Kit EBV Q-PCR Alert - Cód. RTS020 e STD020
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1. A a M H eA Rev 04 Dez 2013 neutralizados antes da elimina o N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagentes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar as instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante N o intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s2. programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia VIC a 0 1 Os valores de fluoresc ncia emitidos pelas sondas espec ficas para EBV na rea o de amplifica o e o valor Threshold permite determinar o cT ciclo Threshold o ciclo em que a fluoresc ncia atinge o valor Threshold Na rea o de amplifica o do controle positivo o valor de cT para a probe espec fica para EBV usado para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte cT do Controle Positivo EBV FAM cT lt 25 POSITIVO CORRETO Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle Positivo cT gt 25 ou indeterminado a presen a do DNA alvo n o foi corretamente detectada Isto significa que problemas podem ter ocorrido durante amplifica o ou detec o que podem ter levado a resultados incorretos A sess o n o v lida e precisa se repetida desde o passo de amplifica o Quando este produto usado para quantifica o do DNA do EBV utilizam se as rea es dos Standard ao inv s do Controle Positivo Neste caso a valida o da rea o feita pelo Standard Na rea o de amplifica o do controle negativo o valor de cT da probe espec fica para EBV usado para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela a seguir Resultado do teste Amplifica o Ct do Controle Negativo EBV FAM Indeterminado NEGATIVO CORRETO Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negati
3. RTSO76 M 80298490100 RTSO76 P 80298490040 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprovado por 24 12 2013 Maur cio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon zs BIOMETRIX oracn stica BEBE Rev 04 Dez 2013 STDO20 EBV Q PCR Standard Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto EBV Q PCR Standard destinado ao uso como um controle positivo e como padr o de quantidade conhecida de DNA para obter uma curva padr o em ensaios de amplifica o em tempo real para detec o e dosagem do DNA do EBV com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER EBV Q PCR Alert AmpliMIX e EBV Q PCR Alert AmpliPROBE da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto Q PCR Standard inclui quatro solu es de plasm deos estabilizadas com titula o conhecida contendo a sequ ncias requeridas divididas em dois tubos de al quotas prontas para uso O procedimento envolve o uso do Q PCR Standard na rea o de amplifica o em tempo real espec fica para uma regi o g nica que codifica a prote na EBNA 1 do EBV A detec o do produto espec fico durante a rea o de amplifica o em tempo real confirma a habilidade de identificar a presen a do DNA do EBV e permite o c lculo da curva padr o O kit possibilita a execu o de 16 sess es de an lise separadas A concentra o inicial do padr o foi determinada por espec
4. ncia de 100 Ve 100 uL Va 5 uL Nc gEq 100 000 c lulas 100 x Quantity 5x5x1 0 Nc gEq 100 000 c lulas 4 x Quantity Quando o kit Extracell usado e o resultado requerido em gEq extra o omitindo o termo Vc a f rmula fica Rev 04 Dez 2013 Vc omitido Ee 1 0 significa efici ncia de 100 Ve 100 uL Va 5 uL Nc gEq extra o 100 x Quantity 5x1 0 Nc gEq extra o 20 x Quantity C lculo de medi o dos limites Quando m todo particular de extra o usado os limites de medi o em gEq mL da amostra devem ser calculado a partir do limite de medi o linear da rea o de amplifica o de acordo com as f rmulas Limite inferior gEq extracao Ve x 10 gEq Vc x Va x Ee Limite superior gEq extracao Ve x 1 000 000 gEq Vc x Vax Ee Quando o kit Extracell usado a f rmula fica Limite inferior gEq mL 4 x 10 gEq Limite superior gEq mL 4 x 1 000 000 gEq LIMITAC ES DO PROCESSO Usar somente DNA extra do das seguintes amostras humanas com este produto sangue total colhido em EDTA suspens es de leuc citos suspens es de linfomon citos N o utilizar com este produto o DNA extra do das amostras heparinizadas A heparina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados inv lidos N o utilizar com este produto DNA extra do contaminado com hemoglobina Esta subst ncia inib
