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1. prova Q 0 02 ml min Q 0 04 ml min 10 10 SP E a as E E E E v 5 5 o 2 prima prova Fa prima prova seconda prova seconda prova 0 0 0 0 005 0 01 0 015 0 0 005 0 01 0 015 Volume ml Volume ml Figura 4 4 Curve P V del vaso nelle due condizioni di prova Q 0 02 ml min pannello di sinistra e Q 0 04 ml min pannello di destra Le rette azzurre Q 0 02 ml min e rosse Q 0 04 ml min identificano il tratto di curva in cui stato calcolato il valore di compliance 94 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici La compliance del vaso stata quindi stimata nel tratto lineare delle curve riportate in Figura 4 4 compreso tra 5 e 10 mmHg Il valore di compliance stato calcolato come rapporto incrementale tra le variazioni di volume normalizzate rispetto il volume interno del vaso Vo e gli incrementi di pressione AV _ AV c 7h W mmH g 2 Nell equazione 2 11 pedice 2 indica il valore di volume pressione corrispondente al valore massimo di volume pressione del tratto in cui si calcolata la compliance mentre il pedice 1 il valore minimo Il volume interno Vo del vaso in condizioni scariche cio il valore del volume all inizio della prova associato alla pressione di 0 mmHg stato calcolato essere pari a 43 ul Il valore medio di compliance ricavato per la prova condotta a Q 0 02 m
2. J J Figure 17 Area of stimulation control volume automatic mode The user can choose the control mode between 1 volume control with manual mode Allows you to manually select the direction of rotation and infusion withdraw flow rate 11 automatic volume mode that Abstract allows you to choose the stimulation pattern as a sequence of three stages infusion aspiration rest duration and flow rate of each phase In this mode the transition from one phase of infusion withdraw to the next is determined by comparing the volume delivered by the pump acquired from SW and the volume target set by the user In this mode the duration of the phase of rest depends on the comparison between a counter and the duration of the phase set by the user 111 automatic pressure limitation the user sets two values of pressure threshold a minimum and a maximum in which he wants to keep the stimulation The SW acquires the pressure signal from the sensor and determines the transition to the next phase of the stimulation pattern when it is reached one of the two thresholds The second macro area of the control panel is dedicated to the monitoring of the stimulation Figure 5 ev hcne ImWmentig 5 E Ratrasd every oys Eo Chew Chani Complisace een R OO EOE Woburn ml o 5 J S 0001 7 600 aw Gee OF 2004 05 2006 0 05 90 00 00 0000 Sakame imil Time lhtemmas Figure 18 Monitorin
3. monitorare 1 parametri biologici delle cellule e o tessuti come le concentrazioni dei fattori di crescita e delle altre componenti nutrienti antibiotici sali ecc presenti nel medium di coltura fornire al tessuto in formazione stimoli meccanici come compressione sforzi idrodinamici sforzi di taglio e gradienti di pressione a seconda del tessuto ridurre 1 fenomeni di moto turbolento del fluido minimizzare il volume di priming di tutto il circuito per ridurre 1 costi facilitare l inserimento e la semina dello scaffold all interno della camera di coltura permettere una facile pulizia e sterilizzazione dei componenti che formano il bioreattore avere dimensioni limitate da permetterne l alloggiamento all interno di incubatori standard Tutti 1 bioreattori devono soddisfare questi requisiti generali poi ognuno pu soddisfare ulteriori requisiti in funzione delle differenti applicazioni per il quale stato progettato Esistono quindi varie tipologie di bioreattori per differenti applicazioni che andremo di seguito a descrivere brevemente 1 4 1 Bioreattore spinner flask I bioreattori spinner flask sono composti da pochi elementi e la loro architettura relativamente semplice Uno o pi scaffold sono immersi in una camera riempita con medium per colture cellulari e sospesi in esso tramite degli aghi Figura 1 4 Tramite la rotazione di una barretta magnetica posta all interno della camera vien
4. chiaro come altre specifiche debbano essere introdotte Non pi solo sufficiente ricreare le condizioni presenti in vivo e sollecitare il costrutto con opportuni stimoli ma necessario anche il monitoraggio di queste condizioni e stimolazioni per permettere ad esempio un ricambio del medium automatico una volta esausto o il controllo nel caso di applicazioni di stimoli meccanici dei valori di deformazione imposti dal sistema di attuazione al tessuto in crescita Il sistema di coltura deve quindi consentire di automatizzare 1l processo 15 Capitolo 1 Introduzione caratteristica propria di tutti 1 processi industriali Ci permette inoltre un alto grado di riproducibilit e standardizzazione delle prove 11 L automazione del processo permette di ridurre 1 costi di produzione rispetto a un sistema che prevede l intervento manuale dell operatore in molte sue fasi fattore non trascurabile nella produzione in larga scala di qualsiasi prodotto Il fine ultimo dell ingegneria dei tessuti produrre costrutti ingegnerizzati che abbiano le propriet e le caratteristiche adeguate per poter essere utilizzabili poi in ambito clinico Per passare a questa fondamentale fase del processo il bioreattore deve soddisfare ulteriori specifiche volte a garantire la sicurezza e l incolumit dei pazienti che riceveranno questo tipo di costrutti come la sterilit 11 rispetto di determinati standard di qualit e l adozione di pratiche
5. elettrovalvola nei due stati Il motivo principale per cui si vuole comandare 1 EV tramite il SW di sincronizzare lo switch dell EV con le differenti fasi della stimolazione es infusione aspirazione rest In tal modo possibile far commutare PEV nello stesso istante temporale di passaggio tra una fase di stimolazione e l altra Lo scopo del circuito quindi quello di permettere la gestione dello switch dell EV tramite un segnale generato dalla scheda NI DAQ e quindi tramite il PC La soluzione implementata consiste nel comandare EV tramite un rel meccanico il quale a seconda della tensione fornita ai capi della sua bobina permette o meno il passaggio della tensione di alimentazione fornita da un alimentatore integrato TXL 015 12S Traco Power al carico nel nostro caso l EV Il rel quindi funge da interruttore consentendo o meno il passaggio dell alimentazione al carico e provocando quindi la commutazione del magnete dell EV Il rel per richiede comunque troppa potenza 0 36 W alla tensione di alimentazione nominale 10 V ed una corrente di 36 mA per essere comandato tramite la scheda NI DAQ Il rel deve quindi essere a sua volta controllato tramite un circuito pilota costituito da un transistor BJT e una resistenza resistenza di guadagno del BJT potenziometro Il transistor richiede una corrente in entrata alla base molto bassa lt 5 mA e una tensione di 5 V questi valori consentono al transistor di
6. on biological soft tissues In particular the control system applies a pressure stimuli through the infusion or withdrawal of a pressurized fluid that acts on the tissue organ In the following of the summary we will proceed initially to describe the hardware and software of the control system developed in this thesis Will be discussed the user interface the general architecture of the SW and the tests carried out to verify the SW Furthermore will be described the practical applications of the control system in biological field biomechanical characterization of biological tissues Development of control system s HW and SW In the present work both HW and SW of the control system are developed The HW components used in this project are 1 a volumetric pump 11 a pressure sensor 111 a solenoid pinch valve EV and iv the wiring needed to send and receive the signals of all components HW via PC Pump The actuator used in the project is a multichannel volumetric pump Ismatec IPC N 12 able to provide flow rates between 0 39 ul min and 11 ul min Furthermore the pump is equipped with an analog port that allows the control via SW through a data acquisition board DAQ USB 6211 National Instruments The control parameters of the pump on which we can act are 1 the starting and stopping of the pump Start Stop 11 the direction of rotation of the rollers CW CCW 111 the flow rate that the pump must
7. 0 001 E gt 0 0 001 0 20 40 60 80 100 Tempo s IRW B 0 003 0 002 PI E 0 001 s 0 0 001 9 20 40 60 80 100 Tempo s Figura 3 6 Tracciato del volume infuso aspirato dalla pompa nel tempo registrato per il pattern IWR A e IRW B Si pu osservare come in nessuno dei due test effettuati 11 volume torni al valore nullo che ci si attendeva al termine di ciascun ciclo nel primo caso IWR si osservata una deriva decrescente del volume verso valori negativi mentre nel secondo caso IRW una deriva crescente verso 12 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo valori positivi Questo significa che ad ogni ciclo successivo il SW forza l aspirazione l infusione di un volume maggiore di quello infuso aspirato nella fase precedente e non garantisce quindi che il volume erogato dalla pompa sia pari a quello impostato dall utente Si quindi indagato il motivo di questo fenomeno acquisendo ed analizzando nel dettaglio 1 valori di tensione in uscita dalla pompa Volt Speed Out Figura 3 5 Dall analisi dei dati s1 potuto verificare prima di tutto la presenza di un ritardo tra l istante in cui il SW invia il comando di cambio fase alla pompa e la reale risposta della pompa nell attuare il cambio di fase Tale ritardo stato stimato essere pari a circa 200 ms valore medio su 10 cicli di ciascun pattern verificato SI osservato che tale ritardo conseguenza del fatto che dura
8. 1 4 8 Bioreattore per la stimolazione meccanica Il lavoro condotto da Wallis et al nel 2008 17 presenta 1 vantaggi che un bioreattore capace di applicare stimoli meccanici fisiologici abbia nella rigenerazione dei tessuti molli Il bioreattore composto da due camere separate dallo scaffold 11 quale mantenuto in posizione da due anelli di sostegno Figura 1 11 L obiettivo del sistema di controllo sollecitare lo scaffold seminato in un range di pressioni prestabilito 0 10 cmH30 con dinamiche diverse tra la fase d incremento di pressione e quella di decremento decine di minuti e decine di secondi rispettivamente Ci possibile grazie a un software commerciale Laborie Medical Technologies UDS software che permette tramite un controllo in retroazione di compensare le variazioni esterne cos da mantenere 1 valori di pressione che agiscono sul costrutto bidimensionale all interno del range prestabilito Inoltre consente all utente di visualizzare 1 valori di pressione in tempo reale Il sistema di controllo di questo bioreattore presenta alcuni aspetti che saranno sviluppati anche nel presente lavoro di tesi 25 Capitolo 1 Introduzione Camera Anticamera Anello di sostegno Anello di sotegno Scaffold Supporto Figura 1 11 Componenti del bioreattore per la stimolazione meccanica di tessuto urovescicale Anche in questo caso si pu osservare come un sistema di controllo associato a una camera
9. 8 9 7 9109 0 2395 35 0200 9 5669 Figura 2 20 Pannello per il post processing Riquadro verde scelta della modalit di elaborazione dati Riquadro arancione tabella riassuntiva con i dati elaborati Riquadro viola grafico con 1 dati elaborati plottati e interpolati La prima scelta che l utente deve fare se analizzare 1 dati relativi al segnale di pressione o di volume a destra nel riquadro verde di Figura 2 20 Successivamente il software consente all utente di eseguire o meno la media mobile dei dati cos da attenuare la componente di rumore indesiderata eventualmente sovrapposta al segnale di interesse Inoltre nel Pannello 3 l utente ha deciso se registrare tutti 1 dati di ogni fase della stimolazione o alternare finestre temporali di registrazione a periodi di non registrazione registrando cos pacchetti di dati Anche in base a questa scelta l utente sceglier come analizzare 1 dati tre le cinque modalit che il programma mette a disposizione riquadro verde di Figura 2 20 i Primo e ultimo valore questa modalit consente di estrarre il primo e l ultimo valore della variabile pressione o volume di ogni pacchetto di dati registrato 57 il iil IV Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo Campionamento consente di estrarre dai dati registrati un valore ogni n secondi di registrazione dove n un tempo impostabile dall utente Media questa opzione perm
10. Il presente lavoro di tesi svolto presso il laboratorio di Micro e Biofluidodinamica Sperimentale uBS Lab del Dipartimento di Elettronica Informazione e Bioingegneria del Politecnico di Milano ha come obiettivo lo sviluppo di un sistema per il monitoraggio e il controllo di dispositivi in grado di applicare una sollecitazione meccanica a tessuti organi biologici molli volta ad esempio alla caratterizzazione del loro comportamento biomeccanico In particolare la stimolazione che viene applicata di tipo pressorio applicata tramite un fluido messo in pressione da un attuatore idraulico che agisce sul tessuto organo da stimolare caratterizzare Il sistema di controllo sviluppato in questo lavoro di tesi si compone di due elementi principali ovvero la componente hardware HW costituita dagli attuatori idraulici dai sensori utilizzati per il monitoraggio dei parametri della stimolazione e dai cablaggi realizzati per interfacciare PHW con il computer e dalla componente software SW che permette di gestire ovvero azionare e monitorare gli elementi dell HW In particolare gli obiettivi che ci si posti nello sviluppo della parte HW sono minimizzazione degli ingombri del set up messo a punto robustezza ed affidabilit del sistema realizzato Dal punto di vista dell ingombro a valle del processo di realizzazione del componente HW stata ad esempio superata la necessit di impiegare un alimentatore da banco per fornire l ali
11. funzionale alla prova di decellularizzazione stessa Cio comporta una riduzione nei tempi delle prove In tutte le applicazioni il sistema di controllo sviluppato si dimostrato adatto ed affidabile per le prove effettuate In due casi misura di compliance di un vaso e protocollo di decellularizzazione della vescica ha inoltre apportato miglioramenti sostanziali nell esecuzione della prova e nel protocollo applicato Discussione All inizio del presente lavoro di tesi si sono fissati degli obiettivi e delle specifiche che 1l sistema di controllo deve rispettare Dal punto di vista HW l obiettivo raggiunto stato di ottimizzare il pi possibile il sistema di controllo dal punto di vista dell ingombro e di assicurare l affidabilit del sistema realizzato Per quanto riguarda il SW si sono soddisfatte le specifiche descritte nella sezione Specifiche SW di controllo In particolare si sono comandati gli attuatori con un buon grado di precisione e si sono integrati 1 segnali di volume e pressione acquisiti come variabili di controllo e limitazione della stimolazione Quest ultima caratteristica s1 tradotta nelle due modalit di controllo automatiche controllo in volume e limitazione di pressione Il SW inoltre permette di monitorare in tempo reale 1 parametri della stimolazione e registrare 1 valori di pressione e volume cos da poterli poi elaborare in seguito Inoltre nelle prove per la caratterizzazione d
12. 36 37 38 39 40 Bibliografia Cambiaghi A and M De Santo Sviluppo di un sistema di misura della compliance di tratti di vasi sanguigni di piccolo calibro in Tesi di Laurea di primo livello Dipartimento di Bioingnegeria 2011 Politecnico di Milano p 73 Atala A et al Tissue engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty Lancet 2006 367 9518 p 1241 6 Cartwright L M et al Porcine bladder acellular matrix porosity impact of hyaluronic acid and lyophilization J Biomed Mater Res A 2006 77 1 p 180 4 Farhat W et al Porosity of porcine bladder acellular matrix impact of ACM thickness J Biomed Mater Res A 2003 67 3 p 970 4 Urban A Ingegneria del tessuto urovescicale caratterizzazione della matrice decellularizzata e sviluppo di un sistema di coltura per la sua sollecitazione meccanica in fase di ricellularizzazione in vitro in Tesi di Laurea Magistrale Dipartimento di Bioingnegeria 2012 Politecnico di Milano p 187 Consolo F et al Dynamic perfusion for intact bladder decellularization analysis of the acellular matrix distention properties Histology and Histopathology Cellular and Molecular Biology 2011 26 S1 Masson I et al Mechanical properties of arteries cryopreserved at 80 degrees C and 150 degrees C Med Eng Phys 2009 31 7 p 825 32 Bolland F et al Development and characterisation of a full thickness acellular porcine bladder matrix
13. EN RR RR 30 22 1 La pompare 31 2 2 1 1 Controllo remoto interfaccia pompa PC 32 22 I schisor Ci RC SO E did 35 2 2 2 1 Alimentazione del sensore di pressione via SW i 37 223 L atto gioire 37 Il sottwaredel sistema di Gontrollo r race 41 Indice 2 3 1 Progettazione del software di controllo 42 2 4 Ambiente di sviluppo software LabVIEW iii 42 2 5 THAMES EA Heels CS IN aed A eid eal acca ee won ea oceans ones 44 Doel pannello Semola ladini 46 2 92 panne lo ACQUISITO lievi 47 253 lb pannello Contool Purns a 49 ZI Afeddisimolizione alia 50 2 5 3 1 1 Controllo in volume modalit manuale 50 2 5 3 1 2 Controllo in volume modalit automatica SI 2 5 3 1 3 Stimolazione in limitazione di pressione modalit automatica 52 2 3 3 2 Arcamontorassio sinmolazione acireale E E a ai 54 ZI ACCESSO dine 55 294 pannello Post ProCessin sro 57 233 li pannello Advanced Serine oe 59 3 Architettura e collaudo del software di controllo 6l 3 1 PREC HITS ora CLE SO DEW Al nia a ahaa ier oman Sea E E E 61 fe Bs ilaele 62 kit A CONV e ae Rr tn re em eB eg ne 64 IEL Cicko der Property NOGCissrssteaiecddact asi aieeeintn ee aleedadetaaieaend atnaiaseaieats 64 3 1 1 3 Ciclo del grafico pattern di stimolazione 65 Sicha Ciclo delvorat
14. del SW 103 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici OX GO Pressione mmHg la 0 00 20 00 30 Tempo hh mm Figura 4 10 Grafico P t dell interfaccia utente del SW di controllo Il monitoraggio in tempo reale della pressione consente all utente di identificare con esattezza 1l momento in cui il valore di pressione giunge a plateau nel caso mostrato in Figura 4 10 dopo circa 20 minuti dall inizio della prova Nel caso in cui il valore di pressione monitorato arrivi a plateau in un tempo inferiore alle due ore l utente pu verificarlo in temo reale tramite il pannello grafico della pressione in funzione del tempo e bloccare la prova Ci permette di sollecitare per un tempo minore il patch cos da preservare maggiormente il tessuto per eventuali prove successive e di ridurre il tempo della prova consentendo di condurre campagne su un numero di campioni maggiore in un tempo minore rispetto al set up precedentemente utilizzato Inoltre l impiego del sistema di controllo rende la prova pi automatizzata limitando l intervento dell utente alle fasi di preparazione del set up e alloggiamento del campione nel bioreattore a perfusione 4 4 Prove di cistometria su vescica Il terzo test che stato condotto utilizzando il sistema di controllo volto a valutare la variazione delle propriet meccaniche dell orga
15. pur essendo il ritardo sempre della stessa durata 1 valori della fase precedente errati che entrano nel calcolo dell integrale della fase corrente non sono prossimi allo 0 a meno di portate nulle imposte e quindi provocano un errore inferiore Tabella 3 1 La Tabella 3 1 mostra il numero e il valore numerico riquadri gialli dei valori di tensione che entrano erroneamente nel calcolo dell integrale della fase successiva a causa dei ritardi introdotti dalla pompa Sono mostrati 1 passaggi di fase da infusione a aspirazione e da rest a infusione per il pattern di stimolazione IWR colonna 1 e 3 di Tabella 3 1 mentre per l altro pattern testato IRW sono mostrati 1 dati nel passaggio di fase da aspirazione a infusione e da rest a aspirazione colonna 2 e 4 di Tabella 3 1 74 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Tensione Tensione Tensione Tensione IWR registrata IRW registrata IWR registrata IRW registrata V V V V 3 8620 3 7844 0 0057 0 0060 3 8669 3 7896 0 0169 0 0300 3 8235 3 7535 0 0350 0 0067 3 8291 3 7387 0 0320 0 0337 3 7840 3 9034 0 0248 0 0110 3 8067 3 8274 0 0215 0 0264 SW fine I 3 8133 SW fine W 3 7732 SW fine R 0 0165 SW fine R 0 0235 SW inizio W 31939 SW inizioI 3 8742 SW inizioI 0 0057 SW inizio W 0 0169 P fine W P inizio I P fine I 0 1268 P fine R P inizio W 1 1602 P inizio I P fine R 2 4267 2 4205 2 0765 P inizio W 3 5545 3 3180 3 1694 0 6307 3 8577
16. tra il FSR della scheda NI DAQ 10 V e il numero dei livelli di discretizzazione del segnale acquisito dalla scheda NI DAQ funzione del numero di bit della scheda 16 nel caso del modello USB 6211 indicato come Digital Value 2 livelli FSR 10V 0 153 mV 8 PAGS Digital Value 9 Si giunge a determinare il valore minimo di pressione APamp_min rilevabile dal sensore di pressione amplificato Eq 6 AMP_minHW T Die 0 193 V 10 3 0 8 10 mmHg 9 mmHg Ppr 0 04 V mmHg 3 8 107 mmHg AP AMP_minPT Se non si fosse realizzato il sistema di amplificazione la scheda NI DAQ avrebbe ricevuto dal sensore di pressione una tensione massima di 16 7 mV HW e 14 75 mV PT Inserendo questi valori nella Eq 4 ed utilizzando 1 valori ottenuti per 11 calcolo delle Eq 5 e 6 si ottiene un APNoAMP_min rilevabile pari a 0 474 mmHg per il sensore HW e 2 593 mmHg per il sensore PT In definitiva il dimensionamento del circuito di amplificazione ha consentito di aumentare la sensibilit 0 del sistema di acquisizione della pressione di un fattore n pari a Eq 7 _ Alvoamp_minuw _ 0474 mmHg su APamp_min HW 0 8 1073 mmHg AlNoaMP minpr _ _ 2093 mmHg _ APamp_min PT 3 8 1073 mmHg 592 5 10 pr 682 4 133 Bibliografia Bibliografia 10 11 12 IS 14 Chaudhuri J and M Al Rubeai Bioreactors for Tissue Engineering Principles Design and Ope
17. 15 00 15 03 Tempo hh mm Figura 3 9 Tracciato del volume nel tempo per le configurazioni 1 11 111 Imposte per verificare la capacit del SW di gestire la riproduzione di pattern di stimolazione corretti Si pu osservare come il tracciato di volume non presenti derive e rimanga per tutta la durata della stimolazione tra 1 due valori di volume impostati dall utente 3 2 3 Stimolazione in limitazione di pressione modalit automatica La terza modalit che il software mette a disposizione dell utente la stimolazione in controllo di volume limitata in pressione indicata nel proseguo della Tesi come modalit di limitazione in pressione Dal punto di vista dell architettura del SW questa modalit simile alla modalit automatica del controllo in volume tranne per il fatto che la variabile di controllo che determina il passaggio da una fase alla successiva nel caso di infusione aspirazione non il volume erogato dalla pompa ma la pressione che il fluido processato dalla pompa esercita sul campione stimolato In questa modalit dunque l utente imposta due soglie di pressione vedi paragrafo 78 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 2 5 3 1 3 che identificano il range di pressione all interno del quale si vuole stimolare il campione durante l esperimento Il ciclo quindi si basa su un confronto in tempo reale tra il valore della pressione che agisce sul campione acquisito dal SW nel ciclo d
18. 3 8594 3 8301 1 7318 3 7324 3 8304 3 8439 2 7957 3 8646 3 8084 3 7952 3 7827 3 8370 3 8025 3 8649 3 6949 Tabella 3 1 Analisi della tensione in uscita dalla pompa registrata per due diversi pattern di stimolazione IWR e IRW Sono evidenziati 1 valori della tensione al momento dell invio da parte del SW del segnale di cambio fase SW inizio e SW fine e al momento dell effettivo cambio fase effettuato dalla pompa P inizio e P fine Si osserva come il SW considera erroneamente alcuni valori di tensione nel calcolo del volume Il numero di tali dati riquadri gialli differente in funzione delle specifica sequenza delle fasi E importante sottolineare come la presenza nei grafici di Figura 3 6 di valori di volume affetti da deriva positiva negativa non solo un effetto di errata elaborazione grafica da parte del SW ma si traduce in un effettivo errato volume infuso aspirato Pertanto si reso necessario rivedere l architettura del SW relativa al calcolo del volume processato dalla pompa 3 2 2 2 Modifica dell architettura della modalit automatica in controllo di volume Per ovviare al problema relativo alla deriva dei volumi descritto nel paragrafo precedente si quindi deciso di modificare l architettura del ciclo di controllo della modalit automatica in controllo di volume Il controllo nel tempo della durata delle varie fasi del ciclo ha infatti mostrato di non garantire lo stesso volume infuso aspirato tra un ciclo e
19. 3 A ed stato connesso ad un regolatore di tensione KA78 10 Fairchild Semiconductor in grado di limitare la tensione in uscita dall alimentatore a 10 V ossia la tensione di alimentazione del sensore Pendotech 2 2 3 L elettrovalvola pinza tubo Come detto in precedenza il sistema di controllo realizzato stato pensato per essere il pi versatile possibile e poter essere utilizzato con diversi tipi di tessuto con diversi set up e in diverse applicazioni Uno dei set up con cui il sistema di controllo stato verificato volto alla decellularizzazione di organi interi attraverso un protocollo dinamico il set up verr descritto nel dettaglio nel capitolo 4 Questo set up richiede l uso oltre che di pompa volumetrica e di un sensore di pressione di un elettrovalvola EV che consente di deviare opportunamente 1l fluido utilizzato come agente decellularizzante in opportune linee del circuito idraulico stata quindi 37 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo integrata nel sistema di controllo anche un elettrovalvola magnetica di tipo pinza tubo O75P3MP12 02S della Bio ChemFluidics Figura 2 6 Figura 2 6 Elettrovalvola magnetica a tre vie 075P3MP12 02S Bio ChemFluidics L elettrovalvola alloggia due tubi e consente di abilitare il passaggio del fluido alternativamente su un ramo o sull altro occludendo un tubo e lasciando pervio l altro Permette inoltre di mantenere
20. Biomedica Vol 15 2009 Patron 216 Darling E M and K A Athanasiou Articular cartilage bioreactors and bioprocesses Tissue Eng 2003 9 1 p 9 26 Mauck R L et al Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading Biomech Model Mechanobiol 2007 6 1 2 p 113 25 Altman G H et al Advanced bioreactor with controlled application of multi dimensional strain for tissue engineering J Biomech Eng 2002 124 6 p 742 9 134 15 16 17 18 19 20 21 23 23 24 25 26 2 28 20 30 Bibliografia Diamantouros S A Pulsatile Bioreactor System for Durability Testing and Compliance Estimation of Vascular Graft in PhD Thesis 2011 Helmholtz Institute for Biomedical Engineering Aachen Germany Shkilnyy A et al Bioreactor controlled by PI algorithm and operated with a perfusion chamber to support endothelial cell survival and proliferation Biotechnol Bioeng 2012 109 5 p 1305 13 Wallis M C et al Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor Tissue Eng Part A 2008 14 3 p 339 48 Schipke K J S D To and J N Warnock Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valves J Vis Exp 2011 54 Ismatec Idex smatec IPC IPC N Operating Manual p 48 National Instrument NJ USB 621x User Manual 2009 National Instrument p 204 PendoTECH
21. Case it et var num 7 Start Stop Pump amp Direction Pump 0 P V Cycle amp Speed Pump Switch Pinch Valve na ea Post Processing Cycle Pressure Acquisition Voltage Pump Out Acquisition Pressure Sensor Voltage Supply Figura 7 Schema dell architettura dei cicli che compongono il SW di controllo ciclo principale 1 ciclo di controllo 1A ciclo di acquisizione 1B AI termine della fase di ottimizzazione del SW sono stati condotte alcune prove di collaudo delle modalit di controllo v Sommario implementate nel SW Per la modalit controllo in volume modalit automatica si sono verificati tre diversi pattern di stimolazione che hanno consentito di verificare il comportamento del SW valutando diversi valori di durata minuti secondi e portata ul min ml min delle fasi In Figura 8 si riporta il tracciato per una della configurazioni utilizzate per 11 collaudo basse portate elevate durate della fasi pattern di infusione aspirazione rest IWR i Cicli 1 4 Cicli 53 57 Volume ml 01 00 13 30 14 30 Tempo hh mm Figura 8 Tracciato del volume nel tempo per la configurazione IWR Q 40 80 ul min I W t 10 5 minuti I W rest di 10 secondi Per la modalit limitazione in pressione modalit automatica si testata la capacit del SW di mantener
22. Figura 4 11 4 5 Prove di decellularizzazione della vescica q Come anticipato nel paragrafo 1 1 1 dall analisi della letteratura emerso come le matrici decellularizzate ottenute da tessuti organi biologici rappresentino tra le varie tipologie di scaffold utilizzati in ingegneria dei tessuti quelle che dimostrano 1 risultati pi promettenti dal punto di vista della possibilit di ottenere un tessuto organo in grado di replicare le funzioni del tessuto organo nativo patologico da rigenerare Tra 1 diversi vantaggi che risiedono nell utilizzo di una matrice biologica decellularizzata di notevole rilevanza il fatto che tale matrice possegga propriet meccaniche paragonabili al tessuto nativo che s1 vuole rigenerare Inoltre le matrici decellularizzate non provocano fenomeni indesiderati post impianto nel paziente come 1 problemi legati al trapianto di organo quali il rigetto da parte dell organismo ricevente Allo stesso tempo nelle matrici biologiche decellularizzate vengono conservate le componenti proteiche della ECM in grado di favorire l adesione la colonizzazione e la proliferazione cellulare e quindi l integrazione con 1 tessuti organi su cui vengono impiantate all interno dell organismo Sulla base di queste evidenze sperimentali inserendosi all interno di un progetto di ricerca ad oggi in corso presso il uBS Lab svolto in collaborazione con il personale della Facolt di Medicina Veterinaria dell Universita S
23. La totale occlusione del vaso comporta la drastica riduzione dell apporto di sangue alla porzione di muscolo cardiaco che esso dovrebbe servire con conseguente insorgenza di fenomeni ischemici In definitiva in tall condizioni si ha la necessit di un nuovo intervento chirurgico per la sostituzione del vaso occluso Uno dei primi step relativi all analisi del fenomeno dell arterializzazione del vaso consiste nella caratterizzazione delle propriet biomeccaniche ed in particolare delle propriet di distensibilit del vaso nella nuova condizione di sollecitazione pressoria a cui essa sottoposta dopo l impianto Per poter valutare e quantificare la variazione del comportamento biomeccanico della vena per necessario caratterizzarne il comportamento in condizioni fisiologiche A tal fine la camera di coltura utilizzata per la stimolazione del vaso stata connessa al sistema di controllo attraverso il quale stato possibile eseguire la caratterizzazione della distensibilit di un campione di vena safena umana in condizioni fisiologiche In particolare 11 SW stato utilizzato per 1 il controllo degli attuatori del circuito idraulico 11 il monitoraggio del segnale di pressione all interno della vena si veda il protocollo sperimentale descritto nel paragrafo 4 2 1 111 la registrazione e la post elaborazione dei dati acquisiti 4 2 1 Protocollo di prova Il test consiste nell infusione controllata di un volume di liquido n
24. PendoTECH Single Use Pressure Sensors Specification Sheet 2011 p 2 Honeywell Installation Instructions for the 26PC Series Pressure Sensors 2002 p 4 Cassani D and F Ballo Ottimizzazione di un sistema di acquisizione di dati relativi a test di compliance su tessuti biologici in Tesi di Laurea di I livello Dipartimento di Bioingnegeria 2011 Politecnico di Milano Melchiorre A Allestimento della strumentazione per la misura delle pressione in un banco prova emodinamico pulsatile in vitro in Tesi di Laurea di I livello Dipartimento di Bioingnegeria 2012 Politecnico di Milano Bio Chem Fluidics Solenoid Operated Pinch Valves 2011 p 20 National Instrument LabVIEW Tutorial Manual 1996 National Instruments Corporation p 250 Piola M Sviluppo e test preliminare di un bioreattore a perfusione destinato all espansione di cellule staminali ematopoietiche in Tesi di laurea in Ingegneria biomedica 2009 Politecnico di Milano p 121 Dummler S et al Pulsatile ex vivo perfusion of human saphenous vein grafts under controlled pressure conditions increases MMP 2 expression Biomed Eng Online 2011 10 p 62 Motwani J G and EJ Topol Aortocoronary saphenous vein graft disease pathogenesis predisposition and prevention Circulation 1998 97 9 p 916 31 Redaelli A and F Montevecchi Biomeccanica anslisi multiscala di tessui biologici 2007 Bologna Patron Editore 135 31 32 33 34 35
25. RPM o ml min 3 diametro interno del sottopompa 4 Il blocco di operazioni riceve diversi parametri di input che determinano poi l effettivo valore di tensione proporzionale alla portata che 11 SW invier alla pompa Un primo case riceve l informazione sulla fase di stimolazione infusione o aspirazione 1 in Figura 3 3 in cui si trova il programma questa indicazione va ad abilitare la corrispondente finestra del case cos che il SubVI riceva il valore della portata di infusione o di quella di aspirazione impostata dall utente 67 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 2 in Figura 3 3 Tramite un case interno di tipo true false il SW traduce la scelta dell utente di assegnare la portata in RPM o ml min 3 in Figura 3 3 attivando rispettivamente il SubVI RPM e il SubVI RPM Tube in Figura 3 3 viene mostrato il caso di RPM Tube Se attiva la modalit ml min il SubVI RPM Tube riceve inoltre l indicazione del diametro interno del sottopompa utilizzato 4 in Figura 3 3 informazione necessaria per applicare l opportuna conversione per il calcolo del volume da erogare L elaborazione di questi parametri di input si traducono in un valore di tensione proporzionale alla portata richiesta alla pompa che 11 SW invia al motore della pompa 3 2 Architettura delle modalit di controllo della stimolazione In questo paragrafo saranno illustrate le tre modalit di controllo della stimolazio
