Arbeitsanleitung - bei Immundiagnostik
Contents
1. 9 3 MutaCHIP Protocol 11 Evaluation and Interpretation of Results 11 12 Trouble shooting 15 Application 3 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 1 Application The MutaCHIP 5 FU Kit is a bio molecular test for the examination of mutations of the Dihydropyrimidine Dehydrogenase gene DPYD from a genomic DNA sample This test is based on a MutaCHIP technology The investigated variations are connected to a decrease in or absence of DPD enzyme activity which in turn leads to an increased risk for severe side effects and toxicities during 5 Fluorouracil 5 FU chemotherapy The following variations are covered by the test DPYD 2A DPYD 3 DPYD 4 DPYD 7 DPYD 8 DPYD 10 DPYD 12 DPYD 13 DPYD M166V DPYD A551T DYPD D949V 2 Introduction Next to age gender and environmental influences such as diet and co medication there are genetic factors that have a major impact on the catalytic activity of many enzymes It is known that patients with decreased or totally absent function of the Dihydropyrimidine Dehydrogenase DPD enzyme are at a higher risk to develop severe to lethal side effects during chemotherapy with 5 Fluorouracil Those effects range between grades 3 4 according to the WHO 5 FU is a cytostatic drug that is routinely used for the treatment of many solid tumours Analysis of the DPYD gene can help to reduce the risk2. 12 5 L Master Mix 3 Component Volume per 25 L reaction DNA min 30 max 60 ng 2 L Primer Mix C red lid 2 L PCR H2O 8 5 L PCR Buffer incl Polymerase 12 5 L Master Mix 4 Component Volume per 25 L reaction DNA min 30 max 60 ng 2 L Primer Mix D blue lid 2 L PCR H2O 8 5 L PCR Buffer incl Polymerase 12 5 L The samples are placed in the thermocycler and the program described in 10 2 is to be applied 8 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 10 2 PCR Protocol The PCR protocol has to be established anew for each laboratory as different thermocyclers have different heating rates This establishment can be omitted when using the recommended thermocycler Peqlab Primus 25 advanced The following standard protocol can be used to start the establishing process Temperature C Time sec Cycles Start 95 300 1 x Denaturation 95 30 40 x Annealing 51 3 30 Elongation 72 50 Finale Elongation 72 420 1 x Pause 4 8 Test Procedure 9 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 10 3 MutaCHIP Protocol A Preparation of the Hybridisation Buffer If the Hybridisation Buffer is turbid or a precipitate can be seen it has to be heated in a microwave for several seconds 240 W or in a water bath Gently shake the Hybridisation Buffer until it gets clear to homogenise it again Before usage it has to be coole
3. Lagerung und Haltbarkeit Alle Komponenten sind bei 2 8 C zu lagern Das Substrat ist unbedingt vor Lichteinwirkung zu sch tzen Im Inneren des Beutels befinden sich 5x MutaCHIPs mit jeweils ge ffnetem Deckel Wenn ein Lichtschutzfolien Beutel ge ffnet wurde m ssen die Deckel der darin verbleibenden MutaCHIPs unbedingt ge ffnet bleiben da das Schutzgas entweicht Die MutaCHIPs k nnen im wieder lose nicht luftdicht verschlossenen keine Klebestreifen verwenden Lichtschutzfolien Beutel mehrere Wochen bei Raumtemperatur RT gelagert werden Dabei einen dunklen und trockenen vor Feuchtigkeit sch tzen Ort zur Aufbewahrung ausw hlen Um selbst minimale Performanceverluste zu vermeiden empfehlen wir jedoch den Verbrauch eines ge ffneten MutaCHIP Beutels m glichst innerhalb von zwei Wochen Die MutaCHIPs sind gegen direkte Sonneneinstrahlung und Staub zu sch tzen 7 Arbeitsbedingungen Die MutaCHIPs d rfen niemals zentrifugiert werden Die Oberfl che des MutaCHIPs darf nicht mit der Pipettenspitze ber hrt werden Der MutaCHIP darf nur mit den im Protokoll erw hnten Substanzen verwendet werden 6 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 8 Hinweise und Vorsichtsma nahmen Die Vorschriften und Grunds tze f r molekularbiologisches Arbeiten m ssen eingehalten werden Der Test ist zur Verwendung mit frisch extrahierter genomischer DNA aus EDTA Vollblut als Ausgangsmaterial geeignet Nur dann k nnen op
