RTSD01-V - Biometrix
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1. o de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados n o v lidos N o utilizar com este produto o DNA extra do contaminado com hemoglobina a hemoglobina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e pode causar resultados n o v lidos a hemoglobina interfere na medi o da fluoresc ncia e pode causar resultados indeterminados ou incorretos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos Os resultados obtidos com este produto dependem da correta recole o transporte conserva o e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos O m todo de amplifica o real time dos cidos nucleicos utilizados neste produto por causa da sua elevada sensibilidade anal tica est sujeito contamina o por parte das amostras cl nicas dos controles positivos e dos mesmos produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados incorretos A modalidade de realiza o do produto pode limitar as contamina es mas estes fen menos podem ser evitados somente com uma boa pr tica das t cnicas de laborat rio e seguindo atentamente as instru es fornecidas neste manual Este produto requer pessoal instru do para a manipula o de amostras biol gicas que po2. confirmar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte Rea o Controle negativo Amplifica o Detec o cT FAM Indeterminado CORRETO cT VIC Indeterminado CORRETO Onde cT FAM o Ciclo limiar do alelo normal e cT VIC o Ciclo limiar do alelo mutado Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negativo diferente de Indeterminado Undetermined foi detectada a presen a de DNA branco na rea o de amplifica o Problemas ocorreram na fase de amplifica o contamina o que podem ter levado a resultados incorretos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores dos cT relativos s sondas espec ficas para os alelos normais FV 1691G FAM e mutado FV 1691A VIC na rea o de amplifica o do Controle Positivo s o utilizados para confirmar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte Rea o Controle Positivo Amplifica o Detec o 20 lt cT FAM lt 25 CORRETO 20 lt cT VIC lt 25 CORRETO zero lt cT FAM cT VIC lt 1 5 CORRETO 8 mm Rev 04 Out 2013 Onde cT FAM cT VIC o valor absoluto da diferen a entre o cT do alelo normal e o cT do alelo mutado Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle positivo n o est dentro dos limites isso significa que problemas ocorreram durante a fase de amplifica o ou detec o prepara o incorreta da mistura de rea
3. es de amostras exigidos na descri o abaixo CONDI ES DE ARMAZENAMENTO Refer ncia A Componente modelo Quantidade Estocagem Fator V G1691A Q PCR Alert AmpliMIX RTSD01 V M 4x 110 uL 20 C Fator V G1691A Q PCR Alert AmpliPROBE RTSD01 V P 4x 110 uL 20 C Q PCR Alert AmpliMASTER 4 x 340 uL 2 8 C Microplaca para amplifica o RTS000 3 Temp Ambiente L mina adesiva para amplifica o 3 Temp Ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico in vitro Manuseio ao manusear o kit e as amostras utilizar EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano N o beber ou comer na rea de trabalho A rea de trabalho deve ser um ambiente limpo e com ventila o adequada Trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo laminar N o manusear o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser 3 mm Rev 04 Out 2013 tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 12
4. este produto Este risco res duo n o pode ser eliminado ou reduzido posteriormente Este risco res duo em situa es particulares pode contribuir a decis es incorretas com consequ ncias potencialmente graves para o paciente 10 mm Rev 04 Out 2013 CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE aconselh vel confirmar o completo procedimento de an lise de cada sess o extra o e amplifica o utilizando uma amostra normal uma amostra homozigota mutada e uma amostra heterozigota j testadas VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Anal tica Limite de Detec o A sensibilidade anal tica deste teste como limite de detec o permite identificar a presen a de aproximadamente 14 000 mol culas de DNA branco correspondentes aos genomas de 7 000 c lulas ou a 50 ng de DNA gen mico humano nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o O limite de detec o foi verificado utilizando um DNA gen mico humano cuja concentra o foi determinada por leitura no espectrofot metro de absorb ncia a 260 nm O DNA gen mico humano foi empregado em uma quantidade de 50 ng por rea o em 50 repeti es para realizar o completo procedimento de an lise amplifica o e detec o com os pro
