FAMÍLIA DE KITS LABTYPE
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1. FAM LIA DE KITS LABTYPE Testes de tipagem HLA Classe I Locus A B C e Classe II Locus DR e DQ Instru es de Uso APRESENTA O E COMPOSI O DA FAM LIA C digo Descri o Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Exon 4 7 Suplementar RSSO1E47 100 testes Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Exon 4 7 Suplementar RSO1E47T 20 testes RSSO1B Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus B 100 testes RSO1BT Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locos B 20 testes Kit Tipagem HLA Alta Resolu o por SSO para Classe I Locus B RSSOH1B 100 testes Kit Tipagem HLA Alta Resolu o por SSO para Classe I Locus B RSOH1BT 20 testes RSSO1A Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus A 100 testes RSO1AT Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I L cus A 20 testes Kit Tipagem HLA Alta Resolu o por SSO para Classe I Locus A RSSOH1A 100 testes Kit Tipagem HLA Alta Resolu o por SSO para Classe I Locus A RSOH1AT 20 testes Kit Tipagem HLA Alta Resolu o por SSO para Classe II L cus RSSOH2B1 DRB1 100 testes Kit Tipagem HLA Alta Resolu o por SSO para Classe II Locus RSOH2B1T DRB1 20 testes RSSO2Q Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus DQA DQB 100 testes RSO2QT Kit Tipagem HLA por SSO para Classe II Locus DQA DQB 20 testes RSSO1S1 Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus B7 1002. e Termociclador da Perkin Elmer Applied Biosystems modelo 9700 equipado com tampa aquecida Outros Materiais e gua deionizada e Etanol 70 eee e Solu o de hipoclorito a 0 5 e Sheath Fluid solu o circulante para cit metro de fluxo e Tag polimerase recombinante e Tubos descart veis de 15 50 mL e Placa PCR de paredes finas com 96 po os e suporte para placa PCR para uso em centr fuga para 1000g ou tubos em tiras e Selador de placa OLI SSPSEA300 ou tampas para tiras Obs placas PCR 25 e seladores para placas 180 suficientes para 2400 amostras podem ser solicitadas One Lambda OLI PCRTRAC e Fonte de eletroforese 150 V de capacidade m nima e Sistema de gel da One Lambda OLI MGS 108 e Transiluminador UV e Sistema de fotodocumenta o e Tamp o TBE 1X Tris borato 89 mM EDTA diss dico 2 nM pH 8 0 com 0 5 ug mL de brometo de etidio ou tamp o TBE 5X com brometo de et dio OLI 5XTBE100 e Agarose com grau para eletroforese e Pressure Pad para PCR OLI SSPPAD e Tubo de microcentrifuga o de 1 5mL e Ponteiras para pipetas e Microplaca 250 uL com 96 po os sem superf cie tratada e Papel alum nio e Placa PCR de 96 po os ou tubos em tiras 0 2 mL capacidade do tubo CONDI ES DE ARMAZENAMENTO TRANSPORTE LIMITES DE TEMPERATURA UMIDADE OU PROTE O LUZ Temperatura de C digo Informa es sobre transporte armazenamento Os produtos devem ser transportados Toda
3. para dispensar a mistura de Hibrida o Desnatura o Neutraliza o a Prepare um banho com gelo picado b Coloque a placa de 96 po os ou as tiras de tubos de 0 2 mL em um suporte para placas PCR c Transfira 5 uL de cada amostra de DNA amplificado dentro de um po o limpo Certifique se de que a localiza o da amostra e sua identifica o foram anotadas d Adicione 2 5 uL de Tamp o de desnatura o Misture bem por pipetagem e incube em temperatura ambiente 20 25 C por 10 minutos Adicione 5uL de tamp o de neutraliza o com uma pipeta e misture bem com a pr pria pipeta Observar a mudan a da cor para transparente ou amarelo p lido Coloque a placa PCR com o produto PCR neutralizado em banho de gelo Cuidado Evite a contamina o do produto amplificado com gua Hibrida o Obs certifique se que o termociclador foi ligado e deixado em execu o no programa a 60 C a Combine volumes apropriados de Mistura de P rolas e Tamp o de Hibrida o para preparar a Mistura de Hibrida o Adicione 38 uL da Mistura de Hibrida o a cada po o Tampe a placa com selador e agite em Vortex em baixa velocidade Remova do suporte da placa e coloque a placa PCR no termociclador pr aquecido a 60 C Coloque a borracha seladora no topo da placa quando estiver usando selador ao inv s de tampas Feche bem a m quina PCR Incube por 15 minutos Coloque a placa em um suporte e remova o sel
4. 2000 IDENTIFICACAO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix biometrix com br Website www biometrix com br CNP 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE One Lambda Inc 21001 Kittridge Street Canoga Park CA EUA me BIOMETHIX 20 REGISTRO ANVISA 80298490005 Respons vel T cnica Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 REVIS ES Revis o Descri o da Altera o Data 00 Elabora o 12 2006 Formata o layout produtos descontinuados altera o nas condi es de armazenagem e transporte inclus o das 01 01 2011 denomina es comerciais de cada item da fam lia inclus o de n mero de registro em altera o de Respons vel T cnica s Produtos descontinuados pelo fabricante pai RSSO2PB1 e RSO2PB1T 03 Produto incluso na fam lia RSSO2P 01 2012 04 Altera o do DDG 09 2012 Inclus o do produto RSO2PT layout revis o 05 ortogr fica e gramatical altera o de Respons vel 12 2012 T cnica me BOMETAIX 31
