Home

Protocolos de Biologia MoLecuLar aplicada à Produção Animal

1. o na Publica o CIP Embrapa Pecu ria Sudeste Protocolos de Biologia Molecular Aplicada Produ o Animal recurso eletr nico Luciana Correia de Almeida Regitano et al S o Carlos Embrapa Pecu ria Sudeste 2007 Modo de Acesso http www cppse embrapa br servicos publicacaogratuita e books LVProtocolos pdf Publica es gratuitas acesso em 21 12 2007 Dispon vel tamb m em CD ROM 250 exemplares ISBN 978 85 86764 19 6 1 Protocolos Biologia molecular Produ o animal Niciura Simone Cristina de M Ibelli Adriana M rcia G Ill Gouveia Jo o Jos de S IV T tulo CDD 572 8 Embrapa 2007 Autores Luciana Correia de Almeida Regitano M dica Veterin ria Dra Pesquisadora da Embrapa Pecu ria Sudeste Rod Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 CEP 13560 970 S o Carlos SP Endere o eletr nico lucianaQcppse embrapa br Simone Cristina M o Niciura M dica Veterin ria Dra Pesquisadora da Embrapa Pecu ria Sudeste Rod Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 CEP 13560 970 S o Carlos SP Endere o eletr nico simone QDcppse embrapa br Adriana M rcia Guaratini Ibelli Bi loga Universidade Federal de S o Carlos Rod Washington Luiz km 235 S o Carlos SP Endere o eletr nico adriana ibelli d gmail com Jo o Jos de Simoni Gouveia M dico Veterin rio Universidade Federal de S o Carlos Rod Washington Luiz km 235 S o Carlos SP End
2. dNTPs Desoxinucleot deos dATP dCTP dGTP dTTP ddNTPs Didesoxinucleot deos ddATP ddCTP ddGTP ddTTP Tamp o contendo magn sio Mg e Tris HCI que atuam como co fator enzim tico e tamp o para manuten o do pH respectivamente Enzima Taq DNA Polimerase OBS A enzima os dNTPs e ddNTPs est o contidos no Kit ABI PRISM Big Dye terminator v 3 1 cycle sequencing Procedimentos 1 Retirar as amostras e os reagentes do freezer e mant los no gelo Todos devem estar totalmente descongelados 2 Preparar o seguinte mix em microtubo de 1 5 mL Mix 1X Big dye 2 5 X 2 uL Buffer Big Dye 5X 1 uL Primer 3 2 pmol 1 uL gua milliQ 5 uL DNA 10 ng 1 uL Total 10 uL Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 35 3 Manter o mix no gelo e vortex lo por alguns segundos 4 Dispensar o mix na placa de sequenciamento de acordo com a quantidade estipulada 5 Adicionar a quantidade desejada de DNA ressuspendendo a solu o e observando se o DNA est se misturando ao mix 6 Cobrir a placa com um tapete de borracha e lev la ao termociclador utilizando o programa adequado como por exemplo gt Pr incuba o 94 C por 2 minutos gt Amplifica o 96 C por 20 segundos 25 ciclos de 58 C por 10 segundos 60 C por 04 minutos gt Resfriamento 4 C por A tabela abaixo mostra a quantidade de amostra utilizada em uma rea o de sequ
3. 2000 SEQUENCIAMENTO DIDESOXI OU POR TERMINA O DA CADEIA baseado na incorpora o de desoxinucleot deos dNTPs e de didesoxinucleot deos ddNTPs a uma cadeia de DNA em crescimento tendo como molde o DNA de interesse Quando os ddNTPs s o adicionados a extens o da cadeia interrompida pois esses didesoxinucleot deos n o apresentam um grupo hidroxila OH 3 necess rio para a liga o do pr ximo desoxinucleot deo dNTP Como esses daNTPs s o marcados podem ser detectados e a sequ ncia dos nucleot deos identificada Esse m todo apresenta duas modalidades e Sequenciamento Manual Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 32 No m todo manual a sequ ncia de bases do DNA lida manualmente ap s a exposi o das bases identificadas em um filme de raio X Para isso s o preparados 4 tubos de rea o cada um contendo o DNA molde a DNA polimerase e um primer Cada tubo recebe uma pequena quantidade de um dos ddNTP dATP ddTTP ddCTP e ddGTP junto com um dos dNTPs dATP dTTP dCTP ou dGTP marcados com f sforo radioativo P Em qualquer um dos 4 tubos ser o produzidos v rios comprimentos de cadeia cada um correspondente ao ponto no qual o respectivo ddNTP desse tubo foi incorporado e ocasionando o t rmino do crescimento da cadeia As amostras de cada tubo s o submetidas eletroforese e posterior exposi o em filme de raio X para que a posi o das bases correspondentes pos
4. o A e transferir para microtubos de 1 5mL 11 Centrifugar 5 min a 16 000 xg e descartar o sobrenadante Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 6 As c lulas brancas assim preparadas podem ser armazenadas entre 20 C e 80 C B Extra o e purifica o do DNA 1 Ressuspender o pellet em 500uL de Solu o B 2 Vortexar at o pellet desprender do fundo do tubo 3 Incubar a 55 C por 4 6 horas ou overnight Vortexar periodicamente durante a incuba o para que a dissolu o do pellet seja completa A Solu o B cont m Tris HCI pH 8 0 que uma solu o tamp o cuja finalidade manter o pH constante Como o pH timo para a a o de DNases end genas por volta de 7 0 este reagente ajuda a evitar a a o destas nucleases O SDS um detergente i nico forte cuja fun o romper as membranas celulares o EDTA age quelando ons Mg e Ca que s o co fatores de diversas enzimas nucleares como as DNases e a proteinase K hidrolisa as prote nas Se houver disponibilidade de um bloco aquecido com agitador termomixer deve se deixar as amostras agitando durante a incuba o 4 Adicionar 210uL de TE pH 7 6 e 240uL de NaCl 5M O NaCl far com que as prote nas precipitem por excesso de ons O TE um tamp o 5 Agitar os tubos por invers o at formar pequenos co gulos 6 Incubar em gelo por 10 min 7 Centrifugar por 15 min a 16 000xg Protocolos de Biologia Molecular
5. 5M 10mM 50 uL gua deionizada Completar para 25 mL Solu o B Solu o de lise Reagente Volume x 1 amostra Concentra o final Tris Cl pH 8 0 1M 5uL 10mM NaCl 5 M 10uL 100mM EDTA pH8 0 0 5M 10uL 10mM SDS 20 12 5uL 0 5 Proteinase K 20 mg mL 2 5uL gua deionizada 460 5 uL Volume final 500 uL gua DEPC dietilpirocarbonato Adicionar 100 uL de DEPC para cada 100 mL de gua deionizada Agitar bem e incubar a 37 C por 12 horas Autoclavar a gua DEPC por 45 minutos a 1 atm Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 64 REFER NCIAS ALVARES L E Aspectos pr ticos da RT PCR Extra o de RNA s ntese de cDNA e PCR In Biologia Molecular Aplicada Produ o Animal Embrapa 2001 AUSUBEL F M Current protocols in molecular biology John Wiley amp Sons v 1 1987 AUSUBEL F M Current protocols in molecular biology John Wiley amp Sons 1994 AZEVEDO M O FELIPE M S S BR GIDO M M MARANH O A Q DE SOUZA M T T cnicas b sicas em biologia molecular Bras lia UnB 2003 BARTLETT J M S STIRLING D Methods in molecular biology In PCR Protocols v 226 22 ed Humana Press Inc 2008 BRAMMER A P Atualiza es em t cnicas celulares e moleculares aplicadas ao melhoramento gen tico vegetal 1 ed Passo fundo Embrapa Trigo 2002 CALSA JUNIOR T BENEDITO V A FIGUEIRA A V O An lise seri
6. 8 0 50 mM NaCl 10 mM MgCl gt 10 mM 2 mercaptoetanol 0 1 mg mL de BSA e 1 unidade da endonuclease de restri o Mbol depende do fabricante A rea o de digest o ser incubada a 37 C depende do fabricante por 3 horas Para an lise dos gen tipos os produtos das digest es ser o separados em gel de agarose 4 com tamp o de eletroforese TBE 1X 90 mM Tris base 90 mM cido b rico e 2 mM EDTA pH 8 0 submetidos voltagem de 3 V cm e corados com Brometo de Et deo incorporado no gel Em cada po o do gel ser o aplicados 14 uL do produto de digest o acrescidos de 2 8 uL de loading buffer numa propor o de 5 1 respectivamente e no primeiro po o de cada fileira do gel ser aplicada uma amostra de padr o de tamanho de DNA de 100 pb tamb m acrescido de loading buffer na mesma propor o acima Os fragmentos ser o detectados sob ilumina o UV e registrados por uma c mera fotogr fica digital Os tamanhos dos fragmentos ser o estimados por compara o com padr o de tamanho de DNA de 100 pb em cada gel e assim ser poss vel determinar os gen tipos de cada animal Os primers utilizados na PCR amplificam uma regi o de 545 pares de bases do gene da tireoglobulina como ilustrado a seguir Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 20 gt 9gi 790 emb X05380 1 Bovine thyroglobulin gene exon 1 and flanks AAGCTTCCTGCTGCCTTTTGGTTGTCTGACGTCCTGGGACAGAGGGGAAAGGG GGATGACTACGAGTATGACTGTGCGTATGTTTGGC
7. SAIKI R K GELFAND D H STOFFEL S SCHARF S J HIGUCHI R HORN G T MULLIS K B ERLICH H A Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase Science v 239 p 487 491 1988 SAMBROOK J E RUSSEL D W Molecular cloning a laboratory manual 3 ed New York Cold Spring Harbor Laboratory Press 2700 p 2002 SEATON G HALEY C S KNOTT S A KEARSEY M VISSCHER P M QTL Express mapping quantitative trait loci in simple and complex pedigrees Bioinformatics v 18 p 339 340 2002 SHAFFER L G BEJJANI B A Medical applications of array CGH and the transformation of clinical cytogenetics Cytogenetical Genome Research v 115 n 3 4 p 303 309 2006 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 66 SILVA J NIOR J G da Eletroforese de prote nas guia te rico e pr tico Rio de Janeiro Interci ncia Ltda 2001 SOUTHERN E MIR K SHCHEPINOV M Molecular interactions on microarrays Nature Genetics v 21 p 5 9 1999 STERKY F LUNDEBERG J Sequence analysis of genes and genomes J Biotechnol 76 1 31 2000 VISSCHER P M THOMPSON R HALEY C S Confidence intervals in QTL mapping by bootstrapping Genetics v 143 p 1013 1020 1996 WESTERMEIER R electrophoresis in practice a guide to methods and applications of DNA and protein separations Wiley VCH 2005
8. de 1 5 mL 2 Homogeneizar centrifugar a 21 000 xg por 5 minutos e descartar o sobrenadante 3 Homogeneizar e adicionar 500 uL de solu o de extra o 4 Incubar por 5 minutos temperatura ambiente e transferir o conte do do tubo para a coluna de extra o acoplada a um tubo coletor 5 Centrifugar a 5 000 xg por 1 minuto 6 Adicionar coluna 500 uL de solu o de extra o e centrifugar a 5 000 xg por 1 minuto 7 Adicionar coluna 500 uL de solu o de lavagem e centrifugar a 21 000 xg por 3 minutos 8 Transferir a coluna para um microtubo de 1 5 mL limpo e livre de DNAses 9 Adicionar 100 uL de gua bidestilada autoclavada e aquecida a 70 C Incubar por 1 minuto temperatura ambiente Centrifugar a 5 000 xg por 1 minuto Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 9 3 EXTRA O DE RNA Adriana M rcia Guaratini Ibelli Luciana Correia de Almeida Regitano Simone Cristina M o A an lise do RNA pode fornecer informa es importantes sobre express o g nica Para que isto seja poss vel necess rio que seja feito uma purifica o eficaz do RNA mantendo sua integridade e qualidade Os m todos para isolamento de RNA baseiam se na lise e na desnatura o das c lulas que permitem a libera o dos cidos nucl icos totais e na presen a de inibidores que impedem a a o de ribonucleases RNAses Ausubel 1987 A principal dificuldade na extra o de RNA a presen a de grande q