4. Reader in der richtigen Art und Weise an bitte wenden Sie sich an das Benutzerhandbuch des PGDx Systems Schlechte Bildqualit t Reinigen Sie die Bodenunterseite des Arraygef es Benutzen Sie ein weichesTuch das mit Desinfektionsmittel angefeuchtet ist Wiederholen Sie das Foto es kann notwendig sein diesen Schritt mehrfach zu wiederholen Unscharfes Bild Reinigen Sie vorsichtig die Kamera mit einem Tuch oder einem Wattst bchen MutaCHIP 5 FU DNA Macroarray Kit for the analysis of mutations in the Dihydropyrimidine Dehydrogenase Gene Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 For in vitro diagnostics only 20 KF390006 10 KF391006 2 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 Content 1 Application 3 2 Introduction 3 3 Concept of the Assay 4 4 Components 4 5 Materials 5 6 Storage and Shelf life 5 7 Working Conditions 5 8 Considerations and Precautions 6 9 Sample Collection 6 10 Test Procedure 7 7 1 PCR Product Generation 8 2 PCR Protocol
5. Schwenken homogenisiert werden bis er wieder klar ist Vor dem Verwenden muss der Puffer auf Raumtemperatur RT abgek hlt werden B Vorbereitung der DNA Proben Den Thermoshaker auf 48 C vorheizen Jeweils 2 L der amplifizierten Proben von Master Mix 1 und 2 unverd nnt in ein PCR Reaktionsgef 5 berf hren Anschlie end die Amplifikate von Master Mix 3 und 4 1 100 verd nnen Hierzu jeweils 1 L der Amplifikate von MM3 und MM4 in jeweils ein PCR Reaktionsgef berf hren und mit 99 L Nuklease freiem Wasser mischen Von diesen Verd nnungen jeweils 2 L in das PCR Reaktionsgef 5 berf hren Die vorbereitete Probe f r 2 min bei 95 C im Thermocycler denaturieren Anschlie end wird die denaturierte Probe mit Hybridisation Buffer auf 100 L aufgef llt 8 L DNA 92 L Hybridisation Buffer Das Gemisch vollst ndig in den MutaCHIP pipettieren ohne dabei den Boden zu ber hren C Hybridisierung Hybridisieren der Probe bei 48 C 550rpm f r 60 min W hrend der Hybridisierungszeit muss der Blocking Mix angesetzt werden Hierzu 0 02 g Blocking Powder in 1 mL Blocking Buffer bei 65 C l sen und danach vortexen Dauer des Vorgangs etwa 10 15 min Anschlie end auf Raumtemperatur abk hlen lassen 10 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 D Waschschritte nach der Hybridisierung Den Thermoshaker auf 41 C temperieren Achtung W hrend des Herunterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCH
6. during the precipitation Completely remove the Washing Buffer from step G Add 100 L of Substrate to the MutaCHIP and incubate for 5 min at 21 C To do so put the MutaCHIP into the thermoshaker Do not activate shaking function Thereafter remove the Substrate completely pipette and immediately add 500 L of Washing Buffer Place the MutaCHIP into the image reader pay attention to the correct orientation take a picture and start with the analysis evaluation of the results see following chapter Evaluation and Interpretation of Results 11 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 11 Evaluation and Interpretation of Results The evaluation is performed using the MAAT and the DPYD Genotyping Software The results are compiled with help of the software into a report For the evaluation of the chip follow the short instructions below For further and detailed information please refer to the NutriGenomics Software handbook Step 1 Create a new project Click on the button New experiment Assign an arbitrary name for the experiment and subsequently save it by clicking on the button save Step 2 Start the analysis process Click on the Start button to initiate data analysis 12 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 Step 3 Quality check of the chip To ensure a correct analysis result the picture quality of the MutaCHIP has to be checked Particles of dust on the bottom side of the MutaCHIP