5. A an lise realizada em cit metro de fluxo utilizando o analisador Luminex PRINC PIO DE A O E REA O 2 Desnsturs o e Neutraliza o 15 gt min 3 Hibndiza o Sa ate oo 15 min s 60 C 1 Amplifica o 90 min A 6 Passo de Lev 1X x 4 Passo de Lavagem 3X e Adicionartamp o lt de lavagem Agitar 5 Adicionar o e Centrfugsr puiso SAPE e Remover 5 min a 60 C sobrenadante Resumo e explica o Os ant genos HLA s o heterod meros polim rficos codificados por genes localizados no bra o curto do cromossomo 6 os quais regulam a resposta imune a pat genos e distingue pr prio de n o pr prio na imunologia de transplantes Testes de histocompatibilidade permitem a sele o de receptores para doadores de rg os com um grau de combina o preciso melhorando o resultado cl nico no transplante de rg o s lidos e medula Os m todos de tipagem baseados na biologia molecular t m sido refinados por testes pr ticos na montagem do laborat rio cl nico O kit LabType SSO utiliza sondas de oligonucleotideos de sequ ncia espec fica SSO ligados microesferas codificadas fluorescentemente para identificar alelos HLA na amostra de DNA A introdu o de uma etapa para amplificar o DNA alvo pela rea o em cadeia da polimerase PCR seguido por mm SIOMETRIX ciacn stica M hibrida o e detec o em um tubo nico torna esse m todo adequ
6. dio corando gel eletrofor tico de agarose anula os resultados do teste 2 Amplifica o de DNA sujeita contamina o por DNA anteriormente amplificado A detec o de contamina o pode anular os resultados dos testes fazendo se um controle de amplifica o usando gua ou teste de esfrega o para DNA pr estabelecido para detec o de produtos DNA amplificados B Analisador Luminex 1 O Analisador Luminex um cit metro de fluxo avan ado que requer manuten o e calibra o di ria Consulte o Manual do Usu rio do Analisador Luminex para todas as opera es de manuten es necess rias A manuten o di ria inclui rotina de procedimentos de inicializa o e desligamento Para melhor desempenho calibre o instrumento como se isso fizesse parte da rotina de inicializa o da m quina todos os dias Calibre o instrumento sempre que o valor de dCalTemp estiver diferente de 2 C 2 O instrumento dever passar pelo teste de calibra o antes que as amostras LabType SSO sejam analisadas C Aquisi o de Dados e An lise Para obter um dado v lido dois par metros intensidade fluorescente e contagem dever o ser monitorados para cada aquisi o de dados A contagem representa o n mero total de p rolas que foram analisadas e a contagem dever ser superior a 100 Uma redu o significante na contagem sugere perda de p rolas durante a aquisi o e ensaio da amostra e pode anular o r
7. o Analisador Luminex e a plataforma XY e siga o procedimento de inicializa o conforme descrito nesse documento O Analisador requer pelo menos 30 minutos para aquecimento 2 Ligue o termociclador e execute um programa de 60 C HOLD ou equivalente por pelo menos 1 5 horas ou HOLD infinito Deixe uma borrachinha preparada para uso ao lado da m quina PCR esta borrachinha auxilia a tampa da m quina a vedar melhor o selo que est sobre a placa PCR Certifique se de esperar at que a tampa do termociclador alcance a temperatura apropriada antes do uso Use o suporte para placa 96 po os para assegurar a temperatura de incuba o adequada 3 Remova todos os reagentes de suas armazenagens para a temperatura ambiente exceto o frasco marrom da solu o SAPE 100X Fracione volumes necess rios de reagentes dentro de frascos limpos Utilize as Tabelas 3 4 e 5 abaixo para refer ncia Certifique se de preparar a solu o SAPE 1X durante a terceira etapa de lavagem Remova o frasco de Solu o SAPE 100X do armazenamento somente quando necess rio e retorne imediatamente para 2 5 C Retorne qualquer por o que n o esteja em uso de Mistura de P rolas e o tamp o SAPE para 2 5 C N o recongele a Mistura de P rolas depois de ter sido descongelada Volume Reagente M todo de prepara o e sugest es teste Em temperatura ambiente fracione volume apropriado mais o volume
8. o deve levar menos que dois minutos Se a posi o no monitor do sistema mudar para Sample Empty antes da calibra o se completar a mensagem Calibration Failed aparecer Clique OK e comece o processo novamente Quando a calibra o acabar para as microesferas de classifica o a mensagem Calibration Succeeded aparecer Os ajustes e qualquer coment rio que for inserido ser o inclu dos no relat rio de calibra o mm SIOMETRIX 23 1 Clique OK 2 Coloque o tubo com as microesferas de calibra o reporter CAL2 no suporte de amostras 3 Selecione Reporter e clique em Start A barra de progresso mostrar o progresso da calibra o A calibra o dever levar menos que dois minutos Se a posi o no monitor do sistema mudar para Sample Empty antes da calibra o se completar a mensagem Calibration Failed aparecer Clique OK e comece o processo novamente Quando a calibra o acabar para as microesferas de classifica o a mensagem Calibration Succeeded aparecer Os ajustes e qualquer coment rio que for inserido ser inclu do no relat rio de calibra o 1 Clique OK Obs as microesferas de calibra o s o muito concentradas Cada vez que o instrumento for calibrado ele dever ser lavado com 4 ciclos de WASH utilizando o fluido de circula o Sheath Fluid Notar que entre as microesferas de calibra o dever ser feita a lavagem por 3 vezes com o f
