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Beginners Guide Italian

1. iii 44 Simmetria del Tubo NMR nn ncnnncnnnnnnnnnn 45 SINGOIEHO scia G 25 SINTONIA ie iii 54 Sistema di controllo dell acquisizione nennen ne 30 Sold AEN SIE ls ia 43 Solventi contenuto d acqua nn ttt nnnnnnnnnrrnnnnanannns 44 dipendenza della temperatura nten reensteeettnnttnnrrnnsennnnreeee nt 43 scelta del solvente nn nn nn n nc nnnnnnnnn 43 solubilit 43 solventi organici nan r cnn nn nar n cnn rr rr 43 VISCOSIMMA iii Aca 43 OPM iii A anna i 26 Spettro Protonico urea iia 89 Spin Measure nn cnn nn rn nena nn nn nn n nn nn nn nn nrnnnn anne mnnrnnnrrnrnnnnnnnns 50 Spin Odia A E 50 Spin Rate rasi aeea ongea in 50 Spinner Inserzione del campione nello spinner 52 SPINNING es ila aerei 44 Spinning sidebandS nana ro canon an n nn n ano n rr rnnnnrrrrrrnnrr 44 Spin spin Effetto dell accoppiamento spin Spin nono 25 Wanna 75 ENT o a la 50 SWeep Amplitude ccoo di dada 50 Sweep Rate nn nn nn cnn nnnn nn cnn nana nn nn nn nnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnnrnnnninnnnna 50 Wii na 75 SIWESFO ld a a ea dd 98 T tabella di edlock icono iii ra ai ioni 59 A a T 74 94 TEMMOCOPPila sciiti detailed 40 Trasformata di FOUFiEer ataia iii 27 94 TUDENMR cintia ei rana Aa A 45 TUNING eiii 40 54 5
2. HaC MISI Li Al Ge I ppm TMS 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Figura 3 6 un illustrazione dei tipici valori di chemical shift di protoni in composto organici Spettro protonico del Benzene 3 5 La struttura dell anello benzenico riportata nella seguente figura Figura 3 7 Anello benzenico Sf SS fa ii Ha e fa Ha C O ES Ha Ha fa st 20 131 ARRUS Versione Italiana Version 002 Spettro protonico del Benzilacetato Tutti i sei protoni denominati Ha possono essere considerati identici Ciascuno di essi legato mediante legame singolo a un carbonio Ciascun atomo di carbonio forma dei legami aromatici con i carboni ad esso adiacente Quindi ciascuno dei sei protoni in un intorno chimico identico e quindi i protoni sono detti chimica mente equivalenti e in questo caso anche magneticamente equivalenti Tutti i sei protoni risuonano esattamente alla stessa frequenza f1 senza essere accoppi ati tra loro Quindi per il benzene puro ci si pu aspettare un singolo segnale La figura sottostante uno spettro di benzene in acetone d6 e mostra che il segnale posto a 7 5 ppm Figura 3 8 Spettro del Benzene TMS Yv 10 5 0 Spettro protonico del Benzilacetato 3 6 Il Benzilacetato C6H5 CH2 O CO CH3 una molecola organica pi compli cata la cui struttura illustrata nella seguente figura Figura 3 9 Benzilacetato 2 ff fa f Fa 7 E fo Hi Hi E O gt
3. Solvent LPower LGain LTime LFilt LPhase Nucl Distance Ref Width RShift 10 0 0 100 100 1 0 ao io ono o paso o 100 1 0 EIA o fino cam 1 i A E etone 8 13 ES E i i 8 si 5 LELLL AE i i E 8 o i i i o E E 200 1 0 ed o 100 1 0 0 0 100 100 1 0 0 o 8 0 0 200 o o 8 3 3 o 8 JE 4l H i E 8 Do e Gia can in 10 lt a 3 al E a 1 0 epele Iele Iele Iele lle e JU F 7 DI i i i SAVE BSMS_FIELD Nucleus NEWSOLVENT DELETE asort LOADSTAN Pose COPY_VALUE po PRINT Si noti che alcuni parametri devono essere ottimizzati dall amministratore del sistema II BSMS pu usare due metodi per cercare il segnale di lock Versione Italiana Version 002 BRUER 59 131 Procedure di base Nel modo di Field il campo magnetico attorno al campione quindi la frequenza di risonanza del deuterio pu essere aggiustata cos che rispetto al solvente la frequenza di lock costante La tabella di edlock contiene le informazioni riguardanti gli aggiustamenti dell in tensit del campo relativi al solvente Questo il modo base di operare Nella modalit di Shift la frequenza stessa del lock pu essere aggiustata in modo da considerare le variazioni del solvente Se si sceglie il modo di Shift questo deve essere espressamente imp
4. 98 Figura 9 7 Spettro Protonico del Colesterolo Acetato_ 100 10 Spettro 13C con disaccoppiamento 103 Figura 10 1 Spettro 13C di Colesterolo acetato Singola scansione Senza Disaccoppiamento _ 105 Figura 10 2 Spettro 13C di Colesterolo acetato 64 Scansioni Senza Disac COPPIAMENTO suicidi bian ta 106 11 Spettro 13C con disaccoppiamento 107 Figura 11 1 Spettro 13C di Colesterolacetato 8 Scansioni con Disaccoppi AMMO dit AA a 110 Figura 11 2 Il Pulse Program zgpg30 112 12 Risoluzione problemi di base 115 Figura 12 1 Posizione dei principali interruttori per Cabinet AQS e BSMS SITI IRR RE CAI A OS 115 GERI Versione Italiana Version 002 Tabelle 1 Introduzione 7 2 Sicurezza 9 3 Teoria di base e Terminologia 13 Tabella 3 1 Tabella di Dati per vari Isotopi 14 Tabella 3 2 Variazioni di Frequenza _ 14 4 Descrizione del Sistema 29 5 Il campione NMR 43 6 Procedure di base 47 Tabella 6 1 La tabella edlock di default 59 7 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda 65 Tabella 7 1 Data Sets con NAME e EXPNO diversi 66 Tabella 7 2 Data Set con diversi NAME EXPNO e PROCNO 67 8 Programmi d impulsi Comandi as ased 83 9 Spettro protonico 89 Tabella 9 1 parametri eda dopo aver impostato il set di parametri stan dard
5. 67 data set grezZ0 nerra aae a 66 dataset elaborato iii iii it ida 66 data Set processati iii 66 be A lila 78 DECIMAI N cocina a ii iii TT Dichiarazione di Conformit 12 ene Versione Italiana Version 002 Index Digitalizzatore accensione e spegnimento 93 DIGMOD a 78 DICTA sin nihil 77 Disaccopiamento disaccoppiamento eteronucleare ent 26 frequenza di disaccoppiamento ne tner renn 108 impulsi di disaccoppiamento nn nnnnnnn 25 potenza di disaccopiamento nn nnnnnos 110 sequenza di disaccopiamento cnn ncnnncnnnnnnnnnnns 113 Disaccoppiamento lirica a 25 Diari 74 A O E a 77 B U PNE AEEA E A 65 B EE S A e a a 77 B E a AN A EAE I ANE ea 77 E Elio Fletromadie ilse nesi N 34 evaporazione dello accio rocio riad ai lei iaia 36 livello oi caia a ana 47 51 misura deliliVello ccoo iaia 51 sensore del livello di elio nne nrnesreenretnrnnnnnnnntnssrennennennnn 35 tasto MS Uria drain canoni anidro 47 temperatura di evaporazione nro nnnnnnnnnnnn 34 torrette dell Eli0 ciic lia id dd 35 F Fa 70 FADC n 77 Fase correzione della fase non nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnns 93 correzione di fase di ordine Zero nenn 95 correzione die fase del primo ordine nono 95 spostamento IITASE
6. N a fi Hi Hi He En a i Versione Italiana Version 002 ARTSA 21 131 Teoria di base e Terminologia Ora possiamo distinguere tre diversi gruppi di protoni che sono stati denominati in modo diverso Per esempio i tre protoni denominati Hb si trovano chiaramente in un intorno atomico diverso da quello dei due protoni denominati Hc tre protoni Hb sono legati al carbonio Cb che a sua volta legato mediante legame singolo all anello benzenico e a un atomo di ossigeno Il terzo gruppo di protoni comprende i cinque protoni Hd dell anello benzenico Figura 3 10 uno spettro protonico del benzilacetato in acetone d6 In questo spettro ci aspettiamo tre segnali che corrispondono ai tre gruppi di protoni Si noti che la posizione dei segnali dell anello benzenico sono stati leggermente spostati da 7 5 ppm Figura 3 8 a circa 7 2 ppm Figura 3 10 protoni dell anello benzenico non sono pi magneticamente equivalenti e sono stati denominati conseguentemente E chiaro dalla Figura 3 10 che il segnale che ha origine dai protoni Hg un multipletto ma questo dettaglio sar trascurato fino al prossimo paragrafo tre picchi protonici mostrati in questa figura hanno in tensit chiaramente diverse L analisi quantitativa dello spettro piuttosto sem plice dal momento che tutti i segnali originano dallo stesso isotopo cio tutti i picchi dipendono in ugual misura dall abbondanza naturale e dalla sensibilit in
7. Queste frequenze sono emesse dai nuclei quando sono eccitatati dall impulso di radiofrequenza valori delle frequenze di risonanza dipendono da due fattori a Tipo di Nucleo Il nucleo di ogni isotopo ha un determinato numero di protoni e neutroni Questa struttura del nucleo determina principalmente il valore della frequenza di risonan za Quindi ogni isotopo presenta una frequenza di risonanza di base nuclei 13C hanno cio una frequenza di risonanza di base diversa se confrontata con quella dell 1H ecc Si noti la sensibile differenza delle frequenze di risonanza di base tra i diversi isotopi come mostrato in Tabella 3 1 Versione Italiana Version 002 GEMINI 13 131 Teoria di base e Terminologia b Intorno Atomico Locale Alla frequenza di risonanza di base si somma l effetto dell intorno atomico in cui si trova un isotopo L esatto valore della frequenza di risonanza di un nucleo 1H in un particolare composto dipende dagli atomi a cui legato e a cui vicino Il nu cleo circondato da elettroni che possono essere considerati come cariche elettriche in movimento a cui sono associati dei campi magnetici Questi elettroni agiscono come una schermatura magnetica per il nucleo L entit di questa scher matura dipende dal preciso intorno atomico L entit delle variazioni del campo lo cale che determinano una variazione della frequenza dipende dall isotopo e dall intensit del campo magnetico in cui posto il ca
8. pippo Si possono ora modificare senza problemi tutti i valori delle shim selezionandoli con la tastiera del BSMS con la certezza di poter impostare i valori precedenti semplicemente rileggendo i valori memorizzati nel file pippo Lettura dei valori delle shim 6 2 2 Funzioni del BSMS 1 Digitare rsh all interno della linea di comando di XWIN NMR Comparir una finestra contenente la lista dei file di shim precedentemente salvati 2 Selezionate pippo oppure il nome voluto Potrebbe essere necessario scorrere la lista dei nomi Sulla tastiera del BSMS ci saranno delle luci che lampeggeranno per alcuni sec ondi Nella linea di comando del XWIN NMR in basso allo schermo comparir il messaggio rsh finished in questo modo saranno ripristinati i vecchi valori L utente deve familiarizzare con il concetto di leggere e scrivere vari tipi di file questo sar molto importante quando dovr gestire differenti set di parametri Se si vuole memorizzare vari set di parametri questi andranno scritti sul disco val ori dei vari parametri saranno salvati all interno di un file Il file avr un nome univoco come da scelta dell utente quindi i vari set di parametri dovranno essere distinguibili gli uni dagli altri Per poterli riutilizzare in futuro basta leggere dal dis co il file desiderato 6 2 3 Solo le funzioni pi significative sono descritte qui di seguito Per maggiori dettagli fare riferimento
9. vicinanze del magnete E nessario Indicare tutte le aree avere un buon sotto influenza del sistema di venti magnete lazione Bancomat e carte Strumenti meccanici sensibili Nastri e dischi di credito p e orologi Tutti questi oggetti si danneggiano se posti in vicinanza del magnete Limite 1 0 mT Azioni preventive nella zona interna 2 2 1 La zona interna si estende dal centro del magnete alla linea 1mT 10 Gauss All interno di questa zona gli oggetti possono improvvisamente essere attirati ver 10 131 QERAS Versione Italiana Version 002 Sicurezza criogenica so il centro del magnete La forza attrattiva del magnete pu variare da scarsa mente percepibile a incontrollabile entro una distanza molto ridotta In nessun caso oggetti ferromagnetici dovranno essere posizionati o mossi all interno di questa zona Le scale per lavorare sul magnete dovranno essere di materiali non magnetici come l alluminio contenitori di elio e azoto usati per mantenere il livello dei liqui di dentro il magnete dovranno essere di materiali non magnetici Piccoli oggetti di acciaio come viti o altro non dovranno essere lasciati sul pavimento vicino al magnete Questi oggetti se attirati nel magnete possono causare seri danni al magnete stesso specialmente se nessun probe inserito Orologi meccanici possono essere danneggiati se indossati nella zona interna Gli orologi digitali possono essere indossati in sicurezza
10. mico aaa 95 A ue ETA E E A E ER 70 ED 26 FIDRES ae 75 FIELD E T E E 50 Finestra di Acquisizione rtn nsrnrtt tette nntnn nnn nn nannten nnen 92 Eluoro LOCK SUl ii aa Aia iaia 37 Fourier Trasformata di ii 27 93 Frequenza della portante nnna ntnenteertnnnnnnnnnnnnaenre eren nnn nnn 15 Frequenza di disaccoppiamento rtn rstnrerrtrrnnrn rrene 107 108 Frequenze trasmesse di Base e di Offset ono nncnnnnnnnnnnnnns 80 Frequenze asSolUte iii aa 17 Frequenze di risonanza nn nn nn cnn nnnnnnnnnnannnnnnnnnns 13 Wie 75 Versione Italiana Version 002 GERI 125 131 Index 126 131 G Gradient shimming nn nn nnnnnnnnnnnrnnnn nn nnnnnnnnnnnn 64 MAS Musica A o 64 H e e e E a a e a a 17 CONVEFSION s cicalino ariani iii rai 18 Host Computer connessione tra Host e AQS ono nnnnnnnnnnnnn 31 Host computer i ici lina iaia 30 APPR ui diari idad listas 32 cablaggio tIDICO ici eil alia 39 modulo di connessione i 33 HPPR 2ii ccnl diana iaia ai 33 I lintensit del segnale ii 15 Impianti metallici ail alal aia 9 Impulso ampiezza siii aa alal 85 fastidio 85 lunghezza O durata ARI ca 85 trasmissione degli impulsi nano no ncnnr nn anna 93 IMPUTEZZO citada dada 43 Impurezze magnetiche i 43 isoto
11. 4 Dopo essersi assicurato che il foro del magnete non tappato rimuovere il campione che pu essere presente attivando il tasto LIFT sulla tastiera del BSMS 5 Spegnere il LIFT 6 Scollegare tutti i cavi BNC dalla base del probe 7 Scollegare la termocoppia la resistenza e ogni altro cavo esempio gradienti PICS 8 Allentare le due viti color oro che assicurano il probe al magnete 9 Abbassare il probe ed estrarlo dal magnete 10 Inserire il nuovo probe ed assicuralo usando le due viti color oro Versione Italiana Version 002 GERI 41 131 Descrizione del Sistema 11 Riconnettere i cavi coassiali la termocoppia la resistenza o la linea di raffred damento o ogni altra connessione 12 Riaccendere la resistenza 42 131 ERIS Versione Italiana Version 002 Il campione NMR Introduzione 5 1 Quando si analizza un campione solido mediante NMR segnali tendono a es sere larghi e non si riesce a risolvere la struttura fine che quella che maggior mente interessa il ricercatore Quindi i campioni solidi sono generalmente sciolti in opportuni solventi prima dell acquisizione Lo stesso vale per campioni liquidi Piccole quantit del riferimento si possono aggiungere in solventi organici Ad ogni modo per ottenere i migliori risultati il campione dovrebbe essere il pi possi bile puro segnali dell impurezze infatti nella migliore delle ipotesi complicano lo spettro e nella peggiore mascherano i segn
12. cambia si sposta una corrente in una bobina speciale bobina Ho posizionata all interno del sistema di shim del magnete viene cambiata e questo ha l effetto di far tornare l intensit del campo magnetico al valore corretto La frequenza del deuterio misurata molte migliaia di volte al secondo In conclusione finch il sistema bloccato locked l utente pu essere sicuro che il campo magnetico mantenuto a un valore costante durante l acquisizione 4 8 Il probe progettato per tenere il campione trasmettere i segnali di radiofrequen za al campione e ricevere la riposta emessa La trasmissione e la ricezione dei segnali raggiunta mediante l utilizzo di apposite bobine RF Versione Italiana Version 002 GEMINI 37 131 Descrizione del Sistema 38 131 Il probe inserito nell estremit inferiore del magnete e sta all interno delle shim a temperature ambiente segnali di eccitazione vengono trasmessi medianti cavi coassiali dagli amplificatori della consolle al probe e lo stesso avviene per il seg nale NMR di ritorno dal campione al ricevitore cavi sono indirizzati mediante i preamplificatori HPPR che sono situati in prossimit della base del magnete preamplificatori sono necessari per aumentare l intensit dei segnali NMR che sono di solito molto deboli Figura 4 5 Campione nel Probe Volume E del campione Bobine probe sono disponibili in diversi tipi e configurazioni
13. i seg nali NMR emessi dai protoni Hg risuonano a tre possibili frequenze e si osserva un tripletto Analogamente l effetto dei protoni He quello di separare i segnali H tre proto ni Ha possono avere quattro diversi stati magnetici Conseguentemente i protoni H risuonano a quattro possibili frequenze cos che il segnale che si origina un quartetto segnali dei protoni dell anello benzenico vengono separati a causa della non equivalenza magnetica e dell accoppiamento spin spin A questo punto per sorge la domanda perch i protoni del CH e del CH dell etilbenzene inter agiscono tra loro mentre i due analoghi gruppi di protoni del benzil acetato no La risposta sta nel numero di legami che separano i due gruppi Nell Etilbenzene Figura 3 11 i due gruppi protonici sono legati a atomi di Carbonio adiacenti e ci si pu attendere che interagiscano sufficientemente lun l altro Nel benzil acetato Figura 3 9 i due atomi di Carbonio C e Cp sono connessi mediante due ulterio ri legami con l Ossigeno e con un altro atomo di Carbonio Conseguentemente i gruppi protonici sono troppo lontani l uno dall altro per mostrare un significativo accoppiamento spin spin GERI Versione Italiana Version 002 Disaccoppiamento Disaccoppiamento 3 8 Si pu rimuovere l effetto delllaccoppiamento spin spin mediante una tecnica chi amata Disaccoppiamento L effetto del disaccoppiamento quello di mascher are la presenza
14. intero spettro orizzontalmente cliccare sul pulsante di scala come mostrato in Figure 9 3 Procedura di Calibrazione 9 9 2 1 Se necessario cliccare Hz ppm in questo modo l asse orizzontale riporter la scala in ppm Versione Italiana Version 002 GERI 97 131 Spettro protonico 2 Fare click su calibrate ll cursore si posizioner automaticamente sullo spettro Muovere il cursore fin sopra il segnale del TMS 3 Premere il pulsante centrale e quando viene richiesta la frequenza del seg nale in ppm inserire zero La scala orizzontala sar cos corretta per mostrare il segnale del TMS a 0 ppm Lo spettro apparir come in Figura 9 7 Figura 9 6 Spettro Protonico del Colesterolo Acetato Sedici scansioni SW 20 66 ppm segnale del TMS calibrato a Oppm La calibrazione automatica dello spettro pu essere effettuata mediante il coman do sref Con questa procedura il programma cerca un segnale nella regione at torno a 0 ppme se lo identifica lo imposta esattamente al valore di 0 ppm Perch la procedura sref funzioni in modo corretto la tabella edlock deve essere stata impostata in modo appropriato ed il solvente corretto deve essere stato scelto nel la routine di lock Impostare la Finestra Spettrale con il comando SW SFO1 9 10 Dalla Figura 9 7 si pu notare come tutti i segnali del Colesterolo Acetato siano nella regione 0 8 ppm non porta quindi nessun vantaggio usare una
15. magneti Bruker sono costituiti da questi circuiti superconduttori Quando il magnete inizialmente installato si inserisce la corrente nella bobina principale Questa operazione chiamata di energizzazione del magnete Una volta energizzato il magnete dovrebbe con tinuare ad operare per molti anni poich la corrente una volta in circolazione continua per sempre L unica manutenzione richiesta dal magnete di assicurarsi che la bobina principale del magnete sia tenuta ad una temperatura sufficiente mente bassa La temperatura di evaporazione dell elio 4K 269 C In condizioni normali a temperature superiori a 4 K l elio un gas A temperature inferiori ai 4 K un liq uido Cos se la bobina tenuta immersa in elio liquido possiamo essere sicuri che la bobina del magnete a 4 K o a temperature inferiori Questo sufficiente mente freddo per assicurare che la bobina del magnete rimanga in condizioni di superconducibilit Comunque l elio liquido evapora e quindi la temperatura della bobina superconduttrice aumenter e ad un certo punto diventer non supercon duttiva Il campo magnetico a causa di questa resistenza nella bobina si romp er improvvisamente accompagnato dalla generazione di calore che porta alla veloce evaporazione di elio e azoto liquido Il locale dove sito il magnete pu di ventare improvvisamente pieno dei gas di evaporazione In questo caso si dice che il magnete
16. per osservare il protone si sciogli il 20 di campione in 80 di solvente deuterato Aggiungere una piccola quantit 0 1 di composto di riferimento tetrametil silano TMS Si faccia attenzione che il segnale del TMS sia inferiore a quello pi intenso del campione o del solvente altrimenti si perde in rapporto seg nale rumore a causa del basso guadagno del ricevitore receiver gain Filtrare la soluzione nel tubo NMR mediante una pipetta Pasteur asciugata in stufa contenente un filtro di lana di vetro Filtrare 0 2cc di solvente attraverso il filtro del tubo NMR La soluzione cos ot tenuta dovrebbe avere un altezza di 3 o 4 cm Chiuder il tubo con un tappino sigillare il tappo con del parafilm per limitare l evaporazione e porre un etichetta in prossimit della cima del tubo Fare at tenzione che tappo parafilm ed etichetta siano concentrici o viceversa ci sar anno problemi a far ruotare il campione L inserimento del campione nello spinner sar discusso nel paragrafo Inserimento del campione nello spin ner a pagina 53 1 Si noti che ci possono essere problemi quando si usa lana di vetro quando si misura T1 GERI Versione Italiana Version 002 Procedure di base Introduzione 6 1 Questo capitolo introduce le operazioni di base che saranno utilizzate ogni volta che si acquisisce un nuovo spettro Sono incluse le operazioni possibili con la tastiera del BSMS sintonia ed accordo del probe di mis
17. sulla barra del menu e dare l invio con il tasto return o enter 8 131 GERI Versione Italiana Version 002 Sicurezza Introduzione 2 1 In termini di sicurezza la presenza di un magnete relativamente potente fa la dif ferenza tra gli spettrometri NMR e gli altri strumenti da laboratorio In fase di alles timento di un laboratorio NMR o di formazione di personale che dovr lavorare nel laboratorio nessun altro aspetto pi significativo Finch ci si attiene alle cor rette procedure lavorare in prossimit di magneti superconduttori totalmente si curo e non ha nessun effetto collaterale dannoso La negligenza pu tuttavia comportare gravi incidenti E importante che le persone che lavorano in prossim it del magnete siano a conoscenza dei rischi potenziali Di particolare impor tanza il fatto che persone dotate di pacemaker o impianti metallici non devono avvicinarsi al magnete Il magnete potenzialmente pericoloso per 1 L enorme forza attrattiva che esercita su oggetti ferromagnetici 2 Il grande contenuto di azoto ed elio liquidi Sicurezza magnetica 2 2 Un campo magnetico circonda il magnete in ogni direzione Questo campo cono sciuto come campo magnetico disperso invisibile e pertanto necessario ap porre la segnaletica di sicurezza nei luoghi appropriati Oggetti fatti di materiale ferromagnetico per esempio ferro acciaio ecc saranno attirati al magnete Se un oggetto ferromag
18. tatto diretto con questi liquidi pu causare congelamento Il responsabile del mag nete dovr controllare regolarmente che i gas di evaporazione siano liberi di uscire dal magnete cio che le valvole di sfogo non siano bloccate Non bisogna cercare di riempire il magnete con elio e azoto se non si stati formati adeguata mente Elio e azoto sono gas non tossici Tuttavia essendo possibile un quench del magnete per il quale la stanza si pu improvvisamente riempire di gas il lo cale deve sempre essere adeguatamente areato Versione Italiana Version 002 GEMINI 11 131 Sicurezza Sicurezza elettrica 2 4 L hardware dello spettrometro non n pi n meno pericoloso di un qualunque hardware elettronico o pneumatico e deve essere trattato di conseguenza Non rimuovere alcuno dei pannelli protettivi dalle varie unit Essi sono fatti per proteggere l utente e possono essere aperti solo da personale di assistenza qualificato Il pannello principale sulla parte posteriore della consolle studiato per essere rimosso usando due viti a svitamento veloce ma ancora questa operazione pu essere fatta solo da personale addestrato Da notare che a meno che non siano disconnesse le ventole di raffreddamento sul pannello posteriore continuano a girare anche se il pannello stato tolto Sicurezza chimica 2 5 Gli utenti devono essere consapevoli di ogni rischio associato ai campioni su cui stanno lavorando composti organici posso
19. 11 Etilbenzene iii iaia alii EAA 23 Figura 3 12 Spettro dell Etilbenzene 24 Figura 3 13 Esperimento di Disaccoppiamento ee 25 Figura 3 14 Spettro dell Etilbenzene con disaccoppiamento omonucleare Gila ie A ili 26 Figura 3 15 Trasformata di Fourier 27 4 Descrizione del Sistema 29 Figura 4 1 Consolle dell operatore consolle e magnete 29 Figura 4 2 Foto del Magnete del Sistema di Shim del Probe e dell HPPR CIO AT EES 32 Figure 4 3 HPPR con tre Moduli e Modulo di Copertura 33 Figura 4 4 Magnete Superconduttore 36 Figura 4 5 Campione nel Probe 38 Figure 4 6 Tipico cablaggio dell HPPR_ nano 39 Figura 4 7 Probe Duale 13C 1H caninos 40 5 Il campione NMR 43 Figura 5 1 Spettro con Spinning Sidebands__ 45 6 Procedure di base 47 Figura 6 1 Tastiera BSMS Versione BOSS 48 Figura 6 2 Inserimento del campione nello spinner 53 Figure 6 3 Esempi di curve di Wobble con differenti valori di Sintonia e Ac COTO ra rp 56 Figura 6 4 Pannello superiore dell HPPR 2_ i 58 Versione Italiana Version 002 GERI 119 131 Figures 120 131 Figura 6 5 Tipico segnale di I0CK 61 Figura 6 6 Pannello del Lock _ i 62 7 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda
20. 65 Figura 7 1 Il Display ed aa 68 Figure 7 2 ll Menu edasp neinni nrni ia nE NANNA NANEN RA a 71 Figure 7 3 Prima Pagina dei Parametri di eda 73 Figura 7 4 Rappresentazione Grafica di alcuni Parametri di Acquisizione TN 76 Figura 7 5 FID distorto a causa di un valore troppo elevato di RG TI Figure 7 6 Relazione tra Potenza e Attenuazione 79 Figura 7 7 Spettro con BF1 600 13 MHz 01 0Hz 80 Figura 7 8 Spettro con BF1 600 13 MHz 01 8 kHz 81 Figura 7 9 Spettro con BF1 600 13 MHz 01 8 kHz SWH 8 4kHz__ 82 Figura 7 10 Interazione di SFO1 BF1 e O1 82 8 Programmi d impulsi Comandi as ased 83 Figure 8 1 Il programma di impulsi 2930 84 Figura 8 2 Il programma di impulsi zg con NS 4 e DS 0 _ 86 9 Spettro protonico 89 Figura 9 1 Finestra di Acquisizione Status del Contatore delle scansioni iaia A iaia eil 92 Figura 9 2 Spettro Protonico del Colesterolo Acetato Sedici scansioni SW 20 00 PPM aiar ai aa 93 Figure 9 3 Alcune utili funzioni della finestra principale di XWN NMR_ 94 Figura 9 4 Esempio di spettro con correzione di fase sotto e senza so pro Lei ito 95 Figura 9 5 Stampa con il TMS picco pi a destra dello spettro 97 Figura 9 6 Spettro Protonico del Colesterolo Acetato
