Kit SPOT-Light HER2 CISH - Thermo Fisher Scientific
Contents
1. Numero di catalogo Numero di lotto Limiti della temperatura Produttore Contiene materiale sufficiente per lt n gt test Rappresentante autorizzato per l UE Utilizzare entro Diagnostica in vitro Chi Consultare le istruzioni per l uso gt E RE Consultare la documentazione allegata per IVDD 98 79 CE Invitrogen Ltd Inchinnan Business Park 3 Fountain Drive Paisley PA4 9RF Regno Unito Copyright Invitrogen Corporation 16 luglio 2008 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 26 di 26 Appendice A Guida all interpretazione del test HER2 CISH Amplificazione del gene HER2 a res wo en ya Mi te Amplificazione r e sity ds A eu Amplificazione elevata gt 10 punti oppure grandi cluster oppure uS W di P nr e insieme di punti multipli e grandi cluster del gene HER2 presenti la M E te Ris A A per nucleo oltre il 50 di cellule tumorali Vedere Figure A B e i s L3 v da j OI 1 wi C v LI j iM a A Grandi cluster B Punti multipli gt 10 punti grandi cluster sono gruppi di segnali di forma irregolare che hanno un diametro superiore a 5 volte il diametro di un singolo punto Come riferimento va utilizzato un singolo punto presente s 4 E nelle cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino Wii Vedere Figura A l kd 4 f Y 6 G Vy V Amplificazione bassa 5 punti fino a 10 punti oppure piccoli2. C in camera di umidificazione Lavare in PBS Tween 20 0 0196 3 volte 2 minuti per volta Durante il lavaggio preparare la soluzione substrato cromogeno DAB e aggiungere una goccia di ciascun reagente reagenti I1 I2 13 a 1 ml di dH O Aggiungere la soluzione substrato cromogeno DAB 2 3 gocce per vetrino o una quantit sufficiente per coprire il tessuto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente 15 30 C in camera di umidificazione Posizionare i vetrini nell apposito supporto Risciacquare in acqua corrente per 2 minuti 11 Colorazione di contrasto e montaggio del vetrino Nota eseguire una breve colorazione di contrasto per 3 5 secondi ed esaminare il tessuto al microscopio senza 1l vetrino coprioggetto Eseguire la colorazione di contrasto per altri 3 5 secondi se si desidera una colorazione dei nuclei pi intensa Il tempo della colorazione di contrasto dipende dal tipo di tessuto utilizzato S1 sconsiglia una colorazione di contrasto troppo scura in quanto potrebbe mascherare 1 segnali di colorazione positivi a b c d Eseguire la colorazione di contrasto del tessuto con ematossilina reagente J per 3 5 secondi Risciacquare in acqua corrente per 2 minuti Disidratare in una serie graduata di EtOH per 2 minuti in ciascun grado 70 85 95 100 100 conservata dal Giorno 1 e utilizzata nello stesso ordine Immergere in xilene 2 volte 2 minuti per volta Il lavaggio di xilene deve essere diverso
3. invitrogen Kit SPOT Light HER2 CISH N cat 84 0150 V 20 test con vetrini coprioggetto da 24 x 30 mm Uso previsto Per uso diagnostico in vitro Il kit SPOT Light HER2 CISH destinato alla determinazione quantitativa dell amplificazione del gene HER2 in sezioni di tessuto mammario neoplastico incluse in paraffina e fissate in formalina FFPE tramite l utilizzo dell ibridazione in situ cromogenica CISH e la microscopia in campo chiaro Il test deve essere eseguito in un laboratorio di istopatologia Il kit SPOT Light HER2 CISH indicato come ausilio nella valutazione di pazienti candidate a un eventuale trattamento con Herceptin trastuzumab I risultati del dosaggio servono come informazioni aggiuntive ai dati clinicopatologici attualmente in uso come parte della gestione di pazienti con carcinoma mammario L interpretazione dei risultati del test deve essere effettuata da un patologo qualificato nel contesto anamnestico della paziente Sommario e spiegazione Il gene umano HER2 o c erbB 2 e il gene equivalente nel ratto neu sono stati identificati come proto oncogeni che condividono un omologia con l oncogene strettamente correlato v erbB Il gene HER2 situato sul cromosoma 17 17q11 2 21 e codifica per una proteina di membrana simil recettoriale di 185 kDa La proteina HER2 possiede attivit di tirosina chinasi e condivide un omologia con il recettore del fattore di crescita epidermica noto come EGFr
4. 96 8 Concordanza negativi 46 46 100 0 IC al 95 92 3 100 0 Totale percentuale concordanza 6 46 54 96 3 IC al 95 87 3 99 6 Tabella 6 concordanza tra CISH e FISH sui casi IHC 2 nel centro B dello studio Risultati CISH Risultati FISH Amplificati Non amplificati Amplificati Non amplificati mae ra 4 casi con risultati assenti o non validi Concordanza positivi 79 77 8 IC al 95 40 0 97 2 Concordanza negativi 45 47 95 7 IC al 95 85 5 99 5 Totale percentuale concordanza 7 45 56 92 994 IC al 95 82 7 98 0 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 16 di 26 Tabella 7 casi IHC 2 discordanti tra CISH e FISH HER2 CISH pos FISH neg HER2 CISH neg FISH pos Numero IHC Numero del caso del caso Centro A 2 3 7094 ENNMNNMMMHBPnn35Yt 2 77 005 00 2 48 0 50 5 00 173 sz0 07700 2 34 0 50800 Centro B 4 7 1496 5 171 5 20 2 00 8 00 1 08 0 50 2 00 S 156 5 00 1 00 9 00 2 23 1 00 5 00 S 178 20 00 20 00 20 00 1 25 0 50 2 00 9 9 183 4 13 3 00 6 00 2 73 1 00 6 00 numero di casi discordanti diviso per il numero totale di casi con FISH e CISH validi del centro corrispondente x 100 C Casi HercepTest 2 Tutti i casi consecutivi e supplementari sono stati testati con HercepTest I casi con punteggio HercepTest 2 sono stati uniti e testati in entrambi i centri dello studio I risultati di ciascun centro de
5. S a Remp E E S AE E r Centro A Centro B Centro A Centro B Centro A Centro B Bk dun 205 54 56 34 4l 48 22 campioni 0 B M oa 75 0 77 8 42 9 80 0 85 7 100 0 positivi 0 ZE 1000 100 0 95 7 100 0 97 2 100 0 90 0 negativi 0 SENIO 99 0 96 3 92 9 88 2 95 1 95 8 95 5 Sensibilit analitica La sensibilit del kit SPOT Light HER2 CISH stata testata utilizzando sezioni di tessuto mammario neoplastico FFPE con stato del gene HER2 con e senza amplificazione oltre a linee cellulari FFPE utilizzate nei vetrini di controllo Il gene HER2 stato identificato come punto singolo nella sezione di tessuto e nei blocchi di cellule con gene HER2 normale Ogni campione con o senza amplificazione ha dimostrato un intensit di colorazione 3 e una buona morfologia tissutale Efficacia dell ibridazione L efficacia dell ibridazione stata determinata esaminando 2 campioni di tessuto 1 con amplificazione 1 senza amplificazione 10 sezioni ciascuno e 4 campioni di linee cellulari 2 con amplificazione 2 senza amplificazione In ogni campione stato analizzato il numero di cellule con segnale HER2 in confronto al numero totale di cellule analizzate 100 300 cellule L efficacia dell ibridazione risultata essere del 94 7 100 Per la colorazione CISH di 226 campioni clinici provenienti da 3 laboratori la percentuale di errore per ogni sede stata rispettivamente di 8 4
6. Se la media di 4 6 punti contare i punti in altre 30 cellule per un totale di 60 cellule e registrare i risultati nella Cartella 2 Se la media 4 o gt 6 non necessario contare altre 30 cellule e il campione pu essere registrato come amplificato o non amplificato Punteggio CISH Linee guida Invitrogen per il punteggio HER2 CISH Assenza di amplificazione 1 5 segnali nucleo nelle cellule tumorali Amplificazione gt 5 segnali nucleo o cluster di segnali amplificati nucleo in oltre il 50 di cellule tumorali Risultato Assenza di amplificazione lt 5 Amplificazione gt 5 Data e firma del tecnico Data e firma del medico patologo invitrogen Cartella 2 risultati CISH Se necessario inserire il numero di punti presenti nel secondo gruppo di 30 cellule N cellula Punti o cluster HER2 N cellula Punti o cluster HER2 N cellula Punti o cluster HER2 1 1 21 2 2 22 3 3 23 4 4 24 5 5 25 6 6 26 7 7 27 8 8 28 9 9 29 e N e 30 Totale dei punti nelle cellule 31 60 Totale dei punti nelle cellule 1 30 Media dei punti in 60 cellule Punteggio CISH Linee guida Invitrogen per il punteggio HER2 CISH Assenza di amplificazione 1 5 segnali nucleo nelle cellule tumorali Amplificazione gt 5 segnali nucleo o cluster di segnali amplificati nucleo in oltre il 50 di cellule tumoralin Risultato DI Assenza di amp
7. 4 00 2 65 1 00 6 00 2 numero di casi discordanti diviso per il numero totale di casi con FISH e CISH validi del centro corrispondente x 100 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 17 di 26 D Casidi polisomia Due centri dello studio hanno esaminato i casi di polisomia in base alle rispettive pratiche cliniche Nel centro A la polisomia del cromosoma 17 stata definita come la presenza di 23 segnali CEP17 in almeno 11 10 delle cellule tumorali mentre nel centro B i criteri prevedevano la presenza di 23 segnali CEP17 in almeno il 30 delle cellule tumorali La frequenza di tumori con polisomia del cromosoma 17 stata del 18 68 nel centro A e del 7 91 nel centro B La percentuale di rilevazione della polisomia nello stesso gruppo di tumori variava in modo significativo tra 1 due centri del test a causa della differenza nella definizione utilizzata nelle due diverse sedi Il livello di concordanza ottenuto indipendentemente in ciascun centro dello studio ha indicato che il kit SPOT Light HER2 CISH ha fornito risultati equivalenti a quelli del test PathVysion HER2 I risultati sono riassunti nelle Tabelle 11 e 12 Tabella 11 concordanza tra CISH e FISH sui casi di polisomia nel centro A dello studio Risultati CISH Risultati FISH Amplificati Non amplificati Totale Amplificati e e o Non amplifica 3 casi con risultati FISH o CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Concordanza positivi 12 14 85