5. o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncia
6. 1 C durante uma hora antes de ser eliminado O material descart vel combust vel deve ser incinerado Os res duos l quidos que cont m cidos ou bases devem ser neutralizados antes da elimina o N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagentes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar as instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante N o intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra
7. NAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Controle Positivo podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo O Controle Positivo apresenta as seguintes advert ncias S S 24 25 Evitar contato com os olhos e pele PROCEDIMENTO O produto Fator V Controle Positivo deve ser usado com a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER gt Fator V Q PCR Alert AmpliMIX gt e Fator V Q PCR Alert AmpliPROBE gt O Controle Positivo Fator V est pronto para o uso portanto dev
8. Rev 04 Out 2013 RTSDO1 V Fator V G1691A Q PCR Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto FATOR V G1691A Q PCR Alert Kit Tempo Real pronto para uso parte de um teste quantitativo de amplifica o dos cidos nucleicos para a determina o al lica do l cus do Factor V da coagula o FV para o polimorfismo em nucleot deos nicos SNP G1691A R506Q Leiden em amostras de DNA extra do do sangue total colhido em EDTA O produto usado juntamente com os dados cl nicos e outros exames de laborat rio na avalia o do risco de trombose venosa profunda PRINC PIO DE A O E REA O O procedimento consiste na rea o de amplifica o em tempo real em microplaca com uma varia o e controle de temperatura program vel e sistema tico de detec o fluorescente simult nea rea o Termociclador em Tempo Real O teste prev a execu o de uma rea o de amplifica o real time em microplaca com um termostato program vel com sistema ptico de detec o da fluoresc ncia Termociclador para real time Em cada po o se efetua uma rea o de amplifica o espec fica para a regi o do gene humano do Factor V detectada pelo SNP G1691A utilizando o DNA extra do das amostras em exame Uma sonda espec fica para o alelo normal FV 1691G R506 marcada com o fluor foro FAM ativada quando hibridiza com o produto normal da rea o de amplifica o Outra sonda espec fica para o alelo mu
9. T para a confirma o igual a 27 5 O valor limite do cT foi estabelecido utilizando algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente homozigoto normal heterozigoto e homozigoto mutado As amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o Em 275 determina es 271 amostras deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 e 4 amostras deram um resultado n o v lido ambos os cT maiores que 27 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Homozigotas normais 112 110 0 2 0 Heterozigotas 110 108 0 2 0 Homozigotas mutadas 53 53 0 0 0 naturais Resist ncia valor da diferen a dos cT dos homozigotos A resist ncia deste teste permite determinar os homozigotos com uma frequ ncia superior a 99 com um valor da diferen a dos cT dos dois alelos maior ou igual a 2 5 O valor da diferen a dos cT dos dois alelos para os homozigotos foi estabelecido utilizando algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente homozigoto normal algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente homozigoto mutado e algumas amostras artificiais de DNA um plasm deo contendo a regi o de interesse que mimetizam um gen tipo homozigoto mutado As amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o Em 224 determina es 222 deram um
10. anced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA RTDS01 V M 80298490096 RTDS01 V P 80298490041 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon mm SIOMET RIX DIAGNOSTICA Rev 04 Out 2013 CTRDO1 V Fator V Controle Positivo Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto Fator V Controle Positivo destinado ao uso como um controle positivo em rea es de amplifica o seguidas de hibridiza o com probes fluorescentes para a determina o al lica para o polimorfismo em nucleot deos nicos SNP G1691A R506Q Leiden no locus do Fator V de coagula o com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER Fator V Q PCR Alert AmpliMIX gt e Fator V Q PCR Alert AmpliPROBE gt da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto fornece o Controle Positivo uma solu o estabilizada de plasm deos contendo a sequ ncia requerida divididas em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo de teste cont m 65 uL de solu o suficiente para 12 sess es O procedimento envolve o uso do Controle Positivo na rea o de amplifica o espec fica para a regi o g nica Fator V incluindo o SNP de interesse A detec o do produto espec fico da rea o de amplifica o confirma a habilidade do siste
