Instruções para a realização do teste rápido imunocromatográ ico
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1. d Digo il 070 oO U oO Wi i em io O Q O Am D 04 D un oO Ko i9 qv Cn o e n D Wil g9 o Wi g9 Q 04 D 46 gt 04 IOM AJ FUNED INSTITUTO Fundac o CC TAVIO E k Di MAGALH ES I zequiel Dias RESULTADO NEGATIVO A presenca de somente uma linha na janela C indica um resultado NEGATIVO Leishmaniaad T RESULTADO POSITIVO A presen a de duas linhas coloridas C e T n o importa qual aparecer primeiro indica um resultado POSITIVO LehmanaAb T INV LIDO Quando a linha controle C n o for vis vel depois da execu o do teste o resultado deve ser considerado INV LIDO Deve se repetir o teste com um novo dispositivo de teste IST Leishmania Ab gm S G 2 1 3 PESE Leishmania Ab S GC 24 LOM AA FUNED Funda o Ezequiel Dias OCT VIO AA MAGALH ES o pm o SL je Wi KD t oO i d Digo Aim o0 oO U Oo Wi i e em E oO Q O Am D 04 D un e Ko oO qv Cn o e n D pm g9 o Wi g9 L 04 QD 46 2 04 ie diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina Escala visual para interpreta o dos resultados q ojuaseoy Leish Ab Q Leish Ab Q i I i Leish Ab Q ojuaseoy OEN A a e a mem diagn stico s2. OCTAVIO AA al Di MAGALHAES zequiel Dias o il o lon je Wi KD lt oO i d Digo il 070 oO U oO Wl i em io O Q O il D 04 D un oO Ko i9 qv Cn o e n D Wil g9 o Wi g9 Q 04 D 46 gt 04 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina 2 Teste r pido imunocromatrogr fico TRI para LVC O diagn stico da Leishmaniose Visceral Canina LVC complexo devido presen a de sinais cl nicos n o espec ficos e a presen a de c es assintom ticos Portanto o uso de testes que combinam velocidade sensibilidade especificidade e exijam o m nimo de equipamentos e complexidade de realiza o tais como os testes r pidos imunocromatograficos TRIs ganharam grande import ncia Uma das abordagens para diagnosticar a LV envolve TRIs que detectam imunoglobulina G IgG que se ligam prote na recombinante rK39 A rK39 derivada de um ant geno espec fico produzido pelo complexo Leishmania donovani e foi utilizada nas duas ltimas d cadas para o diagn stico sorol gico Estes testes s o r pidos apresentam o resultado em aproximadamente 20 minutos minimamente invasivos e normalmente necessitam de apenas uma gota de sangue total ou soro sendo assim adequados para o uso no campo O DPPO Dual Path Platform Bio Manguinhos FIOCRUZ para LVC um TRI que usa a prote na recombinante rK28 ant genos rK9 rK
3. g0 oO Wl i em E O lon Digo D 2 D oO Ko i9 qv O 4 o dm n D g9 o Wi g9 Cc 04 QD ue gt pa 04 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina A doen a no c o de evolu o lenta e in cio insidioso A leishmaniose visceral canina LVC uma doenca sist mica severa e as manifestac es cl nicas s o dependentes do tipo de resposta imunol gica expressa pelo animal infectado O quadro cl nico dos c es infectados apresenta um espectro de caracter sticas cl nicas que varia do aparente estado sadio a um severo est gio final Classicamente a LVC se manifesta por les es cut neas principalmente descama o eczema e pequenas lceras localizadas mais frequentemente nas orelhas focinho cauda e articula es O pelo pode ficar opaco Nas fases mais adiantadas da doen a observa se com grande frequ ncia onicogrifose esplenomegalia lintoadenopatia alopecia dermatites lceras de pele ceratoconjuntivite hiperqueratose coriza apatia diarr ia hemorragia intestinal edema de patas e v mito Na fase final da infec o pode ocorrer paralisia das patas posteriores caquexia inanic o e morte Entretanto c es infectados podem permanecer sem sinais cl nicos por um longo per odo de tempo Outros mamiferos silvestres Figura 1 Foco e transmissores da leishmaniose IOM INSTITUTO A FUNED TT Funda o