21. CL BRUKER US AVANCE Con SGU per la generazione di frequenza Manuale per Principianti Versione Italiana Version 002 Le informazioni contenute in questo manuale potrebbero es sere modificate senza preavviso BRUKER non si assume alcuna responsabilit per atti compiuti a seguito della lettura di questo manuale BRUKER non si as sume alcuna responsabilit per qualunque errore contenuto nel manuale che possa arrecare danno durante installazioni o in terventi sullo strumento Sono vietate riproduzioni non autoriz zate del contenuto del manuale senza permesso scritto dell editore o traduzioni in altre lingue anche parziali L autore del manuale Eamonn Butler Questo manuale stato tradotto da Anna Minoja ed altri Bruker Biospin Italia S r l Editore Stanley J Niles 6 Giugno 2003 Bruker Biospin GmbH Rheinstetten Germania P N Z316331 DWG Nr 1344002 Sommario Sommario sia a Rd iii 1 INTO UZION Cia la 7 1 1 Sorgenti A riireria renan 7 Versione software e Sintassi dei comandi 8 2 A ian 9 2 1 Introduzione 9 2 2 Sicurezza magnetica i 9 Azioni preventive nella zona interna 10 Azioni preventive nella zona esterna 11 2 3 Sicurezza criogenica 11 2 4 Sicurezza elettrica nret 12 2 5 SICUFEZZA CHIMICA mecoroci ntanindsichosnnctai
22. Figura 7 9 mostra lo spettro ipotetico ridiseg nato riducendo il valore assegnato a SWH da 20 kHz a 8 4 kHz Versione Italiana Version 002 GERI 81 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda Figura 7 9 Spettro con BF1 600 13 MHz 01 8 kHz SWH 8 4kHz lt 8 4kHz gt lt Frequenza lt MHz A A A 600 1422 600 1380 600 1338 600 13 SFO1 BF1 Bisogna notare che il valore di SWH usato per ogni esperimento dipende solo dal campione analizzato e dalla risoluzione spettrale richiesta ll valore di 14 ppm per spettri protonici assicura che la maggior parte dei segnali protonici siano osser vati Tuttavia per uno studio dettagliato di un segnale particolare si possono us are valori molto inferiori di SWH La figura seguente mostra i principi generali di come SFO1 BF1 e O1 interagis cono qui mostrati per un campione diverso Figura 7 10 Interazione di SFO1 BF1 e 01 Il valore di SW determina l ampiezza della finestra spettrale SFO1 BF1 01 i i l I l Ji A Impostando O1 a valori positivi si sposta la lt finestra spettrale a Impostando O1 a valori lt Frequenza gt negativi si sposta la finestra spettrale a frequenze inferiori ol ARTISTA frequenze maggiori lt A MHz SFO1 indica il centro dello spettro Per aiutare a inserire ampiezze spettrali adatte si trova all interno del software una particolare funzione SW SFO1 nel sottomen util
23. Proton 90 Tabella 9 2 Metodi di correzione della fase 96 10 Spettro 13C con disaccoppiamento 103 Tabella 10 1 Parametri eda narran 104 11 Spettro 13C con disaccoppiamento 107 Tabella 11 1 parametri eda dopo aver caricato il set di parametri stan dard C13CPD 108 12 Risoluzione problemi di base 115 Versione Italiana Version 002 GERI 121 131 Tables 122 131 ERASI Versione Italiana Version 002 Indice Symbols PAK ar lc 96 prc NEE A E E E A O 96 Pio 96 O ia IT 96 pren 96 A Abbondanza naturale a ia aiaa 15 ACCO tea 40 54 ACQUA contenuto di ici aia aida 44 ACQUISIZIONE ciccia teen Lei rate dida Rai ieri alri 92 Amplificatoti nia nana sla 31 71 a banda lag iii a alia a abad diia ii 31 A ni 71 licor aa A ad 71 Sl iii tac 31 AO sali al ni 76 AQ MO scien 74 AOS lirici iaia EO iaia lita 30 AUto ShM ia a ia aaa i 51 AUtolock ili eil 51 60 Azoto azoto liquido EEE tddi E 11 azoto evaporazione dell occccccccncccnccnnccnnonoconononcnnnnnnnnnnononnnnnnonononnnnnnnos 36 azoto MUSSO Uli ai alt 40 B Benzenens na 20 Benzilacetato 21 A leale lia lata 70 Bric 79 Bobina di osservazione 38 bobina di osservazione i 38 BOSSA 52 BSMSaic cla 31 Se assento Gal lai 47 BSMS tastiera teianei
24. SW di 20 66 ppm come impostato nel set di parametri PROTON Una SW di 20 66 ppm 98 131 QERUSFA Versione Italiana Version 002 Impostare la Finestra Spettrale con il comando SW SFO1 impostata nei parametri standard per includere un ampia regione di protoni senza dover tenere conto del campione o del solvente Un modo semplice per im postare la SW appropriata quello di espandere lo spettro orizzontalmente per mostrare solo la regione di interesse Premere quindi sul pulsante SW SFO1 che si trova nel sottomenu utilities si ot terranno cos due risultati 1 la SW automaticamente impostata per comprendere la regione visualizzata 2 la frequenza di osservazione SFO1 impostata al centro della regione spet trale Impostare la SW per lo spettro del Colesterolo Acetato 9 10 1 Dato che questo modifica i parametri di acquisizione e consigliabile creare un nuovo esperimento Il modo pi semplice incrementare il valore del parametro EXPNO Procedura 1 digitare edc o new e creare l esperimento come segue NAME protone EXPNO 2 PROCNO 1 Si genera cos un nuovo esperimento protone 2 1 Un rapido controllo ai parametri in eda mostra come i parametri di acquisizione di protone 1 1 sono stati copiati nel nuovo esperimento In questo modo parametri e dati in protone 1 1 non saranno soprascritti 2 Ridurre NS a 1 acquisire un FID usando il comando fp per trasformare e co
25. a 1 se volete risparmi are del tempo all inizio DS Due dummy scan sono un valore standard SW 20 6 ppm Pi che abbondante per acquisizioni al protone Comunque una finestra spettrale grande adatta per analizzare un campione per la prima volta Notate come sia pi semplice modificare il parametro SW invece di SWH NUC1 1H Questo parametro indica il nucleo impostato SFO1 si veda O1P O1P 6 175 ppm Questo parametro definisce il valore della frequenza di trasmissione e quindi il centro dello spettro in ppm Con un O1P alla frequenza di 6 175 ppm ed una finestra spettrale di 20 6 ppm la banda di chemical shift osservata va da 4 125 ppm a 16 475 ppm Pi grande il valore di SW meno critico diventa il valore di O1P BF1 dipende dal sistema Impostato automaticamente D array d1 1 2s L unit di misura predefinita per i delay sono i secondi Digitando 2 si imposter un delay di 2 secondi Nella sequenza zg30 d1 l unico delay utilizzato la sua funzione di permettere al campione di rilas sarsi il suo valore non critico finch non diventa troppo corto Per il campione utilizzato un delay di 1 o 2 secondi corretto P array p1 10 us Il parametro p1 il valore di un impulso di eccitazione a 90 gradi ed un impulso della lunghezza di p1 0 33 l unico impulso utilizzato nella sequenza 2930 consultate il Responsabile dell
26. alada dilata ai int 12 2 6 Certificazione CE 12 Teoria di base e Terminologia 13 3 1 INTFOdUZIONE ici iaia 13 a Tipo di Nucleo iiiiiia 13 b Intorno Atomico Locale 14 3 2 Analisi NMR del Cloroformio 16 3 3 Composti di Riferimento Hertz ppm 17 3 4 NMR del protone Chemical shift 19 3 5 Spettro protonico del Benzene 20 3 6 Spettro protonico del Benzilacetato 21 3 7 Spettro Protonico dell Etilbenzene con Accoppiamenti Spin Spin 22 3 8 Disaccoppiamento 25 3 9 FID e Spettro arenan aa Aa Aar alada 26 4 Descrizione del Sistema 29 4 1 Introduzione coincida decada 29 4 2 Consolle dell operatore e connessioni 30 4 3 Consolle eco i rale ire 30 4 4 Connessione tra Host Computer e AQS 31 4 5 Magnete Sistema di Shim HPPR e Probe 32 4 6 Magnete e Dewar del Magnete 34 Foro bore a Temperatura Ambiente 35 Contenitore dell Elio 35 Contenitore dell azoto nn 36 4 7 Introduzione al Sistema di Lock 37 4 8 O 37 Versione Italiana Version 002 RUKER iii IOSPIN Content
27. attualmente inserito nel magnete stao definito mediante il comando ed head Nella tabella seguente potrete notare come il comando getprosol utilizzato per impostare i valori dei parametri come p1 e pl1 Digitate eda ed osservate che i parametri di acquisizione siano elencati come nella tabella seguente Analizzeremo solo i parametri pi importanti Molti parametri dipendono dalla configurazione del sistema non esiste pertanto un va lore ideale per un set di parametri standard Potete utilizzare indifferentemente as o ased per controllare che i parametri siano stati impostati correttamente Tabella 9 1 parametri eda dopo aver impostato il set di parametri standard Proton Parametro Valore Commento PULPROG zg30 Per una descrizione di questa sequenza si veda il paragrafo 8 2 TD 65536 non critico 64K piuttosto largo Potete ridurlo a 16K punti se volete risparmiare tempo se il FID decade in modo sufficientemente veloce o se il parametro d1 sufficientemente lungo RUKER i i i 90 131 QERUSFA Versione Italiana Version 002 Tabella 9 1 Caricare un set di parametri standard parametri eda dopo aver impostato il set di parametri standard Proton Parametro Valore Commento NS 16 Finch gli altri parametri non sono stati ottimizzati non c molto da dire su un elevato numero di scansioni Potete ridurlo
28. dell aria compressa quella di fare ruotare il campione La ro tazione del campione serve per mediare alcune disomogeneit del campo mag netico che potrebbe esserci all interno del magnete Si noti che solitamente non si fa ruotare il campione quando si usano delle sonde di misura inverse Impostare il valore di rotazione usando la procedura seguente Versione Italiana Version 002 BRUKER 53 131 Procedure di base 1 Premere il tasto SPIN RATE sulla tastiera del BSMS 2 Girare la manopola nera della tastiera per impostare la velocit 3 Per iniziare la rotazione premere il tasto SPIN Le velocit suggerite di rotazione sono 20 Hz per le sonde da 5 mm 12 Hz per le sonde da 10 mm Sintonia ed accordo dell impedenza della testa di misura probe 6 6 54 131 La sensibilit di ogni probe varia con la frequenza del segnale trasmesso ed es iste un punto in cui il probe maggiormente sensibile per tale frequenza Inoltre questa frequenza pu essere aggiustata per un certo valore agendo sul conden satore di sintonia posizionato all interno del probe La sintonia implica che il cir cuito elettrico del probe sia ottimizzabile per la frequenza di trasmissione pi significativa SFO1 SFO2 etc Ogni bobina all interno del probe sar sintonizzata ed accordata separatamente Quando si cambia il probe o si modifica significata mene la frequenza di trasmissione potrebbe essere necessario sintonizzare nuo vamente il
29. dello spettro 93 9 7 Elaborazione base Trasformata di Fourier 94 9 8 Correzione della Fase 95 9 9 Calibrazione dello Spettro 96 Procedura per espandere lo spettro orizzontalmente 97 Procedura di Calibrazione 97 9 10 Impostare la Finestra Spettrale con il comando SW SFO1 98 Impostare la SW per lo spettro del Colesterolo Acetato 99 9 11 Aumentare il numero delle scansioni 100 10 Spettro 13C con disaccoppiamento 103 10 1 INTFOGUZIONE vivi dto 103 10 2 Procedura capanna nia iano 103 11 Spettro 13C con disaccoppiamento 107 11 1 Introduzione iran 107 11 2 Procedura x 107 11 3 Determinare la frequenza di disaccoppiamento 108 11 4 Determinazione dei parametri di disaccoppiamento 110 11 5 Il pulse program Zgpg3BO niina 111 12 Risoluzione problemi di base 115 12 1 A 115 12 2 Accensione e Spegnimento dello Spettrometro 115 12 3 Spegnimento dello Spettrometro 116 12 4 Accensione dello Spettrometero 116 Attivazione di XWIN NMR da Sistemi Windows 117 Attivazione di XWIN NMR da Sistemi SGI IRIX_ 117 PEQUES sia a deere 119 TADO Lilli 121 indice ii is 123 Versione Italiana Version 002 Contents vi Versione Itali
30. didseerdie inis oeie ddd dsearan eisie 30 C A O lea 47 misuratore di profondit del nnn nee nne 52 Versione Italiana Version 002 GEMINI 123 131 Index 124 131 rotazione del ii 50 temperatura del asgaliaedo t 40 CAMPO ii 50 Campo omogeneit di arica ir ii a ie 62 Canali Logici cnn nn aiaei aiina diadani aiiin aiii 70 Canali logici E E EEE E EA E TE EA A A AE N E E A 70 NUC Mor n 70 COUN aaea a A A A a a 30 Certificazione CE meus caia 12 Chemical shiften i ei 19 Chimicamente equivalenti trn rrnerteetrttntnnnnnnnenneetennen nennen 21 Comandi e E E ala 90 Apice 93 AS 86 CA A O 86 Oda e E RR RS AR RI A I ILE 65 69 73 OS tna oe iii 65 68 79 A O ANO 67 AAA a a a e N ie N a a 90 OS rl 65 TOA GR OR AA 93 94 Getprosol v i iaia elia aa 90 IGO n 69 73 GSi iaia ear EE 69 73 PP O E E E 58 60 A a iaa dana rada 60 STORIE rn 73 89 PAN aria ela 68 e O A TA 49 WDC D aaa a aida 58 Wil 49 ZO 84 SZO ia 69 73 finestra OA inicia a ela 72 Composite Pulse Decoupling mn nennen 107 Connessione Ethernet i 30 COMNESssioni fallite 30 Consolle lied 29 A E A ai aa e E 107 Creazione di un nuovo data Set 67 D Dan a ii aa ali aiar o 74 dle no 85 Data Set iii diia alii ia 65 creazione di un nuovo data SEt
31. distinguere questi due campioni creando due diversi nomi NAME del data set come grama e gramb Si potrebbe voler analizzare e acquisire FID da ciascun campione in condizioni diverse per esempio si vuole analizzare ogni campione a tre tempera ture diverse Tx Ty and Tz Di conseguenza si distingue ogni esperimento asseg nando a ciascuno uno specifico EXPNO Questo porta a un totale di sei data sets come indicato in tabella A questo punto ogni data set grezzo identificato univocamente dai parametri NAME e EXPNO Tabella 7 1 Data Sets con NAME e EXPNO diversi NAME EXPNO COMMENTO grama 1 Tx grama 2 Ty grama 3 TZ gramb 1 Tx gramb 2 Ty gramb 3 TZ L utente pu ora decidere di processare ogni data set grezzo in due modi diver si per esempio con o senza moltiplicazione esponenziale Per distinguere tra i GERI Versione Italiana Version 002 Creazione di un Data Set due metodi di elaborazione e i corrispondenti spettri si usa il parametro PROC NO Ogni data set grezzo viene processato due volte e quindi si usano due PROCNO Adesso ci sono in totale dodici data set processati che possono essere rappre sentati da quelli in tabella 7 2 Tabella 7 2 Data Set con diversi NAME EXPNO e PROCNO NAME EXPNO PROCNO COMMENTI grama 1 1 Temperatura Tx senza moltiplicazione esponenziale grama 1 2 Temperatur
32. e di graffi Non stro finare i tubi con scovolini per tubi NMR Si ricordi che tubi NMR nuovi non sono necessariamente puliti tubi devono essere puliti con acetone o con acqua distil lata Detersivo liquido pu essere utilizzato purch il tubo sia sciacquato nel giro di pochi minuti per evitare che aderisca al tubo tubi possono essere puliti con ul trasuono utilizzando un opportuna soluzione Se nonostante tutto il tubo ancora sporco allora bisogna immergerlo in ACQUA REGIA fino ad un massimo di due giorni e quindi agitarlo bene prima di asciugarlo tubi asciutti possono essere las ciati in stufa ma ad una temperatura non superiore ai 100 C in quanto si potreb bero distorcere e quindi poi girerebbero in modo non appropriato Il modo migliore per asciugare il tubo mediante azoto gas filtrato Versione Italiana Version 002 BRUKER 45 131 Il campione NMR Manipolazione del campione 5 4 46 131 E buona norma filtrare le soluzioni NMR direttamente nel tubo in modo da evitare polvere o altri inquinanti Possibili filtri sono cotone lana lana di vetro o celite Si noti che il tubo con il campione dovrebbe essere tenuto dall alto Una procedura tipica per la preparazione del campione NMR la seguente 1 Per un campione solido da misurare in un tubo da 5mm sciogliere fino a 20 mg di campione in circa 0 6cc del solvente scelto per tubo da 10mm sciogliere 80mg in 2 5cc Tipicamente per un campione liquido
33. essere specificato o digitando un oppor tuno valore nella tabella dei livelli di potenza nel menu eda o esplicitandolo nella linea di comando di XWIN NMR Dovrebbe inoltre essere menzionato che quando non specificato il canale per un particolare impulso l impulso automaticamente inviato al canale di osser vazione cio al canale F1 La linea 8 assegna anche la fase dell impulso con il comando ph1 Linea 9 go 2 ph31 questo singolo comando determina una serie di processi tra cui l apertura del ricevitore e la digitalizzazione del segnale NMR Quando l ac quisizione stata completata cio dopo che TD punti sono stati digitalizzati il pro gramma torna indietro alla riga con l etichetta 2 cio la linea 7 L intero processo ripetuto NS volte assumendo DS 0 Se NS 8 le linee 7 8 9 saranno ripetute 8 volte La linea 9 inoltre indica la fase del ricevitore con il comando ph31 La necessit dell intervallo di tempo d1 nella linea 7 dovrebbe essere ora pi chiara L eccitazione di un segnale NMR con una serie di impulsi e un intervallo di tempo insufficiente tra di essi fa si che si saturi In altre parole assorbe pi energia di quella che pu rilasciare Per dare al campione il tempo di rilasciare pi ener gia l intervallo di tempo d1 precede ogni impulso consentendo al campione di avere tempo sufficiente per rilassarsi Linea 10 wr 0 Questo comando d istruzione al computer di memorizzare n
34. fase Click su cursore Permette di scegliere il segnale di riferimento su cui appli care la correzione di fase Questa un alternativa all usare il segnale pi intenso come riferimento Calibrazione dello Spettro 96 131 9 9 E convenzione nella tecnica NMR calibrare lo spettro impostando il segnale del TMS a 0 ppm Prima di fare ci conveniente espandere lo spettro orizzontal mente nella regione attorno al segnale del TMS ci utile per puntare esatta mente al picco in esame Il segnale del TMS pu essere facilmente identificato in quanto quello alla frequenza inferiore estrema destra nello spettro Versione Italiana Version 002 Calibrazione dello Spettro Figura 9 5 Stampa con il TMS picco pi a destra dello spettro Procedura per espandere lo spettro orizzontalmente 9 9 1 1 Assicurarsi di essere nella finestra principale di XWIN NMR 2 Posizionare il cursore del mouse nella finestra spettrale e premere il pulsante sinistro Il cursore si posizioner automaticamente sullo spettro 3 Posizionare il cursore del mouse ad un estremo della regione spettrale di inter esse e premere il pulsante centrale 4 Posizionare il cursore del mouse all altro estremo della regione spettrale di in teresse e premere il pulsante centrale La regione di interesse sar espansa automaticamentesu tutto lo schermo Premere il pulsante sinistro per rilasciare il cursore 5 Per vedere l
35. omonucleare H i ppm 7 7 2 H TMS v ppm 2 7 2 6 L esperimento appena descritto un esempio di disaccoppiamento omonucleare in quanto lo stesso nucleo protone in questo caso osservato e disaccoppiato Si parla di disaccoppiamento eteronucleare quando l isotopo osservato diverso da quello disaccoppiato Nel capitolo Spettro 13C con disaccoppiamento a pa gina 103 di questo manuale descritto un esperimento di disaccoppiamento eteronucleare dove si osserva 13C e si disaccoppia 1H Spettrometri AVANCE con SGU consentono di eseguire esperimenti molto com plicati a seconda del numero di canali installati Uno spettro con quattro canali pu essere utilizzato per acquisire un nucleo e disaccoppiarne altri tre Avendo fino a 8 canali indipendenti il ventaglio dei possibili esperimenti si apre a dismisu ra L utente deve sapere che al momento il fattore limitante non la generazione degli impulsi di radiofrequenza per eccitare e disaccoppiare ma il trasferimento di questi impulsi al campione attraverso il probe e anche attraverso i preamplifica tori Il tipo di esperimento viene impostato definendo i parametri nel men edasp che sar descritto nel paragrafo Parametri dello Spettrometro edasp a pag ina 68 3 9 segnali emessi dei nuclei eccitati nel campione sono ricevuti dallo spettrometro e trasformati mediante Trasformata di Fourier dati si dice sono acquisiti Bisogna distinguere tra d
36. probe Per i lavori di routine con solventi organici e sonde selettive le frequenze di trasmissione difficilmente variano di molto Da questo punto in poi una volta che il probe stato sintonizzato delle piccole variazioni di frequenza non necessitano di una successiva verifica della sintonia Di solito la frequenza di trasmissione pu richiedere variazioni fino a 100 KHz senza dover sintonizzare nuovamente il probe Comunque per le sonde multinu cleari le frequenza di trasmissione possono variare moltissimo fra un nucleo e l al tro quindi necessario sempre sintonizzare il probe ogni volta che si seleziona un nucleo diverso Quando si sintonizza il probe si deve anche accordare L accordo serve per far si che la massima potenza applicata al probe possa es sere ritrasmessa dalla bobina che si trova nella parte superiore Questo permette di minimizzare la potenza riflessa dal probe al trasmettitore potenza persa Tutti gli amplificatori Bruker BioSpin sono progettati per funzionare ad impedenza di uscita di 50 Ohms Per questo il miglior accordo si ottiene quando il probe e i rela tivi cavi di collegamento sono anch essi 50 Ohms Sintonia ed accordo possono essere eseguite osservando La curva di wobble nella finestra di acquisizione di XWIN NMR oppure I led verdi e rossi sul pannello superiore del modulo HPPR GERI Versione Italiana Version 002 Sintonia ed accordo dell impedenza della testa di misura probe Entrambi i meto
37. trinseca alla tecnica NMR Perci l area sottostante i picchi del benzene del CH2 e del CH3 dovrebbero essere in rapporto 5 2 3 in accordo con il numero di protoni Figura 3 10 Spettro Protonico del Benzilacetato ppm 50 48 H TMS LOL IT ppm 18 16 7 6 5 4 3 2 1 0 Spettro Protonico dell Etilbenzene con Accoppiamenti Spin Spin 3 7 22 131 La descrizione degli spettri protonici NMR stata fin qui molto semplificata in quanto tutti i segnali con l eccezione di quelli derivato dall anello benzenico del benzilacetato erano singoletti La struttura del composto organico Etilbenzene e i GERI Versione Italiana Version 002 Spettro Protonico dell Etilbenzene con Accoppiamenti Spin Spin corrispondenti spettro protonici sono illustrati in Figura 3 11 e in Figura 3 12 ris pettivamente Come prima i protoni sono stati denominati secondo tre diversi gruppi corrispondenti ai tre intorni atomici La differenza pi ovvia tra i segnali di questo spettro e quelli del benzilacetato lo splitting in multipletti Il segnale emesso dai protoni CH3 un tripletto e il seg nale emesso dai protoni CH2 un quartetto Si notino anche che le posizioni dei segnali sono diverse protoni del CH3 nel benzilacetato emettono un segnale a 1 85 ppm mentre i corrispondenti protoni CH3 nell etilbenzene emettono il seg nale tripletto a 1 25 ppm Questo non molto sorprendente perch i due gruppi CH3 stanno in diversi intorni chi
38. 0 9178393 MHz F2 Processing parameters SI 16384 WDW EM LB 3 00 Hz si nc AAA ARR a Aaa ie a I AA 200 180 160 140 120 100 80 60 _ 40 Il ripetersi delle scansioni ha certamente incrementato enormemente il numero dei picchi significativi ma lo spettro presenta ancora troppo rumore L utente pu anche ottimizzare la SW e la frequenza di osservazione usando la funzione SW SFO1 descritta nel paragrafo Impostare la Finestra Spettrale con il comando SW SFO1 a pagina 98 Il passo successivo non aumentare il numero di scansioni ma piuttosto disac coppiare segnali 13C dai protoni Questo verr descritto nel capitolo successivo 106 131 ETS Versione Italiana Version 002 Spettro 13C con disaccoppiamento Introduzione 11 1 La seguente descrizione fa riferimento al set di parametro standard denominato C13CPD che serve proprio ad acquisire carbonio disaccoppiato da protone usan do una sequenza CPD Composite Pulse Decoupling disaccoppiamento medi ante impulsi composti Il canale 1 usato per trasmettere un impulso di osservazione del carbonio mentre il disaccoppiamento del protone trasmesso sul secondo canale durante e dopo l acquisizione Una caratteristica della se quenza di impulsi quella di impostare la potenza del disaccoppiamento prima dell impulso di osservazione dettagli sono riportati nel pulse program zgpg30 che sar descritta nel paragrafo II pulse program zgpg30 a pagina 111 principali p
39. 0 Ked scanio 100 Vi PR IZ A sm BLAX 300 500 BLAX 300 500 _y_Trrk Accensione e Spegnimento dello Spettrometro 12 2 In generale la consolle le sottounit e l host computer sono lasciate accese anche se non sono in corso esperimenti Se si devono sostituire unit individuali Versione Italiana Version 002 WEE 115 131 Risoluzione problemi di base all interno del rack AQS o BSMS sufficiente spegnere queste sottounit Non necessario spegnere completamente tutto il sistema Bisogna tenere presente che 1 La CCU10 si accende spegne automaticamente ogniqualvolta il rack AQS viene acceso spento 2 La CPU del BSMS e la tastiera sono automaticamente accesi spenti ogni qualvolta il rack del BSMS viene acceso spento Spegnimento dello Spettrometro 12 3 Per spegnere l intero spettrometro vanno effettuati i seguenti passaggi 1 2 Chiudere XWIN NMR Spegnere la CCU10 mediante il comando init 5 e spegnere AQS Su un sistema basato su PC cliccare sull icona dell Hyperterminal e digitare il co mando init Per sistemi basati su computer SGI 02 aprire una sessione Unix e digitare il comando init 3 Spegnimento di ogni unit interna come il BSMS amplificatori VTU eccetera 4 Spegnimento del cabinet principale usando l interuttore rosso sul pannello frontale Accensione dello Spettrometero 12 4 Procedura 116 131 Per accendere l intero spettrom
40. 3 indica che il pulse program ap proprialo per un esperimento monodimensionale con disaccoppiamento e la riga 4 ricorda all utente che invece di utilizzare un impulso di eccitazione di 90 gradi Il pulse program usa un impulso di 30 gradi Riga 5 Questa riga non un commento ma consente di includere nel testo del pulse pro gram comandi definiti in file separati Righe 6 e 7 due delay d11 e d12 il cui significato spiegato alla fine del pulse program sono impostati 30 ms and 20 ys rispettivamente Il set di parametri standard C13CPD usa questi stessi identici valori Riga 8 1 ze Questa riga non preceduta da un punto e virgola ed effettivamente la prima riga del programma Tutte le righe del pulse program possono essere numerate in modo da rendere pi semplice definire i loop e questa riga naturalmente numer ata come 1 Il comando ze consente di sovrascrivere qualsiasi dato in memoria con i dati acquisiti con la prima scansione dati acquisiti nelle scansioni succes sive si sommano a quelli della prima gi memorizzati Il comando ze in pratica libera la memoria per i dati che saranno acquisiti durante l esperimento Righa 9 d12 pl13 f2 Questa riga imposta il livello di potenza per disaccoppiare sul secondo canale F2 uguale al valore definiti da pl13 Il delay intervallo di tempo d12 assicura che ci sia abbastanza tempo per impostare il livello di potenza prima che il disaccoppi a
41. 5 Versione Italiana Version 002 GERI 129 131 Index 130 131 U Unit di Temperatura Variabile 30 40 V Valori delle Shim Salvataggio del ocio anali 49 A TR alli rana ian dica 31 40 W WBSrai ui eni 56 WBS Witt adi A a E 56 A ella 55 WOBBE SW iaa ii 58 Z A AN 84 ABTS Versione Italiana Version 002 Versione Italiana Versi En a Version 002 RUE 131 131
42. Home conf instr lt instrument name gt nuclei Utilizzatori pi esperi possono voler modificare questo file per personalizzare la lista dei nuclei disponibili Si noti che un effetto immediato del cambiamento del tipo di nucleo nel canale logico che la frequenza base nella colonna delle frequenze viene aggiornato au tomaticamente 3 FCU Le opportune connessioni alla FCU sono fatte automaticamente e si consiglia agli utenti inesperti di non modificare queste connessioni di default GERI Versione Italiana Version 002 Parametri dello Spettrometro edasp Figure 7 2 Il Menu edasp dopo aver caricato il set di parametri standard PPROTON Inserisci gli offset Clicca qui per vedere la lista Clicca sui vari settori per preparare di tutti i nuclei disponibli l esperimento l x OFSHI BF2 SFOZ BF SFO3 BF4 BFS SFOS BF6 Esci salvando ORELI X BB31P_2HS 1H X BBI9F_2H5 19F Sel MHz NUC3 off NUCA MHz Fa off MHz NUC5 Hz off MHz NUC6 2H 20 0W Hz off 24 mov Preferred output for 19F 2 19F SWITCH FI FZ SWITCH F1 F3 DEFAULT CANCEL PARAM Inserisci i percorsi di default Esci senza salvare 4 Amplificatori Ancora una volta le connessioni per l opportuno amplificatore sono fatte auto maticamente L uscita degli amplificatori sono facilmente riconoscibili e sono posti sul lato destro degli ampli