7. of 5 FU related toxicities by anticipating the catalytic function of the DPD enzyme for each individual patient With this assay patients bearing variants leading to a decreased enzyme activity can be identified prior to therapy initiation and can be treated accordingly with lower doses or alternative medications if applicable Forty percent 40 of all patients bearing one of the variants and treated with 5 FU will experience severe side effects As many cases of 5 FU related side effects can be explained by mutations in the DPYD gene genotyping of those variants can help to optimize and individualize chemotherapies to prevent undesired effects and lower the costs that emerge from prolonged hospitalization and the treatment of adverse reactions References Mol Cancer Ther 2006 5 11 2895 2904 Clin Cancer Res 2004 10 17 5880 5888 Clin Cancer Res 2006 12 13 3928 3934 Pharmacogenomics 2001 J1 65 70 J Clin Oncol 2008 26 13 2130 2137 4 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 3 Concept of the Assay To analyse the mutations a PCR is performed which amplifies the variable parts of the DPYD gene using freshly extracted genomic DNA as template The amplification product is transferred to the MutaCHIP and is treated following the provided protocol The analysis allows distinct genotyping of all variants of the DPYD gene that are spotted onto the MutaCHIP The amplified product binds onto the MutaCHIP to the immobilised
8. 5 FU bedingte Nebenwirkungen mit dem Vorliegen einer Mutation im DPYD Gen erkl rt werden Die Genotypisierung kann helfen medikament se Therapien individuell zu optimieren und durch unerw nschte Nebenwirkungen entstehende Kosten verl ngerter Krankenhausaufenthalt etc zu senken Referenzen Mol Cancer Ther 2006 5 11 2895 2904 Clin Cancer Res 2004 10 17 5880 5888 Clin Cancer Res 2006 12 13 3928 3934 Pharmacogenomics 2001 J1 65 70 J Clin Oncol 2008 26 13 2130 2137 4 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 3 Testprinzip Zur Analyse der Mutationen werden die relevanten Teile des DPYD Gens mittels PCR amplifiziert wobei frisch extrahierte genomische DNA des Patienten als Matrize dient Das Amplifikationsprodukt wird anschlie end auf den MutaCHIP gegeben und nach mitgeliefertem Protokoll bearbeitet Die Analyse mittels Pr zipitationsreaktion l sst eine eindeutige Genotypisierung aller auf den MutaCHIP gespotteten Allele des DPYD Gens zu Das amplifizierte Produkt wird auf den MutaCHIP gegeben und bindet an den dort immobilisierten Sonden Durch einen Waschschritt werden unspezifisch gebundene Fragmente wieder entfernt Im Anschluss wird das Enzym hinzugegeben welches an den Sonden Fragment Komplex bindet Nach Zugabe des Substrats tritt eine F llungsreaktion an den Stellen an denen noch DNA gebunden ist auf Das farbige Pr zipitat wird mit dem Imagereader detektiert und von der dazugeh rigen Software a
9. IP Technologie Alle untersuchten Variationen stehen in Zusammenhang mit einem erh hten Risiko f r das Auftreten von schwerwiegenden Nebenwirkungen w hrend einer 5 Fluorouracil 5 FU haltigen Chemotherapie Folgende Variationen werden durch den MutaCHIP 5 FU Kit detektiert DPYD 2A DPYD 3 DPYD 4 DPYD 7 DPYD 8 DPYD 10 DPYD 12 DPYD 13 DPYD M166V DPYD A551T DYPD D949V 2 Einleitung Neben Einfl ssen wie Alter Geschlecht Ern hrung und Komedikation k nnen insbesondere genetische Faktoren die Enzymaktivit t beeinflussen Es ist bekannt dass Patienten die keine bzw eine stark reduzierte Aktivit t des Enzyms Dihydropyrimidin Dehydrogenase DPD aufweisen unter einer Therapie mit 5 Fluorouracil 5 FU ein erh htes Risiko f r das Auftreten schwerer bis t dlicher Nebenwirkungen gem WHO Grad 3 4 haben 5 FU ist ein Zytostatikum das standardm ig zur Therapie einer Reihe von Tumorerkrankungen eingesetzt wird Die Untersuchung des DPYD Gens kann helfen das genetisch bedingte Risiko einer Nebenwirkung stark zu reduzieren bzw zu vermeiden Tr ger einer der untersuchten genetischen Varianten des DPYD Gens k nnen somit vor Beginn einer Therapie ermittelt und ggf mit einer alternativen Therapie oder mit deutlich reduzierter Dosierung behandelt werden Von allen Patienten die trotz einer genetischen Variante des DPYD Gens mit 5 FU behandelt werden erkranken ber 40 an schweren Nebenwirkungen Grad 4 In vielen F llen k nnen