9. de detec o tem sido bastante empregado em ensaios de PCR quantitativa em tempo real pois tem a vantagem de ser mais barato em rela o constru o de sondas marcadas Um aspecto importante no uso de SYBR Green que os primers utilizados na rea o de PCR devem ser desenhados cuidadosamente para evitar a Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 44 amplifica o de produtos inespec ficos e forma o de d meros uma vez que esse corante se liga a qualquer DNA dupla fita JA SYBR Green 8 O o Seq ncia alvo o fluoresc ncia Figura 4 Sistema SYBR Green A O corante livre na solu o n o emite fluoresc ncia B Quando o corante se liga ao DNA fita dupla ocorre a emiss o de fluoresc ncia Usando qualquer uma das qu micas apresentadas o aumento na emiss o de fluoresc ncia pode ser lido por um detector em tempo real durante a rea o de PCR e uma consequ ncia direta da amplifica o da sequ ncia de DNA de interesse Um programa de computador calcula um ARn usando a seguinte equa o ARn Rn Rn Onde Rn emiss o de fluoresc ncia em cada ponto Rn emiss o de fluoresc ncia na linha de base Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 45 O computador constr i os plots de amplifica o usando os dados de emiss o de fluoresc ncia durante a PCR Os valores de ARn s o plotados vezes o n mero de ciclos de amplifica o
10. deve ao fato de que os n veis de express o de in meros genes de Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 56 interesse podem ser mensurados em um nico experimento de hibridiza o fornecendo tanto a informa o de qual tecido o gene expresso quanto a informa o din mica da express o revelando como o padr o de express o de um gene se relaciona com os outros A principal aplica o dos arranjos de DNA a an lise comparativa da express o g nica em larga escala Outras aplica es incluem ainda a an lise da varia o no DNA em escala gen mica gen mica comparativa caracteriza o de intera es moleculares e a descoberta de reagentes antisenso efetivos Southern et al 1999 Arranjos tamb m v m sendo desenvolvidos para promover a genotipagem de polimorfismos de base nica do ingl s single nucleotide polimorphisms SNPs em larga escala Meaburn et al 2005 e a determina o do n mero de c pias de um segmento de DNA no genoma Shaffer et al 2006 Este texto abordar os principais aspectos pr ticos da metodologia de microarranjos para estudos de express o g nica procurando indicar os passos desde a constru o de uma plataforma at a an lise dos dados A constru o da plataforma microarranjo O primeiro passo do m todo a sele o do conjunto de mol culas de DNA de interesse que ser o impressas sobre a plataforma Neste m todo as mol culas impressas s o d
11. e de genomas de organismos modelo resultam na identifica o de in meras sequ ncias motivo cujos dom nios estruturais conservados fornecem pistas sobre as fun es biol gicas que estes genes exercem no organismo No entanto nem sempre poss vel definir a fun o biol gica dos genes apenas com a informa o da sequ ncia A detec o e a quantifica o do n vel de express o dos genes tamb m contribuem para adicionar informa es funcionais quelas obtidas pelo sequenciamento revelando transcritos que s o co expressos espacial e temporalmente e tamb m as rela es existentes entre eles O uso de ferramentas tradicionais de quantifica o da express o g nica como Northern blot dot blot e RT PCR por exemplo apesar de precisos e robustos n o apresentam a efici ncia e a rapidez necess rias para acompanhar o ritmo de descoberta de genes novos imposta pelo sequenciamento Abordagens mais eficientes para a an lise da express o g nica constituem um desafio presente para o estudo de um grande n mero de genes simultaneamente Os arranjos de DNA foram desenvolvidos justamente para permitir estudos de express o g nica em escala gen mica Surgiram como resultado da disponibilidade das sequ ncias obtidas em projetos genoma e da rob tica de alta precis o capaz de depositar in meras pequenas amostras de DNA em superf cies s lidas usualmente em uma l mina de microsc pio ou membranas de n lion O poder do m todo se
12. lo positivo Ent o o fator determinante da taxa de migra o ser a massa da mol cula quando se fala em cidos nucl icos a massa diretamente proporcional ao tamanho da mol cula Existem v rios meios de suporte que podem ser utilizados papel filtro membrana de celulose gel de agarose gel de poliacrilamida No caso dos g is a porosidade que tem uma rela o direta com a concentra o de agarose determina o poder de separa o Brammer 2002 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 23 Na escolha do tamp o o principal fator a ser considerado sua capacidade tamponante Os dois tamp es mais utilizados na eletroforese de cidos nucl icos s o o TAE Tris Acetato e EDTA e o TBE Tris Borato e EDTA O TAE mais utilizado que o TBE por m mais facilmente exaurido durante corridas longas ou com alta voltagem O TBE apesar da melhor capacidade tamponante deve ser evitado quando se deseja purificar os cidos nucl icos do gel Ausubel 1994 Alguns fatores alteram a migra o das mol culas atrav s do gel dentre eles podemos citar concentra o de agarose conforma o do DNA e intensidade da corrente A concentra o de agarose atua de forma importante na eletroforese pois ela determina a faixa de tamanho das mol culas de DNA que podem ser separadas As rela es entre concentra o de agarose e resolu o de mol culas lineares de DNA s o apresentadas na tabela abaixo
13. minutos a 37 C 12 Estocar em freezer 20 C Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 42 10 PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL Helena Javiel Alves O m todo de PCR quantitativa em tempo real muito sens vel e pode ser usado quando necess rio quantificar a express o de RNAs mensageiros em baixos n veis Esse procedimento permite a detec o direta dos produtos da PCR durante a fase exponencial da rea o combinando amplifica o e detec o em um s passo O princ pio da t cnica de PCR em tempo real pode se utilizar de duas descobertas importantes a primeira a atividade exonuclease 5 gt 3 da enzima Tag DNA polimerase e a segunda a constru o de sondas de oligonuclet deos marcadas duplamente Essas sondas s o baseadas no princ pio FRET do ingl s Fluorescence Resonance Energy Transfer e emitem sinal de fluoresc ncia somente quando clivadas Com o objetivo de detectar o sinal de fluoresc ncia durante as rea es foram desenvolvidas v rias t cnicas Em PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan Figura 3 a sonda espec fica para o gene de interesse marcada duplamente com um fluor foro rep rter em uma extremidade e um fluor foro silenciador na outra Na forma ntegra a transfer ncia de energia fluorescente ocorre de forma que a emiss o pelo rep rter absorvida pelo silenciador Quando ocorre a degrada o da sonda pela atividade exonuclease da enzima Ta
14. par metro de avalia o da qualidade das prepara es de cidos nucl icos Valores inferiores a 1 8 resultam de contamina o com prote na Utilize o espa o abaixo para anotar o resultado da quantifica o Amostra ODsso ODs gt so Raz o Concentra o A concentra o de RNA nas amostras tamb m ser avaliada por espectrofotometria tendo uma al quota de amostra de RNA dissolvida em gua deionizada na propor o de 1 100 5uL de DNA 495 uL de gua deionizada Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 13 autoclavada O grau de pureza do RNA ser estimado pela raz o entre as absorb ncias medidas a 260 e 280 nm que deve ser igual ou superior a 1 75 Sambrook 2002 Para uma amostra de RNA pura tem se que OD gt eo OD gt go 1 8 a 2 0 Uma densidade ptica igual 1 0 corresponde a 40 ug de RNA fita simples por mL Desta forma a concentra o de RNA na amostra pode ser calculada atrav s da seguinte rela o Concentra o de RNA ug mL OD gt eo X Fator de dilui o 100 X 40 Utilize o espa o abaixo para anotar o resultado da quantifica o Amostra OD260 OD gt s0 Raz o Concentra o Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 14 5 REA O EM CADEIA DA POLIMERASE PCR Adelita Carolina Santiago Gisele Batista Veneroni Luciana Correia de Alme
15. pasa Figura 1 Gel com fragmentos da tireoglobulina ap s digest o com enzima de restri o Mbol Na coluna 1 pode ser observado o padr o de tamanho 100 pb na coluna 2 homozigoto AA coluna 3 homozigoto BB e Coluna 4 heterozigoto AB Resultados Animal Gen tipo Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 22 7 ELETROFORESE DE CIDOS NUCL ICOS Jo o Jos de Simoni Gouveia Luciana Correia de Almeida Regitano A eletroforese uma t cnica utilizada para separar identificar e purificar mol culas carregadas como DNA e prote nas Maniatis 1987 Este m todo foi introduzido por Tiselius no ano de 1937 Brammer e lorczeski 2002 e simples r pido e capaz de separar fragmentos que n o s o adequadamente separados por outras t cnicas Sambrook e Russel 2002 A t cnica apresenta basicamente um sistema de suporte gel de agarose por exemplo um tamp o no qual est imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba onde est o contidos o tamp o e o gel Sob a influ ncia de um campo el trico mol culas carregadas e part culas migram em dire o ao p lo oposto A carga e a massa das mol culas fazem com que elas migrem em velocidades diferentes e portanto propiciam a separa o destas Westermeier 2005 Como os cidos nucl icos DNA e RNA possuem carga el trica negativa devido ao grupamento fosfato eles sempre migrar o em dire o ao p
16. vez que lip dios prote nas e carboidratos celulares podem interferir e causar liga es n o espec ficas dos alvos com as sondas Para a detec o radioativa P dCTP o mais usado por ser um emissor de alta energia permitindo distinguir os sinais entre elementos fisicamente pr ximos um do outro Para a detec o com marcadores fluorescentes Cye 3 dUTP e Cye 5 dUTP s o os mais usados porque s o de maior efici ncia de incorpora o pela transcriptase reversa apresentam boa fotosensibilidade e rendimento al m de serem altamente separ veis em espectros de emiss o permitindo a discrimina o por filtragem ptica Duggan et al 1999 Quando hibridizado ao DNA impresso na plataforma o alvo marcado emite um sinal que detectado por um filme espec fico chamado phosphor imager no caso dos experimentos radiativos ou diretamente pelo scanner no caso dos fluorescentes resultando em imagens digitalizadas dos arranjos Estas imagens s o ent o utilizadas em programas espec ficos ArrayVision ou ImageQuant por exemplo que geram grids capazes de localizar cada um dos sinais no arranjo e de convert los em uma leitura quantitativa relativa ao n vel de express o do gene Hal et al 2000 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 59 12 2 A AN LISE DOS DADOS Experimentos sequenciais de hibridiza o de arranjos geram resultados que consistem basicamente em listas de genes e de valores corres