4. para a obten o de sangue capilar a partir da orelha patas ou rabo do animal e em seguida utilizar os tubos capilares para coletar 10ul de sangue Figura 3 1 Perfure a orelha O Colete lOul de Imobilize o c o com a lanceta sangue E E a y l e Ca 73 o F 2 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina o o lon je Wi I t oO d Digo Wil e10 oO U oO Wi i E O lon Digo D 04 D un oO Ko i9 qv Cn o e n D Wil g9 o Wi g9 Q 04 D 46 gt pa 04 Figura 3 Coleta de sangue capilar para realiza o do TRI Alere no campo Aten o Para o uso de sangue a fresco colocar a amostra imediatamente ap s a coleta IOM ANJ FUNED INSTITUTO OCTAVIO AA ee MAGALH ES zequiel Dias Para realiza o do teste no laborat rio UVZ poder ser coletado sangue total em tubos com anticoagulante ou em tubos sem anticoagulante para obten o do soro usando o procedimento padr o de coleta de sangue por pun o venosa Figura 4 As amostras de sangue total com anticoagulante podem ser armazenadas por at 24 horas em refrigerador 2 a 8 C mas n o devem ser congeladas Caso as amostras de sangue total n o puderem ser testadas dentro desse per odo de tempo separar o plasma atrav s de centrifuga o e estocar como descrito no pr ximo procedimento D Ap s fazer a conten o C
5. 39 e rK26 como ant geno Ap s ensaio de valida o multic ntrica ocorrida em 2011 o TRI DPPO se tornou o teste recomendado pelo Programa de Vigil ncia e Controle da Leishmaniose Visceral Minist rio da Sa de no Brasil para a triagem de casos de LVC No entanto atualmente a produ o de TRI DPPG n o est atendendo a demanda nacional de diagn stico e alternativas diagn sticas s o necess rias para manter as atividades de vigil ncia e controle da LV Para ser utilizado no diagn stico da LVC os kits diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina diagn sticos necessitam de ter registro no Minist rio da Agricultura Pecu ria e Abastecimento No mercado atual est dispon vel comercialmente com este registro o pm o Q je Wi Qc lt oO i Qq Digo Aim o0 oO g0 oO Am i e em E oO Q O pm D 2 D e Ko oO qv O 4 o e n D pm g9 o Wi g9 Cc 04 QD 16 gt pa 04 c o TRI de plataforma nica produzido pela empresa Alere que possui similaridade ao TRI DPP quanto sua composi o antig nica a prote na recombinante K28 fornecendo uma nova op o de TRI para o diagn stico da LVC IOM FUNED UISUUGRUEFE Fundacao OCT VIO AA al Di MAGALHAES Zequiei Dias 2 1 TRI Alere Leishmaniose Alere Leishmaniose Ac Test Kit um imunoensaio imunocromatogr fico para detec o qualitativa de anticorpos anti Leis
6. Instru es para a realiza o do teste r pido imunocromatogr fico Alere para diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina Ro PUDE ci g r9 14 on AT TN Al hi IN e IN TTA HMA ANN yt Ni LAN DA AM TW JA PARE har Elabora o Andreza Pain Marcelino Job Alves de Souza Filho Servi o de Doen as Parasit rias Laborat rio de Refer ncia Nacional em Diagn stico da Doen a de Chagas e Leishmaniose Visceral IOM FUNED Colaborac o Alere M Marcelo Santos Genelhu Respons vel t cnico Alere M Minist rio da Sa de Secretaria de Vigil ncia em Sa de Grupo T cnico das Leishmanioses GT Leishmanioses UVTV CGDT DEVIT Lucas Edel Donato Refer ncia t cnica GT Leishmanioses Belo Horizonte Agosto 2015 Instru es para a realiza o do teste r pido imunocromatogr fico Alere para diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina Sum rio 1 Aspectos gerais da leishmaniose visceral LV 2 1 1 Agente QUOIOLICO caedi arai niiannisai dada voe u uUi MESE ds Ho CR URSUS 2 Conceitos b sicos da o Leishmaniose Visceral LV o RPA jo q ANN RR O SOR CODE SR CR 2 eishmaniose Visceral LV v 1 3 Principal reservat rio Leishmaniose visceral canina LVC 2 e instru es para a es 4 O 2 Teste r pido imunocromatrogr fico TRI para LVC 4 realiza o do teste r pido o 2 1 TRI Alere Leishmaniose eeeenn
