SeroCP™ IgG - Savyon Diagnostics Ltd
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1. Cos Cu SeroCP IgG Imuno ensaio Enzim tico ELISA para a detec o de anticorpos IgG espec ficos de Chlamydia pneumoniae no soro humano Manual de Instru es Kit para 96 determina es N mero de cat logo A191 01M Kit para 192 determina es N mero de cat logo B191 01M Para ser utilizado em Diagn stico In Vitro Conservar a 2 8 C N o congelar Savyon Diagnostics Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Uso Indicado O Kit SeroCPTM IgG indicado para a detec o de anticorpos IgG espec ficos para Chlamydia pneumoniae no soro humano O kit SeroCPTM IgG um Imuno ensaio Enzim tico ELISA qualitativo que utilizado no diagn stico de infec es por Chlamydia pneumoniae Para ser utilizado em Diagn stico In Vitro Introdu o Chlamydia pneumoniae TWAR um agente infeccioso emergente com um espectro de manifesta es cl nicas que incluem infec es do tracto respirat rio superior e inferior 1 A maioria das infec es por C pneumoniae s o moderadas e assintom ticas mas podem no entanto causar doen as graves como faringite sinusite bronquite aguda a pneumonia adquirida por via comunit ria Infec es n o detectadas e n o tratadas podem conduzir a doen as prolongadas e persistentes Dados recentes indicam uma poss vel associa o entra e infec o por2. Dentro de cada Ensaio R plicas M dio 1 196 3 8 0 160 4 6 Entre Ensaios N de Valor VC R plicas M dio 1 152 5 9 0 165 6 4 Bibliografia 1 Myhra W Mordhors C H Wang S P Grayston J T 1990 Clinical features of Chlamydia pneumoniae strain TWAR infection in Denmark CE us 1975 1987 In Bowie WR Caldwell HD Jones RP et al eds Chlamydial infections Cambridge K European Authorized Representative Obelis s a Av De Tervuren 34bte 44 B 1040 Brussels Cambridge University Press 422 425 Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 2 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E mail mail obelis net Mobile 32 475 45 46 60 E Ekman M R Manninen V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk factor for coronary 02 04 11 M191 01P 5
3. E Microplaca revestida com antig nios de C pneumoniae 96 po os separ veis 8x12 revestidos com antig nios de C pneumoniae embalados numa bolsa de alum nio contendo um cart o dessecante 1 Placa Tamp o de Lavagem Concentrado 20X Um tamp o de PBS Tween 1 Frasco 100ml Diluente de Soro azul Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 proclina como conservante 1 Frasco 30ml Diluente do Conjugado verde Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 proclina como conservante 1 Frasco 40ml Controlo Negativo Soro humano negativo para IgG contra C pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 de proclina e menos de 0 1 de Azida de S dio como conservantes 1 Frasco 2 5ml Controlo Positivo Soro humano positivo para IgG contra C pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 de proclina e menos de 0 1 de Azida de S dio como conservantes 1 Frasco 2ml Conjugado HRP Concentrado 300X Anti IgG humana espec fica para a cadeia gama conjugada com Peroxidase de R bano HRP Cont m menos de 0 05 de proclina como preservantes 1 Frasco 0 2ml 02 04 11 M191 01P 8 9 10 Cobertura da Placa Substrato TMB Solu o pronta a usar Cont m 3 3 5 5 tetrametilbenzidina como cromog nio e per xido como substrato 1 Garrafa 14ml Solu o de Paragem Solu o pronta a usar Cont m H gt SO 1M 1 Garrafa 15ml 1 unidade 11 Manual de Instru es 1 Kit