17. 0 uL Formalde do 10 150 uL Azul de bromofenol 0 4 0 004 g gua DEPC 300 uL Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 28 1 Acrescentar 3 uL do tamp o da amostra para cada 1 uL de RNA 2 Acrescentar 1 uL de brometo de et dio 0 05 ug uL 3 Incubar as amostras por 15 minutos 65 C 4 Transferir para um recipiente contendo gelo 5 Centrifugar rapidamente para recolher o conte do no fundo do tubo 6 Manter em gelo at aplicar as amostras no gel 7 3 ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILAR Gustavo Gasparin Durante d cadas a eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose foi intensamente utilizada como uma das ferramentas mais importantes dos laborat rios de biotecnologia e bioqu mica para a an lise de macromol culas Nos ltimos anos por m a eletroforese capilar tem apresentado vantagens em rela o t cnica de eletroforese em placas Para a an lise simult nea de amostras instrumentos de eletroforese capilar com arranjo de capilares s o os mais utilizados Existem aparelhos que possuem desde um nico capilar at 384 capilares possibilitando a maximiza o do tempo necess rio para as mais diferentes an lises desde detec o de res duos de explosivos e drogas at testes de paternidade A separa o das macromol culas conduzida em tubos de dimens es de 15 a 100 um de di metro interno e 36 a 100 cm de comprimento preenchidos com um eletr lito O uso do capilar forne
18. Aplicadas Produ o Animal 7 8 Recolher o sobrenadante dividindo o em dois microtubos de 1 5mL limpos m ximo de 500yL de sobrenadante por tubo 9 Adicionar tmL de etanol 100 absoluto gelado em cada tubo e misturar por invers o fundamental que o volume de etanol corresponda no m nimo 02 vezes o volume da solu o para que a precipita o do DNA seja eficiente Alternativamente pode se utilizar 01 volume de isopropanol temperatura ambiente O lcool torna o meio muito hidrot bico para o DNA fazendo com que ele precipite sobre sua pr pria estrutura 10 Centrifugar por 15 min a 16 000xg 11 Descartar o sobrenadante 12 Secar em papel 13 Adicionar 500uL de etanol 70 gelado O lcool 100 faz com que precipitem muitos sais juntamente com o DNA al m de dificultar a ressuspens o do DNA por isso utiliza se uma lavagem com lcool 70 14 Centrifugar por 5 min a 16 000xg 15 Descartar o etanol e secar o pellet 16 Adicionar 250uL de TE RNase 10ug de RNase por mL de amostra e incubar por 1h a 37 C Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 8 Este protocolo isola juntamente com o DNA uma quantidade consider vel de RNA por isso o tratamento com RNase se faz necess rio para remover este contaminante 2 2 EXTRA O DE DNA DE SANGUE UTILIZANDO O KIT GFX M rcia Cristina de Sena Oliveira 1 Colocar 300 uL de sangue e 900 uL de solu o de lise em microtubo
19. Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 3 2 EXTRA O DE DNA Jo o Jos de Simoni Gouveia Luciana Correia de Almeida Regitano A extra o dos cidos nucl icos DNA e RNA o primeiro passo para a realiza o da maioria das metodologias de biologia molecular Pode se obter DNA a partir de in meros tipos de tecidos e c lulas e existe uma infinidade de protocolos para realiza o de tal procedimento A escolha do protocolo de extra o de DNA depender de diversos fatores como tipo de tecido a ser utilizado grau de pureza e de integridade necess ria para a aplica o em que o DNA ser utilizado PCR sequenciamento clonagem g nica etc Bartlett 2003 O primeiro relato sobre isolamento de DNA data de 1869 e foi realizado por Friedrich Miescher a partir de leuc citos presentes em pus Miescher lisou estas c lulas com uma solu o alcalina e precipitou o material nuclear com solu o salina Este material nuclear que posteriormente seria conhecido como DNA foi chamado de nucle na http Awww dbbm fiocruz br helpdesk mbiology historico2004 paf http www dnai org Basicamente o processo de extra o de DNA consiste em duas etapas A primeira etapa a extra o propriamente dita e consiste no rompimento das membranas celulares e consequente exterioriza o do DNA A segunda fase consiste na purifica o do DNA em solu o ou seja retirada dos outros componentes celulares da solu
20. Durante os ciclos iniciais da amplifica o por PCR os valores de ARn n o excedem a linha de base Portanto um ciclo limiar Ct arbitr rio escolhido baseado na varia o da linha de base Os valores de Ct s o ent o calculados por determina o do ponto no qual a fluoresc ncia excede esse limiar escolhido O Ct definido como o n mero de ciclos nesse ponto Figura 5 2000000 1ecoono 200000 1600000 s 50000 12500 1400000 cestas 781 u f 1200000 ar pia k NTC Fase log i c 1000000 f g j q BOCNCO lt 000004 Ta f s00000 ARO E A f limiar 4 FER SAEF 200000 or PAS A dA cas A g gm OP RA FE o E ma Se 0 9 18 2 e 00900 Linha de base N mero de ciclos Figura 5 Exemplo de constru o dos plots de amplifica o onde ARn plotado contra o n mero de ciclos Existem dois m todos mais comumente utilizados para analisar dados de experimentos de PCR quantitativa em tempo real s o eles o m todo de quantifica o absoluta m todo da curva padr o e o m todo de quantifica o relativa M todo de quantifica o absoluta O n mero de c pias do gene de interesse determinado relacionando se o sinal da PCR com uma curva padr o Para a Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 46 constru o da curva padr o s o utilizadas dilui es seriais de uma amostra de concentra o conhecida Esse m todo tem
21. Maniatis et al 1982 Tabela 1 Limites de efici ncia da separa o de DNA em diferentes concentra es de agarose Maniatis 1987 Concentra o de agarose no Separa o de mol culas de DNA gel Kb Limites de efici ncia 0 3 60 5 0 0 6 20 1 0 0 7 10 0 8 0 9 7 0 5 1 2 6 0 4 1 5 4 0 2 2 0 3 0 1 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 24 Para observar cidos nucl icos em gel de agarose deve se cor los e submet los a uma luz ultravioleta O corante mais comum o brometo de et deo que se intercala entre as bases do DNA Ausubel 1994 7 1 Protocolo para an lise de produtos de amplifica o e fragmentos de digest o em gel de agarose gel 1 gt 0 3 g de agarose para 30 mL de gel que deve ser preparado com tamp o Tris Borato EDTA 1X Para isso aplicar 5 ul de produto de amplifica o 1 ul de loading buffer gel 4 gt 1 2 g de agarose de baixo ponto de fus o para 30 mL de gel que deve ser preparado com tamp o Tris Borato EDTA 1X Utilizado para analisar o resultado das digest es com enzimas de restri o Aplicar todo o produto da digest o 13 ul 2 6 ul de loading buffer Pesar a agarose Coloc la em um erlenmeyer contendo o volume necess rio de tamp o TBE 1X Aquecer no forno de microondas at iniciar a ebuli o aproximadamente 30 segundos em pot ncia m dia para um gel de 30 mL Agitar o fra
22. PROTOCOLOS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA PRODU O ANIMAL 7 Y 4 Ji Luciana Correia de Almeida Regitano k Simone Cristina M o Niciura Adriana M rcia Guaratini Ibelli Jo o Jos de Simoni Gouveia Emxpa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu ria Embrapa Pecu ria Sudeste Minist rio da Agricultura Pecu ria e Abastecimento Protocolos de Biologia Molecular Aplicada Produ o Animal Editores Luciana Correia de Almeida Regitano Simone Cristina M o Niciura Adriana M rcia Guaratini Ibelli Jo o Jos de Simoni Gouveia Embrapa Pecu ria Sudeste S o Carlos SP 2007 Embrapa Pecu ria Sudeste Rodovia Washington Luiz km 234 Caixa Postal 339 CEP 13560 970 S o Carlos SP Fone 16 3361 5611 Fax 16 3361 5754 Home page http Nwww cppse embrapa br Endere o eletr nico sacOcppse embrapa br Comit de Publica es da Unidade Presidente Alberto C de Campos Bernardi Secret rio Executivo Edison Beno Pott Membros Carlos Eduardo Silva Santos Maria Cristina Campanelli Brito Odo Primavesi S nia Borges de Alencar Revisor de texto Edison Beno Pott Normaliza o bibliogr fica S nia Borges de Alencar Editora o eletr nica Maria Cristina Campanelli Brito 1a edi o on line 2007 Todos os direitos reservados A reprodu o n o autorizada desta publica o no todo ou em parte constitui viola o dos direitos autorais Lei no 9 610 Dados Internacionais de Cataloga
23. Posteriormente uma limpeza com lcool permite a retirada de sais que tenham ainda aderido ao precipitado de RNA Ausubel 1987 Na extra o de RNA alguns fatores al m da escolha do protocolo utilizado s o extremamente importantes para a obten o e a manuten o do RNA de qualidade Primeiramente todas as solu es utilizadas dever o ser feitas com gua DEPC dietilporocarbonato autoclavada O DEPC atua inativando RNAses pois degrada as histidinas presentes Os almofarizes pistilos vidrarias e outros utens lios devem ser previamente esterilizados em estufa a 180 C por um per odo de quatro horas As ponteiras tubos de polipropilenos devem ser novos e livres de RNAses As micropipetas devem ser utilizadas apenas para os procedimentos com RNA A bancada deve ser constantemente limpa com SDS 10 e com etanol 70 e se poss vel exclusiva para a manipula o de RNA E principalmente devem ser tomados cuidados com as luvas utilizadas de forma a mant las livres das RNAses normalmente liberadas abundantemente pelas secre es da pele Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 11 3 1 Protocolo de Extra o de RNA adaptado de Chomczynski 1987 9 Macerar o tecido em nitrog nio l quido Para cada 50 a 100 mg de tecido adicionar 1 mL de trizol em tubo de polipropileno de 1 5 mL Homogeneizar em v rtex Incubar 5 min a temperatura ambiente Acrescentar 200 uL de clorof rmio Agit
24. TTATCTCATCAAAATCTCTA CATTCTGTGTTAATGGATCTGCCTGTTTTGTTCCCTGCCATATCCTCATGGCCT AGAATAGTGTCTGCTTCTCTATCAGACTCTAAAGAAACATTGCTAGGAGGGAAG GAAGGAGCATGGATGAGGAGGGAGGGAGCATTGTGTTTCTCTCACGGTGGGCE TGAACGTGTGGCCCACCAAGTTGTTAACTTTGGCCTTTACCCCTGAAGATGAATT ATGAAGCCACACCCCCAGTTCTTCCTTGGTGGCTCAGATGGTCAAGAATCCACC TGCAATGCGGGAGACCTGGGTTTGATCCCTGGGTTEGGAAGATCCCCTGGA GAAGGGAATGGCTACCCACTCCAGTATTCTGGCCTGGAGAATCCCATGGACAG AGGAGCCTGGCGGGATGCAGTCCATGGGGTCTCAGAGAGTCAGATGTGACTGA GCGACTTTCACACACATTCGTCCCTGGTTCTGCTCCCCTACAGCCTCCACAAGA TTTTCAC CCCACACTGGCCACATGAGTGTCCTCCAGGGGAACAGACGCAGGTG GAGGACCTCCTTGTGACCAGCAGAGAAAACAGGGTGGGCACTGCTTCCCTGAG TGCCTGTGGGTGGGGGCTAAGTACCCACAGCAGTGCTATAAAGGCTCCTTGGC CAGAGCCCTAAGGTGGGCAGCAGCTTCTAACCCTTCTCCCTGGAAGGCTCCCA AGATGGCCCTGGCCCTATGGGTCTTCGGTCTGCTGGACTTAATCTGCTTGGCAT CCGCCAACATCTTTGGTAAGTTCTGACCCTGCGGTCTCAGAGCATCGGGTTGG GAGGGACCTCTGAGGCCAACTCCTTGTTAGECCAGGACCTGCCCCAGGGCCATG GAACATTTGTGACCTCATTTAATCCTCAGTGTCCCGAGGTCAGTTATGCACTCTT TCCTTTTCAGATGAAGAGACAGAGGGTCTGAGAAGTCACAGAGTCAGTGATO Obs Os s tios de anelamento dos primers est o sublinhados Em negrito podem ser observados os s tios de restri o Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 21 Ap s digest o com a enzima Mbol o alelo A caracterizado pela presen a de tr s fragmentos de restri o com 74 193 e 278 pares de bases respectivamente o alelo B produz fragmentos de 17 74 176 e 278 pares de bases T e PARA w gt wu ms y