26. SW di acquisizione In Figura 4 1 sono mostrati il telaio interno della camera di coltura e 1 connettori per fissare 11 vaso nella camera a L Figura 4 1 Particolare del telaio della camera di coltura in cui stato alloggiato e fissato il campione di vena safena 1 tramite degli appositi connettori 2 il lume del vaso connesso al circuito idraulico per la perfusione del vaso due vessel loop 3 consentono di fissare il vaso ai connettori Il vaso fissato tramite vessel loop ad appositi connettori integrati nel telato della camera e collegati al circuito idraulico del set up Questo sistema di ancoraggio permette di mantenere in sede il vaso per tutta la durata della prova ma comporta una riduzione della lunghezza utile del vaso da 28 mm a 18 mm Il telaio della camera di coltura su cui alloggiato il vaso mostrato in Figura 4 1 stato poi inserito in un tubo Falcon da 50 ml riempito di soluzione buffer PBS Tramite una guarnizione in gomma siliconica o ring per interferenza geometrica si serrano 1 due elementi telaio e Falcon cos da creare un ambiente chiuso e sterile per la stimolazione Il set up sperimentale realizzato per la misura della compliance del campione di vena mostrato in Figura 4 2 91 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Figura 4 2 Set up sperimentale realizzato per la mis
27. attraverso 1 canali di input ed output I O della scheda di acquisizione dati NI DAQ che a sua volta si interfaccia con il programma realizzato L utente pu scegliere tra tre modalit di controllo stimolazione manuale stimolazione automatica e stimolazione limitata in pressione e decidere 11 pattern di stimolazione impostando diverse combinazioni delle tre fasi infusione aspirazione e rest e 1 valori di portata e durata delle fasi stesse Inoltre il software in grado di utilizzare un parametro di output della stimolazione la pressione come parametro di controllo sulla stimolazione in atto In tal modo il SW in grado di mantenere la stimolazione del costrutto biologico all interno di un range di pressioni predefinito dall utente Il programma in grado inoltre di registrare 1 valori di pressione e volume nel tempo e di salvarli automaticamente in un file di testo sul PC Questo permette all utente di elaborare 1 dati successivamente per analizzare i risultati della stimolazione Quest analisi pu essere fatta dall utente tramite altri programmi es Microsoft Excel oppure attraverso il SW stesso Infatti il programma consente all utente di richiamare 1 file precedentemente salvati ed eseguire un analisi statistica automatica dei dati 2 4 Ambiente di sviluppo software Lab VIEW Alla luce delle specifiche di progetto introdotte nel paragrafo precedente si deciso di sviluppare il programma nell ambiente di
28. campione 2 Pmax rappresenta il valore di soglia massima settato per la prova di decellularizzazione Il puntino verde rappresenta il valore di P corrispondente al volume V di transizione Sulla base delle curve P V acquisite per ciascun organo si sono impostati 1 seguenti valori di pressione di soglia specifici per i due organi definendo 1 seguenti protocolli di decellularizzazione dinamica Campione 1 Pmax pari a 1 5 mmHg e Pmin pari a 0 mmHg Campione 2 Pmax pari a 5 mmHg e Pmin pari a 0 mmHg I valori soglia di Pmax freccia in Figura 4 19 rappresentano il valore della pressione intravescicale di poco superiore alla regione di transizione della pressione puntino verde in Figura 4 19 in questo modo si era certi di distendere in maniera ottimale la vescica esponendo l intera superficie all azione degli agenti decellularizzanti mantenendo per un livello non eccessivo di sollecitazione meccanica della ECM dell organo Attraverso il SW si Impostato un tempo pari a sec come tempo di attesa per verificare che il valore di P si mantenga al di sopra o al di sotto del valore di Pmax O Pmin ed evitare quindi indesiderati passaggi di fase dovuti a spike 118 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici del valore di pressione misurato e non al raggiungimento del valore soglia stabile desiderato Le portate di infusione Qinf e
29. della modalit di controllo limitata in pressione Sono indicati la camera inferiore e superiore la cartuccia di silicone il patch di lattice 1 O ring per il fissaggio del patch alla cartuccia Il bioreattore composto da due camere la camera inferiore alloggia la cartuccia in silicone su cui fissato un patch di lattice tramite un O ring mentre la camera superiore s1 serra sulla camera inferiore per bloccare la cartuccia di silicone E stato impiegato un patch in lattice con la funzione di simulare un tessuto biologico deformabile 79 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo In Figura 3 11 mostrato il set up impiegato per questa prova di collaudo Figura 3 11 Set up per la verifica della modalit di controllo limitata in pressione Sono indicati il PC la scheda NI DAQ la pompa il reservoir da cui la pompa preleva il liquido il sensore di pressione Pendotech PRESS S 000 il bioreattore a perfusione in cui inserito il patch di lattice La pompa Ismatec IPC N12 preleva il liquido da un reservoir e lo infonde nel bioreattore sollecitando cos il patch Il set up prevede anche l utilizzo di un sensore di pressione Pendotech PRESS 5S 000 posto in serie nel circuito idraulico a valle della pompa e a monte del campione per monitorare la pressione che agisce sul patch Si quindi sottoposto il patch a sollecitazioni cicliche con pattern di stimolazione infusione aspirazione rest IWR con por
30. di aspirazione Qasp per entrambe le prove sono state impostate rispettivamente pari a 1 ml min e 2 ml min La scelta di impostare la Qasp pari al doppio della Qing nasce dal fatto che fisiologicamente durante la minzione lo svuotamento della vescica pi rapido del suo riempimento Inoltre si scelto di ridurre la Qinp 1 ml min rispetto al valore utilizzato nel protocollo in controllo di volume 5 ml min alla luce delle curve di cistometria Essendo infatti 11 volume necessario per raggiungere 11 valore di Pmax pari a circa 4 ml e 8 ml per 1 due organi testati si deciso di diminuire la Qnr in modo da evitare un riempimento troppo repentino non fisiologico dell organo sempre con l obiettivo di preservare l integrit strutturale del tessuto In tal modo inoltre la durata della fase di infusione del nuovo protocollo pari a 4 min e 8 min per 1 due organi testati comunque paragonabile a quella del protocollo in controllo di volume 4 min Dalle curve riportate in Figura 4 19 appare quindi evidente 11 limite del protocollo precedente se si fosse infuso il volume teorico di 20 ml si sarebbero sottoposti entrambi gli organi a livelli di sollecitazione molto superiori a quelli fisiologici ovvero si sarebbe riempita la vescica fino ad un valore di volume superiore al volume di overstretching In Figura 4 20 vengono mostrati 1 tracciati di pressione rispetto al tempo di avanzamento del processo di decellularizzazione per il
31. di file generato tramite registrazione automatica L intestazione riporta 1 parametri della stimolazione impostata I dati sono salvati in un file txt e sopra ogni blocco di dati registrati 11 SW genera un intestazione che riporta 1 parametri della stimolazione impostata e la fase attiva al momento della registrazione In questo modo l utente pu sapere anche in un secondo momento da che stimolazione derivino 1 dati che ha registrato I file salvati sono etichettati tramite una radice comune Auto save Pressure o Auto save Volume e una parte variabile che riporta la data e l ora in cui il file stato generato La modalit automatica di registrazione permette di campionare ad intervalli regolari la stimolazione registrando pacchetti di dati e consente quindi di ricostruire l andamento della variabile registrata pressione e o volume della prova senza dover registrare tutti 1 dati e rendendo cos il post processing pi agevole Vi poi la possibilit di salvare la configurazione della stimolazione impostata sottopompa soglie di pressione modalit di controllo pattern tempi e portate delle fasi e di caricarla in un secondo momento senza dover reimpostare tutti 1 settaggi Save info Load info cos da poter ripetere la stessa stimolazione in un secondo momento Dopo che sono state effettuate tutte queste operazioni preliminari di configurazione l utente pu finalmente lanciare la stimolazione tramite il pulsante STOP STA
32. di laboratorio standardizzate Anche il bioreattore e il suo sistema di controllo devono quindi garantire sicurezza affidabilit ed efficacia che devono essere motivate attraverso trial clinici Devono inoltre rispettare tutte le normative vigenti di controllo di qualit QC e garantire gli standard del GMP Good Manufacturing Practice 4 11 Solo rispettando queste specifiche si pu quindi pensare ad una applicazione clinica dei bioreattori e dei prodotti che esso aluta a ricreare Per soddisfare tutti 1 requisiti illustrati finora risulta indispensabile l impiego di un bioreattore inteso come camera di coltura per il costrutto ma soprattutto di un sistema di controllo che sia in grado di monitorare tutti 1 parametri della coltura e gli stimoli che vengono applicati al costrutto Inoltre solo raggiungendo alti livelli di automazione e di standardizzazione di questi processi rendendoli cos riproducibili si pu pensare di rendere l ingegneria dei tessuti una concreta alternativa alle terapie tradizionali L elemento che pu favorire il raggiungimento di questi obiettivi senza dubbio 11 bloreattore dotato di un sistema di controllo 1 3 Il sistema di controllo Il sistema di controllo si compone di due parti sinergiche l hardware e il software Con hardware s intendono gli elementi fisici che controllano e monitorano il bioreattore Nel caso di un bioreattore a perfusione avremmo quindi un attuatore idraulico generalmente una
33. di valori di tensione acquisibili Full Scale Range FSR della DAQ 0 10 V nel caso di pressioni sempre positive per l acquisizione del segnale di pressione aumentando cos la risoluzione del sistema costituito dal sensore e dalla scheda NI DAQ I dettagli del dimensionamento del circuito di amplificazione ed 1 passaggi relativi al calcolo della risoluzione del sistema di acquisizione sono riportati in Appendice A Il circuito di amplificazione per il sensore Honeywell e quello per il sensore Pendotech sono stati realizzati in due precedenti lavori di tesi 23 24 ed erano gi disponibili presso il uBS Lab Il circuito di amplificazione del sensore Honeywell stato modificato per permettere l alimentazione del sensore via software I sensori sono stati cablati sulla scheda NI DAQ in modo tale da permettere un acquisizione riferita a massa Refer Single Ended RSE connettendo quindi il pin del segnale in uscita dal sensore con un morsetto di input analogico della DAQ canale AI 0 morsetto 15 In tal modo il 36 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo valore di tensione viene acquisito rispetto ad un morsetto di ground della scheda NI DAQ canale AI GND morsetto 28 2 2 2 1 Alimentazione del sensore di pressione via SW Per poter acquisire 1 valori di pressione il sensore deve essere alimentato e per far ci una possibilit utilizzare un alimentatore esterno collegato alla rete elettrica
34. eventuale modifica da parte dell utente dei parametri della stimolazione valore di portata durata delle fasi ecc il SW in grado di aggiornare in tempo reale 1 segnali da inviare alla pompa per rispettare le nuove richieste da parte dell utente ad esempio in termini di volume da infondere aspirare ad ogni ciclo Anche la modalit automatica di limitazione in pressione soddisfa questo requisito poich in base al valore di pressione acquisito dal sensore il SW in grado di agire modificandoli durante l esecuzione della stimolazione sui parametri che definiscono il pattern di stimolazione passaggio dalla fase di infusione a quella di aspirazione durata delle fasi ecc cos da mantenere la pressione che agisce sul tessuto organo stimolato all interno del range definito dalle soglie impostate dall utente Al fine di poter monitorare costantemente 1 parametri della stimolazione il SW fornisce all utente la possibilit di visualizzarli in modo immediato e intuitivo Tramite le tre finestre grafiche del pannello di controllo Contro Pump paragrafo 2 5 3 2 dell interfaccia utente l utente pu visualizzare 11 segnale di pressione e di volume rispetto al tempo della stimolazione Inoltre il SW integra questi due segnali cos che l utente possa visualizzare nella finestra grafica dedicata la variazione della pressione che agisce sul tessuto organo in funzione del volume processato dalla pompa in tempo reale Con l o
35. fino ad otto differenti segnali di pressione attraverso otto dei sedici canali di ingresso AI disponibili sulla scheda NI DAQ Nel riquadro verde di Figura 2 11 infatti si vede come sia possibile abilitare o disabilitare 1 canali di acquisizione del segnale di pressione e visualizzarne o meno il valore medio Bisogna ricordare che uno degli otto canali AI disponibili 47 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo sulla scheda NI DAQ dedicato all acquisizione del segnale di tensione che esce dalla pompa proporzionale alla portata Questo canale non sar quindi disponibile per l acquisizione del segnale di pressione Questo pannello permette inoltre di calibrare il segnale di pressione del sensore Infatti il sensore invia al software tramite la scheda NI DAQ un segnale di tensione proporzionale alla pressione che il fluido esercita sul sensore stesso Questo valore deve essere poi convertito in un valore valutato in un unit di misura di pressione mmHg Questa procedura si effettua tramite la calibrazione riquadro giallo di Figura 2 11 Attivando la calibrazione del canale desiderato compare un grafico riquadro azzurro di Figura 2 11 che mostra l andamento del segnale di pressione nel tempo Per effettuare la calibrazione si impone un valore noto di pressione ad esempio tramite un manometro e si scelgono due punti di lavoro generalmente la pressione atmosferica e il valore massimo a cui si pensa di
36. for tissue engineering Biomaterials 2007 28 6 p 1061 70 Yang B et al Development of a porcine bladder acellular matrix with well preserved extracellular bioactive factors for tissue engineering Tissue Eng Part C Methods 2010 16 5 p 1201 11 Analog Devices AD627 datasheet 2005 p 24 136
37. funzionamento del SW in corso d opera per garantire la corretta esecuzione delle funzionalit messe a disposizione dal sistema di controllo per tutta la durata della stimolazione ed in diverse condizioni di lavoro A valle di queste modifiche le prove di collaudo hanno dimostrato come il SW in tutte e tre le modalit di controllo disponibili esegua correttamente le operazioni richieste e sia in grado di fornire la stimolazione desiderata per tutta la durata della prova Il sistema di controllo realizzato stato poi utilizzato integrandolo in tre diversi set up sperimentali prove di compliance permeabilit cistometria volti principalmente alla caratterizzazione del comportamento biomeccanico di organi tessuti e in un set up utilizzato per la decellularizzazione dinamica di un organo intero decellularizzazione della vescica Si voluto quindi dimostrare come il sistema di controllo sviluppato sia dotato di estrema versatilit Nelle quattro condizioni di prova in cui il SW stato impiegato 1 risultati ottenuti sono stati incoraggianti In particolare nel caso della prova per la caratterizzazione della compliance della vena safena cos come nel trattamento di decellularizzazione della vescica la modalit in limitazione di pressione ha permesso di migliorare 1 protocolli preesistenti superando alcuni del 127 Capitolo 5 Conclusioni e sviluppi futuri limiti che essi presentavano In ottica futura quindi il sistema di contr
38. giungere nel corso della stimolazione Per ogni canale che l utente ha abilitato e intende utilizzare si impostano questi due valori nella colonna Ind 0 e Ind 1 si porta il manometro alla pressione impostata su Ind 0 e si preme GO sotto la colonna di Ind 0 si ripete la stessa procedura per il valore impostato su Ind 1 Per eliminare eventuali offset di pressione che si possono generare a seguito del riempimento del circuito idraulico si pu agire manualmente sulla calibrazione appena effettuata tramite il pulsante Show cal Premendo questo pulsante infatti 11 software mostra una finestra all utente dove sono riportati i coefficiente delle rette di calibrazione pendenza e intercetta della retta L utente pu quindi andare ad agire sull intercetta cos da eliminare manualmente il valore di offset che il sensore rileva Il software permette inoltre di salvare e richiamare in un secondo momento le calibrazioni effettuate Save cfg Load cfg cos da non dover ricalibrare 11 sensore ogni volta AI grafico nel riquadro azzurro di Figura 2 11 ma anche a tutti gli altri grafici presenti nell interfaccia utente sono associati una serie di controlli riquadro arancione di Figura 2 11 e di Figura 2 12 Time axis in Time window sec ES a Pre Cuoi ren HE gt Figura 2 12 Opzioni di controllo dei pannelli grafici 48 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo In generale presente un
39. il ramo collegato al reservoir di scarico non deve mai essere attivo e quindi EV deve mantenere pervio sempre il ramo di infusione L utente abilitando la modalit manuale di controllo in volume pu mantenere la stimolazione sempre in infusione come richiesto in questa prova Per la prova di decellularizzazione 11 protocollo della prova descritto nel paragrafo 4 5 2 Ci che per importante sottolineare come grazie al sistema di controllo utente pu eseguire due differenti prove di caratterizzazione meccanica e di decellularizzazione tramite lo stesso set up semplicemente cambiando la modalit di controllo e 1 parametri della stimolazione del SW Non occorre quindi modificare 11 circuito idraulico tra una 122 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici prova e l altra riducendo 1 tempi dovuti alle procedure di riempimento e debollamento del circuito idraulico e quindi il tempo della prova stessa possibile quindi caratterizzare l organo nativo decellularizzarlo e ricaratterizzarlo senza mai intervenire sul circuito idraulico o sul set up Tutto ci si traduce in un vantaggio sostanziale per l utente sia in termini di tempo che di semplicit nel condurre le prove permettendo anche a un utente meno esperto di condurre questo tipo di prove 123 Capitolo 5 Conclusioni e sviluppi futuri Conclusioni e sviluppi futuri
40. la specifica di sterilit in quanto le parti meccaniche dell elettrovalvola non entrano mai in contatto con il fluido Nel momento in cui si alimenta 1 EV il magnete al suo interno si eccita e commuta il suo stato provocando quindi l occlusione del tubo precedentemente pervio e viceversa Poich questo modello di EV richiede 12V di alimentazione e consuma 3 6 W di potenza ha quindi una richiesta di 300 mA di corrente 25 non pensabile alimentarla direttamente via SW paragrafo 2 2 2 1 stato quindi realizzato un circuito elettrico dedicato e miniaturizzato mutuato dal campo dei microcontrollori con il quale possibile comandare attuatori PEV nel nostro caso che richiedono elevati valori di potenza attraverso il SW che invece eroga amperaggi limitati Il circuito realizzato Figura 2 7 composto da quattro elementi principali 1 un potenziometro PTVO9A Bourns 0 1 KO 11 un transistor BJT BC548C Semiconductor Components Industries 111 un rel meccanico N4100 0 36W 10V Forward Relays 1v un regolatore di tensione KA78 10 Fairchild Semiconductor 38 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo IV Negoalore di tensione Tensione per rele 10V Tensione per elettrovalvola _Rel N4100 0 36W 12V ovalvola BMP12 02S Potenziometro PTV 094A on 1 5V off 0 OV Segnale PC Figura 2 7 Schema del circuito elettrico che regola la commutazione dell
41. modalit di controllo tra 1 controllo in volume con modalit manuale consente di scegliere manualmente il verso di rotazione e le portate di infusione e aspirazione della pompa 11 controllo in volume con modalit automatica che consente di scegliere il pattern di stimolazione come sequenza di tre diverse fasi infusione aspirazione rest durata e portata erogata di ciascuna fase In questa modalit il passaggio da una fase di infusione aspirazione alla successiva determinato dal confronto tra il volume erogato dalla pompa acquisito dal SW e il volume target impostato dall utente In questa modalit la durata della fase di rest dipende dal confronto tra un contatore e la durata della fase impostata dall utente 111 IV Sommario limitazione in pressione modalit automatica l utente imposta due valori di pressione soglia uno minimo e uno massimo entro cui vuole mantenere la stimolazione Il SW acquisisce 11 segnale di pressione dal sensore e determina il passaggio alla fase successiva del pattern di stimolazione nel momento in cui si raggiunta una delle due soglie La seconda macro area del pannello di controllo dedicata al monitoraggio della stimolazione Figura 5 resa p piian lee pp ood jj ey iti on 0 mm 100 Pressure mrn Pressure ap T 006 008 1004 jus oon Latt quat 00 20 0090 Sebeme Imi Time Ihtemmaal Figura 5 Area di monitoraggi
42. nelle applicazioni di ingegneria dei tessuti poich le loro caratteristiche si adattano a pi tessuti dai vasi al tessuto osseo Questa tipologia di bioreattori stata introdotta per superare le limitazioni presenti in altri tipi di bioreattori come quelli spinner flask soprattutto per quanto riguarda il trasporto di massa e la semina della cellule 22 Capitolo 1 Introduzione sullo scatfold Il principio di funzionamento di seguito brevemente descritto un costrutto viene fissato in una camera di coltura e il medium gli fluisce attraverso messo in moto da una pompa a monte della camera 2 La perfusione pu essere di due tipi confinata o meno Nel primo caso 1l medium costretto a fluire attraverso 1 pori dello scaffold Figura 1 8 A mentre nel caso di costrutti tubolari il medium scorre all interno ed all esterno del vaso Figura 1 8 B P direct perfusion chamber Figura 1 8 A esempio di bioreattore a perfusione confinata B schema a blocchi di un bioreattore a perfusione per costrutti tubolari 1 4 6 Bioreattore a perfusione pulsatile per vasi Questa categoria di bioreattori particolarmente indicata per la rigenerazione di strutture tubolari come vasi sanguigni Il tipo di stimolazione che viene applicata al costrutto una deformazione radiale pulsatile delle pareti del vaso al fine di replicare le condizioni fisiologiche in cui il vaso sottoposto al flusso pulsatile del sangue Questa sollecitazione
43. of distensibility compliance C of samples of human saphenous vein Through the pressure limitation mode of the SW control we could stimulate the vein in his physiological pressures range O 10 mmHg recording the value of pressure and volume infused over time The set up achieved in this test is shown in Figure 10 Figure 23 Set up for measuring the compliance of the saphenous vein Are shown the pump the pressure sensor the culture chamber and the PC that is running the SW control VI It was therefore calculated the value of C for two different flow rates of infusion provided by the pump for Q 0 02 ml min the C is equal to 0 03116 0 0045 mmHg while for Q 0 04 ml min is equal to 0 0301 0 0006 mmHg C values found are comparable with the values calculated in a previous work carried out at the uBS Lab 1 C 0 0522 0 0122 mmHg The set up and control system developed have improved the test conditions of the previous work where the pressure increases are imposed manually by a manometer and the value of the volume of fluid is seized by the graph paper The system developed has therefore made it possible to make the test more automated and reduce the time for the evaluation of the compliance of the vessel It also allows you to measure the values of P and V more accurately than the previous protocol because the measure is not affected by uncertainty and variability that manual intervention of the
44. operator can result The second set up in which was applied the is directed the of of distensibility of the bladder and to the control system to characterization the properties decellularization of the organ itself Through the SW control tests were carried out on the organ of cystometry pre and post decellularization In Figure 11 1s an example of a curve cystometric of native organ Abstract Curva cistometrica della vescica nativa Regione Regione 2 Regione 3 Pressione amp loi os N Vi Volume Figura 24 PV curve of a native bladder the three regions are highlighted curve characteristics as a function of two specific values of intravesical volume V1 and V2 The values of volume V1 and V2 identify three regions of behavior of native bladder in particular V2 identifies the volume value beyond which the organ is subjected to a non physiological stress region of overstretching From the comparison between the cystometric curve of native and decellularized bladder Figure 12 it has been observed that there is a different behavior between the native and decellularized organ in the second case the body responds to an increase of volume infused with a significant increase pressure only after a value of the volume infused V1 post much higher than that needed organ native pre VI Confronto Cistometria pre e post decellularizzazione Campione 2 a 2 Cisto Pre Press
45. pompa che gestisce ad esempio 1l ricircolo del medium e impone le sollecitazioni desiderate al costrutto in termini di gradiente di pressione e perfusione Si possono poi avere dei sensori per monitorare 1 parametri della coltura come un sensore di pressione di portata di pH o di ossigeno Tutte queste componenti devono essere gestite in modo preciso e sincrono e di questo si occupa il software di controllo Un programma per la gestione di un bioreattore deve quindi controllare gli attuatori siano essi pompe attuatori meccanici o elettrodi per la stimolazione e 16 Capitolo 1 Introduzione deve poter acquisire 1 segnali inviati dai sensori volti al monitoraggio del processo in corso Per rendere pi completo robusto e affidabile il processo il sistema di controllo deve anche essere dotato di un sistema di retroazione Ci fa si che il sistema di controllo possa ri assegnare il valore corretto del segnale d ingresso dell attuatore qualora esso sia diverso dal valore desiderato a causa di eventuali disturbi sulla base del segnale di uscita effettuato dal trasduttore durante il processo Figura 1 3 Disturbo S l Segnale Controllore Attuatore gt Processo d uscita d ingresso Retroazione lt Trasduttore Figura 1 3 Schema a blocchi di un sistema di controllo retroazionato Il vantaggio di introdurre una retroazione nel sistema di controllo non solo di correggere eventuali valori indesiderati dell uscit
46. possono portare al non corretto funzionamento del programma quindi fondamentale che chi agisce su questi parametri abbia piena consapevolezza del loro significato e di come costruito il software Nei riquadri viola di Figura 2 21 sono evidenziati 1 controlli per impostare 1 canali di I O della scheda NI DAQ Una volta che il cablaggio degli attuatori e trasduttori con la scheda NI DAQ stato effettuato questi parametri non vanno pi modificati Un altro set di parametri che possibile Impostare quello riguardante l acquisizione dei segnale di input analogici segnale di pressione e segnale di tensione in uscita dalla pompa Acquisition Settings in Figura 2 21 possibile impostare la modalit di acquisizione a seconda del cablaggio realizzato RSE o differenziale paragrafo 2 2 2 la frequenza di acquisizione del segnale f In questo pannello sono selezionabili 1 canali riquadri gialli di Figura 2 21 tra gli otto canali di AI disponibili nel SW tramite 1 quali viene letto 11 valore di pressione utilizzato come parametro di controllo nella stimolazione in limitazione di pressione canale 0 Channel Pressure Limitation in Figura 2 21 e la tensione in uscita della pompa proporzionale alla portata impostata canale 1 Channel Speed Out in Figura 2 21 attraverso cui viene ricavato il volume erogato aspirato mostrato nel pannello Control Pump del SW paragrafo 2 5 3 2 59 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW
47. principi dell ingegneria e delle scienze della vita con l obiettivo di sviluppare strutture biologiche che possano riparare mantenere o migliorare le funzioni di un tessuto o di un organo intero 8 Oggigiorno la TE basata sull interazione tra componenti biologiche cellule medium e biomateriali scaffold il tutto posto in una camera di coltura chiamata bioreattore che fornisce alle cellule seminate sullo scaffold gli opportuni stimoli chimici pH pO fattori di crescita e o fisici meccanici elettrici magnetici al fine di permettere la maturazione di un tessuto funzionalizzato in vitro Figura 1 1 Gli enormi progressi scientifici fatti in questi ultimi anni nel campo dei biomateriali nuovi materiali superfici biomimetiche e tecniche di lavorazione innovative nell utilizzo delle cellule staminali e nello sviluppo di nuovi bioreattori hanno creato 1 presupposti per l affermazione e l effettivo impiego clinico di procedure legate all ingegneria dei tessuti Gi nella seconda met degli anni ottanta sono stati pubblicati 1 primi lavori in cui sono stati presentati tecniche e approcci che successivamente sono confluiti sotto il nome di ingegneria dei tessuti ma solo nel corso di questi ultimi venticinque anni le pubblicazioni scientifiche si sono fatte sempre pi numerose e specializzate i ul BI g i vr Porosity Mechanical Biocompatibility Na C x Degradability ILD Tissue Engineering Regenera
48. quindi evincere che il sistema di controllo di un bioreattore diventato indispensabili nel campo della TE sia per dispositivi differenti tra loro bioreattori a perfusione bioreattori per stimolazione meccanica set up per la decellularizzazione sia in applicazioni molto diverse tra loro rigenerazione di tessuti caratterizzazione biomeccanica di tessuti decellularizzazione di organi 10 sia per un ampio range di tessuti tessuto cartilagineo osseo e muscolare oltre a vasi e mucose Si visto inoltre come associare a una camera di coltura un sistema di controllo che sia in grado di gestire le 21 Capitolo 1 Introduzione sollecitazioni prodotte dagli attuatori sforzo deformazione 14 gradiente di pressione 15 17 compressione meccanica 13 e monitorare 1 parametri biochimici della coltura pH pO temperatura sia di fondamentale importanza per il fine ultimo dell ingegneria dei tessuti ossia realizzare un costrutto funzionale impiantabile in un paziente Solo tramite un adeguato sistema di controllo infatti si possono assicurare ripetibilit e automazione del processo oltre a garantire il rispetto di standard di qualit ben definiti specifiche imprescindibili per l applicazione clinica di qualsiasi terapia innovativa 28 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 1 Obiettivo del progetto Il presente lavoro di
49. registrata tramite il sensore di pressione Relazione tra APe Q nelle prove di permeabilit 15 10 Portata l min 30 40 50 60 Pressione mmHg 70 80 D1 1 mD 2 AD3 1 AD3 2 D 2 1 S2 1 S1 2 mS2 2 Figura 4 8 Curve P Q ottenute in seguito a prove di permeabilit su tessuto di vescica decellularizzato con protocollo statico S e protocollo dinamico D 101 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici I punti sperimentali ricavati dalle diverse prove effettuate sono stati poi interpolati tramite retta di regressione Figura 4 8 Si osserva che la relazione Q AP lineare pertanto possibile utilizzare la relazione definita nell equazione 3 per il calcolo del coefficiente di permeabilit K calcolando il rapporto fra la portata di infusione imposta e la caduta di pressione misurata Per 15 campioni decellularizzati con protocollo dinamico si ricavato un valore di Kmedio pari a 0 239 0 046 ul min mmHg mentre per i provini decellularizzati con protocollo statico il Kmedio Stato valutato pari a 5 037 2 462 ul min mmHg Il risultato ottenuto mostra come 1 patch di tessuto decellularizzato abbiano un coefficiente di permeabilit non nullo a differenza del tessuto nativo sostanzialmente impermeabile caratterizzato da un coefficiente di permeabilit pari a 0 35 In funzione dei
50. sia affetto da errori introdotti dalle operazione manuali da parte dell utente e sia inoltre ripetibile Inoltre il SW permette di monitorare e registrare il valore di volume infuso dalla pompa rendendo quindi pi semplice ed accurato 11 calcolo del volume di liquido sequestrato dal vaso Ulteriore vantaggio che l impiego del sistema di controllo sviluppato pu garantire la riduzione del tempo necessario per condurre la prova Tramite il SW la fase di precondizionamento resa automatizzata eliminando 1 tempi aggiuntivi che l intervento manuale dell utente comportava nella procedura di carico e scarico della pressione interna del Vaso 4 3 Prove di premeabilit di un patch di tessuto urovescicale decellularizzato In questa specifica prova si utilizzato 11 sistema di controllo per l analisi della variazione delle propriet di permeabilit di un patch di tessuto urovescicale del modello animale del coniglio a valle del processo di decellularizzazione del tessuto In particolare lo scopo dell analisi stato quello di quantificare l effetto indotto dalla rimozione delle cellule uroteliali che in vivo rappresentano la barriera naturale alla fuoriuscita dell urina contenuta in vescica cos come delle cellule muscolari presenti nello strato pi interno della parete dell organo che causa un aumento della porosit della matrice extracellulare in termini di filtrazione di un fluido in pressione attraverso le par