5. 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix amp biometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490053 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprovado por 24 12 2013 Maur cio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon 20 WORKSHEET 12 11 10 ATTACHMENT
6. as sequ ncias disponiveis no banco de dados de organismos diferentes que o EBV inclu ndo o genoma completo do HHV8 o virus de herpes humana que mais similar ao EBV mostrou a sua especificidade e a aus ncia de homologias significativas Especificidade diagn stica amostras negativas A especificidade diagn stica do teste como confirma o das amostras cl nicas negativas foi testada analisando um n mero de amostras de sangue total negativos para o DNA de EBV e o resultado foi maior que 90 A especificidade diagn stica foi avaliada utilizando uma s rie de 10 amostras de sangue total coletado em EDTA que eram negativos para o DNA de EBV Cada painel de amostra foi usado para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N Negativos Positivos Leuc citos de sangue total 10 10 0 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS ABERLE S W et al 2002 J Clin Virology 25 S79 S85 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix amp biometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia Rev 04 Dez 2013 REGISTRO ANVISA
7. aumento da rea o de amplifica o do produto espec fico e medido e registrado pelo equipamento A an lise de dados torna poss vel determinar a presen a e o t tulo de DNA EBV na amostra inicial Assay Chemistry Summary MD Forward Primer Probe S C y O Quencher Reporter Minor Grove Binder Q Na MGB naa AmpliTaq a O Gold DNA Polymerase Non Target Template Target Template mm BIOMETRIX DIAGN BSTICA Rev 04 Dez 2013 A partir do momento que a probe TaqManG for ligada parte espec fica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers se anelam ao DNA A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a probe TaqMan amp do DNA gabarito Isso separa o quencher do rep rter e permite ao rep rter emitir sua energia Isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnaturac o e anelamento mais oportunidades a TaqManG ter de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada O corante do rep rter liberado liberado da dupla fita de DNA criada JR e pela Taq Polimerase Longe do corante nucleotides O 4 from TaqMan quencher a luz emitida do corante Lg Es Ao rep rter dye em estado excitado pode agora ser observada 3 complementary strand A padroniza o do sistema foi realizado nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 3 tem
8. e a Curva Padr o da sess o de amplifica o s o utilizados para calcular a Quantidade Quantity de DNA alvo presente nas reac es de amplifica o das amostras Este kit est em condi es de dosar entre 10 a 1 000 000 c pias de DNA do gene que codifica a prote na EBNA 1 do EBV por rea o de amplifica o correspondente ao genoma Equivalente por rea o Resultado da amostra EBV FAM Genoma Equivalente de EBV por rea o Quantity gt 1 x 10 SUPERIOR A 1 000 000 1x 10 lt Quantity lt 1 x 10 Quantity Quantity 1 x 10 INFERIOR A 10 Os resultados Quantity de cada amostras s o usados para calcular o genoma Equivalente de EBV presente na amostra extra da Nc de acordo com a f rmula Nc Ve x Quantity Vc x Va x Ee Onde e Vc a quantidade de amostra usada na extra o expresso em mL e Ee a efici ncia da extra o expressa em d cimos e Ve o volume total do produto da extra o expresso em uL e Va o volume do produto da extra o usado na rea o de amplifica o expresso em uL e Quantity o resultado da rea o de amplifica o da amostra expresso em gEq por rea o Quando o kit Extracell usado o DNA extra do de 500 000 c lulas de acordo com as instru es de uso e resultado requerido em gEq 100 000 c lulas a f rmula fica Vc 5 500 000 c lulas s o equivalentes a 5 unidades de medi o de 100 000 c lulas Ee 1 0 significa efici