25. a do laborat rio de Biotecnologia Animal do Centro de Pesquisa de Pecu ria do Sudeste e s o adapta es dos protocolos descritos em Regitano 2001 O objetivo deste cap tulo fazer com que o aluno entenda os princ pios deste processo a finalidade de cada reagente em um protocolo de extra o de DNA e a partir da possa utilizar e adaptar os protocolos j existentes de acordo com sua necessidade e disponibilidade de reagentes Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 5 2 1 Extra o de DNA de Leuc citos A Obten o de Leuc citos 1 Coletar 5mL de sangue em tubos contendo EDTA pot ssico 50uL de EDTA Ks a 15 O EDTA uma subst ncia anticoagulante Existem outras subst ncias com esta finalidade citrato e heparina por m se o DNA for utilizado para PCR n o se deve utilizar heparina pois esta subst ncia interfere na atividade da enzima Tag DNA polimerase 2 Transferir 2 5 mL do sangue para um tubo Falcon de 15mL Adicionar 1OmL de Solu o A e vortexar at homogeneizar Centrifugar por 10 min a 700 xg Dispensar o sobrenadante Ressuspender o pellet em 5mL de Solu o A Vortexar at dissolver completamente o pellet Centrifugar por 10 min a 700 xg Repetir os passos 4 9 at obter somente as c lulas brancas o pellet deve estar branco cremoso Res duos de hemoglobina inibem a rea o de PCR 10 Ressupender o pellet em 500uL de Solu
26. a vantagem de que a curva padr o inclu da em cada PCR fornece um controle extra e corre o na efici ncia da PCR de cada amostra individual tornando mais confi veis as compara es entre experimentos M todo de quantifica o relativa Esse m todo mais usado quando existem muitos genes a serem testados em muitas amostras Nesse caso feita a rela o entre o sinal da PCR de um gene de interesse entre um grupo tratado com uma amostra controle por exemplo uma amostra n o tratada Esse procedimento tem a vantagem de n o necessitar da constru o de curvas padr o Por outro lado as efici ncias de amplifica o dos genes de interesse e controle t m que ser similares para a obten o de resultados confi veis Em ambos m todos s o utilizados genes constitutivos para a normaliza o das amostras Tais genes devem ter express o constante em todos os tecidos e em todas as fases de desenvolvimento bem como n o serem afetados pelos tratamentos experimentais O gene mais utilizado com esta finalidade o gene da P actina O m todo de PCR quantitativa em tempo real tem se mostrado uma ferramenta de extrema import ncia na quantifica o de RNAs mensageiros em baixos n veis tornando a quantifica o mais r pida e acurada Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 47 10 1 PROTOCOLO DE UMA PCR EM TEMPO REAL 1 Preparar o Sybr Green mix para 50 rea es Este procedimento realizad
27. al da express o g nica Revista Biotecnologia Ci ncia e Desenvolvimento Bras lia n 33 p 86 98 2004 CHOMCZYNSKI P and SACCHI N Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction Anal Biochem 156 159 1987 CHURCHILL G A DOERGE R W Empirical threshold values for quantitative trait mapping Genetics v 138 p 963 971 1994 DUGGAN D J BITTNER M CHEN Y MELTZER P TRENT J M Expression profiling using cDNA microarrays Nature Genetics London v 21 sup 1 p 10 14 1999 HAL N L W van VORST O VAN HOUWELINGEN A KOK E J PEIJNENBURG A AHARONI A VAN TUNEN A KEIJER J The application of DNA microarrays in gene expression analysis Journal of Biotechnology Amsterdam v 78 n 3 p 271 280 2000 HALEY C S KNOTT S A ELSEN J M Mapping quantitative trait loci in crosses between outbred lines using least squares Genetics v 136 p 1195 1207 1994 HARRINGTON C A ROSENOW C RETIEF J Monitoring gene expression using DNA microarrays Current Opinion in Microbiology Oxford v 3 n 3 p 285 291 2000 http www dbbm fiocruz br helpdesk mbiology historico2004 pdf http www dnai org http www etall hpg ig com br cursopcr htmL Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 65 LANDER E S BOTSTEIN D Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps Gen
28. ar vigorosamente com as m os por 15 segundos Incubar durante 5 min a temperatura ambiente Centrifugar a 16 000 xg 4 C durante 15 min Remover a fase aquosa para tubo limpo Adicionar 500 uL de isopropanol Homogeneizar com as m os 10 Incubar por 10 min a temperatura ambiente 11 Centrifugar a 13 000 xg 4 C por 10 min 12 Descartar o sobrenadante 13 Lavar com 1 mL de etanol 75 feito com gua DEPC Neste ponto pode armazenar em freezer 20 por at um ano 14 Centrifugar a 10 500 xg 4 C por 5 min 15 Secar o pellet durante 15 min a temperatura ambiente Obs N o pode ficar nada de etanol 16 Ressuspender o pellet em gua DEPC 20 uL a 50 uL Obs Verificar o tamanho do pellet para avaliar em que volume ressuspender Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 12 4 QUANTIFICA O EM ESPECTROFOT METRO Luciana Correia de Almeida Regitano Os cidos nucl icos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm Para fazer a leitura no espectrofot metro normalmente se utiliza uma dilui o em gua Para estimar a concentra o de DNA utiliza se a seguinte rela o 1 OD gt eo 50 ug DNA dupla h lice Regitano 2001 Sambrook 2002 Dessa forma a concentra o de DNA na amostra obtida pelo seguinte c lculo DNA Valor da leitura em O D X 50 X Fator de dilui o As prote nas absorvem luz no comprimento de onda de 280 nm Sendo assim a rela o A eo A gt zgo fornece um
29. ce vantagens sobre as placas de gel devido s raz es geom tricas em que h uma elevada rela o entre a rea superficial e o volume interno permitindo a dissipa o eficiente do calor gerado pela corrente el trica e possibilitando a aplica o de campos el tricos elevados 100 a 500 V cm Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 29 o que resulta em separa es de alta efici ncia alto poder de resolu o e reduzido tempo de an lise Em geral um aparelho de eletroforese capilar b sico consiste de uma fonte de alta tens o capilares geralmente de s lica fundida eletrodos de platina normalmente e um detector apropriado A fonte de alta tens o aplicada nos eletrodos de platina situados nos reservat rios contendo uma solu o eletrol tica apropriada As extremidades do capilar s o imersas nos reservat rios da solu o para completar o contato el trico As amostras normalmente s o introduzidas no capilar por m todos eletrocin ticos nos quais uma diferen a de potencial estabelecida entre o capilar e o recipiente que cont m a amostra durante um tempo pr determinado O detector localiza se em algum ponto do capilar pr ximo ao reservat rio de sa da A eletroforese capilar em gel CGE utilizada exclusivamente para separa o de macromol culas tais como oligonucleot deos fragmentos de DNA e prote nas Teve in cio com a aplica o nas separa es de DNA por tamanho
30. cleot deos trifosfatados ANTPs com quantidades iguais de dATP dCTP dTTP e dGTP 5 DNA molde podendo ser fita simples ou fita dupla 6 Tamp o para manuten o do pH geralmente entre 8 3 e 9 temperatura ambiente 5 1 PROTOCOLO DE AMPLIFICA O DO MICROSSAT LITE BMS1617 1 Retirar o DNA do freezer e deixar temperatura ambiente 2 Lavar as m os e colocar luvas 3 Limpar a bancada com lcool 70 4 Marcar os tubos ou identificar a placa Deve se criar um registro das amostras que ser o amplificadas no caderno de laborat rio 5 Preparar o Mix de PCR Mix de PCR Reagente do de uso Vol Vol estoque 1 amostra _ amostras H20 8 235 uL Tamp o 10X 1X 1 25 uL MgCl gt 20mM 1 5mM 0 94uL dNTP 20mM 0 2mM 0 125uL Primer F 5uM 0 1uM 0 25uL Primer R 5uM 0 1uM 0 25uL Taq 5U uL 1U 0 2uL TOTAL 11 25 uL Sempre verifique se o tamp o cont m ou n o MgCl Caso j contenha n o h necessidade de acrescentar Acrescente o volume correspondente ao MgCl gt no volume de gua Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 16 6 Distribuir 11 25uL do MIX de PCR sem o DNA em cada tubo 7 Adicionar 1 25uL de DNA 40 ng uL em cada tubo 8 Levar ao termociclador 9 Utilizar o programa touch 54 do termociclador ProgramaTouch 54 64 C 30 A cada ciclo a temperatura de anelamento reduzida em 0 5 C at atingir a tem
31. de das mol culas de RNA pode ser analisada em gel de agarose normal feito com tamp o TBE TAE com gua DEPC ou em gel desnaturante Devido a intera es intramoleculares as mol culas de RNA podem dobrar se alterando a estrutura secund ria e afetando a migra o das mol culas no gel O gel desnaturante soluciona este problema pois sob condi es desnaturantes as pontes de hidrog nio s o rompidas e o RNA migra como mol cula de fita simples Isto Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 26 permite avaliar com acur cia a qualidade e o peso molecular do RNA Sambrook 2002 Maseka 2005 Dentre os desnaturantes existentes o mais poderoso al m de caro e altamente t xico o hidr xido de metil merc rio Por m o mais frequentemente utilizado o formalde do mas pode haver variantes de g is utilizando tiocianato de guanidina formamida e DMSO A utiliza o de cada um deles apresenta vantagens e desvantagens de acordo com a escolha do tipo de gel poliacrilamida ou agarose diferentes n veis de toxicidade e potencial de desnatura o Patel 1994 Os g is polimerizados com formalde do n o coram satisfatoriamente as amostras de forma que o brometo de etid o deve ser colocado em cada amostra individualmente e n o no gel como comumente utilizado Regitano 2001 Outro diferencial no gel desnaturante de agarose a utiliza o de MOPS 3 N morfolino cido propanosulf nico O MOPS um e
32. e Almeida Regitano A convers o enzim tica de mRNA para cDNa foi descoberta na d cada de 1970 por Kacia Ross Verma e colaboradores Sambrook 2002 A s ntese da primeira fita de cDNA realizada por uma enzima transcriptase reversa dependente de RNA geralmente isoladas de v rus que usa amostras de RNA mensageiro poli A ou RNA total como molde Atualmente diversas esp cies de transcriptases reversas s o comercialmente utilizadas como Mo MLV ALV e SuperScript RT II manual do usu rio 2003 Para que esta convers o seja feita s o necess rios ANTPs altas concentra es de dNTPs s o importantes para a obten o de boa efici ncia na s ntese do cDNA Em baixas concentra es lt 50 uM h decr scimo significativo na produ o da primeira fita Geralmente s o utilizados cerca de 200 a 250 uM de cada dNTP Maniatis 1987 um oligonucleot deo sendo o mais utilizado o oligo dT pois sintetiza a primeira fita a partir de RNAs de cadeia poli A manual do usu rio 2003 tamp o a presen a deste reagente importante pois a altera o do pH acarreta a diminui o da efici ncia da incorpora o e da produ o de transcritos O pH timo geralmente 8 3 J foi observado que pequenas altera es de pH de at 0 5 resultam em diminui o de at 5X na produ o do cDNA Maniatis 1987 MgCl gt os c tions divalentes s o importantes na transcri o reversa pois auxiliam na produ o de transcrit
