KIT DE EXTRAÇÃO MINI SPIN PLUS
Contents
1. IMPORTANTE Aliquotar a quantidade de Tamp o de Elui o necess ria para o n mero de amostras e colocar no termomixer a 56 C 1 Transferir 200 uL de sangue total ou 30 pL de buffy coat dentro de um microtubo de 1 5 mL n o fornecido Para amostras com volumes menores de 200 uL completar o volume com PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o 2 Adicionar 200 uL de Tamp o de Lise A e 20 uL de Proteinase K Homogeneizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva 3 Incubar o microtubo de 1 5 mL por 15 minutos a 56 C enquanto estiver em agita o continua no termomixer Obs Caso n o tenha um equipamento com agita o homogeneizar a amostra cinco vezes no vortex durante a lise 4 Adicionar 400 uL de Tamp o de Liga o B6 e homogeneizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva Transferir toda a mistura para o Tubo Spin RTA e incubar por 1 minuto 5 Centrifugar por 2 minutos a 13 000 x g Descartar o tubo inferior com o filtrado e colocar o tubo filtro em um Tubo de Coleta RTA 6 Adicionar 500 uL de Tamp o de Lavagem e centrifugar por 1 minuto a 13 000 x g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 7 Adicionar 800 uL de Tamp o de Lavagem Il e centrifugar por 1 minuto a 13 000 x g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 8 Centrifugar por 4 minutos na velocidade m xima para eliminar completamente o etanol 9 Colocar o t2. R36 Irritante para os olhos R36 37 38 Irritante para os olhos sistema respirat rio e pele R42 Pode causar sensibiliza o pela inala o R52 53 Nocivo para organismos aqu ticos pode causar efeitos adversos em longo prazo no ambiente aqu tico R67 Vapores podem causar sonol ncia e tonturas S2 Manter fora do alcance das crian as S7 Manter o recipiente bem fechado S13 Manter longe de comida bebida e comida de animais S16 Manter longe de fontes de igni o N o fumar S22 N o inalar o p S24 25 Evitar contato com a pele e olhos 526 Em caso de contato com os olhos lavar imediatamente com gua abundante e procurar aconselhamento m dico S36 37 Usar roupas e luvas protetoras e adequadas S61 Evitar libera o no meio ambiente Consultar instru es especiais ficha de seguran a 6 AMOSTRAGEM E ARMAZENAMENTO DE ACORDO COM O TIPO DE AMOSTRA BIOL GICA Sangue Total e Creme Leucocit rio Buffy coat Os melhores resultados s o obtidos empregando amostras frescas Amostras de sangue total conservadas com EDTA ou citrato podem ser armazenadas a temperatura ambiente por 2 a 3 horas para uma armazenagem r pida at 24 horas as amostras podem ser armazenadas a 4 C Para longos per odos de armazenamento recomendado o congelamento das amostras a 20 C ou 80 C Congelamento e descongelamentos seguidos antes da extra o do DNA devem ser evitados Se houver a presen a de crioprecipitados formados no desc
3. 2108 5252 DDG 0800 726 0504 E mail biometrixQbiometrix com br Site www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 Respons vel T cnica Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 08 10 2013 ralada Uau mac Xe Rafaela Wassmansdorf Laborat rio Assinado por Rafaela Wassmansdorf
4. a x A no 50 EXTRA ES 250 EXTRA ES C digo do produto BP099 10 BP100 50 BP101 250 Tamp o de Lise A 2x1 25mL 1x1 mL 1x55 mL Proteinasen PE io Ra pe aus Ea Tamp o de Liga o B6 1x4 5 mL 1x22 mL 2x55mL Tamp o de Lavagem 1x mie 1x O E 1a E me volume final 6 mL volume final 30 mL volume final 160 mL Tamp o de Lavagem II 1x E me 1 ai a E feia volume final 10 mL volume final 50 mL volume final 2 x 150 mL Tamp o de Elui o 2X 1 25 mL 1x11 mL 1x55 mL Tubo Spin RTA 10 unid 50 unid 5 x 50 unid Tubo de Coleta RTA 10 unid 50 unid 5 x 50 unid Tubo de Elui o 1 5mL 10 unid 50 unid 5 x 50 unid Manual de Instru es 01 unid 01 unid 01 unid Verificar item 9 Preparo dos Reagentes e item 8 Reagentes e Equipamentos necess rios mas n o fornecidos s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 4 ARMAZENAMENTO DOS REAGENTES Todos os tamp es e componentes do BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus exceto a Proteinase K devem ser armazenados em temperatura ambiente entre 15 e 30 C e s o est veis por 18 meses nestas condi es Proteinase K A Proteinase K liofilizada deve ser armazenada em geladeira entre 2 e 8 C A Proteinase K reconstitu da deve ser armazenada a 20 C recomenda se dividir a solu o em al quotas para o armazenamento no freezer Esta solu o pode eventualmente apresentar aspecto leitoso principalmente em fun o de repetidos ciclos de congelamento e descongelamento