9. 2 mL de isopropanol a 70 ou etanol a 70 para o fluxo com lcool Este fluxo remove qualquer pequena bolha de ar que esteja presente no interior do sistema Clique OK quando estiver pronto para iniciar com o fluxo de lcool 7 e em Calibrate na tela principal A seguinte caixa de di logo aparecer Startup Start Calibration LIDO CALT A0380 Acquisitie Pec E Shutdown E E 8 Coloque o nome da pessoa que estiver efetuando a calibra o no campo solicitado mm SIOMETRIX 22 oracn stica 9 Selecione Product Lot Number para as microesferas de calibra o Classification e na sequ ncia para Rep rter 10 Clique OK A caixa de di logo abaixo aparecer Luminex JD x File Analyzer Tools View Help FREIRE E Calibration x Bad Link Classification Channel CAL c Device DD Temp sh Place calibration beads on analyzer Press start when ready d Cal Temp Reporter Channel CAL2 Air PSI Sheath PSI Hi Voltage o oe Eno Calibration Date E Time Temp 0 0 Events Total Shutdown e Missed E Eq Events sec Total Sanitize Soak Gate Run machine Calibration Time 22 11 Coloque o tubo contendo a microesfera de calibra o Classification no suporte para amostra localizado na frente do aparelho 12 Certifique se de que Classification est selecionado e ent o clique Start A barra de progresso mostrar o progresso da calibra o A calibra
10. a fam lia 80 C a 20 C acondicionados com gelo recicl vel O tamp o SAPE n o pode ser recongelado e deve ser armazenado em temperatura entre 80 C e 8 C Ap s descongelado deve ser armazenado entre 2 8 C Todos os outros tamp es t m uma faixa de armazenamento entre 80 C e 25 C e podem ser recongelados Uma vez descongeladas as esferas n o devem mais ser recongeladas devendo ser conservadas entre 2 8 C por at 3 meses Os conjuntos de Primers e as DMIX s o mais est veis quando congelados entre 80 C e 20 C podendo sofrer ciclos de congelamento descongelamento N o utilizar gelo seco para o transporte pois o CO pode alterar as propriedades da DMIX PRECAU ES me BIOMETHIX Aviso O brometo de etidio usado para a colora o do gel n o incluso um produto carcin geno conhecido Manuseie com cuidados apropriados Pode ser nocivo se absorvido pela pele Evite que seja respingado nos olhos e na pele ou na roupa Mantenha bem fechado Lave bem as m os ap s o manuseio Lave a rea contaminada com gua Aviso O tamp o de desnatura o cont m hidr xido de s dio dilu do que corrosivo e pode causar queimaduras No caso de contato lave olhos ou pele imediatamente com bastante gua por pelo menos 15 minutos enquanto simultaneamente remove roupas e sapatos contaminados eee e Cuidado Mistura de p rolas LabType SSO s o sens veis luz e precisam ser p
11. a leitura ESET Sr Figura A plataforma XY l a amostra conforme o seguinte padr o A1 para H1 A2 para H2 A12 para H12 Para obter os melhores resultados leia as amostras t o logo seja poss vel O armazenamento prolongado das amostras superior a 4 horas pode resultar em perda do sinal Armazene as placas com selador a 4 C e no escuro se n o for poss vel l las imediatamente Certifique se de agitar bem as amostras imediatamente antes da leitura Aquisi o de dados Para detalhes adicionais de como usar o Analisador Luminex consulte o Manual de Opera o do equipamento Ligando o sistema me BOMETAIX 17 1 Conecte o frasco de Sheath Fluid cheio e o frasco Waste vazio aos seus conectores correspondentes no cit metro 2 Certifique se que ambos os frascos est o nivelados com o aparelho 3 Ligue o cit metro e ent o a plataforma XY se for o caso e finalmente o computador Iniciando 1 Abra o software de coleta de dados da Luminex 2 Se estiver trabalhando com a plataforma XY ajuste o default da posi o das amostras da plataforma XY sob OPTION estabele a a janela XY de acordo com o manual do Usu rio do Analisador Luminex 3 No menu Startup pressione o bot o WARMUP Aguarde por 30 minutos at que seja mostrado STANDBY no monitor no canto superior direito Se o analisador n o tiver sido usado por algumas horas pode ser necess rio passar pelo WARMUP novamente Para prev
12. ado tanto para teste de pequena quanto de grande escala Princ pio O LabType aplica a tecnologia Luminex ao m todo de tipagem por DNA SSO reverso Antes de mais nada o DNA alvo amplificado usando um primer grupo espec fico O produto da PCR biotinilado marcado com biotina o qual permite ser detectado usando Estreptavidina conjugada com R ficoeritrina SAPE O produto PCR desnaturado e permitido nova hibrida o com sondas complementares ao DNA alvo a derivados microesferas codificadas fluorescentemente Um analisador de fluxo Analisador Luminex identifica a intensidade de fluoresc ncia de PE ficoeritrina em cada microesfera O software de an lise que fornecido com o kit auxilia na determina o de genotipagem da amostra de DNA COMPONENTES FORNECIDOS Os componentes do kit est o descritos na se o APRESENTA O E COMPOSI O DA FAM LIA Quando dizemos que um kit para determinado locos de modo gen rico ele estar representando todos os alelos j encontrados at o momento da fabrica o de determinado lote Cada alelo descoberto gera um novo lote de kit OBS Os volumes fornecidos s o ligeiramente maiores que o montante requerido para teste para prevenir perdas indesejadas durante o processo de pipetagem A mistura de microesferas consiste de um conjunto de microesferas marcadas por fluoresc ncia que transportam em sua superf cie sondas nicas de oligonucleot deos de sequ nc