43. Introduzione al Sistema di Lock Introduzione al Sistema di Lock 4 7 Probes Questo paragrafo stato inserito per dare all utente un introduzione sui principi di funzionamento del sistema di lock Aspetti pratici quali come eseguire il lock del campione saranno trattati nel paragrafo Fare il Lock sul campione a pagina 58 Lo scopo del sistema di lock di assicurare che l intensit del campo magnetico che circonda il campione non cambi durante l esperimento o che il campo mag netico non venga influenzato da disturbi esterni L analisi NMR comporta la misu ra esatta della frequenza del segnale emesso dal campione Le frequenze di questi segnali sono direttamente proporzionali all intensit del campo magnetico cio se l intensit del campo cambia cambia anche la frequenza emessa Perci l utente deve essere sicuro che l intensit del campo magnetico sia sempre man tenuta costante allo stesso valore e ci significa bloccare o fare il lock sul cam pione Il sistema di lock essenzialmente uno spettrometro separato progettato per osservare il deuterio Va menzionato il fatto che i segnali emessi dal deuterio sono generalmente lontani dalle frequenze di interesse In ogni caso se la fre quenza del deuterio non fosse disponibile per il lock allora su pu usare il lock sul fluoro 19F Poich il lock sul deuterio di gran lunga il pi diffuso parleremo solo di questo Il lettore deve per sapere che i principi di
44. La dimensione del probe data in rapporto alla dimensione del tubo del campione che pu ospitare pi co muni sono da 5 e 10 mm A seconda del tipo di esperimento si usano diversi tipi di probe Per osservare nuclei specifici come ad esempio 13C si utilizzano probe selettivi mentre i probe multinucleari X BB o a banda larga vengono usati per analizzare un ampio intervallo di nuclei probe si differenziano fisicamente l uno dall altro in base al numero e al tipo di bobina interna Inoltre il diametro es terno e la lunghezza del probe dipendono dalle dimensioni del magnete con foro largo o standard lunghezze differenti dalla base al centro del campo magnetico a seconda dell intensit del campo I segnali entrano e escono dalle bobine dei probe mediante dei connettori che sono etichettati con chiarezza e posizionati alla base del probe stesso Lo stesso cavo usato sia per portare il segnale al probe che per riceverlo Ogni probe ha una bobina interna o bobina di osservazione Questa posizionata il pi pos sibile vicino al volume del campione al fine di massimizzarne la sensibilit Il cod ice a colori del connettore BNC collegato sulla bobina interna segue una semplice regola e ha sempre lo stesso colore della fascia rettangolare posizionata diretta GERI Versione Italiana Version 002 Probes mente sopra il connettore BNC La figura seguente mostra l etichettatura di un probe multinucleare In questo caso la bobina
45. N dar automaticamente a questo parametro il valore di 6us che adatto per tutti gli esperimenti descritti in questo manuale PL array Power Level in dB lista dei livelli di potenza in dB Cliccando qui compare una lista di 32 livelli di potenza chiamati PLO PL31 Cias cuno di questi 32 livelli possono essere inseriti separatamente e incorporati in un pulse program Pi alto il valore assegnato ad un parametro PL pi alta l attenu azione e di conseguenza pi debole il segnale L effetto di ciascun livello di po tenza dipende dal tipo di amplificatori usato quindi lo stesso valore di PL ha effetti molto differenti se applicato a amplificatori diversi I livelli di potenza possono essere assegnati esplicitamente ad ognuno degli otto canali all interno di un pulse program Se un livello di potenza non esplicita mente indicato PLx assumer il valore di default per il canale Fx Per quanto ri guarda questo manuale il valore di potenza principale pl1 che usato per attenuare sul canale di osservazione F1 Come con tutte le liste spesso conveniente inserire i valori di PL esplicitamente dalla linea di comando di XWIN NMR piuttosto che visualizzare la lista dalla tabel la di eda Ancora una volta i livelli di potenza appaiono in eda in maiuscolo ma devono essere inseriti in minuscolo in un pulse program o digitati in minuscolo direttamente nella linea di comando di XWIN NMR La potenza massi
46. O Create un nuovo esperimento Digitate edc e create l esperimento seguente NAME protone Versione Italiana Version 002 BRUKER 89 131 Spettro protonico EXPNO 1 PROCNO 1 Cliccare su Save Caricare un set di parametri standard 9 3 Caricate il set di parametri standard chiamato PROTON digitando rpar proton Quando richiesto fare clic su acqu e proc e poi su copy Quando viene impostato il set di parametri PROTON indipendentemente dalla precedente impostazione edasp sar ora impostato sull osservazione del pro tone Potrete verificare ci semplicemente digitando edasp Tutti gli altri nuclei saran no off Il comando getprosol 9 3 1 La tabella prosol a cui si pu accedere mediante il comando edprosol una lista di parametri specifici del probe e dello spettrometro Parametri come la lung hezza dell impulso a 90 gradi o di disaccoppiamenti associati ai rispettivi livelli di potenza possono essere salvati per ogni nucleo su ogni canale disponibile Se il file prosol stato impostato correttamente l utente potr utilizzare questi parametri in modo semplice valori salvati possono essere impostati con il co mando getprosol Il programma riconosce quale nucleo stato selezionato in un determinato canale e imposta i parametri appropriati E importante ricordare che il comando prosol funzioner correttamente solo se il probe
47. Va da s che le precauzioni per la zona esterna che verranno discusse ora devono essere rispettate anche per la zona interna Azioni preventive nella zona esterna 2 2 2 La zona esterna si estende dalla linea 1mT a 0 3mT Il campo magnetico non bloccato da muri pavimenti o soffitti e la zona esterna pu anche comprendere stanze attigue Il campo magnetico pu cancellare informazioni salvate su nastri o dischi magnetici Carte di credito tesserini magnetici o qualunque oggetto conte nente una striscia magnetica pu essere danneggiato CD non possono essere danneggiati sebbene i CD drive contengano parti magnetiche Le bombole di ac ciaio con gas pressurizzato dovranno essere posizionate ben oltre la zona ester na preferibilmente al di fuori della stanza del magnete e devono sempre essere adeguatamente fissate al muro Gli schermi a colori dei monitor dei computer pos sono venire distorti se posizionati troppo vicino al magnete sebbene danni per manenti siano improbabili Oltre la zona esterna non sar necessaria alcuna precauzione relativa al campo magnetico Sicurezza criogenica 2 3 Il magnete contiene una quantit relativamente elevata di elio e azoto liquidi Questi liquidi chiamati criogeni servono a mantenere l interno del magnete a una temperatura molto bassa A causa delle basse temperature si dovranno sempre usare guanti indumenti o camici a manica lunga e dispositivi di sicurezza manipolando i criogeni Il con
48. a tre parametri SFO1 BF1 e O1 sono legati dalla relazi one SFO1 BF1 01 Per tutti gli otto canali logici esistono i parametri corrispondenti cos per il canale X il nucleo prescelto NUCX e SFOX BFX OX Bisogna comprendere l importanza di questi parametri che saranno ora illustrati con esempi pratici Spiegazione Numerica delle Frequenze Trasmesse di Base e di Offset 7 5 1 lt MH 80 131 Nel caso di uno spettrometro 600 MHz usato per osservare l idrogeno lo spettrometro configurato per avere il BF1 a 600 13 MHz Uno spettrometro a 500 MHz ha di solito BF1 a 500 13 MHz un 400 MHz a BF1 a 400 13 etc Se O1 zero allora SFO1 600 13 0 600 13 MHz Quindi il centro dello spettro si trova a 600 13 MHz Se SWH di 20 kHz lo spettro sar simile a quello qui sotto Figura 7 7 Spettro con BF1 600 13 MHz 01 0Hz BF1 600 13 e 20kHz _ 01 0 mp filtrati Segnali filtrati gt UUU lt Frequenza z E T 600 14 600 13 600 12 BF1 SFO1 chiaro dal nostro spettro ipotetico che tutti i segnali NMR si trovano verso l es tremit ad alte frequenze della finestra spettrale Inoltre possibile che alcuni segnali si trovino oltre 600 14 MHz e poich questi segnali sono esterni alla finestra spettrale possono essere stati filtrati e quindi non osservati Per control lare la presenza di questi segnali ci sono due possibilit a La finestra spettrale pu essere aumentata per incl
49. a Tx con moltiplicazione esponenziale grama 2 1 Temperatura Ty senza moltiplicazione esponenziale grama 2 2 Temperatura Ty con moltiplicazione esponenziale grama 3 1 Temperatura Tz senza moltiplicazione esponenziale grama 3 2 Temperatura Tz con moltiplicazione esponenziale gramb 1 1 Temperatura Tx senza moltiplicazione esponenziale gramb 1 2 Temperatura Tx con moltiplicazione esponenziale gramb 2 1 Temperatura Ty senza moltiplicazione esponenziale gramb 2 2 Temperatura Ty con moltiplicazione esponenziale gramb 3 1 Temperatura Tz senza moltiplicazione esponenziale gramb 3 2 Temperatura Tz con moltiplicazione esponenziale NOTA usando i parametri NAME EXPNO e PROCNO non esistono due data set che corrispondono alla stessa descrizione cio sono definiti in modo univoco Creazione di un Data Set 7 3 Ogni data set acquisito dallo spettrometro salvato automaticamente nel cosid detto current attuale data set dettagli del attuale data set si trovano sempre nell angolo alto a sinistra del display di XWIN NMR Prima di acquisire un nuovo esperimento bisogna sempre creare un nuovo data set in cui verr salvato Questo evita di sovrascrivere il data set esistente Il termine creazione di un nuovo data set pu essere un po equivoco Fino a questo punto non stato ancora acquisito alcuno spettro Tuttavia creando il nuovo data set il computer prepara il set di file dove l esperimento successivo ver r conservato Per
50. a banda larga quella interna Figure 4 6 Tipico cablaggio dell HPPR Protone Amplificatore xX Amplificatore BSMS 2H Trasmettitore Probe Duale 13C 1H 4 8 1 Prendiamo come esempio una testa di misura tipica il probe duale 13C 1H Come suggerisce il nome questo probe progettato per utenti che sono interes sati ad analizzare i campioni mediante idrogeno e carbonio Versione Italiana Version 002 BRUKER 39 131 Descrizione del Sistema 40 131 Il BNC di sinistra etichettato 2H vedi Figura 4 7 ed usato per il segnale di lock Gli altri due connettori sono per i segnali 1H e 13C e sono etichettati di con seguenza cavi che escono dai connettori BNC sono connessi all HPPR posiz ionato alla base del magnete Figura 4 7 Probe Duale 9C H Connesso al modulo 1H dell HPPR Connesso al modulo Connesso al modulo X BB dell HPPR Nei sistemi NMR moderni i probe sono progettati per consentire di avere la tem peratura del campione NMR controllata La temperatura del campione viene cont rollata mediante una resistenza che opera su un flusso di aria o azoto Una termocoppia inoltre inserita e serve come termometro per leggere la temper atura del campione Tutti questi dispositivi sono collegati alla base del probe e sono facilmente accessibili L unit di temperatura variabile VTU verifica cos tantemente la lettura della termocoppia ed opera gli aggius
51. a del segnale che potrebbe essere qualcosa del tipo 500 1325 MHz Versione Italiana Version 002 GERI 17 131 Teoria di base e Terminologia 18 131 Riferire i segnali al picco del TMS chiaramente riduce il numero di cifre che deter minano la frequenza di un segnale Comunque questo stesso risultato si po trebbe ottenere in modo ancora pi semplice se si usassero come unit di misura le ppm anzich gli Hz L unit di misura ppm rappresenta la frequenza come una frazione della frequenza assoluta che dipende dall intensit del campo magnetico Il vantaggio di usare ppm che le frequenze misurate non dipendono dall intensi t del campo magnetico Questo semplifica enormemente il confronto tra spettri acquisiti su spettrometri differenti Nel diagramma sottostante sono riportati i fattori di conversione da usare per pas sare da Hertz a ppm e viceversa Figura 3 5 Conversione da Hertz a ppm Dividere per la frequenza portante SFO1 in MHz Hertz ppm Moltiplicare per la frequenza portante SFO1 in MHz vantaggi di usare come unit di misura le ppm meglio illustrato con un esempio pratico Si supponga che un segnale 1H sia osservato a 2 5 kHz sopra quello del TMS usando una frequenza della portante SFO1 di 500 MHz La frequenza di ogni segnale NMR emesso direttamente proporzionale all intensit del campo magnetico Lo stesso segnale apparirebbe a 3 0 kHz sopra quella del TMS con uno spettrometro a 600 MHz e a 2 0
52. a frequenza dei segnali Versione Italiana Version 002 ARTSA 95 131 Spettro protonico Per mettere in fase uno spettro necessario applicare sia la correzione di ordine zero che quella di ordine uno Ci sono diversi modi di fare ci Il modo pi sem plice quello di utilizzare la correzione di fase automatica mediante il comando apk La tabella seguente riassume alcune procedure utili per la fasatura E possibile testare le varie procedure ed opzioni dati acquisiti non sono modificati dal tipo di elaborazione che si effettua Tabella 9 2 Metodi di correzione della fase fp Finestra Metodo Risultato Principale Dare il comando La correzione di fase eseguita automaticamente apk Principale Dare il comando Si applica l ultima correzione di fase eseguita in precedenza pk Principale Dare il comando Questo comando unisce la trasformata di Fourier e la cor rezione di fase secondo i parametri impostati phc0 e phc1 Sottomenu fase Click su biggest La fase dello spettro corretta modificando la fase del picco pi intenso La stessa correzione di fase di ordine zero automaticamente applicata a tutto lo spettro Sottomenu fase Click su phO Permette di modificare manualmente la correzione di ordine zero mediante l uso del mouse Sottomenu fase Click su ph1 Permette di modificare manualmente la correzione di ordine uno mediante l uso del mouse Sottomenu
53. accoppiamento Determinare la frequenza di disaccoppiamento parametri principali da impostare sono p1 e pl1 per l impulso di osservazione insieme con la frequenza di disaccoppiamento SF02 i livelli di potenza di disac coppiamento pl12 e pl13 e la durata dell impulso pcpd2 valori di p1 e pl1 sono stati descritti nell esperimento del capitolo precedente Nel seguente para grafo sar illustrato come determinare il valore di SFO2 11 3 1 Digitare re hydrogen 2 1 Questo comando richiama il dataset hydrogen 2 1 che simile allo spettro ri portato in Figura 9 7 Se ignoriamo i picchi relativi al TMS e al cloroformio che il solvente chiaro che tutti i segnali del protone cadono nella regione 0 5 5 5 ppm Perci si potrebbe decidere di posizionare la frequenza del disaccop piamento a 3 ppm Si pu notare che la caratteristica della sequenza CPD quella di disaccoppiare una regione di frequenze protoniche e quindi suffi ciente centrare la frequenza del disaccoppiamento nella corretta regione e non in corrispondenza di una frequenza precisa Il set di parametri standard C13CPD imposta 02 a 4 ppm Si noti che i valori in ppm sono corretti solo se lo spettro protonico stato opportunamente calibrato impostando il picco del TMS al valore di TMS al valore do 0 ppm come descritto nel paragrafo Cali brazione dello Spettro a pagina 96 2 Digitare re carbon 3 1 e imposta
54. agganciare il lock au tomaticamente Questa funzione molto utile in automazione Il valore del FIELD viene regolato automaticamente durante l AUTOLOCK in modo da centrare il segnale del lock ATTENZIONE che premendo il tasto AUTOLOCK lo strumento non terr conto dello spostamento del FIELD dipendente dal solvente impostato nella tabella di edlock Funzioni manuali di shim 6 2 6 Valori degli shim I valori di shim sono modificabili tramite la selezione dei relativi tasti posizionati sotto il pannello alfanumerico luminoso della tastiera del BSMS Questi tasti ser vono a modificare la corrente del sistema di gradienti esterno posizionato nel magnete come si gi discusso nelle sezioni Magnete Sistema di Shim HPPR e Probe a pagina 32 L impostazione dei valori di corrente molto importante per raggiungere dei buoni valori di prestazione dello spettrometro ed il loro aggiustamento sar descritto nel paragrafo Shimming a pagina 62 Tutti i valori delle shim impostati sono memorizzati in un unico file quando questo salvato sul disco AUTO SHIM Pu essere usato per modificare automaticamente i valori delle shim in modo da ottenere il massimo valore del lock valori di shim selezionati durante la procedura di autoshim sono quelli che hanno impostato un valore di ampiezza diverso da zero La funzione AUTOSHIM particolarmente utile in au tomazione ATTENZIONE che la procedura di autoshim efficace
55. agliata e non sarebbe possibile determinare in modo preciso il valore del la frequenza Si direbbe che lo spettro presenta una scarsa risoluzione La risoluzione nella dimensione orizzontale dello spettro una misura di quanto bene si differenziano nello spettro due segnali che sono vicini in frequenza Un ulteriore complicazione l enorme intervallo nella scala verticale La differen za nell intrinseca sensibilit all NMR abbinata alla differenza di abbondanza natu rale rendono improponibile riportare in un unico plot i segnali di isotopi diversi Infatti la risoluzione nella dimensione verticale sarebbe molto scarsa la risoluz ione verticale cio il rapporto segnale rumore dello spettro una misura della sensibilit Se la nostra analisi del Cloroformio si dimostra piuttosto complicata perch stia mo cercando di confrontare i segnali di tre nuclei diversi osservati in un unico spettro trascurando per il momento qualsiasi considerazione su limiti hardware ed elettronici Perci in pratica si fanno esperimenti NMR osservando un solo nucleo per volta Sebbene sia possibile eccitare simultaneamente pi di un nu cleo usando pi frequenze portanti per esempio in esperimenti con disaccoppia mento noi osserviamo i segnali di un solo isotopo Questo semplifica enormemente l analisi dello spettro In precedenza abbiamo detto che le variazio ni della frequenza di base determinate dall intorno atomico locale sono in ge
56. al Capitolo 2 del Manuale dell Utente del BSMS incluso nel CD BASH in dotazione dello strumento Praticamente le varie funzioni possono essere suddivise in quattro categorie con trollo del campione controllo del lock gestione dei gradienti di shim e funzioni del livello dell elio Controllo del campione 6 2 4 Espulsione Inserimento LIFT ON espeller il campione dal magnete LIFT OFF inserir lentamente il campione all interno del magnete posizionandolo in pros simit del probe di misura MAI selezionare LIFT ON se inserito il tappo sopra il magnete Versione Italiana Version 002 GERI 49 131 Procedure di base SEMPRE quando inserite un campione verificare che sia presente il flusso dell aria che deve essere attivato mediante il tasto LIFT SPIN ON OFF Attiva Disattiva la rotazione del campione La rotazione del campi one quando attivata inizier circa 20 secondi dopo aver selezionato LIFT OFF SPIN RATE Permette di modificare la velocit di rotazione del campione Misura ta in Hz SPIN MEASURE Visualizza sulla destra del display la velocit attuale di rotazi one sulla sinistra visualizzata il valore impostato di rotazione due valori de vono essere uguali Controllo manuale del lock 6 2 5 50 131 Le funzioni del sistema di lock sono state spiegate nel paragrafo Introduzione al Sistema di Lock a pagina 37 Lo spettrometro si aggancia al segnale NMR emesso dal deuterio presen
57. ale si trovano di seguito Se l utente solo interessato a produrre spettri pu andare direttamente al capito Spettro protonico a pagina 89 e us are i set di parametri standard chiamato PROTON Questo richiama automaticamente i parametri di acquisizione adatti Lo svantag gio di questo sistema che non viene data una vera spiegazione dei processi di base e quindi Putilizzatore non acquisir la conoscenza necessaria per apportare modifiche parametri sono qui presentati nello stesso ordine con cui appaiono nella secon da colonna della tabella di eda in display mode PULPROG pulse program Il GERI Versione Italiana Version 002 Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda programma di impulsi per l acquisizione Si esegue usando uno di questi comandi zg rga gs go Figure 7 3 Prima Pagina dei Parametri di eda Dopo aver richiamato il set standard di parametri PROTON Si noti che solo i campi evidenziati in rosa o presenti come Array possono essere modificati dall utente Clicca qui per inserire i singoli parametri tra le opzioni Clicca sulla finestra per vedere la lista Clicca qui e trascina per scorrere di tutti i possibili pulse programs su e gi la lista dei parametri edpar PULPROG mey y PARMODE NS RE DS 2 TDO A D x Array sec P xx Array usec su 20 6225 ppm SWH 12376 237 Hz FIDRES 0 188846 Hz FW 125000 00 Hz no 2 6477499
58. ali veri In particolare bisogna fare molta attenzione che il campione sia privo di impurezze magnetiche in quanto queste distorcono il campo magnetico e quindi peggiorano la risoluzione dello spettrometro Impurezze solide si possono facilmente eliminare per filtrazione Per campioni in solventi organici l acqua disciolta pu essere eliminata il pi pos sibile disidratando il campione prima della dissoluzione Scelta del solvente 5 2 Una volta che il campione stato sufficientemente purificato e disidratato il pas saggio successivo quello della scelta del solvente adatto Dal momento che il deuterio decisamente il nucleo pi comune per il canale di lock il campione generalmente sciolto in un solvente deuterato Un solvente deuterato un sol vente in cui un elevata percentuale di solito il 99 degli atomi di idrogeno sos tituito con deuterio Solventi deuterati comunemente utilizzati sono acetone d6 benzene de e cloroformio d sebbene molti altri sono disponibili Quando si sceglie un solvente bisogna tenere conto dei seguenti fattori 1 Solubilit Ovviamente pi il campione solubile meglio Questo infatti rende massima la quantit di campione all interno del volume attivo aumentando la sensibilit dell esperimento L elevata solubilit particolarmente importante se sono dis ponibili solo piccole quantit di campione 2 Interferenza dei segnali del solvente nello spettro del campione Il solv
59. ametri in una sola volta il comando as li mostra sequenzialmente 1 Si digiti as Lo schermo mostra il valore attuale di PULPROG impostato su 2930 2 Si prema il tasto enter della tastiera Il programma di impulsi 2930 appare sullo schermo Questo consente all utente di visualizzare il programma di impulsi definito GERI Versione Italiana Version 002 I Comandi as e ased L operatore ora pronto per assegnare valori dei parametri di acquisizione im portanti per 2g30 Appare il valore attuale del parametro se si vuole lasciare questo valore inalterato occorre premere il tasto ENTER Per inserire un nuovo valore occorre semplicemente digitare il nuovo numero Quando tutti i parametri sono selezionati il messaggio as finished comparir alla base dello schermo Infine occorre non dimenticare che ogni parametro pu anche essere modificato direttamente dalla linea di comando XWIN NMR Questo particolarmente utile quando richiesto un impostazione precisa di un esperimento Versione Italiana Version 002 ARTSA 87 131 Programmi d impulsi Comandi as ased 88 131 ERIS Versione Italiana Version 002 Spettro protonico Introduzione 9 1 Questo capitolo descrive la procedura per acquisire uno spettro protonico Il cam pione usato sar 100 mg del colesterolo acetato in cloroformio d con lo 0 5 TMS passaggi principali sono 1 Inserire il campione e farlo ruotar
60. ana Version 002 Introduzione Scopo di questo manuale di permettere a un utente relativamente inesperto di eseguire una serie di esperimenti NMR ad alta risoluzione HR 1 D Come esem pio stato preso il colesterol acetato Saranno descritti sia osservazioni del pro tone che del carbonio con e senza disaccoppiamento protonico Per assistere l utente vengono utilizzati set di parametri standard che sono inclusi in ogni soft ware XWIN NMR Tuttavia invece che limitarsi a far leggere set di parametri standard stato fatto un notevole sforzo per aiutare l utente a comprendere il sig nificato dei vari parametri In particolare questo manuale si concentrer maggior mente sulla descrizione della procedura di acquisizione che su quella di elaborazione dei dati acquisiti Questo approccio minimizza il tempo speso sullo spettrometro stesso particolarmente nel caso in cui un numero relativamente grande di utenti vengano addestrati In questo caso l elaborazione si pu facil mente effettuare su una stazione di lavoro separata usando i tutorials consegnati insieme alla documentazione dello spettrometro Affinch questo manuale sia utile l utente dovrebbe avere i seguenti requisiti 1 conoscenza di base del software XWIN NMR 2 disponbilit di uno o pi probe in grado di osservare il protone il carbonio e il carbonio con disaccoppiamento protonico 3 conoscenza di base di come operare sulla tastiera BSMS o sul pannello di controll
61. ar automaticamente inserito nella tabella eda ed utilizzato per le acquisizioni successive Avviare l acquisizione 9 5 92 131 Per avviare l acquisizione digitare zg Durante l acquisizione si pu osservare la crescita del FID nella finestra di acqui sizione Digitando acqgu sulla riga di comando se NS gt 1 possibile vedere l ac cumulo dei FID in successione Ci che si vede nella finestra di acquisizione l aggiornamento in tempo reale del contatore delle scansioni e l esempio seg uente mostra il suo funzionamento si veda la figura sotto Figura 9 1 Finestra di Acquisizione Status del Contatore delle scansioni XWIN NMR Yersion 3 1 on QUOKKA started by eng lol xj File Acquire Process Analysis Output Display Windows Help Dataset lt cholac H 1 1 C Bruker Xw31 guest gt Title ui j A C e E 15 ELARA scan ES AS all fex E residual exp tine 2m 256 ETS Versione Italiana Version 002 Trasformata di Fourier e correzione della fase dello spettro Scan 3 16 significa che lo spettrometro ha completato 3 scansioni e sta acquisen do la quarta di 16 Sulla tastiera del BSMS si possono osservare in tempo reale impulso trasmesso potenza diretta e riflessa accensione e spegnimento del digitalizzatore Ogni scansione dura pochi secondi Potete ripetere questi passaggi pi volte per prendere confidenza con i parametri illustrati Per acquisire un FID sufficiente digitare