7. acao OCT VIO AA al Di MAGALHAES Zequiei Dias 2 4 Procedimentos para a realizac o do TRI Alere 1 Remover o cassete da embalagem e coloc lo numa superf cie plana e seca 2 Adicionar 10uL de sangue total soro ou plasma utilizando a pipeta capilar no orif cio marcado com a letra S no cassete de teste Quando o teste for realizado no laborat rio a amostra deve ser homogeneizada antes do teste 3 Adicionar 2 gotas de tamp o no orif cio marcado com a letra S no cassete de teste 4 Quando o teste comecar a reagir deve se observar uma cor rosa se movendo atrav s da janela de resultado no centro do dispositivo de teste 5 Interpretar os resultados do teste em 20 minutos interpretar o Adicionar 2 gotas de resultado em Adicionar 10pL de soro 20 minutos plasma ou sangue total diluente LeishmaniaAb Leishmaniaab T S gt e 5 Amostra de soro G21 i2 1 plasma ou sangue capilar ou venoso Figura 5 Procedimento de realizacao do TRI Alere diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina Os tubos capilares possuem uma marca o de 10yL Figura 6 Quantidades o pm o Q ap pa E t oO i O t o0 oO U oO Wi i e E oO O Q O Am D 04 D un io Ko i9 qv Cn o D D Am g9 g0 g9 L 04 QD 46 gt pa 04 inferiores 10uL podem resultar em testes falso negativ
8. eishmania Leishmania infantum chagasi a esp cie comumente envolvida na transmiss o da LV 1 2 Vetores Os seres humanos s o infectados atrav s da picada de flebotom neos que geralmente se reproduzem em solos midos de reas florestais ricos em mat ria org nica ou em tocas de pequenos roedores Figura 1 No Brasil duas esp cies est o relacionadas com a transmiss o da doen a Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi sendo o L longipalpis a principal esp cie transmissora da Leishmania infantum Durante o repasto sangu neo a f mea do flebotom neo ingere macr fagos parasitados por Leishmania que no intestino do vetor seguem o ciclo necess rio para o seu desenvolvimento Posteriormente ocorre a contamina o de seres humanos e animais pela picada do fleb tomo infectado 1 3 Principal reservat rio Leishmaniose visceral canina LVC Nas ltimas d cadas a LV tem passado por um processo de urbaniza o e os c es Canis familiaris s o considerados os principais reservat rios respons veis pela persist ncia da LV nas reas end micas Surtos de infec es humanas s o comumente associados presen a de c es soropositivos A perman ncia de c es peridomic lio e em reas pr ximas a florestas s o os principais fatores de risco para a infec o canina IOM FUNED UISUSGUEFE Fundacao OCTAVIO AA al Di MAGALH ES zequiel Dias o il o lon je KD lt oO i d Digo il 070 oO
9. ete a sanaue Descarte a agulha e limpe a rea de coleta D peja dispense o sangue no tubo com lcool e algod o com a identifica o do c o LA Figura 4 Coleta de sangue para realiza o do TRI Alere no laborat rio UVZ Amostras de plasma Coletar as amostras de sangue total em frascos de coleta apropriados contendo anticoagulantes como EDTA os tubos fornecidos pelo kit t m capacidade para coleta de 0 5ml de amostra de sangue heparina ou citrato de s dio usando o procedimento diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina padr o de coleta de sangue por pun o venosa Figura 4 Separar o plasma atrav s de centrifuga o As amostras de plasma devem ser estocadas refrigeradas 2 a 8 C o il o Q je pa O t oO d Digo il o0 oO U Oo i oO em oO O Q O pa D 04 D un oO Ko oO qv Cn o de n D g9 o Wi g9 Cc 04 QD 16 gt pa 04 por at cinco dias para estocagens mais longas congelar a 20 C em frascos selados Amostras de soro Coletar as amostras de sangue total em frascos de coleta apropriados sem anticoagulante usando o procedimento padr o de coleta Separar o soro atrav s de centrifuga o As amostras de soro devem ser estocadas refrigeradas 2 a 8 por at cinco dias para estocagens mais longas congelar a 20 C em frascos selados IOM INSTITUTO AA FUNED UISUUGRUEFE Fund
