CLART Pneumovir V11 JUL 2015 Portugues
Contents
1. 7 4 1 visualiza o Manaus 1 Desnatura o Colocar os tubos de amplifica o no termociclador quando tiver atingido 952C e incubar os tubos durante 10 min N o exceder 10 min de tempo de desnatura o para prevenir que os tubos sejam abertos e que possa ocorrer a contamina o Retirar os tubos da incuba o aos 95 Ce coloc los imediatamente no gelo 2 Prepara o da Solu o TL dilu da Preparar 10 mL tira de Solu o TL no momento diluindo 1 mL TL em 9 mL de gua destilada 3 Pr lavagem dos AS Pr Lavagem das CS Antes de iniciar a an lise necess rio efetuar uma pr lavagem das CS adicionando 200 ul de solu o TL dilu da por poco Ap s a adi o homogeneizar a solu o dilu da 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta evitando tocar na superf cie da Strip Aspirar a solu o dilu da TL com o sistema de v cuo e verificar que os po os ficam completamente limpos sem l quido no fundo Adicionar o tamp o logo de seguida da seguinte forma 4 Hibridiza o A Solu o de Hibridiza o SH deve ser aquecida a 592 C de modo a dissolver os sais cristalizados Uma vez desnaturados os produtos PCR adicionar 100 ul de Solu o SH a temperatura ambiente a cada po o evitar que se forme espuma Adicionar 3 ul de cada tubo amplificado incolor e de cor CLART Tira Homogeneizar v rias vezes para misturar bem com a solu o de hibridiza o sem tocar na array Incubar no bloco de aquecimento du2. O tempo de amplifica o de aproximadamente 5 horas mas pode variar ligeiramente dependendo do termociclador 7 4 Visualiza o do produto amplificado para as CLART Strip CS Recomenda es espec ficas antes de iniciar o processo de visualiza o O PROTOCOLO DESCRITO A SEGUIR DEVE REALIZAR SE SEMPRE NUMA REA P S PCR NUNCA TRANSPORTAR O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A REA DE PR PCR 1 Ligar o CAR CLINICAL ARRAY READER antes de iniciar o procedimento A auto calibra o do equipamento leva uns minutos e necess rio introduzir o nome das amostras no programa antes da leitura 2 Assegurar se de que antes de iniciar a hibridiza o a temperatura do termomixer atingiu os 592 C durante pelo menos 1 hora 3 Aquecer a SH solu o de hibridiza o no termomixer 59C9 4 Preparar a solu o de lavagem antes de cada an lise n o utilizar solu es anteriores ou quaisquer solu es remanescentes de an lises anteriores 5 Utilizar uma ponta com filtro diferente para cada po o e substitu la de cada vez que se adicionar um reagente 6 O pente de 8 pontas utilizado na bomba de aspira o deve ser descartado ap s utiliza o ou descontaminado com uma solu o de lixivia a 10 ap s cada an lise Certificar se de que o sistema de v cuo funciona corretamente e n o deixar restos de l quido nos po os 7 Todos os tamp es devem ser completamente aspirados dos po os sem tocar no fundo 14
3. Resultado PCR Inibido CLART Strip CS Pontos de alinhamento considerado como um RESULTADO INV LIDO O processo de amplifica o foi influenciado uma subst ncia desconhecida pode ter a enzima polimerase de ADN inibida Nesta altura aconselhado verificar a presen a de quaisquer subst ncias inibidoras de PCR na amostra ou no material extra do Se for o caso extrair a amostra novamente ou solicitar ao m dico para repetir o processo de colheita novamente Existem tr s possibilidades de obter um Resultado Inv lido e Nos casos em que as r plicas do v rus s o muitos diferentes umas das outras forma e intensidade e Emco infec es com mais de 5 v rus e Quando o sinal de absorvancia do material est no intervalo estabelecido como inv lido para cada tipo de v rus 20 10 ESPECIFICA ES T CNICAS E DE FUNCIONAMENTO 10 1 Controlo de interfer ncias conhecidas Existem subst ncias que podem interferir na detec o durante a utiliza o do dispositivo CLART PneumovVir Tratam se principalmente de subst ncias que inibem a mistura de enzimas e portanto a reac o de amplifica o As interfer ncias mais conhecidas s o Utiliza o de amostras inadequadas A an lise de qualquer outro tipo de amostra cl nica que n o as especificadas no manual do dispositivo CLART PneumoVir bem como colheitas incorrectas podem produzir um resultado de analise invalido ou nao conclusivo devido a falta de am