9. ficos Os tubos contendo Q PCR Standard podem ser congelados e descongelados por no m ximo 8 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo Q PCR Standard apresenta as seguintes advert ncias S S 23 25 N o inalar vapores Evitar contato com os olhos PROCEDIMENTO O produto EBV Q PCR Standard deve ser usado com a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER EBV Q PCR Alert AmpliMIX e EBV Q PCR Alert AmpliPROBE Q PCR Standard est pronto para o uso portanto deve ser usado adicionando 5uL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o em tempo real em uma microplaca com termociclador com sistema tico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso dos produtos EBV Q PCR Alert AmpliMIX bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento em E OE TrAIX FE Rev 04 Dez 2013 Nota Q PCR Standard pode ser congelado e descongelado por no m ximo 8 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo REFER NCIAS ABERLE S W et al 2002 J Clin Virology 25 S79 S85 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel
10. o Desnatura o inicial 95 C 10 min 95 C 15 seg 45 ciclos 60 C 1 min b Preparac o da amplificac o Antes de iniciar necess rio retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar Centrifugar os tubos para que o material ap s descongelamento desca para o fundo do tubo e mant los em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necess rios para o processo lembrando que o conte do de cada tubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que os reagentes ap s o descongelamento que estejam na parede descam para o fundo do tubo e mant los em gelo retirar e descongelar um n mero de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX Repetir o pulso nesses tubos para que seu conte do desca para o fundo do tubo Mant los em gelo retirar tantos tubos de AmpliMASTER quantos os tubos de AmpliMIX Escrever EBV e a data no tubo com caneta com tinta permanente Aplicar um pulso nos tubos para que os reagentes depois de descongelados descam para o fundo do tubo Mant los em gelo Rev 04 Dez 2013 retirar e descongelar os tubos de AmpliSTANDARD necess rios Aplicar um pulso nos tubos para que os reagentes depois de descongelados descam para o fundo do tubo Mantenha em gelo se necess rio cortar a placa de amplifica o para separar a parte que ser utilizada no ensaio tomando o devido cuidado de manipul la com luv
11. Instru es de Uso Este produto requer pessoal instru do para as manipula es de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer roupa de trabalho EPI e rea de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para o procedimento de biologia molecular como a extra o a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos Este produto requer uma rea separada para a extra o prepara o das reac es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos reas de pr e p s PCR Este produto requer o uso de roupas de trabalho EPI e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de EBV n o est detectado no DNA extra do da amostra mas n o poss vel descartar que o DNA de EBV esteja presente a uma titula o inferio
12. NA gen mico muito maior que aprox 150 000 c lulas aprox 1 ug dentro da rea o de amplifica o com 5uL de DNA extra do para prevenir a possibilidade de inibi o As amostras biol gicas a serem usadas para a extra o de DNA precisam ser coletadas e armazenadas conforme descrito abaixo Sangue total coletado em EDTA precisa ser armazenado em 2 8 Cpor no m ximo 3 dias suspens es de leuc citos e linfomon citos em solu o fisiol gica est ril ou PBS est ril precisa ser armazenado a 2 8 Cpelo prazo m ximo de 4 horas recomendado aliquotar as amostras em menores volumes em diversos frascos no sentido de prevenir ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento Instru es para pr tratamento de amostras cl nicas quando aplic vel e para a extra o de DNA est o contidas no Manual de Instru es do kit EXTRAcell amp Subst ncias interferentes O DNA extra do da amsotra inicial n o deve conter heparina ou hemoglobina para poder previnir problema de inibi o e a possibilidade de resultados inv lidos frequentes N o h dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antivirais quimioter picos ou imunosupressores PROCESSO DE MEDI O a Preparo da etapa de amplifica o real time rea de p s PCR Antes de iniciar consultar o manual do equipamento e checar se RT PCR est em condi es de energizar os fluor filos Fam e VIC das probes e se
13. PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para
