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1. ZENIT RA MPO REF 41428 vortex evitando a forma o de espuma N o inverter o recipiente e n o retirar a tampa perfuradora de fecho tampa amarela para os calibradores e tampas verdes ou azuis para os controlos No caso em que os calibradores ou os controlos sejam utilizados pela primeira vez premir a tampa perfuradora para baixo at ao fim Deste modo a membrana que veda o recipiente ser perfurada tornando assim poss vel a colheita do l quido contido no mesmo O abaixamento total da tampa perfuradora assinalado pela simult nea cobertura da faixa vermelha situada na parte superior do r tulo Fig 1 Recipiente selado e Recipiente perfurado Se os calibradores ou os controlos j tiverem sido utilizados o recipiente ter a tampa superior tampa branca e a faixa vermelha do r tulo estar tapada S devem ser carregados no instrumento os recipientes sem tampa superior tampa branca e com a faixa vermelha do r tulo tapada Fig 1 Recipiente perfurado Introduzir no analisador os calibradores ou os controlos na rea das amostras depois da leitura do c digo de barras Os dados do c digo de barras tamb m podem ser introduzidos manualmente se o r tulo estiver estragado ou em caso de falta de leitura Os valores da concentra o de anticorpos IgG anti MPO presente nos calibradores ou nos controlos est o registados no DATA DISK e s o transferidos automaticamente para o analisador Em caso de falta2. ZENIT RA MPO REF 41428 REF 41428 Distribuido por ean ZENIT RA MPO WAMEVARN INSTRU ES eae PARA A K NY Ce UTILIZA O ae 50 APLICAGAO O teste ZENIT RA MPO um teste imunol gico quimiluminescente CLIA para a determina o quantitativa com instrumenta o dedicada Analisador ZENIT RA dos anticorpos espec ficos de classe IgG dirigidos contra a mieloperoxidase MPO em amostras de soro ou de plasma humano EDTA Heparina Esta dosagem utilizada como aux lio no diagn stico das vasculites primitivas sist micas ANCA associadas em especial da poliangioite microsc pica PAM ATEN O Qualquer decis o m dica n o poder basear se unicamente no resultado deste teste mas dever incluir o conjunto de todos os dados cl nicos e de laborat rio dispon veis SIGNIFICADO CL NICO Os anticorpos anti citoplasma dos neutr filos ANCA s o auto anticorpos dirigidos contra os antig nios contidos no citoplasma dos granul citos e dos mon citos Os ANCA s o marcadores serol gicos de algumas vasculites necrotizantes dos vasos de calibre pequeno m dio em especial a granulomatose de Wegener GW a poliangioite microsc pica PAM a glomerulonefrite necrotizante extracapilar pauciimune GNNEP uma forma de PAM limitada aos rins e em menor percentagem a s ndrome de Churg Strauss SCS frequentemente definidas colectivamente como vasculites ANCA associadas VAA 2
3. 3 O estudo n o demonstrou nenhuma reac o cruzada significativa do antig nio em fase s lida com os outros auto anticorpos Efeito de satura o em doses elevadas Alguns m todos imunol gicos empregues para a determina o de amostras que cont m o analito em concentra es extremamente elevadas podem fornecer n veis aparentes de analito subestimados Efeito hook O m todo utilizado no kit ZENIT RA MPO sendo um m todo com duas incuba es n o sofre esse efeito Uma amostra com concentra o extremamente elevada acima do intervalo de medi o de IgG anti MPO confirmou a aus ncia de efeito hook at concentra o de 1843 UA mL Sensibilidade e Especificidade Relativas A presen a de anticorpos anti MPO IgG foi determinada utilizando o kit ZENIT RA MPO e um m todo de dosagem ELISA disposi o no com rcio em 230 amostras 43 amostras de doentes que sofrem de vasculite primitiva sist mica ANCA associada diagnosticada como poliangioite microsc pica 49 amostras de pacientes que sofrem de vasculite primitiva sist mica ANCA associada diagnosticada como granulomatose de Wegener 108 amostras de doentes que sofrem de patologias diferentes doen as inflamat rias intestinais cr nicas l pus eritematoso sist mico conectivites sist micas vasculites n o ANCA associadas artrite reumat ide patologias infecciosas e 30 pacientes normais 12 amostras deram lugar a resultados divergentes entre a dosagem ZENIT