4. a microplaca e proceda com o passo da leitura do CAR 15 CAR CLINICAL ARRAY READER Leitor da Matriz Cl nica Colocar a Strip no CARS este ir analisar os Arrays automaticamente 8 LEITURA DOS RESULTADOS O processamento dos dados obtidos a partir de cada uma das an lises efectua se de modo autom tico O sistema de leitura e an lise apresentar o relat rio onde se indicam os resultados O monitor do sistema apresenta uma tabela de tr s colunas na coluna da esquerda aparecem as esp cies de v rus e os subtipos caracterizando no microarray Na coluna do centro aparece o resultado positivo ou negativo para cada esp cie de v rus e na da direita aparece a valida o da amostra conferida pelo controlo de extrac o ADN ARN e de amplifica o 9 INTERPRETA O DOS RESULTADOS Um dos principais inconvenientes da detec o por amplifica o gen mica a utiliza o de amostras de ADN ARN de qualidade reduzida quantidade insuficiente de ADN ARN degrada o de ADN ARN da amostra durante a extrac o ou a presen a de inibidores de polimerase ADN hemoglobina restos de parafina sais etc nas amostras a serem analisadas interferindo assim com a amplifica o e resultando em falsos negativos O dispositivo CLART PneumoVir cont m controlos internos que permitem verificar reac es de inibi o de PCR 17 Quando os v rus est o presentes na amostra a amplifica o dos gen tipos predominan
5. o foi considerado v lido No caso de n o ser poss vel efectuar a sequencia o da amostra as discrep ncias foram analisadas com um nested PCR caseiro seguido da sequencia o o Sensibilidade Especificidade 10 88 24 100 00 9815 9955 0 8333 10 8333 22 Tabela 2 Sensibilidade e especificidade da t cnica CLART PneumoVir para cada tipo de v rus 11 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS Mart n L zaro J F Benito R Gonz lez Dom nguez M and Su rez M A A case of myocarditis mimicking acute coronary syndrome associated with H1N1 influenza A virus infection Turk Kardiyol Dern Ars Arch Turk Soc Cardiol 2011 39 4 346 350 Romero Gomez M P Guereta L Pareja Grande J Martinez Alarcon J Casas l Ruiz Carrascoso G Ory F and Pozo F Myocarditis Caused by Human Parainfluenza Virus in an Immunocompetent Child Initially Associated with 2009 Influenza A H1N1 Virus Journal of Clinical Microbiology May 2011 Frobert E Escuret V Javouhey E Casalegno J S Bouscambert Duchamp M Moulinier C Gillet Y Lina B Floret D and Morfin F Respiratory Viruses in Children Admitted to Hospital Intensive Care Units Evaluating the CLART1 Pneumovir DNA Array Journal of Medical Virology 83 150 155 2011 Renois F 1 2 Talmud D Huguenin A Moutte L Strady C Cousson J L v que N and Andr oletti L Rapid Detection of Respiratory Tract Viral infections and Co8 infectio
6. PCR assay J med Virol 2003 Jan 69 1 132 44 18 Elliot A J Cross K W Fleming D M Acute respiratory infections and winter pressures on hospital admissions in England and Wales 1990 2005 J Public Health Oxf 30 91 9 19 Cannon J A Carr M J Yandle Schaffer K Kidnay R Hosny G Doyle G Ryan J Gunson R Collins T Carman W F Conell F and W Hall A low density oligonucleotide microarray for the detection of viral and atypical bacterial respiratory pathogens Journal of Virological Methods Volume 163 Issue 1 January 2010 Pages 17 24 24
7. ao aos tubos de amplifica o e Uma micropipeta ajust vel entre 1 20 uL para adicionar o material gen tico aos tubos de amplifica o e Tr s micropipetas ajust veis entre 1 20 uL 20 200 UL e 200 1000 uL para o laborat rio de visualiza o e Bloco de aquecimento com agita o temperaturas ajust veis 259 C 309 C 509 C 539 C e 592 C Compat vel com tubos do tipo Eppendorf de 1 5 ml e Placas de Microtitula o de 96 pocos e Vortex e Sistema de v cuo opcional 5 RECOMENDA ES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULA O Muito importante de modo a evitar a contaminac o Ler cuidadosamente antes de iniciar a an lise 5 1 Recomenda es gerais 1 Esta an lise deve ser efectuada em QUATRO reas separadas fisicamente de modo a evitar a contamina o entre amostras com o produto amplificado anteriormente Cada uma das reas deve ter o seu pr prio material de trabalho identificado pipetas pontas tubos suportes luvas etc que nunca devem ser utilizadas fora destas reas e rea de extrac o Pre PCR a extrac o de ADN ARN ocorre nesta rea Deve ser utilizada uma c mara de fluxo laminar e rea Pre PCR de prepara o dos tubos de amplifica o Nesta rea adiciona se aos tubos de amplifica o a mistura de enzimas Recomenda se a utiliza o de uma camara de fluxo laminar e rea Pre PCR de adi o do material extra do Nesta rea adiciona se o ADN ARN extra do aos tubos de amplifica
