden 3 1 Mikrobiologische Methoden 3 1 1 Kultivierung und Lagerung von E coli DH5 Bakterien Die Kultivierung von Bakterienst mmen erfolgte in LB Medium 1 w v Pepton 0 5 w v Hefeextrakt 1 w v NaCl bei 37 C und 200 Upm in einem Sch t telinkubator ber Nacht Zur Selektion rekombinanter Bakterien wurde Ampicillin 200 ug ml verwendet Zur langfristigen Lagerung wurden 700 ul einer Bakterien ber nachtkultur mit 300 ul 87 v v Glycerin vermischt und bei 80 C aufbewahrt F r kurze Zeitspannen wurden die Bakterien auf Agarplatten LB Medium 1 5 w v Agar kultiviert 3 1 2 Herstellung chemisch kompetenter E coli DH5 Die Herstellung chemisch kompetenter Bakterien erfolgte nach der Methode von Hanahan 1983 Frisches LB Medium 500 ml wurde mit 5ml einer Ubernacht kultur des E coli DH5a Stammes inokuliert Die Zellen wurden bei 37 C und 250 UpM bis zu einer ODgoonm von 0 7 bis 0 8 inkubiert um Zellen in der loga rithmischen Wachstumsphase zu erhalten Die Kulturen wurden 5 10 min auf Eis abgek hlt und die Zellen anschlie end durch Zentrifugation 10 min bei 2300xg und 4 C sedimentiert Alle weiteren Schritte wurden bei 4 C im K hlraum durch gef hrt Der Uberstand wurde verworfen und das Sediment in 30 ml Puffer Tfb I 3l
79. ich durch MHC pr sentierte Antigene erkennt ist die durch den Immunrezeptor vermittelte Spezifit t unabh ngig von der Erkennung von MHCs Chim re Rezeptoren werden ex vivo mit Hilfe retroviraler Vektoren in die autologen T Zellen eines Tumorpatienten eingebracht und die Zellen anschlie end ex vivo ex pandiert Die modifizierten T Zellen werden dem gegebenenfalls durch Lymphode Einleitung 4 I Antik rper s l I x x 7 ad Einzelketten Antik rper scFv Antikorper CH2 CH3 Dom ne TCR Komplex ee ye Dimere Form eines aa 1 5 rekombinanten i scFv Fc CD3 Rezeptors CD3Z Signal dom ne Abbildung 1 1 Schematische Darstellung eines Antik rper basierten rekombinanten Immun rezeptors Die in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten Immunrezeptoren bestehen aus einer Antik rper basierten Bindedom ne scFv mit Spezifit t f r ein Tumor assoziiertes Antigen dem Fc Teil eines humanen IgG Antik rpers als stabilisierendes Bindeglied zwischen extra und intrazellul rer Dom ne sowie einer oder mehreren aus T Zellen entnommenen intrazellul ren Signaldom nen Einleitung pletion vorkonditionierten Patienten transfundiert Die durch Lymphodepletion ver mittelte Beseitigung der verbliebenen Immunzellen im K rper f hrt zur Eliminierung von regulatorischen T Zellen und zur Depletion endogener Zellen die um aktivieren de Zytokine konkurrieren Gattinoni et al 2006 In klinischen
80. ie Rezeptor vermittelte Kostimulation mit CD3C und CD28 vermieden werden Koehler etal 2007 Dahingegen kann die supprimierende Funktion von Tyeg Zellen durch die Abwesenheit von IL 2 berwunden werden da das berleben dieser Zellen von IL 2 abh ngig ist Shevach 2002 Hier wurde gezeigt dass CCR7 T Zellen geringere IL 2 Mengen sezernieren als CCR7 T Zellen und somit geringere Unterst tzung f r das berleben der Treg Zellen liefern Ein hnlicher Effekt zur Unterdr ckung der Funktion von Tyeg Zellen kann auch durch einen chim ren Immunrezeptor mit der intrazellul ren CD3 Dom ne sowie der CD28 Signalkette mit mutierter Ick Bindestelle vermit telt werden Dieser Rezeptor gew hrleistet zwar die kombinierte Kostimulation durch CD28 CD3Z unterdr ckt jedoch die Sekretion von IL 2 CCR7 T Zellen sind durch die Expression von Homing Rezeptoren f r die Peripherie gekennzeichnet und k nnen sich aufgrund der Abwesenheit von CCR7 nicht aus peri pherem Gewebe entfernen Diese Kriterien machen zusammen mit der Tatsache dass CCR7 T Zellen gro es direktes und indirektes zytolytisches Potenzial besitzen diese 100 Diskussion Subpopulation zu einer viel versprechenden Effektorpopulation f r in vivo Applikatio nen mit adoptiv transferierten T Zellen CCR7 T Zellen repr sentieren vor allem sp te Effektorzellen Effektor Ged chtnis T Zellen sowie enddifferenzierte T Zellen Gegen die Verwendung dieser in einem fortg
81. ie end steril gehandhabt Zur Kultivierung eukaryontischer Zellen wurde das Vollmedium Gibco RPMI 1640 1x mit GlutaMAXTMI oder das Minimalmedium Gibco DMEM 1x mit GlutaMAX I beide GibcoBRL Karlsruhe Deutschland eingesetzt Vor Verwendung wurden so wohl RPMI 1640 als auch DMEM Medium mit 10 v v fetalem K lber Serum Bio chrom KG Berlin Deutschland 1001 U ml Penicillin G und 100 ug ml Streptomy cin Penicillin Streptomycin L sung GibcoBRL Karlsruhe Deutschland versetzt Die 34 Methoden Kultivierung in RPMI 1640 Medium erfolgte bei 37 C und 5 CO die in DMEM Me dium bei 37 C und 10 CO 3 3 2 Kryokonservierung eukaryontischer Zellen Zur l ngerfristigen Lagerung von Zelllinien und Prim rzellen wurden 5 x 10 bis 1x10 Zellen sedimentiert und in 900 ul des entsprechenden Kulturmediums resus pendiert Die Zellsuspension wurde in einem thermostabilen Kryovial mit 100 ul DMSO versetzt Das Kryovial wurde dann mit Hilfe eines 5100 Cryo 1 C Free zing Container Mr Frosty Thermo Fisher Scientific Rochester USA langsam von 20 C auf 80 C abgek hlt und bei dieser Temperatur maximal 6 Monate gela gert F r dauerhafte Lagerung wurden die Kryovials in fl ssigen Stickstoff ber f hrt 3 3 3 Passage adh renter Zellen Zur Abl sung adh renter Zellen von der Oberfl che eines Zellkulturgef es wurde zu n chst das Medium entfernt und die Zellen wurden mit PBS 137
82. ierten CCR7 Zellen signifikant ein CCR7 Zellen wurden durch keines der Zy tokine supprimiert Abbildung 4 19 Hier wurde gezeigt dass IL 7 und IL 15 die Viabilit t von CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen erh hen 4 3 2 CD28 OX40 Kostimulation sch tzt CCR7 T Zellen vor Apoptose Um zu pr fen ob die Frequenz apoptotischer CCR7 T Zellen durch Immunrezeptor vermittelte Kostimulation beeinflusst werden kann wurden CD3 T Zellen zur Expression des Rezeptors BW431 26 scFv Fc CD28 CD3 607 oder BW431 26 scFv Fc CD28 CD3C OX40 975 transduziert Die Zellen wurden durch den im mobilisierten anti idiotypischen Antik rper BW2064 36 mit Spezifit t f r das CEA scFv stimuliert Rezeptor tragende CD3 T Zellen die unter Einfluss eines immo bilisierten Antik rpers irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps kultiviert wurden dienten als Kontrolle Nach zwei Tagen wurde mittels F rbung mit AnnexinV der Anteil apoptotischer Zellen der Rezeptor tragenden CCR7 und CCR7 T Zellen be stimmt Die Viabilitat von CCR7 T Zellen wurde durch Rezeptor vermittelte Stimulati on unabh ngig von der Zusammensetzung der Signalkette nicht beeinflusst F r CCR7 T Zellen wurde ein signifikant besseres berleben mit Hilfe der kombi nierten Kostimulation durch CD28 und OX40 beobachtet w hrend diese Zellen 72 Ergebnisse CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen Kontrolle Kontrolle IL 2 IL 2 IL 7 IL
83. ihrer Aktivit t beeintr chtigt werden wurden CD3 T Zellen zun chst trans duziert und anschlie end magnetisch separiert Die ungetrennte CD3 Gesamtpopu lation CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen sowie die in ihrer urspr nglichen Verteilung wiedervereinigten Subpopulationen wurden f r 48 h mit CEA LS174T Zel len oder CEA Colo320 Zellen inkubiert Die Reinheiten der CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen betrugen gt 95 Die berst nde wurden nach 48 h entnommen und mittels ELISA auf die IFN y Konzentration berpr ft 75 Ergebnisse 1200 1000 TA 800 gt aL 600 0 Isotyp mAb a 400 BW2064 36 mAb 200 0 T T Zum 1 CCR7 CCR7 CCR7 CCR7 T Zellen T Zellen Pn at m 607 975 Abbildung 4 21 CD28 0X40 Kostimulation induziert die Expression von Bcl 2 CD3 T Zellen wur den zur Expression der Immunrezeptoren BW431 26scFv Fc CD28 CD3 607 oder BW431 26scFv Fc CD28 CD3L OX40 975 transduziert und die Rezeptor tragenden Zellen isoliert Hierf r wurden die Zellen mit PE konjugiertem F ab 2 anti human IgG Antik rper gef rbt und anschlie end mit anti PE MicroBeads magnetisch markiert Die autoMACSTM Trennung erfolgte unter Verwendung des Pro grammes Possel d f r die Anreicherung von Zellen mit geringer Frequenz mittels Positiv Selektion Auf einer 96 Well Mikrotiterplatte wurden jeweils 5x10 Zellen Well mit immobilisiertem anti CEA scFv Antik rper
84. iner T Zell Population besitzen Wir erwarten daher dass die therapeutische Verabreichung von IL 7 oder IL 15 zusam men mit adoptiv transferierten CCR7 T Zellen zu einem gesteigerten Therapieerfolg f hrt Kombinierte Kostimulation der T Zellen durch rekombinante Immunrezptoren stellt wie in dieser Arbeit ermittelt wurde eine weitere M glichkeit dar um der Apopto se CCR7 T Zellen entgegenzuwirken Die Signalgebung durch einen Immunrezep tor mit den intrazellul ren Dom nen von CD28 CD3C und OX40 bewirkte in CCR7 T Zellen in vitro eine geringere Apoptosefrequenz sowie eine erh hte Bcl 2 Expres sion im Vergleich zur Stimulation durch CD28 und CD3L Immunrezeptoren mit zwei kostimulatorischen Dom nen zus tzlich zur CD3C Dom ne stellen die dritte Gene ration rekombinanter Immunrezeptoren dar Bisher wurden nur Vergleiche von Im munrezeptoren der zweiten Generation also mit einer kostimulatorischen Signaldo m ne zus tzlich zur CD3C Dom ne beschrieben Dabei zeigte sich dass die kombi nierte Signalkette aus CD3 und CD28 T Zellen effizienter stimuliert als die Kombina tion von CD3 mit einer OX40 CD40L 4 1BB oder PD 1 Signaldom ne Finney et al 1998 2004 Lediglich Carpenito et al 2009 beschreiben die Verwendung eines Rezep tors mit den drei intrazellul ren Signalketten von CD28 4 1BB und CD3 zur erfolg reichen Eliminierung gro er etablierter Tumore In bereinstimmung mit dieser Pu blikation wurde
85. ion durch ausschlie lich anti CD3 erfolgte langsamer und stagnier te nach etwa 6 Tagen Die mit MitomycinC behandelten Zellen zeigten keine Proli feration Mit anti CD3 anti CD28 stimulierte T Zellen proliferierten genauso gut wie IL 2 OKT3 AK stimulierte Zellen zeichneten sich jedoch durch einen deutlich gerin geren Anstieg des Anteils an CCR7 T Zellen aus Nach 8 Tagen hatten etwa 40 der anti CD3 anti CD28 stimulierten Zellen die CCR7 Expression eingestellt wohingegen in der mit IL 2 anti CD3 stimulierten Fraktion mehr als 70 CCR7 T Zellen detek tiert wurden Dieser Versuch demonstrierte dass IL 2 anti CD3 Stimulation die Entstehung von CCR7 T Zellen effektiver induziert als anti CD3 anti CD28 Stimulation ob wohl beide Arten der Stimulation zu gleich starker Proliferation f hren Abbildung 4 25 82 Ergebnisse 100 x T 80 5 5 K 3 60 D oc 8 2 Q 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 Zeit Tage Zeit Tage OKT3 AK OKT3 AK O OKT3 AK IL 2 Mitomycin C m OKT3 AK IL 2 A OKT3 AK 15E8 AK 4 OKT3 AK 15E8 AK Abbildung 4 25 IL 2 anti CD3 Stimulation induziert die Entstehung CCR7 T Zellen aus CCR7 T Zellen st rker als anti CD3 anti CD28 Stimulation CD3 CCR7 T Zellen wurden aus frischen PBMCs isoliert Die H lfte der Zellen wurde mit Mitomycin C 20 ug ml behandelt und behandelte so wie unbehandelte CCR7 T Zellen wurden mit CFSE 1 25 uM gef rbt Je 2 6x 10 Zellen wurden mit anti CD3 100 ng