4. duos normais e 100 amostras de dadores estudada 12 amostras deram resultados positivos 2 duvidosos e 275 negativos Especificidade do diagn stico 95 2 275 289 Das 14 amostras com resultados n o negativos 9 pertenciam ao grupo dos pacientes com diagn stico GW dos quais 8 apresentavam ao teste de imunofluoresc ncia indirecta um padr o P ANCA e 5 ao grupo dos pacientes que sofrem de patologias diferentes Na popula o presumivelmente positiva 45 amostras de pacientes com diagn stico PAM estudada 5 amostras deram resultados negativos 2 duvidosos e 38 positivos Sensibilidade do diagn stico 84 4 38 45 Das 5 amostras com resultados n o positivos 3 amostras deram resultado negativo quer ao teste gold standard de imunofluoresc ncia indirecta quer com outros testes ELISA comerciais Em fun o dos resultados da especificidade e da sensibilidade de diagn stico o acordo diagn stico de 93 7 DESEMPENHO Advert ncia os dados apresentados n o representam as especifica es de funcionamento do kit mas constituem a evid ncia experimental em como o kit funciona dentro dessas especifica es no modo previsto pelo fabricante Precis o e Reprodutibilidade A precis o e a reprodutibilidade do kit ZENIT RA MPO foram avaliadas utilizando um protocolo baseado nas linhas guia do documento EP5 A2 dos Clinical and Laboratory Standards CLSI A precis o foi calculada analisando os resultados
5. 16 Radice A Sinico RA La diagnosi clinica e di laboratorio delle malattie autoimmune sistemiche le vasculiti In Il Laboratorio nelle Malattie Reumatiche Autoimmuni R Tozzoli N Bizzaro D Villalta E Tonutti Ed Aesculapio 2007 TECHNOGENETICS S r l Viale Casiraghi 471 20099 Sesto San Giovanni MI Distribuido por A Menarini Diagnosticos Lda Quinta da Fonte Edificio D Manuel 2 B 2770 203 Pago de Arcos Tel 351 210 93 00 00 Fax 351 210 93 00 O1 www menarinidiag pt IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 Pagina 17 de 17
6. Numerosas evid ncias cl nicas ou experimentais sugerem tamb m um papel patogen tico dos ANCA nas VAA em especial para ANCA MPO Atrav s da met dica de padr o de imunofluoresc ncia indirecta IFI em neutr filos humanos normais fixados com etanol absoluto podem ser reconhecidos dois quadros fluorosc picos principais C ANCA e P ANCA Com menor frequ ncia podem ser detectados outros dois padr es fluorosc picos C ANCA at pico e ANCA At geralmente n o associados presen a de uma vasculite idiop tica Nos doentes que sofrem de VAA os principais alvos antig nicos dos ANCA s o a mieloperoxidase MPO e a proteinase 3 PR 3 A MPO uma enzima com propriedades bactericidas importantes que exerce atrav s da cat lise de reac es de peroxida o a forma o de produtos t xicos tais como HOCI H2O e radicais do oxig nio Para al m disso o cido hipocloroso e os seus metabolitos podem inactivar os inibidores das prot ases e portanto influir na degrada o dos tecidos e na manuten o de um microambiente inflamat rio A MPO representa cerca de 5 do conte do proteico total dos neutr filos uma mol cula fortemente cati nica constitu da por um heterodimero de P M 140 kDa IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 Pagina 1 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 A PR3 uma serin prot ase brandamente cati nica contida nos gr nulos prim rios de granul citos e
7. RA e a dosagem ELISA dispon vel no com rcio A concord ncia relativa resultou assim igual a 94 8 218 230 A sensibilidade relativa resultou igual a 93 2 38 44 A especificidade relativa resultou igual a 95 2 177 186 IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 15 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 As tr s amostras com resultados negativos com o kit ZENIT RA MPO e positivos com o kit ELISA pertenciam uma ao grupo das amostras com granulomatose de Wegener uma ao grupo das amostras com poliangioite microsc pica e uma ao grupo dos pacientes com doen as inflamat rias intestinais cr nicas As nove amostras com resultados positivos com o kit ZENIT RA MPO e negativos com o kit ELISA pertenciam duas ao grupo das amostras com granulomatose de Wegener tr s ao grupo das amostras com poliangioite microsc pica uma ao grupo dos pacientes com doen as inflamat rias intestinais cr nicas uma ao grupo com LES e uma ao grupo dos doentes com conectivites sist micas Soros de refer ncia A quantidade de anticorpos anti MPO IgG presentes na amostra MPO ANCA HUMAN REFERENCE SERUM 15 CDC Cat N 152720 Lote N 07 0001 testada com o kit ZENIT RA MPO resultou ser igual a 264 1 UA mL BIBLIOGRAFIA 1 Wiik A Delineation of a standard procedure for indirect immunofluorescence detection of ANCA Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 97 Suppl 6 S12 S13 1989 2 Jennette JC Falk RJ