11. as 110 108 0 2 0 Homozigotas mutadas naturais 53 53 0 0 0 Homozigotas mutadas 59 59 0 0 0 artificiais Especificidade anal tica capacidade de n o identificar como mutado o alelo normal A especificidade anal tica deste teste como capacidade de n o identificar como mutado o alelo normal superior a 99 A capacidade de identificar corretamente o alelo normal resultados corretos sobre resultados v lidos foi verificada utilizando algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente homozigoto normal e heterozigoto As amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o Em 222 determina es 218 deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 Em 218 determina es v lidas 218 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum homozigoto normal foi tomado por um heterozigoto e nenhum heterozigoto foi tomado por um homozigoto mutado nenhuma amostra deu um resultado Indeterminado diferen a entre os cT compreendida entre 2 0 e 2 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Homozigotas normais 112 110 0 2 0 Heterozigotas 110 108 0 2 0 OMETRIX DIAGN STICA Resist ncia valor limite do cT para a confirma o A resist ncia deste teste permite obter uma frequ ncia de amostras v lidas igual a 98 5 com um valor limite do c
12. de medi o C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS Interpreta o dos resultados Os valores registados da fluoresc ncia FAM emitidos pela sonda espec fica para o alelo normal FV 1691G s o identificados por detector nor FV 1691G FAM Os valores registrados da fluoresc ncia VIC emitidos pela sonda espec fica para o alelo mutado FV 1691A s o identificados por detector mu FV 1691A VIC Estes valores de fluoresc ncia das rea es de amplifica o devem ser analisados atrav s de software espec fico Antes de iniciar a an lise consultar o manual do equipamento e programar manualmente o Limiar Threshold para o detector nor FV 1691G a 0 2 programar manualmente o Limiar Threshold para o detector mu FV 1691A a 0 2 programar manualmente o intervalo de c lculo do N vel de fluoresc ncia de fundo Baseline do ciclo 6 ao ciclo 15 Os valores de fluoresc ncia emitidos pela sonda espec fica para os alelos normal FV 1691G e mutado FV 1691A nas rea es de amplifica o e o valor Limiar Threshold de fluoresc ncia s o utilizados para determinar o Ciclo limiar Threshold cT ou seja o ciclo de amplifica o no qual o valor de fluoresc ncia emitido por cada sonda atingiu o valor Limiar de fluoresc ncia Os valores dos cT relativos s sondas espec ficas para os alelos normais FV 1691G FAM e mutado FV 1691A VIC na rea o de amplifica o do Controle negativo s o utilizados para
13. dem transmitir agentes infecciosos e de prepara es qu micas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer roupas de trabalho e reas de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de prepara es qu micas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para o procedimento de biologia molecular como a extra o a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos Este produto requer uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados incorretos Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados incorretos Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos ou incorretos com
14. dir em mais al quotas as amostras para conservar congeladas de modo a n o submet las a ciclos de congelamento descongelamento repetidos As instru es para o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extra o do DNA est o contidas no manual de instru es para o uso de EXTRAcelL O Aconselha se introduzir na rea o de amplifica o uma quantidade de DNA extra do igual cerca 175ng correspondente de aproximadamente 25 000 c lulas N o introduzir na rea o de amplifica o uma quantidade de DNA extra do superior a 200 ng para evitar poss veis fen menos de hibrida o inespec fica ou a inibi o da emiss o da fluoresc ncia Subst ncias interferentes O DNA extra do da amostra de partida n o deve conter heparina para evitar fen menos de inibi o da amplifica o e a apari o de frequentes resultados n o v lidos O DNA extra do da amostra de partida n o deve conter hemoglobina para evitar fen menos de inibi o da amplifica o e da emiss o da fluoresc ncia e a apari o de frequentes resultados n o v lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos Controles de amplifica o absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o preparando uma rea o de controle negativo e uma rea o de controle positivo Para o controle negativo utilizar gua bidestilada est ril n o inclu da no kit para ac