51. sistema di controllo realizzato s1 pu suddividere in due parti complementari la componente fisica ossia l hardware HW costituita da una pompa volumetrica un sensore di pressione un elettrovalvola pinza tubo ed i cablaggi per interfacciare questi elementi con il computer PC e da una componente software SW sviluppata in ambiente LabVIEW 8 6 National Instruments che permette di gestire ovvero azionare e monitorare gli elementi dell hardware In generale come accennato in precedenza il sistema di controllo in grado di applicare diversi pattern di stimolazione intesa come l azione del fluido che esercita uno stimolo pressorio sul tessuto biologico e monitorare l andamento della pressione che agisce sul costrutto acquisita dal sensore di pressione in tempo reale Il sistema di controllo permette quindi di applicare una sollecitazione al tessuto organo controllata monitorata e ripetibile tutte specifiche imprescindibili per un sistema di controllo come messo in evidenza anche negli esempi riportati nel capitolo precedente Ci consente inoltre di standardizzare le procedure sperimentali con potenziali risvolti positivi dal punto di vista dell ingegnerizzazione o dell applicazione clinica dei dispositivi sviluppati in laboratorio Un ulteriore peculiarit del sistema quella di consentire il salvataggio automatico delle grandezze fisiche di output pressione e volume della stimolazione Imposta e di effettuare quindi u
52. solo set up sia per le prove di cistometria che per le prove di decellularizzazione dell organo Per maggiore chiarezza in Figura 4 13 mostrato il set up con 1 componenti necessari alla sola prova di cistometria privato quindi dell elettrovalvola Impiegata nella prova di decellularizzazione il set up completo sar descritto nel paragrafo 4 5 1 Figura 4 13 Set up per la prova di cistometria pre e post decellularizzazione della vescica Sono visibili PC con il SW di controllo scheda NI DAQ pompa volumetrica sensore di pressione contenitore con la vescica Attraverso il set up di Figura 4 13 stato quindi possibile procedere anche in questo caso senza richiedere alcun intervento manuale da parte dell operatore con il riempimento dell organo tramite l infusione di fluido acqua bidistillata monitorando tramite il SW di controllo sia il volume infuso che la pressione in tempo reale La portata di riempimento pari a 1 ml min Con riferimento alla Figura 4 13 la pompa quindi preleva il fluido da un reservoir posto a monte della pompa stessa e lo infonde all interno dell organo incannulato e collegato al circuito idraulico Tra la pompa e l organo posto il sensore di pressione per l acquisizione del valore di pressione intravescicale sensore di pressione vescica reservoir Figura 4 14 Circuito idraulico del set up per la prova di cistometria Sono visibili reservoir pompa sensore di pression
53. stimolazione soglia di pressione portata durata delle fasi sequenza delle fasi ecc siano modificabili ad intervalli di tempo definiti dall utente in funzione della differente risposta del tessuto nel breve o nel lungo termine alla stimolazione imposta Ci permetterebbe di impiegare il sistema di controllo anche con camere di coltura per la rigenerazione di tessuti tramite la ricellularizzazione di matrici biologiche e non 129 APPENDICE A APPENDICE A Dimensionamento del circuito di amplificazione dei sensori di pressione Nel presente lavoro di tesi sono stati impiegati due diversi sensori di pressione il sensore Honeywell 26PCA HW e il sensore Pendotech Press S 000 PT 1 quali differiscono principalmente per il diverso Fondo Scala FS ovvero il valore massimo di pressione che il sensore in grado di acquisire Il valore di FS descritto nel datasheet dei due sensori 21 22 pari rispettivamente a 51 7 mmHg HW e 250 mmHg PT Al valore di FS 1 due sensori emettono un valore di tensione molto basso pari rispettivamente a 16 7 mV HW e 14 75 mV PT Come accennato nel Capitolo 2 paragrafo 2 2 2 il circuito di amplificazione stato realizzato al fine di amplificare il valore di tensione in uscita dai sensori cos da poter sfruttare tutto il Full Scale Range FSR 0 10 V nel caso di pressioni sempre positive della scheda di acquisizione e quindi massimizzare la risoluzione del sistema di acquisizione Senso
54. tesi svolto presso il laboratorio di Micro e Biofluidodinamica Sperimentale uBS Lab del Dipartimento di Elettronica Informazione e Bioingegneria del Politecnico di Milano volto allo sviluppo di nuovi strumenti e tecnologie che trovano applicazione nel settore di ricerca dell ingegneria dei tessuti In particolare l obiettivo specifico del presente lavoro sviluppare un sistema per il monitoraggio e il controllo di dispositivi quali sistemi di coltura dinamici in grado di applicare stimoli meccanici a tessuti biologici molli attraverso un fluido in pressione La stimolazione imposta dal sistema di controllo quindi una stimolazione pressoria dovuta all azione del fluido che perfonde l organo o il patch di tessuto Questo tipo di stimolazione comporta la distensione delle pareti dell organo o del tessuto sollecitato Una delle principali caratteristiche del sistema realizzato sulla base della quale sono state definite molte delle specifiche di progetto la versatilit del sistema intesa come la possibilit del sistema di controllo di adattarsi a differenti set up sperimentali bioreattore a perfusione set up per la decellularizzazione di organi interi e campioni di tessuto e a diverse applicazioni stimolazione di tessuti biologici caratterizzazione delle propriet biomeccaniche dei tessuti decellularizzazione Il sistema stato quindi realizzato in modo tale da poter essere applicato in differenti condizioni di lavor
55. tessuto osseo quindi avr caratteristiche molto diverse da uno per la rigenerazione del tessuto muscolare Gli scaffold possono essere biodegradabili o permanenti naturali o 12 Capitolo 1 Introduzione sintetici ma devono sempre essere biocompatibili ossia non generare una reazione dannosa o comunque indesiderata dal punto di vista dell interazione con 1 tessuti biologici dell organismo con cui vengono a contatto Materiali sintetici ampiamente usati sono ad esempio l acido polilattico PLA l acido poliglicolico PGA e il policaprolattone PCL Per quanto riguarda gli scaffold biologici stanno avendo sempre pi successo per 1 vantaggi che comportano le matrici decellularizzate di tessuti e organi siano essi animali o umani Poich questo tipo di scaffold non altro che l organo che si vuole ricreare privato solo della componente cellulare comprensibile come la sua architettura e le sue propriet meccaniche siano molto simili a quelle volute Diversi studi 9 10 hanno dimostrato come il processo di decellularizzazione di un organo o tessuto mantenga sufficientemente l organizzazione strutturale della ECM e una volta che la matrice stata ricellularizzata permetta di ripristinare le opportune propriet meccaniche del tessuto ingegnerizzato ossia paragonabili a quelle del tessuto nativo Il processo di decellularizzazione necessario per eliminare la componente cellulare Questa ultima infatti sia nel caso di tess
56. the SW vili characteristics of robustness and reliability must ensure that the operations are carried out correctly for the duration of stimulation III User interface of the control SW The user interface is divided into five tabs The first is devoted to the setting of the first parameters to be defined and these parameters won t be changed once defined the stimulation protocol of the experiment to be carried out The second is dedicated to the acquisition of the pressure signal and the calibration of the pressure sensor The third the main panel where the stimulation is set and monitored The fourth panel is dedicated to Post Processing The last panel is dedicated to expert users only and integrates parameters not related directly to the stimulation but rather for example channels of I O used or the acquisition frequency of the pressure signal The main panel Pump Control is divided into two main areas The stimulation Figure 4 is first area dedicated to setting the parameters of stimulation Pressure Limitation Stimulation Pattern we x a OF Infusion Rest Withdraw Rd T Withdraw T Infusion Infusion Speed Withdraw Speed Operation Mode 00 05 00 8 00 03 00 0 376 A 0 376 y j 3 T Rest Pattern Time 0 37 fl 00 02 00 1 00 10 00 02 02 F r Session Time Cycles 0 1 01 j Infusion Withdraw Rest s La WITHDRAW s i e _
57. una campagna con un numero di campioni pi esteso per confermare 1 risultati promettenti ottenuti tramite queste due prove 121 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Durante entrambe le prove di decellularizzazione stato utilizzato 1l SW sviluppato nel presente lavoro di tesi in modalit di limitazione in pressione con un pattern che prevede il ripetersi ciclico in maniera alternata delle fasi di infusione aspirazione rest La fase di rest al termine della aspirazione della durata di 15 sec volta a consentire al segnale di pressione di stabilizzarsi al termine della aspirazione in modo da non acquisire valori errati all inizio della successiva fase di infusione In Figura 4 23 mostrato il pannello principale Control Pump del SW di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi in cui si possono ritrovare tutti 1 parametri della prova di decellularizzazione effettuata Settings Acquistion Panel Pump Control Post Processing Advanced Settings GE 119 gt Pressure Limitation Stimulation Pattern Pump Speed Infusion Volume per Cycle Withdraw Volume per Cycle EMERGENCY ONLY DI Infusion Withdraw Rest x 0 002 mi 0 004 ml Pressure Record Volume Record Max T Infusion Max T Withdraw Infusion Speed Withdraw Speed Auto Rec M IR A D anual Rec vf
58. una cannula graduata posta in posizione orizzontale collegata in serie al vaso e connessa allo sfigmomanometro Inoltre presente un foglio di carta millimetrata solidale con la cannula graduata che consente di leggere 1 valori di volume sequestrato dal vaso durante la prova Il protocollo prevede che vengano manualmente da parte dell utente imposti tramite lo sfigmomanometro incrementi successivi 95 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici del valore di pressione pari a 10 mmHg Il volume sequestrato dal vaso viene quindi stimato rispetto alla nuova posizione che il menisco di fluido assume nella cannula graduata in risposta all incremento di pressione attraverso la carta millimetrata Appaiono evidenti le criticit sperimentali nell effettuare una misura di compliance con questo set up sia per la difficolt di imporre precisamente il valore di incremento di pressione desiderato sia per quanto riguarda la ripetibilit dei valori imposti durante varie prove Anche la valutazione del volume sequestrato dal liquido tramite lettura su carta millimetrata risulta essere poco accurata Tramite invece l utilizzo del SW del sistema di controllo possibile Impostare le soglie di pressione entro cui si vuole mantenere la sollecitazione monitorando l andamento della pressione in tempo reale assicurando cos che il protocollo di prova non
59. valore di volume infuso aspirato fase di infusione e aspirazione o del tempo trascorso fase di rest 2 5 3 1 3 Stimolazione in limitazione di pressione modalit automatica Questa modalit fondamentale per quelle applicazioni che richiedono un controllo molto accurato sul valore di pressione a cui sottoposto il campione in fase di stimolazione Come nella modalit automatica in controllo di volume l utente in grado di selezionare uno tra 14 pattern di stimolazione disponibili blocco B di Figura 2 16 e di settare la portata di infusione e aspirazione in maniera indipendente blocco C di Figura 2 16 In questa modalit la durata delle singole fasi di infusione aspirazione slegata da un controllo sul tempo o sul volume infuso aspirato ma dipende dal valore di pressione acquisito dal sensore Ovviamente la fase di rest rimane legata al controllo della variabile tempo 32 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo Pressure Limitation Stimulation Pattern Infusion Volume per Cycle Withdraw Volume per Cycle Infusion Rest Withdraw ha e ES ml 06 ml Operation Mode Max T Infusion MaxT Withdraw Infusion Speed Withdraw Speed 15 gt fn 00 05 00 00 03 00 0 376 si 0 376 1 25 T Rest Max Pattern Time 0 3 0 3 Stimulation Volume ml oS O Ny un un e 1 Session Time Cycles 0 1 INFUSION RE 352 l Infusion Withdraw Rest z l 100 00 05 00 W
60. 00592 0 00577 0 00015 l 0 08994 0 00728 0 09722 1 5 0 13662 0 00559 0 14221 9 0 19143 0 04586 0 14556 25 0 24038 0 07090 0 16948 3 0 28807 0 11244 0 17563 3 5 0 34476 0 15423 0 19053 4 0 38820 0 19273 0 19548 4 5 0 44024 0 24131 0 19892 5 00 0 47921 0 32043 0 15879 7 50 0 72830 0 55605 0 17226 10 00 0 96616 0 80448 0 16167 20 00 1 95215 1 78016 0 17198 50 00 4 84972 4 69650 0 15322 80 00 7 74037 7 61621 0 12416 90 00 8 73271 8 59879 0 13392 95 00 9 21289 9 08156 0 13132 98 00 9 49992 9 35713 0 14279 100 00 9 67007 9 56009 0 10999 Tabella 3 3 Analisi dei valori di tensione in uscita dal motore della pompa acquisiti per diversi valori di RPM impostati via display e via SW L ultima colonna contiene la differenza tra 1 valori acquisiti nelle due modalit di controllo della pompa 83 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo La Figura 3 13 mostra le due rette di calibrazione ottenute interpolando 1 dati di Tabella 3 3 Controllo pompa tramite Display e SW 10 i r 9 we 8 y gt 6 gt a Controllo Display 4 i Zi 3 s controllo SW 2 AF 1 ya 0 de 1 0 20 40 60 80 100 RPM Figura 3 13 Rette di calibrazione ottenute interpolando 1 dati della Tabella 3 3 per le modalita di controllo della pompa via Display e via SW La colonna dei dati Differenza Display SW V in Tabella 3 3 e la differenza tra le due rette di Figura 3 13 consentono di quantificare quantitativamen
61. 16 Tempo hh mm Figure 22 Routes of curves of pressure versus time in automatic mode in pressure limitation derived from the acceptance test of the SW with the perfusion bioreactor and the patch of latex The tests carried out have made it possible to check the proper functioning of the control arrangements of the SW made available to the user Monitoring and control of parameters of stimulation of organs and biological tissues At the end of the tests it 1s proceeded to the actual use of the control system developed using the system to conduct 4 different experimental for the stimulation with pressurized fluid of tissues or organs 1 characterization of the properties of distensibility compliance of samples of human saphenous vein 2 measurement of the permeability of a patch of biological tissue decellularized rabbit bladder via volume control infusion and pressure monitoring agent on the patch 3 characterization of the properties of distensibility compliance of an entire organ decellularized rabbit bladder compared with native organ through testing cystometry 4 dynamics decellularization of entire organ rabbit bladder through infusion and withdraw of decellularizing agents As example we describe below two sets made up showing how control system was integrated in the set up highlighting the benefits The first set up made into consideration 1s aimed at the characterization of the properties
62. 18 0 016219 0 034965 0 003185 0 030361 0 037718 0 048571 0 127832 0 054037 0 871438 0 555052 0 402779 0 231431 0 204462 0 142303 0 167956 1 607350 1 116786 0 903011 0 759618 0 554394 0 478093 0 362655 0 335358 0 668681 1 060546 0 994112 0 938859 0 780009 0 716534 0 594847 0 545843 0 137549 0 978325 0 967801 0 981285 0 883278 0 859927 0 764222 0 724098 0 312923 1 113497 1 051995 1 054298 0 966815 0 963197 0 887225 0 862558 1 179771 1 003649 1 002334 1 043773 0 985232 1 006609 0 953659 0 948726 0 663670 1 055942 1 019436 1 051009 0 995427 1 029302 0 989836 0 999374 0 897503 1 215780 1 128625 1 127639 1 051338 1 074360 1 032262 1 046404 0 947609 1 025685 1 047720 1 096395 1 045418 1 083239 1 051009 1 072715 0 359689 0 984903 0 992139 1 049364 1 013187 1 063835 1 042458 1 074360 0 825683 1 186180 1 105932 1 113826 1 046404 1 082253 1 053969 1 084226 1 144697 0 985890 1 017134 1 070084 1 026014 1 073044 1 050022 1 084555 0 650309 1 022067 1 007596 1 053640 1 009241 1 058902 1 039169 1 077319 0 892492 1 165460 1 096724 1 107577 1 040484 1 076662 1 048378 1 082582 0 775576 1 048049 1 051338 1 092777 1 039827 1 081266 1 053969 1 087515 0 767225 0 939846 0 965170 1 032262 0 999703 1 054955 1 037196 1 076991 0 839044 1 141123 1 064822 1 080937 1 019765 1 061862 1 037853 1 074688 1 176431 1 062849 1 036538 1 073702 1 020094 1 063506 1 037524 1 074031 N SATZ7ZAA 1 1AR28G 1 naanad 1 1129220 1 NARNAG 1 NRADDA 1052211 1 NMNRARRA Figura 2 19 Esempio
63. 43 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo ll possibilit di interfacciarsi direttamente con la scheda NI DAQ della stessa casa National Instruments mediante appositi drivers Daq Mx che consentono un accesso diretto ai canali di input e output della scheda di nn ill un ambiente diffuso nel laboratorio in cui stato svolto il presente lavoro di tesi e quindi dar la possibilit non solo ad altri utenti esperti di apportare modifiche o adattare il programma in risposta alle future esigenze 2 5 Interfaccia Utente In questo paragrafo s illustreranno le funzionalit del SW realizzato dal punto di vista dell interfaccia utente Per quanto riguarda i dettagli dell architettura del SW ovvero come il programma esegue le varie funzioni implementate queste saranno descritte in dettaglio nel capitolo 3 L interfaccia utente del programma realizzato stata studiata in modo tale da consentire sia ad utenti esperti che non di poter utilizzare il SW di controllo Sono state quindi adottate specifiche di semplicit chiarezza ed intuitivit cos da rendere l interfaccia user friendly Per facilitarne l utilizzo l interfaccia suddivisa in cinque pannelli ciascuno dei quali gestisce diverse funzioni ed impostazioni del programma Figura 2 9 La sequenza con cui sono stati ordinati 1 pannelli stata scelta per ricalcare l ordine logico delle operazioni che un utente deve eseguire per impos
64. Al fine per di ridurre l ingombro del set up sperimentale si valutata la possibilit di alimentare il sensore tramite il SW del sistema di controllo La scheda di acquisizione DAQ USB 6211 fornita di due canali analogici di output uno dei quali utilizzato per comandare il numero di giri della pompa AO 0 Si quindi pensato di alimentare il sensore tramite l altro canale disponibile AO 1 I canali analogici di output sono in grado di erogare 2 mA di corrente ciascuno ed una tensione nel range 0 10V 20 Il sensore Pendotech Press S 000 richiede un alimentazione tra 2 5 e 10 V e una corrente di 20 mA 21 A causa dell eccessiva richiesta di potenza elettrica quindi questo sensore non alimentabile tramite la scheda NI DAQ e quindi tramite SW e si richiede pertanto l utilizzo di un alimentatore esterno Nel caso del sensore Honeywell 26PCA si invece riusciti ad alimentarlo tramite la scheda di acquisizione poich la richiesta di corrente di questo sensore sufficientemente bassa lt 2 mA da essere soddisfatta dalla scheda NI DAQ Tramite quindi il canale analogico di output AO 1 si in grado di alimentare il sensore a 10 V senza la necessit di un alimentatore esterno Per alimentare il sensore di pressione Pendotech stato usato un alimentatore integrato TXL 015 12S Traco Power cos da ridurre al minimo gli ingombri del set up L alimentatore in grado di fornire una tensione di 12 V ad una corrente di 1
65. I iaia 94 4 3 Prove di premeabilita di un patch di tessuto urovescicale decellularizzato 96 Ale Protocollo dIprova a eil 97 4 5 2 Risultati sperimental isisssnsgla letali 101 did Provedir CISLOMEL1 AGU VESCICA x sociali 104 dl Protocollo di piovana 107 442 Risultati spertimentali a ilaele 109 4 5 Prove di decellulanzzazione della vescica area 112 4 5 1 Setup per la decellularizzazione della vescica 113 45 2 Protocollo di Proy dere a ea 115 43 3 Risultati sperimentali ssepe aa a 117 Ds Conclusronte SV NIP PE oriali esi 124 APRBENDICE Sigilli iii ii iu 130 BIDUO I deresan io i ale iena 134 Sommario Sommario Introduzione L ingegneria dei tessuti TE un campo di ricerca multidisciplinare che attraverso 1 principi della biochimica della medicina dell ingegneria della fisica e della matematica si propone di riprodurre in vitro porzioni di tessuti biologici destinati alla sostituzione di tessuti umani danneggiati a causa di eventi traumatici o affetti da patologie 1 Oggigiorno la TE basata sull interazione tra componenti biologiche cellule medium e biomateriali scaffold il tutto riposto in una camera di coltura chiamata bioreattore che fornisce alle cellule seminate sullo scaffold gli opportuni stimoli al fine di permettere la maturazione di un tessuto funzionalizzato in vitro I bioreattore puo essere suddiviso in due sottosistemi Figura 1 l ambi
66. ITHDRAW Q 9 O T Time hh mm ss E Figura 2 16 Area di stimolazione modalit in limitazione di pressione Pattern infusione rest aspirazione tempi fasi massimi 5 minuti infusione 3 minuti aspirazione 2 minuti rest portate 0 3 ml min infusione 0 2 ml min aspirazione La limitazione in pressione consente di mantenere la stimolazione all interno di un range di pressioni deciso dall operatore paragrafo 2 5 1 il SW d la possibilit di impostare le due differenti soglie di pressione ovvero il valore massimo e il valore minimo In questa modalit 1l programma monitora l andamento della pressione e determina il passaggio alla fase successiva del pattern di stimolazione nel momento in cui si raggiunta una delle due soglie Inoltre l utente pu impostare il tempo oltre soglia ossia per quanto tempo la pressione debba mantenersi al di sopra o al di sotto della soglia impostata prima di cambiare effettivamente fase Questa verifica da parte del programma evita che il sistema di controllo cambi fase erroneamente a causa d indesiderati spike di pressione dovuti ad esempio alla temporanea e involontaria compressione di un tubo del circuito idraulico da parte dell operatore Esiste poi la possibilit di Impostare dei valori di tempo massimi oltre 1 quali se non venisse raggiunto 11 valore di pressione desiderato il programma forza il passaggio alla fase successiva blocco B di Figura 2 16 Questo ulteriore con
67. Il primo dedicato all impostazione dei primi parametri da definire in quanto non andranno pi variati una volta definito 1l protocollo di stimolazione dell esperimento da attuare Il secondo dedicato all acquisizione del segnale di pressione e alla calibrazione del sensore di pressione Il terzo il pannello principale dove viene impostata e monitorata la stimolazione Il quarto pannello dedicato alla fase di elaborazione dati Post Processing XN L ultimo pannello dedicato ad utenti esperti e integra parametri non inerenti direttamente alla stimolazione quanto invece ad esempio 1 canali di YO utilizzati o la frequenza di acquisizione del segnale di pressione Il pannello principale Pump Control suddiviso in due aree principali La prima area di stimolazione Figura 4 dedicata all impostazione dei parametri della stimolazione Pressure Limitation Stimulation Pattern i Pump Speed ori Infusion Rest Withdraw Rd Eu C_D rpm Operation Mode T Infusion T Withdraw Infusion Speed Withdraw Speed 1 00 05 00 00 03 00 0 376 Aa 0 376 4 E fe Session Time Cycles Pattern Time et 2 1 E 0 T Rest xc 9 00 02 00 00 10 00 0 0 j Infusion Withdraw Rest WITHDRAW 9 H e Manua 2 J Stimulation 95 PE j rh Ly 0 0 0 INFUSION Figura 4 Area di stimolazione controllo in volume modalita automatica L utente pu scegliere la
68. POLITECNICO DI MILANO Scuola di Ingegneria Industriale e dell Informazione Corso di Laurea Magistrale in Ingegneria Biomedica SVILUPPO DI UN SISTEMA PER IL MONITORAGGIO E IL CONTROLLO DELLA STIMOLAZIONE IN PRESSIONE IN APPLICAZIONI DI INGEGNERIA DEI TESSUTI Relatore Prof Ing Monica Soncini Correlatore Ing Filippo Consolo Tesi di Laurea di Francesco DAL DOSSO Anno Accademico 2011 2012 Indice Indice SOLIERA e TA I Allioni I la MANGO Z ODN Linn ei 10 1 1 Modic 0 TC CGAY aene E EE tenti 10 bi leslie 10 ee AM biofcallore grin i E 15 1 3 ESSI 080111 0 1 6 ERRORE OR RO ORE OR TI 16 L4 Diorcatonnell meeonera TESSUTI iii 18 L41 BIO RCATEO Re DINAH iaia avan 19 tA2 DIORSIHORE A PARITA iii irradia 20 1 4 3 Bioreattore a compressione ii 20 AZ SM UME ACU Ole sao a 21 Me ICRC ALORS a PCL MU SION ira 22 1 4 6 Bioreattore a perfusione pulsatile per vasi 23 2al 2 2 Zo 1 4 7 Bioreattore a perfusione per la proliferazione di cellule endoteliali su costrutti IDO icaro ri 24 1 4 8 Bioreattore per la stimolazione meccanica i 25 1 4 9 Bioreattore per la caratterizzazione meccanica di teSSUtl i 26 1 4 10 Setup per la decellularizzazione di teSSUtl i 26 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 29 Obiettivo del progetto iii 29
69. RT area di destra in Figura q 2 18 Quando la stimolazione in corso il pulsante attivo con segnale luminoso verde Terminata la prova per uscire dal programma si utilizza il pulsante Quit Vi poi un comando di sicurezza ABORT che blocca gli attuatori e forza l uscita dal programma Questo elemento di 56 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo sicurezza stato implementato in caso di eventi inattesi e dannosi che richiedono un immediato arresto del programma e degli attuatori 2 5 4 Il pannello Post Processing Terminata la fase di stimolazione l utente pu decidere di analizzare 1 dati che ha eventualmente registrato sia di pressione che di volume Il pannello di post processing Figura 2 20 offre la possibilit di effettuare un analisi statistica sui dati registrati caricando 1l file txt salvato durante la registrazione paragrafo 2 5 3 3 ed elaborandone 1 dati 4 Settings Acquistion Control nbd epson jen Settings Modali lisi Post Processing Pressure Volume lit Pressure tH J Campionamento G C Mean Vas Start Infusion IN Clear Graph r Ora Campionamento di Start Withdraw campioni MM ogni n secondi 0 TRS Media primi ultimi n elementi J 10 Media di n elementi 10 ogni n secondi A 40 M last sample 0 2850 31000 7 3955 9 6840 7 0200 8 1433 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7
70. Si quindi cos ricavata la retta di calibrazione della portata da RPM in ml min da implementare nel SW Si proceduto al calcolo della retta specifica per ogni diametro di sottopompa d interesse A titolo esemplificativo si mostra la relazione RPM ml min ottenuta tramite la procedura di calibrazione appena descritta per il sottopompa con diametro interno di 0 25 mm Figura 3 14 85 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Calibrazione Sottopompa 0 25mm y 978 712x 0 037196 Input SW RPM ts Ln 0 0 02 0 04 0 06 0 08 0 1 0 12 Output pompa ml min Figura 3 14 Retta calibrazione RPM ml min per il sottopompa di diametro interno 0 25 mm 3 4 3 Verifica della procedura di calibrazione della portata espressa in RPM e ml min A valle della procedura di calibrazione per verificare l effettiva corrispondenza tra il volume erogato dalla pompa comandata via SW ed il volume erogato comandandola via display sono state effettuate alcune prove misurando il peso del liquido acqua demineralizzata erogato in entrambe le modalit di comando della pompa tramite una bilancia elettronica Mark S422 Bel Engineering Si assume la densit dell acqua demineralizzata pari a 1 g cm cos da poter ipotizzare l equivalenza tra peso misurato e volume infuso La prova stata condotta per tubi con due differenti diametri interni 0 25 mm e 1 02 mm Per il sottopompa con diametro 0 25 mm si sono effett
71. T 8 8 8 8 Max Pattern Time E d lt Rest 6 6 v STOP START y ai Pia 2 to Wait s Rec ne Alarm s a i i E 00 00 01 Bi 00 00 30 stop A Session Time Cycles 22 f INFUSION ay 0 E dI T T Auto Rec s REC Time ted I 1 I 1 4 iison Wilhdravi Red a n 00 00 00 00 05 00 00 10 00 00 15 00 00 20 00 WITHDRAW Q gt Time hh mm ss l E V t Time axis in Time window sec GG Compliance Autoscale or Clear Chart Volume 5 L z Er Pressure PL min E Time Plots RE ots k I Pressure mmHg Volume ml 3 2 1 I 1 I 1 I 1 tt 0 I I tt 2 500 5 000 7 500 10 000 12500 15 000 17 901 00 00 00 0000 00 05 00 0000 00 10 00 0000 00 15 15 Volume ml Time hh mm ss 2 Refresh every va ja cycles di Clear Chart hee en en eee 0 3 10 15 20 25 3 35 40 45 50 55 60 Figura 4 23 Pannello Control Pump del SW sviluppato Sono impostati i parametri della prova di decellularizzazione Modalit limitazione in pressione pattern infusione aspirazione rest tempi massimi per la fase di infusione 10 minuti mentre per la fase di aspirazione 5 minuti durata fase di rest 15 secondi portate di 1 e 2 ml min per la fase di infusione e aspirazione modalit Auto Rec attiva Occorre infine sottolineare come sia per le prove di cistometria che di decellularizzazione dell organo intero di vescica stato usato il set up sperimentale di Figura 4 17 paragrafo 4 4 1 Nelle prove di cistometria
72. a L estremita finale della vena fissata ad un connettore cieco ci permette di mettere in pressione il vaso 92 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici attraverso l infusione del fluido Tra la pompa e la camera di coltura inserito in serie il sensore di pressione cos da monitorare il valore di pressione all interno del vaso In Figura 4 3 viene schematicamente rappresentato 1l circuito idraulico appena descritto sensore di gt pressione Ca camera di coltura reservoir Figura 4 3 Schema del circuito idraulico della prova per la misura della compliance di un vaso Si notano reservoir pompa sensore di pressione camera di coltura La prova stata realizzata utilizzando 11 SW del sistema di controllo in modalit automatica in limitazione di pressione paragrafo 2 5 3 1 3 ovvero abilitando l infusione aspirazione del fluido all interno del vaso fino al raggiungimento delle soglie di pressione minima e massima rispettivamente pari a 0 e 10 mmHg ovvero il range di pressione fisiologico per la vena safena umana 28 Prima di procedere con la misura della compliance sono stati eseguiti 14 cicli di precondizionamento del vaso finalizzati a riportare il tessuto in esame in una condizione di omeostasi Infatti a causa della sua viscoelasticit il tessuto vascolare non ha uno stato naturale in cui ri
73. a architettura Il set up sperimentale realizzato 11 medesimo di quello illustrato nel paragrafo 3 2 2 1 stato quindi valutato l andamento del segnale di tensione della pompa proporzionale al volume in varie condizioni di stimolazione Il pattern di stimolazione impostato prevede una prima fase di infusione seguita da una di aspirazione e per ultima una fase di rest Le tre configurazioni testate variano per 1 valori delle portate impostate e per la durata delle varie fasi 1 Portata 40 80 ul min Infusione Aspirazione Durata 10 5 minuti Infusione Aspirazione 10 secondi Rest li Portata 0 6 1 2 ml min Infusione Aspirazione Durata 10 5 minuti Infusione Aspirazione 10 secondi Rest il Portata 0 6 1 2 ml min Infusione Aspirazione Tempi 20 10 secondi Infusione Aspirazione 10 secondi Rest In tal modo si collaudato 11 SW nel momento in cui esso debba gestire durate delle fasi lente nell ordine dei minuti o veloci nell ordine dei secondi associate a portate molto basse ul min o pi alte ml min T1 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo La Figura 3 9 mostra il tracciato del volume nel tempo per le tre configurazioni verificate Cicli 1 4 Cicli 53 57 0 4 S x 01 00 13 30 14 30 Tempo hh mm Cicli 1 4 Cicli 55 59 6 A gt al 01 00 14 00 15 00 Tempo hh mm Ill Cicli 1 4 Cicli 1350 1354 0 2 rs gt ui 00 03
74. a causati da disturbi esterni ma anche di consentire al sistema di adattarsi alle condizioni della coltura che possono variare nel tempo Infatti in esperimenti di coltura di lunga durata fino a decine di giorni possono essere necessarie condizioni di coltura diverse sia in termini biochimici richiesta di un maggior apporto di nutrienti in seguito a proliferazione cellulare sia in termini di stimolazione fisica diversa sollecitazione da applicare a causa delle mutate propriet meccaniche del tessuto in crescita I vantaggi che un sistema di controllo automatizzato comporta sono molteplici Come illustrato anche in precedenza la possibilit di condurre pi prove a parit di condizioni di stimolazione una specifica fondamentale per dare consistenza e validit a una campagna sperimentale 4 Inoltre un aumento del grado di automazione del processo pu garantire un minor rischio di contaminazioni possibili durante 1 vari passaggi manuali necessari nel caso di sistemi non automatizzati e riducendo gli interventi manuali dell operatore assicura una minor variabilit intra ed inter operatore conseguenza altrimenti inevitabile in quanto non solo ogni operatore non opera allo stesso modo ma anche uno stesso operatore non pu garantire la riproducibilit esatta delle manovre tra una prova e l altra 2 4 Oltre a garantire un attuazione pi precisa ripetibile e standardizzata dei parametri di controllo un programma per il controll