10. IP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Hybridisation Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Den Hybridisation Buffer aus Schritt C vollst ndig entfernen 500 L Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren Waschen des MutaCHIPs bei 41 C 550 rpm f r 5 min Nach Ablauf des ersten Waschschritts den Washing Buffer vollst ndig entfernen Erneut 500 L Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren Erneutes waschen des MutaCHIPs bei 41 C 550 rpm f r 5 min E Blockingschritt Den Thermoshaker auf 21 C temperieren Achtung W hrend des Runterk hlens des Thermoshakers muss der MutaCHIP unbedingt aus dem Shaker entnommen werden Der Washing Buffer muss auf dem MutaCHIP verbleiben bis die Zieltemperatur erreicht ist Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Den Washing Buffer aus Schritt D vollst ndig entfernen 100 L Blocking Mix vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren Blocken des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 15 min W hrend des Blockens muss der Enzyme Mix angesetzt werden Hierzu 75 L SSPE mit 175 L PCR H2O und 0 5 L Enzyme lila Deckel mischen und bis zum Gebrauch bei 4 C lagern Dieser Ansatz reicht f r 2 MutaCHIPs F Enzymkonjugation Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Den Blocking Mix aus Schritt E vollst ndig entfernen 100 L Enzyme Mix vorsichtig auf den Mut
11. MutaCHIP 5 FU DNA Macroarray Kit zur Untersuchung von Mutationen des Dihydropyrimidin Dehydrogenase Gens Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 Nur f r in vitro Diagnostik 20 KF390006 10 KF391006 2 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 Inhaltsverzeichnis 1 Verwendungszweck 3 2 Einleitung 3 3 Testprinzip 4 4 Kitbestandteile 4 5 Erforderliche Materialien 5 6 Lagerung und Haltbarkeit 5 7 Arbeitsbedingungen 5 8 Hinweise und Vorsichtsma nahmen 6 9 Probengewinnung 6 10 Testdurchf hrung 7 7 1 PCR Produktherstellung 8 2 PCR Protokoll 9 3 MutaChip Protokoll 11 Auswertung 11 12 Troubleshooting 15 Verwendungszweck 3 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 1 Verwendungszweck Das MutaCHIP 5 FU Kit ist ein molekularbiologischer Test zur Untersuchung von Mutationen des Dihydropyrimidin Dehydrogenase Gens DPYD aus genomischer DNA mittels MutaCH
12. aCHIP pipettieren Konjugieren des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 15 min G Zweiter Waschschritt Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Den Enzyme Mix aus Schritt F vollst ndig entfernen 500 L Washing Buffer vorsichtig auf den MutaCHIP pipettieren Waschen des MutaCHIPs bei 21 C 550 rpm f r 5 min H F rbung Achtung Auf korrekte Einstellung des Volumens achten Der Chip darf w hrend und nach dem F rben nicht gesch ttelt werden Den Washing Buffer aus Schritt F vollst ndig entfernen 100 L Substrate in den MutaCHIP geben und f r 5 min bei 21 C inkubieren Dazu den MutaCHIP in den Thermoshaker berf hren keine Sch ttelfunktion aktivieren Danach das Substrate wieder vollst ndig entfernen Pipette und umgehend 500 l Washing Buffer hinzugeben MutaCHIP in den Imagereader berf hren auf korrekte Platzierung achten Bild erstellen und mit der Analyse Auswertung beginnen siehe folgendes Kapitel Testdurchf hrung 11 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 11 Auswertung Die Auswertung erfolgt ber das MAAT und die DPYD Genotyping Software Die Ergebnisse werden mit Hilfe der Software in einem Report zusammengestellt F r die Auswertung des Chips folgen Sie der folgenden kurzen Anleitung F r weitere und detailliertere Informationen sehen Sie bitte im DPYD Genotyping Software Handbuch nach Schritt 1 Ein neues Projekt erstellen Klicken Sie auf die Schaltfl che Neues Exper