8. da quimiluminesc ncia O antig nio espec fico utilizado para revestir as part culas magn ticas fase s lida e um anticorpo anti IgG humano marcado com um derivado do ster de acrid nio conjugado Durante a primeira incuba o os anticorpos espec ficos presentes na amostra nos calibradores ou nos controlos aderem fase s lida Durante a segunda incuba o o conjugado reage com os anticorpos anti MPO IgG capturados pela fase s lida Depois de cada incuba o o material n o aderido fase s lida removido por aspira o e subsequente lavagem A quantidade de conjugado marcado que ficou aderido fase s lida avaliada atrav s da activa o da reac o de quimiluminesc ncia e medi o do sinal luminoso O sinal criado exprimido em unidades relativas de luz RLU Relative Light Unit indicativo da concentra o de anticorpos espec ficos presentes na amostra nos calibradores e nos controlos AUTOMATIZA O O Analisador ZENIT RA executa automaticamente todas as opera es previstas pelo protocolo de dosagem adiciona no recipiente de reac o as amostras calibradores controlos part culas magn ticas conjugado e solu es de activa o da quimiluminesc ncia separa o magn tica e lavagem das part culas medi o da luz emitida O sistema calcula os resultados da dosagem para as amostras e para os controlos atrav s de uma curva de calibra o memorizada e imprime um relat rio que
9. inclui todas as informa es relativas dosagem e ao doente MATERIAIS E REAGENTES Materiais e reagentes fornecidos IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 3 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 Part culas magn ticas revestidas com antig nio MPO mieloperoxidase em Tamp o Fosfato com prote nas estabilizantes tensioactivo Pro Clin 300 e azida de s dio lt 0 1 como conservantes Anticorpo monoclonal de rato anti IgG humanos marcado com um derivado do ster de acrid nio conjugado em Tamp o Fosfato com prote nas estabilizantes e azida de s dio lt 0 1 como conservante Solu o Diluente de Amostras Tamp o Borato com seroalbumina bovina um tensioactivo um corante vermelho Pro Clin 300 e Gentamicina SO como conservantes Soro humano com baixa concentra o de anticorpos anti MPO IgG em Tamp o Fosfato com seroalbumina bovina um tensioactivo um corante azul inerte Pro Clin 300 e Gentamicina SO4 como conservantes Soro humano com elevada concentra o de anticorpos anti MPO IgG em Tamp o Fosfato com seroalbumina bovina um tensioactivo um corante azul inerte Pro Clin 300 e Gentamicina SO4 como conservantes Todos os reagentes est o prontos a usar Os reagentes 1 2 e 3 s o embalados em conjunto constituindo um cartucho de reagentes As concentra es dos Calibradores s o indicadas em UA mL Unidades Arbitr rias e calibradas em rela o a um padr
10. o de refer ncia interno Os valores das concentra es espec ficos para cada lote de produto est o registados no DATA DISK inclu do no kit DATA DISK Mini DVD que cont m as informa es relativas a todos os produtos da Linha ZENIT RA Reagentes Calibradores Soros de controlo actualizados at ao ltimo lote de produ o excep o dos produtos expirados na data de realiza o do novo DATA DISK Basta conservar o DATA DISK com o n mero de lote mais elevado para manter actualizadas as informa es necess rias para o funcionamento correcto do sistema IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 4 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 Materiais e reagentes necess rios mas n o fornecidos no kit ZENIT RA Analyzer C d N 41400 ZENIT RA Cuvette Cube C d N 41402 Embalagem de 960 cuvetes ZENIT RA System Liquid C d N 41409 1 garrafa de 0 5 litros de solu o 10x ZENIT RA Wash Solution C d N 41407 1 garrafa de 0 5 litros de solu o 20x ZENIT RA Trigger Set 7 C d N 41403 1 frasco de 250 mL de Trigger A solu o de pr activa o 1 frasco de 250 mL de Trigger B solu o de pr activa o ZENIT RA D SORB Solution C d N 41436 Embalagem de 2 garrafas de 1 litro de solu o pronta a usar ZENIT RA Cartridge Checking System C d N 41401 ZENIT RA Top Cap Set C d N 41566 300 tampas superiores para o fecho dos recipi
11. o distribu dos 200 uL de conjugado na cuvete A cuvete de reac o incubada no rotor a 37 durante 10 minutos Dapo N Depois desta ltima fase de incuba o as part culas magn ticas s o separadas e lavadas e a cuvete transferida para a c mara de leitura 7 A quantidade de conjugado aderido fase s lida exprimida em RLU directamente proporcional concentra o de IgG anti MPO presente na amostra 8 As respostas obtidas s o interpoladas na curva de calibra o e transformadas em concentra es As amostras com valores de concentra o mais elevados do limite superior do intervalo de medi o podem ser dilu das e testadas novamente O novo valor obtido multiplicado pelo factor de dilui o utilizado para obter o resultado final IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 9 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 CONTROLO DE QUALIDADE Para assegurar a validade da dosagem devem ser medidos soros de controlo com niveis diferentes de concentra o pelo menos um soro negativo e um soro positivo cada dia em que se executa a dosagem Se o seu laborat rio requer para a verifica o dos resultados da dosagem um uso mais frequente ou um n mero mais elevado de controlos seguir as opera es de controlo de qualidade estabelecidas Se forem utilizados os soros de controlo ZENIT RA os valores m dios esperados e os limites de aceitabilidade s o os indicados no DATA DIS