75. a che la pompa deve garantire in funzione della scelta da parte dell utente di impostare la portata in RPM E in Figura 3 1 o in termini di ml min RPM Tube F in Figura 3 1 In quest ultimo caso il SubVI F che utilizza l opportuna retta di calibrazione della portata in funzione del diametro interno dello specifico sottopompa selezionato due SubVI G e H in Figura 3 1 chiamati dal Main VI solo durante le fasi di registrazione dei segnali di pressione e volume Il SubVI G dedicato alla modalit automatica di registrazione paragrafo 2 5 3 3 mentre il sottoprogramma H consente di gestire le operazioni relative alla registrazione manuale dei dati di pressione e volume paragrafo 2 5 3 3 3 1 2 1 SubVI per 1l controllo della portata della pompa I SubVI dedicati al controllo della portata della pompa sono due 1 il SubVI RPM e 11 il SubVI RPM Tube Il controllo della portata eseguito attraverso l architettura descritta qui di seguito Figura 3 3 implementata tramite un case multiplo paragrafo 3 1 1 Phase EEFI Infusion Speed W Speed ostt prererer Pere er ange rrr Ci pa ry om e a r n Fx F DBLP a ca a si ee ris RPM EH re antes Si PO rpm ml min abe 7 a pue A int mm Figura 3 3 Architettura del SW dedicata al controllo della portata della pompa Parametri di input fase della stimolazione 1 portata di infusione e aspirazione 2 portata in
76. acquisendo 1 valori di pressione dal sensore e calcolando il volume infuso in base al segnale di tensione della pompa Nel caso della cistometria pre decellularizzazione 1l monitoraggio della stimolazione tramite il SW ha inoltre permesso di valutare il range di pressioni entro cui sollecitare l organo durante il processo di decellularizzazione per mantenere la stimolazione in un range di pressioni fisiologico V lt Vo in Figura 11 Ci ha permesso di non danneggiare 1 ECM dell organo conseguenza invece possibile nelle prove di cistometria che non consentono di visualizzare la curva P V in tempo reale Il set up realizzato per la prova di cistometria stato impiegato anche per la prova di decellularizzazione Figura 13 Figura 13 Set up per la prova di cistometria e decellularizzazione di vescica Sono visibili PC con il SW di controllo pompa volumetrica sensore di pressione contenitore con la vescica reservoir con le soluzioni decellularizzanti reservoir di scarico EV Il sistema di controllo gestisce gli attuatori pompa per infondere aspirare EV per VII Sommario commutare tra 1 due rami del circuito idraulico per la decellularizzazione e acquisisce il segnale di pressione dal sensore Quindi un ulteriore vantaggio di questo sistema quello di poter integrare in un unico set up sia le prove di cistometria che quella di decellularizzazione dove la prova di cistometria pre decellularizzazione
77. all interno dell organo in tempo reale un elettrovalvola pinza tubo 075P3MP12 02S Bio ChemFluidics per canalizzare il flusso della soluzione decellularizzante nei due rami linea di infusione e linea di scarico del circuito idraulico durante il processo di decellularizzazione il circuito di alimentazione e di sincronizzazione dello switch dell elettrovalvola con 1 segnali inviati tramite SW un PC su cul viene eseguito 11 SW di controllo Lo schema del circuito idraulico del set up per la decellularizzazione mostrato in Figura 4 18 sensore di pressione vescica reservoir reservoir mandata scarico Figura 4 18 Circuito idraulico del set up per la decellularizzazione di vescica Sono visibili reservoir di mandata reservoir di scarico elettrovalvola a tre vie EV pompa sensore di pressione vescica La componente HW del sistema di controllo realizzato come anticipato nel paragrafo 2 2 3 integra anche un elettrovalvola pinza tubo a tre vie EV L EV viene utilizzata per abilitare alternativamente uno dei due rami che compongono il circuito idraulico una linea del circuito linea di infusione serve a permettere l infusione delle soluzioni decellularizzanti all interno della vescica prelevate dalla pompa dal reservoir di mandata l altro ramo linea di scarico consente invece la raccolta nel reservoir di scarico delle soluzioni aspirate sempre tramite la pompa dall interno dell org
78. an then post processed Also in the tests for the characterization of biological tissues the SW has improved the experimental set up compared to existing ones as shown in the previous section 1 Chaudhuri J and M Al Rubeai Bioreactors for Tissue Engineering Principles Design and Operation Vol VIII 2005 Springer 375 24 Plunkett N and F J O Brien Bioreactors in tissue engineering Technol Health Care 2011 19 1 p 55 69 3 Martin I D Wendt and M Heberer The role of bioreactors in tissue engineering Trends Biotechnol 2004 22 2 p 80 6 4 Wendt D et al Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing Adv Mater 2009 21 32 33 p 3352 67 Abstract IX Capitolo 1 Introduzione I Introduzione 1 1 Medicina rigenerativa La medicina rigenerativa una branca della medicina che si prefigge di essere una concreta alternativa alle tecniche di medicina tradizionale quali trattamenti chirurgici a carattere estirpativo del tessuto organo patologico trattamenti farmacologici trapianto di organi Quest ultimo nonostante sia l unico trattamento in grado di ristabilire totalmente le funzioni dell organo danneggiato presenta svariate problematiche come il rigetto e la scarsa disponibilit di organi umani a fronte di una richiesta sempre crescente La medicina rigenerativa rispetto alla tecniche tradizionali si basa su un approccio diverso ossia riparare
79. ano I due rami sono attivi a fasi alterne e ciclicamente abilitati disabilitati in accordo con l alternarsi ciclico delle fasi di infusione e di aspirazione La commutazione dell EV gestita dal SW di controllo viene effettuata in maniera sincrona con il passaggio dalla fase di infusione a quella di aspirazione Nel dettaglio quando attiva la fase di 114 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici infusione EV apre esclusivamente la linea di infusione mentre quando si invece in fase di aspirazione PEV commuta chiudendo il ramo del circuito di infusione e aprendo la linea di scarico L infusione e l aspirazione delle soluzioni decellularizzanti come detto gestita dalla pompa il quale riceve dal SW il comando di inversione del senso di rotazione dei rulli 4 5 2 Protocollo di prova Il protocollo che si dimostrato pi efficace tra quelli presi in considerazione durante le campagne sperimentali precedentemente svolte presso il uBS Lab 36 combina una decellularizzazione basata su trattamento chimico azione di rimozione cellulare per azione chimica dei detergenti con un approccio di tipo fisico realizzato tramite il continuo riempimento dell organo con gli agenti decellularizzanti e la successiva aspirazione degli agenti stessi Tale approccio ha tre obiettivi principali 1 distendere la superficie della parete della v
80. ario un aggiornamento in funzione di nuove richieste specifiche applicazioni che potrebbero emergere in futuro Ad esempio sar possibile aggiungere eliminare modificare un singolo SubVI senza dover rivedere l architettura generale dell intero SW In questo programma sono presenti otto SubVI livello 2 di Figura 3 1 di seguito descritti due SubVI A e B in Figura 3 1 sono stati costruiti per svolgere specifiche operazioni all interno del ciclo di acquisizione del segnale di pressione 1B in Figura 3 2 quali l abilitazione dei canali di acquisizione della scheda NI DAQ A di Figura 3 1 e la calibrazione del sensore di pressione Cal Data Proc B di Figura 3 1 quattro SubVI indicati con C D E e F in Figura 3 2 gestiscono invece operazioni relative al ciclo di controllo 1A in Figura 3 2 Attraverso questi SubVI possibile gestire 1 segnali che il SW invia per il controllo della pompa Nel dettaglio il SubVI Start Stop C di Figura 3 1 gestisce l invio del segnale di avvio e arresto della pompa Allo stesso 66 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo modo il SubVI Direction Pump D di Figura 3 1 consente di modificare la direzione di moto dei rulli della pompa orario o antiorario e quindi la direzione del flusso del fluido all interno del circuito idraulico del setup sperimentale I SubVI E e F sono invece adibiti al controllo della velocit di rotazione dei rulli della pompa ossia della portat
81. ata Tube Size Flow Rate Table di Figura 2 10 Questo permette all utente di capire che tubo deve usare per ottenere il valore di portata desiderato Vi poi uno strumento di conversione vero e proprio che permette di convertire il valore di RPM in ml min e viceversa La conversione permette di capire che valore di RPM sla necessario usare per ottenere la portata in ml min desiderata Se la portata impostata richiede un numero di giri superiore al 100 o inferiore allo 0 il software segnala la necessit di cambiare sottopompa o ridurre la portata impostata 2 5 2 Il pannello Acquisition Il secondo pannello dell interfaccia utente dedicato all acquisizione del segnale di pressione Figura 2 11 Setti gs Acquistion c ntrol Pump Post Processing Advanced Settings 2 Values in Clear Chart Figura 2 11 Pannello di acquisizione riquadro verde attivazione canali di acquisizione della scheda NI DAQ riquadro giallo area di calibrazione del sensore di pressione riquadro azzurro grafico dell andamento del segnale di pressione acquisito riquadro arancione strumenti associati al grafico La parte del SW dedicata all acquisizione del segnale di pressione basata su un VI preesistente nel laboratorio uBS Lab Si provveduto ad integrarlo nel SW realizzato e ad adattarlo alle nuove esigenze In questo pannello l utente pu scegliere quali canali di input vuole visualizzare 11 SW permette di acquisire
82. ativo Curva cistometrica della vescica nativa Regione 1 Regione 2 Regione 3 Pressione a N Volume Figura 11 Curva P V di una vescica nativa sono evidenziate le tre regioni caratteristiche della curva in funzione di due specifici valori di volume intravescicale Vj e V2 I valori di volume Vj e V gt identificano tre regioni di comportamento della vescica nativa in particolare V2 identifica il valore di volume oltre il quale l organo sottoposto a una sollecitazione non fisiologica regione di overstretching Dal confronto tra la curva cistometrica della vescica nativa e decellularizzata Figura 12 si potuto osservare come vi sia un comportamento diverso tra l organo nativo e decellularizzato nel secondo caso l organo risponde a un incremento di volume infuso con un significativo incremento di pressione solo dopo un valore di volume infuso Vi post molto superiore a quello necessario all organo nativo V1 pre Confronto Cistometria pre e post decellularizzazione Campione 2 V l l posi Cisto Post a Cisto Pre Pressione mmHg ca 0 2 4 6 8 10 12 Volume ml Figura 12 Confronto tra la curva P V dell organo nativo Cisto Pre e dell organo decellularizzato Cisto Post Sono indicati i valori di V pre V1 post Le prove sono state effettuate utilizzando 1l SW sviluppato che ha permesso di osservare in tempo reale le curve P V costruite
83. ato in Figura 4 11 Si possono infatti distinguere le tre regioni delimitate dai valori di Vipre Vapre L organo quindi risponde inizialmente V lt Vipre con un rapido seppur limitato incremento di pressione a fronte dell iniziale infusione di volume Segue poi una fase Vipre lt V lt Vapre in cui ad un sostanziale incremento di volume corrisponde un incremento di pressione molto limitato range fisiologico dell organo L ultima regione che si pu evidenziare V gt Vapre in accordo con la Figura 4 15 caratterizzata da un repentino incremento di pressione a seguito di un ridotto incremento di volume che come detto fa riferimento ad una condizione non fisiologica Analizzando ora la curva dell organo decellularizzato si osserva come il valore di Vj post 6 5 ml sia maggiore rispetto il valore di V pre 0 2 ml di circa un fattore 30 Infatti fino al valore di Vi post VI una regione in cui la vescica risponde ad elevati volumi infusi con un incremento di 109 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici pressione sostanzialmente nullo Questo fenomeno dovuto al processo di decellularizzazione che oltre ad eliminare la componente cellulare provoca una modificazione parziale nell organizzazione e nella distribuzione delle proteine strutturali di membrana principalmente collagene Va per osservato come oltre il valore
84. ato scelto questo modello di pompa principalmente per due motivi permette di impostare un ampio range di portate in tal modo pu essere impiegata in diverse applicazioni che richiedono sia portate molto basse ul min sia portate relativamente elevate ml min consente ll controllo remoto con PC tramite interfaccia seriale RS232 o analogica porta a 15 PIN Figura 2 2 Il controllo remoto della pompa ovviamente un requisito imprescindibile per realizzare il sistema di controllo via software Figura 2 2 Particolare della parte posteriore della pompa porta seriale riquadro azzurro e porta analogica riquadro giallo 2 2 1 1 Controllo remoto interfaccia pompa PC Per poter agire direttamente sui parametri di controllo della pompa ovvero sul valore di tensione del motore si scelto di comandare la pompa tramite interfaccia analogica Questi parametri sono di seguito elencati 32 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo start stop tramite questo parametro possibile avviare o arrestare la pompa direzione consente di selezionare il verso di rotazione dei rulli orario antiorario e quindi la direzione del moto del fluido portata impostata parametro che va ad agire sulla velocita di rotazione dei rulli della pompa e quindi in ultima analisi sul volume di fluido erogato in un determinato intervallo temporale Nel presente lavoro di tesi ci si occupati della realizzaz
85. atore impiegato nel progetto una pompa volumetrica multicanale Ismatec IPC N 12 in grado di garantire portate comprese tra 0 39 ul min e 11 ml min Inoltre la pompa dotata di una porta analogica che ne permette il controllo via SW tramite scheda di acquisizione dati DAQ USB 6211 National Instruments I parametri di controllo della pompa su cui si pu agire sono 1 l avvio e l arresto della pompa Start Stop 11 il verso di rotazione dei rulli orario antiorario 111 la portata che la pompa deve garantire proporzionale alla velocit di rotazione dei rulli Tramite quindi 1 canali di ingresso e uscita I O digitali e analogici della scheda NI DAQ e il cablaggio realizzato s1 potuto gestire questi comandi via SW In Figura 2 riportato lo schema di connessione pompa scheda NI DAQ INTERNAL SPEED Pompa Ismatec IPC N SPEED Figura 2 Schema della connessione pompa scheda NI DAQ II Sommario Sensore di pressione Il sensore di pressione stato integrato nel sistema di controllo per monitorare l andamento della pressione che agisce sui campioni di tessuto o sugli organi stimolati in tempo reale I sensori utilizzati in questo progetto Honeywell 26PCA e Pendotech Press S 000 sono stati interfacciati con 1l PC tramite un canale di input analogico della scheda NI DAQ per poter acquisire il segnale di pressione Inoltre si riusciti ad alimentare il sensore Honeywell tramite un ca
86. azione paragrafo 2 5 3 1 2 Il grafico del ciclo di stimolazione dipende dallo specifico pattern di stimolazione selezionato dalla durata e dalle portate delle varie fasi assegnate dall utente In funzione di queste impostazioni il grafico mostra all utente il ciclo di stimolazione risultante Anche questo ciclo parallelo al ciclo Main principale in quanto come per 1l ciclo delle propriet Property Node non richiede di essere eseguito ad intervalli di tempo molto brevi come per il ciclo precedente viene eseguito ogni 200 ms 3 1 1 4 Ciclo del grafico pressione volume Il ciclo dedicato alla costruzione del grafico che mostra l andamento della pressione rispetto al volume 4 in Figura 3 2 utilizza in tempo reale 11 valore della pressione acquisito dal sensore Acquisition Cycle in Figura 3 2 e del volume processato infuso aspirato dalla pompa Control Cycle in Figura 3 2 per costruire il grafico della pressione rispetto al volume Come per 1 due cicli sopra descritti parallelo al ciclo Main principale ed eseguito ogni 200 ms 65 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 3 1 1 5 Ciclo di Post Processing Il ciclo di Post Processing 5 in Figura 3 2 adibito alle funzioni di post elaborazione da parte dell utente dei dati registrati durante la stimolazione Queste funzioni non sono quindi integrate nel ciclo Main ma poste in un ciclo parallelo cos da non dover allocare nel ciclo Main le risor
87. azione riquadro verde di Figura 2 13 l area di monitoraggio della stimolazione riquadro viola di Figura 2 13 e l area accessoria riquadro giallo di Figura 2 13 Settings Acquistion Control Pump P Processing Advanced Settings Pressure Limitation Stimulation Pattern Infusion Volume per Cycle Withdraw Volume per Cycle EMERGENCY ONLY or Infusion Withdraw Rest RA e fa ml 0 0067 mi l Pressure Record Volume Record i T Wi fusi Withdra d Operation Mode T Infusion ithdraw Infusion Speed w Spee Auto Rec Manual Rec 7 00 00 05 9 00 00 05 0 376 0 376 wi e T Rest Pattern Time 0 3 oe nee guasta STOP START 00 00 03 1 00 00 13 0 2 ie to Wait s Rec Time Alarm s ha b Volume a Session Time Cycles 5 pi xen T Auto Rec s REC Time a og oe ee o 00 00 00 00 00 0300 00 06 00 00 0900 00 12 00 00 15 In _00 00 00 Q O Ji Time hh mm ss ma v t EJ Compliance Volume Autoscale co Clear Chart Pressure al i 0 0028 mimm a 0 0016 m 0 02 9 Pressure mmHg 0 15 0 0 25 50 15 10 0 125 150 175 200 225 250 ohare m Time hh mm ss Figura 2 13 Pannello di controllo Riquadro verde area di stimolazione riquadro viola area di monitoraggio della stimolazione riquadro giallo area accessoria 49 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 5 3 1 Area di stimolazione In quest area del pannello riquadro verde di Fig
88. biettivo di garantire un controllo sullo stato della stimolazione che prevenga situazioni indesiderate sono stati integrati nel SW diversi controlli di sicurezza ad esempio la soglia massima sul valore di pressione Nel caso in cui il SW rilevi il superamento del valore soglia determinato dall utente provoca l immediato arresto della pompa e quindi della stimolazione per evitare di danneggiare il campione biologico ed abilita l invio di un messaggio di alert sulla finestra di interfaccia utente Ulteriore specifica del SW sviluppato la possibilit di registrare 1 parametri della stimolazione pressione e volume cos che l utente possa elaborarli in un secondo momento al termine della stimolazione Il SW mette a disposizione due modalit di registrazione 1 la modalit manuale In cul 1 dati vengono registrati in funzione dei comandi abilitati dall utente tramite interfaccia grafica e 11 la modalit automatica in cui l utente Imposta l intervallo di tempo per cui vuole registrare 1 dati di interesse che vengono poi registrati ciclicamente in maniera automatica dal SW e salvati su un file di teso Nel file di testo ciascun blocco di dati registrato preceduto da 126 Capitolo 5 Conclusioni e sviluppi futuri un intestazione che riportata tutte le informazioni che consentono all utente di risalire alla specifica fase della stimolazione a cui 1 dati registrati fanno riferimento Il SW mette a disposizione dell ute
89. calcolato il valore di C per due diverse portate di infusione fornite dalla pompa volumetrica per Q 0 02 ml min la C pari a 0 03116 0 0045 mmHg mentre per Q 0 04 ml min pari a 0 0301 0 0006 mmHg I valori di C trovati sono confrontabili con 1 valori calcolati in un precedente lavoro svolto presso 11 uBS Lab 5 C 0 0522 0 0122 mmHg Il set up e il sistema di controllo sviluppati hanno permesso di migliorare le condizioni di prova del precedente lavoro dove gli incrementi di pressione sono imposti manualmente tramite sfigomanometro e il valore del volume di liquido sequestrato dal vaso letto su carta millimetrata Il sistema sviluppato ha permesso quindi di rendere la prova pi automatizzata e ridurre 1 tempi per la valutazione della compliance del vaso Inoltre consente di misurare 1 valori di P e V in modo pi accurato rispetto al protocollo precedente in quanto la misura non affetta dall incertezza e dalla variabilit che l intervento manuale dell operatore pu comportare Il secondo set up in cui stato applicato 1l sistema di controllo indirizzato alla caratterizzazione delle propriet di distensibilit della vescica decellularizzata e alla decellularizzazione dell organo stesso Tramite il SW di controllo sono state eseguite prove di cistometria sull organo pre e post decellularizzazione In Figura 11 VII Sommario riportato un esempio di curva cistometrica di organo n
90. capire pi facilmente l eventuale causa del fallimento di una coltura o identificare gli eventi temporali a cui si riferiscono determinati eventi 3 4 Il presente progetto di tesi s1 concentrato sulla realizzazione di un sistema di controllo per bioreattori a perfusione Ulteriore specifica del progetto era di rendere il sistema di controllo il pi versatile possibile ossia capace di adattarsi a differenti applicazioni differenti camere di coltura differenti regimi stazionari differenti tipi di tessuti 1 4 Bioreattori nell ingegneria dei tessuti Il bioreattore uno strumento che deve adattarsi allo specifico contesto in cui viene applicato fornendo di volta in volta funzionalit e caratteristiche diverse pur mantenendo alcune specifiche di base Di seguito sono elencate alcune tra le pi significative specifiche Quando si progetta un bioreattore quindi bisogna fare in modo che quest ultimo sia in grado di 7 assicurare condizioni sterili dei campioni coltivati garantire che 1 materiali con 1 quali costruito il bioreattore siano biocompatibili ed adatti all interazione con costrutti cellularizzati mantenere il campione di tessuto in coltura sotto condizioni fisiologiche garantire un flusso di medium adeguato sia in condizioni stazionarie sia per stimoli ciclici per esempio pulsatili garantire il corretto apporto di nutrienti e l eliminazione dei metaboliti 18 Capitolo 1 Introduzione
91. comando per il refresh della finestra del grafico Clear Chart di Figura 2 12 uno per abilitare l autoscale dell asse delle ordinate cos che si autoimposti a seconda del range di valori visualizzato L asse delle ascisse pu inoltre essere impostato per visualizzare il tempo o il numero di campioni acquisiti nel tempo in funzione della frequenza di acquisizione impostata nel pannello 5 Figura 2 12 per entrambe le configurazioni possibile scegliere rispettivamente la finestra temporale o il numero di campioni visualizzati Vi anche la possibilit di attivare un filtraggio del segnale visualizzato tramite un filtro Figura 2 12 passa basso con una frequenza di taglio impostabile dall utente al fine di ridurre il rumore elettrico che sporca il segnale che si vuole acquisire Questo filtro agisce solo sulla rappresentazione grafica del segnale e non sui dati acquisiti Infine nel grafico del pannello di Figura 2 11 possibile scegliere se visualizzare 11 valore del sensore in Volt tensione o in una unit di misura della pressione tipicamente in mmHg nel caso di applicazioni biomediche 2 5 3 Il pannello Control Pump Questo pannello pu essere visto come il cuore di tutto il programma Qui sono concentrati 1 controlli sui parametri della stimolazione che si vuole applicare e 1 grafici che mostrano l andamento delle variabili di input e di output della stessa Dividiamo quindi questo pannello in tre macro aree l area di stimol
92. combinanti da impiegare poi in altri processi industriali 1 Sono anche utilizzati per applicazioni ancor pi distanti dalla medicina rigenerativa come 1l trattamento delle acque reflue per la loro purificazione o processi alimentari di varia natura come la fermentazione controllata 2 3 Bioreattore Ambiente di coltura Sistema di controllo Mezzo di coltura Costrutti Cellule Scaffold seni Operatore Figura 1 2 Schema a blocchi di un bioreattore 14 Capitolo 1 Introduzione 1 2 Il bioreattore Poich il presente lavoro di tesi incentrato sulla realizzazione di un sistema di controllo per bioreattori andiamo ora ad analizzare pi nel dettaglio la caratteristiche le specifiche e la applicazioni di questo elemento L introduzione dei bioreattori nell ingegneria dei tessuti ha permesso di migliorare 1 risultati che si erano fino a quel momento ottenuti ed ha quindi dato un significativo contributo a questo campo di ricerca Prima della loro introduzione infatti la comunit scientifica si era focalizzata principalmente sulla realizzazione di tessuti monostrato in vitro come ad esempio il tessuto epiteliale o il tessuto cartilagineo utilizzando una piastra Petri come camera di coltura 4 Non appena si cercato di ricreare tessuti di maggior spessore o formati da pi linee cellulari ci si scontrati con difficolt come il non adeguato trasporto di massa ovvero di apporto di ossigeno e di nutrienti e
93. composed of a culture chamber where is housed the scaffold seeded with cells The control system is composed by the actuators and sensors and by a software that sends and receives signals from them The control system therefore allows to monitor and act on one or more of the environmental variables pH temperature oxygenation metabolic activity of cells that characterize the biological processes taking place within the culture chamber Moreover the control system manage the physical variables such as mechanical stress electrical stimulation and magnetic if the bioreactor applies a stimulation on the construct 1 Bioreattore Ambiente di coltura Sistema di controllo Mezzo di coltura Costrutti Cellule Scaffold EEES Figure 14 Bioreactor block diagram The realization of bioreactor s control system is necessary to monitoring the culture parameters of interest and to control the stimuli that the bioreactor applies to the construct 1 In addition the control system can achieve high levels of automation and standardization of processes making them repeatable This is a prerequisite if you want to make tissue engineering a real alternative to traditional therapies 2 3 The objective of the present thesis work carried out at the uBS Lab of DEIB of the Polytechnic of Milan is the development of a system for the monitoring and the control of devices that applies a mechanical stress Abstract
94. configurazione il magnete dell elettrovalvola non essendo alimentato non commuta In Figura 2 8 mostrato HW impiegato e sviluppato nel presente lavoro di tesi cablaggio scheda NI DAQ pompa DAQ alimentatore integrato circuito EV EV sensore di SY amplificazione d i sensore E Figura 2 8 Panoramica del HW impiegato e o sviluppato pompa scheda NI DAQ cablaggio pompa NI DAQ sensore di pressione circuito amplificazione del segnale del sensore di pressione cablaggio sensore NI DAQ elettrovalvola EV circuito di controllo dell EV alimentatore integrato per PEV e per il sensore di pressione Pendotech 40 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 3 Il software del sistema di controllo Completata la descrizione della parte HW del sistema di controllo passiamo ora alla descrizione della parte SW AI fine di una corretta progettazione e implementazione di un SW bene seguire alcuni passaggi fondamentali 1 il 1il IV la definizione delle specifiche di progetto questa fase di fondamentale importanza per definire il campo di applicazione del programma 1 requisiti che esso deve soddisfare le funzionalit che deve offrire e l utenza al quale rivolto lo sviluppo del SW in questa fase si procede alla realizzazione del programma attenendosi alle specifiche definite precedentemente la verifica di funzionamento del SW questo stadio dello svilup
95. del sistema di controllo Il riquadro azzurro di Figura 2 21 invece evidenzia il controllo che permette di impostare la tensione di alimentazione del sensore di pressione 10 V nel caso si impieghi il sensore 26PCA della Honeywell Figura 2 21 Questo controllo va ad agire quindi su un canale di output analogico AO 1 della scheda NI DAQ dedicato all alimentazione del sensore In questo capitolo si descritto il sistema di controllo realizzato dal punto di vista del HW e dell interfaccia utente del SW Nel capitolo 3 andremo a descrivere nel dettaglio l architettura del SW e le logiche di programmazione su cui basato 60 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 3 1 Architettura del software Nel capitolo precedente sono state presentate e descritte le componenti che costituiscono il sistema di controllo sviluppato e le funzionalit che il software SW di controllo mette a disposizione dell utente In questo capitolo saranno descritte nel dettaglio le specifiche soluzioni progettuali che hanno portato alla realizzazione delle varie funzionalit della parte SW sviluppata in ambiente LabVIEW National Instruments Al fine di rispettare la specifica di modularit paragrafo 2 3 il SW stato progettato e realizzato secondo una scala gerarchica comprendente due diversi livelli nel primo livello presente 11 VI principale che consente di
96. dere con un incremento di pressione significativo V gt Vi post in Figura 4 16 Anche in questo caso il campione 2 ha raggiunto il valore di pressione massima a cui stato sollecitato in questa prova Pmax pari a 9 mmHg in sia prima che dopo il processo di decellularizzazione stato calcolato il valore di compliance dell organo nativo e decellularizzato sempre nel tratto di curva successivo al valore di Vj rette in Figura 4 16 stimando per l organo nativo un valore di C di 2 35 ml mmHg e per la vescica decellularizzata di 1 26 ml mmHg La vescica decellularizzata mostra quindi un valore di compliance diminuito di un fattore 1 9 rispetto all organo nativo Le prove di cistometria su vescica sono state condotte avvalendosi del SW del sistema di controllo realizzato ed in particolare sfruttando la modalit manuale in controllo di volume Monitorando 1 pannelli grafici che mostrano l andamento del volume infuso e della pressione intravescicale e soprattutto grazie al grafico integrato della pressione in funzione del volume l utente riesce a sollecitare l organo entro il suo range fisiologico durante la cistometria fermando quindi la prova non appena si supera il valore di V2 In questo modo non si rischia di danneggia ECM dell organo prima della decellularizzazione conseguenza invece possibile nelle prove di cistometria che non consentono di visualizzare la curva P V in tempo reale Sempre grazie l integrazione nel SW di con
97. di coltura consenta di coltivare e sollecitare il costrutto avvicinandosi il pi possibile alle condizioni fisiologiche Inoltre permette di rendere ripetibili le condizioni tra diverse prove e consente di monitorare 1 parametri della coltura 1 4 9 Bioreattore per la caratterizzazione meccanica di tessuti I bioreattori non sono solo pensati per rigenerare porzioni di tessuto o organi interni ma hanno anche altre funzioni Sono impiegati ad esempio per valutare le propriet meccaniche dei costrutti alloggiati al loro interno Nel lavoro presentato da Schipke et al 18 s1 sviluppato un bioreattore per la sollecitazione ciclica della valvola aortica Questo sistema permette di sottoporre il campione a diversi cicli di sollecitazione variando l intensit e la frequenza dei cicli di pressione applicati andando ad agire su di una pompa che regola il flusso nel circuito Grazie a un software sviluppato in ambiente LabVIEW l utente pu quindi sottoporre la valvola a cicli di sollecitazione simulando la condizione fisiologica o svariate condizioni patologiche Ci permette ai ricercatori di comprendere meglio come la valvola reagisca a diversi gradienti di pressione 1 4 10 Set up per la decellularizzazione di tessuti Come illustrato nel paragrafo 1 1 1 le matrici decellularizzate di organi sono considerate delle ottime alternative agli scaffold tradizionali sintetici Per ottenere questo tipo di supporti l organo o il tessuto da dec
98. di Vipos il campione decellularizzato risponda a successivi incrementi di volume con un effettivo incremento di pressione In particolare si pu osservare come l organo post decellularizzazione sia in grado di raggiungere un valore di pressione Pmax post In Figura 4 15 pari a circa 4 mmHg equivalente a quello registrato per il campione nativo Dall analisi della curva P V in Figura 4 15 possibile stimare il valore della compliance C dell organo pre e post decellularizzazione stata calcolata la compliance nel tratto di curva successivo al valore V sia per la curva pre decellularizzazione che post decellularizzazione Tale valore equivale all inverso della pendenza del tratto lineare della curva P V successivo al valore V rette in Figura 4 15 come descritto nell Eq 1 del paragrafo 4 2 1 Si quindi osservato che la vescica nativa caratterizzata da un valore di C pari a circa 8 69 ml mmHg mentre l organo decellularizzato presenta un valore di C pari a circa 5 25 ml mmHg che si traduce quindi in una diminuzione del valore di C di un fattore 1 7 rispetto all organo nativo Quinidi nonostante l organo decellularizzato sia ancora in grado di rispondere con un incremento di pressione intravescicale paragonabile al caso dell organo nativo Pmax comparabile in risposta ad un riempimento le sue propriet meccaniche sono state seppur in maniera contenuta alterate dall azione degli agenti decellularizzanti Vj e C dif
99. di arrestare la pompa nel caso in cui la fase successiva sia quella di Rest pompa ferma Questo confronto viene eseguito in maniera iterativa per tutta la durata della stimolazione con una temporizzazione pari a 20ms In questa modalit quindi il passaggio da una fase ad un altra del pattern governato dalla variabile tempo ovvero dalla durata di ciascuna fase Inoltre impostando la durata e la portata delle singole fasi l utente definisce 11 valore del volume che verr infuso e aspirato ad ogni ciclo Il passo successivo stato quindi quello di creare un blocco che consentisse di monitorare 1l volume effettivamente erogato dalla pompa nel tempo e di inserire una finestra grafica nell interfaccia utente che ne consentisse la visualizzazione in tempo reale L architettura di questo blocco mostrata in Figura 3 5 3rpm mi minc STES Tube int mm E Graph V t PA TETE yPL Is dt Vp else if s 0 yPL Vp else Phase Ga PL Ws dit Vp ___ Volume y p o i 6 Real Time STOP START A diri Acquistion Mode 132 KR Channel Speed Out A Volt Speed Out allo Figura 3 5 Architettura del ciclo dedicato al monitoraggio del volume erogato dalla pompa Si distinguono ciclo di controllo A ciclo di acquisizione B tensione erogata dal motore della pompa ed acquisita dal SW 1 memorizzata in una variabile locale 2 portata espressa in RPM o ml min 3 diame