62. asmettere gli impulsi di osservazi one deve essere collegata tramite un modulo HPPR I canali di disaccoppiamento sono di solito collegati tramite modulo HPPR sebbene possano essere collegati anche direttamente al probe Finestra di edasp 7 4 2 Quando si usa la finestra di edasp bisogna notare che 1 Il canale logico F1 sempre il canale di osservazione OBS tutti gli altri F2 F3 ecc sono di disaccoppiamento 2 Il software considera varie configurazioni di collegamenti hardware per esem pio se il protone viene osservato il default FCU2 Questo dovuto al fatto che l uscita della router 2 non visibile da edasp collegato all ingresso dell amplificatore del protone 3 Per quanto riguarda il raggruppamento dei nuclei si adotta la seguente con venzione H nucleo di idrogeno cio 1H F 3H 19F X tutti gli altri nuclei Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda 7 5 72 131 Accanto ai parametri dello spettrometro i parametri richiamati dal comando eda edit acquisition parameters sono i pi importanti quando si prepara un acquisiz ione Il paragrafo seguente un breve riassunto dei parametri pi significativi a cui un nuovo utente dovrebbe abituarsi Dettagli aggiuntivi riguardo questi e altri parametri sono disponiblili sul XWIN NMR Acquisition Reference Manual o sul XWIN NMR Processing Reference Manual Informazioni sufficienti per l uso di questo manu
63. assaggi da seguire sono 1 Definire un nuovo data set 2 Leggere il set di parametri standard C13CPD 3 Determinare e impostare la frequenza di disaccoppiamento 4 Impostare i parametri pl12 pl13 e pcpd2 Procedura 11 2 1 Partendo dal data set carbon 2 1 creare il nuovo data set carbon 3 1 In questo modo si mantiene la frequenza O1 definita in carbon 2 1 Se il valore di 01P non 100 ppm va preso nota del valore in quanto il set di parametri standard C13CPD imposter automaticamente l offset a 100 ppm Se non si familiari con la routine prosol si prenda nota anche dei valori di pl1 e p1 in quanto saranno sovrascritti 2 Digitare rpar C13CPD all e quando appare la finestra si clicchi su acqu Le principali caratteristiche del set di parametri standard C13CPD fanno si che edasp venga impostato nel modo seguente Canale F1 13C Canale F2 1H Tutti gli altri canali saranno imposti uguali a off Anche il pulse program zgpg30 impostato direttamente richiamando il set di parametri C13CPD Questo sar spiegato nel paragrafo Il pulse program Zz 30 a pagina 111 La spiegazione stata rimandata ad un capitolo successi vo per non interrompere la spiegazione della procedura Se non si familiari con il programma questo il momento per consultare il paragrafo indicato sopra Versione Italiana Version 002 GEIN 107 131 Spettro 13C con dis
64. assimizzare la risposta dei LED quando si usa questo metodo non si deve avere aperta la finestra di acquisizione Procedura 1 Se necessario cliccare su return per tornare alla finestra principale di XWIN NMR 2 Impostare i parametri WBST su 1K e WBSW su 4MHz 3 Digitate wobb 4 Osservando i LED sull HPPR aggiustate di conseguenza la sintonia e l accor do 5 Una volta terminato digitare o cliccare su stop Versione Italiana Version 002 BRUKER 57 131 Procedure di base Figura 6 4 Pannello superiore dell HPPR 2 Tuning and Matching L Sintonia ed accordo su pi di un nucleo 6 6 3 Il software permette all utente di cambiare il nucleo es frequenza selezionato senza fermare la procedura di wobb Questo particolarmente utile per gli esper imenti con disaccoppiamento dove il probe deve essere ben sintonizzato ed ac cordato per pi di un nucleo e frequenza Ovviamente saranno aggiustati diversi circuiti nel probe per ogni nucleo I nuclei con le rispettive frequenze devono essere prima impostati utilizzando il comando edasp ove la procedura di wobb prelever i dati necessari Per cambiare nucleo e frequenza durante la procedura di wobb si pu cliccare su wobb SW nella finestra di acquisizione o digitare il comando wbchan nella lin ea di comando di XWIN NMR oppure se si utilizza il pannello dell HPPR si clicca su CHANNEL SELECT per PHPPR1 o si usa il sottomen relativo de
65. be Pe Figura 4 1 Consolle dell operatore consolle e magnete bi ssa Versione Italiana Version 002 ARTISTA 29 131 Descrizione del Sistema Consolle dell operatore e connessioni 4 2 Consolle 30 131 La consolle dell operatore controlla tutte le funzioni dello spettrometro Mediante comandi digitati dall operatore sulla consolle si possono sia implemen tare che progettare sequenze nonch elaborare i dati Le sottounit della consolle dell operatore sono le seguenti Host computer Pu essere o un PC o un Silicon Graphics 02 Sull host comput er viene lanciato il programma XWINNMR e vengono elaborati ed archiviati i dati Tutte le operazioni importanti per l acquisizione dei dati sono controllate da un secondo sistema di elaborazione chiamato Sistema di Controllo dell Acquisizione AQS sito all interno della consolle stessa Collegamento Ethernet da Host computer a AQS E usato per trasferire dati ed istruzioni tra l host computer e il Sistema di Controllo dell Acquisizione Collegamento RS232 tra host computer ed AQS Questa interfaccia seriale un collegamento alternativo all Ethernet all host computer _ da segnalare che questo collegamento RS232 non necessario per le operazioni in quanto tutte le informazioni sono trasferite mediante il pi veloce collegamento ethernet In ogni modo questo collegamento particolarmente utile qualora il trasferimento ether net per qualsiasi motivo diventasse n
66. bile dipende dall hardware dello strumento e deve essere corretto Una volta corretta la fase assumendo che non siano variate le condizione di acquisizione i parametri di cor rezione di fase devono rimanere invariati e quindi facilmente salvati e poi appli cati di nuovo La figura seguente mostra un esempio dell effetto della correzione di fase Figura 9 4 Esempio di spettro con correzione di fase sotto e senza sopra XWIN NMR Yersion 3 1 on QUOKKA started by eng NN lolx File Acquire Process Analysis Output Display Windows Help Dataset lt cholac H 1 1 C Bruker Xw31 guest gt Title dif Qui TTTTTTT TTrrrrrrt Trrrrrr rt TITrrrrrt TTrrrrrrt TrrrrrrrT TTT retum T A r T T T pph 5 4 3 2 1 0 E importante conoscere la differenza fra la correzione di fase di ordine zero e quella di ordine uno valori numerici della correzione sono salvati utilizzando i parametri phc0 e phc1 rispettivamente E possibile vedere questi parametri dig itando i nomi dalla riga di comando o aprendo la finestra dei parametri di elabo razione con il comando edp Correzione di ordine zero applica la stessa correzione a tutto lo spettro Si cor reggono cos gli spostamenti della fase che sono indipendenti dalla frequenza dei segnali Correzione di ordine uno applica una correzione proporzionale alla frequenza dei segnali Questo serve perch spesso gli spostamenti della fase contengono componenti proporzionali all
67. ceve anche il segnale di lock Versione Italiana Version 002 BRUKER 33 131 Descrizione del Sistema Magnete e Dewar del Magnete 4 6 34 131 Sono disponibili una vasta gamma di magneti a diverse intensit L intensit del magnete misurata in funzione della frequenza del segnale NMR emesso dagli atomi di idrogeno Pi intenso il campo magnetico pi alta la frequenza dell idrogeno Per esempio con un magnete a 500 MHz 11 7 Tesla si intende che quando un campione di interesse chimico inserito nel magnete per essere analizzato gli atomi di 1H del campione emetteranno segnali con una frequenza molto vicina a 500 MHz magneti Bruker sono disponibili nell intervallo di fre quenze 200 900 MHz magneti superconduttori sono elettromagneti e come tali si avvalgono di una corrente elettrica per generare un campo magnetico La parte principale del magnete costituita da un avvolgimento a forma solenoidale di bobine di fila menti conduttori di corrente AI centro della bobina principale esiste un campo magnetico molto intenso Il campione da analizzare inserito in questo campo magnetico A temperature molto basse certi material hanno la propriet fondamentale di di ventare superconduttori Un filamento superconduttore trasporta elettricit senza la necessit di alcun sup porto quali batteria o alimentazione principale Una volta che la corrente inseri ta in un circuito superconduttore lo per sempre
68. citare gli atomi di deuterio del campione LOCK GAIN Regola il guadagno sensibilit del segnale del lock nel ricevitore Per cercare il segnale del lock si possono usare due metodi Quando la frequenza del lock tenuta costante e si varia il valore del campo magnetico si definisce field mode Nell altro caso si tiene costante il valore del campo magnetico e si varia la frequenza e si definisce shift mode aggancio in frequenza FIELD Durante la procedura di lock il campo magnetico viene fatto oscillare at torno un certo valore facendo cambiare la corrente nella bobina Ho del sistema di shim esterno Il valore medio del campo magnetico pu essere modificato usando il tasto FIELD La funzione abilitata quando il BSMS impostato su field mode che anche l impostazione standard Nell altro caso se si imposta shift mode il valore del field mostrato sul pannello della tastiera ma non sar possi bile modificarlo GERI Versione Italiana Version 002 Tastiera del BSMS LOCK SHIFT Durante la procedura di lock la frequenza del lock viene fatta oscil lare attorno al suo valore centrale tale valore modificabile usando il tasto SHIFT Tale modifica solo possibile quando il BSMS impostato su shift mode Se non impostata questa modalit il valore dello SHIFT in ppm mos trato sul pannello della tastiera ma non sar possibile modificarlo AUTOLOCK Quando si preme lo spettrometro cercher di
69. colori utilizzati nell etichetta frontale del probe in modo che possano essere facil mente riconosciute e sono una coppia per ogni bobina all interno del probe L ac cordo di solito varia il minimo della curva lungo l asse verticale mentre la sintonia lungo l asse orizzontale Si osserva comunque che entrambe le correzioni inter agiscono fra loro quindi andranno aggiustate in coppia Quando il minimo della curva di sintonia centrata al centro dello schermo il probe ottimamente sinton izzato ed accordato Versione Italiana Version 002 BRUKER 55 131 Procedure di base A PA 56 131 Figure 6 3 Esempi di curve di Wobble con differenti valori di Sintonia e Accordo attivi accordo e sintonia E attivo accordo buona sintonia La routine di wobble eseguita digitando il comando wobb Durante tale proce dura possono essere modificati due paramentri WBST numero di wobble steps 1K il valore di default comunque il valore non critico WBSW oscillazione del wobble in MHz 4 MHz il valore di default Pi vicini si sar alla sintonia ottima minore po tr essere questo valore Se avete il sospetto che il probe non sia sintonizzato o accordato corretta mente oppure se ci sono delle difficolt nel visualizzare la tipica curva di risonanza aumentate il valore di WBSW p e 32 64 MHz e riducetelo fino a 804 MHZ fino a che non raggiungete i valori ottimali di sintonia e accor do Procedura 1 As
70. creare un nuovo data set si digita edc Questo mostrer i dettagli dell attuale data set come indicato in Figura 7 1 dove il data set attuale guest default 2 3 Ora si pu creare il nuovo data set Come NAME si possono usare fino a 13 car atteri Sia per EXPNO che per PROCNO si pu usare 1 _ da notare che il data set appena creato diventa il attuale data set e i dettagli della descrizione dei parametri compare ora all estremit in alto a sinistra dello schermo Versione Italiana Version 002 GERI 67 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda TYPE SAVE DU Bruker XWINJ disk unit USER guest Owner of data Una parola finale riguardo i vari parametri assegnati ai nuovi data set parametri come quelli di acquisizione che erano stati usati per l esempio XWin NMRHome guest default 2 3 sono conservati anche nel nuovo data set Questi valori pos sono essere ora cambiati Figura 7 1 Il Display edc Current Data Parameters dEFfAULt name of current data set E 2 Experiment number 3 processed data number nmr data type i 2 C0L Parameter Next CANCEL Parametri dello Spettrometro edasp 7 4 68 131 Il comando edasp l acronimo di EDit Acquisition Spectrometer Parameters Questi parametri dello spettrometro servono per configurare lo spettrometro per un esperimento specifico Per esempio quando sono inseriti preparano disposi tivi qual
71. del Magnete a pagina 34 Il sistema di shim a temperatura ambiente montato sulla parte inferiore del mag nete un insieme di bobine di corrente conosciute come shim usate per mas simizzare l omogeneit del campo correggendo le disomogeneit presenti Le correnti in queste shim a temperatura ambiente cos chiamate perch non sono raffreddate mediante immersione in un bagno di elio liquido sono controllate dal BSMS e possono essere modificate dalla tastiera del BSMS al fine di ottimizzare il segnale NMR Questa operazione ha soprattutto effetto sulla sensibilit e sulla risoluzione del segnale Questa azione di aggiustamento delle correnti nelle shim a temperatura ambiente si chiama generalmente shimmatura del magnete Figura 4 2 Foto del Magnete del Sistema di Shim del Probe e dell HPPR A xl j Sistema di Shim HPPR Probe e Sistema di Shim Anche se l HPPR Preamplificatore ad alte Prestazioni trasporta il segnale tras messo al campione la sua funzione primaria di amplificare il segnale relativa Geena Versione Italiana Version 002 Magnete Sistema di Shim HPPR e Probe mente debole emesso dal campione E localizzato alla base del magnete al fine di amplificare il segnale NMR il prima possibile e cos minimizzare perdite lungo i cavi Una volta che il segnale stato amplificato con l HPPR ogni successiva per dita lungo il cablaggio meno critica L HPPR inoltre trasmette e riceve i seg
72. dell im pedenza della testa di misura probe a pagina 54 Per il probe duale in Figu ra 4 7 ci sono viti differenti per sintonia ed impedenza con colori diversi per 1H and 13C Il cambio di un probe richieder la ri connessione del probe stesso al preamplifi catore viceversa il cablaggio di connessione tra HPPR e consolle elettronica non generalmente alterato Cambio del probe 4 8 2 Quando si cambia il probe occorre seguire la procedura qui illustrata probes sono fragili e costosi e quindi il responsabile del sistema dovrebbe essere infor mato prima di effettuare l operazione Il magnete e in particolare le correnti parassite influenzano notevolmente il movimento meccanico del probe Quando si rimuove il probe dal magnete bisogna aspettarsi una improvvisa accelerazione quando si raggiunge l estremit inferiore del foro del magnete Occorre inoltre as pettarsi la stessa resistenza quando si posiziona il probe all interno del magnete Procedura per cambiare il Probe 1 Assicurarsi che non vi sia nessuna acquisizione in corso digitando stop o halt sulla linea di commando sulla finestra principale di XWIN NMR 2 Spegnere ogni sistema di riscaldamento o raffreddamento Usare il comando edte per spegnere la resistenza e impostare il flusso d aria a zero Aspettare che il probe sia a temperatura ambiente Non spegnere lo spettrometro 3 Se il connettore di flusso di aria azoto collegato alla base staccarlo
73. di saranno descritti ma fintanto che il monitor sar visibile il pri mo metodo il pi conveniente pertanto lo descriviamo per primo ATTENZIONE Le viti di regolazione di sintonia e accordo che sono descritte qui di seguito hanno solo un certo numero di giri ed oltrepassando questo numero il probe pu essere danneggiato Sintonia e Accordo di impedenza usando la curva di Wobble 6 6 1 La routine di wobble funziona mediante la trasmissione al probe di un segnale molto basso e confrontando l impedenza dei cavi e del probe con riferimento di 50 Ohm all interno dell HPPR La frequenza di trasmissione quella di SFO1 SFO2 etc ma oscillante per un va lore determinato dal parametro WBSW vedi sotto La curva risultante quella ti pica di un circuito risuonatore ed semplicemente data dalla misura dellampiezza del segnale riflesso asse verticale in relazione alla frequenza asse orizzontale L accordo di impedenza ottimizzato cercando di fare toccare la parte pi bas sa della curva di wobble con la linea dell asse orizzontale asse delle frequenze Questo rappresenta la minima riflessione del segnale trasmesso La sintonia si effettua facendo in modo che questo punto si trovi al centro dello schermo che corrisponde alla frequenza di trasmissione Le correzioni si fanno agendo sulle astine segnate con T e M alla base del probe utilizzando l apposito cacciavite dato in dotazione Le astine usano il codice dei
74. di uno specifico gruppo di protoni per esempio i protoni He nella Figura 3 11 Si acquisisce uno spettro come se i protoni He non ci fossero Questo si ottiene trasmettendo un impulso di disaccoppiamento alla frequenza di risonanza He dei protoni He e quindi saturando tali protoni Per lo spettro mostra to in Figura 3 12 la frequenza di disaccoppiamento sarebbe 1 25 ppm sopra il segnale del TMS Generalmente gli impulsi di disaccoppiamento sono pi lunghi e meno potenti di quelli di eccitazione Nella Figura 3 13 descritto l esperimento di disaccoppia mento mentre la Figura 3 14 mostra lo spettro disaccoppiato Il quartetto del gruppo CH2 ora diventato un singoletto Gli spettroscopisti dicono che il quar tetto collassato in un singoletto Inoltre l area sottostante il singoletto dovrebbe essere uguale a quella del quartetto di partenza si confrontino le intensit relative dei segnali del CH2 e dell anello benzenico nelle due figure Il segnale relativo al gruppo CH3 a 1 25 ppm non compare nello spettro disaccoppiato in quanto gli impulsi di disaccoppiamento eliminano proprio gli effetti della presenza dei protoni CH3 Figura 3 13 Esperimento di Disaccoppiamento LS E y A DIS fe Ha Ha Hi He AS DIS fe H Che 9 RA DIS fe H E 2 H Hg Hr Versione Italiana Version 002 WERE 25 131 Teoria di base e Terminologia FID e Spettro 26 131 Figura 3 14 Spettro dell Etilbenzene con disaccoppiamento
75. e enormemente semplifi cata ed sufficiente fare un aggiustamento fine delle shim pi importanti purch l altezza del campione nel tubo sia costante Questo lo shimming di routine e dovrebbe essere eseguito all inizio di ogni sessione NMR e ogni qualvolta il cam pione nel magnete cambiato Lo shimming di routine significa aggiustamento fine delle shim Z e Z2 e possibilmente X e Y La procedura la seguente 1 Se il probe stato cambiato per prima cosa bisogna caricare il corretto file di shim nell unit BSMS In questo modo si impostano i valori di shim corretti per il probe Si digiti rsh e apparir una lista di file di shim memorizzati Si clicchi sull appropriato file ed in pochi secondi apparir sullo schermo il seguente messaggio rsh finished 2 Si verifichi che il tasto LOCK sulla tastiera BSMS sia attivo cio il campione sia bloccato locked Se il campione deve ruotare si imposti la velocit di spinning a 20 Hz per il probe a 5mm e 12 Hz per il probe 10 mm 3 Si aggiusti LOCK PHASE rendendo massimo il livello di lock 4 Si aggiusti LOCK POWER se necessario cosi che sia impostato ad un valore di 6 dB inferiore alla saturazione L inizio della saturazione data dal livello di LOCK POWER a cui il livello di lock comincia ad essere instabile e tende a variare in modo causale 5 Si attivi il tasto Z on axis Z1 del BSMS Si usi la manopola nera per ag giustare il valore delle
76. e dell operatore non nnnnnnnnnnnnnnannnns 30 Osservazione bobina di Osservazione i 38 nucleo di Osservazion e iania iaia aa 15 P Pam ani a ten 75 Pacemaker cardiaci iniiis ii da dd az 9 Parametri Dici ia i e iii ire 65 EXPNO i ii nacio da 66 NAME catania Praia ai it azien iaia calata 65 PROGCNO riii iti 66 USER sicilia asia iaia at 65 Parametri di acquisition ranas 68 Parametri standard laziali e 69 PARMODE cLici laici iaia i 74 Phase correction Method apk srudo laine allori 96 Method Paint lai aa e a 96 Versione Italiana Version 002 GEMINI 127 131 Index 128 131 Method phO nEn nnn naene eenn 96 Method PAT a aaa 96 Method B AA 96 PL anay arci un T TAE 78 Potenza diretta e riflessa tter re nse estttttrnrtn nn tnset tnt tt nnt nn rannen nnne ne 93 ppm 17 Preamplificatore cnn nnnnnn SEEE nn nn cnnnnnnnnn 72 Preamplificato viii aaa aaa 38 Probe A EON EE 37 cambi del probe iii 41 probe a banda larga nan nn nc cnn nan nc cn nn nannncncnnns 38 probe duale TIC Huici cara ia a iii 39 probe multinucleari non nnonnnnnnnnnnnnnnnannnnns 38 probe selettivi oo a A a a a aid 38 E A 40 ABD iii dc 38 ATA i 65 PULPROG ncnia a a a a a 72 74 pulse program ZII iii 74 83 o i ii 107 Q AU Lo y PCR OE OU ai ia
77. e ogni qual volta vengono spenti o l host computer o AQS e deve essere ristabilito quando sono ri accesi Dal punto di vista dell operatore forse pi semplice considerare AQS come un secondo computer Questo computer generalmente individuato con il nome spect in quanto associato con l hardware dello spettrometro Dopo la riaccensione e il booting dell AQS possibile collegarsi a spect Questo fisicamente collegato alla CCU dell AQS tale collegamento generalmente avvi ene mediante una connessione RS232 al tty00 L interfaccia video richiamata cliccando sull icona dell iperterminal CCU sul desktop dell host computer solo per PC o mediante una sessione UNIX per sistemi con computer 02 SGI Una volta che si effettuato con successo l acceso a spect si pu essere sicuri che AQS accesso e la connessione tra l host computer e l AQS funziona correttamente Versione Italiana Version 002 GERI 31 131 Descrizione del Sistema Nel capitolo Risoluzione problemi di base a pagina 115 verranno descritte le procedure di accensione e spegnimento dei vari elementi dello spettrometro Magnete Sistema di Shim HPPR e Probe 4 5 32 131 Il magnete genera il campo magnetico necessario per indurre transizioni NMR Per mantenere un sistema superconduttore la bobina del magnete raffreddata a temperature molto basse usando elio e azoto liquido per maggiori dettagli si veda il paragrafo Magnete e Dewar
78. e se si desidera 2 Lockare lo spettrometro fare riferimento al paragrafo Fare il Lock sul cam pione a pagina 58 Sintonizzare il probe e adattare l impedenza se necessario Aggiustare le shim Z e Z2 Creare un nuovo set di parametri ad es protone 1 1 Richiamare un set di parametri standard ed impostare i parametri p1 e pl1 Impostare il gaudagno del ricevitore con rg o rga o N O dI A O Ridurre NS da 16 a 1 se si vuole acquisire uno spettro con una sola scansione opzione Ce Digitare zg per avviare l acquisizione 10 Digitare ft e apk per trasformare il fid e applicare la correzione di fase auto matica Verranno descritti altri metodi di processo come la correzione di fase manuale e la calibrazione passaggi 1 2 3 e 4 sono gi stati descritti nelle sezioni precedenti pertanto partiremo dal punto 5 Creare un nuovo dataset 9 2 Prima di impostare un nuovo set di parametri di acquisizione consigliamo di creare un nuovo esperimento Nel paragrafo seguente verranno utilizzati esperi menti con NAME specifici in ogni caso potrete utilizzare NAME a vostro piaci mento E opportuno creare un nuovo esperimento prima di modificare i parametri di acquisizione In questo modo l effetto delle modifiche potr sempre essere os servato confrontando i due esperimenti Il modo pi semplice per definire un nuovo esperimento quello di incrementare il parametro EXPN
79. edura di Shimming_ iiiaae 63 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i coman di eda45p edd lc 65 Introduzione nn nnnn nar n nan nnnnnnnnnnnns 65 Data Set auna ad 65 Creazione di un Data Set 67 Parametri dello Spettrometro edasp 68 La Finestra edasp scort asias 69 1 Frequenza scri iii 70 A iniia n aAA 70 IEC E EET 70 NA aa 71 5 Preamplificatori 72 Alcuni Aspetti della Finestra di edasp _ 72 Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda 72 Spiegazione Numerica delle Frequenze Trasmesse di Base GERI Versione Italiana Version 002 Contents e di Offset cnn nan aaa a aa 80 8 Programmi d impulsi Comandi as ased 83 8 1 programmi di impulso zg e Zg30 83 8 2 Dettagli della sequenza 2930 83 8 3 Comandi as e ased 86 9 Spettro protonico iui 89 9 1 Introduzione aa aa aaao i 89 9 2 Creare un nuovo dataset nt 89 9 3 Caricare un set di parametri standard 90 Il comando getproso 90 9 4 Impostare il Guadagno del Ricevitore 92 9 5 Avviare l acquisizione 92 9 6 Trasformata di Fourier e correzione della fase
80. el disco rigido i dati acquisiti Il dato memorizzato nel data set definito dai parametri NAME PROCNO EXPNO etc Linea 11 Exit Questo comando informa il computer che stata raggiunta la fine del programma di impulsi Linee 12 e 13 Queste due linee definiscono la sequenza del ciclo di fase sia del trasmettitore ph1 che del ricevitore ph31 Questa descrizione stata fatta al fine di dare al lettore un idea dei parametri che devono essere definiti quando si eseguono le sequenze di impulso 2930 cio d1 p1 e pl1 E da notare che le ultime tre linee della sequenza di impulsi sono dei commenti usati per spiegare all operatore il significato di questi tre parametri Il valore preciso dei parametri p1 d1 e pl1 dipender dal campi one da analizzare e dal tipo di probe usato La sequenza di impulso chiamata zg identica a 2930 ad eccezione del fatto che si usa un impulso da 90 gradi piuttosto che da 30 gradi Versione Italiana Version 002 BRUKER 85 131 Programmi d impulsi Comandi as ased Figure 8 1 una rappresentazione grafica del programma di impulsi zg con NS 4 e DS 0 A questo punto il lettore dovrebbe aver compreso gli aspetti principali dell acqui sizione NMR Il resto di questo manuale sar relativo a come acquisire passo per passo degli spettri Figura 8 2 Il programma di impulsi zg con NS 4 e DS 0 pi pi pi pi E di di di d
81. ente stesso d origine inevitabilmente a segnali NMR che oscurano parzial mente lo spettro Questi picchi residui del solvente non dovrebbero sovrapporsi con segnali del campione 3 Dipendenza della temperatura Per esperimenti eseguiti al di sotto o al di sopra della temperatura ambiente biso gna tenere conto dei punti di congelamento e di ebollizione del solvente Inoltre la solubilit molto probabile che cambi con la temperatura 4 Viscosit Versione Italiana Version 002 GEMINI 43 131 Il campione NMR Tubo NMR 44 131 Minore la viscosit del solvente migliore la risoluzione dell esperimento 5 Costo Chiaramente per utilizzo di routine dell NMR quando c bisogno di misurare molti campioni il costo del solvente un aspetto importante da considerare Come re gola empirica il prezzo aumenta all aumentare del numero d atomi deuterati 6 Contenuto di acqua Quasi tutti i solventi contengono tracce d acqua Molti di questo sono anche igro scopici cio assorbono acqua dall atmosfera e quindi pi a lungo sono conser vati pi acqua contengono La presenza di un picco d acqua HDO servir solo a peggiorare la qualit degli spettri NMR II livello d acqua pu essere enormemente ridotto filtrandolo su un agente disidratante o conservando il solvente su setacci molecolari La scelta del solvente per un certo campione sar il miglior compromesso tra i vantaggi e gli svantaggi di ciasc