8. 40X Precauzioni Per uso diagnostico in vitro Per operatori professionisti addestrati all uso Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sull etichetta Se il prodotto viene conservato in condizioni diverse da quelle specificate nelle istruzioni allegate necessario che tali condizioni siano verificate dall operatore Non mangiare bere fumare o utilizzare cosmetici in prossimit dell area dove vengono manipolati i materiali del kit Osservare le buone pratiche generali di laboratorio potenziali rischi biologici Maneggiare tutti i materiali con un livello di biosicurezza 2 come raccomandato per tutti 1 materiali di origine umana a potenziale rischio infettivo nel manuale pubblicato dai Centers for Disease Control National Institutes for Health statunitensi Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4 edizione aprile 1999 Non pipettare 1 reagenti con la bocca ed evitare il contatto di pelle e mucose con i campioni e i reagenti Se 1 reagenti vengono a contatto con la pelle o le mucose risciacquare le aree contaminate con abbondante acqua I reagenti B F e G contengono sodio azide allo 0 1 il reagente H contiene gentamicina solfato allo 0 005 e Proclin allo 0 1 il reagente I2 contiene 185 p v di metanolo e il reagente I3 contiene perossido di idrogeno allo 0 6 Alla concentrazione presente nei prodotti questi reagenti non devono essere contrassegnati come nocivi Per ulteriori informazioni f
9. 7 IC al 95 57 2 98 2 Concordanza negativi 34 34 100 0 IC al 95 89 7 100 0 Totale percentuale concordanza 12 34 48 95 894 IC al 95 85 8 99 5 Tabella 12 concordanza tra CISH e FISH sui casi di polisomia nel centro B dello studio Risultati CISH Totale Nonam o 9 t o L 9 1 0 casi con risultati FISH o CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Concordanza positivi 12 12 100 0 IC al 95 73 5 100 0 Concordanza negativi 9 10 90 0 IC al 95 55 5 99 8 Totale percentuale concordanza 12 9 22 95 594 IC al 95 77 2 99 9 Tabella 13 casi discordanti di polisomia tra CISH e FISH HER2 CISH pos FISH neg HER2 CISH neg FISH pos Nume CISH FISH IHC Numero CISH FISH ro del del caso caso Centro A 2 4 17 E o 4070 00 10 00 2 810 67 500 2 __ 5 277000500 2480307500 t Centro B 1 4 55 A 023 520 200 amp 00 149 067 35 2 96 numero di casi discordanti diviso per il numero totale di casi con FISH e CISH validi del centro corrispondente x 10096 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 18 di 26 E Riepilogo dei risultati del confronto tra il kit SPOT Light HER2 CISH e il kit con sonda a DNA PathVysion HER2 Tabella 14 riepilogo del kit SPOT Light HER2 CISH e del kit con sonda a DNA PathVysion HER2 Casi Casi supplementari Casi equivoci Casi di polisomia Tipi di casi s AE consecutivi TT a a A
10. HERI o c erbB 1 pur differenziandosi da esso L amplificazione del gene HER2 o l iperespressione della proteina HER2 stata identificata nel 18 30 dei carcinomi mammari nell uomo identificazione dello stato di amplificazione del gene HER2 importante per la determinazione della prognosi in pazienti con diagnosi di carcinoma mammario invasivo oltre che per la selezione di pazienti candidate alla terapia con trastuzumab Herceptin F Hoffmann La Roche Ltd Basilea Svizzera e Genentech Inc South San Francisco CA Trastuzumab un anticorpo monoclonale specifico per la proteina HER2 stato dimostrato che trastuzumab rappresenta una terapia efficace solo in pazienti i cui tumori evidenziano un amplificazione del gene HER2 e o un iperespressione della proteina HER2 Nelle fasi iniziali del carcinoma mammario un breve ciclo di trastuzumab somministrato in associazione a docetaxel o vinorelbina si dimostrato efficace nelle donne affette da carcinoma mammario che presentavano un amplificazione del gene HER2 neu Altri studi hanno inoltre dimostrato che lo stato di HER2 in grado di anticipare la sensibilit o la resistenza ad alcuni regimi chemioterapici Per questo motivo diventato sempre pi importante avere a disposizione metodi semplici precisi e coerenti per la valutazione dello stato del gene HER2 e della proteina HER2 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 1 di 26 Principi della procedura La tecnica CISH utilizza sonde
11. Tween 20 50 2 ml Tween 20 in soluzione al 5096 Reagente F CAS Block 3 ml contenente tampone stabilizzante e sodio azide 0 1 pronto all uso ATTENZIONE nocivo Reagente G Anticorpi anti digossigenina murini 3 ml contenente BSA tampone e sodio azide 0 1 pronto all uso ATTENZIONE nocivo Reagente H Anticorpi di capra anti topo coniugati con HRP 3 ml contenente stabilizzante tampone gentamicina solfato 0 005 e Proclin 300 0 1 pronto all uso Reagente I1 Tampone substrato DAB 20x ml concentrato contenente tampone Reagente I2 Soluzione DAB 20x 1 ml concentrato contenente 85 p v di metanolo ATTENZIONE infiammabile e tossico Reagente 13 Perossido di idrogeno 20x 1 ml 0 6 di H20 Reagente J Ematossilina di Mayer 100 ml pronto all uso Reagente K Soluzione di montaggio Histomount 4 ml pronto all uso ATTENZIONE altamente infiammabile e nocivo Vetrino di controllo L Vetrino con cellule per procedura di controllo 2 vetrini ciascuno con due linee cellulari fissate in formalina e incluse in paraffina FFPE posizionate una accanto all altra A HER2 non amplificato MCF 7 e B HER2 amplificato SK OV 3 per un controllo ottimale del dosaggio si consiglia l utilizzo della linea cellulare non amplificata con risultati conteggiabili REAGENTI MATERIALI E APPARECCHIATURA NECESSARI MA NON FORNITI Reagenti materiali ausiliari N cat Invitrogen 1 Vetrini portaoggetto SuperFrost Pl
12. a DNA marcate con digossigenina specifiche per il locus del gene HER2 sul cromosoma 17q11 2 21 da ibridizzare con gli acidi nucleici complementari presenti nel campione di tessuto mammario neoplastico La sonda HER2 marcata viene prodotta utilizzando la Subtraction Probe Technology SPTTM una tecnologia esclusiva e brevettata che permette di creare sonde riducendo in modo significativo le sequenze ripetitive ad es gli elementi Alu e LINE osservate negli acidi nucleici umani Tramite PCR stato dimostrato che la sonda contiene il gene HER2 e che si lega in modo specifico al locus del gene HER2 sul cromosoma 17q11 2 21 tramite FISH in metafase nei linfociti normali Di conseguenza le sonde SPTTM Invitrogen sono intrinsecamente specifiche e non richiedono il blocco delle sequenze ripetute necessario con le tradizionali sonde citogenetiche a DNA La tecnica CISH consente la valutazione delle aberrazioni genetiche con microscopio a campo chiaro utilizzando l identificazione cromogenica I risultati della colorazione CISH possono essere facilmente visualizzati con un microscopio in campo chiaro e un obiettivo a secco da 40X Lo stato di amplificazione del gene HER2 pu essere visualizzato nel contesto della morfologia dei tessuti circostanti Dopo la sparaffinatura 1 campioni vengono pretrattati con una fase di smascheramento termoindotto seguita da una digestione enzimatica I campioni vengono quindi disidratati ed essiccati all aria prima di aggiun
13. da quello utilizzato nel Giorno 1 possibile riutilizzarlo per questa fase per una settimana o fino alla preparazione di 100 vetrini Coprire il vetrino coprioggetto utilizzando la soluzione di montaggio Histomount M reagente K Conservare i vetrini a temperatura ambiente 15 30 C per una successiva analisi dei risultati PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 9 di 26 Limiti della procedura Il kit SPOT Light amp HER2 CISH potrebbe non rilevare il 5 dei tumori mammari riferiti che risultano positivi all esame immunoistochimico IHC ma negativi per l amplificazione del gene HER2 Il CISH una procedura multifase che richiede una formazione specifica all utilizzo dei reagenti corretti alla selezione dei tessuti alle tecniche di fissazione trattamento e preparazione dei vetrini CISH e all interpretazione dei risultati della colorazione La colorazione tissutale dipende dalla preparazione e dal trattamento del campione di tessuto prima della colorazione Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta pu compromettere la corretta interpretazione dei risultati Qualsiasi deviazione dalla procedura di analisi consigliata pu invalidare i risultati attesi per questo motivo importante impiegare e documentare appropriate misure di controllo Gli operatori che non seguono la procedura di analisi consigliata devono assumersi la responsabilit dell interpretazione dei risultati dei campioni ottenuti in tali circostanze Il kit SPOT Lig
14. essiccare la sezione di tessuto Per rimuovere il vetrino coprioggetto senza danneggiare il tessuto immergere prima il vetrino in SSC a temperatura ambiente per 2 3 minuti fino a quando il vetrino coprioggetto non si stacca facilmente A questo punto passare alla fase seguente Lavare rapidamente i vetrini nella vaschetta con SSC a temperatura ambiente 15 30 C e quindi immergere i vetrini per 5 minuti nella vaschetta Coplin con SSC nel bagno termostatico a 70 C 1 C Lavare i vetrini in dH2O 3 volte 2 minuti per volta 10 Immunoidentificazione a b c d e f g h i j k D Immergere i vetrini in H202al 3 in metanolo al 100 per 10 minuti Lavare in PBS Tween 20 0 01 3 volte 2 minuti per volta Aggiungere CAS Block reagente F 2 3 gocce per vetrino o una quantit sufficiente per coprire il tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente 15 30 C Tamponare il reagente F con carta da laboratorio Non risciacquare Aggiungere gli anticorpi anti digossigenina murini reagente G 2 3 gocce per vetrino o una quantit sufficiente per coprire il tessuto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente 15 30 C Lavare in PBS Tween 20 0 01 3 volte 2 minuti per volta Aggiungere gli anticorpi di capra anti topo coniugati con HRP reagente H 2 3 gocce per vetrino o una quantit sufficiente per coprire il tessuto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente 15 30