8. n mero de c pias do plasm deo recombinante especificadas por tipo v rus necess rias para obter uma sensibilidade de 100 na detec o de cada um dos v rus Especificidade anal tica Os ensaios de especificidade foram efectuados com os 17 plasm deos recombinantes e foi observado que n o haviam casos de detec o inespecifica de virus que n o os que eram para determinar Assim consideramos uma especificidade anal tica de 100 Par metros de utilidade diagn stica Para determinar os par metros de diagn stico do dispositivo efectuou se uma avalia o comparativa da t cnica CLART PneumovVir com as t cnicas mais amplamente utilizadas nos hospitais Imunofluoresc ncia Imunocromatografia Q PCR CLART PneumovVir sem Influenza A H1N1 2009 e CLART Fluavir Os seguintes hospitais colaboraram para esta avalia o e Servi o de Microbiologia do Hospital Universit rio Germans Trias i Pujol Badalona Espanha Servi o de Virologia do Hospital Universit rio da Virgen de la Arrixaca Servi o de Virologia do Hospital Universit rio de Reims Fran a O material gen mico foi extra do de 296 amostras lavados nasofar ngeos e analisado para detectar a presen a de todos os v rus presentes na Tabela 2 Quando ambos os resultados o m todo alternativo e CLART PneumovVir apresentaram o mesmo resultado o resultado foi considerado v lido No caso de discrep ncias entre ambos os m todos o resultado da sequencia
9. o onde a mistura enzim tica foi previamente introduzida Deve ser utilizada uma c mara de fluxo laminar e rea P s PCR nesta rea efectuada a amplifica o e visualiza o do produto amplificado 2 Utilizar sempre luvas aconselhado substituir as luvas com uma determinada frequ ncia e obrigatoriamente cada vez que come ar a trabalhar nas reas anteriormente descritas As luvas novas devem ser utilizadas para a prepara o dos tubos de amplifica o e de cada vez que for adicionado ADN ARN a estes 3 Limpar as reas de trabalho bancadas de laborat rio c mara de fluxo laminar suportes pipetas em profundidade com desinfectante dilu do a seguir a cada processamento de amostras desinfectar obrigatoriamente as reas de trabalho em caso de contamina o E altamente recomendada a limpeza antes e depois da sua utiliza o dos termomixer e termociclador 4 Utilizar sempre pontas com filtro ou pipetas com escoamento parcial para evitar contamina es Devem ser utilizadas pipetas distintas em cada rea Eliminar a ponta da micropipeta ap s pipetagem 5 Utilizar material de laborat rio autoclav vel e descart vel 10 6 Nunca misturar reagentes de dois tubos diferentes mesmo que perten am ao mesmo lote 7 Fechar os tubos de reagente imediatamente ap s utiliza o de modo a evitar a contamina o 8 Eliminar a ponta da micropipeta ap s pipetagem 9 A GENOMICA n o pode ser considerada respons vel
10. pelos resultados obtidos com este dispositivo se forem utilizadas outras amostras que n o as indicadas ou com um ADN ARN extra do por outro protocolo que n o o indicado 5 2 Precau es para a extra o e adi o de material extra do para o tubo de amplifica o 1 Usar sempre luvas 2 Limpar as superf cies de trabalho das c maras com solu o de lix via dilu da a 10 3 Ligar o fluxo laminar e a luz UV pelo menos 20 minutos antes da extra o Desligar a luz UV quando estiver a trabalhar dentro da c mara 4 A prepara o das amostras antes da extra o deve ser efetuada dentro da c mara 5 3 Precau es para a visualiza o 1 Evitar que a ponta da pipeta ou do sistema de v cuo toque no fundo do tubo j que pode danificar o micro array fixado no fundo 2 Aconselha se a adi o de todas as solu es s paredes do CS nunca directamente ao fundo 3 conveniente n o adicionar a solu o SH at adi o de produtos desneutralizados de PCR 4 Ap s a incuba o com a solu o CJ muito importante lavar o CS assim como as tampas para evitar que caiam res duos deste que podem reagir com a solu o RE resultando numa precipita o inespec fica que pode levar a falsas interpreta es do resultado 5 Evitar bolhas na superf cie do microarray ao adicionar qualquer solu o 6 Manter limpa a base do CS para evitar poss veis interfer ncias durante a leitura dos resultados 7 Ao visuali
11. 4 4 Outros componentes Para a captura e posterior processamento da imagem s o necess rios os seguintes componentes e CAR CLINICAL ARRAY READER figura 3 Este leitor foi concebido para utiliza o exclusiva com os dispositivos de diagn stico de GENOMICA distribu do pela GENOMICA e SAICLART software desenvolvido e validado pela GENOMICA para processamento de imagens e Software espec fico do dispositivo CLART PneumoVir concebido e validado pela GENOMICA Figura 3 CAR CLINICAL ARRAY READER 5 MATERIAL NECESS RIO MAS N O FORNECIDO Encontra se abaixo a lista de material necess rio mas n o fornecido 5 1 Reagentes e materiais gua destilada Solu o salina Luvas descart veis Pontas de pipeta com filtro ou pipetas de desloca o positivas Recipiente para gelo picado Tubos Eppendorf de 1 5 ml autoclavados Grelha para tubos de 1 5 mL Suporte para tubos de 0 5 mL 0 2 mL 5 2 Equipamento e O equipamento que se segue necess rio para a fase de visualiza o autom tica O autoclart Figura 4 permite o processamento autom tico de 12 tiras ou 96 amostras Figura 4 autoclart e Microcentrifuga e Termociclador e C mara de fluxo laminar para o laborat rio de extrac o e Tr s micropipetas ajust veis entre 1 20 uL 20 200 LL e 200 1000 uL para laborat rio de extrac o e Uma micropipeta ajust vel entre 1 20 UL para adicionar a mistura de enzimas