4. 50ul de conjugado dilu do em cada po o 13 Cobrir as tiras com a cobertura da placa e incubar durante 1h a 37 C numa c mara h mida 14 Rejeitar o conte do l quido e lavar como acima descrito nos passos 9 e 10 D Incuba o com o Substrato TMB 15 Dispensar 100ul de Substrato TMB em cada po o cobrir as tiras com a cobertura da placa e incubar temperatura ambiente por 15 minutos 16 Parar a reac o adicionando 100ul de Solu o de Paragem H gt SO 1M a cada po o E Determina o dos Resultados 17 Determinar a absorv ncia a 450nm e registar os resultados A determina o dos resultados n o dever exceder 30 minutos ap s a paragem da reac o cromog nica Nota Quaisquer bolhas de ar devem ser removidas antes da leitura O fundo da placa de ELISA dever ser limpo cuidadosamente Interpreta o dos Resultados Valida o do Teste Para que o teste seja v lido os seguintes crit rios devem ser satisfeitos Se estes crit rios n o forem satisfeitos o teste dever ser considerado inv lido e ser repetido 1 Controlo Positivo O valor de absorv ncia deve ser gt 0 8 a 450nm 2 Controlo Negativo O valor de absorv ncia m dia do Controlo Negativo deve ser 0 1 lt CN lt 0 4 a 450nm C lculo do Valor de Cut Off VCO e do ndice de Cut Off ICO O valor de cut off calculado de acordo com a seguinte formula VCO CNx2 CN A absorv ncia m dia
5. Teste para 192 Determina es Cat No B191 01M 1 10 Cobertura da Placa Diluente de Conjugado verde Microplaca revestida com antig nios de C pneumoniae 96 po os separ veis 8x12 revestidos com antig nios de C pneumoniae embalados numa bolsa de alum nio contendo um cart o dessecante 2 Placas Tamp o de Lavagem Concentrado 20X Um tamp o de PBS Tween 2 Frascos 100ml cada Diluente de Soro azul Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 proclina como conservante 1 Frasco 60ml Solu o tamp o pronta a usar Cont m menos de 0 05 proclina como conservante 1 Frasco 80ml Controlo Negativo Soro humano negativo para IgG contra C pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 de proclina e menos de 0 1 de Azida de S dio como conservantes 1 Frasco 2 4ml Controlo Positivo Soro humano positivo para IgG contra C pneumoniae pronto a usar Cont m menos de 0 05 de proclina e menos de 0 1 de Azida de S dio como conservantes 1 Frasco 1 25ml Concentrado de conjugado HRP 300X Anti IgG humana espec fico para a cadeia gama conjugada com Peroxidase de R bano HRP Cont m menos de 0 05 de proclina como conservante 1 Frasco 0 2ml Substrato TMB Solu o pronta a usar Cont m 3 3 5 5 tetrametilbenzidina como cromog nio e per xido como substrato 1 Frasco 24ml Solu o de Paragem Solu o pronta a usar Cont m H2S0 1M 1 Frasco 30ml 2 unidade
6. de Lavagem adicionar 50ml do Tamp o de Lavagem Concentrado a 950ml de gua destilada ou bi desionizada B Incuba o de amostras de soro e controlos 5 Diluir cada soro de paciente numa propor o de 1 105 com o Diluente de Soros fornecido do seguinte modo Adicionar 10ul do soro do paciente a 200ul de Diluente de Soros 1 21 e em seguida diluir novamente adicionando 25ul da dilui o 1 21 a 1004 de Diluente de Soros 6 Dispensar 50ul do Controlo Positivo Controlo Negativo e dos soros dilu dos de 1 105 em po os separados da tira de teste O Controlo Negativo deve ser pipetado para dois po os separados 7 Cobrir as tiras com a cobertura da placa e incubar por 1h a 37 C numa c mara h mida 8 Rejeitar o conte do l quido dos po os 9 Passo de Lavagem Encher completamente cada po o com Tamp o de Lavagem 300 350ul e rejeitar o l quido repetindo este passo tr s vezes 10 Secar as tiras e o suporte batendo as gentilmente contra papel absorvente limpo C Incuba o com o conjugado 11 0 concentrado de Anti IgG humana conjugado com HRP deve ser dilu do para a solu o de trabalho pouco antes de ser usado Diluir o concentrado de Anti IgG humana conjugada com HRP numa propor o de 1 300 com diluente do conjugado Por exemplo para duas tiras preparar um m nimo de 3ml de conjugado HRP 10ul de concentrado de Anti IgG humana conjugada com HRP adicionado a 3ml de Diluente do Conjugado 12 Dispensar