5. armazenamento prolongado ou dilui o errada situa es tais que devem ser evitadas Entretanto verificou se que esse aspecto leitoso n o interfere no desempenho do produto N o recomendado dar spin na solu o leitosa pois pode haver forma o de pellet Levando perda de atividade Tamp es de Lavagem Os Tamp es de Lavagem I e Il nos quais foi adicionado etanol devem ser apropriadamente fechados e armazenados em temperatura ambiente entre 15 e 30 C Antes de cada uso ter certeza que os componentes est o em temperatura ambiente Se alguma solu o apresentar precipitado dissolva o com cuidadoso aquecimento at 30 C 5 INFORMA ES DE SEGURAN A Sempre que estiver trabalhando com solu es qu micas e amostras biol gicas EPIs s o recomendados conforme normas de seguran a regulamentadas Depois de receber o kit verificar se as embalagens dos componentes est o danificadas ou se h vazamento dos l quidos Se os frascos de tamp es estiverem danificados ou com vazamento usar luvas e culos de prote o quando descartar os frascos para evitar acidentes N o usar componentes danificados pois eles podem gerar baixo rendimento Sempre trocar as ponteiras entre as transfer ncias de l quidos para evitar a contamina o cruzada recomendado o uso de ponteiras com filtro Toda a centrifuga o deve ser realizada em temperatura ambiente N o misturar componentes de kits diferentes se n o forem o mesmo lote
6. o tubo inferior com o filtrado e colocar o tubo filtro em um Tubo de Coleta RTA 5 Adicionar 500 uL de Tamp o de Lavagem e centrifugar por 1 minuto a 13 000 x g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 6 Adicionar 800 uL de Tamp o de Lavagem Il e centrifugar por 1 minuto a 13 000 x g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 7 Centrifugar por 4 minutos na velocidade m xima para eliminar completamente o etanol 8 Colocar o tubo filtro em um Tubo de Elui o 1 5 mL devidamente identificado Adicionar 200 uL de Tamp o de Elui o pr aquecido Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto Obs Destacar a tampa do tubo filtro antes da centrifuga o e coloc lo novamente no correspondente Tubo de Elui o 1 5 mL sv BIOKPUR Rev 02 Out 2013 9 Centrifugar 8 000 x g por 1 minuto Descartar o tubo filtro e armazenar a amostra de DNA para testes futuros NOTA O DNA pode tamb m ser elu do com pouco mas n o menos que 30 uL ou grande volume de Tamp o de Elui o dependendo do rendimento esperado ou concentra o necess ria do DNA s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 PROTOCOLO 4 e Extra o de DNA gen mico a partir de sangue total aplicado no cart o Biopur Seguir as recomenda es abaixo para coleta de amostra utilizando o cart o Biopur a Utilizar luvas b Identificar o cart o com a informa o apropriada N o escrever n
7. pipetagem repetitiva 3 Incubar o microtubo de 1 5 mL por 30 minutos a 56 C enquanto estiver em agita o cont nua em um termomixer Obs Caso n o tenha um equipamento com agita o homogeneizar a amostra cinco vezes no vortex durante a lise 4 Homogeneizar no vortex por 1 minuto espremer macerar os discos com uma ponteira 5 Centrifugar a 13 000 x g por 1 minuto e transferir o sobrenadante para novo microtubo de 1 5 mL n o fornecido e descartar os discos 6 Adicionar 400 uL de Tamp o de Liga o B6 e homogeneizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva Transferir toda a mistura para o Tubo Spin RTA e incubar por 1 minuto 7 Centrifugar por 2 minutos a 13 000 x g Descartar o tubo inferior com o filtrado e colocar o tubo filtro em um Tubo de Coleta RTA 8 Adicionar 500 pL de Tamp o de Lavagem e centrifugar por 1 minuto a 13 000 x g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 9 Adicionar 800 uL de Tamp o de Lavagem Il e centrifugar por 1 minuto a 13 000 x g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 10 Centrifugar por 4 minutos na velocidade m xima para eliminar completamente o etanol 11 Colocar o tubo filtro em um Tubo de Elui o 1 5 mL devidamente identificado Adicionar 50 100 uL para 2 ou 4 discos respectivamente de Tamp o de Elui o pr aquecido Incubar em temperatura ambiente por 1 minuto Obs Destacar a tampa do tubo