33. em solu es com Tris porque o DEPC inativa essa subst ncia EDTA ethylenediamine tetraacetic acid 0 5M pH 8 0 Dissolva 186 1g de NasEDTA 2H gt 0 em 700 mL de gua Ajuste o pH para 8 0 com NaOH 10M cerca de 50 mL Adicione gua MiliQ para 1 L Autoclave Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 62 TE pH 7 6 tamp o Tris EDTA Reagente Concentra o final Tris HCI pH 7 6 10mM EDTA pH 8 0 tmM Volume para uma amostra 510 uL TBE Tris Borate EDTA 10X Tamp o de Eletroforese Solu o Estoque Reagente Quantidade Tris Base 890 mM 108 g Acido b rico 890 mM 55g EDTA 0 5M pH 8 0 20 mM 140 mL gua deionizada Completar para 1L Total 1L SOLU O DE RNase 10mg mL Dissolver a enzima Ribonuclease A livre de DNase Sigma R 6513 em solu o Tris HCI 10mM pH 7 5 NaCl 15mM Armazenar a 20 C SOLU O DE PROTEINASE K 20mg mL Dissolver 100 mg da enzima em 5 mL de solu o Tris HCI 10mM pH 7 5 Cloreto de C lcio 20mM Glicerol 50 Armazenar a 20 C Loading Buffer 6 x Bromophenol Blue 0 25 Xileno Cianol 0 25 Glicerol 30 em gua estocar a 4 C Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 63 Solu o A Tamp o de Hem lise Para 1 amostra 25mL Reagente Concentra o final X 1 amostra Tris Cl pH 7 6 1M 10mM 250 uL MgCl gt 0 5M 5mM 250 uL NaCl
34. enciamento Template Quantity PCR product 100 200 bp 200 500 bp 500 1000 bp 1000 2000 bp 2000 bp Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 36 8 2 PURIFICA O DA REA O DE SEQUENCIAMENTO Ap s a rea o de sequenciamento necess rio purificar o material para que os ddNTPs dNTPs primers e enzima n o incorporados n o interfiram na leitura no sequenciador 1 Adicionar 40uL de isopropanol 65 a temperatura ambiente 2 Vortexar alguns segundos e incubar no escuro a TA por 15 minutos 3 Centrifugar por 25 minutos a 3000 xg a TA 4 Descartar o sobrenadante por invers o e dar um pulso em centr fuga com a placa invertida em um papel absorvente at 40 xg 5 Adicionar 200uL de etanol 60 e centrifugar por 5 minutos a 3000 xg a TA 6 Descartar o sobrenadante por invers o e dar um pulso em centr fuga com a placa invertida em um papel absorvente at 90 xg 7 Secar no escuro por 1 hora 8 Caso a aplica o em sequenciador autom tico n o seja feita imediatamente selar a placa com adesivo embalar em papel alum nio e armazenar em freezer 20 C 8 3 APLICA O EM ABI 3100 1 Ressuspender as amostras com 10uL de formamida Hi Di 2 Desnaturar as amostras em termociclador por 5 minutos a 95 C 3 Verificar a validade e a quantidade do pol mero POP6 e tamp o EDTA 10X O pol mero v lido por cinco dias quando j no equipamento e o tamp o tem validade de 48 horas ou duas p
35. endonucleases de restri o reconhecem uma sequ ncia espec fica de bases em uma mol cula de DNA e clvam a mol cula naquela sequ ncia ou pr ximo dela A sequ ncia de reconhecimento chamada de s tio de restri o Diferentes enzimas de restri o reconhecem e clivam diferentes s tios de restri o Elas s o indispens veis na an lise da estrutura dos cromossomos no sequenciamento de DNA no isolamento de genes na cria o de mol culas novas de DNA que podem ser clonadas e em t cnicas como RFLP Uma caracter stica marcante de muitos desses s tios de clivagem que eles possuem uma dupla simetria rotacional isto a sequ ncia de reconhecimento palindr mica e os s tios de clivagem s o simetricamente posicionados 6 1 DIGEST O DO DNA Tireoglobulina Emix 1X Emix X gua Milli Q 0 5 uL uL BUFFER 10X 1 4 uL uL Mbol 10 U ul 0 1 uL uL Total 2 uL uL Por rea o colocar 2 0 ul Emix de digest o 12ul DNA amplificado produto de PCR Realizar esta rea o em uma placa de PCR ou em microtubos m dios mas sempre sobre o gelinho Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 19 A rea o de digest o ser incubada a 37 C em aparelho Thermomixer 5436 Eppendorff O volume final da rea o ser de 14 uL sendo 12 uL de produto de amplifica o e 2 uL de Emix de digest o Este ltimo consiste de 10 mM TrisHCI pH
36. enominadas sondas e podem ser 1 col nias de bact rias fixadas em membranas contendo os fragmentos de DNA gen mico ou cDNAs 2 DNA ou cDNA isolados 3 produtos de PCR ou 4 oligonucleot deos sint ticos desenhados para ensaiar genes particulares A cole o de sondas imobilizadas no arranjo pode representar genomas completos dos organismos de interesse transcriptomas tecido espec ficos ou qualquer outro conjunto de genes de interesse Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 57 Al m das sondas representando os genes de interesse o arranjo deve ainda incluir espa os aleatoriamente distribu dos para genes refer ncia usados no processo de normaliza o dos dados de express o Estas refer ncias s o tanto controles positivos que correspondem a genes que n o alteram o n vel de express o entre os tratamentos testados tamb m conhecidos como genes constitutivos quanto controles negativos plasm dio vazio e espa os vazios que s o teis para conferir e estabelecer o valor de backgroud usado nos c lculos de express o A escolha destes controles e a distribui o no arranjo cr tica para a qualidade dos dados gerados O n mero de mol culas de DNA que podem ser impressas em um arranjo varia de acordo com a plataforma utilizada e o tipo de sonda a ser impressa sobre ela sendo que os microarranjos de oligonucleot deos sint ticos sintetizados in situ sobre l minas de microsc pio o
37. ente 2 linha Nome de cada efeito fixo covari vel e caracter stica 32 linha C digo para dados perdidos os indiv duos podem ter dados perdidos para as caracter sticas fenot picas mas todos devem ter valores para efeitos fixos e covari veis 4 linha Identifica o do indiv duo mesma do arquivo de gen tipos seguida dos valores de efeitos fixos covari veis e caracter sticas EXEMPLO 211 Sexo Grupo Peso Esp_Toucinho 999 1117 1 167800 19 1118 2 1 75400 24 1119 2 1 69800 29 1124 1 1 64800 18 1125 1 1 65800 19 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 53 Depois dos arquivos organizados conforme os modelos acima seleciona se o delineamento a ser utilizado na an lise Ex F gt Analysis Nesta janela temos acesso aos arquivos atrav s de um browse para cada um dos arquivos gen tipos mapa e fen tipos clicando em seguida no bot o SUBMIT Neste momento os gen tipos s o checados para erros pela compara o dos alelos nos parentais e nas prog nies em fam lias de irm os completos e meio irm os Os erros s o indicados em uma janela Fatal errors para an lise e corre es Se n o forem encontrados erros a an lise avan ar e uma nova janela estar dispon vel indicando o n mero de fam lias de irm os completos e o n mero total da prog nie que ser utilizada na an lise Estar tamb m dispon vel uma tabela indicando o nome e n mero de ma
38. ere o eletr nico jjsgouveia gmail com Gisele Batista Veneroni Bi loga Universidade Federal de S o Carlos Rod Washington Luiz km 235 S o Carlos SP Endere o eletr nico giseleveneroniQ yahoo com br Gustavo Gasparin Bi logo Universidade Federal de S o Carlos Rod Washington Luiz km 235 S o Carlos SP Endere o eletr nico gustavo gasparinODyahoo com br 1 2 3 4 9 NDICE Regras de seguran a no laborat rio 1 Luciana Correia de Almeida Regitano Extra o d DNA osina aa doando poda Nel eRl EUA asian penis 3 Jo o Jos de Simoni Gouveia Luciana Correia de Almeida Regitano Extra o de RNA sos ssastesas sb anais aaa aliada inn caga Sina 9 Adriana M rcia Guaratini Ibelli Luciana Correia de Almeida Regitano Simone Cristina M o Quantifica o em espectrofot metro 12 Luciana Correia de Almeida Regitano Rea o em cadeia da polimerase PCR 14 Adelita Carolina Santiago Gisele Batista Veneroni Luciana Correia de Almeida Regitano Enzimas de restri o 22252 05505202050250520s0a5 canainsorastaoLisCIsHadE 18 Gisele Batista Veneroni Luciana Correia de Almeida Regitano Eletroforese de cidos nucl icos eees 22 Jo o Jos de Simoni Gouveia Luciana Correia de Almeida Regitano DEQUENCIAMENTO ieie siso scoaanana sina ii aanita ninama i
39. etics v 121 p 185 199 1989 MANIATIS T FRISCH E F SAMBROOCK J Molecular cloning a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory 1987 MANIATIS T FRITSCH E F SAMBROCK J Molecular cloning a laboratory manual New York Cold Spring Harbor Laboratory 545 p 2001 Manual do usu rio SuperScript First Strand Synthesis System for RT PCR Cat logo 11904 018 version E Invitrogen 2003 MASEKA T VOPALENSKYA V SUCHOMELOVAB P POSPISEKA M Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels Analytical Biochemistry V 336 p 46 50 2005 MEABURN E BUTCHER L M LIU L FERNANDES C HANSEN V AL CHALABI A PLOMIN R CRAIG SCHALKWYK L C Genotyping DNA pools on microarrays tackling the QTL problem of large samples and large numbers of SNPs BMC Genomics v 6 p 52 2005 OKUBO K HORI N MATOBA R NIIYAMA T FUKUSHIMA A KOJIMA Y MATSUBARA K Large scale cDNA sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression Nature Genet 2 173 179 1992 PATEL D Gel eletrophoresis essential data Wiley 1994 REGITANO L C A Extra o de DNA para aplica o em rea o em cadeia da polimerase PCR In Biologia molecular aplicada produ o animal Embrapa 2001 Roche 1 4 Dithiothreitol Roche Applied Science 2004 ROMANO E BRASILEIRO A C M Extra o de DNA de plantas Biotecnologia Ci ncia e Desenvolvimento p 40 43 1999
40. g DNA polimerase durante a PCR os fluor foros rep rter e silenciador s o separados e a emiss o de fluoresc ncia do rep rter n o ser mais absorvida pelo silenciador resultando em aumento de emiss o de fluoresc ncia pelo rep rter que ser detectada e quantificada Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 43 A primer direto M M TI NINA Ni i IN silenciador rep rter se COL po poi bi Lo AO LO A AA A DODO LOLA DOIA LOLA LAH HA UE primer reverso B rep rter silenciador polimerase A R pm polimerase pas TIN INE T IT ALLA A AA A SALA ARCO EU AHUA Figura 3 Sistema TaqMan A Ap s a desnatura o os primers e a sonda anelam se sequ ncia alvo A emiss o de fluoresc ncia n o ocorre devido proximidade entre o rep rter e o silenciador B Durante a fase de extens o a sonda clivada 5 3 pela atividade nuclease da enzima Tag DNA polimerase Ent o rep rter e silenciador s o separados permitindo a emiss o de fluoresc ncia pelo rep rter Mais recentemente outros sistemas sofisticados t m sido desenvolvidos como por exemplo molecular beacons scorpions e sondas para hibridiza o Esses sistemas s o baseados no princ pio FRET por m sem a necessidade de hidr lise por atividade nuclease Outra forma de detec o a utiliza o de corantes como SYBR Green Figura 4 que se liga ao DNA dupla fita emitindo fluoresc ncia O uso desse m todo