12. CLART GEN MICA CLART PneumoVir CARACTERIZA O DE V RUS QUE CAUSAM INFEC ES RESPIRAT RIAS HUMANAS ATRAV S DA IDENTIFICA O GEN MICA PARA DIAGN STICO IN VITRO CLART PneumoVir O conte do da presente embalagem est dentro do mbito da protec o da Aplica o de Patente Internacional WO2009144497 CLARTO CLART Strip CARS SAICLART AUTOCLART e PNEUMOVIR s o marcas registadas da GENOMICA ul GENOMICA S A U Parque Empresarial Alvento Edificio B Calle V a de los Poblados 1 12 planta 28033 Madrid Espanha WWW genomica com Versao 11 Julho de 2015 NDICE 1 QUADRO DE S MBOLOS 2 DESCRI O DO PROTOCOLO 3 COMPONENTES E CONSERVA O DA EMBALAGEM 3 1 Reagentes de extrac o purifica o 3 2 Reagentes de amplifica o 3 3 Reagentes de visualiza o 3 4 Outros componentes 4 MATERIAL NECESS RIO MAS N O FORNECIDO 4 1 Reagentes e materiais 4 2 Equipamento 5 RECOMENDA ES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULA O 5 1 Recomenda es gerais 5 2 Precau es para visualiza o 6 COLHEITA DE AMOSTRAS 6 1 Lavados nasofaringeos 6 2 Exsudados faringeos 6 3 Exsudados nasofaringeos 7 PROTOCOLO DE TRABALHO 7 1 Extrac o de material gen tico de v rus associado a infec es respirat rias 7 2 Extrac o autom tica 7 3 Reac o de amplifica o 7 4 Visualiza o do produto amplificado para CLART Strip CS 7 4 1 visualiza o Manaus 7 4 2 visua
13. as vezes e esperar 15 minutos temperatura ambiente 4 Adicionar 600 ul de isopropanol conservado a 202 C misturar invertendo os tubos v rias vezes e centrifugar preferencialmente a 42 C a 13000 rpm durante 20 minutos 12 5 Aspirar o sobrenadante com a micropipeta Pode utilizar a micropipeta de 1000 ul para eliminar o sobrenadante no final pode utilizar uma micropipeta mais pequena de 20 ui para retirar os res duos do fundo do tubo sem remover o precipitado 6 Adicionar 1000 ul de etanol a 70 armazenado a 202 C Agitar ligeiramente para limpar o precipitado do fundo 7 Centrifugar preferencialmente a 4 C a 13000 rpm durante 15 min 8 Eliminar o sobrenadante cuidadosamente como indicado no ponto 4 Deixar secar na c mara durante 15 a 20 minutos at que n o haja res duos de etanol Antes de suspender de novo a amostra confirmar que n o h res duos de etanol 9 Suspender de novo em 20 ul de Solu o de Dilui o 7 2 Extrac o autom tica Consultar as recomenda es e protocolo fornecidos pelo fornecedor do extractor e verificar se o material extra do preenche os requisitos do protocolo CLART PneumovVir 7 3 Amplifica o por RT PCR Recomendacoes especificas para a amplificacdo e Trabalhar na area pre PCR de prepara o dos tubos de amplifica o sempre na c mara e seguindo as recomenda es do ponto 6 1 e Ter especial cuidado ao adicionar a mistura enzima j que cont m uma eleva
14. da percentagem de glicerol Pelo que se se introduzir demasiado a ponta da pipeta a mistura adere s paredes provocando por um lado que se adicione mais mistura do que o necess rio ao tubo de reac o e por outro que se produza uma perda de produto podendo dar se o caso de n o ter volume suficiente para o resto dos tubos de amplifica o do dispositivo e Adicionar o ADN ARN na rea pre PCR de adi o do material extra do sempre na c mara e seguindo as recomenda es do ponto 6 1 Durante o processo manter os tubos separados em gelo Protocolo da Reac o de Amplifica o 1 Para cada amostra a ser processada descongelar e manter no gelo 2 tubos de amplifica o um incolor e outro de cor 2 Centrifugar tubos de reac o na microcentrifuga durante alguns segundos para que todo o l quido atinja o fundo do tubo No caso de n o haver adaptadores de microcentrifuga dispon veis para os tubos de reac o podem ser utilizados tubos maiores ap s ter retirado a sua tampa 3 Adicionar 2 ul da mistura de enzima aos tubos incolor e de cor 4 Adicionar 5 ul de ARN ADN extra do a cada um dos tubos de reac o e suspender de novo v rias vezes com a micropipeta Deixar os tubos no gelo 5 Programar no termociclador os seguintes ciclos de temperaturas 95 15 min 45 ciclos 95 C 0 5 min 50 1 5 min 689 C 1 0 min 1 ciclo 689 C 10 min 49 C continuamente at colheita dos tubos opcional 13