14. Rev 04 Dez 2013 RTSO20 EBV Q PCR Alert Kit Instruc es de Uso USO PRETENDIDO O kit EBV Q PCR Alert Kit serve para teste quantitativo por amplifica o dos cidos nucleicos para a detec o e dosagem do DNA do Virus Epstein Barr de Herpes humana EBV em amostras de DNA extra das do sangue total colhido em EDTA suspens es de leuc citos suspens es de linfomon citos O produto empregado juntamente aos dados cl nicos e a outros exames de laborat rio nos diagn sticos e no monitoramento da infec o da EBV PRINC PIO DE AC O E REAC O O procedimento envolve uma rea o de amplifica o em tempo real em microplaca em um equipamento com termostato program vel fornecido com sistema tico de detecc o fluorescente RT PCR termociclador em tempo real Em cada poco uma rea o de amplifica o realizada para uma regi o do gene que codifica a prote na EBNA 1 do EBV e para uma regi o do gene da beta globulina humana com controle de inibi o interno adequado amostra usando um DNA extra do de amostras a serem testadas Uma probe espec fica para EBV marcada com fluor foro FAM ativada quando hibridizada com produto espec fico da reac o de amplificac o do EBV Outra probe espec fica para o gene da beta globulina humana marcada pelo fluoroforo VIC ativada quando hibridizada com o produto da rea o de amplifica o para o gene da beta globulina humana A emiss o fluorescente aumenta com o
15. abalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transfira materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec
16. anal tica Precis o O estudo da precis o do teste entendido como variabilidade dos resultados obtidos com diferentes repeti es de uma amostra com mesma concentra o analisada durante uma mesma sess o permitiu determinar um Coeficiente de Varia o CV de 15 4 dentro de uma faixa linear de 10 mol culas 5 pL a 10 mol culas 5 pL Sensibilidade anal tica Exatid o O estudo da exatid o do teste que a diferen a entre os resultados m dios obtidos em uma nica sess o em diferentes repeti es de uma amostra com a mesma concentra o e o valor te rico de concentra o da amostra permitiu determinar uma inexatid o m dia de 9 5 dentro de uma faixa linear de 10 mol culas 5 uL a 10 mol culas 5 pL Sensibilidade diagn stica efici ncia de detec o nos diferentes gen tipos subtipos A sensibilidade diagn stica do teste como efici ncia de detec o nos diversos gen tipos subtipos foi avaliada pelo copara o de sequ ncias com banco de dados de nucleot dicos O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o dos primers de oligonucleot deos do AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncias dispon veis no banco de dados do gene que codifica a prote na EBNA 1 de EBV demonstrou sua conservac o e a aus ncia de mutac es significativas Sensibilidade diagn stica amostras positivas A sensibilidade diagn stica do teste confirmando amostras cl nicas positivas foi t
17. as sem talco e de n o causar danos aos po os durante o corte separa o 1 Transferir 100 uL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 pL na mistura 2 Transferir 100 uL de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 pL na mistura 3 Misturar em Vortex a baixa velocidade por 5 segundos evitando produ o de espuma 4 Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que todo l quido escorra para o fundo do tubo 5 Transferir 20 uL da mistura de rea o obtida para o fundo de cada po o na placa de rea o de amplifica o conforme pr elaborado na planilha OBS Caso n o seja utilizada toda a mistura de reagentes que foi elaborada este tubo identificado como EBV poder ser armazenado no escuro a 20 C por no m ximo um m s contanto que esta mistura seja congelada e descongelada somente uma vez 6 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo poco 5 uL de DNA extra do conforme posi o definida na planilha elaborada 7 Transferir depositando cuidadosamente no fundo do poco de controle negativo 5 uL de gua ultrapura 8 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo poco 5uL AmpliSTANDARD 10 c pias conforme posi o definida na planilha elaborada na mistura de rea o Proceder de igual modo tomando se o cuidado de dispensar cada qual em seu po o 5 pL de A