12. podem ser indicados como superiores a 860 UA mL ou testados novamente ap s a devida dilui o Os resultados das amostras podem ser interpretados do seguinte modo IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 10 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 UA mL Interpreta o lt 10 A amostra deve ser considerada Negativa pela presen a de IgG anti MPO 10 a 20 A amostra deve ser considerada duvidosa pela presen a de IgG anti MPO gt 20 A amostra deve ser considerada Positiva pela presen a de IgG anti MPO Os valores acima mencionados devem ser considerados como valores indicativos Cada laborat rio deve estabelecer os seus pr prios intervalos de refer ncia LIMITES DA DOSAGEM Para efeitos de diagn stico os resultados obtidos com o kit ZENIT RA MPO e o sistema ZENIT RA Analyzer devem ser utilizados em conjunto com os outros dados cl nicos e de laborat rio disposi o do m dico A contamina o bacteriana das amostras e a inactiva o ao calor podem influenciar o resultado da dosagem Os anticorpos heter filos presentes nas amostras de soro humano podem reagir com os reagentes base de imunoglobulinas provocando interfer ncias nas dosagens imunol gicas in vitro Estas amostras podem dar lugar a valores anormais se analisados com o kit ZENIT RA MPO VALORES PREVISTOS Foram analisadas as amostras de 100 dadores seleccionados casualmente para verificar a presen a d
13. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies and associated diseases a review Am J Kidney Dis 1990 15 517 29 3 Chen M Kallenberg CGM New advantages in the pathogenesis of ANCA associated vasculitides Clin Exp Rheumatol 2009 27 s 52 108 14 Review 4 Savige J Gillis D Benson E et al International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies Am J Clin Pathol 1999 111 507 13 5 Sinico RA Radice A Pozzi C et al Diagnostic significance and antigen specificity of antineutrophil cytoplasmic antibodies in renal disease a prospective multicentre study Nephrol Dial Transplant 1994 9 505 10 6 Radice A Sinico RA Antineutrophil cytoplasmic antibodies ANCA Autoimmunity 2005 38 93 103 7 Vecchi M Bianchi MB Sinico RA Radice A et al Antibodies to neutrophil cytoplasm in Italian patients with ulcerative colitis sensitivity specificity and recognition of putative antigens Digestion 1994 55 34 9 8 Merkel PA Polisson RP Chang YC Skates SJ et al Prevalence of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies in a Large Inception Cohort of Patients with Connective Tissue Disease Ann Int Med 1997 126 866 73 IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 Pagina 16 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 9 Hagen EC Daha MR Andrassy K Csernok E et al for the EC BRC Project for ANCA Assay Standardization Diagnostic value of standardized assays for anti
14. EAGENTES Os reagentes fornecidos no kit est o todos prontos a usar CONSERVA O E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Conservar os reagentes fornecidos no kit entre 2 e 8 em posi o vertical e s escuras Nestas condi es o cartucho de reagente e os calibradores que n o tiverem sido abertos estar o est veis at ao fim do prazo de validade O cartucho de reagentes depois de aberto poder ser utilizado por 60 dias se conservado no frigor fico entre2e8 IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 6 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 ou a bordo da maquina Os calibradores depois de abertos poder o ser utilizados por 60 dias se conservados no frigor fico entre 2 e 8 e se a perman ncia a bordo da m quina n o ultrapassar as 6 horas por sess o N o congelar os reagentes e os calibradores PREPARA O E CONSERVA O DAS AMOSTRAS A dosagem deve ser executada em amostras humanas de soro e de plasma EDTA Heparina Desaconselha se o uso de amostras lip micas hemolisadas e turvas Se a dosagem for executada mais de 8 horas depois separar o soro ou o plasma do co gulo dos gl bulos vermelhos e das provetas de separa o com gel Antes de serem analisadas as amostras podem ser conservadas no frigor fico entre 2 e 8 no m ximo por 7 dias Se a dosagem for executada mais de 7 dias depois conservar as amostras congeladas lt 200 Evitar congelamentos e descong