100. e Rest Aspirazione Per ogni singola fase del pattern di stimolazione l utente ne imposta la durata blocco B in basso di Figura 2 15 e per le fasi d infusione e aspirazione la portata blocco C in alto di Figura 2 15 nell esempio di Figura 2 15 pari a Pattern infusione rest aspirazione tempi fasi 5 minuti infusione 3 minuti aspirazione 2 minuti rest portate 0 3 ml min infusione 0 2 ml min aspirazione Il SW poi calcola partendo da questi dati 11 volume in ml che sar infuso e aspirato in ogni ciclo Inoltre nella finestra grafica mostrata nel blocco D di Figura 2 15 viene visualizzata la stimolazione che si impostata tenendo conto del pattern e delle durate e delle portate di ciascuna fase L utente cos in grado immediatamente di accorgersi se ha costruito ad esempio un ciclo simmetrico o un ciclo dove 11 volume di infusione maggiore di quello di aspirazione Inoltre una volta avviata la prova un cursore sul grafico fa vedere in tempo reale in che fase della stimolazione ci si trova Oltre all indicazione sul tempo trascorso session time e la fase attiva tre led luminosi in questa modalit attivo anche un contatore che segnala il numero di cicli di stimolazione eseguiti fino a quel momento blocco E di Figura 2 15 Questa modalit permette quindi un controllo in volume automatico della stimolazione impostata dall utente 11 SW determina il passaggio da una fase alla successiva in funzione del
101. e vescica 108 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici 4 4 2 Risultati sperimentali La prova di cistometria stata eseguita sia prima vescica nativa Cisto Pre che dopo vescica decellularizzata Cisto Post il processo di decellularizzazione dell organo in modo da valutare le eventuali variazioni delle propriet meccaniche e in particolare del valore di compliance dell organo I risultati ottenuti dalle prove di cistometria effettuate sui due organi vengono analizzati separatamente Campione 1 Campione 2 Campione 1 Le curve di cistometria del campione 1 sono riportate in Figura 4 15 Confronto Cistometria pre e post decellularizzazione Campione 1 4 2 Pmax pre gt Pmax post gt 3 25 sO 1 5 Vi post 1C isto Pre l Cisto Post r 2 0 5 Volume ml Figura 4 15 Confronto tra la curva P V caratteristica dell organo nativo Cisto Pre e dell organo decellularizzato Cisto Post per il campione 1 Sono indicati i valori di Vj pres V2 pres Vi post Pmax pres Pmax post le rette che approssimano la zona lineare della curva P V in cui stata calcolata la C Analizzando la curva si osserva innanzitutto come la curva P V subisca delle notevoli modificazioni a valle del trattamento di decellularizzazione L organo nativo Cisto Pre ha un comportamento simile a quello riport
102. e EV requires a power too high to be managed directly by the channels of I O of the NI DAQ card The SW sends a signal that can assume a high value 5 V or low 0 V TTL to a BJT transistor bringing it respectively in a state of interdiction or saturation Depending on the state of the BJT closes or opens the supply circuit of the relay connected to it The relay then switches the state of its internal coil or not allowing the passage of the EV supply voltage EV depending on Abstract which receives its supply voltage or less switches in one state or another IV Bas rare tensione on 1 5V off 0 0V Segnale PC ru ERMINI B Figure 16 Diagram of the control circuit of the EV Control SW specific The control SW is been developed in LabVIEW 8 6 The design specifications that the SW must respect are 1 controlling the actuators that apply stimulation to tissue or organ 11 acquire the pressure signal from the pressure sensor 111 control the output parameters of the stimulation pressure se parameters of stimulation within a preset volume in order to maintain the range iv show in real time the parameters of stimulation v record the values of the parameters of stimulation in order to allow data s post processing vi have user friendly interface also for non expert users vii have characteristics of modularity to make it simple integrate new features without changing the general structure of
103. e al fine di verificare che 11 SW garantisse che il volume infuso aspirato dalla pompa fosse effettivamente pari al valore settato dall utente e che ci fosse la ripetibilita tra 11 volume infuso aspirato tra un ciclo e il successivo 71 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 3 2 2 1 Test di collaudo del volume erogato nella modalit automatica di controllo in volume Il collaudo stato effettuato attraverso alcune prove preliminari lanciando l esecuzione del SW collegato alla pompa e registrando 1 dati visualizzati nella finestra grafica volume tempo In questa prova non stato impiegato alcun circuito idraulico in quanto l obiettivo della prova valutare il volume infuso aspirato in termini del calcolo del volume da parte del SW sulla base del segnale di tensione acquisito dalla pompa Il set up sperimentale quindi costituito dalla pompa interfacciata tramite la scheda NI DAQ con 11 SW di controllo Sono stati valutati due diversi pattern di stimolazione A Infusion Withdraw Rest IWR e B Infusion Rest Withdraw IRW In entrambi 1 casi si costruito un ciclo simmetrico ovvero sono stati IMpostati portata e durata di infusione pari alla portata e alla durata di aspirazione cos da ottenere un volume infuso complessivo pari a zero al termine di ciascun ciclo Il tracciato dell andamento del volume nel tempo registrato durante 1 test riportato in Figura 3 6 IWR A 0 003 __ 0 002 E
104. e applicazioni previste nell ambito del presente lavoro di tesi Al termine delle prove di collaudo si verificato come il SW sia in grado di eseguire le operazioni richieste in tutte le modalit di controllo messe a disposizione del utente Nel capitolo 4 si mostrer come il sistema di controllo realizzato stato integrato in diversi set up per la caratterizzazione biomeccanica di tessuti biologici In particolare si andranno ad analizzare 1 risultati sia dal punto di vista dei parametri biomeccanici valutati sia dal punto di vista dei vantaggi o svantaggio che l integrazione del sistema di controllo ha portato 87 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici 4 Monitoraggio e controllo di parametri di stimolazione di organi e tessuti biologici 4 1 Applicazione del sistema di controllo in esperimenti con campioni biologici AI termine delle prove di collaudo descritte nel capitolo 3 effettuate per verificare il corretto funzionamento del sistema di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi si poi proceduto al suo effettivo utilizzo integrando il sistema di controllo con 4 diversi set up sperimentali che prevedono la sollecitazione con fluido in pressione di tessuti e di organi biologici I set up sperimentali sono stati precedentemente sviluppati da ricercatori del uBS Lab nell ambito di differenti progetti di ricerca ad
105. e appositi blocchi definiti structure All interno di tali structure lo sviluppatore del SW crea le connessioni logiche tra 1 vari elementi che determinano l esecuzione delle operazioni da cui dipende il flusso di dati del programma Si illustrano di seguito le tipologie di cicli impiegati nello sviluppo di questo SW ciclo while le operazioni in esso contenute vengono eseguite in maniera iterativa ed eventualmente temporizzata finch il flusso di dati o un comando esterno da parte dell utente non determina una variazione del valore assunto dalla variabile di controllo del ciclo La variabile di controllo di tipo booleano ossia pu assumere 1 valori vero falso rappresentato da un rettangolo dagli angoli smussati W in Figura 3 2 case true false la variabile di controllo del case di tipo booleano In base al valore corrente della variabile di controllo vengono eseguite una sola volta le operazioni contenute nella finestra del case corrispondente vero o falso Come per il ciclo while il flusso logico dei dati o un comando dell utente attraverso l interfaccia utente del SW a determinare il valore assunto dalla variabile di controllo rappresentato da un rettangolo bianco e nero dove la variabile di controllo indicata da un rettangolo verde T F in Figura 3 2 case multiplo la variabile di controllo del case pu essere di tipo numerico 1 2 3 o una stringa di caratteri infusion withdraw re
106. e diverse curve visualizzate volume tempo pressione tempo pressione volume e le proprieta degli assi del grafico ampiezza della finestra temporale autoscale del segnale in ordinata ecc Inoltre i Property Node gestiscono l attivazione o la disattivazione di alcuni controlli ed indicatori in base al valore associato al Property Node corrispondente ad esempio se l utente ha sceltodi lavorare in modalit di controllo in volume in modalit manuale paragrafo 2 5 3 1 1 1 Property Node disabilitano tutti 1 controlli dell interfaccia utente che appartengono alle altre modalit di controllo controllo in volume ed limitazione in pressione in modalit automatica Questo ciclo stato posto in un ciclo parallelo rispetto al ciclo Main principale in quanto le operazioni in esso contenute non necessitano di essere eseguite con la medesima temporizzazione delle operazioni eseguite nel ciclo Main la sua differente temporizzazione fa quindi si che questo ciclo venga eseguito ogni 200 ms la scelta di questo valore sar discussa nel paragrafo 3 3 3 1 1 3 Ciclo del grafico pattern di stimolazione Il ciclo denominato Volume Cycle 3 in Figura 3 2 riservato alla costruzione del grafico che rappresenta il pattern di stimolazione definito dall utente In particolare il grafico mostra il volume infuso aspirato dalla pompa in funzione della durata del singolo ciclo di stimolazione ovvero la durata complessiva delle varie fasi della stimol
107. e il pattern di stimolazione di un patch di lattice alloggiato in camera di perfusione sviluppato in un precedente lavoro di tesi entro un range di pressioni imposto 0 40 mmHg Il pattern di stimolazione impostato per questo collaudo prevede un ciclo IWR con portate di 5 ul min e 50 ul min rispettivamente per la fase di infusione e aspirazione In Figura 9 si mostra il tracciato della pressione rispetto al tempo della prova Cicli 1 3 Cicli 55 58 Cicli 125 128 3 i t da Pressure mmHg pd bSA 5 4 a H_ 00 16 05 00 05 16 11 00 11 16 Tempo hh mm Figura 9 Tracciato delle curve di pressione rispetto al tempo in modalita automatica in limitazione di pressione ricavate dalla prova di collaudo del SW con il bioreattore a perfusione e il patch di lattice Le prove di collaudo eseguite hanno consentito di verificare il corretto funzionamento delle modalit di controllo del SW realizzato messe a disposizione dell utente Monitoraggio e controllo di parametri di stimolazione di organi e tessuti biologici AI termine delle prove di collaudo si poi proceduto all effettivo utilizzo del sistema di controllo sviluppato impiegando il sistema per condurre 4 diverse prove sperimentali che prevedono la stimolazione con fluido in pressione di tessuti o di organi 1 caratterizzazione delle propriet di distensibilit compliance di campioni di vena safena umana 2 misura della permeabi
108. e impostata imponendo o il numero di giri dei rulli della pompa RPM o il valore in ml min il valore di portata impostato tramite un opportuna conversione gestita dal controllore interno alla pompa si traduce in un segnale di tensione ad essa proporzionale che va ad agire sul motore della pompa in funzione del valore di tensione il motore della pompa mette in rotazione un albero ad esso collegato al quale sono connessi gli otto rulli che vanno a comprimere il sottopompa alloggiato nell apposita sede 31 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo in entrambe le modalit di impostazione della portata RPM o ml min il valore impostato si traduce in una velocit di rotazione dei rulli della pompa nel caso si decida di impostare la portata in ml min necessario definire tramite il men della pompa il diametro interno del sottopompa utilizzato questo passaggio consente alla pompa di calibrare correttamente il valore di volume erogato per ciascun sottopompa disponibile Solitamente si preferisce comandare la velocit di rotazione dei rulli della pompa impostando una portata in ml min anzich in RPM poich ci risulta spesso pi intuitivo Nel proseguo del capitolo quando si far riferimento al parametro della velocit di rotazione dei rulli della pompa esso verr identificato con il nome di portata impostata cos da etichettare in modo univoco e intuitivo questo parametro E st
109. e messo in movimento il medium attorno allo scaffold Il moto convettivo del fluido che si genera favorisce il trasporto di massa di ossigeno e metaboliti e la rimozione di cataboliti 2 Questo tipo di bioreattori presenta molte limitazioni le cellule che sono penetrate pi in profondit nello scaffold non ricevono sufficiente apporto di nutrienti e ossigeno e quindi o vanno incontro ad apoptosi o migrano verso la superficie dello scaffold Inoltre non possibile applicare stimoli di tipo meccanico o elettrico se non lo sforzo di taglio sulle pareti dello scaffold generato dal moto del medium Le applicazioni sono quindi molto limitate 2 Questo tipo di bioreattori solitamente non associato ad un sistema di controllo 19 Capitolo 1 Introduzione 3 neck flask gt needle scaffold cell suspension magnetic bar Figura 1 4 Esempio schematico di bioreattore spinner flask 1 4 2 Bioreattore a pareti rotanti Questo tipo di bioreattori pu essere visto come l opposto dei bioreattori spinner flask In questa tipologia di bioreattore infatti il costrutto a muoversi all interno del medium e non viceversa Lo scaffold alloggiato su un supporto cilindrico e immerso nel medium messo in rotazione tramite un attuatore posto all esterno della camera di coltura Figura 1 5 Questo permette una semina e quindi una colonizzazione cellulare pi omogenea nello scaffold rispetto agli spinner flask anche se permane il pr
110. e o ricostruire tessuti patologici 6 Uno dei principali vantaggi di questa tecnica il poter impiegare cellule autologhe prelevate dal paziente stesso siano esse staminali o differenziate superando cos 11 problema del rigetto e della terapia immunosoppressiva derivante dall utilizzo di componente cellulare non autologa nel corpo del paziente La medicina rigenerativa comprende pi tecniche anche molto diverse tra loro come la terapia cellulare la terapia genica e l ingegneria dei tessuti 7 Il presente lavoro di tesi s inserisce nell ambito dell ingegneria dei tessuti quindi andremo ad analizzare pi nel dettaglio questo ramo 1 1 1 Ingegneria dei tessuti L ingegneria dei tessuti TE un campo di ricerca multidisciplinare che attraverso 1 principi della biochimica della medicina dell ingegneria della fisica e della matematica si propone di costruire in vitro porzioni di tessuti biologici destinati alla sostituzione di tessuti umani danneggiati a causa di eventi traumatici o affetti da patologie 1 Riportiamo di seguito una delle prime definizioni di cosa sia l ingegneria dei tessuti data dal Dr Robert Langer nel 1993 10 Capitolo 1 Introduzione an interdisciplinary field that applies the principles of engineering and life sciences toward the development of biological substitutes that restore maintain or improve tissue function or a whole organ 8 un campo interdisciplinare che applica i
111. el ECM dell organo pur garantendo una effettiva rimozione cellulare Tale effetto appare evidente analizzando le istologie dei campioni di vescica decellularizzati con protocollo statico e o dinamico e confrontati con il tessuto nativo Figura 4 9 102 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Tessuto nativo Dinamico 8 8 1 5mI min Statico 8 8 1 o og e da PER pera s Tricromia di Mallory Figura 4 9 Istologie ottenute con colorazione tricromica di Mallory rispettivamente per il tessuto nativo sinistra il tessuto decellularizzato per via dinamica centro e il tessuto incubato staticamente destra Dalle immagini istologiche di Figura 4 9 appare chiaro come il protocollo dinamico sia pi efficace nel mantenimento dell organizzazione delle fibre di collagene che appaiono pi impaccate come si osserva nel caso del tessuto nativo rispetto al caso statico Ci spiegabile dal fatto che fisiologicamente la vescica un organo non votato ad accumulare grandi volumi di urina al suo interno per lunghi intervalli di tempo come nel caso del protocollo statico Sotto queste condizioni la vescica subisce sollecitazioni non fisiologiche che causano una maggiore degradazione dei fasci di fibre di collagene I coefficienti di permeabilit ricavati sono stati poi confrontati con 1 dati presenti in letteratura In partico
112. el vaso e permette di monitorare la relativa variazione di pressione interna al vaso Nel dettaglio la prova condotta ha permesso di determinare la relazione tra la variazione del volume di fluido infuso all interno dell organo AV tramite una pompa peristaltica e la variazione della pressione all interno del vaso AP attraverso un sensore di pressione Il rapporto tra queste due grandezza fisiche detta compliance C parametro che dipende dalle propriet meccaniche del tessuto ed indice del grado di distensibilit del vaso Eq 1 AV C AP ml mmHg 1 La prova di misura della C svolta presso il LIT del Centro Cardiologico Monzino ha previsto l impiego di un tratto di vena safena prelevata da un donatore umano Il tratto di vena safena utilizzato ha un diametro interno pari a 1 8 mm e una lunghezza complessiva di 28 mm La vena stata montata all interno di un sistema di coltura realizzato in un precedente lavoro di tesi 5 composto da una camera di coltura che permette di alloggiare e vincolare il tratto di vena e di stimolarlo attraverso un opportuno circuito idraulico L infusione garantita da una pompa 90 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici volumetrica mentre il monitoraggio della pressione interna del vaso possibile tramite un sensore di pressione interfacciato con un
113. ellularizzare deve essere sottoposto a un protocollo ben preciso Anche in 26 Capitolo 1 Introduzione questo campo 1 bioreattori intesi come camere per la decellularizzazione possono garantire quelle condizioni di sicurezza ripetibilit controllo e automazione che sono necessarie se si vuole ampliare il campo di applicazione delle matrici decellularizzate Un esempio ne il lavoro prodotto da Sullivan e il suo gruppo di ricerca nel 2012 10 In questo progetto stato messo a punto un sistema capace di decellularizzare contemporaneamente pi organi rene Due taniche a con diversi agenti decellularizzanti sono collegate alternativamente ad una pompa peristaltica multicanale c la quale garantisce la perfusione degli organi f e la loro conseguente decellularizzazione Figura 1 12 Figura 1 12 Set up per la decellularizzazione di organi in parallelo Questo sistema quindi in grado di decellularizzare pi organi simultaneamente ma mantenendo ognuno in una sua camera di coltura cos da evitare contaminazioni tra una camera e l altra Questo set up soddisfa quindi il requisito di scalabilit del processo Inoltre garantisce che il protocollo sia ripetibile e controllato A questo sistema non associato un sistema di controllo e in letteratura non sono stati trovati lavori che presentassero set up per la decellularizzazione uniti a un sistema di controllo In conclusione dall analisi dello stato dell arte si pu
114. eno commuta in uno stato o nell altro IV Regoatore di tensione on 1 5V off 0 0V Segnale PC ru Figura 3 Schema del circuito di controllo dell EV Specifiche SW di controllo Nel presente lavoro di tesi si sviluppato il SW di controllo in ambiente LabVIEW 8 6 Le specifiche di progetto che il SW deve rispettare sono 1 controllare gli attuatori che applicano la stimolazione al tessuto o all organo 11 acquisire il segnale di pressione dal sensore di pressione 111 controllare 1 parametri di output della III Sommario stimolazione pressione volume cosi da agire sui parametri di input del sistema stesso al fine di mantenere 1 parametri di stimolazione all interno di un range preimpostato iv mostrare in tempo reale l andamento del parametri della stimolazione v registrare 1 valori dei parametri di stimolazione cos da permettere un analisi dei dati a posteriori post processing vi avere un interfaccia utente chiara e semplice user friendly cos da permettere l utilizzo del SW ad utenti esperti e non Vil avere caratteristiche di modularit cos da poter integrare nuove funzionalit senza variare la struttura generale del SW Vili caratteristiche di robustezza affidabilit deve garantire che le operazioni impostate vengano eseguite correttamente per tutta la durata della stimolazione Interfaccia utente del SW di controllo L interfaccia utente divisa in 5 pannelli
115. ensione dalla pompa Voltage Pump Out Acquisition in Figura 3 2 parametro che consente di controllare 1l valore della portata della pompa e all acquisizione del segnale inviato dal sensore di pressione Pressure Acquisition in Figura 3 2 nel ciclo di acquisizione si fa uso di un canale di output analogico AOI in Figura 3 2 utilizzato per fornire tramite la scheda NI DAQ l alimentazione al sensore di pressione La principale differenza tra questi due sotto cicli consiste nella loro differente temporizzazione definita come l intervallo di tempo che intercorre tra esecuzioni successive del ciclo Nel dettaglio 11 ciclo di controllo viene eseguito ogni 20 ms il razionale che sta alla base della scelta di questo valore sar discussa nel paragrafo 3 3 mentre la temporizzazione del ciclo di acquisizione dipende dalla frequenza di acquisizione selezionata dall utente nel pannello Advanced Settings dell interfaccia utente paragrafo 2 5 5 3 1 1 2 Ciclo dei Property Node Il ciclo Property Node 2 in Figura 3 2 consente di modificare in run time ovvero durante l esecuzione del SW gli attributi e le propriet dei controlli e o degli indicatori presenti nella finestra di interfaccia utente del SW Tramite 1 Property Node possibile effettuare ad esempio 64 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo modifiche di alcuni parametri relativi alle finestre di visualizzazione grafica quali il codice colore dell
116. ensure proportional to the speed of rotation of the rollers Then through the channels of input and output I O digital and analog of the card NI DAQ and the cabling made it is possible to manage these commands via SW Figure 2 shows the diagram of pump connection NI DAQ card INTERNAL SPEED Pompa Ismatec IPC N Figure 15 Diagram of pump connection NI DAQ card Pressure sensor The pressure sensor has been integrated into the control system to monitor in real time the pressure acting on the samples of tissue or organs stimulated The sensors used in this project Honeywell 26PCA and II Pendotech Press S 000 were interfaced with a PC via an analog input channel of the DAQ board to acquire the pressure signal Furthermore the Honeywell sensor is supplied via analog output channel of the DAQ card thus reducing the overall dimensions of the set up while for the sensor Pendotech was used an embedded power supply of small size Pinch valve The solenoid pinch valve O75P3MP12 02S Bio ChemFluidics 1s necessary to increase the versatility of the system In fact the EV allows to sitch the flow of liquid between two branches of a hydraulic circuit This can be useful in applications where it is required to switch between two different lines of the hydraulic circuit according to the phase of stimulation of the tissue To control via SW the switching of the EV it has been realized a custom circuit In fact th
117. ente di coltura e il sistema di controllo Il primo composto da una camera di coltura dove viene alloggiato lo scaffold seminato con cellule Il sistema di controllo costituito dagli attuatori dai sensori e da un software che invia e riceve segnali dagli stessi Il sistema permette quindi di monitorare ed agire su una o pi delle variabili ambientali pH temperatura ossigenazione attivit metabolica delle cellule che caratterizzano 1 processi biologici in atto all interno della camera di coltura e nel caso di bioreattori che applicano una stimolazione del costrutto anche sulle variabili fisiche quali stimolazione sollecitazione meccanica elettrica e magnetica 1 Bioreattore Ambiente di coltura Sistema di controllo Mezzo di coltura Costrutti Cellule Scaffold i CEE Figura 1 Schema a blocchi di un bioreattore In particolare si rende indispensabile la realizzazione del sistema di controllo di un bioreattore per monitorare 1 parametri di coltura di interesse e controllare gli stimoli che vengono applicati al costrutto 2 Inoltre il sistema di controllo permette di raggiungere alti livelli di automazione e di standardizzazione dei processi rendendoli cos ripetibili Questo un requisito indispensabile se si vuole rendere Pingegneria dei tessuti una concreta alternativa alle terapie tradizionali 3 4 Nel presente lavoro di tesi svolto presso il laboratorio di Micro e Biofluidodi
118. erimentali in cui 1 circuiti idraulici sono tra loro completamente indipendenti cos da poter effettuare nell ambito della medesima campagna sperimentale pi prove in parallelo impostando per ciascun campione biologico uno specifico pattern di stimolazione e mantenendo comunque 11 controllo sul parametri della stimolazione di ciascun campione Dal punto di vista del SW si potrebbe inoltre modificare il sistema di controllo sviluppato integrando tra loro le modalit in limitazione in pressione e in volume Si potrebbe cos 128 Capitolo 5 Conclusioni e sviluppi futuri Impostare una stimolazione in cui ad esempio la fase di infusione gestita tramite limitazione in pressione ad esempio tale modalit consentirebbe di effettuare il protocollo dinamico di decellularizzazione della vescica effettuando il riempimento dell organo fino al raggiungimento della pressione soglia e forzando poi lo svuotamento completo quindi fino a totale rimozione del volume precedentemente infuso Inoltre si potrebbe ampliare la gamma di pattern di stimolazione permettendo all utente di decidere 11 numero delle fasi allo stato attuale massimo tre e l ordine delle stesse ad esempio si potrebbe prevedere di costruire pattern di stimolazione in cul ci sia una fase di rest sia a valle dell infusione che a valle dell aspirazione Infine si potrebbe pensare di modificare 11 SW in modo da implementare dei cicli di stimolazione in cui 1 parametri della
119. escica cos che essa sia Interamente esposta all azione degli agenti decellularizzanti 11 facilitare la penetrazione degli agenti decellularizzanti in profondit nelle regioni pi interne della parete della vescica grazie al contributo fornito dal gradiente di pressione imposto all interno dell organo durante l infusione 111 facilitare la rimozione dei detriti cellulari attraverso 1 continui lavaggi interni dell organo risultanti dai cicli di aspirazione Lo stimolo chimico volto alla rimozione delle componenti cellulari attraverso esposizione dell organo all azione di 2 differenti soluzioni decellularizzanti soluzione ipotonica acqua delonizzata utilizzata per la lisi della membrana cellulare per effetto osmotico la cellula tende ad assorbire l acqua deionizzata fino alla rottura della sua membrana detergente non ionico 1 Triton X 100 e 0 1 NHsOH Sigma Aldrich in grado di rimuovere selettivamente 1 residui frammenti cellulari all interno della matrice del tessuto Il protocollo di decellularizzazione dinamica prevede dunque l infusione dell organo con le due soluzioni ha una durata complessiva di 17 ore ed suddiviso in tre fasi 1 cicli di infusione aspirazione con acqua deionizzata della durata complessiva di 8 ore 1i cicli di infusione aspirazione con Triton X 100 e NH40H anche questa fase del protocollo ha una durata pari ad 8 ore 111 lavaggio finale attraverso cicli di infusione aspirazi
120. eti del patch decellularizzato La valutazione del grado di permeabilit di un tessuto decellularizzato Importante poich nell ottica di una futura applicazione del tessuto come patch da impiantare in vivo eventualmente a valle di una ricellularizzazione del patch stesso in sostituzione del tessuto patologico intervento di 96 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici cistoplastica 32 necessario verificare l assenza di fenomeni di filtrazione di urina dal lume interno della vescica verso il comparto addominale per scongiurare l insorgere di conseguenti gravi fenomeni infiammatori per 1l paziente 33 34 Per valutare l effetto che la rimozione delle cellule ha sulla permeabilit del tessuto 1 dati di permeabilit ottenuti sul tessuto decellularizzato sono stati confrontati con quelli del tessuto nativo studiato nell ambito di un precedente lavoro di tesi 35 Il test di permeabilit condotto ha permesso di valutare il coefficiente di permeabilit K caratteristico della matrice del tessuto decellularizzato definito in accordo con la Legge di Darcy equazione 3 come il rapporto tra il valore della portata con cui viene perfuso il tessuto Q e la differenza di pressione AP che si genera a cavallo del tessuto stesso K 3 Il sistema di controllo sviluppato stato impiegato per poter 1 controllare la po
121. ette di calcolare la media e la deviazione standard di ogni pacchetto di dati registrato Media dei primi e ultimi n valori in questa modalit 11 SW calcola la media e la deviazione standard dei primi e degli ultimi n valori di ogni pacchetto di dati registrato Il parametro n anche qui settabile dall utente Media di n valori ogni m secondi quest ultima modalit calcola la media e la deviazione standard di pacchetti di n valori ogni m secondi di registrazione dove n e m sono parametri che l utente pu Impostare In tutte le modalit di analisi dei dati il programma genera un file di testo txt riportante 1 dati estratti o le medie e le deviazioni standard calcolate nonch la fase a cui questi dati fanno riferimento infusione aspirazione rest Oltre a salvare un file con 1 dati elaborati questo pannello permette di visualizzare 1 dati estratti in maniera Immediata sia tramite una tabella che riporta gli stessi dati salvati sul file riquadro arancione di Figura 2 20 sia tramite una finestra grafica riquadro viola di Figura 2 20 Nella finestra grafica vengono plottati in ordinata 1 valori estratti o le medie calcolate a seconda dell analisi effettuata mentre in ascissa i valori temporali di riferimento per ciascun valore Questi punti vengono poi interpolati dal SW e l inizio di ogni nuova fase diversa dalla precedente segnalato da una retta verticale colorata verde per l infusione rossa per l aspira
122. ferenti tra organo nativo e decellularizzato Campione 2 Le curve di cistometria del campione 2 sono riportate in Figura 4 16 Confronto Cistometria pre e post decellularizzazione Campione 2 SP 10 E g V Pmax post gt _ Pmax pre 2 pre if 6 S 4 Cisto Pre Cisto Post Volume ml Figura 4 16 Confronto tra la curva P V caratteristica dell organo nativo Cisto Pre e dell organo decellularizzato Cisto Post per il campione 2 Sono indicati i valori di Vi pres V2 pres Vi post Pmax pres Pmax post le rette che approssimano la zona lineare della curva P V in cui stata calcolata la C 110 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Per l organo nativo si possono distinguere le tre regioni descritte nel paragrafo 4 4 In particolare si osserva il valore di Vj pre pari a 2 ml e il valore di V2 pre circa di 6 ml Analogamente al campione 1 il valore di Vj per il campione 2 pre e post decellularizzazione molto diverso Prima della decellularizzazione infatti il valore di Vi pre pari a circa 2 ml mentre a seguito del processo di decellularizzazione il valore di Vi post pari a circa 7 ml Anche in questo caso quindi si pu osservare come l organo decellularizzato debba essere pre riempito con un volume di fluido 7 ml maggiore rispetto al caso dell organo nativo per poter rispon
123. g area of stimulation From left to right graph P V graph V t graph P t In this area the user through three windows graphic updated in real time can display the acquired pressure and the volume delivered by the pump In addition there is the graph that shows the trend of the pressure versus volume IV Architecture and testing of the control SW The software has been designed and built according to a hierarchy that includes two levels the first level is the main VI Main VI that allows you to call and execute the SubVI which various subprograms represent the second level Figure 6 Livello 1 Main VI Livello 2 Figura 19 Hierarchical structure of the SW control the SW is divided into two levels the first level includes the Main VI that handles the various SubVI belonging to the second level The Main VI is the heart of the program It is divided into seven while cycles managing the various functions of the software The main loop Main Cycle in Figure 7 contains the control cycle that monitoring and control the actuators Control Cycle 1A in Figure 7 and the cycle for the acquisition of the pressure signal from the sensor and voltage from the pump Acquisition Cycle 1B in Figure 7 Abstract Volume Cycle p Start Stop Pump P V Cycle amp Direction Pump Speed Pump Switch Pinch Valve dara p aN Post Processing Cycle Acquisition Cycle _ Pressure Ac