15. grandi cluster o un insieme di punti multipli e grandi cluster o un insieme di punti multipli e piccoli cluster o piccoli cluster del gene HER2 presenti per nucleo nella maggioranza gt 50 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata per il conteggio Vedere le Figure A B C D e E dell Appendice A Guida all interpretazione del test HER2 CISH I grandi cluster sono gruppi di segnali di forma irregolare che hanno un diametro superiore a 5 volte il diametro di un singolo punto Come riferimento va utilizzato un singolo punto presente nelle cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino Vedere Appendice A Figura A I piccoli cluster sono gruppi di segnali di forma irregolare che hanno un diametro 3 5 volte pi grande di quello di un singolo punto Come riferimento va utilizzato un singolo punto presente nelle cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino Vedere Appendice A Figura E Assenza di amplificazione 1 5 punti del gene HER2 presenti per nucleo nella maggioranza 750946 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata per il conteggio Vedere Appendice A Figura F Figura G e Figura H I singoli punti hanno margini lisci e arrotondati e sono presenti nelle cellule normali e in quelle tumorali PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 14 di 26 Valori attesi La prevalenza del gene HER2 amplificato nella popolazione generale di donne con carcinoma mammario del
16. lo smaltimento dei componenti potenzialmente tossici Ridurre al minimo la contaminazione microbica per evitare colorazioni non specifiche e Prestare estrema attenzione durante la manipolazione dei reagenti Indossare guanti protettivi camice e occhiali di sicurezza quando si manipolano sostanze cancerogene Conservazione dei reagenti e Conservare il kit SPOT Light HER2 CISH a 2 8 C e Conservare il reagente J a temperatura ambiente 15 30 C Nota il reagente B pu subire alterazioni se esposto ad alte temperature Conservare questo reagente a 2 8 C immediatamente dopo l uso Non conservarlo a temperatura ambiente e Conservare il tampone PBS Tween 20 attivo a temperatura ambiente 15 30 C per un periodo non superiore a una settimana Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sull etichetta Se il prodotto viene conservato in condizioni diverse da quelle specificate nelle istruzioni allegate necessario che tali condizioni siano verificate dall operatore Non esistono segni visibili per indicare l instabilit di questo prodotto per questo motivo importante esaminare i vetrini di controllo Se si sospetta un problema con il kit contattare 1 Assistenza tecnica PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 5 di 26 Istruzioni per l uso Chi A Preparazione dei campioni Sezioni di tessuto incluse in paraffina Sono idonei per l uso tessuti fissati in formalina tamponata neutra per 6 48 ore prima dell
17. m m cluster oppure insieme di punti multipli e piccoli cluster del za i C Grandi cluster e punti multipli D 55 10 punti gene HER2 presenti per nucleo in oltre il 5096 di cellule tumorali Vedere Figure D e E y Anh OW ET A 14 piccoli cluster sono gruppi di segnali di forma irregolare che E r i e hanno un diametro 3 5 volte pi grande di quello di un singolo be nh pra ui A l edo h punto Come riferimento va utilizzato un singolo punto presente pe et k nelle cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino s Ld eu J Vedere Figura E s To E Piccoli cluster invitrogen Assenza di amplificazione del gene HER2 Assenza di amplificazione Polisomia 3 5 punti del gene HER2 presenti per nucleo in oltre il 5096 di cellule tumorali Vedere Figura F Nelle cellule normali o tumorali i punti singoli hanno margini lisci e arrotondati Vedere Figura F F Polisomia 3 5 punti G Diploidia 1 2 punti Diploidia 1 2 punti del gene HER2 presenti per nucleo in oltre il 50 di cellule tumorali Vedere Figura G Do I wv NA Nelle cellule normali o tumorali i punti singoli hanno margini lisci e ue 4 25 1 S A arrotondati Vedere Figura G A i 8 B t 9 22 2 wr hi Q Coppia a s i f E Se due segnali sono separati da una distanza inferiore al diametro y DL u A di un singolo punto devono essere considerati come un unico SE
18. piccolo cluster Se 1 due segnali sono separati da una distanza inferiore al diametro di uno dei due punti essi devono essere considerati come un singolo punto La coppia il risultato della divisione dei cromosomi con il segnale che risiede su ciascuna delle due cromatidi sorelle e Piccolo cluster Figura E I piccoli cluster sono gruppi di segnali di forma irregolare che hanno un diametro 3 5 volte pi grande di quello di un singolo punto Come riferimento possibile utilizzare un singolo punto presente nelle cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino e Grande cluster Figura A I grandi cluster sono gruppi di segnali di forma irregolare che hanno un diametro superiore a 5 volte il diametro di un singolo punto Come riferimento va utilizzato un singolo punto presente nelle cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino Ingrandimento del segnale CISH 10X I singoli punti sono appena visibili e non facilmente riconoscibili 20X I singoli punti sono piccoli ma chiaramente visibili 40X I singoli punti sono facilmente identificabili 60X o 100X Ingrandimenti non necessari Scelta del campo da esaminare per il conteggio dei segnali HER2 CISH Utilizzando gli obiettivi 4X 20X esaminare il campione CISH colorato per identificare le aree maggiormente rappresentative del carcinoma invasivo dal punto di vista istopatologico Evitare le aree necrotiche 1 segnali sovrapposti a causa d
19. riferimento alla procedura 4 Non esercitare pressioni sul vetrino coprioggetto Immergere prima il vetrino a temperatura ambiente 15 30 C in tampone SSC per 2 3 minuti o fino a quando non possibile rimuovere facilmente il vetrino coprioggetto 5 A meno che non sia indicato diversamente non lasciare asciugare il tessuto durante la procedura CISH 6 Controllare che lo spessore del tessuto sia di 4 6 um 7 Controllare che il tessuto sia fissato per 6 48 ore 8 Controllare che il tessuto sia fissato in formalina tamponata neutra al 10 Colorazione di sottofondo 1 Temperatura di lavaggio stringente errata lt 70 C 2 Eccessiva incubazione con DAB 3 Reagenti errati utilizzati come tampone di lavaggio 1 Controllare che venga utilizzata la temperatura di lavaggio stringete corretta 70 C 2 Controllare che il tempo di incubazione con DAB sia di 30 minuti a temperatura ambiente 15 30 C 3 Durante le fasi di immunoidentificazione necessario utilizzare il tampone di lavaggio reagenti E1 E2 Segnali visibili ma difficili da identificare 1 Eccessiva colorazione di contrasto con ematossilina 1 Controllare che la colorazione di contrasto venga eseguita per 3 5 secondi Se vi fossero dubbi riguardo al tempo ottimale per la colorazione eseguire la colorazione di contrasto per 3 secondi quindi lavare per 2 minuti sotto acqua corrente Controllare al microscopio il tessuto
20. termometro calibrato b Controllare che sia stato osservato il tempo di incubazione del lavaggio stringente corretto 5 minuti 4 Controllare le condizioni di conservazione Il kit SPOT Light HER2 CISH va conservato a 2 8 C Conservare il Reagente J a temperatura ambiente 15 30 C Morfologia tissutale insoddisfacente 1 Condizioni di pretrattamento termico tempo o temperatura errate 1 Controllare che siano state utilizzate le condizioni di pretrattamento termico corrette PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 23 di 26 Problema Possibile causa Azione raccomandata 2 Condizioni di pretrattamento enzimatico tempo o temperatura errate 3 Condizioni di denaturazione tempo o temperatura errate 4 La rimozione del vetrino coprioggetto ha causato un danno fisico al tessuto 5 Il tessuto si asciugato durante la procedura CISH 6 Spessore tissutale errato 7 Tempo di fissazione errato 8 Fissativo errato 2 Controllare che siano state utilizzate le condizioni di digestione enzimatica corrette Per la maggior parte dei tessuti mammari neoplastici si considera ottimale un periodo di 5 minuti a temperatura ambiente 15 30 C A seconda dello spessore del tessuto e del tempo di fissazione pu essere necessario aumentare 0 ridurre il tempo ottimale di incubazione per la digestione 3 Controllare che siano state utilizzate le condizioni di denaturazione corrette Fare
21. 100 o Chiudere ermeticamente e conservare fino a una settimana a temperatura ambiente 15 30 C o fino alla preparazione di 100 vetrini Contrassegnare correttamente ogni reagente di lavaggio e prendere nota dell ordine di utilizzo durante la procedura mantenendo in seguito lo stesso ordine Sparaffinatura Nota preparare una quantit sufficiente di reagenti per ciascuna vaschetta necessaria per il numero di vetrini da analizzare Ogni lavaggio richiede un volume di reagente a parte Se non possibile procedere immediatamente con la seconda fase asciugare i vetrini all aria dopo averli immersi per tre volte in EtOH al 100 invece di lavare i vetrini per tre volte in dH20 a Immergere in xilene 2 volte 5 minuti per volta b Immergere in EtOH al 100 3 volte 3 minuti per volta c Lavare in dH20 3 volte 2 minuti per volta Per ottenere risultati ottimali e riproducibili necessario che l operazione di sparaffinatura sia completa Pretrattamento termico Nota i vetrini devono essere fatti bollire o riscaldati ad una temperatura 798 C per 15 minuti nella soluzione per pretrattamento termico reagente A Non riscaldare eccessivamente 1 vetrini controllando che non venga superata la temperatura di 98 100 C Per questa fase si consiglia di utilizzare la piastra riscaldante Per i protocolli che utilizzano una pentola a pressione con indicatore di pressione e temperatura o un forno a microonde con indicatore di temperatura