10. hmania infantum atrav s da prote na recombinante rK28 ant genos rK9 rK39 e rK26 em amostras de soro plasma ou sangue total canino com resultados qualitativos positivo ou negativo para o diagnostico animal 2 2 Apresenta o do kit TRI Alere O kit Alere Leishmaniose fornece os seguintes componentes Figura 2 1 5 ou 10 Cart es de resultados 2 5 ou 10 Tubos de amostra descart veis com EDTA 3 1 Frasco com solu o tamp o de teste 4 5 ou 10 Dispositivos de teste 5 50u 10 Tubos capilares de 10 microlitros uL erin acio 4 Uo xc o4 1 M 1 3 Lacre para detec o dos antic M todo l e Leisnrmani Assay Diluen Figura 2 Componentes do Alere Leishmaniose Ac Test Kit Nota as lancetas para coleta de sangue capilar ser o fornecidas juntamente com o kit como um anexo portanto sua descric o n o consta na embalagem do produto IOM INSTITUTO AA FuNED AREEIRO Funda o OCT VIO AA al Di MAGALHAES Zequiei Dias o il o e ap O t oO i d Digo il 070 oO g0 oO Wl i em E lo O o Digo D 04 D oO Ko oO qv o dm n D il g9 o Wi g9 Cc 04 QD 46 gt pa 04 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina 2 3 Coleta e prepara o da amostra Amostras de sangue Para realiza o do teste no campo pode se utilizar a lanceta
11. is of visceral leishmaniasis systematic review with meta analysis PLoS neglected tropical diseases 6 e1484 2012 Ready P D Epidemiology of visceral leishmaniasis Clinical epidemiology 6 147 154 2014 WHO World Health Organization Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases Vol 949 Geneva 2010 Refer ncia t cnica bula do Alere Leishmaniose Ac Test Kit Vers o 01 Dez 2014 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina o il o lon je Wi KD lt oO i d Digo il 070 oO U oO Wi i em io O Q O pm D 04 D un oO Ko i9 qv Cn o N D Wil g9 o Wi g9 Q 04 D He gt 04 IO M INSTITUTO AS FUMED TIE ETA TO Funda o OCTAVIO E k Dj MAGALH ES F zequiel Dias Servi o de Doen as Parasit rias Instituto Oct vio Magalh es Funda o Ezequiel Dias Tel 31 3314 4663 4661 leishmania iom ggmail com diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina o i o O je Wi E t Oo i Digo o0 oO U E oO Wi i e E oO O Q O Am D 04 D un e Ko i9 qv Cn o N T D Am g9 o Am g9 Q 04 QD 46 DM gt pa 04 Departamento de Assessoria T cnica Para esclarecimentos de d vidas quanto ao produto e assessoria t cnica Tel 0800 11 3262 veterin ria br alere com Respo
12. maior recomendado o congelamento 20 0 7 Manusear todas as amostras do sangue como sendo capazes de transmitir doen as Infecciosas 8 Fazer o descarte correto dos materiais utilizados considerando os como res duo com risco biol gico e utilizar descarte de perfuro cortante para agulhas e lancetas 3 Considera es Finais Recomenda se o algoritmo proposto pelo Minist rio da Sa de para o diagn stico da Leishmaniose visceral canina LVC triagem com teste imunocromatogr fico e confirma o pelo ELISA Um c o estar confirmado sorologicamente para LVC quando as duas metodologias Teste r pido e ELISA apresentarem resultados reativos Nota t cnica conjunta N 01 2011 CGDT CGLAB DEVIT SUS MS IOM FUNED TT Funda o OCT VIO AA al Di MAGALHAES zequiel Dias o il o Q je O t oO i d Digo Wil o0 oO g0 E oO Wi i em E O lon Digo D 2 D un oO Ko i9 qv O 4 o dm n D il g9 o Wi g9 Cc 04 QD 46 gt pa 04 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina 4 Refer ncias bibliogr ficas Alvar J et al Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence PloS one 7 e35671 2012 Feliciangeli M D Natural breeding places of phlebotomine sandflies Medical and veterinary entomology 18 71 80 2004 Maia Z et al Comparative study of rK39 Leishmania antigen for serodiagnos