18. e a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos podendo causar resultados inv lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fenomenos de inibi o por parte dos medicamentos antivirais quimioter picos ou imuno supressores Os resultados obtidos com este produto dependem de procedimentos corretos de coleta transporte conserva o e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos O m todo de amplifica o Real Time dos cidos nucleicos utilizados neste produto por causa da sua elevada sensibilidade anal tica est sujeito contamina o por parte das amostras cl nicas positivas para o DNA de EBV dos controles positivos e dos mesmos produtos za SIOMETRIX Om mM ARR 1 DIAGNOSTICA J Rev 04 Dez 2013 em E IOMETRIX ESSSSTR8 S BSB B PRB SBB BBB da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados falsos positivos A modalidade de realiza o do produto pode limitar as contamina es mas estes fen menos podem ser evitados somente com uma boa pr tica das t cnicas de laborat rio e seguindo atentamente as instru es fornecidas nestas
19. estada usando um n mero de amostras de sangue total positivas para DNA EBV commo material de refer ncia e o resultado foi maior que 90 A sensibilidade diagn stica foi avaliada usando quatro amostras de sangue total coletado em EDTA que era positivo para DNA de EBV Cada amostra foi usada em duas repeti es para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte TESTE 1 TESTE 2 Amostra DNA de EBV gEq 100 000 gEq 100 000 c lulas c lulas Pos 01 lt 40 4 lt 40 16 Pos 02 lt 40 12 lt 40 4 Pos 03 lt 40 36 44 Pos 04 3 668 3 780 Pos 05 580 336 Pos 06 1 240 1 176 Pos 07 492 536 Pos 08 5 112 5 512 Pos 09 1416 824 Pos 10 n o detectado lt 40 8 Nota A amostra 10 foi negativa de uma das duas repeti es porque sua carga viral estava abaixo do limite de detec o de EBV de 10 gEq rea o ou 40 gEq 100 000 c lulas Rev 04 Dez 2013 Especificidade anal tica marcadores interferentes em potencial A especificidade anal tica do teste que a rea o cruzada com outros marcadores interferentes em potencial foi avaliada por compara o de sequ ncias com bancos de dados de nucleot dicos O exame do alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o dos primers de oligonucleot deos do AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com
20. mente ap s manusear amostras e reagentes Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N o misturar reagentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes de outros fabricantes A M BMM EM EMMMMEMEEME C Rev 04 Dez 2013 em E IOMETRIX MME Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido a contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de tr
21. mpliSTANDARD com 10 10 10 c pias 9 Fechar a Microplaca de amplifica o com a L mina adesiva de amplifica o precavendo se de que a placa fique bem selada fazendo uso de acess rio adequado para tal procedimento 10 Transferir a placa de amplifica o para o termociclador Real Time que deve estar em rea espec fica e destinada para produtos amplificados p s PCR CALIBRA O DO PROCESSO Para este tipo de ensaio e metodologia n o existe procedimento de calibra o para o processo de medi o C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS An lise qualitativa dos resultados Os valores registrados da fluoresc ncia emitidos pela sonda espec fica para EBV fluoresc ncia FAM e pela sonda espec fica para o controle interno fluoresc ncia VIC nas rea es de amplifica o devem ser analisadas por software espec fico em E IOMETRIX ESR BE BB ESB T SR BRRPR PB Rev 04 Dez 2013 Antes de iniciar a an lise necess rio programar manualmente o baseline n vel de fundo fluorescente do ciclo 6 ao ciclo 15 Nota No caso de uma amostra positiva com alto t tulo de DNA de EBV a fluoresc ncia FAM da sonda espec fica para EBV pode come ar a aumentar antes do 15 ciclo Neste caso o intervalo de c lculo da baseline deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluoresc ncia FAM comecar a aumentar programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia FAM a 0 2
22. mponente iibi Quantidade Estocagem EBV Q PCR Alert AmpliMIX RTS020 M 4x 110 uL 20 C EBV Q PCR Alert AmpliPROBE RTSO20 P 4x 110 uL 20 C Q PCR Alert AmpliMASTER 4 x 340 uL 2 C 8 C Microplaca para amplifica o RTS000 3 Temp ambiente L mina adesiva para amplifica o 3 Temp ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico in vitro Manuseio ao manusear o kit e as amostras utilizar EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano N o beber ou comer na rea de trabalho A rea de trabalho deve ser um ambiente limpo e com ventila o adequada Trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo laminar N o manusear o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121 C durante uma hora antes de ser eliminado O material descart vel se combust vel deve ser incinerado Os res duos l quidos que cont m cidos ou bases devem ser