86. it anti human CD3 Klon UCHT 1 anti human CCR7 IgM Klon 2H4 und anti murin IgM sowie anti human CD45RO Klon UCHL1 Antik r pern gef rbt und durchflusszytometrisch analysiert PBMCs die mit Antik rpern irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps gef rbt wurden dienten als Kontrolle graue Fl che 58 Ergebnisse oder des analogen Rezeptors mit Spezifit t f r CEA BW431 26 scFv Fc CD28 CD3 607 transduziert Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Reinheiten gt 95 und mit CD30 CEA L540 Zellen oder CD30 CEA LS174T Zel len 48h koinkubiert Die berst nde wurden entnommen und mittels ELISA auf ihren Gehalt an IL 2 IL 10 und IFN y gepr ft T Zellen der CCR7 Subpopulation produzierten nach Aktivierung weniger IL 2 als CCR7 T Zellen Diese Beobachtung galt sowohl nach Aktivierung durch den CEA als auch durch den CD30 spezifischen Rezeptor Abbildung 4 11 A IL 10 wurde aus schlie lich von mit LS174T Zellen kokultivierten CEA spezifischen CCR7 T Zellen se kretiert Da L540 Zellen gro e Mengen IL10 sezernieren wird die m gliche Induktion einer IL 10 Sekretion durch T Zellen berlagert Abbildung 4 11 B CCR7 T Zellen se zernieren nach Aktivierung mehr IFN y als Antigen spezifische CCR7 T Zellen Ab bildung 4 11 C T Zellen ohne Immunrezeptor f r das jeweilige Antigen sezernierten keine Zytokine Abbildung 4 11 Hier wurde gezeigt dass CCR7 T Zellen durch Rezeptor vermitt
87. k rper so wie dem Fluorochrom konjugierten anti murin IgM Sekund rantik rper nachgewie sen Etwa gleich viele CCR7 und CCR7 T Zellen innerhalb der ungetrennten CD3 T Zell Population exprimierten den Immunrezeptor Auch nach der Trennung der CD3 Ge samtpopulation hinsichtlich der CCR7 Expression wurden die Immunrezeptoren in T Zellen der CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen etwa gleich stark exprimiert Abbildung 4 7 Hier wurde gezeigt dass CCR7 und CCR7 T Zellen aufgrund der gleich starken Ex pression von Immunrezeptoren nach der Transduktion gleiche Voraussetzungen f r die Tumorzell Lyse besitzen Um die Anwesenheit der verschiedenen rekombinanten Immunrezeptoren auf der T Zell Oberfl che nachzuweisen wurden CD3 T Zellen mit den unter schiedlichen Immunrezeptoren retroviral transduziert und die Expression der Re zeptoren unter Verwendung des F ab 2 anti human IgG Antik rpers und des anti human CD3 Antik rpers mittels Durchflusszytometrie analysiert Abbildung 4 8 52 Ergebnisse CD3 T Zellen Transduzierte vor Transduktion CD3 T Zellen IgG Zellsortierung Transduzierte Transduzierte CD3 CCR7 CD3 CCR7 IgG IgG 10 10 107 10 10 CCR7 Abbildung 4 7 CCR7 und CCR7 T Zellen werden mit gleicher Effizienz transduziert und expri mieren die rekombinanten Immunrezeptoren auch nach der Zell Trennung Isolierte CD3 T Zellen wurden zun chst zur Expression des Immu
88. keinerlei zytotoxische Funktion aus b ten 99 Diskussion Neben der lytischen Funktion zeichnen sich CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen durch eine erh hte IFN y Sekretion aus Dies stimmt mit Beobachtungen von Sallusto et al 1999b und Appay et al 2008 berein die von einer erh hten IFN y Pro duktion durch T Zellen in sp teren Differenzierungsstadien berichteten IFN y wirkt durch die Aktivierung von Makrophagen in physiologischen Immunantworten anti viral immunregulatorisch oder antitumoral Schroder et al 2004 Da IFN y eine essentielle Rolle in endogenen anti Tumor Mechanismen spielt Kaplan et al 1998 Shankaran et al 2001 erwarten wir dass die erh hte IFN y Sektretion von adop tiv transferierten CCR7 T Zellen am Tumor unter anderem durch die Aktivierung von Mechanismen der angeborenen Immunantwort zur anti Tumor Antwort bei tr gt Eine weitere Anforderung an Effektorzellen in der adoptiven Immuntherapie mit re kombinanten Immunrezeptoren ist die F higkeit der Zellen den inhibitorischen Ein fl ssen der Tumorumgebung zu widerstehen Immunantworten am Tumor werden unter anderem durch regulatorische T Zellen T eg Shimizu et al 1999 oder inhi bitorische Zytokine wie IL 10 Mocellin et al 2005 und TGF Siegel und Massagu 2003 unterdr ckt welche ihre suppressive Wirkung durch unterschiedliche Mecha nismen aus ben Die Hemmung der T Zell Proliferation durch TGF kann durch d
89. klonaler Maus Antik rper Dako spezifisch f r humanes CD8 Klon DK25 monoklonaler Ratten Antik rper BD Biosciences spezifisch f r die Kette des humanen LFA 1 Klon 2D7 monoklonaler Maus Antik rper Miltenyi Biotec spezifisch fiir humanes CD25 Klon 4E3 monoklonaler Maus Antik rper Immunotech spezifisch fiir humanes CD27 Klon 1A4CD27 25 Material Anti human CD28 Anti human CD45RA Anti human CD45RO Anti human CD57 Anti human CD62L Anti human CD95 Anti human CD103 Anti human CD127 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes CD28 Klon CD28 2 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes CD45RA Klon ALB11 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes CD45RO Klon UCHLI monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes CD57 Klon 21330573 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes L Selektin Klon DREG56 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r humanes Fas Klon DX2 monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch f r humanes CD103 Klon Ber ACT8 monoklonaler Maus Antik rper spezifisch f r die humane IL 7Ra Kette Klon IL 7R M21 26 BD Biosciences Immunotech BD Biosciences Immunotools Immunotech BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences Material Anti human CD197 Anti human CD197 Anti human CEA Anti human CLA Anti human Granzym A Anti human Granzym B
90. ktion Antigen erfahrener Effektor T Zellen ist die Beseitigung infizierter Zel len und die Aktivierung von Makrophagen in Entz ndungsl sionen Die Migration in Einleitung CD8 T cells Naive Antigen experienced i H i i EM i Oy i t 1 1 i i i i Major CD8 T cell subsets CCR7 CCR7 CCR7 CCR7 CCRT and their defining phenotype CD45RA CD45RA CD45RA CD45RA CD45RA CD27 i CD27 CD27 CD27 i CD27 CD28 i CD28 CD28 CD28 CD28 Telomere lenght h I I t KLRG 1 High CD45RA 2 a Receptors associated with activation co stimulation 2 regulation and homeostasis of T cells 5 amp X Low z High 2 2 Receptors associated with homing potential Q chemotaxis and adhesion 2 T x Low Granzyme B S High Granzyme A D IFNy Molecules associated D with functional capacities S cytotoxins without stimulation a cytokines upon stimulation 3 N TNFa a Granzyme K 1 1 Low i n i i i IL 2 t t 1 i Abbildung 1 2 Ph notypische Zusammenh nge der CD8 T Zell Subpopuolationen und deren funktionale Attribute Entwicklung der CD8 Zellen und ihre Expression von Oberfl chenrezeptoren Zytokinen und Effektormolek len Aus Appay et al 2008 Einleitung diese L sionen wird durch Homing Rezeptoren deren Expression zur Wanderung der Zellen in periphere Gewebe f hrt vermittelt Zu diesen Rezeptoren
91. l als CCR7 T Zellen a N es a ok ea ee 62 4 2 CCR7 T Zellen sind in vitro zytolytisch aktiver als CCR7 T Zellen 65 4 2 1 Aktivierung von CD3 CCR7 T Zellen in vitro 65 4 2 2 Spezifit t der durch CCR7 T Zellen vermittelten Zytotoxizit t 65 4 2 3 Aktivierung von CD4 CCR7 T Zellen in vitro 67 4 3 Die hohe Apoptosefrequenz der CCR7 T Zellen kann unterdr ckt werden 69 4 3 1 IL 7 und IL 15 erh hen die Viabilit t CCR7 T Zellen 69 4 3 2 CD28 OX40 Kostimulation sch tzt CCR7 T Zellen vor Apoptose 72 4 4 In vitro Generierung von CCR7 T Zellen 2 22 220 75 4 4 1 Proliferation f rdert die Entstehung von CCR7 T Zellen 77 4 4 2 CCR7 T Zellen verlieren CCR7 durch Proliferation 80 4 4 3 IL 2 anti CD3 Stimulation induziert mehr CCR7 T Zellen als anti CD3 anti CD28 Stimulation 82 4 4 4 Durch Proliferation in vitro generierte CCR7 T Zellen entspre chen isolierten CCR7 T Zellen in Zytokin und Effektormolek l Expression ER a ae ee rn Gk Se Re ae 84 4 5 CD28 OX40 kostimulierte CCR7 T Zellen sind bessere anti Tumor Ef Tektoren In ViVo SEE ERLITT FEN EEE EN 85 4 5 1 In vivo weisen CCR7 T Zellen mit CD28 OX40 Kostimulation bessere anti Tumor Aktivit t auf als CCR7 T Zellen 85 4 5 2 CCR7 T Zellen ben tigen die kombinierte CD28 CD3C OX40 Stimulation f r ihre anti Tumor Effektivit t in vivo 90 4
92. l mit eiskaltem PBS gewaschen Die Zellen wurden mit einem Antik rper spezifisch f r die zu detektierenden Oberfl chenmarker nach Herstellerangaben versetzt und 30 min im K hlschrank inkubiert Danach wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewa schen Falls es sich bei dem bereits verwendeten Antik rper um einen Fluorochrom gekoppelten Antik rper handelte wurden die Zellen anschlie end in 400 ul PBS auf genommen und Fluoreszenzen durchflusszytometrisch gemessen Ansonsten wurden die Zellen mit einem sekund ren Antik rper spezifisch f r den verwendeten prim ren Antik rper versetzt und 30 min im K hlschrank inkubiert Es erfolgten zwei weitere Waschschritte mit eiskalten PBS Aufnahme der Zellen in 400 ul PBS und die durch flusszytometrische Analyse der Fluoreszenzen 3 4 2 Detektion intrazellul rer Marker Vor intrazellul rer F rbung von Zytokinen wurden Lymphozyten zun chst mit 20ng ml PMA und 500 ng ml Ionomycin Sigma Aldrich M nchen Deutschland zur Stimulation der Zytokin Produktion behandelt Zur Blockierung von Transport Prozessen w hrend der T Zell Aktivierung und zur Akkumulation von Zytokinen wur 40 Methoden den die Zellen f r 4 24 h unter Einfluss von Brefeldin A 1 1000 verd nnt BioLegend San Diego USA kultiviert In einem Polystyrol FACS R hrchen wurden 1 5x10 Zellen zun chst zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen Falls zus tzlich zu den intrazellul ren Markern auch Ober
93. lich engl Fluorescence Activated Cell Sorting engl Fetal Calf Serum Fluorescein Isothiocyanat Hodgkin Reed Sternberg Interferon Immunglobulin Interleukin Kilo Dalton Luria Bertani engl Magnetic Activated Cell Sorting mitogenaktivierte Proteinkinase engl Mean Fluorescence Intensity engl Major Histocompatibility Complex 20 mM N Morpholino Propansulfons ure 5 mM Na Acetat 1 mM EDTA pH 7 optische Dichte engl Peripheral Blood Mononuclear Cell Phosphat gepufferte Saline engl Polymerase Chain Reaction Phycoerythrin Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid Phorbol 12 myristat 13 acetat Peroxidase Raumtemperatur 107 Diskussion scFv SLC TAA TAE TCR TGF TIL TNF TNFR Tris HCl UN XTT engl Single Chain Fragment Variable Region engl Secondary Lymphoid Tissue Chemokine Tumor assoziiertes Antigen Tris HCl Acetat EDTA Puffer engl T Cell Receptor engl Transforming Growth Factor Tumor infiltrierender Lymphozyt Tumor Nekrose Faktor Tumor Nekrose Faktor Rezeptor Tris Hydroxymethyl Aminomethan Hydrochlorid tiber Nacht Natrium 3 1 Phenylamino Karbony l 3 4 Tetrazolium bis 4 Methoxy 6 Nitro Benzensulfons urehydrat 108 Literaturverzeichnis Aandahl E M Sandberg J K Beckerman K P Tasken K Moretto W J Nixon D F CD7 is a differentiation marker that identifies multiple CD8 T cell effector subsets J Immunol 170 5 2349 55 2003 Abken H