15. dutos Nanogen Todos as r plicas s o resultados v lidos e determinados corretamente Amostra heterozigota N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas DNA gen mico humano 50 50 0 0 0 Sensibilidade anal tica capacidade de identificar o alelo mutado A sensibilidade anal tica deste teste como capacidade de identificar o alelo mutado superior a 99 A capacidade de identificar o alelo mutado resultados corretos sobre resultados v lidos foi verificada utilizando algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente heterozigoto algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente homozigoto mutado e algumas amostras artificiais de DNA um plasm deo contendo a regi o de interesse que mimetizam o gen tipo homozigoto mutado As amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o Em 222 determina es 220 deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 Em 220 determina es v lidas 220 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum heterozigoto foi tomado com um homozigoto normal e nenhum homozigoto mutado foi tomado por um heterozigoto nenhuma amostra deu um resultado Indeterminado diferen a entre os cT compreendida entre 2 0 e 2 5 11 Rev 04 Out 2013 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Heterozigot
16. e Longe do corante quencher a luz emitida do corante rep rter dye em estado excitado pode agora ser observada A padroniza o do sistema foi realizada nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 Componente Descri o Quantidade Composi o Fator V G1691A Q Menradebimenide Oligonucleotideos PCR Alert AmpliMIX oli e 4x 110 pL TRIS base e cloridrato RTSDO1 V M 8 Glicerol Triton X 100 Fator V G1691A Q N tura AR sondag Oligonucleot deos PCR Alert nugrescentes fluorescentes TRIS base e AmpliPROBE margada a 1 MGE TENU o cloridrato Glicerol Triton O e com VIC MGB NFQ RE TRIS base e cloridrato Glicerol MgCl aradeni Desoriboxinucleot deos PCR Al aptina 4x 340 uL trifosfatos ROX Uracil Pa ph P N glicosilase a Taq DNA polimerase hot j start Microplaca com d 96 pocinhos de 0 2 ml i Rss PE L mina adesiva vedante 3 Pl stico e cola mm SIOMET RIX AGN STICA 2 a Rev 04 Out 2013 MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos C mara de fluxo laminar Agitador tipo V rtex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifuga o 1 5mL a 2 0mL Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr
17. e ser usado adicionando 5 pL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o com termociclador com sistema ptico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso do produto Fator V Q PCR Alert AmpliMIX gt bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento Nota Os Controles Positivos podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS VOORBERG J et al 1994 The Lancet 343 1535 1536 BAKER R et al 1994 The Lancet 344 1162 mm SIOMET RIX oracn stica M mm IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490062 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Rev 04 Out 2013 Aprova o 20 12 2013 Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon 18 WORKSHEET 12 11 10 ATTACHMENT
18. ineficiente ou inv lida ou na fase de extra o aus ncia de DNA ou presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero de c lulas insuficiente que podem ter levado a resultados incorretos A amostra n o adequada o teste n o v lido e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra valor absoluto da diferen a entre cT FAM e cT VIC compreendido entre 2 0 e 2 5 isso significa que problemas ocorreram durante a fase de amplifica o amplifica o ineficiente ou na fase de extra o presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero de c lulas muito elevado que n o permitem a determina o al lica do gen tipo A amostra n o adequada o teste indeterminado e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente 9 mm Rev 04 Out 2013 LIMITA ES DO PROCESSO Utilizar precisamente com este produto o DNA extra do das seguintes amostras humanas sangue total colhido em EDTA N o utilizar com este produto uma quantidade de DNA extra do superior recomendada quantidades maiores de DNA extra do podem causar resultados incorretos ou Indeterminados N o utilizar com este produto o DNA extra do das amostras heparinizadas a heparina inibe a rea