23. ndeterminado De fato a baixa efici ncia na rea o de amplifica o para o Controle Interno pode ser deslocada pela competi o com a alta efici ncia da rea o para o EBV Neste caso a amostra contudo adequada e o resultado positivo do teste v lido An lise quantitativa dos resultados Depois de realizar o procedimento para an lise qualitativa dos resultados poss vel realizar a an lise quantitativa dos resultados de amostras positiva Os valores de cT para sondas espec ficas EBV para os quatro Standards s o usados para calcular a curva padr o para a sess o de amplifica o e para validar a amplifica o e a detec o como descrito a seguir Curva Padr o EBV FAM Coeficiente de Correla o R2 Faixa Aceit vel Amplifica o Detec o 0 990 lt R2 lt 1 000 CORRETO Se o valor do Coeficiente de correla o R2 n o est dentro dos limites isso significa que problemas ocorreram na fase de amplifica o ou de detec o volumes de mistura de rea o incorretos degrada o da sonda degrada o dos padr es dispensa o incorreta dos padr es posicionamentop incorreto dos padr es programa o incorreta do ciclo t rmico que podem causar resultados incorretos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da Rev 04 Dez 2013 fase de amplificacao Os valores de fluoresc ncia emitidos pela probe espec fica para EBV nas rea es de amplifica o de cada amostra
24. ntrole positivo utilizar o DNA obtido de uma amostra positiva j testada ou Q EBV AmpliSTANDARD cll E P m e q Rev 04 Dez 2013 VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULAC ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO DO PRODUTO Sensibilidade Anal tica Limite de Detec o Detection Limit A sensibilidade anal tica deste teste permite identificar a presen a de aproximadamente 10 mol culas de DNA alvo nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de limite de detec o a sensibilidade anal tica do ensaio foi determinada utilizando um DNA de plasm deo contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida por espectrofot metro O DNA de plasm deo foi dilu do a um t tulo de 10 c pias 5 uL em DNA genomico humano a um t tulo de 500 ng 5 pL Esta amostra foi empregada em 50 repeti es para realizar a amplifica o Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N Negativos Positivos 10 c pias DNA plasm dico 500 ng de DNA gen mico 50 0 50 humano Sensibilidade anal tica Faixa de Medi o Linear A sensibilidade anal tica deste teste como Faixa de Medi o Linear permite determinar
25. plate DNA COMPONENTES FORNECIDOS Componente Descric o Quantidade Composic o EBV Q PCR Alert Oligonucleot deos AmpliMIX Mistura de E de 4x 110 uL TRIS base e cloridrato oligonucleotideos RTS020 M Glicerol Triton X 100 Mistura Ge sondas Oligonucleot deos EBV Q PCR Alert fluorescentes fluorescentes TRIS base e AmpliPROBE marcadas com FAM MGB 4 x 110 uL ques cloridrato Glicerol ARTOA NFQ Triton X 100 e com VIC MGB NFQ TRIS base e cloridrato Glicerol MgCL pietura de reagentes Desoriboxinucleot deos P 4 x 340 uL trifosfatos ROX Uracil Q PCR Alert optimizados N glicosilase AmpliMASTER Taq DNA polimerase hot RTS000 start Microplaca com T 96 pocinhos de 0 2 mL ERASLICO PE L mina adesiva vedante 3 Pl stico e cola em E IOMETRIX EEE SPF ESSES J Rev 04 Dez 2013 MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos necess rios Capela de fluxo laminar Agitador tipo V rtex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifugacao 1 5mL a 2 0mL Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr es de amostras exigidos na descri o abaixo CONDI ES DE ARMAZENAMENTO Co
26. pode medir a emiss o ajustar a posi o da microplaca de rea o o tipo de fluoresc ncia que deve ser medida e o tipo de rea o amostra controle negativo de amplifica o padr o com quantidade conhecida Adicionar esta informa o planilha de trabalho que se encontra anexada a esta instru o de uso A planilha deve ser cuidadosamente seguida durante a transfer ncia das misturas de rea o e das amostras em seus po os OBS para a determina o da quantidade de DNA alvo na amostra inicial ser necess rio 5 Rev 04 Dez 2013 preparar uma s rie de rea es usando DNA padr es com quantidades conhecidas c pias nas quantidades 10 10 10 10 para que se possa obter a Curva Padr o Ilustra se a seguir a t tulo de exemplo como pode ser organizada a an lise de 11 amostras r D D D ND A D D Aie X X X X X A 3 Z A2 J NV N N N N NNI N d L 2 ODE N NN MA A IN Ma IN IN IN 7l vag m aa IQQ M 2 EP WP WP WP VR NR NR IN Ww Z Significado A1 A11 Amostras para analisar CN Controle negativo de amplifica o 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias Programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico e um volume de rea o de 25 uL Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISMTM da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico para amplifica