13. can affect the analysis These can be removed by cleaning with a soft and wet tissue Follow the instructions given in the screen shown here Press Continue analysis if the quality of the picture is comparable to the figure above Evaluation and Interpretation of Results 13 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 Step 4 Genotyping results After the complete data analysis the results can be access in the analysis module genotyping module or in the diagnostic report The used icons are explained in the following table Symbole der Software und ihre Bedeutung The patient carries on both alleles the healthy variant of the investigated genetic variants The patient carries on one allele the healthy and on the other allele the mutated genetic variant The patient carries on both alleles the mutated genetic variation in homozygous form The signal values of the probes for this genetic variation are too weak for a valid result This could be caused by other sequence variations in close proximity to the investigated variant The remaining signals of the assay are not influenced Both probes for this genetic variant show an invalid signal This might be caused by impurities or dust particles on the MutaCHIP surface The remaining signals of the assay are not influenced 14 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 Step 5 Diagnostic report To evaluate the results open the diagnostic Report Main Theref
14. d to room temperature RT B Preparation of DNA samples Head up the thermoshaker to 48 C Transfer 2 L of the amplified samples from Master Mix 1 and 2 into a fresh PCR reaction tube 5 Dilute the PCR products from Master Mix 3 and 4 each 1 100 For this use 1 L of each sample and mix it with 99 L PCR water nuclease free in a fresh PCR reaction tube Then Transfer 2 L of each of these dilutions into the reaction tube 5 Denature the prepared samples for 2 min at 95 C in a thermocycler Subsequently fill up the denatured DNA sample to 100 L with Hybridisation Buffer 8 L PCR product 92 L Hybridisation Buffer Pipette the whole mixture into the MutaCHIP without touching the reaction surface C Hybridisation Perform the hybridisation at 48 C 550rpm for 60 min During this hybridisation time the Blocking Mix has to be prepared To do so add 0 02 g Blocking Powder to 1 mL Blocking Buffer mix by vortexing and solubilise this at 65 C Then allow the Blocking Mix to cool down to RT before use 10 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 D Washing steps after Hybridisation Set the thermoshaker to 41 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the thermoshaker The Hybridisation Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Completely remove the Hybridisation Buffer from step C A
15. dd carefully 500 L of Washing Buffer onto the MutaCHIP Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 41 C for 5 min Completely remove the Washing Buffer Add carefully 500 L of Washing Buffer onto the MutaCHIP Wash again the MutaCHIP at 550 rpm and 41 C for 5 min E Blocking Step Set the thermoshaker to 21 C Note During the cooling period the MutaCHIP has to be removed from the termoshaker The Washing Buffer has to remain on the MutaCHIP until the target temperature is reached Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Completely remove the Washing Buffer from step D Add 100 L of Blocking Mix to the MutaCHIP Incubate the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 15 min During the blocking the Enzyme Mix has to be prepared Add 75 L SSPE to 175 L PCR H2O and 0 5 L Enzyme purple lid mix and store at 4 C until use This amount can be used for 2 MutaCHIPs F Enzyme Conjugation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Completely remove the Blocking Mix from step E Add 100 L of Enzyme Mix to the MutaCHIP Incubate the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 15 min G Washing step after Enyzme conjugation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Completely remove the Enzyme Mix from step F Add of 500 L Washing Buffer to the MutaCHIP Wash the MutaCHIP at 550 rpm and 21 C for 5 min H Precipitation Caution Pay attention to the correct adjustment of volume Do not shake the MutaCHIP