94. ls from colo rectal cancer patients against their tumour cells Gut 55 8 1156 64 2006 Hombach A Schneider C Sent D Koch D Willemsen R A Diehl V Kruis W Bolhuis R L Pohl C Abken H An entirely humanized CD3 zeta chain signaling receptor that directs peripheral blood t cells to specific lysis of carcinoembryonic antigen positive tumor cells Int J Cancer 88 1 115 20 2000 Hombach A Wieczarkowiecz A Marquardt T Heuser C Usai L Pohl C Seliger B Abken H Tumor specific T cell activation by recombinant immunoreceptors CD3 zeta signaling and CD28 costimulation are simultaneously required for efficient IL 2 secretion and can be integrated into one combined CD28 CD3 zeta signaling receptor molecule J Immunol 167 11 6123 31 2001 Jember A G Zuberi R Liu ET Croft M Development of allergic inflammation in a murine model of asthma is dependent on the costimulatory receptor OX40 J Exp Med 193 3 387 392 2001 Kaltoft K Bisballe S Dyrberg T Boel E Rasmussen PB Thestrup Pedersen K Establishment of two continuous T cell strains from a single plaque of a patient with mycosis fungoides In Vitro Cell Dev Biol 28A 3 Pt 1 161 167 1992 Kanzler H Hansmann M L Kapp U Wolf J Diehl V Rajewsky K K ppers R Molecular single cell analysis demonstrates the derivation of a peripheral blood derived cell line L1236 from the Hodgkin Reed Sternberg cells of a Ho
95. lseparation am autoMACSTM Ger t Die Reinheiten der erhalte nen Rezeptor tragenden Fraktionen betrugen gt 95 Die angereicherten Rezeptor tragenden Zellen wurden mit dem immobilisiertem anti idiotypischem Antik rper BW2064 36 spezifisch f r das CEA scFv stimuliert Zellen die mit immobilisiertem Antik rper irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps inkubiert wurden dienten als Kon trolle Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit dem anti CCR7 IgM Antik rper dem anti murin IgM Sekund rantik rper und mit dem anti Bcl 2 Antik rper gef rbt und durchflusszytometrisch analysiert CCR7 und CCR7 T Zellen exprimierten nach Stimulation durch den CD28 CD3Z OX40 Rezeptor 975 signifikant mehr Bcl 2 als ohne Stimulation CCR7 und CCR7 T Zellen die den gleichen Immunrezeptor exprimierten wiesen keinen Unterschied in der Bcl 2 Expression auf Insgesamt zeigten die Untersuchungen dass die Apoptoserate CCR7 T Zellen durch die kombinierte CD28 OX40 Kostimulation vermindert werden kann was unter ande rem durch eine erh hte Bcl 2 Expression begr ndet ist 4 4 In vitro Generierung von CCR7 T Zellen Rezeptor tragende CCR7 T Zellen lysieren Antigen positive Tumorzellen besser als CCR7 Rezeptor tragende T Zellen Allerdings ist die Rezeptor vermittelte Zytotoxi zit t der beiden Subpopulationen schw cher als die der ungetrennte Gesamtpopula tion Um zu untersuchen ob Zellen durch die Trennung hinsichtlich der CCR7 Expres sion in
96. m signifikant gr er in CD8 CCR7 Zellen als in CD8 CCR7 Zellen nicht abgebildet Zur Ermittlung der Effektormolek l Expression von aktivierten T Zellen wurden frisch isolierte PBMCs f r 4 Tage in Gegenwart von IL 2 1000 U ml OKT3 Antik rper 100 ng ml und 15E8 Antik rper 10 ng ml kultiviert und anschlie end der gleichen F rbeprozedur wie die unstimulierten Zellen unterzogen Ein deutlich gr erer Anteil der stimulierten CCR7 T Zellen beinhaltete deutlich mehr Perforin und Granzyme als stimulierte CCR7 T Zellen nicht abgebildet Hier wurde gezeigt dass CCR7 T Zellen gr ere Mengen der Effektormolek le Perfo rin Granzym A und Granzym B exprimieren als CCR7 T Zellen 63 Ergebnisse CD4 T Zellen CD8 T Zellen 100 100 p 0 09 0 001 80 80 60 60 Perforin 40 40 20 20 0 a A aaa 0 T T A T 1 Br 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 100 100 x p 0 22 p 0 002 c 80 4 80 oO gt 60 60 G A N 40 a ranzym gt 5 20 20 3 0 T J T T T T A 1 0 T T T T I T 1 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 100 100 p 0 02 p 0 0003 80 80 60 60 40 ai Granzym B 20 20 f 0 A T ZA T z T A T ZA T A 1 0 T T T T T 1 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Spender 1 6 Spender 1 6 O CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen Abbildung 4 14 Mehr CCR7 T Zellen exprimieren Effektormolek le als CCR7 T Zellen PBMCs aus frischem Blut von 6 verschiedenen gesunden Spendern wurden isoliert und je
97. n nung als Dot Plots abgebildet B zeigt den Anteil der Annexin V und PI positiven Zellen in Abh ngigkeit von der Zeit 50 Ergebnisse CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen 405 490nm OD OD 495 490nm to IL 2 U ml OR pg ml Abbildung 4 6 Ermittlung der optimalen Stimulation zur Induktion der Proliferation von CCR7 und CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wurden zun chst in die CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen getrennt und je 2 5x 104 Zellen Well auf eine 96 Well Mikrotiterplatte aufgetragen Nach Zugabe von IL 2 und OKT3 Antik rper oder den Antik rpern OKT3 und 15E8 IL 2 0 500 U ml OKT3 AK und 15E8 AK je 0 10 ug ml wurden die Ans tze f r 4 Tage kultiviert Die Zellen wurden 6h unter Zugabe von BrdU inkubiert Der Einbau von BrdU wurde anschlie end mittels ELISA bestimmt Die Messung der Absorption erfolgte bei OD405 490 nm 51 Ergebnisse 4 1 3 Expression von Immunrezeptoren auf CCR7 und CCR7 T Zellen CD3 T Zellen wurden zun chst retroviral zur Expression des rekombinanten Im munrezeptors BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert und anschlie end CCR7 und CCR7 T Zellen durch magnetische Zellseparation isoliert T Zellen die den Im munrezeptor exprimierten wurden mit Hilfe der F rbung durch den F ab 2 anti human IgG Antik rper mittels Durchflusszytometrie identifiziert Gleichzeitig wurde die CCR7 Expression durch F rbung mit dem anti human CCR7 IgM Anti
98. n was die Persistenz von Effektorzellen mit m glichst gro em zytolytischen Potenzial am Tumorort erfor dert Diese Arbeit befasst sich mit der Hypothese dass das Chemokin gesteuerte migra torische Verhalten von T Zellen einen wesentlichen Einfluss auf die Effektivit t einer anti Tumor Antwort mit adoptiv transferierten T Zellen nimmt In diesem Zusammen hang sollte untersucht werden ob sich die mit der Abwesenheit des CC Chemokin Rezeptors 7 CCR7 auf der Zelloberfl che einhergehenden Eigenschaften einer T Zell Subpopulation auf die anti Tumor Effektivit t auswirken F r die Verwendung von CCR7 T Zellen spricht dass sie nicht aus dem Gewebe aus wandern k nnen wodurch eine Akkumulation dieser Zellen am Tumorort beg nstigt ist Die Subpopulation der CCR7 T Zellen schlie t sp te Effektor T Zellen Effektor Ged chtnis T Zellen sowie enddifferenzierte T Zellen Tgmra ein Diese Populatio nen verf gen ber Homing Rezeptoren f r die Peripherie wo der Tumor lokalisiert ist sowie ber verschiedene Effektormechanismen die eine unmittelbare Immunant wort bewirken k nnen Dabei stellt sich das Problem dass ltere und differenziertere T Zellen zwar durch ein hohes zytolytisches Potenzial in vitro jedoch auch durch repli kative Seneszenz und erh hte Anf lligkeit f r AICD gekennzeichnet sind und daher als ungeeignet f r in vivo Applikationen betrachtet werden Um CCR7 T Zellen auf ihre Eignung als Effektorpopulation
99. n IL 10 Biotin monoklonaler Maus Antik rper spezifisch fiir humanes Interferon y Klon 4S B3 Biotin gekoppelt monoklonaler Kaninchen Antik rper spezifisch fiir humanes Interleukin 2 Klon B33 2 Biotin gekoppelt monoklonaler Ratten Antik rper spezifisch fiir humanes Interleukin 10 Klon JES3 12G8 Biotin gekoppelt BD Biosciences Biosource BD Biosciences 28 Material Sekund re AK Fluorochrom gelabelt Eigenschaften Klon Hersteller FITC konjugierter Anti Maus IgM APC konjugierter Anti Maus IgM polyklonaler Ziegen Antik rper spezifisch f r murines IgM polyklonaler Ziegen Antik rper spezifisch f r murines IgM Beckmann Coulter Company Southern Biotech Spezifit t Spezies Isotyp Klon Hersteller Anti KLH Maus IgG K Klon MOPC 21 BD Biosciences Biolegend Anti KLH Maus IgG Klon 15H6 Southern Biotech Anti KLH Maus IgGoa K Klon X39 BD Biosciences Anti KLH Maus IgGop Klon 133303 R amp D Systems Anti KLH Maus IgM k Klon G155 228 BD Biosciences Anti KLH Ratte IgG2a Klon RTK2758 Biolegend Anti KLH Ratte IgGoa Klon 54447 R amp D Systems Ancell Bayport Minnesota USA Beckmann Coulter Company Marseille Frankreich BD Biosciences Heidelberg Deutschland BioLegend San Diego USA Biosource Ca marillo USA Dako Glostrup D nemark Immunotech Marseille Frankreich Immu notools Friesoythe Deutschland Miltenyi Biotec Bergisc
100. n transduzierten ungetrennten T Zellen von CCR7 T Zellen x von CCR7 T Zellen 4 und von in urspr nglichem Verh ltnis wiedervereinigten CCR7 und CCR7 T Zellen U jeweils mit CEA LS174T Zellen oder CEAT Colo320 Zellen 48h auf ei ner 96 Well Mikrotiterplatte Schein transduzierte T Zellen dienten als Kontrolle Es wurden bei 1 25x 10 bis 1x 10 Effektorzellen Well konstant 2 5x 10 Tumorzellen Well eingesetzt Die IFN y Konzentration im berstand wurde mittels ELISA bestimmt Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen w o ohne without Immunrezeptor 78 Ergebnisse 60 40 20 CCR7 T Zellen 50 100 150 200 250 oO IL 2 OKT3 AK IL 2 OKT3 AK 15E8 AK IL 7 OKT3 AK IL 7 OKT3 AK 15E8 AK 15 gt gt Oo 10 4 Gesamizellzahl x 107 0 T T T T 1 50 100 150 200 250 oO Zeit h Abbildung 4 23 Das CCR7 Expressionsprofil ndert sich in einer Population proliferierender T Zellen Je 1x10 CD3 T Zellen wurden in 20 ml RPMI 1640 Medium unter Zugabe von entwe der IL 2 400 U ml OKT3 AK 100 ng ml 15E8 AK 10 ng ml A oder IL 2 OKT3 AK oder IL 7 10 ng ml OKT3 AK 15E8 AK 4 oder IL 7 OKT3 AK 10 Tage inkubiert Die Zellen wurden gez hlt sowie die CCR7 Expression mittels Durchflusszytometrie bestimmt 79 Ergebnisse 4 4 2 CCR7 T Zellen verlieren CCR7 Oberfl chenexpression durch Proliferation Der An