13. ador da placa Rapidamente adicione 100 uL de Tamp o de Lavagem em cada po o Tampe a placa com o selador Centrifugue a placa por 5 minutos a 900 1000 x g Coloque a placa no suporte de placas e remova o tamp o de lavagem atrav s de uma leve flicagem g Repita a etapa facima mais duas vezes perfazendo um total de 3 etapas de lavagens Lembre se de preparar solu o SAPEIX durante a terceira centrifuga o Marca o a OMETRIX IA GN STICA Coloque a placa no suporte de placas Adicione 50uL de solu o SAPE 1X em cada po o Coloque o selador na placa e agite em Vortex a baixa velocidade Coloque a placa em termociclador pr aquecido 60 C Coloque 16 a borrachinha em cima da placa Feche bem a m quina Incube por 5 minutos Remova a placa Coloque a no suporte e remova o selador Rapidamente adicione 100uL de Tamp o de Lavagem em cada po o Tampe a placa com o selador Centrifugue a placa por 5 minutos a 900 10009 Coloque a no suporte e remova o sobrenadante Adicione 70uL de tamp o de lavagem em cada po o e agite bem por pipetagem Transfira para a placa de leitura usando uma pipeta multicanal de 8 ou 12 po os Evite contamina o de amostra para amostra usando sempre ponteiras novas na mudan a de fileira Obs o volume final dever se de pelo menos 80uL Tampe a placa com selador e papel alum nio Mantenha a placa no escuro e a 4 C at que seja colocada no Analisador Luminex para
14. alor pr ajustado de corte para cada sonda foi estabelecido usando um painel de 100 a 200 amostras de DNA C Determine o alelo HLA ou grupo al lico da amostra combinando o padr o de IDs das p rolas positivas e negativas com a informa o na planilha LabType SSO LIMITACOES DO PROCESSO O sistema LabType SSO combina um processo de amplifica o de DNA com HLA locus espec fico e um processo de hibrida o DNA DNA O procedimento bem como a calibra o do equipamento deve ser estritamente seguido mm BIO METRIX GN STICA A amplifica o de DNA um processo din mico que requer condi es altamente controladas para obter produtos PCR que s o espec ficos ao segmento alvo do gene HLA O procedimento fornecido para o processo de amplifica o de DNA deve ser estritamente seguido Em particular uma vez que a quantidade de amostra de DNA e sua qualidade pode ser significantemente afetada na rea o de amplifica o um procedimento padronizado de extra o de DNA e uma medi o espectrofotom trica da quantidade e qualidade do DNA seguida pela an lise eletrofor tica em gel s o recomendadas Em adi o para evitar contamina o do material inicial com produtos PCR todos os materiais gerados ap s a amplifica o do DNA materiais p s PCR incluindo misturas de reagentes todos os pl sticos descart veis e equipamentos tais como pipetas e materiais de eletroforese e gel devem ser fisicamente
15. assification 2 classifica o CL2 O processo de calibra o utiliza essas microesferas para ajustar classe de voltagem para tima e classifica o consistente de microesfera e leituras de relator reporter Ajustes da ltima calibra o realizada se aplicam automaticamente a qualquer nova sess o Shutdown cc gt Para calibrar o instrumento 1 Ligue o Analisador Luminex Clique em Warmup na tela principal e ent o clique em OK na caixa de di logo que aparecer Depois de 30 minutos de aquecimento warmup v para a pr xima etapa 2 Clique em Prime na tela principal Clique OK quando voc quiser come ar o ciclo de prime onde deixado entrar o fluido de circula o sheath fluid na m quina para a retirada de bolhas maiores 21 3 Remova as microesferas calibradoras Classification CAL1 e Reporter CAL2 de seu local de estoque ou seja das temperaturas de 2 8 C Agite os frascos com as microesferas em Vortex na posi o horizontal 4 Dispense 5 gotas aprox 200 uL da microesfera de calibra o Classification CAL1 em um tubo identificado de 1 5 mL e dispense 5 gotas aprox 200 uL da microesfera de calibra o Reporter CAL2 em um outro tubo identificado de 1 5 mL 5 Envolva os tubos contendo as microesferas com papel alum nio para proteg las da luz Permita s microesferas que sua temperatura chegue temperatura ambiente 6 Clique em Alcohol Flush na tela principal Utilize 1
16. bertas para prevenir evapora o e contamina o 9 Adicione um montante apropriado de Taq polimerase ex 0 2uL por 20 uL de rea o para a mistura de amplifica o preparada na etapa B 6 10 Agite em vortex por alguns segundos e centrifugue OMETRIX 10 TAGNOSTICA lt 11 Fracione 18 uL de mistura de amplifica o dentro de cada po o contendo o DNA Cuidado para prevenir contamina o cruzada certifique se de n o tocar o DNA pr aliquotado no fundo do tubo 12 Feche com as tampas ou selador Se estiver usando um selador certifique se de que ficou bem vedado sobre cada borda de cada po o Coloque a borrachinha sobre a placa antes de fechar a tampa na m quina de PCR Feche bem a tampa da m quina de PCR 13 Corra a PCR conforme o programa na m quina para kits LabTypeTM SSO mostrado na tabela 2 Tabela 2 Programa PCR para LabType SSO Etapal Etapal 96 C 03 00 Etapa 2 96 C 00 20 o coco OE C 00 20 r 00 20 Etapa 3 Se C 00 10 M C 00 15 p ZCO 00 20 CT RL S 14 0 DNA amplificado est agora pronto para ser testado ap s t rmino da PCR usando o procedimento de hibrida o abaixo Use 2 5 uL do DNA amplificado para an lise em gel de eletroforese Confirma o do produto amplificado banda anterior ao ensaio de hibrida o assegura gera o de timos sinais 15 Armazene a placa a 20 C ou 80 C Prepara o do Reagente Teste 5 1 Ligue