16. elber Deckel 6 L PCR H2O 2 5 L PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 L Master Mix 3 Bestandteil Volumen pro 25 L Reaktionsansatz DNA ca 60 ng 2 L Primer Mix C roter Deckel 2 L PCR H2O 8 5 L PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 L Master Mix 4 Bestandteil Volumen pro 25 L Reaktionsansatz DNA ca 60 ng 2 L Primer Mix D blauer Deckel 2 L PCR H2O 8 5 L PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 L Die Proben in den Thermocycler stellen und das in 10 2 beschriebene PCR Protokoll verwenden 8 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 10 2 PCR Protokoll Das PCR Protokoll muss f r jedes Labor erneut etabliert werden da die verschiedenen Thermocycler unterschiedliche Heizraten haben Diese Etablierung entf llt wenn der empfohlene Thermocycler verwendet wird Peqlab Primus 25 advanced F r die Etablierung kann mit dem folgenden Standard Protokoll begonnen werden Temperatur in C Zeit in Sekunden Zyklen Start 95 300 1 x Denaturation 95 30 40 x Annealing 51 3 30 Elongation 72 50 Final Elongation 72 420 1 x Pause 4 8 Testdurchf hrung 9 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 10 3 MutaChip Protokoll A Vorbereitung des Hybridisierungspuffers Falls der Hybridisation Buffer tr b oder flockig geworden ist kann dieser f r wenige Sekunden in der Mikrowelle 240 W oder in einem Wasserbad erw rmt und durch
17. er Sonden f r diese genetische Variation sind zu gering um ein valides Ergebnis zu erzeugen Dies k nnte auf Sequenzver nderungen in direkter N he zur untersuchten Variation hindeuten Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt Beide Sonden f r diese genetische Variation erzeugen ein nicht g ltiges Signal Dies k nnte auf eine Verschmutzung auf der Chipoberfl che zur ckzuf hren sein Die anderen Signale werden jedoch durch den Ausfall nicht beeintr chtigt 14 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 Schritt 5 Diagnostischer Report Um die Daten auszuwerten lassen Sie sich den diagnostischen Report anzeigen Klicken Sie hierf r auf die Schaltfl che Report Zus tzlich k nnen Sie auch ein pdf Dokument erstellen oder den Report direkt ausdrucken Auswertung 15 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 12 Troubleshooting Problem L sung Software Meldung Warnung Die Signale des Biotinreferenzmarkers sind zu niedrig Dies kann ein Zeichen f r einen fehlgeschlagenen oder nicht ausgef hrten Konjugationsschritt sein oder das Enzym ist nicht mehr funktional Das System muss gestoppt werden Pr fen Sie das Enzym und oder Substrat Wiederholen Sie den Assay mit neuem Enzym Substrat Software Meldung keine Fehlerangabe ErrorCode 3011 Der Reader ist nicht richtig angeschlossen Halten Sie Esc f r 3 Sekunden gedr ckt und schlie en Sie den
18. for single use only o only for in vitro diagnostics Do not let the MutaCHIP dry out while performing the analysis The MutaCHIP is designed for the use with the MAAT and the software provided by PharmGenomics Perform all steps in a timely manner Keep all stock solutions cooled while working Always open the MutaCHIP with both hands Do not apply pressure to the tube 9 Sample Collection The template for PCR amplification is genomic DNA from EDTA whole blood The DNA concentration should be between 15 and 30 ng L The minimum DNA purity A260 A280 ratio should be higher than OD 260 280 1 8 For the assay high molecular freshly extracted DNA has to be used Sample Collection 7 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 10 Test Procedure 10 1 PCR Product Generation The table below shows the composition and pipetting scheme for one analysis of the DPYD gene per 25 L reaction To amplify all targets 4 reaction tubes are needed per assay one for each Master Mix All components should be pipetted in the same order as they are listed in the tables Master Mix 1 Component Volume per 25 L reaction DNA min 60 max 120 ng 4 L Primer Mix A green lid 8 L PCR H2O 0 5 L PCR Buffer incl Polymerase 12 5 L Master Mix 2 Component Volume per 25 L reaction DNA min 60 max 120 ng 4 L Primer Mix B yellow lid 6 L PCR H2O 2 5 L PCR Buffer incl Polymerase