101. n vorsichtig abgenommen und die Transduktionsrate wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt Hierf r wurde der Antik rper spezifisch f r den Fc Teil des Rezeptors F ab 2 anti human IgG Southern Biotech Birmingham Alabama USA und fiir CD3 anti human CD3 Dako Glostrup Danemark sowie Propidium Iodid 20 ug ml Roth Karlsruhe Deutschland zur Detektion lebender Zellen ver wendet 38 Methoden 3 3 9 XTT basierter Viabili tstest T Zellen mit oder ohne rekombinante Immunrezeptoren wurden in einem Volumen von 100 ul Well in vier Verd nnungsstufen jeweils im Dreifachansatz auf eine Mi krotiterplatte mit 96 Rundboden Wells pipettiert Anschlie end wurden Zielzel len ebenfalls in einem Volumen von 100 ul Well dazugegeben Das Verh ltnis von Effektor zu Zielzellen wurde meist in den Schritten 1 2 5 1 5 1 10 1 20 gew hlt Die gemeinsame Inkubation von Effektor und Zielzellen bei 37 C und 5 CO erfolgte f r 48 h Es wurden dann 150 ul berstand Well abgenommen und bei 20 C f r Fol geversuche gelagert Zu den verbliebenen 50 ul der Ans tze wurde 100 ul XTT Reagenz Endkonzentration 0 3 mg ml XTT Salz Roche Diagnostics Basel CH gel st in RP MI 1640 Medium gegeben und nach 30 60 und 90 min die Absorption bei OD450 650nm bestimmt Lebende Zellen metabolisieren das in L sung hellrote Tetrazolium Salz XTT zu dunkelrotem Formazan Der Anteil lebender Zielzellen wurde durch Einsetz
102. na A Haines K M Heitjan D F Albelda S M Carroll R G Riley J L Pastan I June C H Control of large established tumor xenografts with ge netically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains Proc Natl Acad Sci U S A 106 9 3360 3365 2009 Champagne P Ogg G S King A S Knabenhans C Ellefsen K Nobile M Appay V Rizzardi G P Fleury S Lipp M F rster R Rowland Jones S S kaly R P McMichael A J Pantaleo G Skewed maturation of memory HIV specific CD8 T lymphocytes Nature 410 6824 106 111 2001 Chen H W Liao C H Ying C Chang C J Lin C M Ex vivo expansion of dendritic cell activated antigen specific CD4 T cells with anti CD3 CD28 interleukin 7 and interleukin 15 potential for adoptive T cell immunotherapy Clin Immunol 119 1 21 31 2006 110 Literaturverzeichnis Coligan J Kruisbeek A Margulies D Current Protocols in Immunology Wiley Interscience New York 1995 Corbett T H Griswold D P Roberts B J Peckham J C Schabel EM Tumor induc tion relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays with a note on carcinogen structure Cancer Res 35 9 2434 2439 1975 Cyster J G Chemokines and cell migration in secondary lymphoid organs Science 286 5447 2098 2102 1999 Debes G F Arnold C N Young A J Krautwald S Lipp M Hay J B Butcher E C Chemokine r
103. nd CCR7 T Zell Subpopulationen lie e sich experimentell mit Hilfe eines Mausmodells untersuchen Hierf r m ssten T Lymphozyten konstitutiv CCR7 exprimierender CCR7 und CCR7 defizienter CCR7 Mausst mme mit Splenozyten aus Wildtyp M usen bez glich ihrer anti Tumor Effektivit t in einer Wildtyp Maus verglichen werden In diesem Zusammen hang m sste zun chst untersucht werden ob die Splenozyten dieser hinsichtlich der CCR7 Expression auf T Zellen ver nderten M use den in dieser Arbeit beschriebenen CCR7 und CCR7 Subpopulationen auch in weiteren Eigenschaften entsprechen In diesem Zusammenhang m ssten insbesondere die Homing sowie zytolytischen Ei genschaften dieser Zellen gepr ft werden Ein weiterer Vorteil des reinen Mausmo dells w re zudem ein authentischeres Homing Verhalten von systemisch injizierten T Zellen in muriner Umgebung Da die Trennung von T Zellen hinsichtlich ihrer CCR7 Expression mittels magnetischer Zellseparation die Zellen sch digt wurde untersucht auf welche Art CCR7 T Zellen generiert werden k nnen Lang anhaltende Proliferation CCR7 T Zellen f hrt zur Ent stehung von CCR7 T Zellen Da die durch Proliferation entstandenen CCR7 den iso lierten CCR7 T Zellen in wichtigen Effektoreigenschaften entsprechen kann die Se paration zur Gewinnung der Zellen f r therapeutische Anwendungen vermieden wer den In unseren Untersuchungen zur Effektivit t getrennter CCR7 und CCR7 T Zellen wur
104. netischer Separation aus PBMCs iso liert Zum einen wurde das CD3 Isolation Kit Miltenyi Biotech Bergisch Gladbach Deutschland verwendet bei dem die T Zellen direkt markiert werden Zum anderen wurde falls die Kopplung der gew nschten Zellen an magnetische Beads f r nachfol gende Versuche unerw nscht war oder die Zellen erneut separiert werden sollten das PanTCelllsolation Kit II Miltenyi Biotech Bergisch Gladbach Deutschland ver wendet das eine negative Selektion der CD3 T Zellen erm glicht Hierf r kommen MicroBead gekoppelte Antik rper zum Einsatz die gegen Oberfl chenmolek le von unerw nschten Zellen gerichtet sind Die gew nschten Zellen werden somit isoliert ohne an die S ule gebunden zu werden bersicht ber die Programme des autoMACS Ger tes F r Trennungen am autoMACSTM Ger t wurden in Abh ngigkeit von den jeweiligen Anforderungen unterschiedliche Programme gew hlt Eine bersicht ber die ver schiedenen Separations Programme ist in Abbildung 3 1 dargestellt Die Rationale f r die Verwendung einzelner Programme ist an den gegebenen Stellen im Ergebnisteil erl utert 36 Methoden Goal Obtain a cell population Eliminate cell sub expressing a particular population s from your cell surface antigen cell sample to obtain Strategy Positive Selection Depletion Magnetically label the target cells Magnetically label cells other than Normal
105. nf EI CCR7 T Zell Subpopulation CD3 T Zellen am Abbildung 4 26 Durch Proliferation entstandene CCR7 T Zellen entsprechen isolierten CCR7 T Zellen in der IFN y und Effektormolek l Expression CD3 T Zellen wurden hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Reinheiten 98 und die Zellen 2h mit PMA 20 ng ml und lonomycin 500 ng ml inkubiert Nach Zugabe von Brefeldin A 1 1000 wurden die Zellen 6 h inkubiert Die Zellen wurden mit dem anti CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 und dem Fluorochrom konjugierten Sekund ranti k rper anti murin IgM gef rbt unter Verwendung des BD Cytofix Cytoperm Fixation Permeabilisation Kit permeabilisiert und intrazellular mit Antik rpern spezifisch f r IL 2 Klon MQ1 17H12 IFN y Klon JES3 19F1 TNF amp Klon MAb11 Perforin Klon 5G9 Granzym A Klon CB9 oder GranzymB Klon GB11 gef rbt und anschlie end durchflusszytometrisch analysiert Ans tze mit Zellen die mit Anti k rpern irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps markiert wurden dienten als Kontrolle CCR7 T Zellen aus derselben Trennung sowie ungetrennte CD3 T Zellen wurden in Gegenwart von IL 2 400 U ml und dem anti CD3 Antik rper OKT3 100 ng ml kultiviert Der Anteil CCR7 T Zellen in der CCR7 T Zell Subpopulation betrug nach 10 t giger Stimulation 84 der in der CD3 T Zell Population 92 Die Expression der oben genannten Zytokine und Effektormolek le durch die kultivierten Zellen wurden untersucht Die Daten re
106. ngsprozess verbunden der die Zellen zu nehmend empf nglich f r den Aktivierungs induzierten Zelltod AICD sein l sst Al lerdings ist der Verlust von CCR7 w hrend der Entwicklung reversibel So k nnen sich beispielsweise murine CCR7 Trm Zellen nach Eliminierung des spezifischen Antigens in CCR7 Tcm Zellen umwandeln Wherry et al 2003 und die Stimulati on von Virus spezifischen CCR7 T Zellen mit Antigen in vitro induziert die Expres sion von CCR7 Champagne et al 2001 van Leeuwen et al 2002 Sallusto et al 1999a 1 7 Zielsetzung Adoptive Immuntherapie mit genetisch modifizierten T Zellen ist eine viel verspre chende Methode zur Bek mpfung metastasierender Tumore T Zellen werden hier f r ex vivo mit chim ren Immunrezeptoren spezifisch f r Tumor assoziierte Antigene versehen expandiert und in den Patienten reinfundiert In mehreren klinischen Stu dien unter Verwendung derartig genetisch modifizierter T Zellen wurde die Sicher 15 Einleitung heit des therapeutischen Konzepts dokumentiert Die Effektivit t der Immunthera pie ist jedoch durch mangelnde Persistenz der infundierten T Zellen eingeschr nkt W hrend die modulare Komposition chim rer Immunrezeptoren immer weiter op timiert wird ist bisher nur wenig ber die f r die Immuntherapie am besten ge eignete Effektorzellpopulation bekannt Systemisch applizierte Effektorzellen m ssen zum Tumorort migrieren und dort ihre Effektorfunktion ausf hre
107. nm gegen ddH20 als Leerwert gemessen Eine OD2 9 nm 1 entspricht bei einer Quarzk vette mit 1 cm Schichtdicke 50 ug ml doppelstr ngiger DNS Quantitative Konzentrationsbestimmung Alternativ konnte die DNS Konzentration durch Gelelektrophorese abgesch tzt wer den Hierf r wurden unterschiedliche Volumina kommerziell erh ltlicher Standards mit bekannten DNS Konzentrationen MassRuler DNA Ladder Low Range oder 33 Methoden MassRuler DNA Ladder High Range Fermentas St Leon Rot neben der zu tes tenden Probe auf ein 1 w v Agarosegel aufgetragen Der quantitative Vergleich er folgte nach Aufnahme der Signale mittels eines UV Transilluminators bei 254 nm Zir kul re DNS Molek le wurden vor der Gelelektorphorese mittels Restriktion lineari siert 3 2 4 Restriktion von DNS Die Identifizierung von Plasmiden geschah mittels Restriktionen Es wurden die Angaben der Hersteller der verwendeten Restriktionsenzyme Fermentas St Leon Rot Deutschland Roche Diagnostics Basel Schweiz ber cksichtigt Die Inkubation erfolgte falls vom Hersteller nicht anders vorgesehen f r 1h bei 37 C 3 3 Eukaryontische Zellkultur 3 3 1 Kultivierung eukaryontischer Zellen Alle Arbeiten mit eukaryontischen Zellen wurden in S1 oder S2 Labors unter sterilen Werkb nken mit S2 Standard durchgef hrt Medien Puffer und Zus tze wurden vor ih rer Verwendung gegebenenfalls autoklaviert oder sterilfiltriert und anschl
108. nol 161 12 6510 6517 1998 Grayson J M Zajac A J Altman J D Ahmed R Cutting edge increased expression of Bcl 2 in antigen specific memory CD8 T cells J Immunol 164 8 3950 3954 2000 Greenwald R J Freeman G J Sharpe A H The B7 family revisited Annu Rev Im munol 23 515 548 2005 Gunn M D Kyuwa S Tam C Kakiuchi T Matsuzawa A Williams L T Nakano H Mice lacking expression of secondary lymphoid organ chemokine have defects in lymphocyte homing and dendritic cell localization J Exp Med 189 3 451 460 1999 Hamann D Baars P A Rep M H Hooibrink B Kerkhof Garde S R Klein M R van Lier R A Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8 T cells J Exp Med 186 9 1407 1418 1997 112 Literaturverzeichnis Hanahan D Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol 166 4 557 580 1983 Harari A Rizzardi G P Ellefsen K Ciuffreda D Champagne P Bart P A Kauf mann D Telenti A Sahli R Tambussi G Kaiser L Lazzarin A Perrin L Pantaleo G Analysis of HIV 1 and CMV specific memory CD4 T cell responses during primary and chronic infection Blood 100 4 1381 1387 2002 Hombach A Schlimper C Sievers E Frank S Schild H H Sauerbruch T Schmidt Wolf I G Abken H A recombinant anti carcinoembryonic antigen im munoreceptor with combined CD3zeta CD28 signalling targets T cel