8. secagem tempo de armazenamento modo e tempo de armazenamento A quantidade de DNA purificado depende do tipo de amostra e do n mero de c lulas na amostra que varia conforme a idade do paciente e seu estado de sa de e conforme condi es de transporte armazenamento e idade das amostras Normalmente uma amostra de 200 uL de sangue total contagem de c lulas brancas intervalo de 3 x 10 a 1 x 10 c lulas mL de um indiv duo sadio rende de 3 a 10 ug de DNA O rendimento t pico do kit de at 10 Lg de DNA Se uma amostra de sangue total for tratada com solu es tamp o contendo anticoagulantes a contagem total de leuc citos diminuir e o rendimento de DNA do processo de extra o ser reduzido O rendimento pode ser aumentado se o tempo de incuba o com o Tamp o de Elui o pr aquecido for prolongado Para a maioria das amostras de sangue total uma nica elui o com 200 uL de Tamp o de Elui o suficiente Para amostras com elevada concentra o de c lulas brancas aproximadamente 80 do DNA ser elu do nos primeiros 200 uL e at 20 mais nos seguintes 200 uL O rendimento e a qualidade do DNA gen mico extra do aplic vel em qualquer sistema de detec o de diagn stico molecular Os testes de diagn stico devem ser realizados de acordo com as especifica es do fabricante 3 COMPOSI O DO KIT INFORMA ES 10 EXTRA ES
9. 0 extra es e Adicionar 1050 uL de gua ultrapura bidestilada ou de inje o ao frasco de Proteinase K e misturar cuidadosamente e Adicionar 15 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem 1 Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado e Adicionar 35 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Il Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado Kit para 250 extra es e Adicionar 1050 uL de gua ultrapura bidestilada ou de inje o ao frasco de Proteinase K e misturar cuidadosamente e Adicionar 80 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem 1 Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado e Adicione 105 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Il Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 10 PROTOCOLOS As instru es a seguir s o v lidas para todos os protocolos Antes de iniciar o procedimento e Ligar o termomixer a 56 C e Aquecer a quantidade necess ria do Tamp o de Elui o a 56 C para o passo final de elui o e Identificar a quantidade necess ria de Tubo Spin RTA cada amostra 1 unid e Identificar a quantidade necess ria de Tubo de Elui o 1 5mL cada amostra 1 unid NOTA As velocidades de rota o rpm necess rias podem variar de uma marca de centr fuga para outra PROTOCOLO 1 e Extra o de DNA gen mico de 200 uL de sangue total humano ou de mam fero e Extra o de DNA gen mico de 30 uL de creme leucocit rio buffy coat
10. Evitar contamina o microbiana dos reagentes do kit Para minimizar risco de infec es recomendado trabalhar em c mara de fluxo laminar Este kit deve ser usado apenas por pessoal treinado Armazenar os qu micos e pl sticos em condi es pr prias para uso em laborat rio Os res duos gerados pelo uso dos kits n o foram testados Contamina es causadas pelos res duos s o rar ssimas mas n o podem ser completamente descartadas Portanto os res duos devem ser considerados como material infeccioso e devem ser manuseados de acordo com as normas de seguran a regulamentadas Caso sejam necess rias mais informa es a respeito do produto favor entrar em contato com a Biometrix solicitando a Ficha de Informa es de Seguran a de Produto Qu mico FISPQ do produto Ver a seguir classifica o de riscos e frases de seguran a utilizadas internacionalmente que se aplicam aos componentes do BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus sv BIOKPUR Rev 02 Out 2013 PRODUTOS RISCOS Tamp o de Lise A R36 S2 S24 Tamp o de Liga o B6 R11 36 67 S2 7 16 524 25 26 Proteinase K R36 37 38 S42 S2 S22 24 26 S36 37 Tamp o de Lavagem R20 21 22 32 S2 13 LEGENDA DOS RISCOS R1 Altamente inflam vel R20 21 22 Nocivo por inala o contato com a pele e se ingeridos R32 Contato com gases muito t xicos liberados de cidos