7. recorrendo a t cnicas standard Soros inactivados por calor n o dever o ser usados N o recomend vel o uso de soros lip micos t rbidos ou contaminados Part culas ou precipitados nos soros podem causar resultados err neos Este tipo de amostras deve ser clarificado por centrifuga o ou filtra o antes do teste 02 04 11 M191 01P Conserva o de Amostras As amostras devem ser conservadas entre 2 a 8C e testadas em 7 dias a adi o 0 1 de Azida de S dio altamente recomendada Se um per odo de conserva o maior for antecipado congelar al quotas a temperaturas iguais ou inferiores a 20 C Evitar descongela es e congela es repetidas Procedimento do teste A Prepara o dos Reagentes 1 Deixar todos os componentes e amostras cl nicas a testar atingir a temperatura ambiente Misturar bem o Controlo Positivo Controlo Negativo e amostras cl nicas antes da sua utiliza o 2 Determinar o n mero total de amostras a testar Para al m das amostras devem ser inclu dos em cada teste dois po os de Controlo Negativo e um po o de Controlo Positivo 3 Retirar a microplaca da bolsa de alum nio cortando uma extremidade pr xima do selo Deixar o n mero necess rio de tiras de acordo com o total de amostras a testar na placa de 96 po os 4 Diluir o Tamp o de Lavagem Concentrado 1 20 com gua destilada ou bi desionizada Por exemplo para preparar um litro de Tamp o
8. C pneumoniae e doen as cr nicas 2 A seropreval ncia de C pneumoniae entre crian as reduzida aumentando acentuadamente at meia idade e permanece alta at velhice gt 50 Dificuldades na recolha da amostra e inacessibilidade ao local de infec o afectam seriamente a utilidade dos m todos de detec o directa Assim testes serol gicos s o usados rotineiramente e funcionam como uma ferramenta n o invasiva na identifica o de infec es quer distais quer cr nicas por Clam dia 3 onde os m todos de detec o directa raramente s o eficientes 4 Para al m disso a presen a de certos tipos de anticorpos poder tamb m indicar o estado da doen a 02 04 11 M191 01P A infec o prim ria por Clam dia caracterizada por uma resposta predominante de IgM em 2 a 4 semanas e uma resposta retardada de IgG e IgA em 6 a 8 semanas Depois de infec es agudas por C pneumoniae os anticorpos IgM desaparecem geralmente em 2 a 6 meses 5 os t tulos de anticorpos IgG normalmente decrescem lentamente enquanto que anticorpos IgA tendem a desaparecer rapidamente 6 Quando existem suspeitas de infec o prim ria por clam dia a detec o de IgM altamente diagnostic vel 7 No entanto em infec es recorrentes ou cr nicas a preval ncia de IgM reduzida e por isso a aus ncia de IgM n o exclui necessariamente uma infec o em curso Em re infec es os n veis de IgG e IgA aumentam rapidame
9. a 450nm do Controlo Negativo corrido em duplicado De modo a normalizar os resultados obtidos em testes diferentes o ndice de cut off calculado de acordo com a seguinte formula Absorv ncia da amostra de soro a 450nm ICO VCO 02 04 11 M191 01P Tabla 1 Absorv ncia ICO Resultado 450nm Negativo Anticorpos O D lt VCO lt 1 0 IgG n o detect veis Indetermi nado VCO lt O D lt 1 1 1 N veis 1 1xVCO baixos de anticorpos IgG Positivo O D gt 1 1x gt 1 1 n veis de VCO anticorpos IgG relevantes Interpreta o do Diagn stico Nenhuma indica o de infec o corrente por C pneumoniae Indica o de poss vel exposi o a C pneumoniae E requerido um segundo teste a amostra ap s 2 4 semanas Indica o de infec o corrente ou passada por C pneumoniae Quando se testar uma segunda amostra devem ser testadas em simult neo a primeira e a segunda amostras Se um resultado indeterminado obtido novamente a amostra deve ser considerada negativa De modo a diferenciar entre infec es correntes e infec es cr nicas recomendada a colheita de uma segunda amostra ap s 2 Se o ICO da segunda amostra aumentar em pelo menos a 4 semanas 40 tal indica uma infec o corrente Para obter um perfil de anticorpos mais abrangente IgA e IgM devem ser tamb m testados Tabla 2 Interpreta o de resultados baseada nas combina es de an