109. nrezeptors BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert und anschlie end in die CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen getrennt Je 2x 10 T Zellen wurden mit dem PE konjugierten F ab 2 anti human IgG Antik rper spezifisch f r den Fc Teil des Rezeptors sowie mit dem anti human CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 und dem FITC konjugierten sekund ren Antik rper anti murin IgM gef rbt und anschlie end durchflusszytometrisch analysiert Td Transduktion 53 Ergebnisse A 439 607 975 BW431 26 BW431 26 BW431 26 ln scFv scFv CD3 523 CD3 Abbildung 4 8 Expression von Immunrezeptoren auf T Zellen nach retroviralem Gentransfer Mit 400 U ml IL 2 und 100ng ml OKT3 Antik rper vorstimulierte CD3 T Zellen wurden mittels retroviralen Gentransfers mit Immunrezeptoren unterschiedlicher modularer Komposition in A sche matisch dargestellt ausgestattet Die Expression dieser Rezeptoren wurde durch F rbung mit PE konjugiertem F ab 2 anti human IgG Antik rper durchflusszytometrisch nachgewiesen Zur Identifizie rung der T Zellen wurde ein FITC konjugierter anti human CD3 Antik rper Klon UCHT 1 mitgef hrt Weiterhin wurde die Markierung mit Pl zum Ausschluss toter Zellen herangezogen nicht abgebildet Schein transduzierte T Zellen nt dienten als Kontrolle 54 Ergebnisse 4 1 4 Expression von Homing Rezeptoren auf CCR7 und CCR7 T Zellen Um das Homing Potenzial von CCR7 und CCR7 T Zellen zu untersuchen wur
110. nte Nakano et al 1998 deutlich Lymphknoten von CCR7 Tieren beinhalten weit weniger Zellen als solche von Wildtyp Tieren da das Homing in die T Zell Zonen der Lymphknoten gest rt ist Gunn etal 1999 Nakano et al 1998 Wei 14 Einleitung terhin weisen Lymphknoten von CCR77 Tieren eine gest rte Gewebearchitektur auf da ihnen die Kompartimentierung in B Zell Follikel und parakortikale T Zell Zonen fehlt Forster et al 1999 CCR7 ist durch die Koordination migratorischer Ereignis se auch wesentlich an der Kompartimentierung des Thymus beteiligt Ueno et al 2004 Misslitz et al 2006 2004 Kurobe et al 2006 Beide Mutanten weisen eine ver nderte Thymus Morphologie verminderte Thymozyten Zahlen sowie eine abnorme T Zell Entwicklung auf Misslitz et al 2004 Im Hinblick auf diese Ph notypen wer den zwei Hauptfunktionen von CCR7 und seinen Liganden deutlich Zum einen regu liert CCR7 das Homing Antigen pr sentierender Zellen und T Zellen in die sekund ren lymphatischen Organe Forster et al 1999 Gunn et al 1999 und zum anderen hat es Einfluss auf deren funktionale Organisation und Struktur Reif et al 2002 Ohl et al 2003 Mit steigendem Alter und Differenzierungsgrad stellen Effektor T Lymphozyten die CCR7 Expression ein wodurch sie nicht mehr in sekund re lymphatische Gewebe sondern bevorzugt in die K rperperipherie wandern Damit ist sowohl der Erwerb zytolytischen Potenzials als auch ein Alteru
111. o 9 Too o TOF To CCR7 FI CCR7 FI Abbildung 4 3 Schema der Trennung von T Zellen hinsichtlich ihrer CCR7 Expression Mit tels negativer Selektion isolierte CD3 T Zellen wurden mit dem murinen anti human CCR7 IgM An tik rper Klon 2H4 20 ul 1x107 T Zellen gef rbt und anschlie end mit anti murin IgM Beads 30 ul 1x107 T Zellen magnetisch markiert Die erste autoMACS Trennung erfolgte mit dem Programm Deplete 025 Die magnetisch markierte Fraktion wurde anschlie end mit dem Programm Possel gereinigt Dargestellt sind Histogramme der CCR7 Expression der jeweiligen Zellpopulationen Fl Fluoreszenz Intensitat 47 Ergebnisse CCR7 T Zellen CCR7 _CD3 T Zellen 0 1023 FSC 103 MACS Trennung CCR7 102 10 10 0 1023 FSC CCR7 T Zellen CCR7 0 1023 Abbildung 4 4 Reinheit der getrennten CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen Die Expres sion von CCR7 auf frisch getrennten T Zellen wurde durch F rbung mit dem gegen murines IgM gerich teten Fluorescin gekoppelten Antik rper ermittelt Die Analyse erfolgte durchflusszytometrisch FSC forward scatter 48 Ergebnisse den alle weiteren Zell Trennungen mit Puffern ohne EDTA und ohne Azid durchge f hrt 4 1 2 Stimulation der Proliferation CCR7 und CCR7 T Zellen Um die optimalen Bedingungen zur Induktion der Proliferation CCR7 und CCR7 T Zellen zu ermitteln wurden die T Zell Subpopulationen zun chs
112. on von Schein transduzierten CCR7 und CCR7 T Zellen mit CEA C15A3 Tumorzel len dienten als weitere Kontrolle Das Tumorwachstum wurde 21 Tage beobachtet und Tiere mit Tumoren gt 500 mm euthanasiert In A ist die Gr e der Tumore der einzelnen M use abgebildet Die dicke Linie zeigt den Mittelwert Das mittlere Tumorvolumen der Gruppe von M usen denen CCR7_ Rezeptor tragenden T Zellen und CEAt Tumorzellen koinjiziert wurde war ab Tag 8 signifikant geringer als die Tumorgr en in allen anderen Gruppen Die mittleren Tumorvolumina der Gruppen sowie individuelle Tumorgr en an Tag 10 sind in B dargestellt p lt 0 05 T Test w o ohne without Immunrezeptor 89 Ergebnisse wurde auch in vitro analysiert Dazu wurden die T Zellen mit dem BW431 26scFv Fc CD28 CD3C OX40 975 Rezeptor 48 h mit den CEA C15A3 oder CEA MC38 Tumor zellen koinkubiert CCR7 T Zellen mit dem CEA spezifischen Immunrezeptor BW431 26scFv Fc CD28 CD3L OX40 975 lysierten CEA C15A3 Tumorzellen mit h herer Effizienz als Rezeptor tragende CCR7 T Zellen Die st rkere Aktivierung der CCR7 T Zellen wurde durch erh hte IFN y Sekretion von dieser Population best tigt CEA Tu morzellen wurden nicht lysiert was die Spezifit t des T Zell Angriffs demonstriert Als Kontrolle dienten Schein transduzierte CCR7 und CCR7 T Zellen bei denen weder Lyse der LS174T Zellen noch IFN y Sekretion festgestellt wurden Abbildung 4 29 4 5 2 CCR7 T Zellen
113. pe wurden 5x 10 CEA C15A3 Tumorzellen zu sammen mit 5x 10 CCR7 T Zellen mit BW431 26scFv Fc CD28 CD3 607 oder BW431 26scFv Fc CD28 CD3 OX40 975 Rezeptor subkutan koinjiziert Das Tumorwachstum wurde 18 Tage beob achtet und die Tumorgr e gemessen In A ist die Gr e der Tumore der einzelnen M use sowie der Mittelwert dicke Linie abgebildet Die Tumorgr e der einzelnen M use in den beiden Gruppen an Tag 9 ist in B dargestellt 92 Ergebnisse 4 5 3 CD28 0X40 kostimulierte CCR7 T Zellen wirken bei systemischer Applikation effektiver gegen einen etablierten Tumor als CCR7 T Zellen Subkutan koinjizierte Tumor und T Zellen spiegeln im Wesentlichen die in vitro Si tuation wider Deshalb wurden in einem weiteren Ansatz T Zellen mit Immunrezep tor in M use mit etabliertem Tumor intraven s appliziert um das therapeutische Po tenzial der beiden T Zell Subpopulationen zu untersuchen Da CCR7 T Zellen von der kombinierten OX40 CD28 Stimulation abh ngig sind wurde in diesem Versuch wieder der Rezeptor 975 eingesetzt der die entsprechenden Signalketten in sei nem intrazellul ren Bereich bereith lt NIH III M usen 7 Tiere Gruppe wurden sub kutan CEA C15A3 Tumorzellen injiziert Bei Erreichen eines Tumorvolumens von 20 40 mm wurden CCR7 oder CCR7 T Zellen mit dem CEA spezifischen Immun rezeptor BW431 26scFv Fc CD28 CD3C OX40 975 intraven s injiziert Als Kontrol le dienten M use denen Schein tran
114. pr sentieren eines von drei Experimenten 86 Ergebnisse nN gt nN gt Zellzahl Zellzahl 0 10 10 102 10 104 10 10 10 107 m CEA FI CEA FI Abbildung 4 27 Subklonierung von C15A3 Tumorzellen C15A3 Zellen wurden durch imiting dilution in Einzelklone getrennt und die CEA Expression mittels Durchflusszytometrie berpr ft Als dicke schwar ze Linie ist die Analyse von Zellen mittels des PE konjugierten anti CEA Antik rpers Klon B1 1 CD66 dargestellt Die grau hinterlegte Fl che stellt Zellen dar die mit einem Antik rper irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps markiert wurden In A ist ein Beispiel f r einen Klon mit einem geringen Anteil Zellen mit hoher CEA Expression abgebildet Klone mit hoher CEA Expression B wurden expandiert und f r nachfolgende Versuche verwendet Fl Fluoreszenz Intensitat transduzierte CCR7 oder CCR7 T Zellen zusammen mit CEA C15A3 Tumorzel len subkutan koinjiziert wurden Das Tumorwachstum wurde 21 Tage beobach tet M use die Antigen spezifische CCR7 T Zellen erhalten hatten entwickelten schnel ler und mit einer h heren Frequenz Tumore als M use denen Antigen spezifische CCR7 T Zellen injiziert wurden Dies best tigt die in vitro beobachtete potentere anti Tumor Aktivit t der CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen Die Zyto lyse der Tumore war spezifisch da CEA MC38 Tumorzellen weder durch anti CEA Rezeptor tragende CCR7 noch durch anti CE
115. ptive Immuntherapie zu untersuchen isolierten Berger et al 2008 CMV spezifische T Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Affen mit einer latenten CMV Infek tion Die Zellen wurden ex vivo expandiert und anschlie end reinjiziert Hierbei wurde gezeigt dass Effektor T Zellen die aus zentralen Ged chtnis T Zellen Tcm generiert wurden weitaus l nger in vivo persistierten als Effektor T Zellen die einer Effektor Ged chtis T Zell Population Tgm entstammten Die aus Tcy Zellen gewon nenen Effektor T Zellen waren im Gegensatz zu aus Tey Zellen gewonnenen Effektor T Zellen dar ber hinaus in der Lage ph notypische und funktionale Eigenschaften von Ged chtniszellen zur ckzuerlangen Da die Persistenz der T Zellen in vivo mit der anti Tumor Effektivit t korreliert Robbins et al 2004 legen diese Beobachtungen eine gr ere Effizienz von Tcm Zellen aufgrund ihrer gesteigerten Kapazit t zur in vi vo Persistenz nach adoptivem Transfer nahe Im Rahmen der Untersuchungen des in vivo Effektor Potenzials einzelner T Zell Subpopulationen wurde auch berichtet dass die Applikation naiver und fr her Effektor T Zellen die Beseitigung gro er etablierter Tumore zur Folge hatte w hrend weiter differenzierte T Zellen eine weniger effektive anti Tumor Antwort vermittelten Gattinoni et al 2005 Auf Grund der genannten Befunde bevorzugt man die Verwendung fr her Effektor 96 Diskussion T Zellen zentraler Ged chtnis T Zellen oder soga
116. pulationen f r nachfolgende Analysen gt 95 betragen sollte wurde das Trennverfahren optimiert 2 T Zellen wurden mit dem APC gekoppelten anti human CCR7 Antik rper Klon 150503 und anschlie end mit anti APC Beads markiert Die auto 45 Ergebnisse MACSTM Trennung erfolgte zun chst mit dem Programm Deplete05 Die durch die erste Trennung erhaltenen magnetisch markierten Zellen wurden ei ner weiteren Separation mit dem Programm Possel unterzogen Possel wird zur positiven Selektion magnetisch markierter Zellen mit mittlerer bis hoher Frequenz innerhalb der Gesamtpopulation angewendet Mit dieser Strategie wurden Reinheiten von etwa 85 f r die jeweiligen Subpopulationen erreicht 3 Schlie lich wurde der murine anti human CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 und Beads gegen murines IgM zur magnetischen Markierung verwendet Die Tren nung der so markierten Zellen mit den autoMACS Programmen Deplete 05 sowie Deplete 025 erbrachten eine Reinheit der CCR7 T Zell Population von gt 90 Die CCR7 Population wurde ohne weitere Markierung nochmals einer Trennung mit dem Programm Possel unterzogen um auch in dieser Frakti on eine Reinheit von gt 90 zu erzielen Der Versuchsablauf ist in Abbildung 4 3 schematisch dargestellt Durch Austitrieren der eingesetzten Mengen an Anti k rper 20 ul anti human CCR7 IgM Antik rper pro 1x10 CD3 Zellen und Beads 30 ul anti murin IgM Be