22. 18 3095 5 Quando l amplificazione del gene HER2 stata confrontata all iperespressione della proteina HER2 gli studi hanno dimostrato che fino al 5 delle pazienti con carcinoma mammario risulta positivo per l iperespressione della proteina testata tramite metodi immunoistochimici HC ma risulta negativo per l amplificazione del gene HER2 9 Caratteristiche specifiche di prestazione Prestazione clinica La sicurezza e l efficacia del kit SPOT Light HER2 CISH sono state valutate in uno studio comparativo di tre test il kit SPOT Light HER2 CISH il PathVysion FISH e l HercepTestM Lo studio ha interessato due gruppi di casi 226 casi consecutivi e 60 casi supplementari I casi consecutivi sono stati selezionati tra casi consecutivi di carcinoma mammario invasivo esaminati durante l assistenza delle pazienti in due centri dello studio centro A e centro B I casi supplementari comprendevano casi con punteggio di 2 tramite metodi immunoistochimici IHC con anticorpi AB8 durante l assistenza delle pazienti nel centro A A Casi consecutivi La seguente tabella riassume la distribuzione dei risultati di CISH e FISH in relazione ai punteggi dell HercepTest M Il test stato considerato valido quando il vetrino colorato con il metodo in esame era ritenuto accettabile per la valutazione Tabella 1 risultati di IHC FISH e CISH HercepTest M 5 4 m Ken 100 pos 5 Isi m 36 70 N N totale x 100 Numero di casi
23. 19 1 3 3 e 0 9 2 08 Specificit analitica Per determinare la specificit sono stati eseguiti studi di metafase su vetrini preparati citogeneticamente ed stata utilizzata la PCR utilizzando una coppia di primer specifica per il gene HER2 sul modello di sonda a DNA per HER2 ed stato eseguito il sequenziamento del DNA su entrambe le estremit dei cloni BAC utilizzando la sonda a DNA per l HER2 La sonda SPOT Light CISH HER2 si dimostrata in grado di legarsi in modo specifico al locus del gene HER2 sulla banda cromosomica 17q11 2 21 La localizzazione del cromosoma stata determinata tramite FISH in metafase in linfociti normali il test con PCR ha dimostrato la presenza della banda DNA desiderata e il sequenziamento del DNA ha dimostrato la corretta sede sul cromosoma e la copertura del gene HER2 Limiti della procedura La procedura SPOT Light HER2 CISH stata testata su valori estremi per ciascuno dei seguenti parametri spessore tissutale pretrattamento denaturazione ibridazione lavaggio stringente immunoidentificazione e colorazione di contrasto Non sono state osservate differenze significative nei risultati della CISH nelle seguenti condizioni PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 19 di 26 Tabella 15 limiti della procedura Intervalli accettabili dei parametri di dosaggio Spessore tissutale 4 6 um Pretrattamento 99 100 C 10 20 min termico Digestione enzimatica 4 14 mi
24. 77 1999 6 Cobleigh MA Vogel CL Tripathy D et al J Clin Oncol 17 2639 2648 1999 7 Ross JS etal The Oncologist 8 307 325 2003 8 Slamon DJ Clark GM Wong SG et al Science 235 177 82 1987 9 Slamon DI et al Science 244 707 12 1989 10 Pauletti G et al J Clin Oncol 18 21 3651 3664 2000 11 Herceptin trastuzumab package insert Genentech South San Francisco CA www fda gov 2004 12 Heikki Joensuu et al N Engl J Med 354 8 809 820 2006 13 Nicols DW et al Ann Clin Laboratory Sci 32 1 2002 14 Bhargava R et al Am J Clin Path 123 237 243 2005 15 Gong Y et al Mod Path 18 8 1015 21 2005 16 Zhao J Wu R Au A et al Mod Pathol 15 6 657 665 2002 17 Dandachi N Dietze O Hauser Kronberger C Anticancer Res 24 4 2401 6 2004 18 Wixom CR et al Appl Immunohistochem Mol Morphol 12 3 248 251 2004 19 Diaz LK et al J Histochem Cytochem 52 4 501 507 2004 20 van de Vijver M et al Chromogenic in situ hybridization CISH compared with FISH and IHC for detection of HER2 gene amplification An international validation ring study 26 Annual San Antonio Breast Cancer Symposium 2003 21 Arnould L et al Br J Cancer 88 1587 91 2003 22 Gupta D et al Am J Clin Pathol 119 381 87 2003 23 Loring P et al Appl Immunohistochem Mol Morphol 13 2 194 200 2005 24 Rueschoff J et al HER2 status assessment by chromogenic in situ hybridization CISH demonstrates high sensitivity fo
25. FISH o CISH validi con corrispondente punteggio IHC N numero totale di casi FISH o CISH validi x 100 Tabella 2 concordanza tra CISH e IHC Risultati CISH Risultati IHC Positivi 3 Negativi lt 3 Totale mad 3m a 3 1 Non amplificati a DS o I 54 20 casi con risultati IHC o CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Concordanza positivi 32 38 84 2 IC al 95 68 8 94 0 Concordanza negativi 164 168 97 6 IC al 95 94 0 99 4 Totale percentuale concordanza 32 164 206 95 1 IC al 95 91 3 97 7 I risultati hanno mostrato una concordanza del 95 1 IC al 9596 91 3 97 7 indicando una forte concordanza tra il kit SPOT Light HER2 CISH e l HercepTest M PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 15 di 26 Tabella 3 concordanza tra CISH e FISH Risultati CISH Risultati FISH Amplificati Non amplificati Totale Amplificati 34 T o T Non amplificat 2 casi con risultati FISH o CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Concordanza positivi 34 36 94 4 IC al 95 81 3 99 3 Concordanza negativi 169 169 100 0 IC al 95 97 8 100 0 Totale percentuale concordanza 34 169 205 99 0 IC al 95 96 5 99 9 I risultati hanno mostrato una concordanza del 99 0 IC al 95 96 5 99 9 indicando una forte concordanza tra il kit SPOT Light HER2 CISH e il test PathVysion HER2 Di conseguenza la percent
26. RE duo H Coppia 1 punto Per gentile concessione della Dott ssa Adrienne Morey punto Le coppie appaiono come un insieme di due punti e non rappresentano un vero e proprio piccolo cluster Vedere Figura H invitrogen www invitrogen com 2008 Invitrogen Corporation Tutti i diritti riservati Questi prodotti possono essere coperti da una o pi autorizzazioni per uso limitato consultare il catalogo Invitrogen o il sito www invitrogen com Con l uso di questi prodotti si accettano i termini e le condizioni riguardanti tutte le autorizzazioni per uso limitato Prodotti non destinati all uso terapeutico o diagnostico negli animali o nell uomo a meno che non sia indicato diversamente O 079226 r1 0808 Appendice B Foglio per il punteggio HER2 CISH Kit SPOT Light HER2 CISH N cat 84 0150 ID registro colorazione analisi Kit SPOT Light HER2 CISH 84 0150 Lotto n ID campione Risultati CISH registrare il numero di segnali HER2 per ogni cellula esaminata Cartella 1 Risultati CISH N cellula Punti o cluster HER2 N cellula Punti o cluster HER2 N cellula Punti o cluster HER2 1 1 21 2 2 22 3 3 23 4 4 24 5 5 25 6 6 26 7 7 27 8 8 28 9 9 29 10 20 30 Nota per i cluster fornire la migliore stima possibile di punti copie del gene piccoli cluster 5 punti grandi cluster 10 punti Totale dei punti in 30 cellule Media dei punti in 30 cellule
27. are riferimento all MSDS specifico per il componente Il reagente B contiene pepsina e questo enzima pu causare reazioni allergiche se viene a contatto con la pelle Per ottenere risultati ottimali utilizzare un bagno termostatico calibrato un blocco riscaldante e un forno per ibridazione Alcuni reagenti di questo kit contengono sodio azide come conservante La sodio azide pu reagire con le tubature di piombo o di rame e formare azidi metalliche esplosive specialmente dopo un accumulo Quando vengono smaltiti i reagenti contenenti sodio azide risciacquare abbondantemente con acqua per evitare l accumulo di sostanze chimiche pericolose nelle tubature Alcuni reagenti di questo kit contengono Proclin sodio azide o perossido di idrogeno Questi reagenti vengono classificati come nocivi in quanto irritanti per pelle e mucose Queste sostanze vengono fornite in forma diluita come componenti del kit di conseguenza il rischio di esposizione viene ridotto al minimo anche se non completamente eliminato Evitare il contatto con pelle occhi e indumenti Per ulteriori informazioni fare riferimento all MSDS specifico per il componente Il 3 3 diaminobenzidina tetracloruro DAB pu risultare dannoso se ingerito inalato o assorbito attraverso la pelle e pu essere irritante per occhi pelle mucose e prime vie respiratorie Il DAB un sospetto cancerogeno consultare le normative federali statali e o locali per le raccomandazioni sul suo smaltim
28. con la colorazione di contrasto Se la colorazione ancora troppo leggera ripeterla per altri 3 5 secondi prima di posizionare il vetrino coprioggetto Aree senza segnale 1 Formazione di bollicine d aria sotto il vetrino coprioggetto dopo l aggiunta della sonda 2 Volume della sonda insufficiente per la dimensione del tessuto 1 Controllare che non si formino bollicine d aria quando vengono aggiunti la sonda e il vetrino coprioggetto 2 Per un tessuto coperto da un vetrino coprioggetto 22 x 22 mm aggiungere 15 pl di sonda Per i tessuti di grandi dimensioni pu essere necessario utilizzare una quantit maggiore di sonda o un vetrino coprioggetto pi grande utilizzare 20 ul per un tessuto con vetrino coprioggetto da 24 x 30 mm NOTA se si verifica un problema non riportato nell elenco precedente o se l azione raccomandata non consente di risolvere il problema contattare l Assistenza tecnica al numero verde 1 800 955 6288 solo per gli Stati Uniti oppure inviare un e mail all indirizzo techsupport invitrogen com PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 24 di 26 BIBLIOGRAFIA 1 King CR Kraus MH Aaronson SA Science 229 4717 974 976 1985 2 Schechter AL Hung MC Vaidyanathan L et al Science 229 976 978 1985 3 Semba K Kamata N Toyoshima K et al PNAS 82 19 6497 6501 1985 4 Ross JS Fletcher JA Am J Clin Pathol 112 853 S67 1999 5 ShakS Semin Oncol 4 Suppl 12 71