11. a rea delimitada para coleta c Manusear o cart o pelas extremidades para evitar contamina o cruzada N o tocar nas reas que ser o utilizadas para coleta da amostra Para amostra de sangue total coletada com lanceta a Limpar a rea a ser perfurada com antiss ptico len os com lcool isopropil swab com iodo ou algod o gaze com lcool A perfura o deve ser realizada com for a suficiente para penetra o da lanceta que sustente um fluxo de v rias gotas de sangue Utilizar uma lanceta est ril e descart vel para perfurar a pele na lateral da extremidade do dedo O procedimento de coleta deve fornecer pelo menos 200 ul de sangue total b Com o dedo estendido permitir que uma grande gota se forme e se acumule no local da perfura o Para coletar a gota encostar o cart o na borda da gota permitindo que o sangue seja absorvido pelo papel por capilaridade Evitar que o dedo entre em contato com o cart o Deixar outra gota de sangue se acumular e coletar na rea ao lado da primeira coleta N o acumular gotas de sangue uma sobre as outras Continuar a coleta at preencher todos os c rculos do cart o ou at que a perfura o se feche Se a perfura o se fechar antes de coletar material suficiente ela pode ser massageada levemente para encorajar a forma o de nova gota de sangue N o apertar a perfura o para obter mais sangue Se a coleta for incompleta este procedimento poder ser repetido em um dedo adjacente
12. c importante que a coleta seja adequada saturando cada c rculo com sangue sem sobrepor gotas em uma mesma rea d Fornecer um peda o de algod o para cobrir a rea perfurada Para amostra de sangue total coletada em tubo de coleta e Sangue venoso com anticoagulante EDTA ou ACD deve ser depositado no cart o o quanto antes ap s sua coleta e preferencialmente em 24 horas ap s a coleta Para amostras rec m coletadas inverter o tubo de coleta 2 3 vezes para homogeneizar o sangue total Abrir cuidadosamente o tubo de coleta f Utilizar uma micropipeta com ponteira descart vel para aspirar 15 ul do sangue total sem encostar a ponteira no cart o dispensando a amostra no c rculo repetir a aplica o em rea adjacente at completar a rea completamente sem sobrepor a amostra 5 6 aplica es de 15 ul Alternativamente utilizar uma pipeta Pasteur ou um meio de transfer ncia apropriado limpo e est ril para saturar a rea do cart o sem sobrepor a amostra Secagem do cart o com amostra de sangue O tempo para secagem da amostra ir depender da temperatura ambiente e das condi es de umidade Em geral recomenda se secar todas as amostras por pelo menos 4 horas preferencialmente durante a noite em posi o suspensa horizontal em um rack de secagem se dispon vel ou na horizontal sob um papel toalha limpo em fluxo laminar ou capela N o utilizar nenhuma fonte externa de calor para secar a amostra Quando seca a am
13. filtro antes da centrifuga o e coloc lo novamente no correspondente Tubo de Elui o 1 5 mL sv BIOXPUR Rev 02 Out 2013 12 Centrifugar 8 000 x g por 1 minuto Descartar o tubo filtro e armazenar a amostra de DNA para testes futuros NOTA O DNA pode tamb m ser elu do com pouco mas n o menos que 30 uL ou grande volume de Tamp o de Elui o dependendo do rendimento esperado ou concentra o necess ria do DNA 11 CONTROLE DE QUALIDADE O fabricante e o distribuidor garantem a fun o correta do BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus para as aplica es descritas neste manual assegurando um produto de qualidade consistente s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 12 INFORMA ES PARA PEDIDO PRODUTO TAMANHO DA EMBALAGEM C DIGO DO PRODUTO BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus 50 50 testes BP100 50 BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus 250 250 testes BP101 250 13 INFORMA ES DO FABRICANTE SR Com rcio de Produtos para Laborat rios Ltda EPP Rua Para so do Norte 866 CEP 83 324 221 Pinhais PR Tel 41 2108 5295 Fax 41 3667 2660 E mail assessoriacientificaesrprodulab com br Site www srprodulab com br CNPJ 04 645 160 0001 49 Respons vel T cnica Franciele Camila Kimura CRF PR 19247 14 DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Rua Estrada da Graciosa 1081 Curitiba Paran Brasil CEP 82 840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41