117. r naiver T Zellen alle mit CCR7 Ph notyp f r die adoptive Immuntherapie da man sich von diesen Zellen eine effizientere Tumorlyse verspricht Sp te T Zellen Effektor Ged chtnis T Zellen so wie enddifferenzierte T Zellen CCR7 Ph notyps werden aufgrund einer gesteiger ten Apoptoserate dieser Zellen sowie replikativer Seneszenz und damit einhergehend geringerer in vivo Persistenz nicht in Erw gung gezogen Gerade diese Zellen je doch zeichnen sich durch ein sehr hohes zytolytisches Potenzial in vitro aus Un terschiedliche T Zell Stadien sind auf verschiedene stimulatorische Signale angewie sen In den genannten Studien wurde die verwendete Stimulation nicht an die Er fordernisse von T Zell Stadien mit fortgeschrittener Differenzierung angepasst Wir stellten uns daher die Frage ob sp te T Zellen Effektor Ged chtnis T Zellen so wie enddifferenzierte T Zellen durch gezielte Stimulation nicht ebenfalls oder so gar besser zur Rezeptor vermittelten Tumorlyse geeignet sind als die aktuell bevor zugt verwendeten naiven T Zellen fr hen Effektor T Zellen und zentralen Ged chtnis T Zellen F r die Verwendung von in ihrer Differnzierung fortgeschrittenen CCR7 T Zellen spricht weiterhin das spezielle Migrationsverhalten dieser Zellen In zwei parallel ver ffentlichten Publikationen mit unterschiedlicher methodischer Vorgehensweise wur de befunden dass CCR7 ein kritischer Faktor f r die Auswanderung von T Zellen aus der Peripherie
118. rend CD28 ein kostimulatorisches Signal in der fr hen T Zell Aktivierung liefert ist OX40 an der Kostimulation spaterer T Zell Differenzierungsstadien beteiligt Der OX40 Rezeptor ein Mitglied der TNFR Superfamilie vermittelt bei Bindung an den OX40 Liganden ein kostimulatorisches Signal welches die Zytokin Produktion stei gert Baum et al 1994 das Uberleben von Zellen durch Induktion der Expression von Bcl 2 und Bcl xL f rdert Rogers et al 2001 die klonale Expansion naiver CD4 11 Einleitung T Zellen induziert Gramaglia et al 1998 und Ged chtniszellen durch die F rderung des berlebens von Effektor T Zellen generiert Maxwell et al 2000 OX40 Signalge bung ist ebenfalls unerl sslich f r die Expansion von Ged chtnis T Zellen in sekun d ren Immunantworten und bei der Verl ngerung ihres berlebens Jember et al 2001 Finney et al 2004 zeigten dass im Vergleich verschiedener kostimulatorischer Signaldom nen in Kombination mit der CD3 Signalkette in einem Immunrezeptor die CD28 Signaldom ne ruhende T Zellen besser aktivierte als zum Beispiel OX40 oder 4 1BB Um die zus tzlichen Vorteile der Stimulation durch Molek le die in sp teren T Zell Entwicklungsstadien relevant sind zu nutzen besteht die M glichkeit Immun rezeptoren mit den drei intrazellul ren Signalketten beispielsweise von CD28 CD3 und OX40 zu verwenden Immunrezeptoren mit lediglich der CD3 Kette als Signal gebender Dom ne wer
119. rennt Reinheiten gt 95 und 48h mit CEA LS174T Zellen oder CEA C010320 Zellen koinkubiert CCR7 T Zellen mit CEA spezifischem Immunrezeptor lysierten CEA Tumorzellen mit h herer Effizienz als Rezeptor tragende CCR7 T Zellen Die st rkere Aktivierung der CCR7 T Zellen wurde durch erh hte IFN y Sekretion best tigt Als Kontrolle dienten Schein transduzierte CCR7 und CCR7 T Zellen die weder LS174T Zellen lysierten noch IFN y sezernierten Abbildung 4 15 Dieser Versuch zeigt die effektivere Immunrezeptor vermittelte Aktivierung von CCR7 T Zellen im Vergleich zu CCR7 T Zellen 4 2 2 Spezifit t der durch CCR7 T Zellen vermittelten Zytotoxizit t Um die Spezifit t der Effektorfunktion CCR7 T Zellen zu berpr fen wurden T Zellen mit Rezeptoren gleicher Bauart ausgestattet die gegen zwei unterschiedliche Tumor assoziierte Antigene gerichtet sind CD3 T Zellen wurden zur Expression des anti CD30 Rezeptors HRS3 scFv Fc CD3 523 oder des analogen Rezeptors mit Spezifit t f r CEA BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert mittels magnetischer Zellsortierung in die CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen getrennt Reinheiten 65 Ergebnisse LS174T CEA Colo 320 CEA gt 100 100 80 80 a t 60 4 60 4 a a 2 40 40 gt 20 20 0 a B 1 20 1 10 15 1 25 1 20 1 10 15 125 06 0 6 0 4 0 4 Ti D S gt gt 02 02 LL 0 0 9 4 U u 0 0
120. rrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps gef rbt wurden dienten als Kontrolle Die Expression der Homing Rezeptoren auf den CCR7 und CCR7 T Zell Subpopulationen innerhalb der CD4 oder CD8 T Zell Populationen wurde durchflusszytometrisch analysiert Dargestellt sind die Mittelwerte der Homing Marker Expression auf den T Zellen der vier Spender Standardabweichungen p S0 05 T Test 56 Ergebnisse 4 1 5 Differenzierungsstatus von CCR7 und CCR7 T Zellen Um den Grad der Differenzierung von CCR7 und CCR7 T Zellen zu charakterisieren wurde die CD45RO Expression der unstimulierten und stimulierten Subpopulationen untersucht Hierf r wurden zun chst PBMCs aus frischem Blut isoliert und ein Teil der Zellen mit dem anti human CD3 Antik rper dem anti human CCR7 IgM Antik rper und dem Fluorochrom konjugierten anti murin IgM Sekund rantik rper sowie dem anti human CD45RO Antik rper gef rbt und die CD45RO Expression auf den CCR7 und CCR7 Subopulationen der CD3 T Zellen durchflusszytometrisch untersucht PBMCs aus dem selben Buffy Coat wurden f r 4 Tage unter Einfluss von immobi lisierten OKT3 und 15E8 Antik rpern kultiviert und anschlie end der gleichen Analyse der CD45RO Oberfl chenexpression unterzogen Innerhalb der unstimulierten CCR7 T Zell Population exprimierten 72 der Zellen CD45RO Damit wiesen in dieser Population 28 der Zellen den Ph notyp naiver T Zellen auf w hrend nach 4 Tagen Stimulation nur noch 2
121. s viel ver sprechende Ziele f r Immuntherapien F r die adoptive Immuntherapie mit genetisch ver nderten T Zellen werden die se mit rekombinanten T Zell Rezeptoren versehen die es den T Zellen erm gli chen definierte Tumor spezifische Antigene zu erkennen Rekombinante TCRs k n nen aus und Kette eines TCR oder alternativ aus einer Polypeptidkette mit Antigen bindender Dom ne und intrazellul rer Signaldom ne bestehen Immunre zeptor Solche Immunrezeptoren setzen sich aus einer Antik rper basierten Binde dom ne im extrazellul ren Bereich sowie einer aus dem TCR stammenden Signaldo m ne im intrazellul ren Bereich zusammen Intra und extrazellul re Dom nen sind durch ein Gelenkst ck mit Transmembrandom ne miteinander verbunden Abbil dung 1 1 Die bevorzugt verwendeten Bindedom nen sind TAA spezifische Einzelkettenfrag mente scFv welche die variablen Regionen von sowohl der schweren VH als auch der leichten Kette VL eines monoklonalen Antik rpers vereinigen Die bevor zugt verwendete Signaldom ne ist die aus T Zellen entnommene CD3Z Kette die gegebenenfalls mit zus tzlichen kostimulatorischen Signalketten beispielsweise aus CD28 OX40 oder 4 1BB kombiniert werden kann Eshhar 2008 Durch die Ausstat tung mit dieser Art von Rezeptor kann T Zellen Spezifit t f r jedes beliebige Anti gen verliehen werden sofern ein Antik rper verf gbar ist Im Gegensatz zum physio logischen TCR der ausschlie l
122. sduzierte CCR7 oder CCR7 T Zellen injiziert wurden Das Tumorvolumen wurde t glich gemessen Tumore von M usen die mit Rezeptor tragenden CCR7 T Zellen behandelt wurden wuchsen schneller als Tumore von M usen denen Rezeptor tragende CCR7 T Zellen injiziert wurden Abbildung 4 31 Dies best tigt die in Kapitel 4 5 1 bei subkutaner Koinjektion beobachtete potentere anti Tumor Aktivit t der CCR7 T Zellen im Ver gleich zu CCR7 T Zellen auch f r die systemische Gabe der T Zellen Tiere die mit Schein transduzierten CCR7 oder CCR7 T Zellen behandelt wurden zeigten st r keres Tumorwachstum als Tiere die Rezeptor tragenden CCR7 oder CCR7 T Zellen erhalten hatten Diese Beobachtungen demonstrieren dass CCR7 T Zellen unter CD28 OX40 Ko stimulation auch zur Zytolyse etablierter Tumore besser geeignet sind als CCR7 T Zellen Als Nebenwirkung der intraven sen Behandlung mit T Zellen traten Nekrosen bei vier von sieben M usen aus der mit Schein transduzierten CCR7 T Zellen behandelten Gruppe sowie bei drei von sieben M usen aus der mit 975 transduzierten CCR7 93 Ergebnisse T Zellen behandelten Gruppe auf Die Nekrosen entwickelten bis zu 1 cm gro e L sionen am hinteren R cken die bei allen M usen nach einigen Tagen abheilten Wei terhin wiesen je zwei von sieben M usen aus den eben genannten Gruppen sowie eine Maus aus der mit CCR7 T Zellen mit 975 Rezeptor behandelten Gruppe ne krotisches Ge
123. se von CCR7 T Zellen durch erh hte Expression von Bcl 2 Infolgedessen lysierten CD28 OX40 kostimulierte CCR7 T Zellen etablierte Tumore in vivo effektiver als CCR7 T Zellen Diese Ergebnisse machen deutlich dass im Gegensatz zu aktuellen Strategien der Einsatz CCR7 T Zellen f r die adoptive Immuntherapie zu besserer anti Tumor Ak tivit t in vivo f hrt vorausgesetzt dass die Effektorzellen durch CD28 CD3C OX40 sti muliert werden 105 Abk rzungsverzeichnis 7 AAD ABTS AS Bcl 2 bp BrdU BSA CCR CEA CH2 CH3 CLA CTL DC ddH20 ddNTP DMEM DMSO 7 Amino Actinomycin D 2 2 Azino bis 3 Ethylbenzthiazolin 6 Sulfons ure Antik rper engl Activation Induced Cell Death Ampicillin Allophycocyanin Aminos ure engl B cell lymphoma 2 Basenpaare 5 Brom 2 Desoxyuridin Rinderserumalbumin CC Chemokin Rezeptor engl Carcino Embryonic Antigen konstante Dom nen der schweren Kette human IgG engl Cutaneous Lymphocyte Antigen engl Cytotoxic T Lymphocyte engl Dentritic Cell doppelt destilliertes Wasser Didesoxynukleotid Triphosphat engl Dulbecco s modified Eagle Medium Dimethylsulfoxid 106 DNS dNTP EDTA EtOH ER FACS FCS FITC HRS IFN Ig IL LB MACS MAPK MFI MHC MOPS OD PBMC PBS PCR PE PI PMA POD RT Desoxyribonukleins ure Desoxynukleotid Triphosphat Ethylendiamintetraessigs ure Ethanol endoplasmatisches Retikulum Durchflusszytometrie eignent