10. anas mucosas Evitar o contacto directo 3 Todos os componentes deste kit foram calibrados e testados por lote N o recomend vel misturar componentes de lotes diferentes pois tal pode afectar os resultados 4 Acido sulf rico dilu do H2SO4 1M um agente irritante para os olhos e a pele Em caso de contacto com os olhos lavar imediatamente a rea com gua e consultar um m dico Armazenamento e Validade dos Reagentes 1 Todos os reagentes fornecidos devem ser guardados entre 2 a 8 C Os frascos de reagentes n o abertos s o est veis at data limite de validade indicada na embalagem do kit A exposi o de componentes fechados de origem ou selados temperatura ambiente por algumas horas n o deteriorar os reagentes N O CONGELAR 2 Uma vez aberto o kit deve ser utilizado dentro de 90 dias 3 Tiras n o utilizadas devem ser seladas de novo na bolsa de alum nio com o cart o dessecante enrolando a extremidade aberta e selando completamente com fita por cima de toda a extens o da abertura 4 Poder se o formar cristais no Tamp o de Lavagem concentrado 20X durante armazenamento a baixas temperaturas Isto perfeitamente normal Os cristais ser o redissolvidos aquecendo o tamp o a 37 C antes da dilui o Uma vez dilu da a solu o pode ser guardada entre 2 a 8 C por um per odo de vinte e um dias Recolha de Soro Preparar soros a partir de amostras recolhidas assepticamente
11. azy Elbhar M Thibon M Caracter sticas de Desempenho Revol C and Akue B A 1994 Post therapeutic evolution of serum chlamydia antibody titers in women Tabla3 with acute salpingitis and tubal infertility Fertility and Compara o do SeroCP IgG com teste de Sterility 62 No 3 microimunofluorescencia MIF in house 6 Saikku P Matila K Nieminen M S Huttunen J K Leinon M Eckman M R Makela P H and Valtonen O SeroCP IgG foi avaliado comparativamente a testes MIF V 1988 Serological Evidence of an Association of a realizados in house Novel Chlamydia TWAR with Chronic Coronary Heart O estudo foi efectuado num centro m dico usando 63 Disease and Acute Myocardial Infarction Lancet 2 amostras de soro de doentes sintom ticos e 35 amostras de 983 986 soro de indiv duos saud veis 7 Grayston J T Cambell L A Mordhorst C H Saikku P Thom D and Wang S P 1989 A New Total Respiratory Pathogen Chlamydia pneumoniae Strain TWAR J Inf Dis 161 618 625 SeroCPTM 8 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki Positivo 61 E Ekman M R Mannin V Manttari M Frick M H Negativo 37 and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia 98 pneumoniae Infections as a Risk Factor for Coronary Heart Disease in the Helsinki Heart Study Ann of Int Sensibilidade 60 63 x 100 95 Med 116 2 37278 Especificidade 34 35 x 100 97 Concord ncia Global 94 98 x 100 96 Precis o
12. nte com frequ ncia em uma a duas semanas 8 Anticorpos IgA mostraram ser um marcador imunol gico fi vel de infec es prim rias cr nicas e recorrentes Normalmente estes anticorpos baixam rapidamente para n veis basais no seguimento do tratamento e erradica o das infec es de Clamidia 3 A persist ncia de t tulos elevados de anticorpos IgA geralmente considerada como um sinal de infec o cr nica 6 Os anticorpos IgG persistem por longos per odos e declinam muito lentamente Deste modo a presen a de anticorpos IgG sobretudo indicativa de uma infec o de clam dia numa altura indeterminada Contudo um aumento de quatro vezes em IgG ou n veis altos de anticorpos IgG podem indicar uma infec o cr nica em curso SeroCPTM um ensaio baseado em ELISA no qual corpos elementares de C pneumonaie TWAR 183 purificados s o usados como antig nios para detectar a resposta de anticorpos em humanos Para o diagn stico completo de infec es correntes cr nicas ou passadas recomendada a determina o de anticorpos IgG IgM e IgA contra C pneumoniae Principio do Teste S o fornecidas Placas SeroCPTM revestidas com antig nios de corpos elementares de C pneumoniae TWAR 183 purificados Osoro a ser testado dilu do e incubado na placa SeroCPTM por 1h a 37 C Neste passo os anticorpos de C pneumoniae ligar se o aos antig nios imobilizados Anticorpos n o espec ficos s o removidos duran