15. ea o com revelador Figura 2 Esquema do m todo de visualiza o As sondas imobilizadas sobre a superf cie capturam os seus produtos amplificados complementares marcados com biotina Atrav s da biotina liga se o conjugado neste caso estreptavidina HRP HorseRadish Peroxidase O substrato o Dianisidina atrav s da ac o da HRP produz um precipitado sobre o local de hibridiza o 3 COMPONENTES DA EMBALAGEM E CONSERVA O O dispositivo CLART PneumovVir cont m reagentes suficientes para a extrac o e a an lise de 24 a 96 amostras cl nicas Os reagentes inclu dos na embalagem est o agrupados em v rias caixas dependendo da temperatura de conserva o Todos os reagentes permanecem est veis at ao prazo de validade da embalagem desde que sejam respeitadas as recomenda es de conserva o 4 1 Reagentes de extrac o purifica o O dispositivo de purifica o extrac o expedido a 202 C e deve ser conservado a esta temperatura at ser utilizado e SEML Solu o de extrac o Uma vez descongelado deve ser conservado a 42 C e utilizado dentro de 8 dias e SD Solu o de dilui o Conservar a 20 C ou 42 C e isopropanol Conservar a 202 C e Etanol a 70 Conservar a 209 C 4 2 Reagentes de amplifica o S o expedidos e conservados a 20 C e Tubos de amplifica o prontos a usar Cont m 45 ul de mistura de reac o Deve apenas ser descongelado sobre gelo o n mero de t
16. lheita de amostra de exsudado nasofaringeo insere se uma zaragatoa flex vel no nariz e abaixo da faringe rodando suavemente v rias vezes Introduzir a zaragatoa no tubo com o meio de transporte Conservar a 4 C se pretender processar a amostra no proprio dia ou a 802 C se pretender processar a amostra posteriormente 7 PROTOCOLO DE TRABALHO De modo a optimizar resultados necess ria a quantidade m nima de 5 10 ng ul DNA RNA independentemente de ser efectuada manual ou automaticamente 7 1 Extrac o de material gen tico de uma amostra cl nica Recomenda es espec ficas antes de iniciar a extrac o e Trabalhar na rea de extrac o pre PCR utilizando sempre uma c mara de fluxo laminar e seguindo as recomenda es mencionadas na sec o 6 1 e Manter as amostras em gelo e bem separadas e Adicionar os reagentes pela ordem indicada e N o utilizar solu o salina para as zaragatoas Protocolo de extrac o 1 Incluir em cada s rie de amostras um controlo negativo constitu do por 200 ul de gua isenta em ARN e processar de igual modo que as restantes amostras 2 Pipetar 200 ul de amostra cl nica No caso das zaragatoas com meio de transporte homogeneizar em vortex durante 30 segundos e depois pipetar 200 ul 3 Adicionar 600 ul de SEML solu o de extrac o de amostras l quidas Esperar que a solu o descongele e se torne transparente antes de us la Homogeneizar invertendo os tubos v ri
17. liza o com o autoclart 8 LEITURA DOS RESULTADOS 9 INTERPRETA O DOS RESULTADOS 10 ESPECIFICA ES T CNICAS E DE FUNCIONAMENTO 11 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS 20 4 30 9 1 Lil T 25 C C C 18 o C QUADRO DE S MBOLOS Verificar as instru es de utiliza o Prazo de validade Dispositivo medico para diagn stico In Vitro N de Lote Conservar temperatura ambiente Conservar entre 49C e 89C Conservar entre 302C a 189C 2 DESCRI O DO PROTOCOLO O dispositivo CLART PneumoVir capaz de detectar e caracterizar a presen a de 19 tipos mais frequentes de v rus humanos que causam infec es respirat rias nas amostras cl nicas mais comuns incluindo a detec o espec fica do subtipo novo de Influenza A H1N1 2009 Os v rus analisados s o Adenovirus Bocavirus Coronavirus Enterovirus Echovirus Influenza v rus A subtipos H3N2 humano H1N1 humano B e C e H1N1 2009 Metapneumovirus subtipos A e B v rus 1 2 3 e 4 Parainfluenza subtipos A e B Rhinovirus V rus Sincicial Respirat rio Tipo A RSV A V rus Sincicial Respirat rio tipo B RSV B A detec o do produto amplificado por RT PCR efectuada atrav s da utiliza o de uma nova plataforma baseada em baixa densidade CLART Clinical Arrays Technology A plataforma baseia se num princ pio muito simples mas muito rent vel Consiste em incluir um microarray no fundo de um p
18. ns in Patients with Influenza like Illnesses by Use of RT9 PCR DNA Microarray Systems Journal of Clinical Microbiology August 2010 1 Heyman PVV Carper HT Murphy DD Platss Mills TA Patrie J McLaughlin AP et al Viral infections in relation to age atopic and season of admission among children hospitalized for wheezing J Allergy Clin Immunol 2004 114 239 47 2 Miguel C Amela C Neumon as en Espafia 1982 1992 Bol Epidemiol Semanal 1993 1 7 123 9 3 Donowitz GR Mandell GL Neumon a aguda En Mandell GL Bennett JE Dolin R ed Principios y pr ctica de las enfermedades infecciosas Editorial M dica Panamericana S A 48 ed Buenos Aires 1997 682 702 4 Organizaci n Panamericana de la Salud Infecciones respiratorias agudas en la Am ricas Bolet n Epidemiol gico OPS 1995 16 4 1 5 5 Knott AM Long CE Hall CB Parainfluenza viral infections in pediatric outpatients seasonal patterns and clinical characteristics Pediatr Infect Dis J 1994 Apr 13 4 269 73 6 Spicuzza L Spicuzza A La Rosa M Polosa R Di Maria G New and emerging infectious diseases Allergy Asthma Proc 2007 28 1 28 34 An outbreak of influenza in a residential drug rehabilitation community J med Virol 2006 78 9 1218 22 23 8 Herrera GA Iwane MK Cortese M Brown C Gershman K Shupe A Averhoff F Chaves SS Gargiullo P Bridges CB Influenza vaccine effectiveness among 50 64 year old persons during a season of poo