82. etro vanno effettuati i seguenti passaggi 1 6 Accensione dell host computer sia esso un PC o un Silicon Graphics SGI 02 Eseguire quindi il Log in ma non eseguire il programma XWINNMR Accensione del cabinet principale usando l interruttore verde sul pannello fron tale Accensione di tutte le sottounit come il rack AQS amplificatori BSMS VTU ecc L accensione dell AQS causa l accensione della CCU10 con reboot del soft ware Osserva la procedura di booting attraverso il logging onto spect usan do l icona Hyperterminal per sistemi basati su PC o aprendo una sessione Linux UNIX per sistemi basati su Linux o SGI 02 Mediante il logging onto spect si accede fisicamente alla CCU10 ed generalmente eseguito medi ante la connessione RS232 al tty00 Il messaggio system is ready sta a sig nificare che il booting completato L accensione del BSMS causa il reboot della CPU del BSMS Osserva questo sulla tastiera del BSMS dove saranno visualizzate le parole booting e con necting Si esegui il programma XWIN NMR dall host computer Dopo il rebooting della CCU10 consuetudine eseguire di nuovo il log onto spect GERI Versione Italiana Version 002 Accensione dello Spettrometero Si noti che si pu usare anche il telnet spect invece di log onto spect mediante la connessione ethernet Attivazione di XWIN NMR da Sistemi Windows 12 4 1 1 Assicura
83. etto di disaccop piamento tanto intenso che utenti esperti raramente perdono tempo ad acqui sire spettri 13C senza disaccoppiamento Determinazione dei parametri di disaccoppiamento 11 4 La qualit del disaccoppiamento dipende da due fattori 1 La frequenza di disaccoppiamento impostata mediante il parametro SF02 2 livelli di potenza per il disaccoppiamento s impostano mediante i parametri pl12 e pl13 Si potrebbe ora analizzare l effetto variando i valori determinati per questi due parametri Per esempio si pu impostare la frequenza di disaccoppiamento a 3 8 13 ppm sopra quelle del TMS Si osservi pl13 a valori compresi tra 10 e 20 db In ge di pl12 in modo da mantenere NOE Prima di anche l effetto di impostare pl12 e nerale pl13 posto 3 db maggiore impostare pl12 o pl13 a un valore sotto i 5db si parli con un utente esperto in quanto questo potrebbe determinare un surriscaldamento del probe 110 131 QERAS Versione Italiana Version 002 Il pulse program zgpg30 Il pulse program zgpg30 11 5 Una copia del pulse program mostrata in Figura 11 2 pu essere visualizzata sullo schermo mediante il comando edcpul Per lo scopo di questa spiegazione ciascuna linea del programma stata numerata a differenza di come appare in XWINNMR Le prime 4 linee sono commenti La riga 1 semplicemente riporta il nome del pulse program e la riga 2 la versione La riga
84. ficatori e contrassegnati come X 19F e 1H ecc Lo schermata di edasp dipende dal tipo di amplificatori installati Sistemi con Amplificatori Interni Con il BLA2BB l uscita dell 1H collegata all 1H HPPR e l uscita di X al modulo X BB HPPR Queste connessioni sono inequivocabili e non c possibilit di sba gliare Se il sistema comprende anche un BLAX300 interno ci sono due possibili amplificatori per X Bisogna solo assicurarsi che indipendentemente da quale amplificatore per X selezionato per il canale di osservazione un cavo connetta Puscita di questo amplificatore al modulo HPPR X BB Sistemi con Amplificatori Externi Versione Italiana Version 002 BRUKER 71 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda Alcuni Aspetti della C una variet di configurazioni possibili per gli amplificatori alcuni hanno tre possibili uscite di solito indicate X 19F and 1H Indipendentemente dalla con figurazione vale lo stesso principio base Quando un amplificatore scelto nella finestra di edasp bisogna assicurarsi che l uscita selezionata e o fisicamente collegati all opportuno modulo HPPR o direttamente collegati al probe 5 Preamplificatori A seconda del sistema fino a 5 moduli HPPR possono essere configurati In molti sistemi c una corrispondenza univoca tra le uscite degli amplificatori e i moduli HPPR Ogni uscita di amplificatore usata per tr
85. guentemente l intervallo per il rilassamento Sebbene ogni segnale singolarmente emesso sia meno inten so l accumulazione pi veloce dei dati che l impulso 30 gradi consente di aumen tare complessivamente l intensit due programmi standard sono zg per eccitazioni con impulso 90 gradi e 2930 per impulsi di eccitazione di 30 gradi Per maggiori informazioni sulla nomenclatura convenzionale usata per livelli di potenza impulsi intervalli di tempo e contatori di loop usati nelle sequenze di im pulsi Bruker si prega di far riferimento al file XWinNMRHome exp stan nmr lists pp Param info Per informazioni sulla nomenclatura usata nei nomi delle se quenze di impulso Bruker far riferimento a XWinNMRHome exp stan nmrl lists pp Pulprog info Infine un file utile per verificare variazioni nell ultima versione di software XWinNMRHome exp stan nmr lists pp update info XWinNMRHome indica il nome della directory nella quale programmi di XWIN NMR sono stati installati di solito u sotto IRIX C Bruker XWIN NMR sotto Win dows e opt XWINNMR sotto Linux Dettagli della sequenza zg30 8 2 a Qualsiasi istruzione in una sequenza di impulsi preceduta da un commento inserito per utilit dell utente Il compilatore del programma ignora il contenuto di ogni riga preceduta da un punto e virgola Per agevolare questa descrizione ogni Versione Italiana Version 002 BRUKER 83 131 Programmi d impu
86. i A ad ad o Me 1 ze wr 0 exit _ i I P Tempo I Comandi as e ased 8 3 86 131 Ora che avete familiarizzato con il software di acquisizione e con gli aspetti princi pali delle sequenze di impulsi pu essere opportuno introdurre due nuovi coman di as e ased Entrambi i comandi rispondono allo stesso scopo e differiscono solo nella presentazione Questi comandi possono essere utilizzati per fissare parametri di acquisizione di un particolare programma di impulsi ad esempio im pulsi intervalli di tempo etc due comandi si riferiscono al programma di impulsi impostato cio il programma definito in PULPROG nella tabella eda Una volta definito che 2g30 la sequenza di im pulsi definita digitate ased Viene visualizzata una tabella tipo eda E da notare comunque che la tabella eda presenta la lista completa dei valori di impulsi e intervalli di tempo mentre la tabella ased semplicemente contiene p1 e d1 Questo perch la sequenza 2930 non usa altri impulsi e intervalli di tempo parametri nella tabella ased possono essere cambiati al valore idoneo per l esperimento Ogni cambio verr ri portato nella tabella eda Cliccare su SAVE per tornare al MENU PRINCIPALE ased un comando utile in quanto riporta tutti i parametri importanti per un specifico esperimento Mente ased mostra tutti i par
87. i digiti getprosol pl12 120 db Si consulti il responsabile dello spettrometro per impostare pl12 o si usi il comando getprosol Si veda anche il paragrafo Determinazione dei parametri di disaccoppiamento a pagina 110 pl13 120 db Si consulti il responsabile dello spettrometro per impostare pl12 o si usi il comando getprosol Si veda anche il paragrafo Determinazione dei parametri di disaccoppiamento a pagina 110 d11 30 ms 30 ms D array d1 2 2s Non cruciale Si pu usare sia il comando as che il comando ased per controllare che i parametri siano stati impostati in modo corretto 4 Si digiti zg per far partire l acquisizione 5 Si trasformi il FID e si fasi correttamente La figura sottostante un esempio di spettro disaccoppiato Si noti che ora ap pare a 0 ppm il picco del TMS Versione Italiana Version 002 109 131 Spettro 13C con disaccoppiamento Figura 11 1 Spettro 13C di Colesterolacetato F2 Acquisition Parameters 20011108 17 36 2 35971 223 Hz 0 548877 Hz 0 9110143 sec 32768 13 900 usec 6 00 usec 300 0 K 2 00000000 sec 0 03000000 sec 0 00002000 sec CHANNEL fl 130 12 20 usec 5 00 dB 150 9178388 MHz 20 00 dB sm2 600 1318004 MHz F2 Processing parameters sI 32768 wu no LB 0 00 Hz 8 Scansioni con Disaccoppiamnto Fr 200 180 160 140 120 100 80 60 E anche da notare l aumento del rapporto segnale rumore L eff
88. i il router che collega ciascun segnale con l opportuno amplificatore Il co mando edasp consente di progettare un esperimento considerando i nuclei che verranno investigati oltre a selezionare gli amplificatori gli output degli amplifica tori e i moduli HPPR Quando si prepara un esperimento il primo passaggio implica leggere un set di parametri con il comando rpar e richiamare la finestra di edasp _ importante che i parametri dello spettrometro siano messi a punto correttamente prima di us GERI Versione Italiana Version 002 Parametri dello Spettrometro edasp are il comando eda per inserire i parametri di acquisizione L utente devo con siderare che 1 Ogni modifica dei parametri dello spettrometro nalla finestra di edasp sono salvati automaticamente anche nei parametri di acquisizione tabella eda 2 Ogni modifica dei parametri di acquisizione per esempio l offset della frequen za sono salvati nei set di parametri dello spettrometro solo se edasp viene digitato nuovamente e solo se i cambiamenti fatti alla tabella eda sono stati gi salvati 3 Se dopo aver fatto delle modifiche nei parametri di acquisizione si usa il co mando edsp e non edasp i cambiamenti saranno persi e saranno richia mati i parametri di default dello spettrometro Bisogna tener presente che quando si caricano i parametri di default vengono im postati sia i parametri di acquisizione che de
89. ia ie 34 R RG a avariati ia 76 Riferimento composti di riferimento cnn nnnnncnnnnnnns 17 Riga forma della ii 64 Risoluzione Spettrale siii Ea ela ae 62 RS232 connessione nn nn nn nn nnnnnnrnnnnn anar EEEE EEEn Ennen ennt 30 S SADO idee Ai ir ti daa 77 NO 98 Schermatura Magnet senssa nanen p 14 Segnale comando SINO areor isai ut Lie tddi 101 intensit del segnale cii iii 15 misura dell intensit del segnale 15 rapporto segnale rumore nro nnnnnnnnnnnnnnns 100 Sensibilit acari n a a a a a a A E 17 SFO epii a aa Reni pata 70 79 Shift Modalit dl isis diia 60 Shim demnizione ns alal ei ta 32 Procedura iii 63 shimmatula nsira diia iatale ala ia sa 47 62 shimmingriniziale azien 63 sistema di ShM iaa id a 32 47 62 ene Versione Italiana Version 002 Index oli 94 Sicurezza azioni preventive cnn nan nnnn nn nn nnncnnnnnnnnns 10 azioni preventive nella zona esterna 11 azioni preventive nella zona interna 10 bombole di gas pressurizzato i 11 CAMPO ina ia 9 chimica iunediai ii a adan 12 e i 11 elettrica alan 12 introduzione non nnnnnnnnnnn rn nen anne nn nnnnnnnnnrnnrrnnnnnnnnnmnnnnnnn 9 pacemakers cardicaci ssrsirsssi aaia dalai 9 quench del magnete enn 34 Sideband intensit delle
90. ient shimming che pu essere utilizzata per protoni e deuteri Se questa opzione dis ponibile l utente si dovrebbe consultare con il responsabile del sistema in quanto si semplifica notevolmente la procedura di shimming Una descrizione pi dettagliata dello shimming data nel Capitolo 6 del BSMS User Manual disponibile sul CD BASH GERI Versione Italiana Version 002 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda Introduzione 7 1 In questo capitolo si spiegano due dei pi importanti gruppi di parametri richiamati dai comandi eda e edasp Anche se c un terzo comando edsp che molto simile a edasp solo edasp verr descritto poich il pi versatile Prima di as segnare valori ai vari parametri importante che l utente capisca il significato dei data set che sono inscindibilmente associati ai gruppi di parametri Data Set 7 2 L uso regolare dello spettrometro genera un rapido accumulo di una grande quan tit di dati bene che gli utenti salvino i dati in file denominati in modo da per metterne in seguito un rapido accesso Questo particolarmente importante se vi sono pi utenti Quando un esperimento viene eseguito viene salvato nel cosid detto data set Ogni data set deve avere una descrizione univoca per permettere di distinguerlo dagli altri La descrizione completa per un data set richiede l uso di cinque parametri DU USER NAME EXPNO e PROCNO I
91. igitalizzato prima dell elaborazione Il valore assegnato a TD il numero di punti che sono raccolti e digitalizzati a dare il FID vedi Figura 7 4 Di solito TD 16K 32K o 64K per FID 1D standard Sebbene l aumento delle dimensioni di TD migliori la risoluzione del FID questo determina l incremento del tempo di acquisizione PARMODE Parameter Set Mode Pu essere 1D 2D o 3D a seconda del tipo di esperimento NMR da eeguire Seleziona 1D per tutte le acquisizioni descritte in questo manuale NS Number of Scans numero di scansioni In NMR spesso si accumulano dei transienti o scansioni per migliorare la qualit dello spettro ovviamente il tempo impiegato per eseguire l esperimento aumen ta Il numero di acquisizioni determinato dal parametro NS NS di solito un multiplo di 8 per consentire il normale ciclo di fase che incor porato nel pulse program Tuttavia quando si prepara un esperimento per la pri ma volta fa risparmiare tempo usare NS 1 mentre si ottimizzano gli altri parametri prima di aumentare NS DS Number of Dummy Scans A volte si trasmette al campione una serie di impulsi identici a quelli usati per l ac quisizione prima che il ricevitore registri il segnale emesso dal campione Questo consente al campione di raggiungere uno stato stazionario o di equilibrio Questa serie di impulsi viene definita dummy scans poich nessun dato viene raccolto Il numero di questi dummy scan dipende dal
92. io Torrette dell elio Porte dell azoto Torrette dell azoto Inserire il Piastra campione qui megnetica Camera del vuoto __ Magnete Inserire il probe qui Contenitore dell azoto 4 6 3 Le tre torrette pi piccole che emergono dal magnete consentono l accesso al contenitore di azoto Ognuna di queste torrette pu essere usata per controllare il livello di azoto con ur idonea stecca di plastica solo per utenti esperti e riempire il contenitore quando necessario Di nuovo il responsabile del sistema dovrebbe regolarmente controllare che tutte le valvole inserite sulle porte di accesso al con tenitore di azoto non siano bloccate dal ghiaccio Come gi detto i magneti sono progettati per minimizzare l evaporazione dei liq uidi Durante il normale funzionamento una piccola quantit di azoto evaporer regolarmente Questo assolutamente normale e infatti la mancanza di evapo razione di azoto indica che una delle torrette bloccata La frequenza del rabboc co di elio e di azoto dipende dal tipo di magnete E anche buona consuetudine controllare il livello di elio con regolarit e registrare questi dati Sebbene l evapo razione di elio sia molto inferiore di quella di azoto consentendo intervalli di tem po pi lunghi tra le operazioni di riempimento 3 6 mesi il controllo regolare assicurer che l evaporazione di elio sia costante 36 131 ERYS Versione Italiana Version 002
93. it di scansione si aggiusta usando la funzione SWEEP RATE della tastiera del BSMS Una buona qualit di uno spettro CW illustrata nella Figura 6 5 GERI Versione Italiana Version 002 Fare il Lock sul campione Figura 6 5 Tipico segnale di lock F4 Picco principale Estremo positivo Ringing R criteri II Uvm Direzione della scansione Se il segnale di lock gi agganciato la forma dello stesso dovrebbe essere una linea orizzontale associata a del rumore irregolare vedi la figura Pannello del Lock a pagina 62 L altezza di questo segnale chiamato livello del lock Procedura 1 Digitare lockdisp per vedere il segnale di lock 2 Digitare lock 3 Selezionare il solvente appropriato dall elenco che apparir per il campione utilizzato per descrivere l esperimento del manuale scegliete CDCI3 Il LED di autolock della tastiera del BSMS inizier a lampeggiare fino a che il segnale di lock non sar agganciato Quando questo succeder apparir sullo schermo il messaggio lock fin ished ed il LED di Lock On Off si accender 4 Se il livello del lock sar instabile dovuto a saturazione sar necessario ag giustare il LockPower manualmente usando la tastiera del BSMS Per evitare che il problema si ripresenti la soluzione migliore quella di aggiustare la po tenza del lock all interno della tabella di edlock per quel solvente Ed bene verificare con il responsabile dello strument
94. ities Per maggiori dettagli vedere Impostare la Finestra Spettrale con il comando SW SFO1 a pagina 98 Versione Italiana Version 002 Programmi d impulsi Comandi as ased I programmi di impulso zg e zg30 8 1 Come gi menzionato nel paragrafo relativo ai parametri d acquisizione Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda a pagina 72 i pro grammi d impulso sono usati per definire la sequenza di impulsi con cui viene ec citato il campione Un nuovo spettrometro AVANCE con SGU avr gi installato una libreria di programmi di impulso standard La lista dei programmi di impulsi pu essere visualizzata digitando il comando edpul Ci si pu muovere lungo la lista finch non si trova il programma 2930 Cliccando su 2930 si visualizza il programma riprodotto Figure 8 1 Un descrizione dettagliata del programma di impulsi oltre gli scopi di questo manuale sebbene alcuni commenti sul programma chiamato 2930 potrebbero essere utili all operatore per capire quali parametri sono importanti e perch Un esperimento 1D standard dovrebbe usare un impulso 90 gradi per eccitare il seg nale NMR ed avere il massimo segnale quando si ottimizza anche la durata tra impulsi successivi al fine di consentire al campione di rilassarsi E stato mostrato che in caso di eccitazione ripetute su un campione il metodo pi efficace di ec citare il campione con un impulso 30 gradi e ridurre conse
95. kHz sopra quella del TMS con uno spettrometro a 400 MHz Una singola conversione non un enorme inconve niente ma questa conversione dovrebbe essere fatta per tutti i picchi di ciascun sistema Si consideri ora lo stesso segnale espresso in ppm Frequenza in Hertz divisa per SFO1 Frequenza in ppm Esempi 2500 Hz 500 MHz 5 ppm 3000 Hz 600 MHz 5 ppm 2000 Hz 400 MHz 5 ppm si pu ora dire che il segnale 1H cade 5 ppm sopra cio a campi pi bassi il picco del TMS indipendentemente dalla frequenza dello spettrometro Utenti esperti usano sempre le ppm e gli spettri riportati nelle pubblicazioni scien tifiche mostrano sempre la scala orizzontale in ppm e non in Hertz Il lettore dovrebbe sapere che nell esempio sopra riportato sono state fatte alcune semplificazioni Il valore della frequenza portante dell 1H su uno spettrometro a 500MHz non esattamente 500MHz La frequenza portante da usare nel calcolo delle ppm dovrebbe essere il valore preciso assegnato al parametro SFO1 GERI Versione Italiana Version 002 NMR del protone Chemical shift Analogamente per gli spettrometri a 600 e 400 MHz le frequenza della portante non saranno esattamente 600 e 400 MHz Si noti inoltre che un valore positivo di ppm denota una frequenza maggiore di quella del TMS e si definisce a campi bassi rispetto al TMS NMR del protone Chemical shift 3 4 Dal momento che 1H l isotopo pi comunemente osservato in esperime
96. l ap ertura probe che tengono il campione e trasmettono ricevono i segnali al dal campione sono inseriti dall estremit inferiore dell apertura Contenitore dell Elio 4 6 2 In un magnete normale il contenitore dell elio sospeso mediante due torrette sulla parte superiore del magnete L accesso al contenitore di elio effettuato at traverso queste due vie Una di queste due torrette consente il riempimento di elio liquido ed anche l ingresso per un sensore del livello di elio L altra torretta usata solo per energizzare disernegizzare il magnete Queste torrette di accesso possono supportare diverse valvole che controllano il rilascio dell elio che inevita bilmente evapora Il responsabile del sistema dovrebbe verificare che queste val vole funzionino correttamente cio non siano bloccate dal ghiaccio E importante che le porte dell elio non vengano lasciate aperti per lunghi intervalli di tempo p e gt 30 secondi Il livello di elio pu essere controllato manualmente o elettronicamente Il controllo manuale si esegue inserendo un lungo tubo nel contenitore dell elio da una delle torrette di accesso solo per utenti esperti Il controllo elettronico dell elio ese guito dalla tastiera del BSMS e sar discusso nel paragrafo Funzioni del BSMS a pagina 49 Versione Italiana Version 002 BRUKER 35 131 Descrizione del Sistema Figura 4 4 Magnete Superconduttore Porte dell el
97. l loro significato 1 DU Disk Unit Su sistemi che hanno una grande quantit di dati possono rendersi necessari pi di un hard disk Questa possibilit viene considerata dal parametro DU che indica la partizione di disco in cui si trova il data set 2 USER Utenti diversi possono avere accesso allo spettrometro quindi l identit dell utente che acquisisce i dati dovrebbe fare parte della descrizione del data set Ogni descrizione del data set indica lo USER Di solito solo gli utenti che appartengono ad uno stesso gruppo possono modificare o cancellare i data set del proprio gruppo 3 NAME Anche se un solo utente acquisisce i dati probabile che numerosi campioni vengano analizzati Per distinguere tra campioni diversi si usa il parametro NAME nella descrizione del data set L utente pu scegliere un nome qualsiasi ma di solito se ne usa uno che richiama il campione Per es empio i data set che si riferiscono al campione di gramicidina possono essere associati al NAME gram mentre i data set acquisiti sul colesterolo acetato avranno NAME colac Prima di spiegare i prossimi due parametri del data set bisogna distinguere tra i termini raw data dati grezzi e processed data dati elaborati Versione Italiana Version 002 BRUKER 65 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda 66 131 Quando un campione inserito nel magnete e viene fatta un acquisizione il data set acquisito vie
98. l pannello dell HPPR 2 In tutti i casi il nucleo sar selezionato a partire dalla frequenza inferiore Fare il Lock sul campione 6 7 Tutti i parametri di lock possono essere aggiustati singolarmente dalla tastiera del BSMS ma per gli utenti relativamente inesperti raccomandato utilizzare la pro cedura di lock attivabile con il comando lock nella linea di comando di XWIN 58 131 ARTISTA Versione Italiana Version 002 Fare il Lock sul campione NMR Questo aggiuster automaticamente alcuni parametri in modo da ottimizza re la procedura di lock Come spiegato nel paragrafo Introduzione al Sistema di Lock a pagina 37 devono essere utilizzati dei solventi deuterati per avere il segnale di riferimento utilizzato dal sistema di lock La frequenza ed intensit di questo segnale dipende dal solvente usato La caratteristica di base della procedura di lock di XWIN NMR che imposta i parametri di potenza guadagno e frequenza al valore appropriato per ogni sol vente Con questi parametri di base impostati vicino a quelli che ci si aspetta dal solvente il BSMS pu localizzare rapidamente ed agganciare il segnale di lock facendo variare i valori della frequenza o il valore del campo magnetico parametri in base al solvente sono selezionati nella tabella di edlock Tabella 6 1 La tabella edlock di default ediock El Edit 2Hlock File Curhead 1 probel Lockfreq 92 12360895 FIELD 100 BFREO 600 13 MHz
99. lick qui CUL per impostare la scala 211413 Orizzontale EH standard 10 hase calibrate Fare click qu integrate per entrare nel Utilities sottomenu di _autoplot 5 correzione die fase T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T PP 5 10 5 retum Retum to main menu Elaborazione base Trasformata di Fourier 9 7 La Trasformata di Fourier converte il FID in uno spettro di frequenze Questo si ot tiene mediante il comando ft Il numero di punti che compongono lo spettro definito dal parametro SI size Il FID trasformato in uno spettro composto da un numero SI di punti nella componente reale ed un numero SI di punti nella com ponente immaginaria L impostazione normale per SI SI TD 2 Se avete im postato il set di parametri PROTON potete verificare che TD 64K e SI 32K Una volta digitato il comando ft il display mostra automaticamente la finestra principale Se volete ritornare alla finestra di acquisizione basta digitare acqu Se ad un certo punto lo spettro sparisce dalla finestra sufficiente cliccare sulle funzioni di scala come mostra la Figure 9 3 Dopo il comando ft lo spettro pu apparire distorto questo pu essere risolto me diante le tecniche di correzione della fase come descritto in seguito 94 131 EEE Versione Italiana Version 002 Correzione della Fase Correzione della Fase 9 8 Lo spostamento della fase dei segnali trasmessi e ricevuti inevita
100. llo spettrometro Come accennato sopra il comando edasp pi versatile di edsp e si consiglia agli utilizzatori di abituarsi a questa procedura Da notare che edasp e non ed sp viene richiamato cliccando su NUCLEI nella tabella di eda Quando l hardware FCU Router SGU ecc stato collegato e configurato cor rettamente si possono progettare tutti gli esperimenti desiderati nel caso in cui siano consentiti dalla finestra di edasp Il software considera sia il collegamento tra FCU e gli amplificatori che ogni necessario switch interno tra la router e gli am plificatori vedi Figure 7 2 Per esempio se il protone selezionato come nucleo di osservazione Canale 1 allora la seconda FCU sar selezionata di default in accordo con il collegamento hardware Tuttavia da notare che il software non pu controllare le connessioni tra l uscita di alcun amplificatore e l HPPR Sebbene possibile vedere la connessione con l HPPR nella finestra di edasp cambiamenti ai collegamenti dell HPPR non hanno nessun effetto reale sull hard ware L utente deve assicurarsi che le corrispondenti connessioni tra i cavi siano presenti NOTA moduli dell HPPR sono mostrati per permettere al software di vedere la destinazione finale del canale F1 che selezionato come il nucleo di osservazione o OBS Gli utenti dovrebbero familiarizzarsi e abituarsi alla finestra di edasp Le modi fiche nella finest
101. lock sul deuterio e di lock sul fluoro sono identici Negli spettrometri AVANCE il BSMS fornisce l elettronica necessaria per eseguire il lock ed un modulo separato nell HPPR riceve e trasmette il segnale di lock Un po di deuterio deve ovviamente essere inserito nel campione che si deve analiz zare Questo generalmente fatto sciogliendo semplicemente il campione in un solvente deuterato Un solvente deuterato un solvente nel quale una grande percentuale di atomi di idrogeno sono stato sostituiti da atomi di deuterio sol venti deuterati pi comunemente usate sono acetone d6 benzene d6 e clorofor mio d sebbene ve ne siano molti altri disponibili Il campione che sar usato in questo manuale per illustrare alcune tecniche NMR di base colesterolo acetato in cloroformio d La frequenza dei segnali del deuterio emessi per un dato magnete nota con pre cisione perci se l intensit del campo magnetico corretta ogni nucleo di deute rio del campione dovrebbe emettere a questa frequenza Il sistema di lock usa un ricevitore sito nell unit BSMS per monitorare questa frequenza del deuterio e fa degli aggiustamenti all intensit del campo magnetico al fine di bloccarlo Il ricevitore nel sistema di lock progettato in modo tale che quando l intensit del campo corretta cio viene misurata una frequenza del deuterio corretta non vengono eseguite correzione sul campo Viceversa quando l intensit del campo