29. contare i nuclei sovrapposti n le aree in cui i nuclei non sono visibili Contare solo i segnali CISH che si trovano all interno dei nuclei Escludere i segnali sporadici fuori dai nuclei di solito dovuti a residui di DNA del gene HER2 fuoriuscito in seguito al turnover delle cellule tumorali Assenza di amplificazione o Definita come 1 5 punti singoli nella maggioranza gt 50 delle cellule tumorali nell area di tessuto selezionata o Non necessario contare 1 punti in 30 cellule Facoltativamente servirsi del foglio di lavoro contenuto nell Appendice B Foglio per il punteggio HER2 CISH per la conta delle cellule Per ottenere una diagnosi chiara di assenza di amplificazione registrare i risultati come media della conta totale in 30 cellule PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 12 di 26 Amplificazione o BDefinita come o gt S punti nella maggioranza 75096 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata oppure o Presenza di grandi cluster nella maggioranza gt 50 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata oppure o Uninsieme di punti multipli e grandi cluster nella maggioranza 750946 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata oppure o Uninsieme di punti multipli e piccoli cluster nella maggioranza 75094 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata oppure o Piccoli cluster nella maggioranza 75096 delle cellule di carcinoma nell area di tessuto selezionata
30. contattare 1 Assistenza tecnica di Invitrogen all indirizzo techsupport g invitrogen com La soluzione per pretrattamento termico reagente A pu essere utilizzata per due volte prima del suo smaltimento a Posizionare i vetrini nell apposito supporto b Riscaldare la soluzione per pretrattamento termico reagente A in un becher posto su piastra riscaldante fino a quando non bolle costantemente e non viene raggiunta una temperatura gt 98 C Per evitare l evaporazione del tampone necessario coprire il becher con un coperchio di vetro o con un foglio di alluminio c Mettere 1 vetrini nella soluzione bollente coprire il becher cominciare il cronometraggio quando la temperatura raggiunge i 98 C oppure quando ricompaiono nuovamente le bollicine di bollitura e lasciare bollire per 15 minuti Verificare che la temperatura rimanga a 98 100 C d Trasferire immediatamente i vetrini in dH2O a temperatura ambiente 15 30 C e Lavare in dH20 tre volte 2 minuti per volta Digestione enzimatica Nota per la maggior parte dei tessuti mammari una digestione enzimatica di 5 minuti a temperatura ambiente 15 30 C consente di ottenere risultati CISH ottimali Il tempo di digestione deve essere modificato in base ai risultati iniziali del periodo di 5 minuti di digestione Pu essere necessario un diverso tempo di incubazione con gli enzimi a seconda dello spessore dei tessuti e del metodo di fissazione Da uno studio sulla dige
31. e a 80 C b Tempo di lavaggio stringente errato 4 Temperatura eccessiva durante la conservazione o il trasporto 1 Controllare che siano state utilizzate le condizioni di pretrattamento corrette Fare riferimento alla procedura a Controllare che siano state utilizzate le condizioni di pretrattamento termico corrette 15 minuti a 98 102 C b Controllare che siano state utilizzate le condizioni di pretrattamento enzimatico corrette tempo consigliato 5 minuti intervallo 2 20 minuti Controllare che l enzima venga portato a temperatura ambiente 15 30 C prima dell uso c A seconda dello spessore del tessuto 4 6 um e delle condizioni di fissazione pu essere necessario aumentare o ridurre il tempo ottimale di incubazione per il pretrattamento enzimatico 2 Controllare che siano state utilizzate le condizioni di denaturazione corrette Fare riferimento alla procedura a Controllare che la temperatura di denaturazione sia di 95 C intervallo di 95 98 C per il ciclatore termico per PCR e di 90 C intervallo di 85 90 C per il blocco riscaldante b Controllare che il tempo di denaturazione sia di 5 minuti per il ciclatore termico per PCR 3 Controllare che siano state utilizzate le condizioni di lavaggio stringente corrette Fare riferimento alla procedura a Controllare che il lavaggio stringente sia stato eseguito a 70 C Per controllare la temperatura si consiglia l utilizzo di un
32. ella 17 riproducibilit tra osservatori HER2 ID N vetrino Osservatore 1 Osservatore 2 Osservatore 3 1 Campione 1 2 punti 1 5 punti 1 2 NAM NAM N 2 Campione 2 Grande cluster Grande cluster gt 10 AM punti multipli punti AM 5 2 AM Campione 3 3 5 NAM NAM 2 3 NAM 1 NAM 4 NAM Campione 7 Grande cluster Grande cluster Grande cluster AM punti multipli punti multipli AM AM AM Campione 8 NAM Riproducibilit tra sedi Lo studio sulla riproducibilit della CISH tra sedi si basato su 226 casi consecutivi ripetuti in tre centri Le percentuali complessive di concordanza per la riproducibilit della CISH con un valore di cutoff per la positivit 75 sono state di 99 0 98 6 e 98 1 indicando una forte riproducibilit dei test con il kit SPOT Light HER2 CISH Tabella 18 riproducibilit della CISH per tutti i casi consecutivi Esaminata dai centri A e B Centro A Centro B risultati CISH Risultati CISH Amplificati Non amplificati Totale Amplificati gw olio let Non amplificati 20 casi con risultati CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Totale percentuale concordanza 34 170 206 99 0 IC al 95 96 5 99 9 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 21 di 26 Tabella 19 riproducibilit della CISH per tutti i casi consecutivi Esaminata dai centri C e B Centro C Centro B risultati CISH Risultati CISH Amplificati Non amplificat
33. ella sovrapposizione di nuclei e i nuclei con segnali di debole intensit Evitare componenti di carcinoma intraduttale DCIS dei carcinomi invasivi Valutare la possibile eterogeneit intratumorale dello stato del gene HER2 prima del conteggio CISH Se il campione risulta omogeneo scegliere per il conteggio dei segnali un area di tessuto con forti segnali CISH Procedere al conteggio dei segnali Se il campione possiede una eterogeneit intratumorale dello stato del gene HER2 nel componente del carcinoma invasivo scegliere per il conteggio dei segnali le aree che rappresentano ogni stato del gene HER2 Un campione di tessuto considerato eterogeneo quando lo stato del gene HER2 cellule amplificate e non amplificate varia nelle differenti aree della stessa sezione di un carcinoma mammario primario necessario esaminare le cellule in ogni area eterogenea per determinare quale stato del gene HER2 amplificato o non amplificato predomina in pi del 50 della sezione del tumore Procedere con il conteggio dei segnali nell area in cui lo stato del gene HER2 predominante per questo tumore Conteggio dei segnali Utilizzare un obiettivo 40X Se necessario possibile utilizzare un obiettivo a maggiore ingrandimento ma non necessario usare l immersione in olio Fare riferimento all Appendice A Guida all interpretazione del test HER2 CISH I singoli geni HER2 sono visibili come piccoli punti rotondeggianti Figura G Non
34. ento Evitare l evaporazione del reagente I2 Il metanolo evapora facilmente Fare il possibile per evitarne l evaporazione ad esempio sigillando il contenitore e chiudendo immediatamente il coperchio dopo l uso L evaporazione del metanolo pu causare la precipitazione del DAB influenzando eventualmente 1 risultati della colorazione Evitare l evaporazione durante l ibridazione controllando che i vetrini siano stati sigillati correttamente e che sia presente un umidit adeguata nella camera di ibridazione PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 4 di 26 e Il pretrattamento enzimatico pu variare a seconda della fissazione e dello spessore dei tessuti Per la maggioranza delle sezioni di tessuto 4 5 um fissate in formalina tamponata neutra al 10 si considera ottimale un pretrattamento enzimatico di 5 minuti Per i tessuti di cui non nota la fissazione necessario eseguire una titolazione enzimatica ad es 2 5 e 10 minuti modificando il tempo di digestione ottimale in base ai risultati iniziali e Reagente C sonda HER2 marcata contenente formammide una sostanza nociva R21 Nocivo a contatto con la pelle R22 Nocivo in caso di ingestione R61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati S24 Evitare il contatto con la pelle 36 Indossare un indumento di protezione adeguato S37 Indossare guanti adeguati S39 Far uso di un apparecchio di protezione degli occhi e del viso e Reagente I2 la solu
35. gere la sonda HER2 Dopo l aggiunta della sonda e il posizionamento del vetrino coprioggetto sul campione l insieme viene denaturato e ibridato per pi di 10 ore o per tutta la notte A questo punto il campione viene lavato per rimuovere la sonda non ibridata e il segnale viene identificato per via cromogenica tramite l aggiunta sequenziale di anticorpi anti digossigenina coniugati con perossidasi di rafano HRP Il colore si forma dalla reazione dell HRP legato con il cromogeno DAB e il substrato H5O Infine viene eseguita la colorazione di contrasto del campione con ematossilina di Mayer per identificare la morfologia dei tessuti e quindi viene posto un vetrino coprioggetto Il segnale del gene HER2 rappresentato da un singolo punto bruno scuro se presente in un basso numero di copie oppure da cluster di colore bruno se il segnale rappresenta numerose copie Le aree delle cellule tumorali possono essere facilmente identificate con l obiettivo a basso ingrandimento di un microscopio in campo chiaro e le copie del gene HER2 vengono quantificate utilizzando un obiettivo 40X La rilevazione delle cellule tumorali e la quantificazione delle copie del gene HER2 avvengono quindi con un microscopio in campo chiaro e un obiettivo 40X Il DAB forma un precipitato colorato in modo da permettere di archiviare i risultati per una valutazione successiva Materiali forniti Il kit SPOT Light HER2 CISH contiene tutti i reagenti necessari per eseguire la proced