19. oco de placa microtitulada CLART Strip CS Figura 1 este sistema simplifica consideravelmente o processo de hibridiza o e visualiza o quando comparado com os sistemas de microarrays cl ssicos Figura 1 Plataforma CLART no formato de tiras de 8 pocos CS Este tipo de tecnologia permite a detec o simult nea de m ltiplos marcadores de utilidade diagn stica e dos controlos necess rios para assegurar a fiabilidade dos resultados obtidos O sistema de detec o CLART PneumovVir baseia se na precipita o de um produto insol vel naquelas zonas de micro array onde ser produz a hibridiza o dos produtos amplificados por sondas espec ficas Durante a RT PCR os produtos amplificados s o marcados com biotina Ap s a amplifica o hibridizam se com as suas sondas espec ficas respectivas que est o imobilizadas em locais conhecidos e concretos de micro array ap s o qual s o incubadas com conjugado estreptavidina peroxidase O conjugado liga se atrav s da estreptavidina com a biotina presente nos produtos amplificados que tamb m se encontram ligados s suas sondas espec ficas e a actividade peroxidase provoca o aparecimento de um produto insoluvel que precipita nos locais de hibridiza o de micro array Figura 2 Produtos marcados Sondas do array A Biotina Hibridiza o N WH Incuba o com conjugado f Conjugado A ere e maa SNS Precipita o especifica R
20. or utiliza o na etapa 9 15 10 Lavagem tripla Adicionar imediatamente 200 ul de Solu o TL dilu da cada po o e homogeneizar 10 a 15 vezes com a pipeta em seguida eliminar a solu o utilizando a pipeta ou o sistema de v cuo Se esta lavagem n o for efectuada rapidamente pode causar sinais ileg veis durante a leitura muito importante que o tamp o CJ dilu do seja completamente removido dos po os uma vez que este pode reagir com o tamp o RE produzindo um sinal inespec fico Revela o com Solu o RE Remover a Solu o TL adicionar 100 ul de solu o RE a cada array do CS e incubar 10 minutos a 25 C no bloco de aquecimento sem agita o ADVERT NCIA muito importante utilizar o bloco de aquecimento sem agitar e ler as amostras imediatamente ap s incuba o Eliminar a Solu o RE com pipeta ou sistema de v cuo O microarray deve ficar seco CAR CLINICAL ARRAY READER Colocar a Strip no CAR este ir analisar os Arrays automaticamente 7 4 2 A visualiza o com o autoclart Desnatura o Utilize o aparelho de ciclagem t rmica para desnaturar os tubos de amplifica o Coloque os tubos de amplifica o no aparelho de ciclagem t rmica e quando o mesmo atingir 952 C incube os tubos durante 8 minutos Retire os tubos da incuba o a 95 C e coloque os imediatamente no gelo Desnature o produto de amplifica o antes de colocar os reagentes de visualiza o no autoclart Lig
21. plifica o em consequ ncia de colheita reduzida ou por inibi o da reac o e A conservacao inadequada das amostras pode influenciar o resultado da an lise Se as amostras forem submetidas a condi es que possam dar lugar a reac es de degrada o do ADN ARN o resultado da an lise pode levar a um falso negativo A presen a tanto de hemoglobina como etanol ap s a extrac o de ADN ARN pode levar a inibi es de PCR Este problema pode ser evitado purificando e secando o ADN ARN 10 2 Especificidades t cnicas Par metros Anal ticos Sensibilidade anal tica A sensibilidade anal tica dos tipos de v rus detalhados no quadro 1 foi determinada atrav s da amplifica o das dilui es em s rie do ADN de plasm deos recombinantes Cada um deles cont m o produto amplificado inserido incluindo a parte complementar da sonda espec fica de detec o A etapa de visualiza o foi efectuada em Tiras CLART obtendo os mesmos resultados que est o resumidos no quadro a seguir V rus associados a N de c pias de plasm deo recombinante por Infec es Respirat rios reac o de PCR Metapneumovirus Coronavirus Influenza virus A H1N1 humano H3N2 humano Influenza A H1N1 2009 Influenza virus B Influenza virus C Parainfluenza virus 4 VRS A VRS B Adenovirus Bocavirus Enterovirus Echovirus Parainfluenza virus 1 Parainfluenza virus 2 Parainfluenza virus 3 Rhinovirus 21 Tabela 1 Rela o entre o