124. gici e alla gestione di un protocollo 88 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici di decellularizzazione Nello specifico il sistema di controllo stato integrato in 4 differenti set up utilizzati in differenti ambiti di ricerca nel campo dell ingegneria dei tessuti 1 caratterizzazione delle propriet di distensibilit compliance di campioni di vena safena umana 2 misura della permeabilit di un patch di tessuto biologico decellularizzato vescica del modello animale del coniglio attraverso controllo del volume infuso e monitoraggio della pressione agente sul patch 3 caratterizzazione delle propriet di distensibilit compliance di un organo intero decellularizzato vescica del modello animale del coniglio rispetto all organo nativo attraverso test di cistometria 4 decellularizzazione dinamica di organo intero vescica del modello animale del coniglio attraverso infusione aspirazione degli agenti decellularizzanti I set up messi a punto per condurre le prove e 1 risultati ottenuti sono descritti nei paragrafi seguenti 4 2 Prove di misura di compliance di campioni di vena safena umana La prima applicazione in cui stato utilizzato il sistema di controllo sviluppato nell ambito del presente lavoro di tesi la caratterizzazione del comportamento biomeccanico di una vena safena umana ed in particolare l anal
125. gnale di pressione acquisito Obiettivo della prova infatti quello di giungere ad un plateau del segnale di pressione registrato durante l infusione ed utilizzare questo valore nel calcolo del AP nell Eq 3 Il tempo di infusione variabile rispetto ai 3 valori di portata utilizzati inoltre caratterizzato da un certo grado di variabilit tra 1 differenti campioni Nel corso delle diverse prove condotte si comunque limitata la durata della sollecitazione ad un massimo di 2 ore per non giungere a deterioramento del tessuto come suggerito anche dalla letteratura 33 34 e falsare dunque la prova Il raggiungimento di un plateau della pressione in risposta ad una continua infusione di fluido rappresentativo del raggiungimento della condizione di equilibrio del fenomeno della filtrazione fine del transitorio ovvero la condizione in cui si ha l uguaglianza tra il volume di fluido infuso dalla pompa e quello che filtra attraverso le pareti del patch Se il tessuto fosse totalmente impermeabile questa condizione non si verificherebbe mai infatti nel caso delle prove condotte con il tessuto urovescicale nativo si veda la sezione dei risultati della prova 4 3 2 s1 osservato un continuo incremento della pressione a cavallo del patch indice del fatto che 1l tessuto ha un coefficiente di permeabilit prossimo allo zero Nel caso del tessuto decellularizzato invece 1l coefficiente di permeabilit non nullo a causa del processo d
126. gura 3 5A In particolare l operazione di integrazione numerica avviene per le fasi di infusione e aspirazione mentre per la fase di rest 11 volume visualizzato durante tutta la fase pari all ultimo valore del volume calcolato nella fase precedente in rest il calcolo del volume non viene fatto in base all integrale della portata in quanto la tensione del motore anche se la pompa ferma non nulla la pompa accesa e ci porterebbe erroneamente al calcolo di un volume non nullo 4 si ottiene cos il valore del volume che viene poi inviato alla finestra grafica volume tempo 7 in Figura 3 5A e a un indicatore che mostra all utente il valore numerico del volume infuso aspirato in tempo reale 8 in Figura 3 5A L operazione di integrazione numerica stata effettuata come sommatoria dei valori di portata istantanea Q per l intervallo temporale di integrazione At come mostrato nell equazione 1 Ve a At 1 Il valore di At utilizzato dal SW dt in Figura 3 5 nel calcolo dell integrale della portata pari al valore della temporizzazione del ciclo principale questo vuol dire che il volume viene calcolato e aggiornato al valore corrente nella finestra volume tempo ogni 20ms Al termine della fase di realizzazione dell architettura della modalit automatica del controllo in volume si proceduto al collaudo della funzionalit della modalit appena descritta In particolare le prove sono state effettuat
127. i AI termine della fase di progettazione realizzazione ed ottimizzazione del sistema di controllo attraverso gli opportuni cablaggi realizzati per interfacciare gli attuatori con la scheda NI DAQ e quindi con il PC il SW ha dimostrato la capacit di poter controllare gli elementi dell HW in diverse condizioni sperimentali di esercizio Durante la realizzazione del SW sono stati inoltre risolti alcuni problemi emersi come la non corretta gestione da parte della modalit automatica di controllo in volume del segnale di inversione dei rulli della pompa rispetto al parametro di controllo durata della fase di infusione aspirazione attraverso l implementazione di opportune modifiche di specifici blocchi dell architettura del SW paragrafo 2 5 3 1 3 Relativamente ad altri problemi riscontrati quali il ritardo associato all invio del segnale di cambio fase della pompa paragrafo 2 5 3 1 2 non si reso possibile la loro risoluzione in quanto non imputabili al SW sviluppato ma al limiti fisici della pompa Riscontrati questi problemi si comunque proceduto ad una analisi approfondita degli stessi volta a comprendere l origine e l entit di tali criticit cos da poterne tenere conto nelle fasi successive di sviluppo del SW con l obiettivo di limitare l effetto indesiderato dei problemi riscontrati Questa fase di ottimizzazione ha consentito di realizzare un SW di controllo che permette quindi di controllare l attuazione della po
128. i acquisizione e passato al ciclo di controllo 1A e 1B di Figura 3 2 tramite una variabile locale e 1 due valori di soglia impostati Il SW quindi invia il segnale di cambio fase alla pompa solo al raggiungimento del valore di soglia impostato dall utente tramite l interfaccia utente Per la fase di rest di nuovo permane il controllo sul tempo in quanto la pressione potrebbe variare durante la fase rest ma non per effetto della pompa pompa ferma e quindi la durata di questa fase determinata unicamente dal valore temporale settato dall utente Una volta raggiunto il valore di soglia della pressione inoltre 11 SW verifica che il valore raggiunto rimanga sopra sotto la soglia per un intervallo di tempo sufficiente anch esso definito dall utente tramite interfaccia utente Questo doppio controllo permette di evitare un cambio di fase errato dovuto ad improvvisi ed inattesi spike di pressione si veda il paragrafo 2 5 3 1 3 Per verificare l efficacia di questa modalit stato effettuato una prova di collaudo utilizzando un set up sperimentale che verr successivamente impiegato per la caratterizzazione meccanica di tessuti paragrafo 4 3 1 Nel set up della prova di collaudo stato impiegato un bioreattore a pertusione realizzato in un precedente lavoro di tesi presso 11 uBS Lab 27 In Figura 3 10 mostrato in dettaglio il bioreattore a perfusione impiegato Figura 3 10 Bioreattore a perfusione impiegato per la verifica
129. i colore differente l utente pu vedere immediatamente in che fase del ciclo ci si trova led verde attivo in infusione rosso in aspirazione azzurro in rest 2 5 3 1 2 Controllo in volume modalit automatica Questa modalit Figura 2 15 a differenza di quella manuale consente all utente di scegliere che pattern di stimolazione applicare in termini di sequenza delle tre fasi durata e portata di ciascuna fase Pressure Limitation Stimulation Pattern Infusion Volume per Cycle Withdraw Volume per Cycle JInfusion Rest Withdraw i 06 ml Operation Mode T Infusion T Withdraw 00 05 00 3 00 03 00 0 376 ai T Rest Pattern Time 0 3 ry Werte T 00 02 00 00 10 00 0 2 Volume ml a l I l I I Stimulation Session Time Cycles 01 INFUSION EEE 52 mei Infusion Withdraw Rest z 00 05 00 WITHDRAW 9 J i cd Time hh mm ss E Figura 2 15 Area di stimolazione controllo in volume modalit automatica Pattern infusione rest aspirazione tempi fasi 5 minuti infusione 3 minuti aspirazione 2 minuti rest portate 0 3 ml min infusione 0 2 ml min aspirazione SI Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo Il programma d la possibilit di scegliere tra quattro diversi pattern di stimolazione blocco B in alto di Figura 2 15 1 Infusione Rest 2 Infusione Aspirazione 3 Infusione Aspirazione Rest 4 Infusion
130. i decellularizzazione che come detto in precedenza elimina la componente cellulare uroteliale e causa un aumento della porosit della matrice extracellulare Nel corso di questa campagna di prove condotta con 1l sistema di controllo sviluppato sono stati testati provini ricavati da 5 campioni di tessuto urovescicale decellularizzato 100 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di 4 3 2 Risultati sperimentali organi e tessuti biologici In Tabella 4 1 vengono riportati 1 risultati delle prove effettuate Sono stati tesati 5 provini di patch di vescica decellularizzata con protocollo dinamico indicati con la lettera D e 3 provini di patch di vescica decellularizzata con protocollo statico indicati con la lettera S K u min mmHg Q ulmin 10 AP mmHg D1_1 4 2 D2_1 16 3 D 10 2 D3_1 9 8 D322 4 5 ol 2 2 9 S2_1 2 1 D2 1 2 15 20 1 37 5 26 4 31 4 18 3 4 8 2 9 20 40 3 71 2 51 6 58 9 38 9 7 4 3 7 251 Tabella 4 1 Dati ottenuti dalle prove di permeabilit per i campioni testati I campioni evidenziati in azzurro sono stati decellularizzati per protocollo dinamico D mentre quelli viola per protocollo statico S I punti sperimentali di Tabella 4 1 sono stati poi interpolati in un grafico Figura 4 8 cos da evidenziare la relazione tra la portata imposta tramite la pompa Q e la corrispondente caduta di pressione AP
131. i tessuti biologici il SW ha permesso di migliorare 1 set up sperimentali rispetto ad quelli preesistenti come illustrato nella sezione precedente 1 Chaudhuri J and M Al Rubeai Bioreactors for Tissue Engineering Principles Design and Operation Vol VIII 2005 Springer 375 Di Plunkett N and FJ O Brien Bioreactors in tissue engineering Technol Health Care 2011 19 1 p 55 69 3 Martin I D Wendt and M Heberer The role of bioreactors in tissue engineering Trends Biotechnol 2004 22 2 p 80 6 4 Wendt D et al Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing Adv Mater 2009 21 32 33 p 3352 67 IX Abstract Introduction Tissue engineering TE iS a multidisciplinary research field that assimilates the principles of biochemistry medicine engineering physics and mathematics The aim of TE is to reproduce in vitro portions of biological tissues for replacement of human damaged tissues after traumas or diseases 1 Nowadays TE is based on the interaction between biological components cells medium and biomaterials scaffold all placed in a culture chamber called bioreactor Buioreactors provide to the cells seeded on the scaffolds appropriate stimuli in order to promote the maturation of a functionalized tissue in vitro The bioreactor can be divided into two subsystems Figure 1 the culture environment and the control system The first 1s
132. icli di infusione aspirazione rende quindi questo protocollo particolarmente adatto ad essere gestito tramite il sistema di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi che consente il controllo degli attuatori ed il continuo monitoraggio dei parametri caratteristici del processo quali la portata da infondere aspirare 11 volume di fluido da infondere o la pressione raggiunta all interno dell organo durante l infusione delle soluzioni 4 5 1 Set up per la decellularizzazione della vescica Il set up sperimentale per la decellularizzazione dinamica della vescica progettato e realizzato nell ambito delle attivit del presente progetto di tesi mostrato in Figura 4 17 Figura 4 17 Set up per la decellularizzazione di organo intero vescica Sono visibili PC con il SW di controllo pompa volumetrica sensore di pressione contenitore con la vescica reservoir con le soluzioni decellularizzanti reservoir di scarico elettrovalvola pinza tubo EV circuito elettrovalvola 113 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Il set up composto da una pompa peristaltica IPC N12 Ismatec utilizzata per l infusione delle soluzioni contenenti gli agenti decellularizzanti all interno della vescica incannulata un sensore di pressione 26PCA Honeyweel ed 11 suo circuito di amplificazione per monitorare il valore di pressione
133. ico pressione VOlMIMe sectesiecdactenie seni aaa 65 ILES CielodePost Processmg rca 66 Lil SL 66 3 1 2 1 SubVI per il controllo della portata della pompa 67 3 2 Architettura delle modalit di controllo della stimolazione 68 JLL Controllo in volume modalita manuale ideale 68 3 2 2 Controllo in volume modalit automatica iii 69 3 2 2 1 Test di collaudo del volume erogato nella modalit automatica di controllo in volume 72 3 Modifica dell architettura della modalit automatica in controllo di volume 75 3 3 3 4 Indice 3 2 3 Stimolazione in limitazione di pressione modalit automatica 78 Temporzzazione delciclo di controllo assai SI Calibrazione del segnale di tensione della pompa in valori di portata 82 3 4 1 Calibrazione per il controllo della portata espressa in RPM 82 3 4 2 Calibrazione della portata espressa in MI MIN 85 3 4 3 Verifica della procedura di calibrazione della portata espressa in RPM e ml min 86 4 Monitoraggio e controllo di parametri di stimolazione di organi e tessuti biologici 88 4 1 Applicazione del sistema di controllo in esperimenti con campioni biologici 88 4 2 Prove di misura di compliance di campioni di vena safena umana ceeeeteeetees 89 4 2 rotoColloi provai dee 90 4 22 RISUNTAD S PERON
134. il SW di controllo Permette il monitoraggio in tempo reale della caduta di pressione ai capi del campione di vescica il SW di controllo sviluppato nel presenta lavoro di tesi 98 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici un bioreattore a perfusione che permette di alloggiare il campione circolare di vescica e mantenerlo in sede durante la perfusione del fluido stato impiegato un bioreattore a perfusione disponibile presso il uBS Lab realizzato in un precedente lavoro di tesi 27 e riadattato relativamente al componente che alloggia il patch di tessuto in questo tipo di prova in un altro lavoro di tesi 35 svolto sempre presso il uBS Lab un circuito idraulico che consente un facile riempimento del circuito e di ottimizzare le operazioni di alloggiamento e vincolo del patch di tessuto decellularizzato nel bioreattore a pertusione 35 Uno schema del circuito idraulico realizzato riportato in Figura 4 6 parte superiore della camera della camera lt parte inferiore circuito di riempimento circuito di perfusione sensore di pressione Figura 4 6 Schema idraulico del set up sperimentale per la misura della permeabilita su provini circolari di matrice decellularizzata I 3 rubinetti a tre vie sono numerati e hanno funzioni differenti il rubinetto 1 il punto di accesso per il riempiment
135. il successivo a causa dei ritardi della pompa nel mettere in atto le indicazioni ricevute dal SW e dell errore introdotto nel 75 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo calcolo dell integrale Si quindi deciso di modificare la variabile di controllo della durata delle fasi del ciclo passando da un controllo nel tempo ad un controllo del volume effettivamente erogato dalla pompa Il ciclo modificato a valle dei primi test di collaudo mostrato in Figura 3 8 ay 3 Tal milli W T gt AAAA OOOO OOO OOOO OOO OO Figura 3 8 Blocco di programmazione del ciclo in modalita automatica con controllo in volume modificato 1 il passaggio tra una fase e la successiva del pattern basata sul controllo del volume infuso aspirato dalla pompa nel passaggio tra infusione e aspirazione e viceversa 2 la durata della fase di rest invece ancora controllata attraverso la variabile temporale relativa alla durata del rest Si distinguono anche il volume calcolato in tempo reale 3 le portate imposte dall utente 4 e le durate delle fasi di infusione e aspirazione impostate dall utente 5 In questa nuova configurazione si deciso comunque di mantenere il tempo come variabile di controllo della fase di rest in questo modo 2 in Figura 3 8 quando la stimolazione nella fase di rest 11 SW invia il segnale di passaggio alla fase successiva di infusione aspirazione quando il contatore raggiunge i
136. io aspirazione E l utente tramite comando su interfaccia grafica a determinare il valore assunto dalla variabile booleana agendo sul comando Manual Stimulation Infusion Withdraw paragrafo 2 5 3 1 1 68 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 3 2 2 Controllo in volume modalit automatica Questa modalit consente all utente di selezionare uno dei pattern di stimolazione tra quelli disponibili ovvero la sequenza delle tre fasi di infusione aspirazione e rest 1 valori delle portate e delle durate di ciascuna fase Il pattern cos definito verr poi eseguito in maniera ciclica ed automatica fino al ricevimento di un comando di arresto da parte dell utente L architettura costruita per implementare questa logica mostrata in Figura 3 4 dove vengono evidenziate le variabili di input output ed 11 blocco di operazioni che vengono eseguite dal SW quando attiva questa modalit Anche in questo caso si utilizzato un case multiplo in cui la variabile di controllo del tipo stringa di caratteri dove ogni stringa richiama una delle tre fasi del pattern di stimolazione In base al pattern di stimolazione selezionato dall utente 1 in Figura 3 4 il SW abilita la finestra del case multiplo corrispondente al pattern scelto in Figura 3 4 viene mostrata a titolo di esempio la finestra corrispondente al pattern Infusion Withdraw Rest EMILIE Infusi Rec wp EE ZE SAINI nfusion Withdraw Re
137. ione mmHg lt Cisto Post 6 Volume ml Figure 25 Comparison of the PV curve organ native Cistus Pre and decellularized organ Cistus Post Are the values of V1 and V1 pre post The tests were carried out using the SW developed which allowed to observe in real VII time the PV curves constructed by acquiring the pressure values from the sensor and calculating the volume infused according to the voltage signal of the pump In the case of cystometry pre decellularization monitoring of stimulation through the SW has also enabled us to assess the range of pressures within which urge the organ during the process of decellularization to maintain pacing in a range of physiological pressures V lt V2 in Figure 11 This has allowed not to damage the ECM organ can result in the tests instead of cystometry that do not display the PV curve in real time The set up made for the test of cystometry also the test of was employed for decellularization Figure 12 Figura 26 Set up for the test and Cystometry decellularization of the bladder Are visible PC with the SW control volumetric pump pressure sensor the container with the bladder with the solutions decellularizzanti reservoir reservoir exhaust EV The control system operates the actuators pump to infuse aspirate EV to switch between the two branches of the hydraulic circuit for the decellularization and acquires the pressure from the signal
138. ione che agisce sul motore della pompa proporzionale alla portata impostata Il segnale varia tra 0 e 10 V Questo pin connesso ad un canale di input analogico morsetto AI 1 di Figura 2 4 della scheda NI DAQ cos da poter leggere il valore di tensione tramite PC e convertirlo poi nella portata corrispondente fase di calibrazione il pin 13 se non connesso ad un ground abilita il controllo remoto tramite 11 pin 5 della portata impostata Se connesso ad un ground invece la velocit deve essere impostata dal pannello di controllo display della pompa Il pin 13 connesso al morsetto 5 V di Figura 2 4 della scheda NI DAQ che fornisce un valore costante di 5 V cos da abilitare il controllo remoto tramite il pin 5 La Tabella 2 1 riassume 11 cablaggio effettuato per interfacciare la pompa con la DAQ e quindi 1l computer su cui viene eseguito il SW del sistema di controllo Porta a 15 Pin DAQ NI USB 6211 Funzione associata Pin Tipo di canale morsetto D GND 11 P1 0 6 P1 1 7 AO 0 12 AI 1 17 CtrlSpeed 13 5V 10 Tabella 2 1 Tabella riassuntiva della connessione tra i 7 pin cablati della porta analogica della pompa e la scheda NI DAQ USB 6211 connessa al PC con codice colore del cablaggio 2 2 2 Il sensore di pressione Oltre alla pompa il sistema di controllo prevede anche l impiego di un sensore di pressione cos da poter monitorare l andamento della pressione che agisce sui campioni di
139. ione del cablaggio dedicato per connettere 1 15 pin della porta analogica della pompa con una scheda di acquisizione dati DAQ USB 6211 National Instruments Figura 2 3 Figura 2 3 Scheda di acquisizione dati NI USB 6211 Tramite la scheda DAQ si in grado infatti di interfacciare la pompa con il PC andando ad agire sul 3 parametri di controllo della pompa descritti in precedenza Questo modello di scheda di acquisizione fornito di 20 8 canali analogici di input AI in modalit di acquisizione differenziale o 16 in modalit di acquisizione riferita a massa capaci di acquisire un segnale di tensione compreso tra 10 Ve 10 V 2 canali analogici di output AO che consentono di fornire una tensione di 10 V ed una corrente di 2mA per canale 4 canali digitali di input PO 4 canali digitali di output P1 capaci di fornire un segnale TTL ossia un segnale che pu assumere un valore alto 5 V o basso 0 V 33 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 1 canale di uscita a 5V in grado di alimentare componenti elettronici a basso consumo di corrente Il cablaggio realizzato schematizzato in Figura 2 4 DIRECTION INTERNAL SPEED Pompa Ismatec IPC N Figura 2 4 Schema connessione pompa scheda NI DAQ Per la scheda NI DAQ sono indicati 1 canali di I O usati AI 1 canale di input analogico D GND ground digitale P1 x canali di output digitale AO 0 canale di ou
140. isi delle propriet di distensibilit del vaso in risposta ad una sollecitazione di tipo pressorio Tale analisi s1 inserisce all interno di un progetto di ricerca pi ampio condotto dai ricercatori del uBS Lab in collaborazione con 1l personale del Laboratorio di Ingegneria Tissutale Cardiovascolare LIT del Centro Cardiologico Monzino di Milano Lo scopo del progetto quello di analizzare il fenomeno dell arterializzazione della vena safena in conseguenza del suo impiego come graft per bypass aorto coronarici Dalla letteratura scientifica infatti si evince come la vena safena una volta impiantata nell albero coronarico del miocardio subisca una modificazione strutturale fenomeno che prende il nome di rimodellamento del tessuto del vaso Tale rimodellamento un processo biologico che avviene in risposta alla sollecitazione non fisiologica che la vena subisce nel sito di impianto dopo l impianto infatti la vena viene sottoposta ad una pressione quella coronarica di tipo pulsatile nel range 80 120mmHg contro 0 10 mmHg associati ad una pulsatilit nulla a cui la vena sottoposta fisiologicamente 28 Tale fenomeno porta nell arco di pochi anni all ispessimento della tunica muscolare del vaso che causa una graduale riduzione del lume fino alla sua completa 89 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici occlusione 29
141. l min pari a 0 0312 0 0045 mmHg mentre per il vaso sollecitato con una portata di Q 0 04 ml min pari a 0 0301 0 0006 mmHg I valori di compliance ottenuti sono stati confrontati con 1 valori riportati in un precedente lavoro di tesi svolto presso il uBS Lab 5 In questo lavoro sono stati analizzati 5 segmenti venosi Il valore medio di compliance nel range di pressione 5 10 mmHg stato calcolato pari a 0 0522 0 0122 mmHg Si osserva come i valori di compliance misurati durante le prove effettuate con il sistema di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi siano paragonabili a quelli riportati nel precedente lavoro 5 AI di l della corrispondenza del risultato biologico occorre per porre l attenzione sui vantaggi che il sistema di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi ha portato nel protocollo sperimentale per 11 calcolo del valore di compliance di un vaso venoso I dati con cui ci si confrontati 5 sono stati ottenuti utilizzando un set up messo appunto in un secondo lavoro di tesi svolto presso 11 uBS Lab 31 In questo set up il calcolo del valore di compliance basato sull imposizione di valori noti di pressione tramite uno sfigmomanometro e la misura del volume di liquido sequestrato dal vaso Il set up composto da 1 un sistema per l alloggiamento del vaso e 11 una camera di misura della compliance collegata al sistema di alloggiamento La camera di misura della compliance costituita da
142. l valore associato alla durata del rest impostata dall utente Il passaggio dalla fase di infusione aspirazione ad un altra fase infusione aspirazione rest invece gestita tramite 1l confronto 1 in Figura 3 8 tra il volume che la pompa sta erogando 3 in Figura 3 8 e il volume che l utente ha impostato come target per ciascuna delle fasi Il volume erogato 76 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo calcolato in tempo reale tramite conversione a partire dalla tensione Volt Speed Out acquisita dalla pompa come descritto nel paragrafo 3 2 2 Il valore di target con cui il volume in tempo reale si deve confrontare invece dato dalla portata della fase di infusione e o di aspirazione 4 in Figura 3 8 moltiplicato per le rispettive durate 5 in Figura 3 8 impostate dall utente In questa nuova configurazione il SW quindi mantiene l esecuzione della fase di infusione aspirazione indipendentemente dalla durata della fase ma fintantoch il volume processato non effettivamente pari a quello desiderato e imposato dall utente segnale ricevuto dalla pompa Se durante la stimolazione l utente modifica il valore della portata il volume target s1 aggiorna in tempo reale in questo modo viene mantenuta la possibilit che l utente possa variare le condizioni della stimolazione a prova in corso SI sono condotte quindi delle nuove prove di collaudo per verificare l efficacia del funzionamento di questa nuov
143. lare nei lavori di Farhat et al 34 e di Cartwright et al 33 stato analizzato il coefficiente di permeabilit della matrice decellularizzata di vescica porcina In entrambi i lavori stato impiegato un protocollo statico di decellularizzazione per l ottenimento della matrice su cui stato effettuato il test di misura della permeabilit Il protocollo di prova utilizzato per la misura di permeabilit basato sull imposizione di una pressione idrostatica costante colonna di acqua pari a 10 cmH30 che va ad agire sul campione ed stato misurato a istanti di tempo definiti ogni ora per tre ore il volume ultra filtrato a valle del campione I valori trovati sono pari rispettivamente a 9 ul min mmHg 33 e 68 ul min mmHg 34 quindi paragonabili in particolare nel caso del lavoro di Farhat 34 al valore di Kmedio 5 0371 pl min mmHg 1 dei provini decellularizzati con protocollo statico determinato nel presente lavoro di tesi In relazione all utilizzo nelle prove effettuate l impiego del SW di controllo oltre a permettere un controllo accurato sulla portata ha consentito di monitorare in tempo reale e registrare 1 dati DS di pressione e volume rispetto al protocollo precedente dove il valore di pressione stato registrato manualmente ad intervalli di 30 minuti In Figura 4 10 si mostra il grafico della pressione rispetto al tempo che l utente visualizza in tempo reale attraverso l interfaccia grafica
144. lidi si procede a una biopsia per prelevare una porzione del tessuto di interesse e successivamente alla frammentazione del tessuto Tramite l impiego di enzimi che digeriscono la matrice extracellulare ECM si ottengono sospensioni cellulari che saranno poi trattate come nel primo caso La componente biologica sia essa tessuto organo o anche semplicemente un aggregato di cellule va mantenuta in un ambiente che riproduca le condizioni in cui le cellule si trovano all interno dell organismo ossia in vivo Per questo motivo l elemento biologico sempre immerso o sospeso in un medium per colture cellulari che ne garantisce il corretto apporto di nutrienti e di fattori di crescita oltre a mantenere condizioni osmotiche e di pH ideali In commercio sono disponibili varie tipologie di medium tra cui il Dulbecco s Modified Eagle Medium DMEM uno dei pi diffusi Il secondo elemento principale lo scaffold un supporto generalmente tridimensionale in cui sono seminate le cellule e che funge da elemento di sostegno meccanico strutturale durante la fase di maturazione in vitro Inoltre la struttura e la composizione chimica dello scaffold favoriscono l adesione e la migrazione cellulare Infatti gli scaffold cercano di mimare l architettura della matrice extracellulare del tessuto che si vuole ricreare per fornire alle cellule un ambiente in cui crescere maturare e proliferare il piu simile possibile a quello biologico Uno scaffold per il
145. lit di un patch di tessuto biologico decellularizzato vescica del modello animale del coniglio attraverso controllo del volume infuso e monitoraggio della pressione agente sul patch 3 caratterizzazione delle propriet di distensibilit compliance di un organo intero decellularizzato vescica del VI Sommario modello animale del coniglio rispetto all organo nativo attraverso test di cistometria 4 decellularizzazione dinamica di organo intero vescica del modello animale del coniglio attraverso infusione e aspirazione di agenti decellularizzanti A titolo di esempio si descrivono di seguito due dei set up realizzati mostrando come sia stato integrato il sistema di controllo sviluppato e mettendo in risalto 1 vantaggi che ci ha comportato Il primo set up preso in considerazione volto alla caratterizzazione delle propriet di distensibilit compliance C di campioni di vena safena umana Tramite la modalit in limitazione di pressione del SW di controllo s1 potuto stimolare la vena nel suo range di pressioni fisiologico 0 10 mmHg registrando il valore di pressione e di volume infuso nel tempo Il set up realizzato in questa prova mostrato in Figura 10 Figura 10 Set up per la misura della compliance della vena safena Sono indicati la pompa volumetrica il sensore di pressione la camera di coltura ed il PC su cui viene eseguito il SW di controllo Si quindi
146. ll azione degli agenti decellularizzanti in funzione della densit cellulare dello spessore e dell organizzazione del tessuto considerato 13 Capitolo 1 Introduzione Il terzo macro componente impiegato nell ingegneria dei tessuti il bioreattore Il bioreattore pu essere suddiviso in due sottosezioni l ambiente di coltura e il sistema di controllo Il primo composto da una camera di coltura dove viene alloggiato lo scaffold seminato di cellule Questa camera deve garantire un ambiente sterile cos che il costrutto non possa andare incontro a contaminazione batterica che porterebbe alla morte cellulare Il sistema di controllo costituito dagli attuatori dai sensori e da un software che comanda e riceve segnali dagli stessi Il sistema permette quindi di monitorare ed agire su una o pi delle variabili ambientali pH temperatura ossigenazione attivit metabolica delle cellule dei processi biologici in atto all interno della camera di coltura e nel caso di bioreattori che prevedono una stimolazione del costrutto anche sulle variabili fisiche quali sollecitazione meccanica stimolazione elettrica e magnetica 3 Figura 1 2 I bioreattori sono un introduzione relativamente recente nel campo dell ingegneria dei tessuti Sono stati mutuati dall industria delle biotecnologie dove sono impiegati per la proliferazione di cellule eucariote e procariote al fine di produrre in larga scala antibiotici enzimi o geni ri
147. lo in Pressione Campione 1 Campione 2 Pressione mmHg Volume ml Cistometria post Controllo in Volume Pressione mmHg Volume ml Figura 4 22 Confronto tra curve P V di vesciche decellularizzate tramite protocollo modificato e processo gestito dal SW di controllo sviluppato nella Tesi e protocollo precedentemente utilizzato Sono indicati 1 valori di Vj per entrambi 1 protocolli Dall analisi della curve appare evidente come il Vj nel protocollo controllato in pressione Vi prex Sia di circa 4 volte inferiore rispetto il valore di V ottenuto a valle della decellularizzazione effettuata con il protocollo precedentemente utilizzato infusione ad ogni ciclo di 20ml di soluzione decellularizzante senza monitoraggio del valore della pressione Il valore pi basso del parametro Vj indice del fatto che la decellularizzazione tramite limitazione in pressione riesce a ridurre i fenomeni di eccessiva sollecitazione meccanica dell organo durante il riempimento paragrafo 4 4 2 e quindi a limitare la variazione del comportamento biomeccanico tra l organo decellularizzato rispetto all organo nativo I campioni 1 e 2 decellularizzati con il protocollo modificato limitato in pressione non sono stati sollecitati oltre 1 valori massimi di pressione di 4 e 9 mmHg rispettivamente Figura 4 22 per mantenere l integrit dei campioni poich saranno sottoposti a prove istologiche Ci si propone in futuro di condurre
148. lularizzazione non sono ad oggi purtroppo ancora disponibili 1 risultati dell analisi istologica Ematossilina e Eosina e Tricromica di Mallory che il personale della Facolt di Medicina Veterinaria dell Universit Statale degli Studi di Milano sta effettuando in questi giorni Basandosi per sull osservazione dell organo pre e post decellularizzazione si pu ritenere che per entrambi gli organi si sia giunti ad un effettiva decellularizzazione dell organo In Figura 4 21 viene mostrato il campione di vescica 1 prima nativo e dopo la decellularizzazione Ep rr mr Lr __ _ e oo iei 1 Was ada Figura 4 21 Vescica pre A e post B decellularizzazione Dalle fotografie in Figura 4 21 si pu osservare infatti come l organo decellularizzato presenti un colore differente tendente al bianco rispetto all organo nativo rosa indice questo dell effettiva rimozione della componente cellulare In Figura 4 22 si riporta il confronto tra le curve P V degli organi decellularizzati nel presente lavoro di tesi paragrafo 4 4 2 tramite limitazione in pressione e le curve degli organi decellularizzati tramite 11 protocollo precedente controllo in volume estratte in un precedente lavoro 36 120 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Cistometria post Control