41. i se a temperatura para 50 C durante 15 segundos 3 Extens o Ap s o anelamento do primer ocorre a extens o do fragmento atrav s da inser o dos dNTPs dATP dTTP dCTP dGTP pela Taq DNA Polimerase Como os ddNTPs est o em concentra es muito menores que os dNTPs a sua inser o na cadeia menos frequente Essa etapa ocorre a 60 C durante 4 minutos Quando os ddNTPs s o inseridos no lugar dos dNTPs a extens o p ra Ap s a rea o de sequenciamento os produtos s o submetidos eletroforese capilar no sequenciador autom tico Os fragmentos marcados com fluoresc ncia migram ordenadamente no interior dos capilares e medida que s o excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimentos de onda que s o detectados por uma c mara CCD Em seguida essa informa o transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida os dados possam ser recuperados em formato de eletroferograma ou de texto fasta seguindo se da an lise de bioinform tica Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 34 8 1 PROTOCOLO DE REA O DE SEQUENCIAMENTO Para a realiza o de uma rea o de sequenciamento s o necess rios os seguintes componentes DNA template na concentra o de 100 a 150 ng uL para DNA plasmidial e de 50 a 80 ng uL para produto de PCR Primer oligonucleot deo complementar determinada regi o do fragmento de interessse Ex primer universal M13 R ou F
42. ida Regitano A rea o em cadeia da polimerase nada mais do que a replica o in vitro do DNA Foi desenvolvida na d cada de 1980 por Karry Mullis que conseguiu pela primeira vez amplificar pequenos fragmentos de DNA Em 1988 foi descoberta uma enzima DNA polimerase termoest vel isolada de Thermus aquaticus permitindo que este processo ganhasse automa o Saiki 1988 O impacto deste m todo foi enorme pois possibilitou facilidade rapidez versatilidade na manipula o de cidos nucl icos o que tornou a t cnica poderosa e imprescind vel em grande parte dos procedimentos realizados atualmente utilizada por exemplo na realiza o de sequenciamento como diagn stico de doen as detec o de muta es pontuais entre outros Esta t cnica envolve tr s etapas desnatura o do DNA pelo calor entre 94 95 C anelamento de primers sequ ncia alvo em fita simples atuando de 3 a 5 C abaixo da temperatura de melting 35 a 60 C e uma etapa de extens o do primers anelados por uma DNA polimerase termoest vel 72 a 78 C Alguns componentes s o essenciais para que ocorra a PCR 1 presen a de uma DNA polimerase termoest vel como por exemplo Tag Termus aquaticus a ou Tfl T flavus 2 presen a de um par de primers oligonucleot deos que funcionam como ponto de in cio da polimeriza o 3 c tions divalentes como MgCls Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 15 4 deoxinu
43. l 2000 Mas como todo m todo os arranjos tamb m apresentam algumas limita es A necessidade de conhecimento pr vio da sequ ncia do gene preso plataforma uma delas Por isso arranjos s o constru dos apenas para esp cies que possuem sequ ncias gen micas ou ESTs dispon veis Calsa Junior et al 2004 Outras limita es incluem o alto custo dos equipamentos e a disponibilidade dos arranjos tais como problemas associados com hibridiza o cruzada entre transcritos e sequ ncias alvo causada pela duplica o de genes e a restrita sensibilidade dos arranjos de ESTs para transcritos pouco frequentes pobremente representados nas bibliotecas e normalmente genes regulat rios importantes Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 61 13 PREPARO DAS SOLU ES Tris HCI tris hydroxymethyl aminomethane 1M Dissolva 121g de Tris Base em 800 mL de gua MiliQ Ajuste o pH desejado com HCI concentrado Adicione gua at 1L Autoclave Cerca de 70 mL de HCI s o necess rios para pH de 7 4 e cerca de 42 mL para pH de 8 0 Nota importante O pH dos tamp es com Tris muda significativamente com a temperatura caindo cerca de 0 028 para eleva o de cada 1 C O pH das solu es tamponadas com Tris deve ser ajustado na temperatura na qual as solu es ser o usadas Como o pK do Tris 8 08 o tamp o n o deve ser usado a pH abaixo 7 2 nem acima de 9 0 N o adicione DEPC Diethyl Pyrocarbonate
44. lacas corridas recomend vel a cada 15 dias retirar o capilar desmontar o aparelho e realizar uma limpeza em seus componentes Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 37 4 Enquanto isso montar a planilha de corrida no software Data Collection em Plate View 5 Nesse momento aberta uma nova planilha Sample name 9 Dye Set F Mobility File DT3100POP6 BDV3 V1 mob Bio LIMS 3100Project Run Module 1 StsSegq50 POP6 Default Module Analysis Module 1 BC 3100 SeqOffFtoff saz OK 6 Esfriar a placa em gelo 7 Montar a placa nos acess rios pr prios do sequenciador 8 Colocar a placa no sequenciador verificando na planilha Run View se ela est corretamente instalada 9 Clicar em Status View Verificar voltagem laser e temperatura 10 Caso esteja tudo OK clicar em Run 11 Aguardar para verificar poss veis erros durante o in cio da corrida 12 Ap s 40 minutos poss vel o acompanhamento da corrida pela visualiza o da imagem de cada capilar 13 Ao t rmino da corrida analisar os dados pelo software Sequence Analysis 14 Adicionar a corrida desejada atrav s do Add Files e clicar em Start 15 Aguardar a execu o da tarefa 16 Abrir os eletroferogramas e avaliar os resultados obtidos Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 38 9 S NTESE DE DNA COMPLEMENTAR CDNA Adriana M rcia Guaratini Ibelli Luciana Correia d
45. lf sib s o os mais usados Em cada uma dessas op es s o encontradas instru es sobre os formatos dos arquivos a serem utilizados no programa A seguir descrito o formato dos tr s arquivos gen tipos mapa e fen tipos que devem ser criados para realizar as an lises no QTL EXPRESS utilizando a Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 50 op o F ANALYSIS Todos os arquivos devem ser tipo texto onde os dados s o separados por espa os ou tabula o ARQUIVO DE GEN TIPOS 1 linha N mero de marcadores 2 linha Lista dos nomes dos marcadores qualquer caracter alfanum rico 3 linha Nome dado a cada gera o nome das linhagens parentais F e F3 4 linha Indica o de sexo 1 macho e 2 f mea ou M macho e F f mea 5 linha S mbolo que representa dados perdidos ou ou 0 6 linha Dados de cada indiv duo na seguinte ordem 1 Identifica o do indiv duo qualquer caracter alfanum rico 2 Identifica o do pai no caso dos parentais onde a identifica o do pai desconhecida utilizar ou ou 0 3 Identifica o da m e igual do pai 4 Sexo de acordo com o definido na linha 4 5 Linhagem ou gera o como definido na linha 3 6 Gen tipos dos marcadores cada dois valores correspondem aos alelos de um marcador os gen tipos devem estar na mesma ordem da lista dos marcadores linha 2 Este arquivo pode ser obtido reformatando
46. molecular utilizando colunas preenchidas com gel denominados g is qu micos um capilar tratado com um reagente que estabiliza o gel junto parede do capilar atrav s de liga es covalentes Esse m todo foi descartado dado o grande n mero de problemas que surgiram tais como aparecimento de bolhas perda de condutividade introdu o limitada de amostra reten o de fragmentos com alto peso molecular e degrada o do gel por hidr lise Tais problemas levaram formula o de novos sistemas que foram denominados g is f sicos G is f sicos s o matrizes polim ricas hidrof licas dissolvidas em tamp o apropriado que n o s o ligados parede do capilar podendo assim ser substitu dos Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 30 a cada separa o o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por centenas de vezes sem perda de efici ncia A uma dada concentra o de pol mero as fitas polim ricas individuais come am a interagir umas com as outras formando uma estrutura em rede dentro do capilar possibilitando a separa o dos fragmentos de DNA A concentra o polim rica tima depende do tamanho do DNA a ser separado 7 4 PROTOCOLO PARA AN LISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICA O EM SISTEMA CAPILAR Antes da inje o no capilar as amostras s o desnaturadas em presen a de formamida para evitar que a forma o de estruturas secund rias afete a velocidade de migra o Um pad
47. ndai Raa Tai 31 Kerli Ninov Lilian Giotto Zaros S ntese de DNA complementar CDNA 38 Adriana M rcia Guaratini Ibelli Luciana Correia de Almeida Regitano 10 PCR quantitativo em tempo real ossss 42 Helena Javiel Alves 11 Mapeamento de QTLs QTL Express eee 49 Millor Fernandes do Ros rio K tia Nones 12 Arranjos de DNA ssssisasimasscsosossmascaasdocoicacasdnadassconailissanemando 55 Erika Cristina Jorge Luiz Lehman Coutinho 13 Preparo de Solu es risiini naanin aaan nia a aani 61 Refer ncias nannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nnmnnn nnna 64 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 1 1 REGRAS DE SEGURAN A EM LABORAT RIOS Luciana Correia de Almeida Regitano Seguran a a prioridade n mero um em qualquer laborat rio qu mico importante conhecer sempre o laborat rio como um ambiente global de trabalho experimental J no in cio deve se familiarizar com todo equipamento de seguran a dispon vel no laborat rio sabendo onde encontr lo e como utiliz lo lava olhos chuveiro de emerg ncia extintores sa das de emerg ncia Muitas regras de seguran a envolvem apenas bom senso n o tocar em itens quentes n o comer nem beber no laborat rio n o fumar dentro do laborat rio n o fazer brincadeiras O uso de Equipamentos de Prote o Indi
48. o com o objetivo de padronizar os componentes da rea o que ser o distribu das para cada amostra O mix consta de 100 uL de tamp o de rea o 10X tamp o da enzima Taq DNA polimerase 2 uL de Sybr Green 10X concentrado 73 uL de gua ultra pura 25 uL de DMSO Manter a solu o contendo Sybr Green ao abrigo da luz 2 Preparo do mix de PCR em tempo real Reagente Volume Concentra o Vol 1 rea o uL final amostras dNTP 10 mM 0 4 0 2 mM Primer F 2 5 pmol uL 1 0 0 125 pmol uL Primer R 2 5 pmol uL 1 0 0 125 pmol uL MgCl 50 mM 1 0 2 5 mM Tag 5U uL 0 3 1 5U Sybr Green mix 4 0 BSA 20 mg 0 25 0 25 ug rea o gua 11 05 Volume final 19 3 Colocar 19 uL do mix de PCR em cada pocinho da placa 4 Colocar 1 uL do cDNA 25 ng uL de cada amostra no respectivo pocinho da placa Homogeneizar bem a mistura amostra mix 5 Dar um pulso cuidadosamente por centrifuga o a 3000 rpm 6 Colocar a placa no aparelho de PCR em tempo real 7 Escolher o programa de amplifica o do gene de interesse Para o gene MCP 1 utiliza se o seguinte programa Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 48 gt Pr incuba o 95 C por 5 minutos gt Amplifica o 95 C por 10 segundos 56 C por 5 segundos 55 ciclos de 72 C por 12 segundos 78 C por 3 segundos gt Curva de melting 95 C por O min 68 C p