27. r ao limite de detec o do produto neste caso o resultado ser um falso negativo Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos falsos positivos e falsos negativos com este produto Este risco residual n o pode ser eliminado ou reduzido posteriormente Este risco residual em situa es particulares como os diagn sticos de urg ncia pode contribuir a decis es incorretas com com consequ ncias graves para o paciente CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Controle de Qualidade aconselh vel confirmar o completo procedimento de an lise de cada sess o extrac o e amplifica o utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva Como amostra negativa utilizar uma amostra negativa para o DNA de EBV j testada ou da gua bidestilada est ril Como amostra positiva utilizar uma amostra positiva para o DNA de EBV j testado Controles de amplifica o absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o preparando uma rea o de controlo negativo e uma rea o de controle positivo Para o controle negativo utilizar gua bidestilada est ril n o inclu da no kit para acrescentar rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o co
28. sitivo Determinado alido cT 35 adequado Macau DETECTADO positivo Se o resultado da reac o de amplificac o de uma amostra cT Indeterminado para a probe espec fica dO EBV e cT 35 ou Indeterminado para a probe espec fica do controle interno isso significa que n o foi poss vel detectar de modo eficiente o DNA do controle interno Neste caso problemas ocorreram na fase de amplifica o amplifica o n o eficiente ou nula ou na fase de extra o aus ncia de DNA presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero de c lulas insuficiente que podem causar resultados incorretos e falsos negativos A amostra n o adequada o teste n o v lido e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT Indeterminado para a probe espec fica do EBV e cT lt 35 para a probe espec fica do controle interno o DNA do EBV n o foi detectado no DNA extra do da amostra mas n o poss vel descartar a presen a do DNA de EBV a um t tulo inferior ao limite de detec o do produto verificar dados a seguir em Caracter sticas de Desempenho Neste caso o resultado seria um falso negativo Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Quando o DNA de EBV detectado em uma amostra o controle interno pode resultar em um cT gt 35 ou I
29. sua rea de trabalho Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes Os produtos EBV Q PCR Alert AmpliMIX EBV Q PCR Alert AmpliPROBE EBV Q PCR AmpliSTANDARD Q PCR Alert AmpliMASTER apresentam as seguintes advert ncias S S 23 25 N o respirar vapores aerossol Evitar o contato com os olhos Observa es importantes e Os tubos que cont m o AmpliMIX e o AmpliPROBE s o descart veis e portanto devem ser utilizados uma nica vez na prepara o da mistura de rea o e Os tubos que cont m o AmpliSTANDARDO n o podem ser congelados e descongelados por mais de 8 vezes Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar perda na titula o za SIOMETRIX ciscn stica BEER EEEEEEMMMEEssss s ssssssquqg9cctddcAHAAmnmEmmEENM em E IOMETRIX ME Rev 04 Dez 2013 e Os tubos que cont sm o AmpliMASTER n o podem ser congelados e descongelados por mais de 1 vez Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar uma perda na efici ncia da amplifica o CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa Amostras O material a ser usado com este kit precisa ser constitu do de DNA extra do de amostras biol gicas O sistema para extra o de DNA da amostra inicial precisa fornecer DNA que adequado para as rea es de amplifica o Quando amostras celulares biol gicas s o usadas recomendado n o liberar uma quantidade de D