36. ht HER2 CISH stato ottimizzato esclusivamente per l identificazione e la quantificazione del gene HER2 neu in nuclei in interfase di campioni di tessuto di tumori mammari umani fissati in formalina e inclusi in paraffina Altri tipi di campioni o di fissativi non sono stati convalidati L interpretazione clinica dei risultati delle analisi deve essere eseguita nel contesto anamnestico della paziente e di altri risultati diagnostici ottenuti in laboratorio PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 10 di 26 Controllo di qualit Controlli positivi e negativi su singolo vetrino Vetrino di Immagine 1 Il vetrino di controllo L controllo L contiene una linea cellulare A non amplificata MCF 7 e una linea cellulare B amplificata SK OV 3 Nota le linee cellulari non sono riportate in scala e sono pi piccole di quelle indicate nel disegno e Jl segnale CISH deve essere netto di colore bruno e facile da valutare e I vetrini di controllo in dotazione vetrino L contengono due sezioni da 4 um prelevate da blocchi di cellule FFPE provenienti da due diverse linee cellulari Questi vetrini devono essere utilizzati come controlli per la procedura La linea cellulare A MCF 7 non amplificata e possiede lt 5 segnali o punti per ogni nucleo La linea cellulare B SK OV 3 amplificata e ha l aspetto di piccoli o grandi cluster DAB presenti all interno del nucleo e JI vetrino di controllo con le linee cellulari deve essere analizzato insieme ad og
37. i Totale Amplificati pr ile i Non amplificati 4 casi con risultati CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Totale percentuale concordanza 354184 222 98 696 IC al 95 96 1 99 7 Tabella 20 riproducibilit della CISH per tutti i casi consecutivi Esaminata dai centri C e A Centro C Centro A risultati CISH Risultati CISH Amplificati Non amplificati Totale Amplificati Non amplificati 19 casi con risultati CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Totale percentuale concordanza 32 171 207 98 1 IC al 95 95 1 99 5 Studi di ripetibilit e riproducibilit su sezioni di tessuti consecutivi e di vario spessore Sono stati condotti studi di ripetibilit e riproducibilit per valutare la ripetibilit e la riproducibilit del kit SPOT Light HER2 CISH durante il test di tessuti consecutivi di carcinomi mammari con o senza amplificazione e di vario spessore I campioni in esame includevano vetrini di tre tipologie di tessuto mammario neoplastico senza amplificazione HER2 normale con amplificazione HER2 borderline e con amplificazione HER2 elevata Dieci campioni per ogni blocco di sezioni consecutive con spessore di 4 um sono stati preparati ed esaminati in base a procedure standard in condizione controllata mentre campioni di diverso spessore da 2 a 8 um in ciascun blocco sono stati preparati allo stesso modo e testati in duplicato in base alle procedure standa
38. inclusione in paraffina Fissativi diversi dalla formalina tamponata neutra al 10 non sono stati ottimizzati per questo protocollo e non sono idonei per l uso Le sezioni di tessuto 4 5 um di spessore devono essere montate su vetrini per microscopio HistoGrip M o Superfrost Plus Se possibile utilizzare sezioni di tessuto di spessore standardizzato al fine di assicurare l uniformit della colorazione con tecnica di identificazione CISH e dei reagenti per la colorazione di contrasto Asciugare i vetrini all aria o a 37 C e quindi mettere nel forno per 2 4 ore a 60 C I tessuti fissati e inclusi correttamente si mantengono a tempo indeterminato prima della preparazione delle sezioni e del montaggio su vetrino se conservati in un luogo fresco e asciutto 15 30 C Le sezioni di tessuto con spessore di 2 3 um possono fornire risultati con un numero di copie di geni erroneamente basso B Procedura CISH standard per sezioni di tessuto FFPE Note sulla procedura Tutti i reagenti tranne il reagente C sonda HER2 devono essere portati a temperatura ambiente 15 30 C prima dell uso La sonda HER2 pu essere utilizzata fredda senza portarla a temperatura ambiente Ogni incubazione deve essere eseguita a temperatura ambiente 15 30 C a meno che non sia indicato diversamente A meno che non sia indicato diversamente nel corso dell intera procedura importante evitare l essiccazione della sezione di tes
39. lificazione x5 Amplificazione gt 5 Data e firma del tecnico Data e firma del medico patologo invitrogen www invitrogen com 2008 Invitrogen Corporation Tutti i diritti riservati Questi prodotti possono essere coperti da una o pi autorizzazioni per uso limitato consultare il catalogo Invitrogen o il sito www invitrogen com Con l uso di questi prodotti si accettano i termini e le condizioni riguardanti tutte le autorizzazioni per uso limitato Prodotti non destinati all uso terapeutico o diagnostico negli animali o nell uomo a meno che non sia indicato diversamente O 079226 r1 0808
40. llo studio hanno dimostrato che il kit SPOT Light HER2 CISH ha fornito risultati equivalenti a quelli del test PathVysion HER2 I risultati della correlazione sono riassunti nelle Tabelle 8 e 9 Tabella 8 concordanza tra CISH e FISH sui casi HercepTest 2 nel centro A dello studio Risultati CISH Totale Ampe __ 9 _ __3__ 2 casi con risultati FISH o CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Concordanza positivi 3 7 42 9 IC al 95 9 9 81 6 Concordanza negativi 27 27 100 0 IC al 95 87 2 100 0 Totale percentuale concordanza 3 27 34 88 2 IC al 95 72 6 96 7 Tabella 9 concordanza tra CISH e FISH sui casi HercepTest 2 nel centro B dello studio Risultati CISH Risultati FISH Amplificati Non amplificati Totale Amplificati Non amplificat 2 casi con risultati FISH o CISH assenti o non validi sono stati esclusi dalla tabella Concordanza positivi 4 5 80 0 IC al 95 28 4 99 5 Concordanza negativi 35 36 97 2 IC al 95 85 5 99 9 Totale percentuale concordanza 4 35 41 95 1 IC al 95 83 5 99 4 Tabella 10 casi HercepTest 2 discordanti tra CISH e FISH HER2 CISH pos FISH neg HER2 CISH neg FISH pos Numero CISH FISH IHC Numero del CISH FISH IHC del caso caso Centro A 4 11 7696 __ M99 47000 1000 25 0 67 500 I N soci icai 7 Centro B 2 4 8894 A 023 5 20 2 00 8 00 1 49 0 67 3 50 2 B 008 2 77 2 00
41. lule o dei tessuti Se si verifica una colorazione non specifica dei nuclei della porzione di tessuto normale del controllo positivo i risultati ottenuti dai campioni del paziente non devono essere considerati validi e necessario convalidare le modifiche nella preparazione dei tessuti e nelle procedure tecniche del laboratorio dell operatore poich possono causare una significativa variabilit nei risultati rendendo necessaria l adozione periodica di controlli interni in aggiunta alle seguenti procedure Interpretazione Valutazione dell adeguatezza dei vetrini I punti segnali HER2 CISH devono essere piccoli ma chiaramente distinguibili con un obiettivo 20 40X I punti presentano un colore bruno rispetto alla colorazione di contrasto PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 11 di 26 Se non sono presenti punti visibili nel campione necessario ripetere il dosaggio Contattare l Assistenza tecnica di Invitrogen al numero verde 1 800 955 6288 solo per gli Stati Uniti per discutere le possibili cause del problema Aspetto del segnale CISH fare riferimento all Appendice A Guida all interpretazione del test HER2 CISH I punti HER2 CISH possono avere il seguente aspetto e Punto singolo Figura G Nelle cellule normali o tumorali i punti singoli hanno margini lisci e arrotondati Ogni singolo punto rappresenta una singola copia del gene HER2 e Coppia Figura H I punti appaiono come coppie e non rappresentano un vero e proprio
42. n Denaturazione Ciclatore termico per PCR 93 98 C 2 8 min Ibridazione 30 39 C 10 18 ore Lavaggio stringente 60 78 C 2 8 min Immunoidentificazione Coniugato HRP 25v60 min Cromogeno DAB 15 60 min Colorazione di 3 30 sec contrasto Riproducibilit Tre lotti distinti del kit SPOT Light HER2 CISH sono stati testati su 3 campioni di tessuto mammario neoplastico e 4 campioni di linee cellulari con diversi livelli di espressione del gene HER2 Non sono state rilevate variazioni nelle prestazioni del dosaggio tra i 3 lotti testati Riproducibilit interdosaggio tra giorni diversi SEC ES mammario neoplastico con tre tipi di stato del gene HER2 e tre campioni per ogni tipo di stato Di seguito viene riportato un riepilogo dei risultati Tabella 16 riproducibilit interdosaggio tra giorni diversi Copia del gene N Non amplificati Non amplificati Amplificati polisomia Media N 9 1 79 3 45 20 22 Dev std 9 0 05 0 12 1 72 CV 9 3 4 8 Studio con diversi osservatori Tre patologi sono stati addestrati alla lettura di vetrini preparati e colorati con il kit SPOT Light HER2 CISH Per verificare la loro capacit a ciascun patologo sono stati forniti da Invitrogen otto vetrini precolorati 2 con amplificazione e 6 senza In entrambi i tipi di casi con amplificazione e senza tutti i campioni 100 sono stati interpretati correttamente PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 20 di 26 Tab
43. ne utilizzato un vetrino coprioggetto convenzionale necessario sigillare per evitare l evaporazione durante l incubazione Per sigillare possibile utilizzare una siringa da 5 ml e un ago da 18G x 12 mm Riempire la siringa con colla polimerica e applicarne uno strato sottile sui margini del vetrino coprioggetto ricoprendo anche una piccola parte del vetrino portaoggetto Lasciare asciugare la colla polimerica 10 minuti per evitare che il vetrino coprioggetto si sposti La denaturazione e l ibridazione vengono eseguite utilizzando un ciclatore termico per PCR con un comparto vetrini o un blocco riscaldante con display digitale per la temperatura insieme ad una camera di umidificazione e un incubatore a 37 C 1 Quando viene utilizzato un ciclatore termico per PCR con un comparto vetrini denaturare a 95 C X1 C per 5 minuti e quindi incubare per tutta la notte 10 18 ore a 37 C X1 C 2 Quando vengono utilizzati un blocco riscaldante e una camera di umidificazione con incubatore a 37 C denaturare a 95 C 1 C per 5 minuti e quindi incubare per tutta la notte 10 18 ore a 37 C 1 C in camera di umidificazione Procedura Giorno 2 8 Preparazione dei reagenti PBS tampone fosfato isotonico o Aggiungere una confezione di PBS in polvere reagente E1 a 1 1 di dH O Miscelare Tampone PBS Tween 20 Tween 0 01 o Aggiungere 10 gocce di Tween 20 al 50 reagente E2 ad 1 di PBS la soluzione s