15. K tamb m presente na embalagem dos controlos Se forem utilizados soros de controlo diferentes necess rio antes da sua utiliza o definir os valores esperados com reagentes e sistema ZENIT RA Se o valor dos controlos n o estiver dentro do intervalo de aceitabilidade especificado os respectivos resultados da dosagem s o inv lidos e essas amostras devem ser analisadas novamente Neste caso necess rio executar uma recalibra o antes da repeti o da dosagem C LCULO E INTERPRETA O DOS RESULTADOS C lculo dos resultados A concentra o dos anticorpos IgG anti MPO presentes nas amostras em exame calculada automaticamente pelo sistema Os valores podem ser visualizados no ecr ou imprimidos As concentra es s o exprimidas em UA mL O c lculo da concentra o na amostra efectuado atrav s da leitura da resposta obtida por cada amostra numa curva de calibra o elaborada com um sistema de fitting log stico de quatro par metros 4PL Y ponderado corrigida periodicamente em fun o das respostas obtidas na dosagem dos calibradores Para mais informa es sobre o sistema de c lculo dos resultados consultar o manual de instru es do sistema Interpreta o dos resultados O intervalo de medi o da dosagem ZENIT RA MPO de 0 0 a 860 UA mL Os valores inferiores a 0 0 UA mL s o valores extrapolados e podem ser indicados como iguais a 0 0 UA mL Os valores superiores a 860 UA mL
16. de transfer ncia dos dados poss vel introduzi los manualmente No final da sess o os recipientes dos calibradores e dos controlos devem ser fechados com as respectivas tampas superiores tampas brancas e conservados entre 2 e 8 at serem novamente utilizados Fig 1 Recipiente fechado Os calibradores s podem ser utilizados ao m ximo quatro vezes Figura 1 Desenho do recipiente Recipiente selado Recipiente perfurado Recipiente fechado Carregamento das amostras Identificar as amostras utilizando o leitor de c digo de barras e introduzi las no analisador no respectivo recipiente Em caso de falta do c digo de barras na amostra ou em caso de falta de leitura os dados de identifica o da amostra podem ser introduzidos manualmente Seleccionar os par metros requeridos de cada amostra IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 8 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 Calibra o O Analisador ZENIT RA utiliza uma curva de calibra o memorizada master curve criada pelo fabricante para cada lote de cartuchos de reagentes Os par metros das master curve juntamente aos valores das concentra es dos calibradores est o memorizados no DATA DISK e s o transferidos para a base de dados do analisador Os calibradores A e B s o utilizados para recalibrar a master curve quer em fun o do analisador utili
17. de 20 repeti es de cinco soros um negativo e quatro positivos com diferentes concentra es de anti MPO IgG executados com dois lotes de reagentes diferentes na mesma sess o experimental A concentra o do soro anti MPO IgG negativo LOB2 deu um resultado dentro do intervalo de 3 6 a 4 5 UA mL e de 3 5 a 5 3 UA mL respectivamente com o Lote de reagentes n 1 en 2 Na Tabela est o indicados os resultados obtidos com os 4 soros positivos IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 12 de ZENIT RA MPO REF 41428 amosia Reagertze Concmm io a ov P1 P2 P3 P4 A reprodutibilidade foi calculada analisando os resultados da determina o de cinco soros um negativo e quatro positivos com diferentes concentra es de anti MPO IgG executada individualmente com dois lotes de reagentes diferentes em 30 sess es diferentes A concentra o do soro anti MPO IgG negativo LOB2 deu um resultado dentro do intervalo de 2 7 a 4 4 UA mL Na Tabela est o indicados os resultados obtidos com os 4 soros positivos Amostra oe URL SD CV P1 17 9 1 45 8 1 P2 48 8 4 38 9 0 P3 82 3 6 18 7 5 P4 211 0 16 22 7 7 Linearidade das Dilui es A linearidade das dilui es do kit ZENIT RA MPO foi avaliada utilizando um protocolo baseado nas linhas guia do documento EP6 A dos Clinical and Laboratory Standards CLSI Foram doseadas dil
18. e anticorpos IgG anti MPO Todas as amostras analisadas deram resultados negativos com um valor m dio de 1 2 UA mL e um desvio padr o de 0 741 UA mL Com os resultados obtidos foi calculado o Limit of Blank LoB o valor mais elevado que podemos esperar numa s rie de amostras que n o contenham o analito O Limit of Blank determinado como 95 por cento de popula o negativa resultou igual a 1 9 UA mL com o Lote de reagentes n 1 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE CL NICA Foi testado com o kit ZENIT RA MPO um total de 334 amostras das quais 45 amostras de pacientes que sofrem de vasculite primitiva sist mica ANCA associadas diagnosticada como poliangioite microsc pica PAM 50 amostras de doentes que sofrem de vasculite primitiva sist mica ANCA associadas diagnosticada como granulomatose de Wegener GW 109 amostras de doentes que sofrem de v rias patologias 14 doen as inflamat rias intestinais cr nicas 44 de l pus eritematoso sist mico 7 de IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 11 de ZENIT RA MPO REF 41428 conectivites sist micas 20 vasculites n o ANCA associadas 10 artrites reumat ides 14 patologias infecciosas 30 amostras de individuos normais e 100 amostras de dadores Na popula o presumivelmente negativa 50 amostras de pacientes com diagn stico GW 109 amostras de pacientes que sofrem de v rias patologias n o ANCA associadas 30 amostras de indiv