22. r antigenic match between vaccine and circulating influenza virus strains Colorado United States 2003 2004 Vaccine 2007 Jan 2 25 1 154 60 9 Hammond S Chenever E Durbin JE Respiratory virus infection in infants and children Pediatr Dev Pathol 2007 May Jun 10 3 172 80 10 WHO data 2002 11 Marta Cruz Cafiete David Moreno P rez Antonio Jurado Ortiz Francisco Jesus Garc a Martin Juan L pez Siles Laura Olalla Martin Enferm Infecc Microbiol Clin 2007 25 177 183 12 M A Marcos M Camps J Puig de la Bellacasa T Pumarola E Garcia J Mensa A Torres y M T Jim nez de Anta Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 40 46 13 Vicente D Human bocavirus a respiratory and enteric virus Emerg Infect Dis 2007 Apr 13 4 636 7 14 M L Garcia Virus respiratorios emergentes Rev Patol Resp 2007 10 15 Gonzalez R Malone DL Maselli JM Sande M A Excessive antibiotic use for acute respiratory infections in the United Status Clin Infect Dis 2001 33 757 762 16 Coiras MT Aguilar JC Garcia ML Casas Perez Brena P Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested PCR assays J med Virol 2004 Mar 72 3 484 95 17 Coiras MT Perez Brena P Garcia ML Casas Simultaneous detection of influenza A B and C viruses respiratory syncytial virus and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested
23. rante 1 hora a 59 C agitando a 550 rpm Ap s a incuba o retirar as tiras e eliminar a Solu o SH com a pipeta ou com o sistema de v cuo Programar o bloco de aquecimento a 30 C e deix lo em funcionamento para poder ser utilizado mais tarde na etapa 6 Pode retirar a tampa para que arrefe a mais rapidamente 5 Lavagem lavar duas vezes cada po o CS com 200 ul de Solu o TL dilu da homogeneizar 10 a 15 vezes com a pipeta Eliminar a solu o TL dilu da com pipeta ou preferencialmente com sistema de v cuo deixando um volume No caso do bloco de aquecimento n o ter atingido uma temperatura de 302 C ao chegar a esta etapa deixar os po os cheios com esta solu o TL dilu da at o bloco de aquecimento ter atingido a temperatura necess ria 6 Bloqueador e conjugado aconselhado centrifugar a solu o CJ durante 10 segundos antes de utiliz la Em seguida preparar a solu o CJ dilu da Misturar num tubo 1 mL de solu o DC e 7 5 ul de solu o CJ para cada tira Quando conservada a 49 C a Solu o CJ dilu da permanece est vel durante 4 horas ap s a prepara o N o utilizar se este tempo for ultrapassado Adicionar 100 ul de Solu o CJ dilu da a cada po o Incubar durante exactamente 15 minutos a 30 C agitando a 550 rpm Ap s esta incuba o eliminar rapidamente a solu o do po o utilizando uma pipeta ou sistema de v cuo Deixar o bloco de aquecimento arrefecer at aos 252 C para sua posteri
24. te em rela o amplifica o dos controlos Assim em determinadas condi es por exemplo quando h um n mero elevado de c pias de um v rus ou quando h v rios tipos de v rus nas amostras os controlos internos podem n o aparecer SEM SINAL Considerando todas estas informa es podemos interpretar os resultados da leitura como 1 Amostras Positivas 1 1 Com controlo de amplifica o positivo Resultado Controlo sinal Resultado Controlo interno gt 0 168 e CLART Strip CS Controlo de Amplifica o Pontos de alinhamento 3 Controlo Interno n SS o o Virus Este um RESULTADO V LIDO O resultado pode ser considerado como um positivo real 1 2 Com controlo de amplifica o negativo Resultado Controlo Sinal Resultado Controlo Interno lt 0 165 e CLART Strip CS Pontos de alinhamento a Virus Mesmo se o Controlo Interno n o aparecer os resultados podem ser considerados v lidos Tal devido competi o entre alvos durante o processo de amplifica o Trata se de um RESULTADO POSITIVO REAL 18 2 Amostras negativas Resultado Controlo Sinal Resultado Controlo Interno gt 0 165 CLART Strip CS Controlo de Amplifica o Pontos de alinhamento Controlo Interno considerado como um RESULTADO V LIDO Neste caso o resultado pode ser considerado como um NEGATIVO REAL 19 3 Amostras inadequadas inibidas
25. ua destilada SH solu o de hibridiza o Pronto para utilizar Adicione o volume especificado no recipiente uma vez temperado CJ Conjugado Recomenda se que se centrifugue por breves momentos o CJ antes de o utilizar O ecr apresenta o volume final do CJ dilu do a adicionar o que significa que cada ml indicado no ecr deve ser preparado da seguinte forma 1 ml de DC Diluente do Conjugado e 5 ul de reagente CJ Centrifugue a solu o dilu da para que a mesma fique completamente misturada RE Reagente Adicione o volume de RE indicado no ecr 12 Feche a porta e carregue no bot o para iniciar o programa O dispositivo inicia a prepara o do sistema Em seguida efetua as pr lavagens do CJ e adiciona a solu o de hibridiza o Uma vez terminados estes passos o dispositivo emite um bipe como sinal para o utilizador adicionar as amostras sobre o CS O autoclart continuar a emitir bipes at o utilizador abrir a porta 13 Para a adi o das amostras sobre o CS retire cuidadosamente a placa do autoclart e adicione cada um dos seguintes volumes dos produtos desnaturados da mesma amostra para o mesmo alv olo Misture com cuidado para n o tocar na matriz e para colocar a microchapa de novo no autoclart Carregue no bot o para continuar com o processo de visualiza o 14 Uma vez terminado o processo de visualiza o a autoclart emitir um bipe indicando o fim do programa Retire com cuidado