44. ni analisi dei vetrini del paziente e deve essere trattato allo stesso modo delle sezioni di tessuto e Seil vetrino di controllo vetrino L risulta negativo per entrambe le linee cellulari A e B questo indica che si verificato un errore durante la procedura CISH e La linea cellulare del controllo positivo B in grado di dimostrare l amplificazione del gene HER2 deve essere esaminata per prima per appurare il funzionamento corretto di tutti i reagenti La presenza di cluster di geni o di un numero superiore a 5 singoli segnali o punti all interno del nucleo di ogni singola cellula indicativa della reattivit positiva attesa Se il controllo positivo non riesce a dimostrare la presenza di cluster o di un numero superiore a 5 singoli segnali per nucleo nella maggioranza 75096 delle cellule di carcinoma i risultati ottenuti dai campioni del paziente non devono essere considerati validi e La linea cellulare del controllo negativo o normale A in grado di dimostrare l assenza di amplificazione del gene HER2 deve contenere un numero uguale o inferiore a 5 punti all interno del nucleo di ogni cellula e Se si verifica una colorazione non specifica dei nuclei del controllo normale A 1 risultati ottenuti dai campioni del paziente non devono essere considerati validi e Se si verifica una colorazione non specifica in genere questa ha un aspetto di colorazione diffusa A volte possibile osservare una colorazione bruna sporadica al di fuo
45. o Intuttii casi sopra descritti non necessario contare i punti in 30 cellule Facoltativamente servirsi del foglio di lavoro contenuto nell Appendice B Foglio per il punteggio HER2 CISH per la conta delle cellule Per ottenere una diagnosi chiara di amplificazione registrare i risultati come media della conta totale in 30 cellule Per il conteggio considerare 1 piccoli cluster equivalenti a 5 punti e i grandi cluster equivalenti a 10 punti o Razionale l assegnazione di un numero specifico di punti ai cluster piccoli e grandi arbitraria a fini quantitativi Le cellule normalmente possiedono due copie del gene HER2 Le cellule in cui avvenuta la replicazione del DNA ma che non si sono ancora divise possiedono 4 copie del gene Per questo motivo la presenza di un piccolo cluster indica un amplificazione e contiene almeno 5 copie del gene I grandi cluster di dimensione almeno doppia di quella dei piccoli cluster hanno almeno 10 copie del gene e Casi non definiti di amplificazione o assenza di amplificazione Interpretare con cautela i campioni che non appartengono chiaramente alle categorie di amplificazione o assenza di amplificazione Questi campioni mostrano 4 6 punti nella maggioranza 75096 delle cellule di carcinoma nel campo in esame selezionato Se il numero medio di punti si trova tra 4 e 6 dopo il conteggio di 30 cellule tumorali sar necessario contare altre 30 cellule per un totale di 60 cellule Se vi sono ancora d
46. opra descritta Miscelare o Conservare a temperatura ambiente 15 30 C per un periodo non superiore a una settimana Soluzione substrato cromogeno DAB o Preparare questa soluzione immediatamente prima dell uso o Aggiungere una goccia di ciascun reagente I1 I2 I3 ad 1 ml di dH O Miscelare bene H 0 al 3 in metanolo assoluto o Aggiungere una parte di H5O al 30 a 9 parti di metanolo o Chiudere ermeticamente e conservare fino a una settimana a temperatura ambiente 15 30 C o fino alla preparazione di 100 vetrini Xilene 2 rack portavetrini PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 8 di 26 Chiudere ermeticamente e conservare fino a una settimana a temperatura ambiente 15 30 C o fino alla preparazione di 100 vetrini 9 Lavaggio stringente Nota l utilizzo di una temperatura superiore a quella raccomandata per la procedura pu causare una riduzione o la perdita totale del segnale CISH I lavaggi ad una temperatura troppo bassa possono causare un elevato sottofondo Utilizzare un termometro calibrato per assicurare che venga raggiunta e mantenuta la temperatura del bagno termostatico a b c d e f Accendere il bagno termostatico a 70 C 1 C e portarlo alla temperatura desiderata Preparare due vaschette Coplin contenenti tampone SSC reagente D mantenendo uno a temperatura ambiente e riscaldando l altro a 70 C Staccare la colla polimerica o togliere il coprivetrino UnderCover M Non lasciare
47. r predicting response to Herceptin 27 Annual San Antonio Breast Cancer Symposium 2004 25 Wolff AC et al American Society of Clinical Oncology College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer Arch Pathol Lab Med 131 18 43 2007 26 Sheehan DC Hrapchak BB Theory and practice of histotechnology St Louis CV Mosby Company 1980 27 24 Kiernan JA Histological and histochemical methods theory and practice New York Pergamon Press 1981 28 Data on file PMA application amp USCAP 2008 Annual Meeting poster presentations numbers 138 139 amp 140 29 Cooper K et al J Clin Pathol 44 406 409 1991 MARCHI COMMERCIALI Clearmount M HistoGrip M Histomount M e SPTTM sono marchi commerciali di Invitrogen Corporation SPOT Light e Zymed sono marchi registrati di Invitrogen Corporation Herceptin un marchio registrato di Genentech Inc HercepTest M un marchio commerciale di Genentech Inc Path Vysion un marchio registrato di Abbott Molecular Inc PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 25 di 26 Invitrogen Corporation 542 Flynn Road Camarillo e California 93012 USA Tel 1 800 955 6288 Per problemi tecnici inviare un e mail all indirizzo techsupport invitrogen com Per informazioni generali sul kit SPOT Light HER2 CISH inviare un e mail all indirizzo her2cish invitrogen com URL www invitrogen com her2cish Spiegazione dei simboli
48. rd I risultati delle analisi sono riportati nelle Tabelle 21 23 Tabella 21 Media dei punti HER2 CISH per cellula in sezioni consecutive da 4 um carcinoma mammario con HER2 normale NENNEN M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media punti HER2 CISH per 18 20 19 20 1 6 1 7 1 7 L6 1 7 2 0 nucleo Media HER2 1 8 DS 0 16 CV 8 9 Tabella 22 Media dei punti HER2 CISH per cellula in sezioni consecutive da 4 um tumore mammario con amplificazione borderline di HER2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media punti HER2 CISH per 54 5 5 5 3 5 8 52 62 57 54 5 5 5 nucleo Media HER2 5 6 DS 0 30 CV 5 4 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 22 di 26 Tabella 23 Media dei punti HER2 CISH per cellula in sezioni consecutive da 4 um carcinoma mammario con HER2 amplificato Numero sezione 7 8 9 10 Media punti HER2 CISH per BC BC BC BC BC BC BC BC BC BC nucleo Risoluzione dei problemi Problema Possibile causa Azione raccomandata Segnale debole o assente 1 Le istruzioni sul pretrattamento non sono state seguite a Condizioni di pretrattamento termico tempo o temperatura di incubazione errate b Condizioni di pretrattamento enzimatico tempo o temperatura errate c Spessore della sezione di tessuto non ottimale 2 Condizioni di denaturazione errate a Temperatura di denaturazione errata b Tempo di denaturazione errato 3 Condizioni di lavaggio stringente errate a Temperatura di lavaggio stringente errata superior
49. ri dei nuclei nelle sezioni di tessuto che hanno subito una fissazione eccessiva in formalina In questi casi i risultati devono essere interpretati con cautela La colorazione non specifica non deve essere confusa con i segnali CISH positivi e Se utilizzato un tessuto per il controllo positivo composto da tessuto mammario neoplastico in grado di dimostrare l amplificazione del gene HER2 deve evidenziare la presenza di cluster di geni o di un numero superiore a 5 singoli segnali o punti per nucleo nella maggioranza gt 50 delle cellule di carcinoma un fattore indicativo della reattivit positiva attesa Se il tessuto per il controllo positivo non riesce a evidenziare la presenza di cluster o di un numero superiore a 5 singoli punti per nucleo in oltre il 50 delle cellule di carcinoma i risultati ottenuti dai campioni del paziente non devono essere considerati validi e Se utilizzato un tessuto per il controllo negativo composto da tessuto mammario neoplastico in grado di dimostrare l assenza di amplificazione del gene HER2 deve contenere un numero inferiore a 5 segnali per nucleo nella maggioranza gt 50 delle cellule di carcinoma e In generale la presenza di non pi di due segnali o punti nei nuclei cellulari della porzione di tessuto normale cellule epiteliali o stromali normali nel tumore di un controllo positivo conferma l assenza di reattivit crociata tra la sonda e 1 reagenti per l immunoidentificazione e 1 componenti delle cel
50. stione enzimatica emerso che il tempo di digestione pu variare da 2 a 20 minuti fornendo un segnale CISH soddisfacente per la valutazione del gene HER2 in una serie di reperti di tessuto mammario In uno studio di concordanza per supportare l utilizzo di CISH rispetto a FISH dove sono stati utilizzati campioni di tessuto mammario neoplastico preparati non pi di 12 mesi prima della data dello studio una digestione enzimatica di 5 minuti ha fornito segnali CISH ottimali per la valutazione del gene HER2 C a Portare il reagente per pretrattamento enzimatico reagente B a temperatura ambiente 15 30 C b Aggiungere una quantit sufficiente di reagente B per coprire la sezione di tessuto e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente 15 30 C c Lavare in dH20 3 volte 2 minuti per volta Disidratare in una serie graduata di etanolo a EtOH al 70 2 minuti b EtOH al 85 2 minuti c EtOH al 95 2 minuti d EtOH al 100 2 minuti PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 7 di 26 e EtOH al 100 2 minuti 6 Asciugare all aria per gt 20 minuti o fino ad asciugatura completa Se necessario contrassegnare i vetrini con una matita 7 Denaturazione e ibridazione Nota utilizzare un ciclatore termico per PCR con un comparto vetrini o un blocco riscaldante con un display digitale per la temperatura e una camera di umidificazione con incubatore a 37 C o strumentazione simile Veri ficare che l umidit delle camere venga manten