19. lecido anteriormente no Plano de trabalho Nota Se n o se utiliza toda a mistura de rea o conservar o volume restante em ambiente escuro a 20 por um m ximo de um m s no tubo FATOR V Congelar e descongelar a mistura de rea o somente uma vez 6 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo 5 uL de DNA extra do da primeira amostra no correspondente pocinho da Microplaca de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho proceder igualmente com todos os outros DNA extra dos 7 Transferir depositando os cuidadosamente na mistura de rea o 5 pL de gua bidestilada est ril n o fornecida no kit no pocinho da Microplaca de amplifica o do controle negativo de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho 8 Transferir depositando os cuidadosamente na mistura de rea o 5 uL de Controle positivo no po o da Microplaca de amplifica o do controle positivo de amplifica o como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho 9 Fechar cuidadosamente a Microplaca de amplifica o com a L mina adesiva de amplifica o 10 Transferir a Microplaca de amplifica o no thermal cycler para real time na rea de amplifica o detec o dos produtos de amplifica o e iniciar o ciclo t rmico de amplifica o a Rev 04 Out 2013 CALIBRA O DO PROCESSO Para este tipo de ensaio e metodologia n o existe procedimento de calibra o para o processo
20. m tempo real total de 96 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descartar Usar jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipete solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N o misturar reagentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes de outros fabricantes Advert ncias e p
21. ma de determina o al lica em identificar a presen a apenas do tipo selvagem ou gene alelo mutado bem com para identificar uma amostra heterozigota O kit possibilita a execu o de 25 rea es de amplifica o usando 5uL por rea o MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o z Plasm deo TRIS base TRIS A EINA 2 x 65uL cloridrato EDTA RNA total Controle Positivo plasmideo de levedura e Armazenar a 20 C ou inferior MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Agitador V rtex Microcentr fuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 uL 50 200 pL gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador mm Rev 04 Out 2013 ACESS RIOS Os reagentes para amplifica o e detec o do DNA n o est o inclusas neste produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados e Q PCR Alert AmpliMASTER gt RTS000 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e Fator V Q PCR Alert AmpliMIX gt RTSDO1 V M primers oligonucleot deos para PCR em tempo real total de 96 rea es e Fator V Q PCR Alert AmpliPROBE RTSDO1 V P probes fluorescentes para PCR e
22. o dispensa o incorreta do controle positivo e das amostras degrada o da sonda posicionamento incorreto do controle positivo programa o incorreta do termociclador que podem ter levado a resultados incorretos A sess o inv lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores dos cT relativos s sondas espec ficas para os alelos normais FV 1691G FAM e mutado FV 1691A VIC na rea o de amplifica o de cada amostra s o utilizados para validar a amplifica o e a detec o e para a determina o al lica do gen tipo de cada amostra como descrito na tabela seguinte E E Adequa o Resultado Gen tipo da da amostra do teste amostra cT FAM gt 27 5 e cT VIC gt 27 5 Inadequado Inv lido T FAM Indet e cT VIC lt 27 5 os adequado v lido HOMOZICOTO CTFAM cTVIC gt 2 5 MUTANTE com cT FAM gt cT VIC cT FAM lt 27 5 ICT FAM lt 27 5 e cT VIC Indet ou ou ig HOMOZIGOTO cTVIC lt 27 5 CTFAM CTVIC gt 2 5 adequado v lido NORMAL com cT FAM lt cT VIC 2 0 lt cT FAM cT VIC lt 2 5 Inadequado v lido INDETERMINADO ERRO SE m CTVICI lt adequado v lido HETEROZIGOTO Onde cT FAM cT VIC o valor absoluto da diferen a entre o cT do alelo normal e o cT do alelo mutado Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT FAM gt 27 5 e cT VIC gt 27 5 isso significa que problemas ocorreram durante a fase de amplifica o amplifica o