19. elamentos repetidos PROCEDIMENTO Para obter desempenhos anal ticos v lidos respeitar escrupulosamente as instru es do manual de instru es do instrumento Carregamento dos reagentes Os reagentes fornecidos no kit est o todos prontos a usar Antes de inserir o cartucho de reagentes no sistema o recipiente das part culas magn ticas deve ser agitado por rota o horizontal de modo a facilitar a suspens o das part culas Executar a opera o evitando a forma o de espuma Colocar o cartucho de reagentes na rea dos reagentes do analisador utilizando a respectiva guia e deixar em agita o durante pelo menos 30 minutos antes de usar A coloca o do cartucho de reagentes determina simultaneamente a leitura do c digo de barras de identifica o Se o r tulo do cartucho estiver estragado ou por falta de leitura os dados de identifica o do cartucho de reagentes podem ser introduzidos manualmente O analisador mant m automaticamente as part culas magn ticas em agita o cont nua Se o cartucho de reagentes for retirado do analisador deve ser conservado na vertical e s escuras entre 2 esc Carregamento dos calibradores e dos controlos Os calibradores e os controlos ZENIT RA est o prontos a usar Deixar os calibradores e os controlos a temperatura ambiente durante 10 minutos e agitar delicadamente o conte do manualmente ou com um IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 7 de 17
20. entes dos calibradores ap s a primeira utiliza o O analisador ZENIT RA e os acess rios identificados pelo asterisco s o fabricados por Immunodiagnostic Systems S A Rue E Solvay 101 B 4000 Li ge B lgica e distribu dos por A Menarini Diagnostics Srl Outros Reagentes Aconselhados ZENIT RA ANCA GBM CONTROL SET C d N 41449 3 ampolas de 1 5 mL de soro humano negativo e 3 ampolas de 1 5 mL de soro humano positivo para anticorpos anti MPO ADVERT NCIAS E PRECAU ES Os reagentes fornecidos no kit ZENIT RA MPO s o exclusivamente para uso em diagn stico in vitro e n o para uso in vivo em pessoas ou animais Este produto deve ser usado por utilizadores profissionais respeitando rigorosamente as instru es deste documento IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 5 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 A Menarini nao pode ser considerada respons vel por perdas ou danos provocados por uma utiliza o diferente da indicada nas instru es fornecidas Precau es de seguran a Este produto cont m material de origem animal e portanto deve ser manuseado como se contivesse agentes infecciosos Este produto cont m componentes de origem humana Todas as unidades de soro ou plasma utilizadas para o fabrico dos componentes deste Kit foram analisadas com m todos FDA aprovados e resultaram n o reactivas pela presen a de HBsAg anti HCV anti HIV1 e anti HIV2 Todavia co
21. eval ncia da doen a na popula o averiguada Uma requisi o adequada probabilidade elevada pr teste permite obter um resultado de utilidade cl nica real e reduz significativamente a possibilidade de resultados falsos positivos Portanto a pesquisa dos ANCA deveria ser efectuada na presen a de uma suspeita cl nica fundamentada e um resultado positivo s por si n o suficiente para o diagn stico de VAA deve ser avaliado em combina o com um quadro cl nico e histol gico IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 2 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 Na literatura s o ocasionalmente assinaladas positividade a ANCA em patologias diferentes das vasculites associadas a ANCA apesar de n o sempre confirmadas por demonstra o da especificidade antig nica para MPO ou PR3 S o numerosas as patologias a considerar no diagn stico diferencial entre as quais til recordar tamb m pela sua frequ ncia elevada as patologias infecciosas e em especial a endocardite bacteriana subaguda Apesar de o VPN de um resultado negativo ser geralmente elevado este n o exclui totalmente a possibilidade de uma VAA sobretudo em doentes com uma evid ncia cl nica forte de vasculite primitiva sist mica PRINC PIO DO M TODO O kit ZENIT RA MPO para a determina o quantitativa das IgG espec ficas anti MPO utiliza um m todo imunol gico indirecto em dois passos baseado no princ pio