14. mico livre de RNA for necess rio recomenda se adicionar 20 uL de solu o estoque RNase A 20 mg mL amostra antes da adi o do Tamp o de Liga o Remo o dos Contaminantes Residuais Os contaminantes s o eficazmente removidos usando Tamp o de Lavagem e Il enquanto o DNA gen mico permanece ligado membrana Depois da lavagem a membrana dever ser seca por centrifuga o s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 Elui o O DNA gen mico elu do usando Tamp o de Elui o e est pronto para uso em diferentes aplica es pode ser armazenado entre 4 e 8 C por no m nimo 2 meses ou at 5 anos se armazenado a 20 C 8 EQUIPAMENTOS E REAGENTES NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS Centr fuga para microtubos Termomixer 56 C Proveta 250 mL Micropipetas monocanais e ponteiras com filtro Vortex Microtubos de 1 5 mL extras Perfurador e suporte para recortar discos do cart o Biopur Etanol PA gua ultrapura ou bidestilada ou de inje o PBS 1X opcional 9 PREPARO DOS REAGENTES Kit para 10 extra es Amostra e Adicionar 500 uL de gua ultrapura bidestilada ou de inje o ao frasco de Proteinase K e misturar cuidadosamente e Adicionar 3 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado e Adicionar 7 mL de etanol PA ao Tamp o de Lavagem Il Misturar cuidadosamente e manter o frasco bem fechado Kit para 5
15. neizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva Transferir toda a mistura para o Tubo Spin RTA e incubar por 1 minuto 5 Centrifugar por 2 minutos a 13 000 x g Descartar o tubo inferior com o filtrado e colocar o tubo filtro em um Tubo de Coleta RTA 6 Adicionar 500 uL de Tamp o de Lavagem e centrifugar por 1 minuto a 13 000g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 7 Adicionar 800 uL de Tamp o de Lavagem Il e centrifugar por 1 minuto a 13 000g Descartar o filtrado e colocar o tubo filtro no mesmo Tubo de Coleta RTA 8 Centrifugar por 4 minutos na velocidade m xima para eliminar completamente o etanol 9 Colocar o tubo filtro em um Tubo de Elui o 1 5mL devidamente identificado Adicionar 200 uL de Tamp o de Elui o pr aquecido Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto Obs Destacar a tampa do tubo filtro antes da centrifuga o e coloc lo novamente no correspondente Tubo de Elui o 1 5 mL 10 Centrifugar 8 000g por 1 minuto Descartar o tubo filtro e armazenar a amostra de DNA para futuros testes NOTA O DNA pode tamb m ser elu do com pouco mas n o menos que 30 pL ou grande volume de Tamp o de Elui o dependendo do rendimento esperado ou concentra o necess ria do DNA s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 PROTOCOLO 3 e Extra o de DNA gen mico de 200 uL Fluido Cerebroespinhal CSF e Extra o de DNA gen mico de 20 uL de Medula ssea e Ex
16. ongelamento de amostras congeladas evitar aspir los pois eles poder o entupir a membrana do tubo V rios tipos de tubos prim rios sistema de coleta de sangue e anticoagulantes podem ser usados para a coleta de sangue com exce o de heparina Creme leucocit rio a fra o do sangue total rica em c lulas brancas Para preparar e extrair a camada de creme leucocit rio recomenda se o seguinte processo Usar uma amostra de sangue total anticoagulantes EDTA ou citrato com uma fra o sedimento celular proveniente de um repouso durante a noite a 4 C A camada clara logo abaixo ao plasma o creme leucocit rio contendo leuc citos que s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 podem ser facilmente distinguidos dos eritr citos da camada inferior Um fator de enriquecimento de 10 esperado a partir desse processo portanto devido a esse enriquecimento leucocit rio ficar atento para evitar uma sobrecarga no processo de extra o de DNA Fluido Cerebroespinhal CSF e Medula ssea Os melhores resultados s o obtidos de amostras frescas As amostras podem ser armazenadas a 4 C por 2 a 3 horas Para um per odo maior congelar as amostras a 20 C comum ocorrer o ressecamento das amostras As amostras secas devem ser armazenadas em refrigerador a 4 C em ambiente livre de umidade Cart o Biopur Certificar se de que a amostra est completamente seca antes da armazenagem fornecendo tempo suficiente para o passo de secagem Os cart e