23. o de exemplo como pode ser organizada a an lise de 11 amostras o VAR GR A VR VA V VA VR V a NININAINAINAINLNANALINLN AN ANA YW NV NV N NM Na Ny v A W W NANA AN AN AN LAN LN LAN LN AIRIA 7 V S S S S S NA N4 S SI NINA LN LAN LAN LN A do do de A AP VA VAR VA VA VAR VA VA VA VA VA VAR wa a l X D D o O T E T A Aa RS NR NOR NR NOS RS NR NOR NNE SNS AS gt N 4 AS Z PIN AIN INLINAINLINLIN AN LN AN i Aa Aa AIN AIN AIN LINLIN LN LN XX ANS SNS SNS N D N N IN AIN AIN AIN INN JE Significado A1 A6 Amostras para analisar CN Controle negativo de amplifica o CP Controle positivo de amplifica o IOMETRIX M DIAGN STI c Programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico e um volume de rea o de 25 uL Para equipamento Applied Biosystems ABI PRISMTM da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico de amplifica o o t 2 min Desnatura o inicial 95 C 10 min 95 C 15 seg 30 ciclos 60 C 1 min 6 FEFFFE EEE EEE e ee z E SS b Prepara o da amplifica o Antes de iniciar necess rio Para realizar na rea de extra o prepara o da rea o de amplifica o retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar Centrifugar os tubos para obter no fundo todo o conte do Mant lo em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necess rios para a sess o lembrando que o conte do de cada t
24. recau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transferir materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de 16 DO J J J G G GG J lj extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e R
25. reendida entre 2 0 e 2 5 0 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Heterozigotas 110 108 0 2 Indeterminadas DIAGN STICA Reprodutibilidade A reprodutibilidade deste teste como capacidade de obter em sess es diversas os mesmos resultados a partir das mesmas amostras superior a 95 A capacidade de obter em sess es diversas os mesmos resultados a partir das mesmas amostras foi verificada utilizando algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente homozigoto normal e heterozigoto As amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o Em 3 sess es de determina o al lica realizadas em dias diferentes com as mesmas 21 amostras 21 deram um resultado concordante Amostras N Sess es Concordantes Discordantes Homozigotas normais 14 3 14 0 Heterozigotas 6 3 6 0 Homozigotos mutados 1 3 1 0 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS VOORBERG J et al 1994 The Lancet 343 1535 1536 BAKER R et al 1994 The Lancet 344 1162 iOMETRIX 13 E eeee Y Te a TR Rev 04 Out 2013 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Adv
26. rescentar rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o controle positivo utilizar o DNA obtido de uma amostra positiva heterozigota j testada ou o CONTROLE POSITIVO Factor V mm Rev 04 Out 2013 PROCESSO DE MEDI O Preparo da etapa de amplifica o real time rea de p s PCR Antes de iniciar necess rio consultar o manual do equipamento e ligar o termociclador e o computador iniciar o software espec fico e abrir uma sess o absolute quantification programar primeiramente o detector para a sonda para o alelo normal nor FV 1691G com o reporter FAM e o quencher none NFQ um quencher n o fluorescente programar em segundo lugar o detector para a sonda para o alelo mutado mu FV 1691A com o reporter VIC e o quencher none NFQ um quencher n o fluorescente para qualquer po o em uso da microplaca programar o detector tipo de fluoresc ncia para medir o passive reference ROX normaliza o da fluoresc ncia medida e o tipo de rea o amostra controle negativo de amplifica o do controle positivo de amplifica o Compilar a planilha anexada ao final destas instru es de uso transcrevendo estas informa es ou imprimir a organiza o da microplaca A planilha dever ser seguida com aten o durante a transfer ncia nos pocinhos da mistura de rea o e das amostras Ilustra se logo abaixo a t tul
27. resultado v lido ao menos um dos cT menor ou e mm Rev 04 Out 2013 igual a 27 5 Em 222 determina es v lidas 222 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum homozigoto foi tomado por um heterozigoto nenhuma amostra deu um resultado n o determinado diferen a entre os cT compreendida entre 2 0 e 2 5 Amostras N Corretas Incorretas Inv lidas Indeterminadas Homozigotas normais 112 110 0 2 0 Homozigotas mutadas naturais 53 53 0 0 0 Homozigotas mutadas 59 59 0 0 0 artificiais Resist ncia valor da diferen a dos cT dos heterozigotos A resist ncia deste teste permite determinar os heterozigotos com uma frequ ncia superior a 99 com um valor da diferen a dos cT dos dois alelos compreendido entre 0 e 2 0 O valor da diferen a dos cT dos dois alelos para os heterozigotos foi estabelecido utilizando algumas amostras de sangue total de gen tipo sabidamente heterozigoto As amostras foram empregadas para realizar o completo procedimento de an lises extra o amplifica o e detec o Em 110 determina es 108 deram um resultado v lido ao menos um dos cT menor ou igual a 27 5 Em 108 determina es v lidas 108 amostras deram um resultado correto nenhuma amostra deu um resultado incorreto nenhum heterozigoto foi tomado por um homozigoto nenhuma amostra deu um resultado Indeterminado diferen a entre os cT comp