22. mite de detec o do kit ZENIT RA MPO foi igual a 3 8 UA mL Os valores do limite de detec o juntamente com as considera es de car cter cl nico e com os resultados de compara o com m todos de refer ncia contribu ram para a defini o do valor de cut off Especificidade Anal tica Interfer ncias Um estudo baseado nas linhas guia do documento EP7 A2 do CLSI demonstrou que os desempenhos da dosagem n o s o influenciados pela presen a na amostra de subst ncias potencialmente interferentes indicadas na tabela seguinte at concentra o experimentada IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 14 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 gd e ojenciaimento Concentra o m xima experimentada nterferentes Bilirrubina livre 20 mg dL Bilirrubina conjugada 28 mg dL Hemoglobina 1000 mg dL cidos gordos 3000 mg dL Desaconselha se o uso de amostras lip micas hemolisadas ou turvas Especificidade anal tica Reac es cruzadas Para avaliar as potenciais reac es cruzadas do antig nio utilizado para sensibilizar as part culas magn ticas foi conduzido um estudo com 25 amostras todas com n veis altos de outros auto anticorpos e negativos a anti MPO IgG As amostras utilizadas estavam assim subdivididas SS A 2 SS B 3 U1 snRNP 1 Jo 1 2 Scl 70 3 Cenp B 2 Histonas 1 Nucleolares 1 B gt GPI CL IgG 2 Gliadina t TG 3 CCP 1 RF 1 dsDNA
23. mo nenhum m todo de an lise capaz de garantir a aus ncia de agentes patog nicos todo o material de origem humana deve ser considerado potencialmente infectado e manuseado como tal Se a embalagem estiver estragada com derramamento dos reagentes providenciar descontamina o da rea afectada com uma solu o dilu da de Hipoclorito de S dio depois de se ter protegido com dispositivos de protec o individual adequados bata luvas culos Eliminar o material utilizado para a limpeza e os res duos da embalagem afectados pelo derramamento de acordo com as normas nacionais para a elimina o de lixos potencialmente infectados Alguns reagentes cont m azida de s dio como conservante Como a azida de s dio pode reagir com o chumbo cobre e lat o revestido de chumbo formando azidas explosivas nos canos aconselha se n o deitar reagentes ou res duos no esgoto mas respeitar as normas nacionais em mat ria de elimina o de lixos potencialmente perigosos Precau es de utiliza o Para assegurar a obten o de resultados v lidos devem ser rigorosamente respeitadas estas instru es de utiliza o e as indica es do manual de instru es do instrumento Os reagentes fornecidos no kit devem ser utilizados exclusivamente com o sistema ZENIT RA Analyzer Os componentes do cartucho de reagentes n o podem ser retirados do cartucho e montados novamente N o usar o kit para al m do prazo de validade PREPARA O DOS R
24. mon citos constitu da por 228 amino cidos e com P M 29 31 kDa dotada de actividade antimicrobiana contra bact rias e fungos A maior parte das suas fun es biol gicas depende da actividade proteol tica Num contexto inflamat rio libertada no exterior da c lula juntamente a outros constituintes dos gr nulos e radicais do oxig nio onde pode degradar o colag nio os proteoglicanos e outros constituintes do tecido conectivo Todavia uma actividade proteol tica excessiva prolongada ou inadequada provoca danos no organismo Os ANCA PR3 interferem com a inibi o enzim tica da PR3 pelo seu inibidor fisiol gico a1 antitripsina Na maior parte dos casos o padr o C ANCA devido presen a de anticorpos espec ficos para a PR3 enquanto um quadro P ANCA pode ser provocado por anticorpos dirigidos contra numerosas prote nas entre as quais a mais frequente e a MPO At hoje os ANCA dirigidos contra outros componentes citoplasm ticos diferentes de PR3 e MPO n o t m um significado cl nico claro e portanto n o s o teis para o diagn stico laboratorial das VAA Ap s a publica o dos resultados do folheto multic ntrico para a padroniza o dos m todos para a determina o dos ANCA foram redigidas as Linhas de Guia para a execu o correcta e interpreta o dos 410 11 Como se testes ANCA nos doentes com suspeita de vasculite a consultar para um aprofundamento deduz com clareza do estudo mencionado cuj
25. neutrophil cytoplasmic antibodies in idiopathic systemic vasculitis Kidney Unt 1998 53 743 53 10 Sinico RA Radice A Tonutti E Villalta D et al per il gruppo FIRMA Proposta di linee guida per la determinazione degli anticorpi anti citoplasma dei neutrofili ANCA Riv Med Lab JLM 2002 3 4 20 24 11 Savige J Dimech W Fritzier M et al for the International Group for Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplamic Antibodies ANCA Addendum to the International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplamic Antibodies quality control guidelines comments and recommendations for testing in other autoimmune diseases Am J Clin Pathol 2008 120 312 18 12 Jennette JC Wilkman AS Falk RJ Diagnostic predicting value of ANCA serology Kidney Int 1998 53 796 8 13 Schmitt WH van der Woude FJ Clinical Applications of Antineutrophil Cytoplamic Antibody Testing Curr Opin Rheumatol 2004 16 1 9 17 14 Sinico RA Radice A Corace C Di Toma L Sabadini E Value of a New Automated Fluorescence Immunoassay ELIA for PR3 and MPO ANCA in Monitoring Disease Activity in ANCA Associated Systemic Vasculitis Ann NY Acad Sci 2005 1050 185 92 15 Mandl LA Solomon DH Smith EL Lew RA Katz JN Shmerling RH Using antineutrophil cytoplasmic antibody testing to diagnose vasculitis can test ordering guidelines improve diagnostic accuracy Arch Inter Med 2002 162 1509 14