149. mantenere 1 parametri di stimolazione all interno di un range preimpostato la visualizzazione real time dell andamento dei parametri di stimolazione pressione volume 41 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo la registrazione dei valori dei parametri di stimolazione cos da permettere un analisi dei dati a posteriori post processing Caratteristiche di modularit cos da poter integrare nuove funzionalit o modificare quelle preesistenti in funzione di nuove richieste da parte dell utilizzatore caratteristiche di robustezza e affidabilit deve garantire che le operazioni impostate vengano eseguite correttamente per tutta la durata della stimolazione controlli di sicurezza in grado di arrestare repentinamente la stimolazione in caso di eventi inattesi 2 3 1 Progettazione del software di controllo Dopo aver descritto nel paragrafo precedente le specifiche generali che il sistema realizzato deve rispettare andiamo ora ad illustrare nel dettaglio le caratteristiche del SW di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi Nei paragrafi successivi del presente capitolo verranno descritte le diverse funzioni di cui esso dotato e le modalit con cui l utente Imposta 1 vari parametri della stimolazione attraverso l interfaccia grafica Lo scopo principale del programma quello di controllare gli attuatori e acquisire 1 segnali dal sensori presenti nel sistema
150. mentazione ai sensori di pressione Nel caso del sensore Honeywell 26PCA infatti il sensore viene alimentato direttamente tramite un segnale inviato dalla scheda NI DAQ USB 6211 nel caso del sensore Pendotech PRESS S 000 l alimentazione viene fornita tramite un alimentatore integrato di dimensioni ridotte TXL 015 12S Traco Power stato inoltre realizzato un circuito di controllo e di alimentazione dell elettrovalvola pinza tubo anch esso di dimensioni molto contenute Dal punto di vista della robustezza e dell affidabilit dell HW in tutti 1 test di collaudo effettuati per verificare il corretto funzionamento del sistema cos come durante le prove di carattere biologico effettuate non sono state riscontrate particolari criticit il sistema infatti ha sempre 124 Capitolo 5 Conclusioni e sviluppi futuri garantito il mantenimento della stimolazione impostata dall utente per tutta la durata della prova anche per prove di durata elevata fino a 17 ore Per quanto riguarda invece lo sviluppo della componente SW le specifiche che 11 programma deve rispettare sono molteplici Il primo requisito che il SW deve garantire il controllo degli attuatori idraulici impiegati per la stimolazione del tessuto organo Questo vuol dire che 11 SW deve poter tradurre 1 parametri impostati dall utente nella definizione del pattern di stimolazione desiderato in termini di segnali analogici o digitali che vengono inviati agli attuator
151. monitoraggio e controllo sui parametri della stimolazione rispetto alle dinamiche delle sollecitazioni Imposte questo SW stato progettato e realizzato per applicazioni che richiedono sollecitazioni cicliche la cui durata delle fasi spazia dalle ore ai secondi e quindi comunque sempre maggiore di almeno due ordini di grandezza rispetto al valore della temporizzazione imposta per l esecuzione del ciclo principale 20 ms Per quanto riguarda 1 cicli while ausiliari del SW sviluppato cicli 2 3 4 5 in Figura 3 2 la temporizzazione scelta stata di un ordine di grandezza superiore rispetto a quella del ciclo while di controllo 20 ms I cicli sono stati temporizzati in modo da eseguire le proprie operazioni ogni 200 ms valore che permette un aggiornamento sufficientemente frequente delle finestre grafiche dei cicli while 3 Volume Cycle e 4 P V Cycle di Figura 3 2 e consente di svolgere in tempi ragionevoli le operazioni richieste nel ciclo while dedicato al post processing SI Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Infine il ciclo while n 2 Property Node stato temporizzato con lo stesso valore dei 3 precedenti per uniformare la temporizzazione di tutti 1 cicli ausiliari 3 4 Calibrazione del segnale di tensione della pompa in valori di portata Come illustrato nel paragrafo 2 2 1 1 11 valore di portata che la pompa deve garantire pu essere gestito inviando al motore della pompa un segnale di tensi
152. mpa volumetrica con un grado di precisione paragonabile a quella fornita del controllore interno alla pompa che gestisce il controllo della pompa tramite 1 comandi presenti sul display Relativamente alla gestione del segnale via SW che provoca la commutazione dell elettrovalvola s1 stati in grado di sincronizzare tale segnale con il comando che gestisce l inversione del verso di rotazione della pompa Seconda specifica che 11 SW deve rispettare la possibilit di acquisire un segnale di pressione tramite la scheda NI DAQ inviato da un sensore di pressione Il SW ha soddisfatto questa specifica offrendo la possibilit di acquisire fino a sette segnali di pressione differenti su altrettante linee tra loro connesse o tra loro indipendenti del circuito idraulico Il SW deve poi effettuare un monitoraggio dei parametri di output della stimolazione pressione e volume in base alla modalit di controllo scelta dall utente cos da poter modificare alcuni dei 125 Capitolo 5 Conclusioni e sviluppi futuri parametri di input del sistema in tempo reale durante la stimolazione e mantenere 1 parametri di stimolazione sempre all interno del range desiderato Nel caso in cui l utente scelga di lavorare in modalit automatica in controllo di volume il SW in grado di monitorare uno degli output del sistema ossia la tensione in uscita dalla pompa che proporzionale al valore di portata della pompa in questo modo in funzione di una
153. n analisi statistica dei dati registrati 2 2 Hardware I componenti HW utilizzati in questo progetto sono 1 una pompa volumetrica 11 un sensore di pressione 111 un elettrovalvola pinza tubo EV e iv i cablaggi necessari per inviare e leggere 1 segnali di tutti 1 componenti tramite PC In questo lavoro di tesi si provveduto a realizzare il cablaggio per interfacciare la pompa con il PC il circuito elettrico che gestisce PEV e il cablaggio per interfacciarla con il PC 30 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 2 1 La pompa volumetrica Nel presente lavoro di tesi stata utilizzata la pompa volumetrica Ismatec IPC N 12 Figura 2 1 La versione utilizzata dotata di otto rulli in acciaio inossidabile e pu alloggiare sottopompa del diametro interno compreso tra 0 13 e 3 17 mm con spessore di 0 8 mm Questo permette alla pompa di garantire portate teoriche che variano da 0 39 ul min fino a 11 ml min Inoltre permette di alloggiare fino a 12 sottopompa cos da poter alimentare 12 circuiti idraulici paralleli e tra loro indipendenti 19 Figura 2 1 Pompa volumetrica Ismatec IPC N12 Il meccanismo di funzionamento di questa pompa pu essere riassunto come descritto qui di seguito tramite 1 comandi ed il display della pompa o tramite controllo remoto ovvero connettendo opportunamente la pompa ad un PC viene impostata la portata che la pompa deve garantire la portata pu esser
154. n tempo reale della stimolazione P V P t V t Figura 2 17 136 31 Da PV vit zo Pere EI Compliance 2 Autoscale or Clear Chart Volume i Autoscale ort cea cre Pressure PL l at i BE ong 0 0016 m EECH 0 007 A 120 0 006 ry 100 i 0 004 0 005 0 006 0 007 00 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 Volume mi Time hh mm ss Time s Figura 2 17 Area di monitoraggio della stimolazione Da sinistra a destra grafico P V grafico V t grafico P t Modalit controllo in volume automatica impostando un pattern di stimolazione infusione aspirazione rest durante una stimolazione di un patch di lattice Sopra i pannelli grafici sono visibili 1 loro controlli Il grafico sulla destra Figura 2 17 mostra il tracciato di pressione letto dal sensore di pressione nel tempo visualizzando il segnale dei canali attivi Pannello 2 Come introdotto nel paragrafo 2 5 2 alle finestre grafiche sono associati vari controlli autoscale filtraggio del segnale finestra temporale visualizzata refresh della finestra Il grafico centrale di Figura 2 17 mostra invece l andamento del volume infuso aspirato dalla pompa nel tempo Questo grafico costruito tramite il segnale di tensione in uscita dalla pompa il quale proporzionale alla velocit di rotazione dei rulli e quindi alla portata effettiva fornita dalla pompa Non quindi un andamento teorico basato sul valore di portata impost
155. nale di output analogico della scheda NI DAQ riducendo cos l ingombro del set up mentre per il sensore Pendotech stato utilizzato un alimentatore integrato di dimensioni ridotte Elettrovalvola pinza tubo L introduzione dell elettrovalvola pinza tubo O75P3MP12 02S Bio ChemFluidics nel sistema di controllo volta ad aumentare la versatilit del sistema sistema Infatti PEV permette di deviare il flusso di liquido tra due rami di un circuito idraulico Ci pu essere utile in applicazioni in cui richiesta la commutazione tra due linee diverse del circuito idraulico a seconda della fase di stimolazione del tessuto Per controllare via SW la commutazione dell EV sincronizzando lo switch dell EV con il passaggio dalla fase di infusione a quella di aspirazione della pompa stato realizzato un apposito circuito Infatti PEV richiede una potenza troppo alta per essere gestita direttamente dai canali di I O della scheda NI DAQ Il SW invia quindi un segnale che pu assumere un valore alto 5 V o basso 0 V TTL ad un transistor BJT portandolo in uno stato rispettivamente di interdizione o saturazione A seconda dello stato del BJT si chiude o si apre il circuito di alimentazione del rel ad esso collegato Il rel quindi commuta lo stato della sua bobina interna permettendo o meno il passaggio della tensione di alimentazione all EV Quest ultima a seconda che riceva la sua tensione di alimentazione o m
156. namica Sperimentale uBS Lab del Dipartimento di Elettronica Informazione e Bioingegneria del Politecnico di Milano ha come obiettivo lo sviluppo di un sistema per il monitoraggio Sommario e il controllo di dispositivi in grado di applicare una sollecitazione meccanica a tessuti biologici molli In particolare la stimolazione applicata di tipo pressorio realizzata tramite l immissione O l aspirazione di un fluido in pressione che agisce sul tessuto organo da stimolare Nel proseguo del sommario si proceder inizialmente a descrivere la componente HardWare HW e SoftWare SW del sistema di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi Si discuteranno in sequenza le specifiche l interfaccia utente e l architettura generale del SW oltre alle prove di collaudo effettuate per verificarne l affidabilit Inoltre saranno descritte le applicazioni pratiche volte alla caratterizzazione biomeccanica di tessuti biologici in cui il sistema di controllo stato impiegato Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo Nel presente lavoro di tesi si realizzato 1l sistema di controllo sia nella sua componente HW che SW I componenti HW utilizzati in questo progetto sono 1 una pompa volumetrica 11 un sensore di pressione 111 un elettrovalvola pinza tubo EV e iv 1 cablaggi necessari per inviare e ricevere 1 segnali di tutti 1 componenti HW tramite PC Pompa volumetrica L attu
157. ne che 11 SW mette a disposizione dell utente dal punto di vista della logica progettuale su cui basata ciascuna modalit Inoltre verranno presentati alcuni problemi riscontrati durante la fase di sviluppo del SW 1 test di collaudo effettuati per giungere all identificazione degli errori che causano 1 problemi riscontrati e le successive modifiche apportate all architettura del SW che hanno consentito di risolverli 3 2 1 Controllo in volume modalit manuale Come illustrato nel capitolo precedente questa la modalit pi semplice che il sistema mette a disposizione ed basata sull esecuzione dei Sub VI Start Stop C in Figura 3 1 e Direction Pump D in Figura 3 1 Il SubVI Start Stop attivato attraverso una variabile booleana il cui valore definito dal comando di Start Stop del pannello di controllo della pompa nell interfaccia utente descritto nel paragrafo 2 5 3 3 Quando l utente attiva il comando Start la variabile booleana assume il valore vero e viene attivata la rotazione dei rulli della pompa Quando viene poi attivato il comando Stop la variabile booleana passa al valore falso arrestando cos la rotazione dei rulli Il controllo sulla direzione di rotazione dei rulli della pompa gestito attraverso un altra variabile booleana che attiva l esecuzione del SubVI Direction Pump il valore vero si traduce nella rotazione oraria dei rulli infusione mentre il valore falso nella rotazione in senso antiorar
158. no intero di vescica modello animale del coniglio a valle del processo di decellularizzazione 1 dettagli del processo sono riportati nel paragrafo 4 5 Quest analisi necessaria in ottica del successivo impiego del tessuto decellularizzato nella rigenerazione di organi Infatti per poter impiegare il tessuto o organo decellularizzato come supporto per ricreare organi in vitro occorre valutare se il tessuto a seguito di un processo di 104 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici decellularizzazione abbia mantenuto caratteristiche biomeccaniche comparabili con quelle del tessuto organo nativo Nel dettaglio l analisi della caratteristica biomeccanica descritta nel presente paragrafo definita come prova di cistometria Il test di cistometria consente di valutare la risposta dell organo intero di vescica dal punto di vista dell incremento di pressione intravescicale associata ad un incremento del volume intravescicale ovvero associata ad un riempimento dell organo con un fluido in pressione In ambito clinico la cistometria un test funzionale utilizzato per diagnosticare eventuali patologie dell organo legate a disfunzioni del processo di immagazzinamento dell urina e della successiva minzione problemi di minzione incontinenza ritenzione urinaria infezioni del tratto urinario ecc Nell ambito della caratterizzazi
159. no state effettuate le prove di misura di compliance Sono state effettuate due differenti prove impostando tramite il SW di controllo due differenti portate di infusione pari a 0 02 e 0 04 ml min al fine di indagare l influenza che questo parametro potesse avere in termini di risposta meccanica del vaso In entrambe le prove stato quindi monitorato il volume sequestrato all interno dell organo AV Eq 1 e la risposta del vaso in termini di incremento di pressione interna AP Eq 1 Per ogni valore di portata sono state eseguite due misure di compliance per valutare la ripetibilit del comportamento del vaso 4 2 2 Risultati Sperimentali Come detto in precedenza sono stati eseguiti 14 cicli di precondizionamento del vaso A valle dei 14 cicli di precondizionamento non si giunti ad una effettiva riduzione dell area di isteresi della curva P V definita come l area compresa tra la curva P V di infusione e quella di aspirazione tra un ciclo di carico scarico e il ciclo successivo Nonostante ci si deciso di procedere ugualmente con il test di misura della compliance per non giungere a deterioramento del tessuto della vena Al termine della prova stata valutata la relazione che lega l incremento di pressione all interno del vaso all aumento di volume di fluido sequestrato durante l infusione ed in definitiva si stimato il valore della compliance del vaso La Figura 4 4 mostra le curve ottenute durante la
160. nte anche alcune funzioni di post processing automatiche filtraggio tramite media mobile calcolo del valore medio e relativa deviazione standard dei dati attraverso 1 comandi posti in un apposito pannello dell interfaccia utente Poich questo SW dedicato all utilizzo da parte di utenti esperti e meno esperti esso deve soddisfare la specifica di semplicit di utilizzo ed intuitivita dei comandi da azionare Si quindi sviluppata un interfaccia utente in grado di guidare l utente nell impostazione di tutti 1 parametri della stimolazione escludendo quindi la possibilit che l utente possa settare 1 diversi parametri in maniera non coerente tra loro Dal punto di vista della sua architettura nell ottica di futuri ulteriori sviluppi del sistema di controllo che potrebbero emergere sulla base di nuove applicazioni di utilizzo del SW il SW garantisce la possibilit di integrare nuove funzionalit o modificare quelle preesistenti in funzione delle nuove richieste da parte dell utilizzatore Tramite l integrazione nel software di specifici SubVI paragrafo 3 1 2 si reso infatti possibile l aggiornamento di singole parti del SW senza doverne modificare l architettura generale Ultima specifica non certo per importanza che il SW deve garantire l affidabilit e la robustezza del sistema realizzato Come descritto nel Capitolo 3 stato necessario apportare alcune modifiche dell architettura e della logica di
161. nte il passaggio tra una fase e la successiva es I W 11 valore di Volt Speed Out si porta inizialmente a zero 0 V per poi riportarsi al nuovo valore corrispondente al valore della portata impostata per la fase successiva Figura 3 7 Tensione IWR i Infusione Infusione gt 3 55 Aspirazione Aspirazione zs 25 E 1 5 pa de Rest 0 5 5 10 15 20 Tempo s Tensione IRW 4 5 Aspirazione Aspirazione 3 l ie Infusione Infusione zs 25 4 A 2 154 2 o 5 si Rest 0 5 8 13 18 23 28 Tempo s Figura 3 7 Comportamento della tensione Volt Speed Out erogata della pompa durante il cambio fase per diversi pattern di stimolazione IWR e IRW Si noti come durante il cambio di fase la tensione si porti al valore 0 V prima di riassestarsi al valore equivalente alla portata impostata per la fase successiva 73 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Tale comportamento rappresenta un limite fisico della pompa la quale nel momento in cui deve invertire il verso di rotazione dei rulli deve necessariamente in un primo momento fermare 1 rulli Volt Speed Out pari a 0 V e successivamente far ripartire la loro rotazione Apparentemente per questo fenomeno non in grado di spiegare il motivo di derive negative o positive registrate durante le prove In realt dall analisi dei dati si visto come questo effetto comporti un errore cumulativo nel calcolo del volume che c
162. o AI termine della fase di progettazione realizzazione e collaudo del sistema di controllo si poi proceduto al suo effettivo utilizzo integrandolo in quattro diversi set up sperimentali ad oggi in uso presso il uBS Lab 1 camera di coltura per la caratterizzazione delle propriet di distensibilit compliance di campioni di vena safena umana da utilizzare come graft per bypass aorto coronarici 11 set up per la misura della permeabilit di un patch di tessuto biologico decellularizzato vescica del modello animale del coniglio 111 setup per la caratterizzazione 29 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo delle proprieta di distensibilita compliance dell organo decellularizzato vescica del modello animale del coniglio rispetto all organo nativo attraverso test di cistometria 1v set up per la decellularizzazione dinamica di organo intero vescica del modello animale del coniglio Queste prove richiedono una stimolazione del tessuto tramite un gradiente di pressione imposto dal sistema e quindi si adattano alle specifiche che il sistema di controllo realizzato in grado di fornire I dettagli di realizzazione dei quattro diversi set up e 1 risultati ottenuti verranno presentati nel capitolo 4 Il presente capitolo contiene invece la descrizione delle componenti realizzate nel presente lavoro di tesi che costituiscono il sistema di controllo sia dal punto di vista hardware che software Il
163. o dall utente ma costruito tramite 1 valori di tensione effettivi acquisiti dalla pompa convertiti poi dal SW in portata e letti in tempo reale paragrafo 2 2 1 1 pin 9 in Figura 2 4 L ultimo grafico a sinistra in Figura 2 17 unisce 1 due precedenti Difatti rappresenta l andamento della pressione in funzione del volume da quindi un informazione sulla compliance del tessuto stimolato 54 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo Tramite questi tre pannelli viene soddisfatta la specifica che consente all utente di monitorare in tempo reale l andamento della stimolazione specifica di fondamentale importanza come introdotto nel paragrafo 2 3 2 5 3 3 Area accessoria L ultima area presente nel pannello di controllo quella accessoria riquadro giallo di Figura 2 13 Quest area Figura 2 18 pu essere suddivisa in due blocchi Pressure Record Volume Record Auto Rec Manual Rec STOP START T to Wait s Rec Time Alarm s EA E 01 00 00 T Auto Rec s REC Time 5 00 00 30 I Figura 2 18 Area accessoria area registrazione a sinistra area avvio arresto programma e stimolazione a destra Una prima parte a sinistra in Figura 2 18 dedicata alla registrazione dei segnali di volume e pressione Qui l utente pu scegliere tra una registrazione manuale e una automatica Nella registrazione manuale l inizio e la fine della registrazione sono decisi dall
164. o del bioreattore permette un altra funzione fondamentale il monitoraggio dei parametri fisico chimici della coltura Soprattutto nella fase di ottimizzazione 17 Capitolo 1 Introduzione del set di parametri della coltura diventa indispensabile poter seguire l evoluzione temporale dei parametri della coltura Poter osservare solo il risultato finale al termine della coltura non permette di capire quale parametro possa aver causato eventuali dati inattesi e quando questo problema si sia presentato 4 Un software che consente la visualizzazione in tempo reale dei parametri biochimici e di stimolazione invece da la possibilit all utente di intervenire tempestivamente su tali variabili nel momento in cui ad esempio la richiesta metabolica oppure le propriet meccaniche nel caso vi sia presente una sollecitazione meccanica in atto delle cellule o del costrutto siano variate 4 Ci consente quindi di adattare 1 parametri della coltura durante la coltura stessa cos da garantire sempre le migliori condizioni al costrutto biologico Oltre alla visualizzazione in tempo reale deve essere data anche la possibilit di registrare 1 dati d interesse cos da poter eseguire un analisi dei dati a posteriori post processing in modo da poter analizzare l andamento dei parametri della coltura nel caso in cui non si siano potuti monitorare costantemente durante l esperimento Inoltre tracciare l andamento di queste variabili consente di poter
165. o del circuito con il liquido utilizzato per la perfusione i rubinetti 2 e 3 hanno il compito di isolare la camera di perfusione per favorire il corretto posizionamento del patch di vescica nella camera di coltura Sono indicati anche 1 due elementi che compongono il bioreattore camera inferiore e superiore il sensore di pressione e la pompa I tre rubinetti a 3 vie evidenziati in figura consentono di debollare e riempire facilmente il circuito idraulico secondo un protocollo sviluppato in un precedente lavoro di tesi 35 Sono indicati inoltre 1 due elementi che compongono il bioreattore utilizzato parte inferiore e superiore 1 quali una volta serrati consento di fissare la cartuccia di silicone in cui alloggiato il patch di tessuto Figura 4 7 99 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Figura 4 7 Cartuccia di PDMS in cui alloggiato il patch di tessuto decellularizzato Tramite una guarnizione in gomma siliconica o ring il patch viene vincolato all interno della cartuccia La cartuccia viene poi inserita all interno del bioreattore a perfusione impiegato nelle prova Ciascuno dei provini ricavati dalle porzioni di vescica decellularizzata stato sollecitato con tre differenti valori di portata Q Eq 3 pari a 10 15 20 ul min La sollecitazione stata applicata per una durata di tempo variabile in funzione del se
166. o della stimolazione Da sinistra a destra grafico P V grafico V t grafico P t In quest area l utente tramite tre finestre grafiche aggiornate in tempo reale pu visualizzare la pressione acquisita e il volume erogato dalla pompa rispetto al tempo di stimolazione Inoltre presente 1l grafico che mostra l andamento della pressione in funzione del volume Architettura e collaudo del SW di controllo Il SW stato progettato e realizzato secondo una scala gerarchica che comprende due diversi livelli nel primo livello presente 1l VI principale Main VI che consente di richiamare ed eseguire 1 vari SubVI sottoprogrammi che rappresentano il secondo livello Figura 6 Main VI Livello 1 Livello 2 Figura 6 Struttura gerarchica del SW di controllo il SW suddiviso in 2 livelli il primo livello comprende il Main VI che gestisce 1 vari SubVI appartenenti al secondo livello Il Main Vi il cuore del programma suddiviso in 7 cicli while che gestiscono le diverse funzioni del SW Il ciclo principale Main Cycle 1 in Figura 7 contiene il ciclo di controllo volto all attuazione al monitoraggio e al controllo degli attuatori Control Cycle 1A in Figura 7 e il ciclo per l acquisizione del segnale di pressione dal sensore e di tensione dalla pompa Acquisition Cycle 1B in Figura 7 Main Cycle Start Stop Program Case Sea I Control Cycle Volume Cycle Manual Auto PL
167. o su pi thread che possono essere eseguiti in parallelo L ambiente di programmazione composto da due differenti pannelli 11 pannello frontale front panel e il diagramma a blocchi block diagram Il primo l interfaccia utente del VI ed composto da controlli e indicatori che costituiscono 1 terminali interattivi e grafici delle variabili d ingresso e d uscita Per quanto riguarda 1 controlli s1 pu scegliere tra pulsanti matrici manopole cursori tramite 1 quali si possono fornire gli input allo schema a blocchi del VI Gli indicatori invece sono sotto forma di grafici tabelle caselle di testo matrici Simulano 1 dispositivi di uscita degli strumenti reali 1 loro pannelli di interfaccia utente ad esempio e mostrano 1 valori che lo schema a blocchi acquisisce dall esterno segnale di pressione inviato da un sensore o genera risultato di una funzione matematica implementata nel block diagram Nel diagramma a blocchi si costruisce effettivamente 11 SW In questo pannello s1 connettono 1 controlli e gli indicatori del front panel attraverso le linee di collegamento creando cos il flusso di dati del programma Si implementa inoltre l architettura del software attraverso cicli for while if ed operatori matematici booleani e di confronto La scelta di sviluppare il software in ambiente LabVIEW dovuta principalmente a tre motivi 1 facilit di realizzare un interfaccia utente chiara semplice ed intuitiva
168. oblema del non adeguato trasporto di massa per elevate densit cellulari o spessori del costrutto 2 Sono utilizzati per coltivare costrutti tubolari come 1 vasi waste removal r nutrients and oxygen supply inner cylinder gear inner cylinder outer cylinder gear porous wall outer cylinder culture medium Figura 1 5 Esempio di bioreattore a pareti rotanti 1 4 3 Bioreattore a compressione Questa tipologia di bioreattori ampiamente utilizzata nella rigenerazione del tessuto cartilagineo e osseo Tramite questo sistema di coltura possibile applicare al costrutto sia una sollecitazione statica quindi una compressione costante nel tempo che un carico dinamico ossia 20 Capitolo 1 Introduzione una sollecitazione meccanica variabile nel tempo per intensita e verso 12 Un studio condotto da Mauck et al 13 nel 2005 dimostra come una compressione meccanica dello scaffold seminato con condrociti favorisca la produzione di componenti della ECM oltre a mantenere il fenotipo delle cellule seminate Il sistema di attuazione del bioreattore descritto da Mauck et al consiste in una cella di carico messa in movimento da un motore di tipo stepper Il sistema gestito da un software sviluppato in ambiente LabVIEW che permette di applicare vari patterns di stimolazione agendo sulla forma d onda la frequenza e la durata dello stimolo applicato al costrutto Figura 1 6 Questo sistema di controllo quindi permette di agire s
169. oggi in corso presso il laboratorio In questa fase del lavoro si voluto verificare come l integrazione di un sistema di controllo nei diversi set up potesse migliorare l esecuzione e l output degli esperimenti condotti In tutti 1 casi quindi 1 risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in precedenti lavori svolti presso 11 uBS Lab o presenti in letteratura in cui non previsto un sistema di monitoraggio e controllo della stimolazione Dato il numero esiguo di esperimenti effettuati per ciascun tessuto organo testato occorre sottolineare come nel proseguo del capitolo si tender a dar maggior enfasi ai risultati delle prove condotte dal punto di vista dal comportamento del sistema di controllo e dei vantaggi operativi che esso ha consentito di ottenere nei diversi ambiti in cui stato utilizzato rispetto all effettivo significato dei risultati ottenuti Infatti l obiettivo principale del presente lavoro di tesi lo sviluppo di un sistema di controllo dotato di ampia versatilit e non il suo utilizzo in campagne sperimentali estensive finalizzate allo studio del comportamento dei tessuti stimolati I risultati pi significativi ottenuti con campioni biologici verranno comunque descritti e ove possibile discussi e confrontati con 1 dati presenti in letteratura Come introdotto nel capitolo 2 il sistema di controllo stato utilizzato in set up sperimentali finalizzati alla caratterizzazione biomeccanica di tessuti biolo
170. ollo sviluppato potr essere impiegato in un range ancora pi ampio di applicazioni Infatti 1 quattro set up sperimentali in cui stato utilizzato il SW nell ambito del presente lavoro sono solo alcuni esempi applicativi il SW Infatti applicabile in tutte quelle condizioni sperimentali che prevedono la stimolazione di un tessuto tramite l infusione di fluido in pressione quali ad esempio la fase di stimolazione di un tessuto ricellularizzato volta alla sua funzionalizzazione pre impianto in vivo Il sistema realizzato dimostra di soddisfare tutte le specifiche che ci si era posti all inizio del presente lavoro di tesi sia per quanto riguarda la componente HW che SW Nonostante ci il sistema di controllo presente ancora dei limiti e sono stati quindi identificati alcuni possibili sviluppi futuri Per quanto riguarda PHW l impiego di una pompa volumetrica OEM miniaturizzata potrebbe ulteriormente ridurre l ingombro del sistema Alla luce della ricerca di mercato condotta stata individuata la pompa P625 10K 143 prodotta da Instech come possibile soluzione Figura 5 1 Pompa volumetrica P625 10K 143 prodotta da Instech Questa pompa oltre ad avere ingombri molto ridotti eroga portate molto basse l min adeguate pertanto ad esempio ad un futuro impiego del sistema di controllo nel processo di ricellularizzazione di matrici decellularizzate Inoltre l impiego di pi teste pompanti consentirebbe di realizzare set up sp
171. ome visto nel paragrafo precedente calcolato sulla base dell integrale nel tempo del valore di Volt Speed Out convertito in termini di portata In particolare s1 osservato come l errore nel calcolo dell integrale sia differente nel passaggio dalla fase di rest alla fase di infusione e o aspirazione rispetto al passaggio dalla fase di infusione a quella di aspirazione e viceversa Infatti durante il passaggio di fase a causa del fatto che la pompa passa prima ad un valore di 0 V per poi riportarsi alla tensione corrispondente alla portata richiesta Figura 3 7 entrano nel calcolo dell integrale della fase corrente un certo numero di valori di tensione appartenenti in realt alla fase precedente Tabella 3 1 Nel caso la fase precedente ad una fase di infusione aspirazione sia una fase di rest si osservato come l errore introdotto sia pi significativo Infatti 1 valori di tensione associati alla fase di rest hanno un valore prossimo allo zero ci comporta che nel calcolo dell integrale nella fase successiva infusione aspirazione vengano considerati non solo 1 valori prossimi allo 0 dovuti al cambio di fase ma anche 1 valori della fase precedente di rest sempre prossimi allo 0 Questo spiega come l errore nel calcolo dell integrale sia maggiore nel passaggio da una fase di rest ad un altra rispetto al passaggio ad esempio dalla fase di infusione a quella di aspirazione e viceversa In questo ultimo caso infatti
172. one compreso tra 0 e 5 V L utente deve per avere la possibilit di impostare direttamente il valore di portata in RPM o in ml min e non settare un valore di tensione Occorre quindi implementare nell architettura del SW una retta di calibrazione che trasformi il valore di portata espressa in RPM o ml min settato dall utente in un valore di tensione che 11 SW invia alla pompa 3 4 1 Calibrazione per il controllo della portata espressa in RPM Si inizialmente proceduto alla calibrazione per il controllo della portata espressa in RPM in quanto questa modalit di controllo della portata indipendente dal sottopompa utilizzato Tramite 1l pin 9 paragrafo 2 2 1 1 della pompa stato acquisito il segnale di tensione erogato dal motore e proporzionale alla velocit di rotazione dei rulli comandando la pompa manualmente ovvero impostando diversi valori di RPM tramite il suo display Questo segnale compreso tra 0 e 10 V In questo modo si ricavata la retta di calibrazione che associa il valore di portata settato al valore di tensione da inviare alla pompa I parametri della retta di calibrazione pendenza e intercetta sono stati implementati nel SubVI RPM nel ciclo di controllo del SW cos da calibrare la variabile Volt Speed Out Figura 3 5 che determina la portata della pompa Per effettuare la calibrazione stato realizzato un cablaggio differente da quello descritto nel paragrato 2 2 1 1 poich era necessario acqui