102. lsi Comandi as ased 84 131 linea della sequenza zg30 stata indicata con un numero che comunque non appare sullo schermo di XWIN NMR ogni qualvolta si visualizza la sequenza di impulsi Le prime quattro linee sono esempi di commenti La linea 1 semplicemente indica il titolo della sequenza di impulsi e la linea 2 la versione La linea 3 indica che questa sequenza adatta per esperimenti 1D NMR e la linea 4 ricorda all opera tore che invece di impulso di eccitazione di 90 gradi la sequenza prevede di usare un impulso di 30 gradi da qui il nome del programma Figure 8 1 Il programma di impulsi 2930 zg30 avance version 00 02 07 commenti 1D sequence bap ni Using 30 degree flip angle Bb OO N gt 5 include lt Avance incl gt 1ze 2 d1 p1 0 33 ph1 90 2 ph31 wr 0 sequenza di impulso 2 2009 XX exit 12 ph1 02201331 13 ph31 02201331 14 pl1 f1 channel power level for pulse default 15 p1 f1 channel 90 degree high power pulse bag e D 16 d1 relaxation delay 1 5 T1 poa TTT La linea 5 non un commento ma un richiamo a un file separato in cui sono defi nite istruzioni qui utilizzate Linea 6 1 ze Questa riga non preceduta da punto e virgola ed quindi la pri ma riga della sequenza Ogni linea del programma pu essere numerata per facil itare loop e questa numerata come linea 1 Il comando ze zero un comando che co
103. ma attenu azione minima su tutti i canali 6dB per ragioni storiche Questa convenzione stata mantenuta per minimizzare i cambiamenti per gli utenti pi esperti che lavorano su nuovi spettrometri Da notare che si ottengono ridotti livelli di potenza aumentando il livello di attenuazione misurato in dB applicati al segnale di ecci tazione GERI Versione Italiana Version 002 Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda Figure 7 6 Relazione tra Potenza e Attenuazione attenuazione crescente 6dB 0dB 120dB max min potenza p potenza potenza decrescente Si tenga presente che il modo pi comune per danneggiare un probe di usare una potenza troppo elevata Per questo motivo i livelli di default assegnati per i set di parametri standard sempre 120 che rappresenta la massima attenuazi one cio potenza zero Gli utenti dovrebbero controllare con il responsabile del sistema quali livelli di potenza siano adatti per i vari probe o usare il comando getprosol Il comando getprosol descritto nel paragrafo Il comando get prosol a pagina 90 NUCLEI Passa al menu edasp Questo consente di fare rapidi cambiamenti nella configurazione dello spettrometro Poich la tabella eda non stata salvata i cambiamenti di offset fatti non saranno incorporati nei parametri dello spettrometro Se si vogliono in corporare gli offset nei parametri dello spettrome
104. mento abbia inizio Versione Italiana Version 002 GERI 111 131 Spettro 13C con disaccoppiamento Figura 11 2 Il Pulse Program zgpg30 1 zgpg30 2 avance version 00 02 07 3 1D sequence with power gated decoupling 4 using 30 degree flip angle 5 include lt Avance incl gt 6 d11 30m 7 d12 20p 8 1 ze 9 2 d12 pl13 f2 10 d1 cpd2 f2 11 d12 pl12 f2 12 p1 0 33 ph1 13 go 2 ph31 14 wr 0 15 d11 do f2 16 exit 17 ph1 02201331 18 ph31 02201331 19 pl1 f1 channel power level for pulse default 20 pl12 f2 channel power level for CPD BB decoupling 21 pl13 f2 channel power level for second CPD BB decoupling 22 p1 f1 channel 90 degree high power pulse 23 d1 relaxation delay 1 5 T1 24 d11 delay for disk I O 30 msec 25 d12 delay for power switching 20 usec 26 cpd2 decoupling according to sequence defined by cpdprg2 27 pcpd2 f2 channel 90 degree pulse for decoupling sequence Riga 10 d1 cpd2 f2 GERI Versione Italiana Version 002 Il pulse program zgpg30 Questo comando d inizio alla sequenza di disaccopiamento definito dal parametro cpdprg2 nella tabella eda Un controllo veloce nella tabella eda rivela che il set di parametri standard imposta cpdprg2 uguale a waltz16 Il disaccoppia mento prosegue con livello di potenza pl13 per la durata d1 Riga 11 d12 pl12 f2 Per disaccoppiare durante l impulso di eccitazione e l acquisizione il livello di p
105. mici La causa dello splitting in un multipletto dovuto all effetto noto come accoppia mento spin spin Un esauriente spiegazione di quest effetto va oltre lo scopo di questo manuale e il lettore dovrebbe fare riferimento a un testo NMR per dettagli Per il nostro scopo una breve descrizione dell accoppiamento spin spin dovrebbe essere sufficiente Figura 3 11 Etilbenzene e Hi F i ce o Da ii Versione Italiana Version 002 WERE 23 131 Teoria di base e Terminologia 24 131 4 ml ppm 8 7 6 5 Figura 3 12 Spettro dell Etilbenzene H I GH Nii i ppm 7 4 72 H NII C j H pm 27 26 TMS I 3 2 i l Yy le rr e r 4 o Lo splitting dei segnali NMR in Figura 3 11 deriva dall interazione magnetica tra nuclei vicini due protoni Hf sono magneticamente equivalenti e non interagis cono tra loro Analogamente i tre protoni H sono magneticamente equivalenti e non hanno alcun effetto reciproco Ad ogni modo i due protoni Hr e i tre protoni He sono posti in intorni differenti e quindi sono accoppiati tra loro Il risultato di questo accoppiamento che i due gruppi di protoni interagiscono tra loro e ques ta interazione determina lo splitting dei due segnali due protoni Hf possono avere tre diversi stati magnetici questo dipende dall orientazione degli spin da cui il termine accoppiamento spin spin Come risultato dell accoppiamento
106. mpione La Tabella sot tostante riporta le tipiche variazioni di frequenze per due dei pi studiati nuclei in spettroscopia NMR 1H e 13C E chiaro che l intorno atomico locale ha un effetto relativamente piccolo sulla fre quenza di risonanza di base Tabella 3 1 Tabella di Dati per vari Isotopi Frequenze riferite a un magnete a 11 7T Nucleo NMR attivo n di a ATE naturale approssimata MHz 1H si 500 99 98 2H si 77 0 015 3H si 533 0 005 12c no du 98 89 13C si 126 1 11 35c si 49 75 53 cl si 41 24 47 Tabella 3 2 Variazioni di Frequenza riferito per a un magnete a 11 7 T Tipica variazione di frequenza di base data da intorno Nucleo atomico locale 1H 6 kHz Ne 100 kHz I segnali NMR sono generalmente presentati come spettri ed analizzati in base a frequenza e intensit E convenzione tracciare la frequenza sull asse orizzontale e crescente verso sinistra 14 131 Versione Italiana Version 002 Introduzione Figura 3 2 Spettro NMR A Intensita SL lt Frequenza Come detto prima il valore di frequenza comporta informazioni qualitative circa l intorno atomico Il valore dell integrale del segnale una misura dell intensit del segnale e si determina integrando l area sottostante il picco L integrale direttamente proporzionale al numero di nuclei che danno origine a un segnale a una data frequenza se tutti i nuclei so
107. nali di lock sul deuterio o fluoro ed usato nell operazione di controllo della sintonia ed dell impedenza Possono essere configurati fino a 5 HPPR o 8 HPPR II moduli individuali es cludendo il modulo di copertura che sempre presente e possono essere visual izzati nella funzione edasp Nella Figure 4 3 mostrata una configurazione tipica costituita da tre moduli individuali protone X BB e 2H oltre al modulo di co pertura Il modulo 2H usato per trasmettere e ricevere il segnale di lock Nella Fiqure 4 6 illustrato come collegare i moduli dell HPPR al probe e agli amplifi catori La parte tecnologicamente rilevante dell HPPR correlata alla funzione di selezione tra trasmissione e ricezione Il segnale che viene inviato al probe tr asmesso senza alcuna modifica Una volta che questo segnale ha percorso il suo tragitto e passa in fase di ricezione amplificato di circa 30dB Il trucco di effet tuare questa selezione il pi velocemente possibile in modo da eliminare interfer enze e sovrapposizione tra il segnale trasmesso ed il segnale ricevuto Figure 4 3 HPPR con i tre Moduli e Modulo di Copertura Modulo di Visualizzazione Modulo di copertura Moduli individuali Il probe inserito nel sistema di shim alla base del magnete ed costituito essen zialmente di alcune bobine usate per trasmettere impulsi di eccitazione al campi one e ricevere il segnale emesso Il probe trasmette e ri
108. ne chiamato raw data set Questo pu essere o un FID per esperimenti 1D o una serie di FID per i 2D Si dice raw grezzo nel senso che non stato ancora processato FID sono processati tramite trasformata di Fourier che converte i dati dal do minio del tempo a quello delle frequenze e di solito da manipolazioni che com prendono window function e correzione di fase Il data set risultante si chiama processed data set data set elaborato Ogni singolo data set grezzo pu essere processato in modi diversi e la de scrizione del data set deve considerare questa eventualit Si usano i due parametri EXPNO e PROCNO per fare questa distinzione Diversamente dai parametri USER e NAME EXPNO e PROCNO assumono valori numerici 4 EXPNO Experiment Number A ciascun raw data set assegnato un unico EXPNO Per esempio lo stesso campione chimico pu essere analizzato pi volte usando diversi parametri di acquisizione Per distinguere tra i diversi data sets grezzi a ciascuno di essi assegnato un univoco EXPNO 5 PROCNO Processing Number Il PROCNO viene usato per distinguere tra diversi data set processati di uno stesso raw data set Il corretto uso dei parametri del data set pu essere meglio illustrato con un es empio Tuttavia non si far riferimento ai parametri USER o DU poich questi di solito non cambiano durante un sessione NMR Esempio Ci sono due campioni di gramicidina da analizzare Si possono
109. nere relativamente piccole Quindi non si avranno elevati intervalli spettrali Inoltre lab bondanza naturale e la sensibilit intrinseca saranno sempre le stesse per cias cun isotopo Quindi l intensit relativa di due segnali nello stesso spettro diciamo del protone dipender esclusivamente dal numero di atomi che contribuiscono al segnale Questo semplifica molto l analisi degli spettri per ottenere informazioni quantitative Prima di proseguire ulteriormente con una pi dettagliata descrizione della tecnica NMR il lettore dovrebbe prendere confidenza con il concetto di de terminazione dei segnali in ppm parti per milione rispetto a un segnale di riferi mento Composti di Riferimento Hertz ppm 3 3 E gi stato detto che i segnali NMR si analizzano in base a due parametri inten sit e frequenza Le frequenze assolute si misurano in Hertz Hz cicli per secon do o Mega Hertz MHz L analisi dei segnali misurati semplificata se tutte le frequenze sono misurate rispetto al riferimento Per spettroscopia NMR 1H il com posto di riferimento consigliato il Tetrametilsilano TMS Quando si registra uno spettro 1H o 13C il TMS d luogo ad un picco singolo facilmente individuabile Questo picco posto a zero e le frequenze di tutti gli altri picchi sono determinati relativamente alla frequenza de TMS Quindi si pu dire che un segnale 2 5 kHz sopra il picco del TMS Questo preferibile a dare la frequenza assolut
110. netico troppo vicino pu essere improvvisamente attirato nel magnete con estrema forza Ci pu danneggiare il magnete o provocare danni a persone che si trovano lungo il percorso Siccome la forza del campo magnetico disperso diminuisce allontanandosi dal magnete utile parlare di sicurezza considerando due diverse zone quella inter na e quella esterna In termini di organizzazione di un laboratorio e di definizione di corrette procedure di lavoro il concetto di zona interna ed esterna particolar mente utile L ambito fisico di queste due zone dipende dalla dimensione del magnete Pi grande il magnete pi forte sar il campo magnetico e pertanto pi grande la di mensione delle due zone La Figura 2 1 mostra il concetto delle due zone non in scala Ulteriori dettagli sui campi magnetici dei vari magneti si trovano nel Site Planning consegnati con il BASH CD Versione Italiana Version 002 GEMINI 9 131 Sicurezza Figura 2 1 Azioni preventive nella zona interna ed esterna Accesso non consentito a persone con peacemaker nessuna sedia metallica nella stanza del magnete Le bombole di azoto ed elio gas devono essere assicurate al muro Limite 0 5mT ll campo magnetico passa attraverso i muri Queste stesse precauzioni devono essere seguite nelle stanze adiacenti sottostanti e sovrastanti Non lasciare cacciaviti o Non usare scale contenenti pinze metalliche nelle ferro o acciaio
111. no essere altamente infiammabili corrosivi carcinogeni ecc Certificazione CE 2 6 Tutte le principali unit di hardware contenute nelle consolle Avance con SGU e le unit periferiche come HPPR shim systems probe e tastiere BSMS sono con formi alla Dichiarazione di Conformit CE Ci include sia il livello di qualunque ra diazione elettromagnetica dispersa che pu essere emessa sia il rischio elettrico standard Da notare che per minimizzare la perdita di radiazione elettromagnetica gli spor telli della consolle devono essere chiusi e il pannello posteriore montato 12 131 QERUSFA Versione Italiana Version 002 Teoria di base e Terminologia Introduzione 3 1 L NMR una tecnica utilizzata per analizzare la struttura di molte molecole chimiche in primo luogo composti organici Tipicamente questi composti sono fat ti di Carbonio Idrogeno ed Ossigeno Nella sua forma pi semplice un esperimento NMR consiste di tre passaggi 1 Porre il campione in un campo magnetico statico 2 Eccitare i nuclei del campione con un impulso di RadioFrequenza 3 Misurare la frequenza dei segnali data dal campione Figura 3 1 Eccitazione e Risposta Segnale emesso N II o Impulso di eccitazione Dai valori delle frequenze emesse l analista pu dedurre informazioni relative ai legami e alla disposizione degli atomi del campione nuclei NMR attivi nel campi one risuonano a diverse frequenze dette frequenze di risonanza
112. no uniformemente eccitati e quindi fornisce una informazione quantitativa circa la struttura chimica Per eccitare un dato nucleo in un esperimento NMR la frequenza dell impulso di eccitazione deve coincidere con la frequenza di risonanza del nucleo Questa fre quenza detta frequenza della portante in quanto effettivamente porta lecci tazione al nucleo Allora se si fanno esperimenti con un magnete 11 7 T i nuclei 1H richiedono una frequenza portante di circa 500 MHz mentre nuclei 13C rich iedono una frequenza portante di circa 126 MHz La frequenza della portante definita dal parametro SF01 Il nucleo che viene eccitato dalla frequenza portante denominato nucleo osservato Si noti che ci sono esperimenti in cui si eccitano pi nuclei per esempio durante trasferimenti di polarizzazione o disaccoppiamento In questi casi ci sono pi fre quenze portanti ma una sola frequenza di osservazione Non tutti gli isotopi reagiscono a impulsi di radiofrequenza cio non tutti sono NMR attivi In natura esistono tre isotopi dell elemento idrogeno 1H idrogeno 2H deuterio 3H trizio Radioattivo L abbondanza naturale di questi isotopi rispettivamente 99 98 0 015 0 005 Tutti e tre sono NMR attivi sebbene come mostrato in Tabella 3 1 mostrino una grande variazione nella frequenza di risonanza Per analizzare un campione contenete idrogeno viene eccitato l isoto po 1H in quanto decisamente il pi abbondante Degli i
113. non possono essere eviden ziati con il mouse Le frequenze trasmesse sono stabilite mettendo degli offset alle frequenze di base BF1 BF2 e BF3 ecc Per il canale di osservazione SFO1 BF1 offset frequenza di trasmissione automaticamente impostata dall utente Analogamente per i due successivi canali di disaccoppiamento SFO2 BF2 offset SFO3 BF3 offset Gli offset sono chiamati OFSH1 OFSX1 OFSF1 ecc secondo le convenzioni per le denominazioni indicate nel paragrafo Alcuni Aspetti della Finestra di edasp a pagina 72 Si noti che questi parametri non possono essere richiamati dalla linea di comando Quando un nucleo viene selezionato l opportuna frequen za di base inserita automaticamente Dopo aver letto un set di parametri stan dard la frequenza di base corretta richiamata solo l offset deve essere modificato Bisogna ricordare che SFOX il parametro pi importante poich la frequenza che viene effettivamente trasmessa al campione Da notare anche che gli offset possono essere posti a zero e quindi SFOX BFX Una descrizione pi dettagliata se trova nel paragrafo Spiegazione Numerica delle Frequenze Tr asmesse di Base e di Offset a pagina 80 2 Canali Logici In questa colonna si selezionano i nuclei da studiare Il canale logico F1 o NUC1 sempre il nucleo di osservazione Se un canale non usato dovrebbe essere spento La lista dei nuclei che possono essere scelti presa dal file XWinNMR
114. nsente di sostituire ogni dato al momento presente in memoria con il dato acquisito durante la prima scansione dati acquisiti durante le scan sioni successive saranno poi sommati in memoria Il comando ze azzera la me moria in preparazione dei dati che saranno acquisiti durante un esperimento GERI Versione Italiana Version 002 Dettagli della sequenza zg30 Linea 7 2 d1 Questa riga un commando di delay o ritardo L intervallo di tem po chiamato d1 Un ritardo semplicemente una pausa durante la quale non sono trasmessi impulsi La durata di d1 pu essere specificata digitando un valore idoneo in una lista di delay del menu eda o digitandolo esplicitamente nella lin ea di comando di XWIN NMR Linea 8 p1 0 33 ph1 Il comando p1 0 33 segnala allo strumento di emettere un impulso di lunghezza p1 moltiplicato per 0 33 Questo un impulso di eccitazi one 30 gradi in quanto convenzionalmente p1 impulso 90 gradi Ogni impulso ha tre principali caratteristiche 1 lunghezza 2 intensit e 3 fase La lunghezza o durata dell impulso pu essere determinata indicando un idoneo valore di p1 nella tabella di impulsi del menu eda o esplicitandolo nella linea di co mando di XWIN NMR L intensit di un impulso spesso indicata dal suo livello di potenza In questo caso non specificato il parametro di potenza cos il livello di default usato dallo spettrometro pl1 Il valore di pl1 pu
115. nti NMR questo isotopo verr trattato in maggiore dettaglio Un nucleo 1H contiene un sin golo protone e gli spettri in cui si osserva 1H sono normalmente denominati spettri protonici Si detto prima che un protone posto in un campo magnetico di 11 7 T mostra una frequenza di risonanza di base di circa 500 MHz ma l esatta frequenza di risonanza dipende dall intorno atomico locale Un protone in una molecola di clo roformio risuona a una frequenza leggermente diversa da quella di un protone in una molecola di benzene CeHe Perci la frequenza emessa fornisce un infor mazione qualitativa sull intorno atomico locale del protone Questa la base dell NMR L esatta variazione della frequenza di risonanza detta chemical shift sposta mento chimico La frequenza di risonanza spostata per effetto degli atomi adia centi e in particolare dell entit della schermatura magnetica degli elettroni vicini come detto in precedenza L entit dello spostamento generalmente misurato in ppm relative al picco del TMS che posto come riferimento a 0 ppm La maggior parte dei protoni indipendentemente dal composto organico cui ap partengono presentano chemical shift entro 14 ppm dal TMS Versione Italiana Version 002 GEMINI 19 131 Teoria di base e Terminologia Figura 3 6 Chemical Shifts 1H in Composti Organici _ ______ __ ma Hs C C NH2 m
116. o tenza per il secondo canale impostato dal parametro pl12 Nuovamente in cluso un delay di 20 us d12 per facilitare l impostazione del livello di potenza Riga 12 p1 0 33 ph1 Riga 12 Questa riga definisce un impulso di eccitazione di 30 gradi analoga mente a quanto stato spiegato nel paragrafo Dettagli della sequenza zg30 a pagina 83 La differenza in questo caso solo che ora l impulso dato alla fre quenza del carbonio e non del protone La durata dell impulso sar quindi im postata di conseguenza Riga 13 go 2 ph31 Anche questa riga stata spiegata nel paragrafo Dettagli della sequenza zg30 a pagina 83 Riga 14 wr 0 Si veda il paragrafo Dettagli della sequenza zg30 a pagina 83 Riga 15 d11 do f2 Il comando do significa decoupling off disaccoppiamento sospeso Versione Italiana Version 002 GERI 113 131 Spettro 13C con disaccoppiamento 114 131 ERIS Versione Italiana Version 002 Risoluzione problemi di base 1 2 Introduzione 12 1 Per una guida introduttiva non opportuno descrivere le procedure avanzate di risoluzioni dei problemi o troubleshooting Comunque tutti gli utenti dovrebbero essere in grado di accendere e spegnere il sistema Figura 12 1 Posizione dei principali interruttori per Cabinet AQS e BSMS INTERRUTTORI PRINCIPALI ON OFF N B Spegnendo la consolle si spengono tutte le unita inclusi AQS e BSMS 2 BLAXH ES BLAX sgh
117. o NMR su quale sia il valore di pl1 oppure utilizzate getprosol Il valore ottimale di pl1 dipende dal sistema specifico e dal probe che state utilizzando Ricordate che p1 e pl1 sono collegati tra loro 9 Eseguire rga per impostare il valore appropriato di guadagno del ricevitore RG 10 Acquisire il FID eseguendo zg Si osservi che la fila di LED sul nucleo X della tastiera del BSMS si accende 11 Digitare si e quindi inserire il valore di 8k 12 Eseguire ft 13 Correggere la fase dello spettro usando il mouse e memorizzare la correzione Si noti che la correzione di fase usata per lo spettro protonico non corretta per lo spettro di carbonio Viceversa una volta che si corretta la fase dello spettro 13C questa pu essere usata per i successivi spettri 13C Alternativa mente si pu digitale apk per eseguire automaticamente la correzione di fase Lo spettro risultante probabilmente solo rumore con un solo picco significati vo visibile Questo picco determinato dal solvente cloroformio Espandendo lo spettro attorno a questo segnale si potr notare che in realt un tripletto a RUKER i i i 104 131 QERUSFA Versione Italiana Version 002 Procedura causa dell accoppiamento con il Deuterio diversamente dal protone che ha spin 1 2 il Deuterio ha spin 1 e questo comporta uno splitting diverso 14 Calibra il picco centrale del tripletto a 77 ppm Questo di fat
118. o digita u for 5 e Inserendo m or s cambia l unit di misura a millisecondi o a secondi rispettiva mente La lunghezza d impulso P1 quasi sempre il normale impulso di ecci tazione di 90 Sebbene le pulse width appaiano nella tabella eda in maiuscolo quando si inseriscono in un pulse program o direttamente nella linea di comando di XWIN NMR bisogna usare le lettere minuscole Quando si inseriscono le pulse width bisogna considerare che impulsi troppo lunghi possono causare scariche o surriscaldamento del probe in special modo se il livello della potenza non sufficientemente attenuato Valori tipici per la dura ta degli impulsi di osservazione e non di disaccoppiamento sono 6 15 ps SW Spectral Width ampiezza spettrale A volte viene anche chiamata sweep width una misura delllampiezza dello spettro di frequenze analizzato Di solito un campione emette una serie di fre quenze piuttosto che una singola che devono essere contenute nell ampiezza spettrale Segnali la cui frequenza cade all interno della spectral width possono essere os servati mentre segnali al di fuori di questo intervallo saranno filtrati Se si ha un idea delle frequenze di risonanza nel campione si pu impostare una piccola SW con i relativi vantaggi D altra parte se si analizza un campione incognito bene cominciare con SW larghe La SW espressa in ppm pu essere pensata come l ampiezza della finest
119. o BSMS Mentre stato fatto ogni sforzo per fornire una descrizione graduale i nuovi utenti avranno sicuramente delle domande e come tali avranno bisogno di supporto occasionale da parte di un utente pi esperto Sorgenti di rischio 1 1 Il capitolo seguente tratter in dettaglio della sicurezza per il momento suffi ciente sottolineare che lavorare su uno spettrometro NMR comporta dei rischi po tenziali Il sistema talmente sofisticato che ci sono invece poche possibilit per un utente di danneggiare lo strumento Le cause di danno pi probabili sono 1 Rimuovere un campione dal magnete senza aver rimosso il tappo 2 Inserire un campione nel magnete senza il supporto del cuscino d aria 3 Emettere impulsi RF troppo lunghi o troppo potenti o entrambi 4 Trasmettere potenza RF lungo cavi non collegati o probe non sintonizzati nuovi utenti sono tenuti a informarsi dei rischi potenziali prima di cominciare re sponsabili del sistema sono tenuti ad assicurarsi che qualunque nuovo utente sia al corrente delle informazioni fornite sopra Versione Italiana Version 002 BRUKER 7 131 Introduzione Versione software e Sintassi dei comandi 1 1 1 Questo manuale stato scritto per XWIN NMR versione 3 1 Nel manuale verran no indicate le procedure per inserire vari comandi Il comando da digitare sar in carattere semplice e colore magenta Per esempio digitare eda significa digitare il comando eda
120. o che i tre valori di LPower LGain e LTime siano appropriati 5 Se necessario aggiustare la fase del lock per massimizzare il livello del lock Versione Italiana Version 002 WERE 61 131 Procedure di base Shimming 62 131 Figura 6 6 Pannello del Lock grid node store resi quit 6 8 Shimming il processo durante il quale si fanno degli aggiustamenti minimi del campo magnetico fino a ottimizzare l omogeneit del campo Migliorando l omo geneit si ottiene una migliore risoluzione dello spettro Sar necessario rifarlo ogni volta che si cambier il probe o il campione Salvando gli appropriati valori di shim qui chiamati shim file per ogni probe si ri durranno notevolmente i tempi di shimming necessari per ogni cambio di probe si veda il paragrafo Salvataggio dei valori delle shim a pagina 49 Lo shimming controllato da un gruppo di bobine di shim nel sistema di shim a temperatura ambiente inserito nel foro del magnete La corrente nelle bobine e di conseguenza il campo all interno del magnete pu essere aggiustata usando la tastiera del BSMS Il numero di bobine dipende dal tipo di BSMS del sistema Queste hanno tutte dei nomi alfanumerici Z Z2 X Y etc ed i rispettivi tasti si tro vano sulla tastiera del BSMS Il campo magnetico tridimensionale ed il nome degli shim tenta di riflettere la corrispondente funzione alfanumerica nelle coordi nate XYZ del sistema densa Versione I