17. ostra coletada ter um aspecto marrom uniforme e nenhuma rea com colora o avermelhada deve ser observada s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 Considera es importantes na presen a de umidade os cidos nucl icos nas amostras aplicadas no cart o s o extremamente sens veis degrada o sendo essencial se assegurar de que as amostras estejam completamente secas e com sach dessecante com indicador de umidade Ao abrir envelopes armazenados sob refrigera o ou congelamento importante equilibrar o envelope em temperatura ambiente antes de abri lo Abrir envelopes imediatamente ap s sua retirada de baixas temperaturas poder resultar na condensa o das amostras no interior do envelope Assegurar se que os dissecantes n o cont m umidade e que permaneceram secos durante sua armazenagem Eles podem ser secos e ou reutilizados em estufa a 65 C overnight Retirar da estufa e armazenar em uma embalagem selada Os envelopes devem ser pr prios para armazenagem de amostras biol gicas imperme veis a gases IMPORTANTE Aliquotar a quantidade de Tamp o de Elui o necess ria para o n mero de amostras e colocar no termomixer a 56 C 1 Recortar com perfurador sobre suporte apropriado de 2 a 4 discos de 2 0 mm cada em um microtubo de 1 5 mL n o fornecido Recortar 2 discos do papel em branco entre amostras diferentes 2 Adicionar 200 uL de Tamp o de Lise A e 20 uL de Proteinase K Homogeneizar a amostra no vortex ou por
18. s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 KIT DE EXTRA O MINI SPIN PLUS Instru es de Uso 1 USO PRETENDIDO O BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus a ferramenta ideal para uma extra o e purifica o manual simples r pida e eficiente de DNA gen mico empregando tubo filtro Devido ao alto grau de pureza o DNA extra do est pronto para ser utilizado em an lises de diagn stico in vitro e em outras aplica es aplicado para as seguintes amostras e Sangue total de mam feros e Creme leucocit rio buffy coat e Sangue de n o mam feros tais como aves e peixes e Fluido cerebroespinhal CSF e Medula ssea e Cart o Biopur com amostra de sangue total N o existe estudo de valida o publicado para a extra o de DNA gen mico de c lulas isoladas ou oriundas de cultura tecido swabs ou fluidos corp reos livres de c lulas como fluido sinovial e urina fezes bact rias fungos parasitas ou para a extra o de RNA total A aplica o do kit para a extra o e purifica o de DNA viral n o foi avaliada Para outras valida es entrar em contato com o nosso Laborat rio O BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus designado para o processamento de m ltiplas amostras simultaneamente O procedimento r pido e n o requer uma extra o com fenol e clorof rmio ou precipita o em etanol requerendo m nima intera o com o usu rio O procedimento foi desenvolvido para evitar contamina o cruzada de amo
19. s devem ser embalados individualmente em um envelope apropriado imperme vel a l quidos e gases com veda o e prote o da luz contendo 2 3 saches indicativos de s lica para remover qualquer umidade residual Certificar se de que a mesma informa o de identifica o esteja presente no cart o e no envelope Os cart es embalados em envelopes podem ser armazenados em temperatura ambiente Para armazenagem em longo prazo e melhor rendimento armazene os cart es embalados em envelopes em geladeira ou freezer 7 PROCEDIMENTO O BIOPUR Kit de Extra o Mini Spin Plus abrange as seguintes etapas Lise da amostra Liga o do DNA gen mico membrana do tubo Lavagem da membrana e elimina o do etanol Elui o do DNA gen mico AWUN Lise Para um melhor resultado as amostras devem estar em temperatura ambiente antes da lise As amostras sofrem lise na presen a de Tamp o de Lise A e da Proteinase K em temperaturas elevadas Liga o do DNA Gen mico Pela adi o do Tamp o de Liga o B6 ao lisado condi es timas de liga o ser o obtidas Cada lisado ent o transferido ao Tubo Spin RTA e o DNA gen mico ir ligar se membrana As condi es timas de pH e salina garantem que contaminantes como prote nas que podem inibir rea es de PCR ou outras rea es n o sejam retidas na membrana de s lica NOTA DNA e RNA s o purificados em paralelo se ambos estiverem presentes na amostra Se um DNA gen