17. citado um nome para o New Folder nova pasta digite um nome Pressione OK 5 Na tela Multiplex Acquisition pressione SETTINGS no menu superior 6 Ajuste eventos para 100 por p rola EVENTS 100 Per Bead Mude SAMPLES para a quantidade de amostras exatas a serem obtidas 7 Confirmar SAMPLE SIZE a 50 uL Pressione APPLY para fechar a janela de ajustes 8 Antes de pressionar o bot o START certifique se que o tubo com a amostra j se encontra em seu suporte no cit metro Caso esteja trabalhando com a placa na plataforma na janela Multiplex Acquisition clique no bot o SINGLE que se encontra abaixo do bot o START isso permite que a aquisi o pare ap s a primeira amostra 9 Certifique se que a amostra na primeira fileira esteja indicada a menos que outra amostra esteja para leitura que n o a primeira Pressione ent o START caso esteja trabalhando com a plataforma 10 Uma aquisi o normal dever durar menos que 1 minuto por amostra 11 Se os dados estiverem aparentemente normais certifique se que a segunda amostra esteja indicada na fileira de identifica o das amostras e pressione START Caso esteja trabalhando com a plataforma XY clique novamente em SINGLE para que essa fun o seja desmarcada e pressione START novamente para ser iniciada a aquisi o autom tica de todas as amostras que est o na placa 12 Depois de ter sido completada a aquisi o de todas as amostras pressione o bot o SAVE no menu super
18. ck com tamp o SAPE para o n mero apropriado de testes mais o volume extra Proteja da luz Tamp o SAPE 49 5 uL Utilize 57 5 uL de SAPE Stock e adicione 5693uL de Tamp o SAPE para 96 amostras Mantenha o frasco de SAPE Stock a 2 5 C Obs O volume extra requerido depende da t cnica de pipetagem e estado de calibra o do equipamento Utilize um volume total de Mistura de P rolas do tubo OMETRIX 13 TAGNOSTICA fornecido suficiente para aproximadamente 110 testes para 96 testes Prepare SAPE 1X para 115 testes e use o volume total de outros reagentes para prevenir escassez Recomendamos a calibra o e teste de todos os aparelhos de pipetagem pela al quota de gua Para os reagentes fornecidos com volume em excesso tal como Tamp o de Desnatura o e Neutraliza o poder ser usado um cochinho para pipetagem com pipeta m ltipla Tabela 4 Volumes de Reagentes NE Tamp o de Tamp o de Tamp o de Tamp o de Mistura HR Desnatura o Neutraliza o Hibrida o Lavagem pL de P rolas uL HL uL para Placa HL 1 2 5 5 34 480 4 10 25 50 340 4800 40 20 50 100 680 9600 80 50 125 250 1700 24000 200 96 TUDO TUDO 3740 TUDO TUDO Tabela 5 Volumes de SAPE e Tamp o SAPE N mero de Testes Volume de SAPE Stock uL Kons P SARE 0 5 49 5 a 5 0 495 0 a 10 0 990 0 25 0 2475 0 96 57 5 5693 0 Ob
19. e D mix somente na rea de pr PCR Armazene esses itens em freezer a 20 C somente na rea de pr PCR STA 5 Amplifica o prepara o na rea de pr PCR 1 Configure a m quina PCR com a programa o espec fica para procedimentos com kit LabType conforme mostrado na Tabela 2 abaixo Confirme todos os par metros w Y gelo at o momento do uso Ligue o termociclador para que seja iniciado o aquecimento da tampa Descongele o DNA os primers de amplifica o e as D mix Mantenha em 4 Ajuste a concentra o do DNA gen mico para 20 ng uL usando gua est ril in Agite em vortex a D mix e o Primer de Amplifica o por 15 segundos D um pulso em centrifuga ou aplique flicagem para o que estiver na tampa des a 6 Usando a Tabela 1 abaixo misture as quantidades indicadas de D mix e Primers Agite em Vortex por 15 segundos e coloque os em gelo Para pipetagem precisa de Taq polimerase recomendado que voc prepare a m ster mix para pelo menos 10 rea es 7 Adicione a Taq polimerase imediatamente antes do uso Tabela 1 Mistura de Amplifica o de rea es D Mix uL Primer de Amplifica o pL a Ro 1 13 8 4 0 2 10 138 0 40 2 0 50 690 0 200 10 0 96 1491 0 432 21 6 22 8 Pipete 2 uL de DNA a 20 ng uL no fundo de um tubo para um volume final de 20 uL por PCR Armazene os tubos ou placas parcialmente co
20. enir isso execute o PRIME uma vez a cada hora que com isso o aparelho n o passar pelo WARMUP imediatamente antes da aquisi o das amostras 4 Observe dCalTemp que fica abaixo do STANDBY na tela do computador e certifique se que o dCalTemp est entre 2 0 Caso contr rio a calibre o aparelho de acordo com o Manual do Usu rio do Analisador Luminex 5 Pressione o bot o PRIME ato de introduzir gua em bomba hidr ulica para deslocar o ar para que possa efetuar a suc o Pressione OK para iniciar 6 Ap s ter terminado com o PRIMING ejete o suporte da placa da plataforma pressionando o bot o EJECT no menu superior 7 Adicione lcool 70 dentro de um tubinho ou reservat rio na plataforma XY para retrair o est gio pressione RETRACT 8 Pressione a tecla ALCOHOL FLUSH Pressione OK para confirmar 9 Ap s conclus o do fluxo de lcool troque o tubo com lcool por um tubo com Sheath Fluid fluido de circula o 10 Pressione o bot o WASH Pressione OK para confirmar 11 Repita a lavagem com o fluido uma vez mais para que sejam feitas duas lavagens consecutivas Aquisi o de dados 1 Coloque o tubo com a amostra no suporte apropriado ou ejete o suporte na plataforma para que a placa com as amostras seja colocada adequadamente 2 Pressione o bot o TEMPLATE no menu superior 3 Na op o CHOOSE TEMPLATE selecione o gabarito template desejado Pressione OK 4 Na caixa de di logo onde soli