124. stimmung mit verschiedenen Publikationen Mora und von Andrian 2006 Kunkel und Butcher 2002 Ward und Marelli Berg 2009 Sallusto et al 1999b in denen das Homing Potenzial naiver und fr her vs sp ter T Zellen beschrieben ist Im Hinblick auf das zytolytische Potenzial der beiden Subpopualtionen wurde gezeigt dass mehr CCR7 T Zellen sowohl der CD4 als auch der CD8 T Zell Population gr Bere Mengen der Effektormolek le Perforin GranzymA und Granzym B exprimierten als CCR7 T Zellen Diese Beobachtung steht in bereinstimmung damit dass sp te Effektor T Zellen sowie Effektor Ged chtnis T Zellen die durch die Abwesenheit von CCR7 auf der Oberfl che charakterisiert sind ber ein breiteres Spektrum sowie gr Rere Mengen zytolytischer Effektormolek le verf gen als CCR7 naive T Zellen und junge Effektor T Zellen sowie zentrale Ged chtnis T Zellen Appay et al 2008 Gatti noni et al 2005 Sallusto et al 1999b Das gr ere zytolytische Potenzial der CCR7 T Zellen wird durch die gr ere Zytotoxizit t gegen ber Tumorzellen in vitro wider gespiegelt Antigen spezifische CCR7 T Zellen lysierten Antigen positive Tumorzel len mit sehr viel gr erer Effizienz als CCR7 T Zellen Die durch den Immunrezeptor vermittelte Tumorzelllyse durch CCR7 T Zellen ist Antigen spezifisch da Rezeptor tragende CCR7 T Zellen Antigen negative Tumorzellen nicht lysierten und Schein transduzierte CCR7 T Zellen ohne Rezeptor
125. sweise die Tyrosin Kinase Inhibitoren wie Imatinib und Gefi tinib oder monoklonale Antik rper wie Trastuzumab oder Rituximab Angiogenese Inhibitoren sowie Hormone Immuntherapien stellen einen weiteren Ansatz zur Be k mpfung maligner Tumor erkrankungen dar Sie umfassen ein Repertoire an thera peutischen Strategien um das Immunsystem des Patienten zur Tumoreliminierung zu aktivieren Einleitung 1 1 Adoptive Immuntherapie und die Struktur von rekombinanten Immunrezeptoren Immuntherapien gegen Krebserkrankungen zielen darauf ab effektive Immunantwor ten zur Erkennung und Eliminierung von Tumoren zu erzeugen und zeichnen sich im Gegensatz zu den konventionellen Therapien durch eine Antigen spezifische anti Tumor Reaktion aus Die Wirksamkeit von Immuntherapien unter Verwendung monoklonaler Antik rper beruht auf deren physiologischer Eigenschaft eine zytotoxische Immunreaktion bei spielsweise durch Komplement Aktivierung zu erzeugen Diese Aktivit t kann durch die Kopplung der Antik rper an zytotoxische Substanzen verst rkt werden Der Ein satz monoklonaler Antik rper in vivo ist allerdings durch eine geringe Halbwertszeit unzureichende Gewebepenetration sowie Reaktivit t mit gesundem Gewebe limitiert Pavoni et al 2006 T Lymphozyten k nnen im Gegensatz zu Antik rpern Gewebe aktiv penetrieren Yaz di et al 2006 und sind daher zu einer effektiven und gezielten anti Tumor Reaktion in der Lage Rosenberg 1996
126. t aus frisch ge wonnenen CD3 T Zellen isoliert Die Zellen wurden auf einer 96 Well Mikrotiter platte in Gegenwart von IL 2 0 500 U ml und dem anti CD3 agonistischen Anti k rper OKT3 0 10 ug ml oder mit OKT3 und dem anti CD28 agonistischen An tik rper 15E8 jeweils 0 10 ug ml 4 Tage kultiviert Anschlie end wurde die Pro liferation der Zellen durch den Einbau von BrdU w hrend der Zellteilung gemes sen Stimulation durch die anti CD3 und anti CD28 agonistischen Antik rper OKT3 und 15E8 induzierte einen st rkeren Einbau von BrdU und regte damit beide T Zell Subfraktionen effektiver zur Proliferation an als die Stimulation durch IL 2 und anti CD3 Antik rper IL 2 vermochte auch in einer Konzentration von 1000 U ml nicht die Proliferation zu verst rken nicht abgebildet CCR7 T Zellen wurden durch 500 U ml IL 2 und 1 ug ml OKT3 oder alternativ durch 100 ng ml OKT3 und 10 ug ml 15E8 maximal stimuliert CCR7 T Zellen proliferierten am st rksten in Gegenwart von 500 U ml IL 2 und 1 ug ml OKT3 oder 10 ng ml OKT3 und 10 ug ml 15E8 Abbildung 4 6 Da CCR7 T Zellen unter Stimulation mit den oben genannten Bedingungen sehr schnell in den Aktivierungs induzierten Zelltod AICD eintreten wurde im weiteren 400 U ml IL 2 und 100 ng ml OKT3 oder jeweils 10 100 ng ml der beiden Antik r per OKT3 und 15E8 zur Stimulation von T Zellen gew hlt Diese Stimulation f hr te zu einer gr eren Lebensf higkeit CCR7 T Zellen und
127. t die Rezeptor tragende T Zelle bei Kontakt mit dem spezifischen Antigen das CD3 Signal und Kostimulation gleichzeitig Dies ist vor allem dann notwendig wenn Zielzellen die Liganden f r kostimulatorische Molek le nicht exprimieren wie es bei vielen Tumoren der Fall ist Die Verwendung von Kombinationen kostimulatori scher Signalketten f hrt zur Erhaltung und Optimierung der anti Tumor Aktivit t von T Zellen Abken et al 2002 Kostimulation durch CD28 Interaktion mit seinen Liganden ist der wichtigste kosti mulatorische Signalweg zur T Zell Aktivierung Greenwald et al 2005 Das Einf gen der intrazellul ren CD28 Dom ne in den Immunrezeptor f hrt zu verst rkter Prolife ration gesteigerter Sekretion von IL 2 Hombach et al 2006 und zu einer vermin derten Anf lligkeit f r AICD der Rezeptor tragenden T Zellen Emtage et al 2008 Die TGF vermittelte Inhibition der Proliferation von T Zellen am Tumorort welche zur Unterdr ckung der Immunantwort beitr gt wird durch das kombinierte CD28 CD3Z Signal berwunden Koehler et al 2007 Dies f hrt zu einer gr eren Effekti vit t der durch Rezeptor kostimulierten T Zellen in vivo Emtage et al 2008 Aller dings ist CD28 Kostimulation allein zur Expansion von CD8 CTLs nicht ausreichend Laux et al 2000 Deeths et al 1999 Maus et al 2002 F r diese Aufgabe kommt wei teren kostimulatorischen Proteinen wie beispielsweise OX40 eine bedeutende Rolle Zu W h
128. teil CCR7 T Zellen innerhalb einer proliferierenden T Zell Population nimmt ber die Zeit zu Es stellt sich die Frage ob diese Zunahme durch Proliferation der CCR7 T Zellen bedingt ist oder ob CCR7 T Zellen unter Proliferation die Expression des CCR7 Markers auf der Zelloberfl che einstellen Zur L sung dieser Fragestellung wurden CD3 T Zellen zun chst hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Reinhei ten 295 und mit CFSE gef rbt Jeweils die H lfte der Zellen der beiden Subpopu lationen wurde durch Mitomycin C in ihrer Proliferation gehemmt Alle Ans tze wur den unter Zugabe von IL 2 IL 7 und den agonistischen Antik rpern OKT3 und 15E8 f r 7 Tage inkubiert An Tag 0 2 5 und 7 wurden Proben entnommen und die CCR7 Expression der Zellen sowie deren CFSE Markierung durchflusszytometrisch gemes sen CCR7 T Zellen proliferierten weit st rker als CCR7 T Zellen Mit Mitomycin C behandelte Populationen zeigten erwartungsgem keine Proliferation Der Anteil CCR7 T Zellen stieg in den CCR7 T Zell Subpopulationen unabh ngig von der Be handlung mit Mitomycin C auf etwa 20 an Bei nicht mit Mitomycin C behandel ten CCR7 T Zellen wurde eine Abnahme der CCR7 exprimierenden T Zellen korre lierend mit zunehmender Anzahl proliferierter Zellen beobachtet Dahingegen blieb der Anteil CCR7 exprimierender T Zellen in der gleichen Population unter Mitomy cin C Einfluss konstant Die Hemmung der Proliferation durch Mitomycin C hemmte a
129. th factor beta active at physiologic pH J Clin Invest 82 6 1915 1921 1988 Niehans G A Brunner T Frizelle S P Liston J C Salerno C T Knapp D J Green D R Kratzke R A Human lung carcinomas express Fas ligand Cancer Res 57 6 1007 1012 1997 Ohl L Henning G Krautwald S Lipp M Hardtke S Bernhardt G Pabst O F rster R Cooperating mechanisms of CXCR5 and CCR7 in development and orga nization of secondary lymphoid organs J Exp Med 197 9 1199 1204 2003 Park J R Digiusto D L Slovak M Wright C Naranjo A Wagner J Meechoovet H B Bautista C Chang W C Ostberg J R Jensen M C Adoptive transfer of chi meric antigen receptor re directed cytolytic T lymphocyte clones in patients with neuroblastoma Mol Ther 15 4 825 833 2007 Pavoni E Flego M Dupuis M L Barca S Petronzelli F Anastasi A M D Alessio V Pelliccia A Vaccaro P Monteri G Ascione A Santis R D Felici E Cianf riglia M Minenkova O Selection affinity maturation and characterization of a human scFv antibody against CEA protein BMC Cancer 6 41 2006 Pear W S Nolan G P Scott M L Baltimore D Production of high titer helper free retroviruses by transient transfection Proc Natl Acad Sci U S A 90 18 8392 8396 1993 Rappl G Schrama D Hombach A Meuer E K Schmidt A Becker J C Abken H CD7 T cells are late memory cells generated from CD
130. tolytic effector molecules the secretion of high amounts of IFN y upon stimulation via the recombinant immunore ceptor which may enhance anti tumor immune response by attracting macrophages and the secretion of reduced amounts of IL 2 which avoids stimulation of regulatory T cells Redirected CCR7 T cells are more efficiently activated in vitro to lyse tu mor cells than CCR7 T cells However CCR7 T cells which include late effector effector memory and terminally differentiated T cells are prone to activation induced cell death AICD Receptor triggered CD28 CD3C OX40 stimulation but not CD28 CD3 stimulation prevents apoptosis of CCR7 T cells by Bcl 2 upregulation Conse quently CCR7 T cells redirected by a combined CD28 CD3C OX40 immunoreceptor performed superior in specific lysis of established tumors in vivo compared to CCR7 T cells These results suggest that in contrast to current strategies redirecting CCR7 T cells for adoptive therapy provide superior anti tumor activi ties in vivo if stimulated by combined CD28 CD3C OX40 cosignaling Inhaltsverzeichnis Abstract iii 1 Einleitung 1 1 1 Adoptive Immuntherapie und die Struktur von rekombinanten Immun TEZE PLOTOM Set A a a ar A Bods ata dad e eye en 2 1 2 Anspr che an eine Effektorzellpopulation 5 1 3 T Zell Effektorfunktionen 2 2 Cm onen 6 1 4 T Zell Subpopulationen 2 22m comme 7 1 5 Bedeutung von Kostimulation in der T
131. tzung durch zahlreiche Anregungen und technischen Support erhielt ich von Ulrike Hohmann und Martin Zuther Vielen Dank daf r Bei den Mitgliedern der AG Tumorgenetik m chte ich mich f r das freundschaftliche Arbeitsklima und die sch ne Zeit bedanken Es war mir ein gro es Vergn gen mit Euch zusammenzuarbeiten ich werde Euch vermissen Meiner Familie und Martin danke ich f r motivierenden Zuspruch und daf r dass sie immer f r mich da sind Erkl rung Ich versichere dass ich die von mir vorgelegte Dissertation selbst ndig angefertigt die benutzten Quellen und Hilfsmittel vollst ndig angegeben und die Stellen der Arbeit einschlie lich Tabellen Karten und Abbildungen die anderen Werken im Wortlaut oder dem Sinn nach entnommen sind in jedem Einzelfall als Entlehnung kenntlich gemacht habe dass diese Dissertation noch keiner anderen Fakult t oder Universit t zur Pr fung vorgelegen hat dass sie noch nicht ver ffentlicht worden ist sowie dass ich eine solche Ver ffentlichung vor Abschluss des Promotionsverfahrens nicht vor nehmen werde Die Bestimmungen dieser Promotionsordnung sind mir bekannt Die von mir vorgelegte Dissertation ist von Prof Dr Thomas Langer und Prof Dr Hinrich Abken betreut worden K ln den 27 April 2009 Claudia Ederer