26. os resultados foram mais tarde amplamente confirmados a determina o correcta dos ANCA usufrui da execu o combinada da met dica IFI e da identifica o da especificidade antig nica reconhecida atrav s de sistemas antig nios espec ficos para os dois antig nios principais MPO e PR3 m todos ELISA FEIA CLIA 2 A execu o combinada das duas met dicas permite obter uma especificidade gt 98 mesmo para as patologias de controlo muito superior que se pode obter com os testes usados individualmente O t tulo dos ANCA relaciona se apesar de algumas excep es com a actividade da doen a portanto para a monitoriza o dos doentes aconselha se a utiliza o de met dicas quantitativas para a dosagem de ANCA MPO ou de ANCA PR3 A especificidade dos ANCA MPO ou PR3 n o permite diferenciar as diferentes VAA GW PAM GNNEP SCS contudo a presen a de P ANCA MPO ANCA tende mais para um diagn stico de PAM ou de GNNEP enquanto uma positividade C ANCA PR3 ANCA mais frequentemente associada GW Na GW e na PAM incluindo a forma limitada aos rins em fase activa a preval ncia dos ANCA de 70 a 90 na SCS os ANCA est o presentes em apenas 40 dos doentes com a MPO como especificidade antig nica prevalente No que respeita utilidade diagn stica do dado laboratorial til recordar que os valores preditivos positivo e negativo VPP VPN dependem para al m da sensibilidade e especificidade do teste da pr
27. ui es escalares de 3 soros de concentra o elevada de IgG anti MPO executadas com o Diluente de Amostras Os resultados deste estudo est o resumidos na tabela seguinte IFU018ZENIT RA Vers o 01 10 de Fevereiro de 2010 P gina 13 de 17 ZENIT RA MPO REF 41428 Concentra o Concentra o Amostra Se te medida prevista caia g UA mL UA mL o r 2 3 De qualquer modo torna se necess rio sublinhar que nem todos os soros quando medidos em dilui es diferentes podem dar resultados lineares dentro do intervalo de medi o dependendo o resultado n o s da concentra o mas tamb m da afinidade dos anticorpos presentes na amostra Sensibilidade Anal tica A sensibilidade anal tica do kit ZENIT RA MPO exprimida como limite de detec o Limit of Detection LoD ou seja a menor quantidade de analito que o m todo capaz de medir foi determinada utilizando um protocolo baseado nas linhas guia do documento EP17 A dos Clinical and Laboratory Standards CLSI e a f rmula para o c lculo LoD LoB Cg SDs onde LoB representa o valor do Limit of Blank SDs o desvio padr o previsto pela distribui o da amostra a baixa concentra o e Cg deriva de 95 por cento da distribui o padr o de Gauss Foram utilizadas 4 amostras de baixa concentra o de analito determinadas uma s vez com dois Lotes de reagentes diferentes em 30 sess es diferentes O Li
28. zado quer dos reagentes a bordo Para executar a recalibra o analisar os dois calibradores A e B em triplicado e os controlos individualmente Os valores de concentra o obtidos com os controlos permitem validar a nova calibra o Assim que a recalibra o da master curve tiver sido aceite e memorizada todas as amostras seguintes poder o ser analisadas sem outra calibra o excepto nos seguintes casos quando estiver carregado a bordo do analisador um cartucho de reagentes com um lote novo quando os valores dos controlos n o estiverem dentro do intervalo de aceitabilidade quando for executada a opera o de manuten o do analisador quando tiver expirado a validade da master curve recalibrada O prazo de validade da master curve recalibrada para o kit ZENIT RA MPO de 15 dias A gest o da recalibra o accionada automaticamente pelo analisador Dosagem Premir o bot o de in cio 1 O sistema aspira 80 uL de Diluente de Amostras 40 uL de Part culas Magn ticas 100 uL de Diluente de Amostras e 4 uL de amostra ou controlo para os calibradores o soro positivo fornecido pr dilu do com o Diluente de Amostras e o volume recolhido de 104 uL As solu es e a suspens o aspiradas s o distribu das na cuvete de reac o A cuvete de reac o incubada no rotor a 37 durante 10 minutos Depois desta fase de incuba o as part culas magn ticas s o separadas e lavadas S
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