49. o restos de membrana prote nas RNA Romano 1999 O rompimento das membranas celulares geralmente feito com detergentes SDS ou CTAB A utiliza o de agentes caotr picos como o tiocianato de guanidina Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 4 impede o DNA de se ligar nas outras mol culas facilitando sua separa o na segunda fase do processo Ap s esta fase deve se separar o DNA dos outros componentes celulares Isto feito por meio da adi o de subst ncias que fa am com que a solu o torne se heterog nea e que o DNA fique dissolvido em apenas uma das fases como por exemplo quando se utiliza fenol para desnaturar as prote nas ficando o DNA na fase aquosa e as prote nas na interface entre as fases org nica e aquosa Uma alternativa utiliza o dos solventes org nicos como o fenol fazer a separa o das prote nas utilizando altas concentra es de sal salting out Ap s separar o DNA dos outros componentes celulares pode se proceder uma precipita o do DNA para garantir a m xima pureza do material esta precipita o geralmente faz se utilizando lcool etanol ou isopropanol que em presen a de c tions monovalentes promove uma transi o estrutural na mol cula de cido nucl ico resultando em agrega o e precipita o Regitano 2001 Azevedo 2008 http Awww etall hpg ig com br cursoper html Os protocolos abordados neste cap tulo s o utilizados na rotin
50. o arquivo gen do CRIMAP ou criado atrav s do EXCEL Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 51 EXEMPLO 14 MK1 MK2 MK3 MK4 MK5 MK6 MK7 MK8 MK9 MK1O MK11 MK12 MK13 MK14 LW MS F1 F2 12 0 1039 152915301F14147121252112542121324631252 1040 152915302 F14147121272112525121324134200 ARQUIVO DO MAPA DE LIGA O 1 linha N mero de cromossomos 2 linha Intervalo para c lculo das probabilidades genot picas e coeficientes em cM 3 linha Nome do primeiro cromossomo n mero de marcadores deste cromossomo determinar se o mapa ser constru do para os dois sexos 1 ou n o 2 4 linha Para o primeiro cromossomo ou grupo de liga o indicar os nomes dos marcadores em ordem separados pelas dist ncias entre eles em cM Os nomes dos marcadores devem ser os mesmos utilizados no arquivo de gen tipos Se for feita a op o pela utiliza o do mesmo mapa para os dois sexos esta linha aparece apenas uma vez se os dois sexos tiverem mapas separados esta linha aparece duas vezes com diferentes dist ncias Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 52 Repetir as linhas 3 e 4 para cada cromossomo EXEMPLO 2 1 SSC1 7 1 MK2 42 MK1 28 MK7 8 MK10 28 MK3 3 MK4 22 MK5 SSC7 7 1 MK6 35 MK8 25 MK9 17 MK11 22 MK12 25 MK13 21 MK14 ARQUIVO DE FEN TIPOS 12 linha N mero de efeitos fixos covari veis e caracter sticas respectivam
51. o do significado biol gico dentro de um enorme volume de dados pode n o ser uma tarefa direta A interpreta o dos dados varia desde uma lista de genes que s o induzidos e reprimidos em fun o do tratamento at an lises de agrupamentos sofisticadas como por agrupamento Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 60 hier rquico ou por sefl organizing maps SOM O agrupamento hier rquico tem sido tradicionalmente utilizado em an lises filogen ticas e usa uma combina o progressiva de elementos mais similares para agrupar os genes por padr o de express o Os sefl organizing maps amostram o conjunto completo dos dados para determinar as dist ncias entre eles e escolhe aleatoriamente pontos chamados centr ides a partir dos quais os genes s o organizados Harrington et al 2000 12 3 VANTAGENS E LIMITA ES DO M TODO Os arranjos fornecem um acesso ilimitado ao perfil de express o dos genes caracter sticos de um tecido ou de um organismo porque os genes as ORFs open reading frames e at mesmo regi es interg nicas podem estar representadas na plataforma As informa es geradas por diversos experimentos podem ainda ser integradas e utilizadas para a determina o de fun es biol gicas dos genes desconhecidos para gerar uma vis o global da atividade transcricional de um genoma em resposta a qualquer est mulo ou para compreender os mecanismos que controlam o desenvolvimento Harrington et a
52. or 15 min 95 C por O min gt Resfriamento 40 C por 30 s Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 49 11 MAPEAMENTO DE QTLs QTL EXPRESS Millor Fernandes do Ros rio K tia Nones O QTL EXPRESS Seaton 2002 o programa mais utilizado para mapear QTLs em popula es parcialmente endog micas como nas esp cies de animais dom sticos Este programa pode ser acessado atrav s de http gtl cap ed ac uk Ele implementa o mapeamento por intervalo Lander e Botstein 1989 atrav s da aproxima o de quadrados m nimos Haley et al 1994 realizando uma varredura dos intervalos entre dois locos adjacentes testando a hip tese inicial de que n o h QTL no intervalo considerado O programa considera que h fixa o dos alelos contrastantes do poss vel QTL nas linhagens fundadoras da popula o utilizada para mapear os QTLs Operacionalmente a primeira linhagem parental relacionada no arquivo de gen tipos considerada como fixada para o alelo QTL Q e a segunda fixada para q Tamb m se baseia na estima o das probabilidades de identidade por descend ncia IBD dos alelos em cada loco considerando um conjunto de dados multilocos al m de testar um modelo estat stico podendo incluir efeitos fixos e covari veis para as observa es fen tipos e os coeficientes IBD O programa possui diferentes op es de an lises de acordo com o delineamento utilizado na popula o a ser estudada F e ha
53. os completos em concentra es de 6 a 10 mM Quando fragmentos muito longos ser o transcritos podem ser utilizados c tions Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 39 monovalentes dentre eles o mais indicado o pot ssio que auxiliam na manuten o da efici ncia da transcri o RNAse OUTO Invitrogen degrada RNAses presentes durante a s ntese do cDNA Manual do usu rio 2003 DTT ou ditiotreitol um agente redutor que tem como principal fun o proteger oxida o de enzimas e prote nas Roche 2004 RNAse H utilizada no final da rea o para remover h bridos RNA cDNA com a fun o de aumentar a sensibilidade e a efici ncia do PCR A presen a de RNAse H durante a s ntese do cDNA degrada o mRNA causando um d ficit na produ o desta mol cula Por isso foram desenvolvidas transcriptases reversas que apresentam atividade reduzida de RNAse H durante a produ o da primeira fita e que s o adicionadas apenas no final da rea o para remo o de mol culas h bridas Manual do usu rio 2003 importante considerar que para que este procedimento tenha sucesso o RNA das amostras deve ser intacto e sua quantifica o precisa para evitar varia es na utiliza o deste molde em t cnicas futuras como por exemplo em arranjos de DNA ou PCR quantitativo Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 40 9 1 PROTOCOLO DE S NTESE DE CDNA 1 Descongela
54. peratura ideal do primer O BMS1617 um marcador molecular do tipo microssat lite de repeti o tg localizado a cerca de 56 3 cM no cromossomo cinco em bovinos Seus alelos apresentam tamanho entre 143 e 171 bp Resultados Animal Gen tipo Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 17 5 2 PROTOCOLO DE AMPLIFICA O DO GENE DA TIREOGLOBULINA 1 Retirar o DNA do freezer 2 Lavar as m os e colocar luvas novas 3 Limpar a bancada 4 Tirar o DNA o gelinho e reagentes menos a Tag do freezer 5 Marcar os tubos ou identificar a placa 6 Preparar o Emix 1X X H20 Milli Q 15 54 uL uL 10x PCR Buffer 2 5 uL uL MgCl 20mM 2 44 uL uL dNTP 20mM 0 25 uL uL Pr up 5 uM 0 82 uL uL Pr down 5 uM 0 82 uL uL Taq 5u ul 0 13 uL uL 6 Distribuir 22 5uL do Emix tubo ou po o se for placa de PCR sempre sobre um gelinho 7 Distribuir 2 5uL DNA tubo ou po o se for placa de PCR 8 Colocar as amostras em um termociclador escolher o programa correto para amplifica o Programa RFLP55 Programa RFLP55 94 0 94 0 72 0 72 0 X 307 E 55 0 gt 307 10 4 0 30 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 18 6 ENZIMAS DE RESTRI O Gisele Batista Veneroni Luciana Correia de Almeida Regitano As enzimas de restri o tamb m chamadas de
55. pondentes que representam o n vel relativo de express o dos transcritos detectados Estas listas podem ser extremamente complexas uma vez que os arranjos apresentam uma alta densidade de genes e para cada um deles os experimentos geram informa es quantitativas referentes express o em tratamentos diferentes a an lise de dois tratamentos com tr s repeti es em um arranjo contendo 5 000 clones por exemplo permite gerar uma matriz com 30 000 entradas O enorme volume de dados torna imperativo o uso de programas computacionais para administrar e maximizar a quantidade de informa es extra das Harrington e colaboradores 2000 definiram os passos necess rios para uma an lise eficiente dos dados de arranjos gerados ap s a obten o da imagem processada 1 normaliza o dos dados 2 filtragem dos dados e 3 identifica o do padr o A normaliza o necess ria para permitir a compara o direta do padr o de express o e deve ser efetuada tanto entre amostras no mesmo arranjo quanto para o conjuntos de experimentos A filtragem importante para restringir o volume de dados Por exemplo comum considerar apenas os genes expressos acima de um determinado valor estipulado pelo experimentador desconsiderando aqueles que n o apresentarem varia o do n vel de express o entre os tratamentos O ltimo passo talvez seja o mais complexo Encontrar o padr o ou os grupos de dados que podem ser usados para a determina
56. r o de tamanhos conhecidos aplicado junto com as amostras para permitir a estimativa do tamanho dos fragmentos analisados Procedimento 1 Preparar o MIX de formamida padr o interno de tamanho de fragmentos para cada amostra colocar 8 85 uL de formamida Hi Di e 0 15 uL de padr o GS 500 ROX 2 Aplicar esses 9 uL de MIX em um pocinho da placa de corrida 3 Aplicar 1 uL de produto de PCR da sua amostra por pocinho 4 Desnaturar as amostras j na placa de corrida durante 5 minutos 95 C 5 Colocar as amostras imediatamente no gelo ap s a desnatura o permanecendo por 5 minutos 6 Preparar a inje o das amostras no computador atrav s do software Data Collection Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 31 8 SEQUENCIAMENTO Kerli Ninov Lilian Giotto Zaros As duas t cnicas mais importantes para o sequenciamento de DNA s o o m todo qu mico de degrada o de bases desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert em 1977 e o m todo didesoxi ou termina o da cadeia de Fred Sanger e colaboradores em 1978 Os dois m todos s o baseados na produ o de um conjunto de fitas simples de DNA que s o separadas pelo princ pio de eletroforese Okubo 1992 Se comparado ao sequenciamento de Maxam e Gilbert o m todo de termina o da cadeia de Sanger gera dados que s o mais facilmente interpretados Por isso essa tem sido a t cnica mais utilizada em Projetos Genoma Sterky amp Lundeberg