21. esultado do teste A intensidade fluorescente FI representa um sinal PE detectado dentro das p rolas contadas FI varia segundo resultado da rea o O valor de FI esperado para a sonda de controle positivo seria de 1000 a 3600 dependendo do pool de p rolas e lote A redu o significativa no FI para sonda controle positivo sugere quantidade e ou qualidade de amostra inadequada fraca efici ncia de ensaio ou falha do instrumento e pode anular os resultados dos testes REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS The Luminex 200 User s Manual Luminex Corporation PN 89 00002 00 005 Rev B NG J HURLEY CK BAXTER LOWE LA et al Large scale oligonucleotide typing for HLA DRB1 3 4 and HLA DQB1 is highly accurate specific and reliable Tissue Antigens 1993 42 473 479 Rev 4 June 2002 Page 10 of 11 LABType PLdoc BODMER JG MARSH SGE ALBERT E BODMER WF BONTROP RE DUPONT B ERLICH HA HANSEN JA MACH B MAYR WR PARHAM P PETERSDORF EW SASASUKI T SCHREUDER GMT STROMINGER JL SVEJGAARD A TERASAKI PI Nomenclature for factors of the HLA system 1998 Tissue Antigens 53 407 446 1999 Human Immunology 60 361 395 1999 European Journal of Immunogenetics 26 81 116 1999 COLINAS RJ BELLISARIO R et al Multiplexed genotyping of beta globin variants from PCR amplified newborn blood spot DNA by hybridization with allele specific oligodeoxynucleotides coupled to an array of fluorescent microspheres Clinical Chemistry 46 996 998
22. extra para o n mero Mistura de requerido de testes dentro de um tubo limpo 4 uL p rolas Proteja da luz Utilize o conte do completo do tubo de Mistura de P rolas para 96 amostras Agite em Vortex imediatamente antes do uso Fracione para exatamente o mesmo numero de testes Tampao de 34 uL conforme usado para Mistura de P rolas hibrida o i f Adicione mistura pr aliquotada de Mistura de Tai EEE 5 P rolas para prepara a Mistura de Hibrida o Utilize 3740 uL para 96 amostras Mantenha em temperatura ambiente 20 25 C at o uso Volume Reagente M todo de prepara o e sugest es teste Fracione volume apropriado mais o volume extra para o n mero de testes requerido e mantenha em Tamp o de 480 uL temperatura ambiente 20 25 C lavagem Utilize o volume completo de 50 mL para as 96 amostras Fracione o volume apropriado mais o volume extra para o numero de testes Tampao de 2 5 uL Utilize o volume completo de 2 5 em cochinho para as desnatura o 96 amostras Mantenha em temperatura ambiente 20 25 C Fracione o volume apropriado mais o volume extra Tamp o de para o n mero de testes 5 uL neutraliza o Utilize completamente o volume de 2 5mL em um cochinho para 96 amostras Mantenha a RT 20 25 0 SAPE Stock Durante a ltima etapa de centrifuga o prepare a 0 5 uL 100X solu o SAPE 1X fazendo dilui o 1 100 de SAPE Sto
23. fluorescente FD comparativa da amostra ao seu correspondente valor de corte O valor de corte foi experimentalmente determinado por um dado lote do produto LabType SSO e o corte usado para distinguir entre sinais positivos e negativos baseados na genotipagem HLA de uma amostra Os resultados s o 27 esperados para refletir a presen a ou aus ncia de certos alelos HLA fornecendo uma indica o de tipagem regular Em amostras anormais ou sob ensaio e condi es de aquisi o anormais os valores pr determinados de corte precisar o de ajuste para designar a especificidade HLA Por exemplo quantidade ou qualidade insuficientes de DNA deve requerer redu o dos valores de corte Condi es de ensaio anormais tais como temperatura de incuba o de hibrida o ou temperatura de reagente fora de 60 C 0 5 C requerer provavelmente ajuste dos valores de corte pr determinados menor temperatura maior FI e maiores temperaturas menor FI VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Valores esperados A Amplifica o da Amostra 1 Espera se que a mistura de primer HLA locus espec fico fornecida produza quantidade adequada de DNA amplificado A falha na detec o de um produto amplificado pelo brometo de et
24. ia especifica para alelos HLA Cada mistura de microesferas inclui um controle positivo e negativo para subtra o de sinais de fundo n o espec ficos e normaliza o de dados originais para ajustar as poss veis varia es em quantidade de amostra e efici ncia de rea o A mistura de microesferas pr otimizada para produtos PCR espec ficos obtidos pela amplifica o de DNA usando as misturas determinadas de primers HLA l cus espec ficos Essas misturas s o otimizadas para amplifica o de genes HLA espec ficos de 40 ng de DNA gen mico purificado em um volume de 20 uL quando usado em conjunto com a D mix a quantidade de Taq polimerase recombinante prescrita e o programa da PCR est detalhado abaixo Para cada lote verifique a worksheet fornecida para os alelos HLA espec ficos que podem ser identificados por cada sonda usando os procedimentos descritos abaixo Para lotes espec ficos de s tios de sondas referir se ao documento Informa o de Sonda da Bead Bead Probe Information MATERIAIS E N O FORNECIDOS Instrumentos e Analisador Luminex e Plataforma Luminex XY acess rio opcional para leitura automatizada de 96 amostras no cit metro de fluxo Analisador Luminex da empresa Luminex Corporation e Centr fuga e Rotor para tubo de microcentrifuga o de 1 5 mL 14000 a 180009 e Rotor horizontal para microplaca de 96 po os 900 a 1000 g tubos em tiras e Agitador Vortex com velocidade ajust vel