13. s 11 Manual de Instru es 1 Materiais Necess rios mas n o Fornecidos 1 o AOV Or Tubos de teste limpos para dilui o dos soros dos pacientes Frasco de pl stico descart vel conjugado HRP concentrado Micropipetas ajust veis ou pipetas de multicanais gamas de 5 50 50 200 e 200 1000il e pontas descart veis Frasco volum trico de um litro Uma proveta de 50ml Garrafa de lavagem Papel absorvente para dilui o do 8 Vortex 9 Banho de gua a 37 C com tampa ou uma c mara h mida colocada numa incubadora a 37 C 10 Leitor de ELISA com filtro de 450nm 11 Agua destilada ou bi desionizada Advertencias e Precau es Para utiliza o em Diagnostico In Vitro 1 Este Kit cont m soros humanos os quais foram testados com t cnicas aprovadas pela FDA amp CE e foram dados como negativos para HbsAg e para anticorpos contra HCV e VIH 1 amp 2 Visto que nenhum m todo conhecido pode fornecer a garantia completa que produtos derivados de sangue humano n o transmitam infec es todos os componentes de sangue humano fornecidos neste kit devem ser manuseados como soro ou sangue potencialmente infecciosos de acordo com as recomenda es publicadas no manual do CDC NIH Biosafety in Micro Biological and Biomedical Laboratories Bioseguran a em Laborat rios Microbiol gicos e Biom dicos 1998 2 A solu o do Substrato TMB um material irritante para a pele e membr
14. te as lavagens Anti IgG humana conjugada com Peroxidase de R bano HRP adicionada e incubada por 1h a 37 C Neste passo o Conjugado HRP liga se aos complexos antig nio anticorpo previamente ligados O conjugado n o ligado removido durante as lavagens Com a adi o do substrato TMB o substrato hidrolizado pela peroxidase gerando uma solu o azul do substrato reduzido Com a adi o da Solu o de Paragem a cor azul torna se amarela e dever ser lida num leitor de ELISA a um comprimento de onda de 450nm A absorv ncia proporcional quantidade de anticorpos espec ficos que se encontram ligados aos antig nios do revestimento Procedimento do Ensaio Adicionar 2x50ul de Controlo Negativo 1x50ul de Controlo Positivo e amostras dilu das 1 105 aos po os das microplacas revestidos com antig nios de C pneumoniae Cobrir a placa e incubar por 1h a 37 C com 100 de humidade Lavar 3 vezes com Tamp o de Lavagem 300 350ul v Adicionar 50ul de Conjugado HRP dilu do 1 300 Cobrir a placa e incubar por 1h a 37 C com 100 de humidade Lavar 3 vezes com Tamp o de Lavagem 300 350u Adicionar 100ul do Substrato TMB Cobrir a placa e incubar 15 min temperatura ambiente y Adicionar 100 ul de Solu o de Paragem y Ler absorv ncia a 450nm 4 Calcular e interpretar os resultados Conte do do Kit Kit para 96 determina es N mero de cat logo A191 01M
15. ticorpos IgG IgA e IgM N veis de anticorpos anti Interpreta o C pneumoniae dos Resultados IgM IgG IgA Nenhuma Negativo Negativo Negativo indica o de infec o por C pneumoniae Negativo Negativo Indica o de Positivo ou ou infec o Positivo Positivo corrente Indica o de Negativo Positivo Negativo infec o passada ou corrente Positivo Indica o de Negativo ou Positivo infec o Negativo corrente ou cr nica Limita es do Teste heart disease in the Helsinki heart study Ann Intern Med 116 273 278 3 Sarov l Kleinman D Cevenini R Hocberg G Potashnik G Sarov B and Insler V 1986 Specific IgG and IgA antibodies to Chlamydia trachomatis in infertile women In J Fertil 31 3 193 197 4 Campbell L A 1993 PCR detection of Chlamydia 1 Nenhum teste serol gico isolado dever ser usado para um diagn stico definitivo Todos os dados cl nicos e laboratoriais devem ser tomados em linha de conta 2 Amostras obtidas demasiado cedo durante infec o prim ria podem n o ter anticorpos detect veis Se se suspeita de uma infec o a Clamidia uma segunda pneumoniae In Diagnostic Molecular Microbiology anost deve ser obtida ap s 2 a 4 semanas e sada Principles and Applications Persing D H Smith T F em paralelo com a amostra original a F C and White T J Eds ASM Press pp RT 5 Henry Suchet J Askien
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