19. iment Vergeben Sie einen beliebigen Namen f r das Experiment und speichern Sie es anschlie end indem Sie auf die Schaltfl che Speichern klicken Schritt 2 Analyseprozess starten Klicken Sie auf die Schaltfl che Start um die Datenanalyse zu starten 12 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 Schritt 3 Qualit tspr fung des MutaCHIPs Um ein einwandfreies Analyseergebnis zu erhalten muss zun chst die Bildqualit t des MutaCHIPs berpr ft werden Staubpartikel auf der Unterseite des MutaCHIPs k nnen die Analyse beintr chtigen Diese k nnen durch das s ubern mit einem weichen und feuchten Tuch entfernt werden Klicken Sie auf die Schaltfl che Analyse fortsetzen falls die Bildqualit t der in der oberen Abbildung entspricht Auswertung 13 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 Schritt 4 Genotypisierungsergebnisse Nach der vollst ndigen Datenanalyse k nnen Sie die Ergebnisse im Analysemodul Genotypisierungsmodul oder im Diagnosebericht abrufen Die dabei verwendete Symbole werden in der unten stehenden Tabelle erl utert Symbole der Software und ihre Bedeutung Der Patient tr gt auf beiden Allelen die gesunde Variante der untersuchten genetischen Variation Der Patient tr gt auf einem Allel die gesunde und auf dem anderen Allel die mutierte genetische Variation Der Patient tr gt auf beiden Allelen die mutierte genetische Variation in homozygoter Form Die Signalwerte d
20. imus 25 advanced o Thermoshaker with cooling function BIOR Mixing Block MB 102 Required Materials not provided pipettes o 0 1 2 5 L o 05 10 L o 10 200 L o 100 500 L 0 2 mL PCR tubes sterile 6 Storage and Shelf life All components are stored at 2 8 C The substrate has to be strictly protected against light exposure The bags contain each 5x MutaCHIPs with open lids After unsealing a bag the lids of the remaining MutaCHIPs have to remain open as the protection gas escapes The MutaCHIPs can be stored in the loosely not airtight closed do not use tape light protection bag up to several weeks and room temperature RT For storage choose a dry and dark place To avoid even minimal loss of performance we recommend using up one bag of MutaCHIPs within two weeks The MutaCHIPs have to be protected against direct exposure to sunlight and dust 7 Working Conditions Never centrifuge the MutaCHIPs Do not touch the surface of the MutaCHIPs with a pipette Use only substances that are mentioned in the protocol 6 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 8 Considerations and Precautions The guidelines and principles for working in a biomolecular laboratory have to be followed The test is suitable for genomic DNA freshly extracted from whole EDTA blood as starting material Only then optimal results are guaranteed Do not mix reagents from different lots The MutaCHIPs are o
21. ore click on the button Report Additionally a pdf document can be created or the report can be directly printed Evaluation and Interpretation of Results 15 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 12 Trouble shooting Problem Solution Software Message Warning The signals of the biotin reference markers are too low This could be a sign of a failed or missed conjugation step Alternatively the enzyme could be degraded The system will be stopped Check enzyme and or substrate Repeat the assay with new enzyme substrate Software Message Warning The signals of the DNA probes indicate a failed amplification However there might be a homozygous deletion of the CYP2D6 gene Please refer to the handbook under section Detection of 5 homozygous Please read paragraph 11 1 Software Message No error description ErrorCode 3011 The reader is not plugged in properly Keep Esc pressed for 3 seconds and plug in the reader in the right manner please refer to the user manual of the PGDx System Poor image quality Clean the bottom side of the MutaCHIP using a cotton swab or a cloth wet with disinfectant Repeat the photograph it can be necessary to repeat this procedure several times Blurred picture Carefully clean the camera with a cotton swab