25. ior para que seus dados sejam salvos no disco r gido Caso contr rio os dados poder o ser perdidos Desligando 1 Prepare um tubo com solu o com hipoclorito ou coloque a solu o em um reservat rio no interior da plataforma XY 2 Pressione o bot o SANITIZE 3 Troque o tubo por outro tubo com gua destilada Caso esteja trabalhando com a plataforma enx gue o reservat rio com gua e ent o adicione gua destilada em seu interior 4 Lave o sistema com gua por pelo menos 4 vezes 5 Pressione SOAK 6 Abra os frascos com o Sheath Fluid e Waste para que a press o seja liberada e ent o desligue o cit metro e a plataforma se for o caso 7 Desligue o Computador An lises Siga as instru es de an lise do Software LabType SSO para importar e analisar os dados PROCEDIMENTOS DE CALIBRA O Logo ap s a instala o ou revis o manuten o t cnica e durante procedimentos de rotina a calibra o do analisador Luminex dever ser efetuada A calibra o dever ser feita diariamente como parte da rotina de inicializa o da m quina e sempre que a temperatura d Cal Temp mostrada no monitor do sistema indicar uma mudan a de mais de 3 graus Celsius C Os calibradores s o microesferas com propriedades de dispers o de luz conhecida e tamb m com intensidades conhecidas de fluoresc ncia nas faixas dos comprimentos de onda de Reporter relator RP1 Classification 1 classifica o CL1 e Cl
26. luido de circula o C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS Encontra se abaixo a base de c lculo que o software que acompanha o kit efetua em cima dos resultados adquiridos N o h necessidade de o t cnico de laborat rio efetuar qualquer c lculo uma vez que eles s o feitos automaticamente pelos softwares envolvidos no programa Base de C lculo dos Dados A A intensidade fluorescente FI gerada pelo software coletor de dados da Luminex ou equivalente cont m o FI para cada p rola ou salto da sonda E para a p rola por amostra A porcentagem de valor positivo calculado como Porcentagem de Valor positivo 100 x FI sonda n FI sonda controle negativo FI sonda controle positivo FI sonda controle negativo A rea o positiva definida pelo porcentual de valores positivos para a sonda maior que a sonda com valores de corte pr ajustados A rea o negativa definida como o porcentual dos valores positivos menores que o valor de corte B Compare os porcentuais de valores positivos calculados aos valores de corte pr determinados para cada sonda teste Designe um atributo positivo s sondas que tenham um porcentual positivo acima do corte e um atributo negativo quelas que estiverem abaixo do corte O FI do controle positivo dever estar dentro de 2000 4000 FI O FI de cada sonda normalizado contra o controle positivo FI e expresso como um porcentual do controle positivo FI O v
27. o precisam ser calibrados de acordo com as recomenda es de seus fabricantes Para informa o lote espec fico referir se ao documento de Informa o da Sonda da P rola CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE P rolas que exibem descolora o ou agrega o que n o podem ser removidos por agita o em Vortex dever o ser desconsideradas para uso Se houve precipita o de sais na solu o das al quotas de D mix durante armazenagem ou transporte redissolva por agita o em Vortex em temperatura ambiente 20 25 C As al quotas de D mix depois de serem descongeladas temperatura ambiente 20 25 C dever o ter a colora o rosea Qualquer al quota de D mix fora da colora o indicada dever ser desconsiderada para uso Uma corrida eletrofor tica dever ser realizada antes de come ar o processo de hibrida o descrito acima para que seja verificada a total amplifica o das amostras que passaram pela rea o em cadeia da polimerase PCR Caracter sticas de desempenho espec ficas Em amostras normais e usando ensaio e condi es de aquisi o de dados que est o dentro das especifica es descritas nestas instru es de uso ex concentra o inicial do DNA gen mico de 20 ng uL e pureza OD260 280 de 1 65 a 1 80 temperatura de incuba o de hibrida o e condi es de lavagem e o estado de performance do LabScreen 100 rea es positivas e negativas s o determinadas pela compara o da intensidade
28. o transporte Orienta es para uso Cuidado Cuidado especial dever ser tomado no processo de aliquotagem Falha no cumprimento das etapas descritas abaixo poder o resultar na perda de reagentes Manuseio da P rola e Armazenagem 1 3 Utilize o material pl stico recomendado tubos placas e ponteiras para evitar perdas de p rolas devido ades o n o espec fica P rolas LabType SSO podem se depositar ou se agregar se deixadas no tubo As p rolas devem ser eventualmente homogeneizadas antes de serem dispensadas Agite bem o frasco com as p rolas por pipetagem repetitiva ou por Vortex na posi o horizontal por 10 a 30 segundos ou tanto quanto necess rio para obter uma mistura totalmente homog nea O frasco com as p rolas LabType SSO envolvido em papel de alum nio N o remova o frasco dessa embalagem at que esteja pronto para usar seu conte do P rolas LabType SSO cont m corante fluorescente bem como sondas HLA alelo espec ficas ligadas sua superf cie Para evitar fotobranqueamento das p rolas proteja as da luz durante manuseio e armazenamento Armazene as a 20 C em seu tubo bem fechado at o momento do uso Cubra os frascos onde v o as p rolas com papel alum nio durante o ensaio Cuidados Uma vez que as p rolas foram descongeladas armazene as a 2 5 C e use as at 3 meses N o recongele as p rolas Abra os pacotes contendo a mistura de amplifica o de primer