26. ubos de amplifica o necess rio conservando os tubos restantes a 209 C S o expedidos dois tipos de tubos de amplifica o e Tubo incolor multiplex PCR 1 para a amplifica o de Coronavirus Metapneumovirus subtipos A e B Parainfluenza virus 1 2 3 e 4 subtipos A e B e RSV A Advert ncia A mistura enzimatica deve ser adicionada antes da introducao do material gen tico extraido e Tubo de cor multiplex PCR 2 para a amplifica o de Adenovirus Bocavirus Enterovirus Echovirus Influenza virus A Be C Rhinovirus e RSV B Advert ncia A mistura enzim tica deve ser adicionada antes da introdu o do material gen tico extra do e Mistura enzim tica trata se de uma mistura de RT retrotranscriptase e Polimerase ADN Pronto a usar Conservar a 209 C 4 3 Reagentes de visualiza o O dispositivo de visualiza o expedido a 42 C AVISO Ap s receber os CLART Strip CS estes devem ser conservados a temperatura ambiente e CLART Strip CS incluem as sondas espec ficas S o enviados num envelope selado Depois de aberto o envelope deve ser fechado e conservado temperatura ambiente 25 C m x protegido da luz 7 e SH Solu o de hibridiza o Conservar a 42 C e DC Diluente do conjugado Conservar a 4 C e CJ Conjugado Conservar a 42 C Centrifugar antes de utilizar e RE Solu o de revela o Conservar a 42 C e TL Tamp o de lavagem Conservar a 42 C
27. ue o equipamento autoclart e siga as instru es apresentadas no ecr 1 2 3 4 10 11 Feche a porta e carregue no bot o Selecionar Run Program acionar o Programa a partir do menu principal Selecione o ensaio PneumoVir Test de entre os constantes na lista Selecione o alv olo da tira onde vai ter in cio o processamento do ensaio A1 ou E1 para o caso dos 4 primeiros alv olos j estarem processados Selecione a quantidade de amostras a serem processadas Com o autoclart o utilizador pode processar de 4 at 96 amostras por processamento Em qualquer dos casos as amostras devem ser m ltiplos de quatro Confirme se a quantidade de amostras e o alv olo de arranque A1 ou E1 est o corretos Coloque o suporte dos bicos cheio em posi o Carregue a microchapa da matriz no suporte Certifique se que o fecho est seguro a fim de se poder trancar a chapa Verifique se ambos os recipientes do desperd cio de bicos e desperd cio de l quidos est o vazios e em posi o Encha a garrafa de DI com 250 ml de gua destilada Adicione cada reagente ao respetivo recipiente espec fico O autoclart calcula os volumes espec ficos necess rios de acordo com a quantidade de amostras indicadas TL Tamp o de Lavagem O volume apresentado no ecr indica o tamp o de lavagem 16 dilu do necess rio Para preparar o tamp o de lavagem dilu do dilua por favor 1 10 do reagente TL fornecido em g
28. zar a imagem no leitor confirmar que aparecem os marcadores de posi o e que n o h bolhas de ar ou manchas que interfiram na leitura Caso contr rio limpar o fundo do tubo por fora com um papel de celulose bater suavemente no tubo com o dedo 6 COLHEITA DE AMOSTRAS 11 6 1 Lavado nasofaringeo Introduzir 3 a 7 ml de solu o salina est ril na fossa nasal mantendo a cabe a do doente para tr s e efectuar a colheita da solu o num contentor est ril colocado abaixo das fossas nasais inclinando a cabe a para a frente Conservar a amostra a 4 C se for processada no dia ou a 802 C se for processada posteriormente 6 2 Exsudado faringeo Para a colheita de exsudado faringeo que o segundo produto mais habitual para a detec o de v rus respirat rios ap s o lavado nasofar ngeo utiliza se uma esp tula de madeira de modo a evitar a contamina o com a saliva e colhe se a amostra da zona posterior da faringe nas zonas inflamadas e eritematosas ou onde existam les es vis veis girando a zaragatoa e tentando colher c lulas epiteliais da les o No caso de haver exsudados ou res duos mucosos aderentes s les es devem ser retirados com outra zaragatoa antes de proceder colheita da amostra Introduzir a zaragatoa no tubo com o meio de conserva o Manter a 42 C se pretender processar a amostra no proprio dia ou a 809 C se pretender processar a amostra posteriormente 6 3 Exsudado nasofar ngeo Para a co
Download Pdf Manuals
Related Search