132. ubation wurde die CCR7 Expression durch F rbung mit dem anti human CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 und dem FITC konjugierten sekund ren Antik rper anti murin IgM sowie die Proliferation der Zellen anhand des CFSE Gehalts der Zellen durchflusszytometrisch analysiert Abgebil det sind der Anteil proliferierter Zellen durchgezogene Linie und der Anteil CCR7 T Zellen gestrichelte Linie in den jeweiligen Subpopulationen 81 Ergebnisse 4 4 3 IL 2 anti CD3 Stimulation induziert bevorzugt CCR7 T Zellen im Vergleich zu anti CD3 anti CD28 Stimulation Um festzustellen ob die Art der Stimulation Einfluss auf die Expression von CCR7 auf der Zelloberfl che hat wurden CD3 CCR7 T Zellen Reinheit 97 isoliert Die H lf te der Zellen wurde mit Mitomycin C behandelt Anschlie end wurden behandelte und unbehandelte CCR7 T Zellen mit CFSE gef rbt Die Zellen wurden entweder nur mit anti CD3 Antik rper OKT3 oder mit IL 2 und anti CD3 AK oder mit den Antik rpern anti CD3 und anti CD28 15E8 stimuliert Nach der F rbung mit CFSE sowie anschlie Bend alle zwei Tage wurden Zellen entnommen und deren CCR7 Expression sowie de ren Gehalt an CFSE durchflusszytometrisch analysiert IL 2 anti CD3 stimulierte T Zellen prolifierierten zun chst verz gert im Vergleich zu anti CD3 anti CD28 stimulierten T Zellen Nach 8 Tagen hatten sich nahezu al le Zellen in diesen beiden Populationen mindestens einmal geteilt Die Proliferati on nach Stimulat
133. uch die Generierung von CCR7 T Zellen Abbildung 4 24 Die Expressionst rke von CCR7 auf den Subpopulationen korrelierte mit dem prozentualen Anteil CCR7 expri mierender Zellen Bei mit MitomycinC behandelten CCR7 T Zellen wurde ein An stieg in der mittleren Fluoreszenz Intensit t ber die Zeit beobachtet nicht abgebil det Hier wurde gezeigt dass T Zellen unter Proliferation die Expression von CCR7 einstel len CCR7 T Zellen k nnen also durch die Induktion der Proliferation CCR7 T Zellen generiert werden 80 Ergebnisse ohne Mitomycin C mit Mitomycin C 100 100 80 80 60 60 CCR7 T Zell 40 40 Subpopulation 20 20 8 0 2 4 6 8 N 100 100 N 80 80 a oe CCR7 T Zell 40 40 Subpopulation 20 20 0 0 l 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 P Zeit d Dass proliferierte Zellen CCR7 t T Zellen Abbildung 4 24 Proliferierende CCR7 T Zellen stellen die Oberfl chenexpression von CCR7 ein CD3 T Zellen wurden zun chst hinsichtlich der Expression von CCR7 mittels magnetischer Zellseparation getrennt Jeweils die H lfte der erhaltenen Subpopulationen wurde mit Mitomycin C 20 ug ml behandelt Sowohl die behandelten als auch die unbehandelten Populationen wurden mit CFSE 1 25 uM gef rbt und anschlie end in Gegenwart von IL 2 400 U ml IL 7 10 ng ml OKT3 Antik rper 100 ng ml und 15E8 Antik rper 10 ng ml kultiviert Nach der F rbung mit CFSE sowie nach 2 5 und 7 Tagen Ink
134. ung zu Effektorzellen Die Effektor Ged chtnis T Zellen Tgm vermitteln unmittelbaren Schutz in peripheren Geweben Tpm Zellen exprimieren kein CCR7 sind heterogen bez glich der Expression von CD62L und in der Lage sofortige Ef fektorfunktion auszuf hren Im Gegensatz zu zentralen Ged chtniszellen besitzen sie eine Vielzahl migratorischer und zytolytischer F higkeiten die bei ihrer Wanderung in entz ndetes peripheres Gewebe zum Einsatz kommen Die Abbildung 1 3 zeigt das Expressionsprofil unterschiedlicher Oberfl chenmarker der Ged chtnis T Zell Subpopulationen Urspr nglich wurde die Expression der CD45 Isotypen zur Differenzierung zwischen naiven CD45RA CD45RO und aktivierten CD45RA CD45RO T Zellen verwendet Merkenschlager et al 1988 Young et al 1997 Nach heutigem Wissensstand k nnen Antigen erfahrene T Zellen jedoch wieder zur CD45RA Isoform wechseln Diese Zellen Einleitung CD4 compartment CD8 compartment Tom Tem Tem Tem Temna CCR7 CD45RO a CD45RA Be Gm u cosa iw co LE la er CD28 el I cxcR5 I EE Nee a cxcee3 EES CCR4 I ces E lO OO a CRTH2 nd nd nd Abbildung 1 3 Ph notypische Heterogenit t humaner Ged chtnis T Zellen Aus Sallusto et al 2004 nd not defined sind weiterhin durch einen CCR7 und weitgehend CD62L Ph notyp gekennzeich net und werden als terminal differenzi
135. uzierte CD4 T Zellen bei denen 67 Ergebnisse LS174T MyLa CEA CD30 CEA CD30 140 140 120 120 100 100 80 80 anti CD30 60 60 Rezeptor 523 40 40 20 20 x 0 T T T 1 0 T T T 1 1 16 1 8 14 1 2 1 16 1 8 14 1 2 i 120 120 As gt 100 100 80 80 FR en anti CEA Rezeptor 439 40 40 20 20 0 T f T 1 0 T T 1 1 16 1 8 1 4 1 2 1 16 1 8 14 1 2 p Verh ltnis Effektor Targetzellen CD3 t T Zellen w o m CD3 CCR7 T Zellen mit R t 4 CD3 CCR7 En a Abbildung 4 16 CCR7 T Zellen vermitteln spezifische Zytolyse von Tumorzellen in vitro CD3 T Zellen wurden mit anti CD30 HRS3 Fce CD3 523 oder anti CEA BW431 26 scFv Fc CD3 439 transduziert und in die CCR7 und CCR7 4 T Zell Subpopulationen getrennt Die Koinkubation mit CD30 CEA LS174T Zellen oder CD30 CEAT MyLa Zellen erfolgte f r 48 h in 96 Well Mikroti terplatten Schein transduzierte CD3 T Zellen dienten als Kontrolle Es wurden bei 1 25x 10 bis 1x 10 Effektorzellen Well konstant 2x 10 Tumorzellen Well eingesetzt Die Viabilitat der Tumorzellen wurde aus den nach Zugabe von XTT Reagenz gemessenen Absorptionen bei OD450 650 nm errechnet Die Daten repr sentieren Mittelwerte von Triplikaten Standardabweichungen w o ohne without Im munrezeptor 68 Ergebnisse weder Lyse der LS174T Zellen noch IFN y Sekretion festgestellt wurden Abbil dung 4 1
136. von CCR7 auf CD3 T Zellen Fl Fluoreszenz Intensitat 44 Ergebnisse 100 x 90 0 5 O 2 80 20 o N O 70 aa o O a O 60 o 2 O 8 N 50 T T T 1 15 25 35 45 55 Alter Jahre Abbildung 4 2 Die Anzahl der CCR7 CD3 ist unabh ngig vom Alter des Spenders Der Anteil CCR7 T Zellen an der Gesamtzahl der T Zellen im peripheren Blut wurde durchflusszytometrisch be stimmt und in Abh ngigkeit vom Alter des Blutspenders aufgetragen PE gekoppelten anti human CCR7 Antik rper Klon 3D12 gef rbt und anschlie Send mit anti PE Beads durch magnetisch aktivierte Zell Sortierung getrennt Es wurden die Programme Deplete S Deplete 05 und Deplete 025 vergli chen Deplete Programme werden zur Selektion von nicht magnetisch mar kierten Zellen verwendet Das Programm Deplete S verwendet eine langsame re Rate um die magnetisch markierten Zellen auf die S ule aufzutragen als das Standardprogramm Deplete wodurch auch schw cher markierte Zellen durch die S ule gebunden werden Deplete 05 tr gt Zellen nur halb so schnell auf die S ule auf wie Deplete s und Deplete 025 nur halb so schnell wie Deplete 05 Durch diese Programme k nnen Zellen mit geringer Frequenz in der Gesamtpo pulation angereichert werden Mit diesen Versuchsans tzen wurden maximale Reinheiten bis 75 in den jeweiligen Subpopulationen erreicht Da die Reinheit der CCR7 und CCR7 T Zell Po
137. von CLA im Ver gleich zu CD4 CCR7 T Zellen aus Weiterhin wurde mehr CD103 von CD4 CCR7 als von CD4 CCR7 T Zellen exprimiert Abbildung 4 9 Hier wurde gezeigt dass CD62L zum Homing in sekund re lymphatische Gewebe vor allem auf CCR7 T Zellen exprimiert wird w hrend CCR7 T Zellen Homing Rezeptoren f r die Peripherie exprimieren 55 Ergebnisse A CD8 T Zellen CD4 T Zellen 100474 10 71 Ss 80 80 S a4 2 60 60 N 40 40 E 2 20 20 J a 0 Bm im es B 0 a a se fox ge Se a 8 T se DD Ae Oe ig o E 5 dD E ag a een 8000 Bei 7 11300 5 G R mi y 6000 6000 A m 7 e Y LL A 4000 4000 71 Y m 2 f 2000 2000 rn Y Y m EN 0 T T Ta T T 0 T T 7 T a 8 u S a 2 8 2 3 z ee ee O CCR7 T Zellen CCR7 T Zellen Abbildung 4 9 CCR7 T Zellen exprimieren Homing Marker f r die Peripherie CCR7 T Zellen f r die sekund ren Iymphatischen Gewebe Je 5x 10 PBMCs aus frischem Blut von 4 verschiede nen gesunden Spendern wurden mit anti CD8 Klon DK25 oder CD4 Klon MT310 Antik rpern mit dem anti CCR7 IgM Antik rper Klon 2H4 und dem anti murin IgM Sekund rantik rper sowie mit je einem An tik rper spezifisch f r die Homing Marker CD62L Klon DREG56 CCR10 Klon 314305 CD103 Klon Ber ACT8 CCR4 Klon 205410 CLA Klon HECA 254 oder f r die LFA 1 Kette Klon 2D7 gef rbt PBMCs die mit Antik rpern i
138. webe an der Schwanzspitze auf 94 Ergebnisse gt 600 E m CCR7 T Zellen g 4 CCR7 T Zellen 5 O CCR7 T Zellen S 7 a A CCR7 a en 2 Zeit nach Injektion Tage 600 E o CCR7 T Zellen j CCR7 T Zellen E CORE T Zellen are CCR7 T Zellen 2 Tag 9 Tag 10 Zeit nach Injektion Abbildung 4 31 CCR7 T Zellen mit CD28 OX40 Kostimulation sind bei systemischer Applika tion effektiver in der anti Tumor Antwort als CCR7 T Zellen NIH III M usen 7 Tiere Gruppe wurden 8x 10 CEA C15A3 Tumorzellen subkutan injiziert Bei Erreichen eines Tumorvolumens von 20 40 mm wurden 1x10 CCR7 oder CCR7 T Zellen mit BW431 26scFv Fc CD28 CD3C OX40 Rezeptor 975 intraven s injiziert Schein transduzierte CCR7 und CCR7 T Zellen dienten als Kon trolle Das Tumorwachstum wurde t glich gemessen Abgebildet sind die Mittelwerte der Tumorgr en der verschiedenen Gruppen ber 10 Tage A und an Tag 8 10 B p lt 0 05 T Test w o ohne without Immunrezeptor 95 5 Diskussion Therapeutische Erfolge mit adoptiv transferierten Zellen bleiben h ufig aufgrund ge ringer Persistenz und damit einhergehender mangelnder Effizienz der Effektorzellen in vivo aus Es besteht daher Bedarf eine Effektorzellpopulation zu definieren die den Anforderungen gewachsen ist m glichst effektiv und anhaltend Zielzellen zu elimi nieren Um die m gliche Eignung einzelner T Zell Subpopulationen f r die ado
139. wurde f r die Induktion der f r den retroviralen Gentransfer ben tigten Proliferation als ausreichend befun den 49 Ergebnisse Trenn Puffer EDTA Azid EDTA Azid CCR7 T Zellen Annexin V CCR7 T Zellen o gt oO J gt oO O CCR7 T Zellen A CCR7 T Zellen 20 m CCR7 T Zellen 4 CCR7 T Zellen EDTA Azid EDTA Azid apoptotische Zellen 0 T T T T 1 0 20 40 60 80 100 Zeit h Abbildung 4 5 Magnetische Zellseparation mit Puffern ohne EDTA und ohne Azid senkt die Apop toserate von CCR7 und CCR7 T Zellen Aus frisch isolierten PBMCs wurden zun chst CD3 Zel len gewonnen und diese anschlie end hinsichtlich ihrer CCR7 Expression getrennt Beide Trennungen wurden jeweils mit den kommerziell erh ltlichen Puffern Rinsing Solution PBS 2 mM EDTA pH 7 2 Running Buffer PBS 2 mM EDTA 0 5 BSA 0 09 Azid pH 7 2 und mit Puffern ohne EDTA sowie ohne Azid durchgef hrt Auf einer 96 Well Mikrotiterplatte wurden je 1 x 10 Zellen Well in RPMI 1640 Medium ohne weitere Zus tze kultiviert Direkt nach der Trennung sowie nach 24 48 und 96 h wurden Zellen mit Annexin V und 7 AAD gef rbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert Ans tze mit Zellen die mit Antik rpern irrelevanter Spezifit t gleichen Isotyps markiert wurden dienten als Kontrolle In A ist die Verteilung der Annexin V und PI gef rbten Zellen in den einzelnen Fraktionen direkt nach der Tre

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