57. r e homogeneizar brevemente cada componente abaixo Preparar o mix RNA primer Componente Para uma amostra At 5 ug de RNA total M ximo de 8 uL 10 mM dNTP mix 1uL Oligo dT 0 5 ug uL 1 uL gua DEPC do kit Completar para 10 uL o volume deste mix deve ser 10 uL Assim o volume m ximo de RNA a ser utilizado 8 uL contendo de 1 ng a 5 ug de RNA total Se for utilizado 8 uL a gua DEPC do kit n o adicionada ao mix 2 Incubar a 65 C por 5 minutos 3 Esfriar em gelo por 1 minuto 4 Preparar o mix de rea o adicionando cada componente a partir da primeira linha da tabela Este mix pode ser preparado em um tubo separado junto com a prepara o do mix anterior Se isso for feito mant lo sempre em gelo Componente Para uma amostra Buffer RT 10 X 2 uL MgCl2 25 mM 4 uL 0 1 M DTT 2 uL RNAse out 1 uL Total 9 uL 5 Adicionar os 9 uL do mix acima em cada tubo contendo o RNA primer Dar um spin 6 Incubar a 42 C por 2 minutos 7 Adicionar 1 uL 50 U da enzima SuperScript RTII em cada tubo Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 41 obs Os tubos n o podem ser colocados em gelo para adi o da enzima RTII A temperatura deve continuar de 42 C 8 Incubar a 42 C por 50 minutos 9 Terminar a rea o a 70 C por 15 minutos 10 Esfriar no gelo e dar um spin 11 Adicionar 1 uL de RNAse H e incubar por 20
58. rcadores suas dist ncias e o n mero de alelos observados em cada marcador Para continuar o procedimento de an lise deve ser clicado o bot o CONTINUE uma nova janela aparecer Nesta nova janela temos v rios campos para a escolha dos par metros e dos modelos a serem utilizados na an lise juntamente com as caracter sticas que se deseja analisar Depois de escolhidos todos os par metros clicar no bot o SUBMIT Uma nova janela se abrir apresentando o resultado do mapeamento por intervalos em cM da an lise estat stica F raz o de verossimilhan a e LOD e estimativas do efeito aditivo e de domin ncia al m dos gr ficos do mapeamento por intervalo dos efeitos de aditividade e domin ncia e das permuta es Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 54 As permuta es s o implementadas de acordo com a metodologia proposta por Churchill e Doerge 1994 e t m por objetivo determinar os n veis de signific ncia ou threshold no cromossomo ou no genoma O QTL EXPRESS tamb m permite que os intervalos de confian a de cada QTL mapeado sejam estimados de acordo com a proposta de Visscher et al 1996 por meio do procedimento de bootstrap com reamostragem Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 55 12 ARRANJOS DE DNA Erika Cristina Jorge Luiz Lehmann Coutinho O sequenciamento de etiquetas de sequ ncias expressas do ingl s Expressed Sequence Tags ESTs
59. s que comportam uma maior densidade A Affymetrix www affymetrix com umas das empresas que fabricam microarranjos comercialmente garante a s ntese de DNA chips contendo at 500 000 oligos em uma nica l mina J os arranjos de membranas suportam no m ximo 9 200 clones impressos 12 1 O M TODO O princ pio deste m todo baseia se na hibridiza o de cidos nucl icos que bastante sens vel e espec fica em consequ ncia das propriedades de complementaridade entre fitas de cidos nucl icos Duggan et al 1999 A amostra biol gica de interesse fornece a popula o de RNAs mensageiro RNAm que se pretende quantificar aqui denominada alvo A cin tica de hibridiza o linear e a quantidade de alvo hibridizado em cada sonda proporcional abund ncia de Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 58 RNAm do alvo e portanto correspondente ao n vel de express o do gene na c lula ou no tecido do qual o alvo foi obtido Tipicamente a transcri o reversa usada para obter os alvos a partir de um oligo dT e na presen a de nucleot deos modificados produzindo produtos marcados na extremidade 3 de cada gene diretamente complementar s sondas imobilizadas no arranjo Frequentemente pools de RNA total s o marcados para maximizar a quantidade de mensagem que pode ser obtida de uma dada quantidade de tecido A pureza do RNA um fator cr tico na performance da hibridiza o uma
60. sa ser determinada lendo se ao longo das 4 colunas do gel www dnai org e Sequenciamento Autom tico O sequenciamento autom tico utiliza sequenciadores com eletroforese vertical em placa ou eletroforese em capilar onde cada ddNTP possui marca o fluorescente ao contr rio do m todo manual em que estes apresentam uma mesma marca o radioativa Para a gera o de fragmentos durante a rea o de sequenciamento os dNTPs s o adicionados nova fita e no momento da adi o de um ddNTP a extens o da cadeia interrompida e consequentemente marcada com o ltimo didesoxinucleot deo incorporado No final de v rios ciclos tem se v rias cadeias de DNA de diferentes tamanhos terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente ser o identificados lidos em sequenciador autom tico Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 33 A rea o de sequenciamento ocorre em termociclador e caracterizada por v rias etapas ou ciclos em diferentes temperaturas repetidos por v rias vezes por um determinado per odo de tempo Suas etapas s o 1 Desnatura o a primeira etapa da rea o de sequenciamento na qual a mol cula de DNA separada em fita simples Para ocorrer a desnatura o eleva se a temperatura a 96 C durante 2 minutos 2 Anelamento Caracterizada pela utiliza o de um nico primer que ir se anelar fita de DNA na regi o complementar sua sequ ncia Para ocorrer o anelamento diminu
61. sco e retornar ao forno de microondas por mais alguns segundos Aguardar a redu o da temperatura para aproximadamente 60 C e adicionar Brometo de Et dio na quantidade indicada para cada gel Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes Ap s a solidifica o colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tamp o TBE 1X Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 25 7 Aplicar as amostras acrescidas de loading buffer e aplicar a corrente de acordo com o tamanho do gel A eletroforese deve ser realizada em TBE 1X a uma voltagem constante na faixa de 2 a 5 V cm considerando a dist ncia entre os eletrodos Ap s a corrida submergir o gel por 20 minutos em solu o de brometo de et dio a 0 5 ug mL e visualiz lo sob luz ultra violeta Caso o fundo do gel esteja muito corado pode se lavar o excesso de brometo por submers o em TBE 1X por 5 a 10 minutos w O Brometo de et dio um potente agente mutag nico Utilizar luvas e m scara para preparar a solu o estoque e manipular os g is w A luz ultra violeta produz queimaduras severas Utilize m scara culos de prote o adequados 7 2 GEL DESNATURANTE PARA RNA Adriana M rcia Guaratini Ibelli Para analisar mol culas de RNA podem ser utilizados g is de agarose e poliacrilamida desnaturantes ou n o As propriedades desta eletroforese s o basicamente semelhantes s de eletroforese de DNA Patel 1994 A qualida
62. uantidade de ribonucleases RNAses est veis e ativas nos tecidos que permitem que o RNA altamente inst vel seja rapidamente degradado Desta maneira a primeira etapa em todos os m todos de isolamento de RNA ap s a pulveriza o dos tecidos a exposi o deste material a tamp es de extra o Estes apresentam subst ncias como o cloreto de l tio que auxilia a precipita o do RNA e isotiocianato de guanidina que permite a manuten o do RNA intacto nas etapas posteriores da extra o atrav s da degrada o das ribonucleases end genas Sambrook 2002 Atualmente h v rios reagentes comerciais como por exemplo Trizol Invitrogen e Brazol Lab Trade do Brasil que possuem em sua composi o reagentes combinados como isotiocianato de guanidina e fenol possibilitando uma extra o de RNA mais r pida que a dos protocolos convencionais e garantindo a integridade do material Sambrook 2002 Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 10 necess ria ainda a adi o de clorof rmio ao tamp o contendo RNA que solubiliza os lip dios permitindo a sua remo o Ap s a centrifuga o tr s fases poder o ser observadas uma r sea formada pela presen a do fenol uma interfase formada pelo clorof rmio e DNA e uma fase aquosa onde estar presente o RNA A precipita o do RNA feita com um lcool como por exemplo o isopropanol Nesta etapa observa se uma nuvem branca contendo o RNA
63. vidual EPI s obrigat rio assim como o uso de capela de exaust o em caso de solventes Manter vidrarias sempre em condi es adequadas de trabalho Manter as solu es sempre identificadas e com os cuidados a serem tomados em caso de acidentes Manter os frascos de reagentes sempre limpos sem respingos para manter uma boa condi o de uso dos t cnicos e estagi rios Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 2 Usar sempre culos de seguran a e avental de prefer ncias de algod o e mangas longas N o use saias bermudas ou cal ados abertos Pessoas de cabelos longos mant los sempre preso N o trabalhe sozinho principalmente fora do hor rio de expediente Lave bem as m os ao deixar o laborat rio Ao executar qualquer experimento esteja consciente de como proceder e os cuidados Leia atentamente o protocolo at o fim verificando se compreendeu todos os procedimentos e se possui todo o material necess rio Nunca brinque no laborat rio Certifique se da tens o de trabalho da aparelhagem antes de conect lo rede el trica Quando n o estiverem em uso os aparelhos devem ficar desconectados N o use nenhum equipamento para o qual n o tenha sido autorizado ou treinado a utilizar Respeite seus amigos de trabalho n o os distraindo com conversas paralelas Caso perceba algo diferente ou mesmo anormal recorra ao t cnico respons vel para tirar suas d vidas Protocolos de
64. xcelente tamp o para manuten o de sistemas biol gicos em pH neutro muito utilizado em biologia molecular e bioqu mica 1 2 3 4 28S ea 18S P 4 5S Figura 2 Exemplo de separa o eletrofor tica Nos n meros 1 a 3 s o mostradas as bandas 28S 18S e 5S do RNA indicando integridade das amostras O n mero 4 exemplifica uma amostra de RNA degradada Protocolos de Biologia Molecular Aplicadas Produ o Animal 27 7 2 PROTOCOLO DE GEL DESNATURANTE DE AGAROSE 1 COM FORMALDE DO adaptado de L cia Elvira Alvares 2001 Quantidade 0 39 6 0 mL Formalde do 2 2M 5 4 mL Agua DEPC 18 6 mL Total 30 mL verificar se o pH do formalde do superior a 4 A vidraria utilizada para a prepara o do gel assim como a cuba de eletroforese devem estar previamente tratadas contra a o de RNAses Todas as solu es empregadas devem ser feitas com gua DEPC Tamp o de corrida 5X Reagente Quantidade MOPS 100 mM 20 69 Acetato de s dio 0 05 M 40 mM 800 mL EDTA 0 5 M pH 8 0 5 mM 10 mL 1 Pesaro MOPS 2 Dissolv lo em acetato de s dio 0 05 M Ajustar o pH para 7 0 com NaOH 2N e completar o volume para um litro de gua DEPC 3 Adicionar o EDTA 0 5 M pH 8 0 Guardar protegido da luz 4 Diluir este tamp o para concentra o final de 1X com gua DEPC Tamp o da Amostra Reagente Quantidade Tamp o de Corrida 5X 300 uL Formamida 50 75

Protocolos de Biologia MoLecuLar aplicada à Produção Animal

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Protocolos de Biologia MoLecuLar aplicada &agrave; Produ&ccedil;&atilde;o Animal

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Protocolos de Biologia MoLecuLar aplicada à Produção Animal