121. o di 64 scansioni in tempo reale E anche indicato il tempo sperimentale residuo La tastiera del BSMS lampegger ad ogni impulso di eccitazione ed il LED dell digitalizzatore si accender e spegner in sequenza 6 Quando l acquisizione sar finita trasformate e fasate lo spettro Lo spettro apparir incrementato di 8 volte in sensibilit E giunto il momento di conoscere il comando SINO molto utile per il calcolo auto matico del rapporto segnale rumore La descrizione dettagliata del comando SINO esula dagli scopi di questo manuale ed riportata nell XWIN NMR Pro cessing Reference Manual disponibile all interno del menu help Per confrontare pi spettri utile utilizzare la funzione Dual Display Anche ques ta funzione descritta nel XWIN NMR Processing Reference Manual Versione Italiana Version 002 WERE 101 131 Spettro protonico 102 131 ERIS Versione Italiana Version 002 Spettro 13C con disaccoppiamento Introduzione 10 1 Questo capitolo descrive l analisi al carbonio di un campione di colesterolo aceta to Inizieremo con la sequenza 2930 che non usa tecniche di disaccoppiamento Il capitolo seguente tratter l osservazione del carbonio con disaccoppiamento al protone Per chi si avvicina per la prima volta all NMR la tecnica di acquisizione senza disaccoppiamento adatta a comprendere i benefici dell introduzione del disaccoppiamento Se il vostro scopo solo ottenere uno spet
122. o spettrometro NMR su come impostare p1 Il modo pi semplice quello di utilizzare il comando getprosol Il valore di 10 us impostato dal set di parametri standard solo un valore tipico Ricordatevi che se avete impostato un valore di 10 ps la lunghezza effettiva dell impulso sar pari a 3 33 ps Se sapete come utilizzare la procedura paropt potete utilizzarla per ottimizzare il valore di p1 In realt l esperimento dovrebbe funzionare anche se p1 non stato ottimizzato si avr solo una perdita di sensibilit PL array pl1 120 dB Anche in questo caso consultare l amministratore di sistema su come impostare il parametro pl1 Anche in questo caso il modo pi semplice usare il comando getprosol Il valore ottimale di pl1 dipende dal sistema specifico Non dimenticate che p1 e pl1 sono collegati tra loro Per proteggere il probe il valore di pl1 in un set standard di parametri impostato a 120 dB RG Questo valore va ottimizzato in quanto dipende dal sistema general mente un valore di 4 abbastanza basso Utilizzate rga per ottimiz zare in modo automatico il guadagno del ricevitore Versione Italiana Version 002 91 131 Spettro protonico Impostare il Guadagno del Ricevitore 9 4 Digitare rga Lo strumento eseguir diverse acquisizioni per determinare il valore ottimale del RG Il valore di RG s
123. ogni volta il comando zg Ogni volta il nuovo FID andr a sovrascrivere quello precedente sempre assumendo che non abbiate cambiato il parametro EXPNO Trasformata di Fourier e correzione della fase dello spettro 9 6 Digitare ft seguito da apk Questa sequenza di comandi eseguono la trasformata di Fourier seguita dalla correzione di fase automatica Lo spettro risultante dovrebbe assomigliare a quel lo mostrato sotto la lista dei parametri stata aggiunta per comodit Figura 9 2 Spettro Protonico del Colesterolo Acetato Sedici scansioni SW 20 66 ppm Current Data Parameters NAME cholac H EXPNO PROCNO 1 F2 Acquisition Parameters 20011109 17 17 drx600 Smm H C N z6 zg30 65536 CDC13 16 2 6613 757 0 100918 4 9546471 12 7 75 600 6 00 300 0 1 00000000 Hz Hz sec usec usec K sec nmana CHANNEL fl manama F2 Processing parameters SI WDW LB Versione Italiana Version 002 CIV BRORMR 93 131 Spettro protonico Prima di procedere con il paragrafo seguente analizziamo alcune semplici tec niche di elaborazione Figure 9 3 Alcune utili funzioni della finestra principale di XWN NMR XWIN NMR Version 3 1 on QUOKKA started by eng File Acquire Process Analysis Output Display Windows 210 xl Fare click qu per impostare Dataset lt cholac H 1 1 C X Bruker Xw31 guest gt la scala Verticale Title standard ID na sz 0 miz Fare c
124. on funzionante Tastiera del BSMS Questo dispositivo opzionale consente all utente di control lare il lock ed il sistema di shim nonch operazioni basilari quali inserimento rotazione ed espulsione del campione NMR Connessione tra tastiera BSMS e CPU BSMS La tastiera collegata alla CPU dell unit BSMS sita all interno della consolle Se il BSMS viene spento poi nec essario ristabilire la connessione Durante questa operazione i messaggi boot ing e connecting appariranno sulla tastiera L assenza di ogni messaggio di errore confermer che la connessione stata ristabilita con successo 4 3 Questa unit pu essere costituita da un armadio con un anta o due ante a secon da del sistema e contiene la maggior parte dell elettronica associata a un moder no spettrometro digitale Le unit principali sono AQS Sistema di controllo dell acquisizione il BSMS Bruker Smart Magnet System la VTU Unit di tem peratura variabile e i vari amplificatori AQS Le varie unit all interno dell AQS generano gli impulsi di radiofrequenza us ati per eccitare il campione e per ricevere amplificare e digitalizzare il segnale NMR emesso dal campione Una volta che il dato stato ricevuto e digitalizzato l informazione trasferita all host computer per ulteriori elaborazioni ed archiviaz ione Il collegamento principale con l host computer mediante la CCU Unit di Controllo della Comunicazione E importan
125. on premerlo inutilmente ne vedremo pi avanti le reali ragioni vedere il paragrafo Funzioni del livello dell elio a pagina 51 2 Verificare che il tappo sopra il magnete non sia inserito prima di attivare il tasto LIFT Quando si introduce nel magnete un nuovo campione verifi care sempre che sia presente il flusso dell aria che deve essere attivato mediante il tasto LIFT Prima di utilizzare la tastiera del BSMS bene salvare in memoria alcuni parametri importanti quali i valori di corrente delle shim selezionabili dal BSMS Jn vedere il paragrafo Salvataggio dei valori delle shim a pagina 49 In ques to modo sar possibile ripristinare facilmente tutte le modifiche errate in caso di necessit valori di corrente di shim sono modificabili agendo sui relativi tasti p e X Y XZ X3 etc che si trovano nelle tre file in basso della tastiera Figura 6 1 Tastiera BSMS Versione BOSS 48 131 EEE Versione Italiana Version 002 Tastiera del BSMS Salvataggio dei valori delle shim 6 2 1 Per salvare i valori delle shim si scrive su disco un file di shim mediante il coman do wsh write shim file 1 Digitare wsh all interno della linea di comando di XWIN NMR Comparir una finestra contenente l elenco dei file di shim precedentemente salvati 2 Selezionare TYPE NEW NAME 3 Scrivere il nome che desiderate es pippo valori dei gradienti saranno cos salvati nel file
126. one dello spettro FW Filter Width ampiezza del filtro In genere un filtro analogico inserito automaticamente a seconda del valore di SW e SWH FW predisposto per eliminare tutti i segnali che si trovano al di fuori Versione Italiana Version 002 BRUKER 75 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda dell ampiezza spettrale Poich adesso i filtri standard sono digitali si usano solo filtri analogici a banda larga A seconda del digitalizzatore sono possibili nella ta bella eda un numero limitato di valori come 20 KHz 90 KHz 125 KHz 625 KHz ecc AQ Acquisition Time tempo di acquisizione Il tempo di acquisizione il tempo in secondi necessario per acquisire una scan sione Viene calcolato internamente sulla base dei valori assegnati a TD e SW Tuttavia pu essere inserito manualmente causando una corrispondente modifi ca dei valore di TD Figura 7 4 Rappresentazione Grafica di alcuni Parametri di Acquisizione lt aAa T _ _ _ ___ Na Impulso di j eccitazione i Numero totale di punti campionati TD RG Receiver Gain guadagno del ricevitore Il guadagno del ricevitore receiver gain un parametro molto importante che usato per aggiustare l ampiezza del FID al range dinamico del digitalizzatore L assegnazione corretta del gain pu essere determinato analizzando il FID Se il FID troncato sopra o sotto la scherma
127. ormula DECIMATION DW DWOV DSPFIRM Firmware usato per i Filtri Digitali sharp standard DIGTYP Type of Digitizer tipo di digitalizzatore Il tipo di digitalizzatore usato dallo spettrometro Questo pu essere SADC HADC FADC ecc Questo parametro usato per sistemi con pi di un digitaliz zatore Solo i digitalizzatori effettivamente disponibili su un particolare spettrometro sono disponibili nella tabella eda Se il DIGTYP stato selezionato durante il processo di expinstall questo automaticamente richiamato tutte le volte che un set di parametri standard caricato Versione Italiana Version 002 BRUKER 77 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda 78 131 DIGMOD Digitizer Mode modalit del digitalizzatore Per sistemi AVANCE con SGU si pu selezionare la modalit digital Quando si esegue un esperimento di disaccoppiamento omonucleare bisogna selezionare la modalit homodecoupling digital Se si seleziona invece analog i filtri digitali sono disabilitati DE Prescan Delay Questo delay il tempo precedente l inizio dell acquisizione dei dati Questo de lay indicato automaticamente in microsecondi garantisce che l impulso di ecci tazione sia decaduto del tutto prima di cominciare ad acquisire i dati Durante il processo di expinstall viene richiesto di inserire un valore di DE Leggendo il set di parametri standard PROTO
128. ostato all interno del men del BSMS L utente ha a disposizione tre metodi per agganciare il campione 1 Digitare lock sulla linea di comando di XWIN NMR come descritto sopra e selezionare il solvente appropriato In questo si varia prima il valore dell inten sit del FIELD per selezionare il solvente e poi si cerca il segnale di lock pi intenso del solvente Quando il sistema si agganciato sar visualizzato il messaggio lock finished 2 Premere AUTOLOCK sulla tastiera del BSMS Questo non terr conto del sol vente ma agir sull intensit del campo magnetico fino a quando sar rilevato e centrato il segnale di lock alla relativa sweep quindi lo aggancer 3 Premere LOCK ON sulla tastiera del BSMS Questo non varier il valore del campo magnetico per aggancer il segnale solamente se sar intenso e centrato nella finestra di sweep selezionata Questo metodo raccomandato solo quando si sostituisce il campione con un altro con lo stesso solvente oppure quando si sa che tutti i vari parametri di lock sono corretti per quel campione Procedura per Agganciare il Campione 6 7 1 60 131 Il segnale del lock pu essere visualizzato digitando il comando lockdisp Assumendo che il segnale del lock non sia agganciato il segnale sullo schermo rappresenta la sovrapposizione in onda continua dello spettro del deuterio una scansione da sinistra a destra e l altra da destra verso sinistra La veloc
129. pi 13 15 frequenze di risonanza di base ono nnnnnnn 13 L LGania gua AA RA ii 61 A lalla 49 L IQUICI CAMPIONI sciiti itato eine eni 43 LOCK Gallicano air 50 E A oa ring ila 50 Lock Phase ilaele ani ana 63 LOCK PO Wer siciliana liada 50 Lock SMi rcn ERE 51 Lock Sistema do TOSCANO ii 37 fare il Lock sul campione mann 37 FICEVITONO atico dirias TRA ai 37 SCOPO alla ai ai 37 LOCK ON Gialla ia 60 LOCNUC osiinsa iiai a a a a a a eta 79 PO West leali 61 A a a a a ae a a a eR 61 ABTS Versione Italiana Version 002 Index M Magneti campo Magnetico ea 11 descrizione del sIStemMa 29 34 dewar del Magnete miccional ideada 34 magneti superconduttori nn nant 34 parte principale aosi aaa aaa 34 o ELETRE p ROPA AEAEE PEE APE ie 11 34 Sicurezza a 9 Magneticamente equivalenti nnne 21 Matching id 40 54 Modalit di Field nnmnnn eeen ee nn 60 Modalita di Shifts iiaa ala rallo 60 N NMR AtlIVO icuar ii aaa 15 NS iaia i lia iii 74 99 NUCI siriana 70 79 NUCLEI tici aaa diritta 79 Nucleo UPO di visir iaa dada iaia ici 13 Nucleo di osservazione a aa a aa iadaaa a aiian 15 O Dl Gialli alia 79 OP lire alp heat aan 79 OF Pea a a E S 70 OPS orde dota idea 70 DES ea aaa 70 Operatore Consolle dell operatore non nnnncnnnnnnnnnannnnns 29 consoll
130. pressa ATTENZIONE mai espellere il campione con il tappo inserito sopra il tubo centrale del magnete Il nuovo sistema di gradienti BOSS 2 costruito in modo da disabilitare la funzione di lift quando il tappo inserito In ogni caso veri ficare sempre che ci sia il flusso d aria udibile facilmente prima di posizionare il campione sul foro centrale del magnete GERI Versione Italiana Version 002 Rotazione del campione Figura 6 2 Inserimento del campione nello spinner 1 4 5 Linea del centro del campo Vite per Vaggiustamento 2 della profondita Per inserire il tubo e lo spinner nel magnete seguire queste procedure 1 Se presente togliere il tappo inserito sopra il foro centrale del magnete 2 Attivare il tasto LIFT sulla tastiera del BSMS Lentamente si udir il rumore del flusso d aria e se ci sar gi un campione all interno del magnete questo us cir spinto dall aria compressa e rester sospeso nella parte superiore del foro centrale del magnete 3 Togliere il vecchio campione dal magnete e posizionarvi il nuovo 4 Premere di nuovo il tasto LIFT Il campione sar posizionato lentamente all in terno del magnete e posizionato nella testa di misura probe 5 Riposizionate il tappo nella parte superiore del foro centrale del magnete Questo molto importante per evitare che particelle metalliche possano cad ere all interno del magnete Rotazione del campione 6 5 Un altra funzione
131. quenchato Questo pu danneggiare permanentemente il magnete oppure no In ogni caso la rienergizzazione del magnete un operazi one lunga e costosa e questi quench dovrebbero essere sempre evitatati Molte delle ricerche tecnologiche sui magneti sono rivolte al difficile compito di as sicurare che la minor quantit possibile di elio che copre la bobina del magnete evapori Questo risultato si ottiene minimizzando il flusso di calore dal laboratorio NMR temperatura ambiente al cuore del magnete 4K Il magnete consiste di molte sezioni La parte esterna del magnete sottovuoto e le superfici interne sono coperte da fogli color argento questo lo stesso principio usato nei thermos solo che nel nostro caso si vuole evitare che il calore entri anzich esca Poi vi una vasca di azoto che riduce la temperatura a 77 35K 195 8 C e finalmente un contenitore di elio all interno del quale immerso la bobina superconduttiva si veda la figura Magnete Superconduttore a pagina 36 GERI Versione Italiana Version 002 Magnete e Dewar del Magnete Foro bore a Temperatura Ambiente 4 6 1 contenitori di elio e di azoto sono posizionati attorno alla colonna centrale cono sciuta come apertura del magnete Un tappo di metallo generalmente chiude le estremit del foro magneti sono disponibili con aperture normali o grandi cam pioni da analizzare vengono introdotti nel magnete dall estremit superioredel
132. r reggere la fase Notate che la correzione della fase conservata come la cali brazione del segnale del TMS a 0 ppm 3 Posizionare il cursore del mouse nella finestra spettrale e premere il pulsante sinistro Il cursore si posizioner automaticamente sullo spettro Posizionare il cursore a 10 ppm circa e premere il pulsante centrale Posizionare il cursore a 1 ppm circa e premere il pulsante centrale Premere il pulsante sinistro per svincolare il cursore La regione fra 1 e 10 ppm ora espansa nella finestra oOo N O dl dA Entrare nel sottomen utilities e premere SW SFO1 quando la regione es pansa visualizzata La SW verr automaticamente impostata come la regione visualizzata e la fre quenza di osservazione SFO1 sar impostata al centro della regione SW Potete verificare nella finestra eda i nuovi valori di SW circa 11 ppm 01Pe SFO1 9 Acquisite un FID trasformate e correggete la fase Notate come l uso di fp non porter probabilmente ad una corretta correzi one di fase Questo una conseguenza dei nuovi SW e SFO1 Potete usare Versione Italiana Version 002 BRUKER 99 131 Spettro protonico apk o correggere la fase manualmente come descritto nel paragrafo Cor rezione della Fase a pagina 95 10 Aumentate a 16 il numero di scansioni acquisite trasformate e fasate un spettro Lo spettro ottenuto dovrebbe apparire come nella figura sottostante Fig
133. ra attraverso la quale si osserva lo spettro Per spettri protonici una SW di 20 ppm sufficientemente larga per vedere tutti i segnali quando la frequenza di trasmissione sulla quale SW centrata SFO1 corretta Il set standard di parametri PROTON che usato in questo manuale ha una SW di 20 6 ppm Un utile funzione quando si ottimizza SW la funzione SW SF01 che si trova nel submenu utilities Questa definisce SW pari al valore della regione mostrata sullo schermo e SFO1 in corrispondenza del centro della schermata SWH Spectral Width in Hertz ampiezza spettrale in Hertz Uguale a SW ma misurata in Hertz invece che in ppm si veda il paragrafo Com posti di Riferimento Hertz ppm a pagina 17 Cambiando il valore assegnato a SW si modifica automaticamente SWH e viceversa Quando un valore arbitrario di SW e SWH viene inserito il software lo aggiusta di poco automaticamente per garantire che dwell time del digitalizzatore abbia un valore discreto Il valore massimo che pu essere assegnato a SWH dipende dal tipo di digitalizzatore FIDRES FID Resolution in Hertz per punto Questo viene calcolato automaticamente in base ai valori di SWH e TD selezi onati Corrisponde al rapporto SWH TD Lo spettro che appare sullo schermo in realt un insieme di punti uniti da linee Ogni punto quindi rappresenta un range di frequenze chiamato FID resolution Pi piccolo il valore del FIDRES pi accurata sar la rappresentazi
134. ra di edasp non ha alcun effetto sull hardware dello spettometro finch non viene dato il comando ii initialize interfaces Anche dopo aver iniz ializzato l interfaccia l effettiva trasmissione di impulsi non comincia fino a che om non si diano comandi del tipo zg gs or go Se i parametri dello spettrometro sono stati cambiati si pu facilmente ripristinare la configurazione normale caricando i set di parametri standard Per esempio digita rpar PROTON clicca su acqu per richiamare i parametri dello spettrometro per l osservazione dell 1H digita par C13CPD clicca su acqu per richiamare i parametri dello spettrometro per l osservazione dell 13C con dis accoppiamento CPD La Finestra edasp 7 4 1 Il software degli spettrometri AVANCE con SGU sono progettati in modo che la configurazione dello spettrometro modifica automaticamente la finestra di edasp In questo modo si vede solo l hardware che effettivamente installato Versione Italiana Version 002 BRUKER 69 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda 70 131 nel proprio spettrometro La finestra di edasp organizzata in varie colonne che sono descitte qui sotto 1 Frequenza Le frequenze dei segnali trasmessi sui canali uno due e tre ecc sono definite dai parametri SFO1 SFO2 e SFO3 ecc rispettivamente Tuttavia queste frequenze non possono essere inserite direttamente si noti che
135. re 02P uguale a 3 ppm 3 Digitare eda e impostare i parametri come indicato nella tabella sottostante Tabella 11 1 parametri eda dopo aver caricato il set di parametri standard C13CPD C13CPD Parametro Nuovo Parametro Commento Valore Valore impostato PULPROG zgpg30 zgpg30 Per una descrizione del pulse program si veda il para grafo 11 5 TD 65536 64k Non cruciale 64K piuttosto grande NS 1K 8 troppo grande Ridurre a 8 DS 2 2 SW 238 ppm 238 ppm Il carbonio copre un ampia regione e a questo punto non opportuno cambiarla O1P 100 ppm Questa frequenza dovrebbe corrispondere al valore di SFO1 di carbon2 1 e pu esserci bisogno di un aggiusta mento O2P 4 ppm 3 ppm Questo non cruciale in quanto CPD disaccoppia una regione RUKER i i i 108 131 GERI Versione Italiana Version 002 Determinare la frequenza di disaccoppiamento Tabella 11 1 parametri eda dopo aver caricato il set di parametri standard C13CPD C13CPD Parametro Nuovo Parametro Commento Valore Valore impostato p1 14 u Il parametro p1 il valore dell impulso 90 gradi di ecci tazione e un impulso della durata di P1 0 33 usato per eccitare il carbonio nel pulse program zgpg30 Si usi il valore usato precedentemente in carbon 2 1 o si digiti getprosol pl1 120 db Si imposti il valore usato precedentemente in carbon 2 1 or s
136. rsi che lo spettrometro spect sia accesso e operante Questo pu essere fatto cliccando sull icona dell Hypertyerminal della CCU sul computer desktop Si noti che si pu usare anche il telnet spect per accedere mediante connessione ethernet 2 Cliccare l icona XWIN NMR sul desktop Attivazione di XWIN NMR da Sistemi SGI IRIX 12 4 2 1 Assicurarsi che lo spettrometro spect sia accesso e operante Questo pu essere fatto aprendo una sessione unix e digitando telnet spect per accedere mediante connessione ethernet 2 Aprire una sessione UNIX 3 Digitare xwinnmr Versione Italiana Version 002 GERI 117 131 Risoluzione problemi di base 118 131 ERIS Versione Italiana Version 002 Figure 1 Introduzione 7 2 Sicurezza Figura 2 1 Azioni preventive nella zona interna ed esterna 10 3 Teoria di base e Terminologia 13 Figura 3 1 Eccitazione e Risposta nana 13 Figura 3 2 Spettro NMR ice 15 Figura 3 3 Analisi NMR del CHC da Figura 3 4 Segnali NMR emessi da CHCI3 16 Figura 3 5 Conversione da Hertz a ppm _ 18 Figura 3 6 Chemical Shifts 1H in Composti Organici 20 Figura 3 7 Anello benzenico 20 Figura 3 8 Spettro del Benzene_ ninas 21 Figura 3 9 Benzilacetato i 21 Figura 3 10 Spettro Protonico del Benzilacetato 22 Figura 3
137. s 5 1 5 2 5 3 5 4 6 1 6 2 6 3 6 4 6 5 6 6 6 7 6 8 7 1 7 2 7 3 7 4 7 5 Probe Duale 13C 1H 39 Cambio del probe neige ien EE 41 Il campione NMR ci ia 43 INTFORUZIONE ci eni lalla 43 Scelta del solvente 43 TUDO NMR citada 44 Manipolazione del campione 46 Procedure di base i 47 Introduzione iaia a i iii 47 Tastiera del BSMS ii idad 47 Salvataggio dei valori delle shim 49 Lettura dei valori delle ShiM 49 Funzioni del BSMS 49 Controllo del campione 49 Controllo manuale del lOCk 50 Funzioni manuali di shim_ 51 Valori degli ShIM cui 51 Funzioni del livello dell elio 51 Inserimento del campione nello Spinner 52 Inserimento del tubo e dello spinner nel magnete 52 Rotazione del campione 53 Sintonia ed accordo dell impedenza della testa di misura probe 54 Sintonia e Accordo di impedenza usando la curva di Wobble io 55 Sintonia ed accordo usando i LED luminosi dell HPPR 57 Sintonia ed accordo su pi di un nucleo 58 Fare il Lock sul campione 58 Procedura per Agganciare il Campione 60 SNIN G eose iii N 62 Shimming iniziale isni a ainai 63 Proc
138. sec RG 128 DU 40 400 usec DUOV 2 525 usec DECIM 16 DSPFIRM sharp standard DIGTYP HADC DIGMOD digital DR E DDR 2 rc se DT PL Array AMP Array x CNST ne Array e NUCLEI edit NUC1 1H i 3 SAVE 1 coL Parameter Noxt CANCEL Esd esda Alterna il display a Passa al prossimo parametro che 1 colonna o corrisponde alla combinazione 2 colonne nel campo Parameter Scrivi una lettera o pi e Invio per selezionare direttamente ogni parametro Clicca qui per vedere la tabella edasp Esci e salva Versione Italiana Version 002 BRUKER 73 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda 74 131 Un esperimento NMR implica l eccitazione del campione con una ben definita se quenza di impulsi RF Tale sequenza definita da un programma di impulsi e consiste di solito in una serie in impulsi intervallati da pause Per distinguere i di versi programmi ad ognuno assegnato un nome Il nome viene introdotto in cor rispondenza del parametro PULPROG Il pulse program zg30 che sar usato in questo manuale spesso usato per semplici esperimenti NMR 1D se necessar io accumulare il segnale AQ_mod Acquisition Mode Modo di acquisizione Determina come i dati acquisiti vengono ripartiti tra i due canali di ricezione Seleziona DQD per spettrometri AVANCE con sistemi SGU TD Time Domain Data Size Dimensione del dominio tempo Il segnale emesso dal campione NMR viene d
139. shim Z in modo da massimizzare il livello del lock Versione Italiana Version 002 PRYSER 63 131 Procedure di base 64 131 6 Si attivi il tasto Z2 Si aggiusti la shim Z2 in modo da massimizzare il livello di lock Potrebbe essere necessario ridurre il LOCK GAIN per mantenere il seg nale sullo schermo 7 Si ripetano i punti 5 e 6 finch non si osserva ulteriore miglioramento 8 Infine si aggiusti il LOCK PHASE in modo da massimizzare il livello di lock 9 Si fermi la rotazione del campione e si aggiustino le shim X e Y X Y Z0 in modo da massimizzare il livello di lock NOTA Con il passare del tempo le condizioni interne ed esterne al magnete pos sono cambiare leggermente e per ottenere ottime prestazioni potrebbe essere necessario aggiustare anche shim di ordine superiore quali Z3 Z4 e Z5 Inoltre per campioni in H20 D20 potrebbe essere necessario uno shimming pi accurato per ottenere una migliore soppressione dell acqua Il livello del lock non il miglior criterio per valutare omogeneit del magnete Sebbene una descrizione sia oltre lo scopo di questo manuale la forma della riga larghezza e simmetria infatti un indice migliore dell omogeneit del campo magnetico Aumentando la propria esperienza l utente potr discutere con il re sponsabile del sistema la necessit di ottimizzare shim di ordine superiore usan do la forma di riga Si noti che esiste una procedura chiamata gradshim grad
140. sicuratevi che SFO1 sia selezionato sulla frequenza finale di trasmissione Fate click su ACQU 2 Digitate il comando wobb 3 Osservando la curva di risposta migliorate la sintonia e l accordo agendo sulle apposite astine R RUKER Versione Italiana Version 002 Sintonia ed accordo dell impedenza della testa di misura probe 4 Quando avete ultimato digitate o selezionate stop Se necessario potete impostare il parametro WBST su 1K e WBSW su 4MHz se non lo sono gi Questo pu essere fatto nella finestra dei parametri in eda o digitato direttamente nella line di comando Sintonia ed accordo usando i LED luminosi dell HPPR 6 6 2 Questo metodo si utilizza solo quando il monitor posizionato in modo da non es sere visibile mentre si aggiustano le astine di sintonia e di accordo La sola differ enza di questo metodo che le regolazioni si fanno osservando i LED verdi e rossi del pannello superiore luminoso dell HPPR La riga orizzontale dei LED rappresenta la sintonia e quella verticale l accordo Le regolazioni devono essere fatte in modo da minimizzare il numero di LED illumi nati in entrambe le direzioni Come nella routine di wobb le astine di sintonia ed accordo devono essere aggiustate in sequenza Un probe propriamente sintoniz zato ed accordato deve mostrare solo uno o due LED illuminati in entrambe le direzioni notate che un solo LED illuminato rappresenta zero segnale riflesso NOTA Per m