20. stras e permitir um manuseio seguro de amostras potencialmente contaminantes Devido alta pureza o DNA gen mico extra do fica pronto para uso em um grande painel de aplica es em Biologia Molecular ou poder ser armazenado a 20 C para uso subsequente Aplica es em Biologia Molecular e PCR convencional e Digest o por Enzima de Restri o e An lises SNP e Tipagem HLA e Clonagem O produto indicado para uso por profissionais treinados em t cnicas de biologia molecular Quaisquer resultados gerados utilizando o procedimento de prepara o de amostras em conjunto com qualquer an lise de diagn stico devem ser interpretados considerando outras conclus es cl nicas e laboratoriais Para minimizar irregularidades nos resultados de diagn sticos controles adequados devem ser empregados Rev 02 Out 2013 2 CARACTER STICAS DO PRODUTO AMOSTRA INICIAL RENDIMENTO TEMPO RAZ O 1 200 uL sangue total de mam feros At 10 ug em m dia 6 ug 1 30 uL de creme leucocit rio buffy coat dependendo da qualidade AZ60 A280 1 25 uL de sangue de n o mamiferos origem e idade da amostra 30 minutos 1 7 2 0 f 1 200 uL fluido cerebroespinhal seu transporte e f 1 20 uL de medula ssea armazenamento A260 A280 At 160 ng por disco dependente da 2 a 4 discos de 2 mm de cart o Biopur com dependendo da aplica o da 45 mi aplica o da minutos amostra de sangue total amostra secagem modo e amostra
21. tra o de DNA gen mico de pequenas quantidades de v rios tipos de amostras humanas e de mam feros IMPORTANTE Aliquotar a quantidade de Tamp o de Elui o necess ria para o n mero de amostras e colocar no termomixer a 56 C a Material Fresco Adicionar 200 uL de fluido cerebroespinhal ou 20 uL de medula ssea em um microtubo de 1 5 mL n o fornecido Para amostras com volumes menores de 200 uL completar o volume com PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o b Material Seco Tratar este material por exemplo l minas hematol gicas como descrito a seguir e Umedecer o material seco com 1 gota de PBS 1X e Adicionar 180 uL de PBS 1X a um microtubo de 1 5 mL n o fornecido e Raspar o material citol gico dentro do microtubo usando o canto de uma l mina limpa e Dissolver o raspado resultante por pipetagem repetitiva 1 Adicionar 200 uL de Tamp o de Lise A e 20yL de Proteinase K Homogeneizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva 2 Incubar o microtubo de 1 5 mL por 20 minutos a 56 C enquanto estiver em agita o cont nua em um termomixer Obs Caso n o tenha um equipamento com agita o homogeneizar a amostra cinco vezes no vortex durante a lise 3 Adicionar 400 uL de Tamp o de Liga o B6 e homogeneizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva Transferir toda a mistura para o Tubo Spin RTA e incubar por 1 minuto 4 Centrifugar por 2 minutos a 13 000 x g Descartar
22. ubo filtro em um Tubo de Elui o 1 5 mL devidamente identificado Adicionar 200 uL de Tamp o de Elui o pr aquecido Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto Obs Destacar a tampa do tubo filtro antes da centrifuga o e coloc lo novamente no correspondente Tubo de Elui o 1 5 mL 10 Centrifugar 8 000 x g por 1 minuto Descartar o tubo filtro e armazenar a amostra de DNA para futuros testes s BIOXPUR Rev 02 Out 2013 NOTA O DNA pode tamb m ser elu do com pouco mas n o menos que 30 pL ou grande volume de Tamp o de Elui o dependendo do rendimento esperado ou concentra o necess ria do DNA PROTOCOLO 2 e Extra o de DNA gen mico de 25 uL de sangue total de n o mam feros IMPORTANTE Aliquotar a quantidade de Tamp o de Elui o necess ria para o n mero de amostras e colocar no termomixer a 56 C 1 Transferir 25 uL de sangue total dentro de um microtubo de 1 5 mL n o fornecido Completar o volume para 200 uL com PBS 1X ou gua ultrapura bidestilada ou de inje o 2 Adicionar 200 uL de Tamp o de Lise A e 20yL de Proteinase K Homogeneizar a amostra no vortex ou por pipetagem repetitiva 3 Incubar o microtubo de 1 5 mL por 25 minutos a 56 C enquanto estiver em agita o cont nua no termomixer Obs Caso n o tenha um equipamento com agita o homogeneizar a amostra cinco vezes no vortex durante a lise 4 Adicionar 400 uL de Tamp o de Liga o B6 e homoge
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