29. rotegidas da luz e Cuidado use a mistura de p rolas LabType SSO dentro de tr s meses ap s terem sido descongeladas Consulte a FISPQ Ficha de Informa es de Seguran a de Produto Qu mico MSDS Material Safety Data Sheet para informa es detalhadas O tamp o de hibrida o o tamp o de lavagem o tamp o de dilui o do SAPE e as beads p rolas s o produtos sem indica o a produtos perigosos ou nocivos ao usu rio CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA A amostra dever ser tratada como potencialmente infecciosa uma vez que o DNA extra do de origem humana sem nenhum controle de infec o PROCESSO DE MEDI O Coleta da Amostra e Prepara o DNA poder ser purificado de leuc citos humanos por qualquer m todo de prefer ncia do laborat rio A amostra de DNA que ser usada para PCR dever estar suspendida em gua est ril ou em 10 mM Tris HCl pH 8 0 9 0 concentra o de 20 ng 4uL com raz o a A260 A280 de 1 65 1 80 As amostras n o poder o estar ressuspensas em solu es contendo agentes quelantes tal como EDTA acima de 0 5 mM em concentra o As amostras de DNA podem ser usadas imediatamente ap s a separa o ou armazenadas a 20 C ou abaixo para per odos extensos de tempo acima de 1 ano sem nenhum efeito adverso nos resultados iIOMETRIX DIAGN As amostras de DNA dever o ser despachadas a 4 C ou abaixo para preservar sua integridade durante
30. s os volumes de reagentes nas Tabelas 4 e 5 s o para n meros exatos de testes O n mero real de al quotas difere dependendo da precis o de pipetagem PROCEDIMENTO DO TESTE mm SIOMETRIX IAGN STICA 14 EEE Cuidados Necess rios Antes de Come ar a Preparar 1 Para analisar um pequeno n mero de amostras 48 ou menos poder ser utilizada uma placa de 96 po os uma placa que tenha sido cortada para o n mero apropriado de po os ou tubos PCR em tira de parede fina com volume de 0 2 mL Certifique se de usar um suporte para tubos placa PCR 2 Agitar as amostras em uma placa de 96 po os envolve fechamento da placa e agit la em Vortex em baixa velocidade por alguns segundos Ajuste a velocidade do Vortex de modo que o l quido no interior do tubo n o espirre em demasia Anote a velocidade ajustada e utilize a para o m todo da placa de 96 po os 3 O fechamento da placa PCR de 96 po os dever ser bem feito de modo a prevenir contamina o de amostra po o a po o Sele a placa fechando o selador contra a borda de cada um dos 96 po os N o reutilize os seladores Utilize um selador novo em cada etapa que requeira o uso do selador Uma pipeta de repeti o poder ser usada quando aplic vel entretanto um pipetador de repeti o menos preciso na dispensa o do volume 4 Recomendamos uma calibra o regular e uma checagem de volume manual para cada volume a ser dispensado N o utilize uma pipeta de repeti o
31. separados dos materiais usados antes da amplifica o de DNA materiais de pr PCR incluindo todos os pl sticos descart veis pipetas amostras de DNA todos os outros reagentes usados para as rea es de amplifica o Testes de esfrega o frequentes para detectar produto PCR durante as etapas de pr PCR s o recomendados O ensaio baseado na hibrida o DNA DNA usando LabType SSO um processo altamente sens vel varia o de temperatura A temperatura do bloco de aquecimento ou equipamento equivalente usado no ensaio precisa ser frequentemente checado para assegurar rea es timas A estrita fidelidade aos tempos de incuba es e temperaturas descritas nesse procedimento cr tico para obter resultados timos As microesferas LabType SSO s o sens veis luz e precisam ser protegidos de sua incid ncia tanto quanto for poss vel Evite congelamento e descongelamento para assegurar m xima validade Para minimizar a perda de esferas durante o ensaio siga o protocolo descrito aqui e use somente as ponteiras e tubos indicados aqui A mistura de microesferas fornecida cont m uma quantidade cuidadosamente otimizada de conjuntos de microesferas que transportam sondas com alelos HLA espec ficos Qualquer altera o da mistura afetaria significantemente a precis o do ensaio e anularia o resultado 26 OMETRIX STA LA Todos os instrumentos ex termociclador pipetas analisador e o bloco de aqueciment
32. testes RSO1S1T Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus B7 20 testes RSSOH1C Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I L cus C 100 testes RSOH1CT Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus C 20 testes RSSOMICA Kit Tipagem HLA por SSO para MICA Locus MICA 40 testes RSSO2345 Kit Tipagem HLA por SSO para Classe II Locus DRB2345 100 testes RSO2345T Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus DRB2345 20 testes RSSO1C Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I L cus C 100 testes RSO1CT Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus C 20 testes RSSO1S4 Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I e I Locus BW4 100 testes C digo Descri o RSO1S4T Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I e I Locus BW4 20 testes RSSO2B1 Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus DRB1 100 testes RSO2B1T Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus DRB1 20 testes RSSO2P Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus DPA1 DPB1 100 testes RSO2PT Kit Tipagem HLA por SSO para Classe I Locus DPA1 DPB1 20 testes USO PRETENDIDO Tipagem de DNA para alelos HLA de classe I e classe I utiliza o n vitro O sistema de tipagem de DNA LabType SSO fornece sondas de oligonucleot deos de sequ ncia espec fica imobilizadas em microesferas para identifica o de alelos HLA em amostras de DNA gen mico amplificadas atrav s de PCR e posterior hibrida o
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