22. probes In a washing step the unspecific fragments are removed from the surface Subsequently the Enzyme Mix is added to the MutaCHIP coupling with the probe target complex After addition of the substrate a precipitate will form This precipitate is then detected by the Image reader and the signals are e valuated by the software 4 Components Each test kit contains the following components for 20 MutaCHIP 5 FU assays and the instruction manual Description Size of Reaction Tube or Flask Number 5 FU Primer Mix A green lid 2 mL Reaction Tube 1 5 FU Primer Mix B yellow lid 2 mL Reaction Tube 1 5 FU Primer Mix C red lid 2 mL Reaction Tube 1 5 FU Primer Mix D blue lid 2 mL Reaction Tube 1 PCR Buffer incl Polymerase 2 mL Reaction Tube 1 Hybridisation Buffer 30 mL Reaction Tube 1 Washing Buffer 60 mL Plastic Flask 1 Blocking Powder 15 mL Plastic Flask 1 Blocking Buffer 60 mL Plastic Flask 1 Enzyme purple lid 2 mL Reaction Tube SSPE 15 mL Plastic Flask 1 Substrate 30 mL Plastic Flask 1 DNA Ref 1 M166V 2 mL Reaction Tube 1 MutaCHIPs 1 5 mL Reaction Tube 20 Instruction manual 1 Components 5 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 06 12 2012 5 Materials Required materials that can be ordered separately from PharmGenomics Macroarray Analysing Tools MAAT o Notebook DPYD Genotyping Software o MutaCHIP image reader o Thermocycler Peqlab Pr
23. timale Ergebnisse sichergestellt werden Mischen Sie keine Reagenzien aus unterschiedlichen Lots Die MutaCHIPs sind o nur f r den Einmalgebrauch bestimmt o nur zur in vitro Diagnostik zu verwenden Der MutaCHIP darf w hrend den Arbeitsschritten nicht austrocken Der MutaCHIP ist f r den Gebrauch mit dem MAAT und der dazugeh rigen Software von PharmGenomics ausgelegt Die Arbeitsschritte z gig durchf hren Alle Ausgangsl sungen w hrend des Arbeitens k hlen Das MutaCHIP Gef mit zwei H nden ffnen Dabei ist darauf zu achten dass kein Druck auf den MutaCHIP ausge bt wird 9 Probengewinnung Als Matrize f r die PCR Amplifikation dient genomische DNA aus EDTA Vollblut Die DNA Konzentration sollte zwischen 15 30ng l liegen Die Reinheit OD260 280 der DNA sollte h her als 1 8 sein F r den Assay darf nur hochmolekulare frisch extrahierte DNA verwendet werden Probengewinnung 7 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 10 Testdurchf hrung 10 1 PCR Produktherstellung Die unten stehenden Tabellen zeigen die Zusammensetzung f r eine Analyse des DPYD Gens pro 25 L Reaktionsansatz Master Mix 1 Bestandteil Volumen pro 25 L Reaktionsansatz DNA ca 60 120 ng 4 L Primer Mix A gr ner Deckel 8 L PCR H2O 0 5 L PCR Buffer inkl Polymerase 12 5 L Master Mix 2 Bestandteil Volumen pro 25 L Reaktionsansatz DNA ca 60 120 ng 4 L Primer Mix B g
24. usgelesen und bewertet 4 Kitbestandteile Jedes Testkit enth lt die folgenden Reagenzien zur Durchf hrung von 20 MutaCHIP 5 FU Assays sowie eine Gebrauchsanweisung Bezeichnung Gef gr e Menge Primer Mix A gr ner Deckel 2 mL Schraubgef 1 Primer Mix B gelber Deckel 2 mL Schraubgef 1 Primer Mix C roter Deckel 2 mL Schraubgef 1 Primer Mix D blauer Deckel 2 mL Schraubgef 1 PCR Buffer inkl Polymerase 1 5 mL Schraubgef 1 Hybridisation Buffer 30 mL Plastikgef 1 Washing Buffer 60 mL Plastikgef 1 Enzyme lila Deckel 2 mL Schraubgef mit 500 L Einsatz 1 Blocking Powder 15 mL Plastikgef 1 Blocking Buffer 60 mL Plastikgef 1 SSPE 15 mL Plastikgef 1 Substrate 30 mL Plastikgef braun 1 DNA Ref 1 M166V 2 mL Schraubgef 1 MutaCHIPs 1 5 mL Gef 20 Gebrauchsanweisung 1 Kitbestandteile 5 2012 Immundiagnostik AG Version 3 0 04 12 2012 5 Erforderliche Materialien Ben tigte Ger te von PharmGenomics erh ltlich Macroarray Analysing Tool MAAT o Notebook DPYD Genotyping Software o MutaCHIP Imagereader o Thermocycler f r PCR Peqlab Primus 25 advanced o Thermomixer mit K hlfunktion BIOR Mixing Block MB 102 Ben tigte Ger te und Verbrauchsmaterialien nicht mitgeliefert Pipetten o 0 1 2 5 L o 0 5 10 L o 10 200 L o 100 500 L 0 2 ml PCR Gef e steril 6
Download Pdf Manuals
Related Search