51. suto tra le diverse fasi Nel corso della procedura necessario eseguire diversi lavaggi Utilizzare nuova soluzione ad ogni lavaggio I vetrini di controllo devono essere analizzati insieme ad ogni analisi dei vetrini del paziente e devono essere trattati allo stesso modo dei campioni di analisi durante tutte le fasi A meno che non sia indicato diversamente tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente 15 30 C Per completare questa procedura sono necessarie pi di otto ore Di seguito viene riportata una comoda suddivisione di questo periodo Il giorno 1 si inizia con la sparaffinatura per poi passare alla denaturazione e alla ibridazione per tutta la notte e proseguendo il giorno 2 con il lavaggio stringente fino all esame microscopico in campo chiaro Per la procedura CISH sono necessari i reagenti Invitrogen forniti con il kit L utilizzo di altri reagenti pu causare un elevato sottofondo o la riduzione perdita del segnale CISH La sostituzione di uno qualsiasi dei reagenti forniti come componenti del kit pu invalidare i risultati del dosaggio Procedura Giorno 1 1 Preparazione dei reagenti Xilene 2 vaschette EtOH al 100 3 vaschette o Chiudere ermeticamente e conservare fino a una settimana a temperatura ambiente 15 30 C o fino alla preparazione di 100 vetrini Serie di etanolo EtOH PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 6 di 26 2 Da o Preparare diverse vaschette con EtOH al 70 85 95 e
52. uale di concordanza indica che il kit SPOT Light HER2 CISH ha fornito risultati equivalenti a quelli del test PathVysion HER2 Di seguito viene riportato un riepilogo dei 2 casi discordanti tra il test con sonda HER2 SPOT Light e il test con sonda HER2 PathVysion I dati relativi a CISH e FISH vengono riportati come media e intervallo e la colonna IHC riporta il punteggio dell HercepTest M Tabella 4 casi discordanti tra FISH e CISH HER2 CISH pos FISH neg HER2 CISH neg FISH pos Numero del CISH FISH THC Numero CISH FISH THC caso del caso 2 0 98 __ Aso 407000 1009 281 0 67 5 00 eee 277000400 2 5 00 600 1 numero di casi discordanti diviso per il numero totale di casi con FISH e CISH validi del centro corrispondente x 100 B Casi IHC 2 supplementari Sono stati forniti altri 60 casi supplementari IHC 2 dal centro A dello studio che sono stati testati nei centri A e B I risultati di ciascun centro dello studio hanno dimostrato che il kit SPOT Light HER2 CISH ha fornito risultati equivalenti a quelli del test PathVysion HER2 I risultati della correlazione sono riassunti nelle Tabelle 5 e 6 Tabella 5 concordanza tra CISH e FISH sui casi IHC 2 nel centro A dello studio Risultati CISH Risultati FISH Amplificati Non amplificati Totale Amplificati e Eo o Non amplificati Eris E a a 6 casi con risultati assenti o non validi Concordanza positivi 6 8 75 0 IC al 95 34 9
53. ubbi ripetere il dosaggio su un nuovo vetrino Registrare i risultati utilizzando il foglio di lavoro dell Appendice B Foglio per il punteggio HER2 CISH 1 Contare i punti in 30 cellule tumorali nell area di tessuto selezionata Se sono presenti piccoli cluster fare riferimento al punto n 4 sottostante Sommare il numero di punti nelle 30 cellule e calcolare la media 3 Registrare 1l risultato in base alla media di 60 cellule Se viene osservato un insieme di punti singoli e piccoli cluster a causa della formazione di cluster da parte di punti singoli o se vengono osservati solo piccoli cluster e conteggiare ogni piccolo cluster come 5 punti e possibile utilizzare un singolo punto presente in cellule epiteliali normali o tumorali dello stesso vetrino come riferimento per determinare da cosa rappresentato un piccolo cluster 5 Registrare i risultati come la media della conta totale in 60 cellule per ottenere una diagnosi di amplificazione o assenza di amplificazione secondo le linee guida Invitrogen e Registrazione dei risultati I risultati possono essere registrati utilizzando il foglio di lavoro dell Appendice B Foglio per il punteggio HER2 CISH La registrazione dello stato del gene HER2 deve essere effettuata secondo le linee guida Invitrogen in particolare nei casi dubbi di amplificazione o assenza di amplificazione PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 13 di 26 Riepilogo dell interpretazione Amplificazione 75 punti o
54. ura CISH su campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina I materiali elencati di seguito sono sufficienti per eseguire un totale di 20 test e fino a 2 analisi con i due vetrini di controllo utilizzando campioni di tessuto da 24 x 30 mm con vetrino coprioggetto Se vengono utilizzati vetrini coprioggetto pi piccoli possibile eseguire ulteriori test Il kit SPOT Light HER2 CISH viene fornito con pacchetti refrigeranti Al momento della consegna tali pacchetti devono essere ancora freddi per assicurare che la confezione non sia stata esposta ad alte temperature Tuttavia anche se alcuni componenti non dovessero essere congelati questo non influenza le prestazioni del kit Fare riferimento a Conservazione dei reagenti per l immediato stoccaggio di questi componenti dopo la consegna Reagente A Soluzione per pretrattamento termico 1 1 contenente tampone tris EDTA pronto all uso Reagente B Reagente per pretrattamento enzimatico 5 ml contenente una soluzione di pepsina con sodio azide 0 05 e detergente pronto all uso ATTENZIONE nocivo Reagente C Sonda HER2 0 4 ml sonda HER2 SPOT Light marcata con digossigenina in tampone di ibridazione contenente formammide pronto all uso ATTENZIONE nocivo Reagente D Tampone SSC 500 ml contenente sodio citrato SSC pronto all uso Reagente E1 PBS in polvere 3 confezioni ciascuna sufficiente per 1 1 di PBS PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 2 di 26 Reagente E2
55. us OPPURE Vetrini portaoggetto adesivi Histogrip 00 8050 2 Tessuto per il controllo positivo sezione di tessuto di carcinoma mammario FFPE di tipo duttale tubulare lobulare o misto con amplificazione del gene HER2 precedentemente confermata con CISH o FISH 3 Tessuto per il controllo negativo sezione di tessuto di carcinoma mammario FFPE di tipo duttale tubulare lobulare o misto con assenza di amplificazione del gene HER2 precedentemente confermata con CISH o FISH 4 Acqua deionizzata o distillata dH5O 5 Xilene 6 Etanolo al 70 85 95 e 100 EtOH 7 Vetrini coprioggetto colla polimerica ago da 18G x 12 mm e siringa da 5 ml OPPURE 8 Coprivetrino UnderCover 18 x 18 mm 00 8403 9 Coprivetrino UnderCover 22 x 22 mm 00 8404 10 Perossido di idrogeno al 30 H5O 11 Metanolo al 100 PI84 0150 Rev 0 0 Pagina 3 di 26 Apparecchiatura 9 R PEON R Een Cronometro Pipette 20 ul 1000 pl Puntali Rack portavetrini Piastra riscaldante fogli di alluminio e becher da 1 1 Riscaldatore per vetrini Incubatrice a 37 C Ciclatore termico per PCR con comparto vetrini OPPURE Blocco riscaldante con termometro digitale e incubatore a 37 C 1 C e camera di umidificazione per vetrini Bagno termostatico in grado di mantenere un intervallo di temperatura di 70 80 C con un termometro calibrato 10 Vaschette Coplin e vaschette per colorazione 11 Microscopio in campo chiaro con obiettivi 20X e
56. uta in modo adeguato L ibridazione eseguita per periodi di tempo pi brevi pu fornire un segnale pi debole La denaturazione della sonda ad una temperatura inferiore a quella raccomandata dal protocollo pu fornire risultati con segnale CISH debole o assente La modifica dei tempi di incubazione pu fornire un segnale debole o una colorazione di sottofondo a b d e Aggiungere 15 ul della sonda HER2 reagente C al centro del vetrino coprioggetto da 22 x 22 mm A seconda della dimensione del tessuto pu essere necessario utilizzare una quantit maggiore o minore di sonda Utilizzare 1l seguente volume di sonda in base alle dimensioni del vetrino coprioggetto 18 x 18 mm 10 ul 22 x 22 mm 15 ul 24 x 30 mm 20 ul Posizionare il vetrino coprioggetto con il lato della sonda verso il basso sull area corretta del campione di tessuto posto sul vetrino Al posto dei tradizionali vetrini coprioggetto possibile utilizzare 1 coprivetrini per CISH UnderCover M di Invitrogen Quando vengono utilizzati i coprivetrini per CISH UnderCover M staccare la carta di protezione e posizionare il vetrino coprioggetto esposto dove stata rimossa la carta sull area del vetrino portaoggetto in modo da coprire il campione di tessuto Premere sui margini del nastro adesivo per sigillare il vetrino coprioggetto ed evitare cos l evaporazione NON ESERCITARE LA PRESSIONE SULLA PARTE CENTRALE DEL VETRINO COPRIOGGETTO Quando vie
57. zione di DAB contiene metanolo una sostanza infiammabile e tossica Per ulteriori informazioni fare riferimento all MSDS R10 Infiammabile R23 24 25 Tossico per inalazione ingestione e contatto con la pelle S45 In caso d infortunio o di malore consultare immediatamente un medico 36 Indossare un indumento di protezione adeguato S37 Indossare guanti adeguati e Reagente K la soluzione di montaggio Histomount contiene toluene una sostanza altamente infiammabile e nociva se inalata Per ulteriori informazioni fare riferimento all MSDS R11 Molto infiammabile R20 Nocivo per inalazione S2 Conservare fuori portata dei bambini S16 Conservare lontano da qualsiasi fonte di infiammazione Non fumare S25 Evitare il contatto con gli occhi S29 Non gettare i residui nelle condotte fognarie 833 Evitare l accumulo di cariche elettrostatiche e Tutti i reagenti contrassegnati come pronti all uso sono stati diluiti in modo ottimale Un ulteriore diluizione potrebbe influenzare negativamente 1 risultati del dosaggio e tempi di incubazione i reagenti e le temperature sono state ottimizzate L uso di tempi di incubazione reagenti o temperature diversi potrebbe influenzare negativamente i risultati del dosaggio e Si sconsiglia l uso di fissativi o spessori diversi per i tessuti in quanto ci potrebbe influenzare negativamente i risultati del dosaggio Consultare le normative locali per
Download Pdf Manuals
Related Search