30. te produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados e Q PCR Alert AmpliMASTER RTSOO0 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e EBV Q PCR Alert AmpliMIX RTSO20 M primers oligonucleot deos para PCR em tempo real total de 96 rea es e EBVQ PCR Alert AmpliPROBE RTSO20 P probes fluorescentes para PCR em tempo real total de 96 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte Usar jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipetar solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosa
31. trofot metro pela medi o da absor o da prepara o inicial de DNA de plasm deo MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o Solu o de Plasm deo TRIS base EBV Q PCR Standard t Q 10 dad plasmideo em tubo 2x50yL TRIS cloridrato EDTA com tampa vermelha RNA total de levedura Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base EBV Q PCR Standard Q 10 i em tubo com tampa 2 x 50 pL TRIS cloridrato EDTA azul RNA total de levedura Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base EB PCR vQ e stangar em tubo com tampa 2 x 50 pL TRIS cloridrato EDTA verde RNA total de levedura Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base EBV Q PCR Standard i Q 10 did em tubo com tampa 2x50yL TRIS cloridrato EDTA amarela RNA total de levedura e Armazenar a 20 C ou inferior em E IOMETRIX a I Rev 04 Dez 2013 MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Agitador v rtex Microcentrifuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 pL 5 50 uL 50 200 pL 200 1000 pL gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador ACESS RIOS Os reagentes otimizados para amplifica o os primers oligonucleot deos e os reagentes de detec o probes fluorescentes n o est o inclusas nes
32. um t tulo de 1 000 000 a 10 mol culas de DNA alvo nos 5 pL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de Faixa de Medi o Linear a sensibilidade anal tica do teste foi determinada utilizando um painel de dilui es 1 logi entre uma dilui o e a seguinte de DNA de plasm deo contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida por espectrofot metro Os pontos do painel de 10 mol culas por rea o a 10 mol culas por rea o foram empregadas em 9 repeti es para realizar a amplifica o A an lise dos dados obtidos realizada atrav s de regress o linear demostrou que o teste apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel coeficiente de correla o linear superior a 0 99 Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Faixa de Medi o Linear C pias DNA rea o gEq 100 000 c lulas Limite superior 1 000 000 4 000 000 Limite inferior 10 40 O limite superior da Faixa de Medi o Linear como gEq rea o foi fixado a 10 mol culas rea o dentro de um logaritmo do valor de mais alta concentra o do padr o de amplifica o AmpliSTANDARD 10 mol culas rea o O limite inferior da Faixa de Medi o Linear foi fixado em 10 mol culas 5 pL dentro de um logaritmo de concentra o mais baixo do padr o de amplifica o AmpliSTANDARD 10 mol culas 5 uL Rev 04 Dez 2013 Sensibilidade
33. vo diferente de Indeterminado Undetermined a presen a do DNA alvo foi detectado Isso significa que problemas ocorreram na fase de amplifica o contamina o que podem causar resultados incorretos e falsos positivos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Na rea o de amplifica o de cada amostra os valores de cT das sondas espec ficas EBV s o usados para detectar a presen a do DNA alvo enquanto os valores de cT das sondas espec ficas do controle interno s o usados para validar a amplifica o detec o e extra o Verificar no software do instrumento que o cT foi determinado por um r pido e regular crescimento dos valores de fluoresc ncia e n o por picos ou incremento de sinal de fundo Este produto pode detectar uma quantidade m nima de aproximadamente 10 c pias do DNA do gene que codifica a proteina EBNA 1 do EBV por rea o de amplifica o correspondente ao genoma Equivalente por rea o Resultado do teste Amplifica o em E Rev 04 Dez 2013 Os resultados dos Cts s o usados utilizados conforme descrito na tabela seguinte OMETRIX DIAGN BSTICA Rea o d t ea o da amostra l Adequa o da Resultado do DNA de EBV EBV FAM Beta globina VIC amostra teste vds Ki E Inadequado Inv lido Indeterminado Indeterminado e cT lt 35 adequado M vo negativo DETECTADO erm 2 i adequado o DETECTADO Indeterminado po
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