13. nnes 5 imunocromatogr fico S E qv R 2 2 Apresenta o do kit TRI Alere eeeeeeeeeee 5 TRI para o diagn stico E o Wi S 2 3 Coleta e prepara o da amMOStra esessesssesseresesrrrerrrresrrresn 6 da Leishmaniose Visceral o Q J Q 2 4 Procedimentos para a realiza o do TRI Alere 8 Canina LVC E E 2 5 Leitura e interpreta o dos resultados 10 p pe PAS TE CAUC S siri aot Dacia anca E I Mpsi eiUA NUM 13 Ls 3 Consideracoes FINAIS sanesna na VES OI EUER prnd 13 E E OO O 4 Refer ncias bibliogr ficas sees 14 o P O DORO KS v n toc c Sa o 5 kf de Cn m E Es IOM ZZ wes OCTAVIO MAGALHAES AM Ezequiel Dias 1 Aspectos gerais da leishmaniose visceral LV A leishmaniose visceral LV uma zoonose causada por protozo rios do g nero Leishmania e transmitida aos animais e humanos por insetos flebotom neos A LV caracterizada por febre alta perda substancial de peso anemia hepatomegalia e esplenomegalia Se deixada sem tratamento a forma visceral tem uma taxa de letalidade pr ximo a 100 Mundialmente h uma estimativa de 400 mil novos casos de LV por ano sendo que cerca de 9796 dos casos de LV nas Am ricas ocorrem no Brasil 1 1 Agente etiol gico A leishmaniose causada por protozo rios da fam lia Tripanosomatidae g nero Leishmania Nas Am ricas a L
14. ns vel t cnico Marcelo Santos Genelhu marcelo genelhu alere com IOM 2 FUNED INSTITUTO Funda o OCT VIO AM MAGALH ES Ezequiel Dias
15. orol gico da leishmaniose visceral canina o il o Q je O t oO i d Digo Wil o0 oO U E oO Wi i oO em io O lon Digo D 04 D un oO Ko i9 qv O 4 o dm n D Wil g9 o Wi g9 c 04 eb 46 gt 04 Nota A intensidade da cor das linhas C e T podem ser diferentes ou seja a linha controle C poder ser mais fraca que a linha teste T ou vice versa Considerar o resultado POSITIVO em qualquer situa o FUNED Funda o Ezequiel Dias IOM 7 INSTITUTO OCT VIO AA MAGALH ES 2 6 Precau es 1 O kit sens vel ao calor Segundo informa es da bula o kit deve ser armazenado a temperatura de 2 a 7 No entanto ensaios de estabilidade em tempo real realizados pelo produtor demonstraram que o kit est vel em temperaturas de armazenamento de 2 a 30 Este estudo encontra se em an lise pelo Minist rio da Agricultura Pecu ria e Abastecimento para futuras altera es nas recomenda es constantes na bula processo n mero 21028005636 2014 13 2 N o congelar o kit 3 Realizar o teste imediatamente ap s a abertura do envelope 4 N o reutilizar a plataforma de teste 5 N o utilizar o kit ap s o vencimento 6 Se a amostra n o for testada imediatamente manter sob refrigera o 2 a 8 C por 24 horas amostras de sangue total ou at cinco dias plasma ou soro Se for necess rio armazenar por um prazo
16. os e quantidades FUNED Funda o Ezequiel Dias IOM 7 INSTITUTO OCT VIO A A MAGALH ES Figura 6 Marca o de 10pL no tubo capilar Leish Ab Figura 7 Teste invalido devido ao excesso de amostra na plataforma de teste I OM AA FUNED INSTITUTO AA Funda o GCT VIO E al Di MAGALH ES zequiel Dias o i o O je Wi E t Oo i Digo o0 le U le Wi i e oO Q O Am D 04 D 1 e Ko lo qv Cn o p D Am g9 o Am g9 L 04 QU He 2 04 diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina 2 5 Leitura e interpretac o dos resultados O Alere Leishmaniose Ac Test Kit possui uma letra T como linha teste e uma linha C como linha controle na superf cie do cassete Ambas as linhas n o s o vis veis na janela de resultado antes da aplica o da amostra A linha de controle C usada para controle de procedimento Esta linha deve sempre aparecer se o procedimento do teste estiver correto e se os reagentes da linha de controle estiverem funcionando Uma linha roxa ser vis vel na janela de resultado T se houver a presen a de anticorpos anti Leishmania infantum na amostra testada Ant genos selecionados s o utilizados na banda de teste como materiais de captura e detec o diagn stico sorol gico da leishmaniose visceral canina o il o lon je Wi KD lt oO i
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