141. solo quando sono necessari dei minimi aggiustamenti del valore dei gradienti Funzioni del livello dell elio 6 2 7 HELIUM LEVEL Lo spettrometro effettua automaticamente una misura del livello dell elio ogni 24 ore e lo salva in un determinato file L impostazione standard di salvataggio di questo file nelle seguenti cartelle Windows NT 2000 C Bruker Xwin nmr LINUX opt xwinnmr SGI u Il livello mostrato in percentuale es 100 pieno Quando si preme il relativo tasto gli ultimi due valori sono mostrati sul pannello luminoso per 5 secondi il pi recente quello di destra In questo modo non si effettua nessuna nuova misura Quando il livello dell elio scendo sotto un certo livello dipendente dal tipo di mag nete viene mostrato sul pannello luminoso un segnale di allarme e si deve pro cedere con la ricarica al pi presto Versione Italiana Version 002 ABRIS 51 131 Procedure di base HELIUM MEASURE Prima che la misura sia effettuata sono necessari 12 secon di Si fa notare che la misura dell elio induce un piccolo aumento del consumo perci tale funzione non deve essere usata troppo spesso Inserimento del campione nello spinner 6 3 Il tubo di vetro contenente la sostanza da analizzare tenuto da uno spinner di plastica Il misuratore di profondit del campione fornito per controllare les atta posizione del tubo all interno dello spinner in modo che il campione stesso sia perfettamen
142. sotopi di carbonio che si trovano in natura solo uno NMR attivo Purtroppo l isotopo pi abbondante 12C abbondanza naturale 98 89 inattivo Quindi l analisi NMR di composti organici per il carbonio si basa su segnali emessi dall isotopo 13C che ha una ab bondanza naturale solo dell 1 11 Naturalmente l analisi NMR del carbonio pi difficile di quella per esempio del protone ci sono comunque altri fattori da cui dipende la sensibilit questi fattori saranno discussi nel prossimo paragrafo di questo capitolo Versione Italiana Version 002 GEMINI 15 131 Teoria di base e Terminologia Sulla base della breve introduzione all NMR un buon esercizio vedere in che modo si utilizza la tecnica NMR per analizzare la composizione del cloroformio CHCI3 Analisi NMR del Cloroformio 3 2 Tre esperimenti separati come indicato nella figura sottostante possono essere condotti per osservare i nuclei 1H 13C e 35Cl Figura 3 3 Analisi NMR del CHCIz Es CI E CI E gt E3 CI CE C H C C2H CI C H fs CI As Cl As Pi CI Es Asa Eccitazione E 1 Eccitazione E 2 Eccitazione E3 Intensita 16 131 Tre impulsi di eccitazione E1 E2 E3 alle appropriate frequenze portanti vengono mandati al campione E1 corrisponde alla frequenza di risonanza di 1H E2 alla frequenza del 13C e E3 alla frequenza del 35Cl Nell ipotesi che i tre isotopi vengano eccitati in modo efficiente il campione emette segnali alle
143. ta allora il gain deve essere abbassato D altra parte se il gain troppo basso e non si usa appieno il range dinamico del digitalizzatore dovrebbe essere aumentato Quando si osserva l ampiezza del FID sullo schermo bene che la scala verticale sia quella di default Il gain pu essere inserito automaticamente con il comando rga che fortemente consigli ato per i nuovi utenti 76 131 ERYS Versione Italiana Version 002 Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda Figura 7 5 FID distorto a causa di un valore troppo elevato di RG m DW Dwell Time Con l introduzione dei filtri digitali e dell oversampling sovracampionamento questo parametro meno significativo Rappresenta l intervallo di tempo in micro secondi tra la digitalizzazione di due punti del FID raccolti in modo da soddisfare il teorema di Nyquist Viene calcolato internamente in microsecondi dalla formula DW 106 2 SWH DWOV Oversampling Dwell Time Questo l effettivo tempo DW usato dal digitalizzatore qualora i filtri digitali e l oversampling siano stati abilitati selezionando come parametro DIGMOD vedi sotto digital o homodecoupling digital Il valore di DWOV calcolato interna mente DECIMATION Decimation Rate of Digital Filter velocit di decimazione del filtro digitale Questo il rapporto tra DW e DWOV e rappresenta il fattore per cui il FID sov racampionato E calcolato internamente con la f
144. taliana Version 002 Shimming Una misura delllomogeneit del campo data dall altezza del segnale di lock sul lo schermo il livello del lock a valori di potenza e guadagno del lock costanti All aumentare del livello del lock l omogeneit aumenta Un metodo di shimming quindi quello di osservare il livello del lock ed aggiustare la corrente degli shim fino a che non ci saranno miglioramenti del livello del lock Nota il livello del lock non il solo modo per misurare l omogeneit del campo Pu essere usata anche la forma e l area del FID Le sezioni seguenti mostrano le due principali categorie di modalit di shim che si possono identificare Shimming iniziale 6 8 1 Quando il magnete energizzato per la prima volta deve essere shimmato da zero del tecnico installatore Il valore della corrente per ogni bobina di shim sar ottimizzata individualmente La procedura complicata dal fatto che molte shim sono interdipendenti ed ag giustandone una pu essere necessario riaggiustarne molte altre Il magnete deve essere shimmato per ogni probe che si utilizzer I valori di shim di un particolare probe possono essere salvati in un file di shim in modo che sia possibile richiamarli facilmente quando si cambier il probe Consultatevi con il responsabile dello strumento per sapere quali shim file utilizza re per ogni probe Procedura di Shimming 6 8 2 Quando lo shimming iniziale completato l operazion
145. tamenti necessari al fine di mantenere la temperatura richiesta Infine alla base del probe possibile notare un certo numero di viti etichettate con T tuning o sintonia o M matching o accordo d impedenza Questo sono uti lizzate al fine di effettuare aggiustamenti fini sul probe per ottimizzarne le WEE Versione Italiana Version 002 Probes prestazioni L analisi di un composto realizzata eccitandolo con segnali di una frequenza definita la frequenza di risonanza Nuclei diversi saranno eccitati da diverse frequenze e quindi l operazione di sintonizzazione riguarda un aggiusta mento del circuito interno del probe al fine di renderlo pi sensibile alla frequenza di interesse Per ridurre al minimo la riflessione del segnale di eccitazione viene anche corretta l impedenza del probe Sia la sintonia che l impedenza sono collegate tra loro per cui vanno corrette inter attivamente e non si pu quindi operare in modo indipendente l una dall altra Per lavori di routine in solventi organici una volta ottimizzata la sintonia e l impe denza probabilmente sufficiente riverificarle su base settimanale o mensile Viceversa per lavori di ricerca nel quale le prestazioni dello spettrometro vanno ottimizzate opportuno controllare sintonia ed impedenza ogni volta che si cam bia campione Ogni bobina nel probe viene corretta separatamente in sintonia e impedenza usando la routine wobble descritta in Sintonia ed accordo
146. te all interno del campione Questo si ottiene tramite una oscillazione continua aumentando e diminuendo del campo magnetico all interno del magnete Ad un determinato valore di campo magnetico gli atomi di deuterio verranno eccitati alla loro naturale frequenza di risonanza e questo ge nerer un segnale osservabile nella finestra del lock Ci sono due fasi distinte Durante la prima fase il campo magnetico attorno al campione viene fatto oscillare ed quindi il campione si aggancia locked tasti della tastiera del BSMS che controllano queste oscillazioni sono descritti qui di seguito SWEEP RATE La velocit delle oscillazioni del campo magnetico pu essere variata SWEEP AMPLITUDE Le oscillazioni del campo magnetico sono continue per un certo intervallo L ampiezza di questo intervallo modificabile tramite questo tas to SWEEP Attiva e disattiva l oscillazione del campo magnetico Loscillazione au tomaticamente disattivata non appena il segnale di lock viene agganciato LOCK ON OFF Quando si seleziona questa funzione lo strumento tenta di ag ganciare il lock Il LED verde inserito nel tasto lampegger per qualche secondo fino a diventare fisso non appena il segnale di lock sar realmente agganciato Nelle condizioni standard l acquisizione del segnale dovr essere fatta solo se lo spettrometro sar in condizioni di lock agganciato LOCK POWER Regola il livello di potenza del segnale usato per ec
147. te allineato con le bobine di ricezione all interno del probe di misura Sul misuratore c una scala graduata che pu essere usata per posizionare la profondit del tubo 1 Guardando la scala graduata posizionare la parte superiore di plastica bianca della vite di regolazione fra 18 e 20 mm al di sotto della linea centrale linea dello Omm per le sonde di 5mm Per le sonde di 10mm posizionare la vite a 20mm sotto della linea centrale Questi sono dei valori di profondit standard raccomandati si dovr consultare il responsabile del sistema per la posizione corretta in caso di magneti e sonde di misura particolari Una volta stabilita la profondit corretta questa dovr es sere sempre la stessa in modo da minimizzare la necessit di aggiustare i gra dienti di shim dovuta al cambiamento della profondit 2 Tenendo il tubo nella parte superiore inseritelo nello spinner e lo spinner nel misuratore di profondit 3 Con molta cura spingere il tubo all interno dello spinner fino a quando il livello inferiore e superiore della sostanza sono equidistanti rispetto alla linea dello Omm Se c abbastanza sostanza nel tubo spingerlo fino a che sfiori la base di plastica bianca 4 Rimuovere il misuratore di profondit prima di inserire lo spinner all interno del magnete Inserimento del tubo e dello spinner nel magnete 6 4 52 131 L inserimento e l espulsione del campione sono controllate da un flusso di aria com
148. te enfatizzare che il sistema di con trollo dell acquisizione ha il totale controllo dello strumento durante un esperimen to per assicurare che l operazione non sia interrotta e garantire quindi l integrit dell acquisizione L unit contiene un insieme di schede digitali ed analogiche es traibili che prepararono il segnale che deve essere trasmesso e anche ricevono GERI Versione Italiana Version 002 Connessione tra Host Computer e AQS amplificano e digitalizzano il segnale Una trattazione approfondita di queste schede non tra gli scopi di questo manuale BSMS Questo sistema controllato mediante la tastiera BSMS o via software commando bsmsdisp ed usato per operare sul lock sul sistema di shim e controllare l espulsione l inserimento la rotazione del campione VTU A seconda del modello la VTU pu essere un unit separata o essere incor porata nel BSMS La sua funzione quella di cambiare la temperatura del campi one in modo controllato e mantenerne costante il valore Amplificatori conosciuti anche come trasmettitori Per eccitare dei campioni sono necessari dei segnali di ampiezza relativamente grandi e sono quindi richi esti degli amplificatori Gli amplificatori possono essere interni incorporati nell unit AQS o esterni unit separate L uscita degli amplificatori collegata direttamente all HPPR mediante dei cavi e consente di inviare segnali RF al cam pione Sebbene vi sia una grande
149. tempo di rilassamento del campione e dalla sensibilit al riscaldamento ed inserito in corrispondenza di DS Valori tipici per esperimenti standard sono 4 o 8 D array Delay DO D31 lista dei delay Cliccando su questo parametro nella tabella di eda si visualizza una lista di 32 intervalli delay denominati da DO a D31 Ciascuno di questi 32 delay possono essere inseriti separatamente e incorporati nel pulse program Si noti che se un delay scritto come numero senza unit di misura di default in secondi Tutta via questo pu essere cambiato digitando u per microsecondi o m per millisec ondi prima di dare l invio se si vogliono vedere solo 16 delay nella lista basta selezionare il 2 column display Il delay D1 quasi sempre usato come delay per il rilassamento Di solito pi veloce mettere i delay in modo esplicito scrivendo nella linea di co mando piuttosto che usare la tabella in eda Sebbene i delay appaiano in eda in maiuscolo quando si inseriscono in un pulse program o sono digitati manual GERI Versione Italiana Version 002 Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda mente nella linea di comando di XWIN NMR occorre usare il carattere minusco lo P array Pulse PO P31 lista degli inpulsi Una lista di 32 possibile lunghezze di impulso pulse width possono essere incor porate in un pulse program L unit si misura di default il microsecond
150. to equivalente a calibrare il picco del TMS a 0 ma il picco del TMS non ancora visibile Figura 10 1 Spettro 13C di Colesterolo acetato Singola scansione Senza Dis accoppiamento Current Data Parameters NAME cholac C EXPNO 1 PROCNO 1 F2 Acquisition Parameters 0011108 17 16 drx600 Smm H C N 26 zg 16384 cDC13 1 0 37593 984 2 294555 Hz 0 2179705 sec 2 13 300 usec 6 00 usec 303 0 K 2 00000000 sec amas CHANNEL fl smunena 13C 12 20 usec 5 00 dB 150 9178393 MHz F2 Processing parameters 16384 EM 00 Hz SER TR RR RR a a il ES E 200 180 160 140 120 100 _ 80 60 40 L utente pu ora decidere che il livello di rumore nello spettro deve essere ridotto aumentando il numero di scansioni 15 Creare il data set carbon 2 1 16 Impostare NS uguali a 8 16 32 o 64 17 Acquisire il FID eseguire trasformata di Fourier e correzione di fase La figura seguente un tipico spettro 13C di colesterolo acetato dopo 64 scansio ni Versione Italiana Version 002 ARTSA 105 131 Spettro 13C con disaccoppiamento Figura 10 2 Spettro 13C di Colesterolo acetato 64 Scansioni Senza Disaccoppi amento Current Data Parameters NAME cholac C EXPNO 2 PROCNO 1 F2 Acquisition Parameters 20011108 spect 5mm H C N 26 zg 16384 CDC13 64 0 37593 984 Hz 2 294555 Hz 0 2179705 sec 2 13 300 usec 6 00 usec 303 0 K 2 00000000 sec CHANNEL fl 13c 12 20 usec 5 00 dB 15
151. tre frequenze f1 f2 ed f3 che saranno registrate su tre spettri separati Se i segnali emessi fossero mostrati in un unico plot utente si potrebbe aspettare uno spettro simile a quello della figura 3 4 Si noti che le frequenze del segnale illustrate sono quelle di un magnete a 11 7 Tesla e che tutti i segnali sono rappresentati come singoletti cio singoli picchi Figura 3 4 Segnali NMR emessi da CHCI 35C1 1H 13C Ly T T Y T 200 lt Frequenza MHz 126 49 Geena Versione Italiana Version 002 Composti di Riferimento Hertz ppm Questo spettro artificiale mostra tre picchi che corrispondono ai tre isotopi Tenen do conto del numero relativo dei tre isotopi uno si potrebbe aspettare che linten sit dei picchi di idrogeno carbonio e cloro fosse 3 1 1 Ad ogni buon conto bisogna tenere conto dell abbondanza naturale dei tre isotopi si veda Tabella 3 1 e quindi attendersi un rapporto 227 100 1 L utente pu verificare che l inten sit dei picchi determinata sperimentalmente non in accordo con questi valori Il motivo di questa discrepanza la sensibilit intrinseca alla tecnica NMR di cias cun isotopo L 1H 63 volte pi sensibile all NMR del 13C Questo significa che se anche un campione contenesse lo stesso esatto numero di nuclei 1H e di nu clei 13C l intensit dei segnali 1H sarebbe 63 volte quella dei 13C Con un plot come quella presentato in Figura 3 4 si perderebbe ogni informazi one dett
152. tro occorre salvare la tabella eda prima di entrare in edasp LOCNUC Nome del NUCleo di LOCk Di solito 2H deuterio anche se a volte si usa 19F fluoro quando il segnale del deuterio potrebbe interferire con quelli del campione di interesse Il lock su 19F richiede un hardware particolare NUC1 Nome del NUCleo da osservare Il nome del nucleo da osservare Il nucleo osservato di solito definito usando un menu diverso edasp che sovrascriver i parametri di eda Per informazione il nucleo di osservazione mostrato anche nella tabella eda 01 Frequenza di Offset della trasmittente per il canale F1 in Hz SFO1 Frequenza della frequenza Questa la frequenza usata per eccitare il nucleo di osservazione canale logico F1 e si trova al centro dello spettro Pu essere pensato come la frequenza cen trale della finestra attraverso la quale si osserva lo spettro O1P Frequenza di Offset della trasmittente per il canale F1 in ppm BF1 Frequenza di Base di trasmissione per il canale F1 espressa in Hz Questa frequenza impostata automaticamente a seconda del nucleo per esempio 13C 1H di osservazione Versione Italiana Version 002 GERI 79 131 Preparazione dell Acquisizione Data Sets i comandi edasp eda L uso corretto dei tre parametri spiegato di seguito Si dovrebbe notare che per convenzione nella spettroscopia NMR le frequenze sull asse orizzontale aumen tano da destra a sinistr
153. tro passate al capitolo seguente dopo aver eseguito i passaggi dall 1 al 4 Se state utilizzando un probe non ottimizzato per l osservazione del carbonio sar necessario sostituirlo La procedura di sosti tuzione del probe illustrata nel paragrafo Cambio del probe a pagina 41 ma sempre opportuno consultare il responsabile dello spettroemtro NMR per queste operazioni Procedura 10 2 1 Sostituire il campione di 100 mg di colesterolo acetato in CDCI3 usato nel paragrafo precedente con il campione da 1 g nello stesso solvente L NMR del carbonio meno sensibile rispetto a quello del protone cos l uso di un campi one pi concentrato preferibile 2 L inserimento del nuovo campione causer la perdita del lock Si esegua il lock sul nuovo campione come descritto nel paragrafo Procedura per Aggancia re il Campione a pagina 60 3 Correggere le shim Z e Z2 finch il livello del lock sia ottimizzato si veda il paragrafo Procedura di Shimming a pagina 63 4 Se non gi stato fatto eseguire la correzione di sintonia ed impedenza del probe per osservare 13C come descritto nel paragrafo Sintonia ed accordo dell impedenza della testa di misura probe a pagina 54 5 Usare il mando edc per creare un nuovo data set per esempio carbon 1 1 6 Caricare l insieme dei parametri C13CPD mediante il comando rpar C13CPD all 7 Digitare edasp impostare 13C su Channel F e tutti gli altri canali s
154. u off 8 Digitare eda e introdurre i valori dei parametri come mostrato nella tabella ri portata di seguito Si pu effettuare il commando as o ased per verificare in modo conveniente se parametri sono impostati ai valori corretti Versione Italiana Version 002 GEIN 103 131 Spettro 13C con disaccoppiamento Tabella 10 1 Parametri eda Parametro Valore Commento Pulprog zg30 TD 16k NS 16 Paragonabile al precedente spettro protonico DS 0 d1 2s SW 250ppm gli spettri al carbonio coprono una regione spettrale maggiore rispetto al protone O1P 100ppm E un valore indicativo ottimizzato in seguito 100 ppm il valore Tip ico utilizzato nei set di parametri standard per il carbonio RG 8k in alternativa si pu utilizzare il comando rga per calcolare il guadagno del ricevitore P1 Il parametro p1 la lunghezza dell impulso di eccitazione a 90 gradi l impulso di lunghezza P1 0 33 l unico impulso presente nella sequenza 2930 Interpellate il Responsabile dello spettrometro NMR su quale sia il valore di P1 corretto per il vostro strumento oppure utiliz zate getprosol Se conoscete il comando paropt potete ottimizzare p1 da soli L esperimento dovrebbe funzionare anche se p1 non stato ottimiz zato la sensibilit sar ridotta pl1 anche in questo caso interpellate il Responsabile dello spettrometr
155. udere eventuali segnali per si Tuttavia questo ha lo svantaggio di aumentare FIDRES minore il valore del FIDRES migliore la risoluzione GERI Versione Italiana Version 002 Parametri di Acquisizione di Base la Tabella eda b E preferibile lasciare la finestra spettrale inalterata e assegnare un nuovo va lore ad O1 in modo da spostare il centro della finestra Nel nostro esempio i segnali osservati si trovano tutti nella zona attorno a 600 138 MHz quindi si vorr spostare il centro della finestra a questa frequenza gt SFO1 600 138 BF1 O1 gt 600 138 600 13 O1 gt 01 0 008 MHz 8 kHz Quindi se O1 la frequenza di offset di 8 kHz la finestra viene spostata e sar come quella di Figura 7 8 Figura 7 8 Spettro con BF1 600 13 MHz 01 8 kHz 20 HZ lt Frequenza MHz 600 148 600 138 re 600 128 Infine chiaro dalla figura qui sopra che i segnali NMR emessi dai protoni nel nostro campione ipotetico occupano solo una frazione della finestra spettrale Quindi l ampiezza spettrale pu essere ridotta senza perdere dati significativi Un vantaggio della diminuzione di SW che la risoluzione spettrale migliora Lo svantaggio che il tempo di acquisizione aumenta proporzionalmente Nel Capitolo 3 Teoria di base e Terminologia a pagina 13 si dice che i chem ical shift protonici raramente superano i 14 ppm Questo corrisponde a 8 4 kHz in uno spettrometro a 600 MHz La
156. ue termini FID Dominio tempo e il corrispondente Spettro Dominio frequenze Quando si effettua un acquisizione i dati grezzi sono acquisiti e il segnale ricevu to denominato FID Free Induction Decay Nella Figura sottostante riportato un tipico FID GERI Versione Italiana Version 002 FID e Spettro Figura 3 15 Trasformata di Fourier Intensita Trasformata di Fourie Spettro Intensita Frequenza Prima che un FID possa essere analizzato in modo utile deve essere trasformato nel Dominio Frequenze Questo si ottiene applicando una trasformata di Fourier mediante il comando FT La Trasformata di Fourier un operazione matemat ica che converte il FID in uno spettro di frequenze Un FID un segnale la cui in tensit varia nel tempo mentre in uno spettro l intensit funzione della frequenza La trasformata di Fourier l operazione matematica pi importante di tutta una serie di operazioni di elaborazione che si compiono sui dati grezzi Versione Italiana Version 002 BRUKER 27 131 Teoria di base e Terminologia 28 131 ERIS Versione Italiana Version 002 Descrizione del Sistema Introduzione 4 1 Lo spettrometro consiste nelle seguenti sottounit Consolle dell operatore comprendente host computer monitor tastiera e tasti era del BSMS Consolle contenente la parte elettronica Sistema magnete comprendente sistema di Shim preamplificatori HPPR e pro
157. uno Per i precisi dettagli di solventi specifici il let tore dovrebbe fare riferimento a un testo NMR 5 3 Quando un campione deve essere analizzato pu essere ruotato a secondo del tipo di esperimento e di probe Far ruotare il campione ha l effetto di eliminare le disomogeneit del campo magnetico nella direzione Z e quindi migliora la risoluz ione spettrale Uno svantaggio della rotazione che si potrebbero introdurre spinning sideband Le spinning sideband sono segnali spuri cio picchi che derivano dalla modulazione del campo magnetico alla frequenza di risonanza L intensit delle spinning sideband sono proporzionali all intensit del segnale ve ro Quindi se la velocit di rotazione di 20 giri secondo 20 Hz le spinning side bands appaiono a 20 Hz sopra e sotto le frequenze di risonanza dei segnali veri GERI Versione Italiana Version 002 Tubo NMR Figura 5 1 Spettro con Spinning Sidebands Satelliti 13C N Re uti 100 Hz Mentre la presenza delle spinning sidebands pu essere inevitabile la loro inten sit spesso dipende dalla qualit del tubo Idealmente il tubo dovrebbe essere di simmetria perfettamente cilindrica Raramente elevate spinning side bands sugg eriscono che il tubo non sufficientemente simmetrico e quindi che l uso di tubi con specifiche migliori e quindi di costi maggiori raccomandabile tubi devono essere sempre mantenuti puliti privi di polvere
158. ura 9 7 Spettro Protonico del Colesterolo Acetato Current Data Parameters NAME cholac H EXPNO 2 BRUKER PROCNO 1 F2 Acquisition Parameters Date_ 20011109 Time 17 17 drx600 5mm H C N z6 zg30 65536 cDC13 16 2 6613 757 Hz 0 100918 Hz 4 9546471 sec 12 7 75 600 usec 6 00 usec 300 0 K 1 00000000 sec ammansa CHANNEL fl manaa F2 Processing parameters SI 32768 no 0 00 Hz sedici scansioni SW 11 ppm segnale del TMS calibrato a 0 ppm Aumentare il numero delle scansioni 9 11 Il rapporto segnale rumore di uno spettro pu essere aumentato con un maggior numero di accumuli o scansioni L aumento quantitativo e proporzionale alla radice quadrata del numero delle scansioni Es 64 scansioni incrementeranno la sensibilit di un fattore 8 paragonata a quella Di una singola scansione a discap ito del tempo di acquisizione Il numero delle scansioni determinato dal parametro di acquisizione NS 1 Digitare edc 2 Impostare uguale a 3 il parametro EXPNO L esperimento corrente ora protone 3 1 3 Digitare eda ed impostare NS 64 100 131 EEE Versione Italiana Version 002 Aumentare il numero delle scansioni in alternativa digitare ns da linea di comando e inserire il numero delle scan sioni 4 Digitare acqu per osservare la finestra di acquisizione 5 Digitare zg 5 Si noti come la finestra di acquisizione mostri ora il progressivo accumul
159. ura e le procedure di omo geneit Questo capitolo pu essere saltato se si conoscono gi tali procedure Nota Alcuni sistemi potrebbero essere sprovvisti della tastiera del BSMS in questi casi il BSMS E controllato dal software digitando il comando bsmsdisp Tastiera del BSMS 6 2 La descrizione completa di tutte le funzioni della tastiera del BSMS e la gestione delle singole Funzioni disponibile nel Manuale dell Utente del BSMS incluso nel CD BASH in dotazione con lo strumento Per l uso del seguente manuale si assume che l utente sia gi a conoscenza delle funzioni di base su come utilizzare la tastiera del BSMS Sono disponibili alla pa gina 47 nel paragrafo Funzioni del BSMS l elenco delle funzioni pi importanti della tastiera del BSMS La tastiera del BSMS utilizzata per le seguenti funzioni 1 Controllare le funzioni del lock 2 Controllare la rotazione e l espulsione inserimento del campione 3 Modificare la corrente nel sistema di shim esterno operazione chiamata shimming 4 Monitorare il livello dell elio all interno del magnete Esistono varie versioni di tastiere ma la loro distinzione non importante per il momento Vedi l esempio della figura Tastiera BSMS Versione BOSS a pag ina 48 ATTENZIONE Prima di iniziare fare attenzione all uso dei seguenti due tasti Versione Italiana Version 002 GERI 47 131 Procedure di base 1 Il tasto HELIUM MEASURE bene n
160. variet di amplificatori disponibili comprenden do anche quelli per solidi le due principali categorie sono Amplificatori selettivi anche conosciuti come 1H o amplificatori del pro tone sono progettati appositamente per amplificare le frequenza pi alte associate a nuclei quali 1H e 19F Amplificatori a banda larga anche conosciuti come amplificatori X sono progettati per amplificare un ampio intervallo di frequenze escludendo 1H e 19F La potenza RF entra nelllamplificatore mediante il connettore di tipo SMA individ uato con l etichetta RF in Questa un segnale a bassa intensit con al massi mo un ampiezza di 1Vpp La qualit di questo segnale in ogni caso cruciale poich ha la frequenza la forma la fase e il timing del segnale finale Gli utenti pi esperti possono visualizzare questo segnale su un oscilloscopio La funzione dell amplificatore di prendere il segnale di ingresso e applicargli un fattore fisso di amplificazione Nella scheda SGU prima dell amplificatore implementato il controllo delllampiezza mediante i parametri pl0 pl31 Il segnale RF di uscita dall amplificatore pu essere dell ordine di diverse centinaia di volt e si raccoman da di non visualizzarlo su un oscilloscopio senza inserire un attenuatore Connessione tra Host Computer e AQS 4 4 Anche se durante una tipica sessione di XWIN NMR il collegamento perma nentemente attivo e trasparente all utente il collegamento cad

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