28. s e precau es espec ficas para os componentes e Os produtos FATOR V Q PCR Alert AmpliMIX FATOR V Q PCR Alert AmpliPROBE FATOR V AmpliSTANDARD Q PCR AmpliMASTER apresentam as seguintes advert ncias S S 23 25 N o respirar vapores aerossol Evitar o contato com os olhos Observa es importantes e Os tubos que cont m o AmpliMIX e o AmpliPROBE s o descart veis e portanto devem ser utilizados uma nica vez na prepara o da mistura de rea o 4 mm Rev 04 Out 2013 e Os tubos que contenham o Controle Positivo devem ser congelados e descongelados por um m ximo de doze vezes Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento poderiam causar uma perda de titula o e Os tubos que cont m o AmpliMASTER n o podem ser congelados e descongelados por mais de 1 vez Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar uma perda na efici ncia da amplifica o CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa Amostras Este produto deve ser utilizado com DNA extra do das seguintes amostras biol gicas sangue total colhido em EDTA As amostras de sangue total destinadas extra o do DNA devem ser colhidas em EDTA segundo as indica es do laborat rio transportadas a 2 C 8 C e conservadas a 2 C 8 C por um m ximo de tr s dias em caso contr rio devem ser congeladas e conservadas a 20 C por um m ximo de trinta dias Recomenda se subdivi
29. tado FV 1691A Q506 Leiden marcada com o fluor foro VIC ativada quando hibridiza com o produto mutado da rea o de amplifica o A emiss o da fluoresc ncia aumenta com o aumentar dos produtos espec ficos da rea o de amplifica o e medida e registrada pelo equipamento A elabora o dos dados permite determinar a presen a dos alelos no DNA extra do da amostra de partida Assay Chemistry Summary Forward 8 Primer O Quencher 65 Reporter Minor Grove Binder O AmpliTaq TINA Gold DNA Polymerase Non Target Template Target Template mm SIOMET RIX DIAGNOSTICA Rev 04 Out 2013 A partir do momento que a sonda TaqManQ for ligada parte espec fica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers se anelam ao DNA A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a probe TaqMan do DNA gabarito Isso separa o quencher do rep rter e permite ao rep rter emitir sua energia Isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnatura o e anelamento mais oportunidades a TaqMan ter de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada T q E a gt complementary strand COMPONENTES FORNECIDOS template DNA E nucleotides A N 4 x Ao from TaqMan O corante do rep rter liberado liberado da dupla fita de DNA criada pela Taq Polimeras
30. ubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo todo o conte do Mant lo em gelo retirar e descongelar um n mero de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo todo o conte do Mant lo em gelo retirar um n mero de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX Escrever com tinta indel vel o nome do teste FATOR V e a data na etiqueta dos tubos Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo todo o conte do Mant lo em gelo retirar e descongelar o tubo de Controle positivo Centrifugar o tubo por 5 segundos para obter no fundo todo o conte do Mant lo em gelo se necess rio cortar a Microplaca de amplifica o para separar a parte utilizada na sess o prestando aten o em manipul la com luvas sem p e de n o causar danos aos pocinhos 1 Transferir 100 uL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mi 2 Transferir 100 uL de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 L na mix 3 Misturar por 5 segundos com o v rtex a baixa velocidade evitando produzir espuma 4 Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conte do 5 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo 20 pL da mistura de rea o assim obtida nos po os da Microplaca de amplifica o como estabe
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