173. one con acqua deionizzata volto a rimuovere gli eventuali residui cellulari e soluzioni detergenti rimasti all interno dell organo per una durata complessiva di 1 ora 115 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Inoltre l esecuzione di continui cicli di infusione aspirazione delle soluzioni decellularizzanti volto a replicare la naturale dinamica di riempimento e svuotamento dell organo in vivo Per permettere l infusione aspirazione delle soluzioni nel dall organo la vescica viene incannulata con un catetere inserito nell uretra al quale la vescica viene fissata tramite una fascetta in plastica in analogia con quanto descritto nel paragrafo 4 4 1 e gli ureteri suturati per evitare la fuoriuscita delle soluzioni infuse nel lume interno dell organo L organo viene poi immerso in un reservoir riempito della stessa soluzione decellularizzante che viene infusa aspirata ciclicamente per esporre anche la superficie esterna dell organo all azione degli agenti chimici Il protocollo precedentemente utilizzato prevede di infondere l organo con una portata di infusione di 5 ml min per 4 minuti infondendo quindi 20 ml di soluzione decellularizzante Al termine di questa fase si procede a svuotare l organo per gravit differenza di quota tra il reservoir di mandata e quello di scarico queste due fasi vengono iterativamente ripet
174. one definito dall utente Nel dettaglio nel protocollo modificato nell ambito del presente lavoro di tesi la vescica viene riempita fino al raggiungimento di un valore soglia di pressione intravescicale Pmax tale da infondere nell organo un volume di soluzione decellularizzante sempre inferiore al volume di overstretching Il valore di pressione soglia viene determinato specificatamente per ciascun organo processato attraverso un test di cistometria pre decellularizzazione paragrafo 4 4 Inoltre si modificato il metodo utilizzato per lo svuotamento dell organo gestito nel nuovo 116 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici protocollo tramite 11 SW che invia alla pompa il segnale di inversione del verso di rotazione dei rulli in questa configurazione la aspirazione svuotamento dell organo viene interrotta nel momento in cui il sensore rileva il raggiungimento all interno dell organo di un valore di pressione Pmin pari a zero Tali modifiche del protocollo sono state possibili proprio grazie all integrazione del sistema di controllo il quale 1 consente di monitorare in tempo reale il valore della pressione nell organo 11 consente di sincronizzare il passaggio dalla fase di infusione a quella di aspirazione sulla base del valore di pressione rilevato dal sensore modalit limitazione in pressione e 111 consente di
175. one del comportamento biomeccanico della vescica decellularizzata il test volto a valutare le propriet di distensibilit ovvero la compliance dell organo Pertanto possibile definire la capacit dell organo ovvero il massimo volume di fluido che la vescica in grado di immagazzinare prima di giungere ad una condizione cosiddetta di overstretching Questa condizione caratterizzata da una sovrasollecitazione meccanica delle componenti strutturali della matrice dell organo che potrebbero portare ad un danneggiamento delle strutture e conseguentemente ad una perdita di funzionalit dal punto di vista biomeccanico La peculiare propriet della vescica di rispondere con un moderato incremento della pressione in risposta all immagazzinamento di grandi volumi di fluido fino al valore di overstretch infatti una propriet mediata anche dalle propriet meccaniche del tessuto Il test realizzato ha previsto quindi l infusione tramite una pompa comandata dal SW del sistema di controllo di un fluido all interno dell organo incannulato e il monitoraggio dell incremento di pressione acquisito tramite un sensore di pressione ad esso associato Inoltre l analisi della curva di cistometria curva della relazione pressione volume intravescicale P V dell organo effettuata sull organo nativo ovvero prima della decellularizzazione consente di estrarre alcuni parametri che verranno poi utilizzati nel protocollo di decellulari
176. passare dalla fase d interdizione a quella di saturazione La commutazione tra queste due fasi permette di aprire o chiudere il circuito L uscita digitale della scheda NI DAQ P1 2 39 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo fornisce un segnale TTL 0 5 V ed una corrente di 5 mA Questa uscita quindi collegata tramite la resistenza di guadagno potenziometro alla base del transistor mentre l emettitore del BJT collegato a massa Il collettore del BJT connesso ad uno dei due pin della bobina del rel mentre l altro pin della bobina del rel collegato alla tensione di alimentazione del rel fornita dal regolatore di tensione LM in Figura 2 7 che posto a monte del circuito per limitare la tensione fornita dall alimentatore integrato 12 V a quella di alimentazione del rel 10V Quando tramite il SW viene inviato un segnale alto 5 V TTL il transistor entra in fase di saturazione scorre quindi corrente nella bobina del rel che eccitandosi chiude il circuito di alimentazione dell elettrovalvola permettendone l alimentazione e quindi la commutazione tra un ramo e l altro del circuito Quando invece tramite SW viene dato un segnale basso alla base del transistor questo entra in fase di interdizione e apre il circuito Cos facendo non scorre corrente nella bobina del rel che non si eccita e ci non fa quindi chiudere il ramo dell alimentazione collegato all EV In questa
177. pitolo 2 63 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo due cicli while dedicati alla costruzione delle finestre di visualizzazione grafica ovvero il grafico del valore del volume infuso aspirato dalla pompa rispetto al tempo di avanzamento della stimolazione costruito sulla base dei parametri impostati dall utente pattern di stimolazione valori di portata durata delle varie fasi del ciclo ciclo while 3 in Figura 3 2 il grafico del valore della pressione acquisita dal sensore ed il grafico della pressione rispetto al volume ciclo while 4 in Figura 3 2 anche questi ultimi visualizzati in tempo reale rispetto al tempo di stimolazione il ciclo while adibito alle operazioni di post processing 5 in Figura 3 2 3 1 1 1 Ciclo Main Il ciclo Main 1 in Figura 3 2 il cuore del programma in quanto contiene le istruzioni necessarie per l esecuzione di tutte le funzioni relative all attuazione al monitoraggio e al controllo degli attuatori e all acquisizione dei segnali inviati dai sensori Il ciclo Main gestisce quindi l invio e la ricezione dei segnali verso da tutti 1 canali di input output I O della scheda NI DAQ A sua volta diviso in due sotto cicli ovvero il ciclo di controllo ed il ciclo di acquisizione 1A e 1B in Figura 3 2 Il primo dedicato alle operazioni di controllo e attuazione sia della pompa che dell elettrovalvola Il secondo dedicato all acquisizione del segnale di t
178. po del SW di cruciale Importanza in quanto permette di verificare in che termini il software soddisfi effettivamente le specifiche Il collaudo viene eseguito di norma utilizzando il SW per il controllo ed 11 monitoraggio della stimolazione di elementi paradigmatici ed in generale molto semplici la revisione del SW una volta effettuato il collaudo si procede alla revisione del programma per correggere gli eventuali errori riscontrati nella fase di verifica Inoltre in questa fase e solo dopo aver collaudato effettivamente il SW si pu decidere se introdurre nuove funzionalit o apportare modifiche a quelle gi implementate Questo processo di sviluppo SW valido in tutti 1 campi di applicazione non solo per SW di controllo impiegati nell ingegneria dei tessuti Di seguito sono descritte le particolari specifiche di progetto adottate per lo sviluppo del SW oggetto del presente progetto di tesi Il programma di controllo sviluppato deve prevedere il controllo degli attuatori volti alla stimolazione del tessuto organo cos da fornire gli stimoli che l utente ha impostato l acquisizione del segnale di pressione inviato dal sensore un interfaccia utente chiara e semplice user friendly cos da permettere l utilizzo del SW anche ad utenti non particolarmente esperti il controllo sui parametri di output della stimolazione pressione volume in grado di agire sul parametri di input del sistema stesso al fine di
179. primo campione trattato 8h 4h AAAA AAAA AAN Fase V f 12 Oh neg _ w Pressione imr PAIS P VV Pet VV VI 7 h 16 h Fi Il Fase FAVA _ T_ a Pressione fmm Ill Fase Pressione mmHg 0 10 minuti Figura 4 20 Curve della pressione nel tempo durante la decellularizzazione del campione 1 Si pu notare come il tracciato rimanga entro 1 valori soglia impostati 0 lt P lt 1 5 mmHg I tracciati sono suddivisi in base alla fase del processo di decellularizzazione a cui appartengono Le curve mostrano tracciati di pressione della durata di 10 minuti ogni 4 ore di stimolazione I tracciati di pressione sono suddivisi in base alla fase del processo di decellularizzazione in cui 119 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici sono stati acquisiti 8 ore con acqua deionizzata 8 ore con Triton X 100 e NH4OH e 1 ora di lavaggio con acqua delonizzata Per entrambi gli organi processati s1 osservato come per tutte le 17 ore della prova il valore di pressione sia rimasto sempre all interno del range desiderato 0 lt Py lt 1 5 mmHg e 0 lt Pg lt 5 mmHg ulteriore riprova del corretto funzionamento e della robustezza e della affidabilit garantite del sistema di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi Relativamente alla valutazione dell efficacia del protocollo di decel
180. programmazione LabVIEW 8 6 42 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo LabVIEW abbreviazione di Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench l ambiente di sviluppo software prodotto da National Instruments Austin TX USA Questo linguaggio di programmazione si distingue dagli altri C Java poich si basa su un approccio grafico viene infatti definito linguaggio grafico G Language Un programma e un sottoprogramma realizzato in LabVIEW sono chiamati rispettivamente VI Virtual Instrument e Sub VI e possono essere salvati in formato binario visualizzabile e compilabile solo tramite LabVIEW 26 Nella programmazione in LabVIEW le varie funzioni delle strutture dati matematiche logiche cicli condizionati sono rappresentate da icone e oggetti grafici ognuno dei quali possiede funzioni diverse e sono connesse tra loro tramite linee wire cos da formare un diagramma di flusso dei dati In LabVIEW infatti l ordine di esecuzione delle operazioni definita da queste connessioni che connettono monodirezionalmente il flusso di dati tra pi blocchi funzionali Dal momento che 1 dati possono anche scorrere in parallelo tra loro attraverso blocchi funzionali diversi uniti da differenti linee 11 linguaggio di programmazione gestisce autonomamente questa condizione attraverso una specifica funzione denominata multithreading 26 che permette di suddividere il carico di lavor
181. quisition Voltage Pump Out Acquisition 7 Figure 20 Diagram of the cycles that make up the control SW 1 main loop control loop 1A 1B acquisition cycle At the end of the optimization of the SW some arrangements are implemented in the SW Automatic control volume is tested with three different stimulation patterns that allowed us to verify the behavior of the SW of time considering different values minutes seconds and flow ul min ml min phases Figure 7 shows the layout for the configurations used for testing low flow high durations of the phases patterns of infusion aspiration rest IWR Cicli 1 4 Cicli 53 57 gt Volume ml 0 01 00 13 30 14 30 Tempo hh mm Figura 21 Track volume over time for configuration IWR Q 40 to 80 1 min I W t 10 5 minutes IW rest 10 seconds For the pressure limitation mode was tested the ability of SW to maintain the pattern of stimulation within a range of pressures v Abstract imposed 0 40 mmHg on a patch of latex housed in a perfusion chamber developed in a previous thesis work The stimulation pattern set for this testing involves a cycle IWR with flow rates of 5 ul min and 50 ul min respectively for the phase of infusion and withdraw Figure 9 shows the layout of the P t Cicli 1 3 Cicli 55 58 Cicli 125 128 E 9 t I i jf 4a Pressure mmHg A il b LL l Lf 00 16 05 00 05 16 11 00 11
182. r fasi precedenti o successive alla stimolazione come il riempimento del circuito o l eventuale ricambio del medium in caso di applicazioni di colture cellulari Inoltre pu essere utile durante le prove preliminari per determinare il set di parametri ottimali per la stimolazione che si vuole eseguire che verranno poi impostati nella modalit automatica 50 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo La direzione di rotazione dei rulli della pompa controllata dal comando Manual Stimulation Figura 2 14 A che permette di passare dalla fase di infusione a quella di aspirazione e viceversa Nell area C di Figura 2 14 l utente trova la possibilit di selezionare il valore della portata di infusione e di aspirazione separatamente in RPM o ml min Come detto settando la portata in ml min la velocit dei rulli della pompa si auto adatta al range di portate del sottopompa impostato nel pannello Settings Il blocco D Volume infuso per ciclo e pattern del ciclo del riquadro verde in Figura 2 14 non attivo in questa modalit e verr spiegato di seguito L ultimo blocco di questo pannello il blocco E dove sono integrati due diversi indicatori Il primo session time mostra da quanto tempo stata avviata la stimolazione un contatore che si attiva quando si preme Start e si ferma quando si preme Stop La seconda informazione visualizzabile relativa alla fase della stimolazione tramite tre led d
183. rano l andamento della pressione e del volume nel tempo e della pressione rispetto 11 volume Pannello 4 Post processing Questo pannello consente di eseguire un analisi statistica dei valori di pressione e volume registrati Nella sequenza delle operazioni logiche da eseguire l utente accede a questo pannello una volta che ha concluso la stimolazione Quindi questo pannello viene immediatamente dopo il pannello di controllo della stimolazione Pump Control Pannello 5 Advanced Settings Questo pannello dedicato solo ad utenti esperti possibile selezionare 1 canali di I O sulla scheda NI DAQ la frequenza e la modalit di acquisizione del segnale di pressione ed altri parametri che non riguardano direttamente 1 parametri della stimolazione 45 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 5 1 Il pannello Settings Il pannello Settings Figura 2 10 diviso sostanzialmente in tre aree Speed max 100 rpm S a 3 3 a sc sunt i 02500 04400 10200 11400 13000 14200 15200 16500 17500 Figura 2 10 Pannello Settings riquadro rosa selezione del diametro interno del sottopompa utilizzato riquadro verde soglie di pressione massima e minima relative alla stimolazione in limitazione di pressione riquadro azzurro area di conversione della portata da RPM a ml min Il primo parametro che l utente deve impostare il diametro del sottopompa utilizzato riq
184. ration Vol VIII 2005 Springer 375 Plunkett N and F J O Brien Bioreactors in tissue engineering Technol Health Care 2011 19 1 p 55 69 Martin I D Wendt and M Heberer The role of bioreactors in tissue engineering Trends Biotechnol 2004 22 2 p 80 6 Wendt D et al Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing Adv Mater 2009 21 32 33 p 3352 67 Bono N and L Casadonte Sviluppo di un sistema di coltura di segmenti di vena safena per lo studio ex vivo del vein graft disease in Tesi di Laurea Magistrale Dipartimento di Bioingnegeria 2012 Politecnico di Milano p 187 Atala A Engineering organs Curr Opin Biotechnol 2009 20 5 p 575 92 Consolo F et al Multilevel Experimental and Modelling Techniques for Bioartificial Scaffolds and Matrices in Scanning Probe Microscopy in Nanoscience and Nanotechnology B Bhushan Editor 2010 Springer Berlin Heidelberg p 425 486 Langer R and J P Vacanti Tissue engineering Science 1993 260 5110 p 920 6 Crapo P M T W Gilbert and S F Badylak An overview of tissue and whole organ decellularization processes Biomaterials 2011 32 12 p 3233 43 Sullivan D C et al Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high throughput system Biomaterials 2012 33 31 p 7756 64 Mantero S et al Fondamenti di Ingengeria dei Tessuti per la Medicina Rigenerativa ed I
185. rchitettura del SW Per far ci si sono ad esempio spostate fisicamente tutte le operazioni che riguardano l elaborazione delle finestre grafiche e il loro aggiornamento in cicli paralleli rispetto al ciclo principale Nell ambiente di programmazione LabVIEW l aggiornamento in tempo reale delle finestre grafiche richiede infatti risorse di calcolo elevate che comporterebbero quindi tempi di esecuzione del ciclo pi lunghi Inoltre si cercato di minimizzare l utilizzo delle variabili locali per non rallentare il ciclo principale a causa del passaggio dei dati memorizzati in una variabile locale contenuta in un ciclo ad una contenuta in un ciclo esterno parallelo Al termine dell ottimizzazione si riusciti a ridurre il tempo di esecuzione di un singolo passo del ciclo while di controllo ad un valore medio nell ordine dei 2 ms Al fine di garantire che il ciclo di controllo venga effettivamente eseguito sempre nell intervallo temporale desiderato si deciso di scalare aumentandolo di un fattore dieci il tempo di esecuzione stimato 2 ms assegnando quindi un valore di temporizzazione pari a 20 ms Si scelto questo valore in quanto si ritenuto essere accettabile per le applicazioni previste per l utilizzo del sistema di controllo anche alla luce della lista delle specifiche di progetto definite nel paragrafo 2 3 Infatti 20 ms un valore che permette un esecuzione comunque sufficientemente rapida delle operazioni di
186. re scheda NI DAQ della pressione tramite 1l software Il circuito analogo per 1 due sensori HW e PT mostrato in figura Al Figura Al Circuito di amplificazione sensore di pressione in figura viene mostrato il circuito per il sensore HW 130 APPENDICE A Il circuito composto da Amplificatore operazionale AD627 Analog Devices Inc Condensatore da 0 1 uF 104K63 Kemet dimensionato per evitare sovraccarichi di tensione che potrebbero danneggiare l amplificatore Potenziometro PTV09A Bourns permette di settare il valore della resistenza di guadagno Rg Cablaggio per ricevere il segnale del sensore ed inviare 1 dati acquisiti alla DAQ Cablaggio per l alimentazione del sensore Tra questi l elemento che determina l effettiva amplificazione della tensione emessa dal sensore l amplificatore operazionale AD627 il cui schema della piedinatura riportato in Figura A2 40 Figura A2 Schema della piedinatura dell AD627AN Pin 1 e 8 collegamento della resistenza di guadagno potenziometro Pin 2 e 3 ingresso del segnale acquisito dal sensore Pin 4 e 7 alimentazione dell amplificatore Pin 5 e 6 uscita del segnale amplificato da inviare alla DAQ Come descritto nel datasheet dell amplificatore 40 il guadagno Gamp dell integrato determina il valore di amplificazione del segnale che esso riceve in ingresso dal sensore secondo la relazione riportata nell equazione 1 Vou
187. reattore a perfusione per la proliferazione di cellule endoteliali su costrutti tubolari Un altro esempio di bioreattore a perfusione quello presentato da Shkilnyy at al nel 2011 16 In questo lavoro il gruppo di ricerca si concentrato maggiormente sull ottimizzazione del sistema di coltura ed in particolare ha implementato un controllo retroazionato sulle variabili biochimiche come la concentrazione di O2 e il pH Grazie a un software sviluppato in ambiente LabVIEW il sistema in grado di leggere in real time 1 valori di pH e pressione parziale di ossigeno del medium e tramite una retroazione agisce sulle portate dei gas CO e Oz che si mescolano nella camera di ossigenazione cos da mantenere costanti 1 valori impostati di pH e pO Il programma consente inoltre di monitorare e registrare altri parametri della coltura come la pressione ai capi del costrutto tubolare e la portata di medium che vi fluisce attraverso Uno schema di tutto il sistema di coltura riportato in Figura 1 10 24 Capitolo 1 Introduzione Legenda Direzione del Flusso Pompa Flussimetro Elemento pulsatile Camera di coltura 2 pH Camera di ossigenazione od Pr pe Filtro ae ni gt Porta di iniezione EATEN H Trasmettitore Bagnetto Sonda Camera di compliance oO J 5 I DQIQ Valvola a 4 vie l m C z Figura 1 10 Schema a blocchi del bioreattore a perfusione per la proliferazione di cellule endoteliali
188. regione comportamento non fisiologico di overstretching Tale regione della curva fa riferimento ad un comportamento non osservabile in vivo in quanto non fisiologico Infatti in vivo superato il valore V2 la contrazione delle cellule muscolari in risposta ad uno stimolo che giunge dal sistema nervoso attiva 11 meccanismo della minzione con conseguente svuotamento dell organo La curva di Figura 4 11 stata invece ottenuta incannulando la vescica e infondendo il fluido attraverso l uretra e al fine di impedire appunto lo svuotamento avendo preventivamente suturato gli ureteri si veda la descrizione del protocollo del test riportato nel paragrafo 4 5 2 106 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici 4 4 1 Protocollo di prova Le prove di cistometria sono state effettuate su due vesciche espiantate da conigli bianchi maschi di 6 mesi di vita prelevati dal macello Presso 11 Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie dell Universit degli Studi di Milano un equipe di veterinari ha provveduto all espianto degli organi dai due animali La prima vescica stata testata dopo circa 4 ore dall espianto mentre la seconda stata conservata in PBS a 4 C fino al momento della prova circa 96h per evitare la degradazione del tessuto L infusione del fluido acqua bi distillata all interno dell organo avviene attraverso l
189. richiamare ed eseguire 1 vari SubVI che rappresentano il secondo livello Figura 3 1 Livello 1 we Livello2 hi SubVI Figura 3 1 Struttura gerarchica del SW di controllo il SW suddiviso in 2 livelli il primo livello comprende il Main VI che gestisce i vari SubVI appartenenti al secondo livello In figura vengono schematizzati gli 8 SubVI utilizzati per l invio e l acquisizione dati tramite i canali di ingresso e uscita della scheda NI DAQ A il monitoraggio del segnale di pressione B l invio del comando di avvio arresto della pompa C l invio del comando di inversione del verso di rotazione della pompa infusione aspirazione D la regolazione della portata della pompa espressa in RPM E o in ml min F la registrazione dati in modalit automatica G o manuale H per le operazioni di postprocessing L interfaccia utente illustrata nel Paragrafo 2 5 costruita nel Main VI livello 1 in Figura 3 1 mentre 1 SubVI livello 2 in Figura 3 1 vengono eseguiti in background solo quando sono 61 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo richiamati dal VI principale L utente quindi non dovra mai interfacciarsi con 1 SubVI poich questi ultimi svolgeranno le loro operazioni attraverso una gestione diretta da parte del Main VI 3 1 1 Main VI In LabVIEW possibile tradurre i cicli condizionati if else while for tipici di altri linguaggi di programmazione C C tramit
190. rimozione di cataboliti Inoltre attuando una cultura priva di stimoli esterni siano essi meccanici o elettrici si potuto osservare come le cellule in alcuni casi andassero incontro a de differenziamento cellulare passando quindi dalla linea cellulare di interesse ad una indesiderata 2 nata dunque la necessit di impiegare sistemi di coltura pi complessi in grado di ricreare il pi fedelmente possibile le condizioni presenti in vivo Il campo di applicazione dei bioreattori inizialmente era limitato ad attivit nell ambito della ricerca scientifica di laboratorio In questa fase quindi le specifiche che il bioreattore deve necessariamente rispettare riguardano le modalit di semina cellulare sullo scaffold il condizionamento fisico e l ottimizzazione del trasporto di massa tralasciando altre specifiche In questa fase infatti non necessario soddisfare specifiche come ad esempio la riduzione dell ingombro del bioreattore o il rispetto di specifici criteri costruttivi per la sua industrializzazione 2 Questa fase dello sviluppo quindi maggiormente incentrata a ricreare le condizioni ottimali per la coltura e lo sviluppo del tessuto In questo stadio molte operazioni sono ancora soggette all intervento dell operatore e questo limita il grado di riproducibilit delle prove eseguite 11 Volendo quindi trasferire il processo di produzione di tessuti ingegnerizzati ad un livello diverso quello dell industrializzazione
191. ristaltic Pump ue e f pa x i B7 Figura 1 7 Schema del sistema di coltura stimolazione e controllo volto alla rigenerazione del legamento crociato anteriore In questo lavoro il sistema di controllo stato pensato per gestire l attuazione del motore stepper 1 in Figura 1 7 via software tramite un programma realizzato in ambiente di programmazione Visual Basic V 6 0 Consente all utente di impostare il pattern di stimolazione variando 1 parametri dello sforzo torsionale o monoassiale applicato modulo verso fase di rest e della sua durata frequenza numero di cicli 14 Il controllo della pompa peristaltica 2 in Figura 1 7 permette di scegliere tra varie modalit di pertusione per la semina cellulare garantendo portate comprese in un ampio range 0 25 25 ml min Grazie poi a quattro microcontrollori 4 in Figura 1 7 il sistema in grado tramite una retroazione di leggere il valore corrente di temperatura e attivare una termocoppia per mantenere la temperatura sempre al valore desiderato 37 C In questo progetto viene anche gestita e monitorata l ossigenazione e il valore di pH del medium Un flussimetro 3 in Figura 1 7 gestisce le singole portate dei gas azoto ossigeno anidride carbonica cos da ottenere la miscela con le concentrazioni appropriate all interno della camera Environmental Chamber di Figura 1 7 14 1 4 5 Bioreattore a perfusione I bioreattori a perfusione sono tra 1 pi diffusi
192. risultati di carattere biologico ottenuti si pu quindi evincere che le prove di permeabilit rappresentano un ulteriore conferma del fatto che a seguito del processo di decellularizzazione il tessuto urovescicale inizialmente impermeabile diventa fortemente permeabile a causa della rimozione delle cellule uroteliali e dell aumentata porosit della matrice che favorisce la filtrazione del fluido attraverso le sue pareti D altro canto la completa rimozione della componente cellulare dal tessuto un aspetto imprescindibile per l ottenimento di un patch impiantabile in vivo nell uomo paragrafo 1 1 1 Pertanto in previsione di un suo futuro impiego per interventi di cistoplastica si render necessario procedere alla ricellularizzazione ad esempio tramite cellule uroteliali o co cultura di cellule uroteliali e cellule muscolari del tessuto al fine di ridurne la permeabilit Si deve per notare come il valore di Kmedio del campioni decellularizzati con protocollo dinamico sia inferiore di oltre un ordine di grandezza rispetto al Kmedio del campioni decellularizzati con protocollo statico e molto pi vicino inoltre al valore del tessuto nativo 0 Il valore inferiore di K dei campioni decellularizzati per via dinamica indice di un grado di porosit minore rispetto ai campioni decellularizzati per via statica Questo spiegabile considerando che il protocollo dinamico riesce a preservare meglio le caratteristiche strutturali d
193. rtata di fluido tramite l invio dei segnali dal software SW alla pompa 11 monitorare in tempo reale l andamento della pressione che agisce sul patch stimolato 111 registrare 1 dati acquisiti e elaborarli al termine della prova 4 3 1 Protocollo di prova Le prove di permeabilit sono state condotte su patch di tessuto urovescicale decellularizzato provenienti da una precedente campagna di decellularizzazione condotta presso 1l uBS Lab sia con protocollo dinamico cicli di infusione aspirazione degli agenti decellularizzanti 1 dettagli del protocollo sono riportati nel paragrafo 4 5 che statico incubazione della vescica riempita con un volume pari a 20 ml di soluzione decellularizzante in un reservoir contenente la stessa soluzione 36 I campioni sono stati poi opportunamente conservati fino al momento delle prove attraverso criopreservazione alla temperatura di 80 C I campioni sono stati congelati in medium di coltura DMEM Sigma Aldrich con aggiunta di soluzione DMSO 15 per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio all interno del tessuto che potrebbero danneggiarlo dal punto di vista strutturale al momento dello scongelamento 37 Una volta scongelati 1 campioni sono stati estratti dal congelatore ed immersi in un bagno termostatato con temperatura di 40 C per 10 min 1 campioni sono stati lavati con soluzione fisiologica per eliminare 1 residui di medium e di DMSO 37 Successivamente da ciascun patch sono sta
194. se di calcolo richieste per l analisi e la post elaborazione dei dati in questo modo si evita di rallentare il ciclo principale del programma e si garantisce che venga effettivamente eseguito ogni 20ms Il ciclo di Post Processing stato temporizzato in modo tale da essere eseguito ogni 200 ms 3 1 2 SubVI Analogamente agli ambienti di programmazione testuali tradizionali l ambiente LabVIEW permette di creare dei sottoprogrammi detti SubVI che solo quando richiamati dal VI principale svolgono specifici pacchetti di operazioni I SubVI contengono quindi dei cicli che potrebbero essere definiti come cicli silenti ovvero attivati ed eseguiti solo quando effettivamente necessario durante l esecuzione del programma L utilizzo dei SubVI permette di suddividere in diversi blocchi funzionali 1 diversi sottoprogrammi Tale soluzione progettuale consente quindi di evitare di annidare diversi cicli uno dentro l altro o di concatenare in serie 1l flusso di diversi dati che sono in realt tra loro indipendenti fino a rendere estremamente complesso e dispendioso dal punto di vista delle risorse richieste al PC il flusso di dati gestito dal Main VI e quindi in definitiva in modo da non rallentare inutilmente la temporizzazione del Main VI Inoltre aspetto non trascurabile rispetto alle specifiche definite per il sistema di controllo l utilizzo dei SubVI rende pi immediata la modifica di singole parti del SW qualora si renda necess
195. sensor Therefore a further advantage of this system Abstract is to be able to integrate into a single set up both the cystometry test and decellularization test where the test of cystometry pre decellularization is functional to the test of decellularization same This entails a reduction in the times of the tests In all applications the control system developed has proved suitable and reliable In two cases measure of for tests compliance of a vessel and protocol decellularization of the bladder also made in the substantial improvements performance of the test and the protocol applied Discussion In this thesis all the objective and specifications are reached From the point of view of the objective HW achieved was possible to optimize the more the control system from the point of view footprint as well as ensuring the reliability of the system realized As regards the SW have met the specifications described in the Specifications section control SW In particular the actuators are controlled with a good degree of accuracy and is able to integrate the signals of volume and pressure acquired as control variables and limitation of stimulation This last feature has resulted in the two modes of automatic control control limitation The volume and pressure VII software also allows to monitor in real time the parameters of the stimulation and record the values of pressure and volume so that they c
196. sincronizzare la commutazione dell EV e quindi abilitare la linea di infusione o la linea di scarico con l istante del passaggio tra la fase di aspirazione e quella di infusione Impostando la stimolazione via SW in limitazione di pressione possiamo quindi fissare il range di pressioni entro cui effettuare la decellularizzazione il controllo del processo non pi quindi basato su un valore di volume infuso teorico ma su un valore di pressione rilevato in tempo reale tramite 1l SW e specifico per il campione processato 4 5 3 Risultati sperimentali Sono state effettuate due differenti prove di decellularizzazione con il nuovo protocollo mantenendo inalterata la durata complessiva del processo 17ore e delle 3 fasi 8 8 1 ore paragrafo 1 1 2 e le soluzioni decellularizzanti acqua deionizzata e 1 Triton X 100 0 1 NH40OH Per ciascun campione si proceduto ad effettuare la prova di cistometria pre decellularizzazione le curve P V registrate sono riportata in Figura 4 19 117 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Cistometria pre decellularizzazione Campione 1 4 E a 2 3 2 S Pmax gt 0 0 2 4 6 8 Volume ml Cistometria pre decellularizzazione Campione 2 i 6 Pmax _T E 4 5 2 0 0 2 4 6 8 10 Volume ml Figura 4 19 Curve P V pre decellularizzazione del campione 1 e del
197. sire il segnale di tensione impostando pero manualmente la portata tramite 1 comandi sul display della pompa La Tabella 3 2 descrive il cablaggio effettuato per interfacciare la pompa con la scheda NI DAQ Porta a 15 Pin DAQ NI USB 6211 Funzione associata Pin Tipo di canale morsetto Ground 1 2 AI GND 28 Start Stop 3 AI GND 28 Speed out 9 AI0 15 Tabella 3 2 Tabella riassuntiva delle connessioni dei 4 pin della porta analogica della pompa cablati sulla scheda DAQ USB 6211 82 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Al termine di questa fase si proceduto poi ad acquisire nuovamente la tensione in uscita dalla pompa ma comandando la pompa via SW ovvero imponendo via SW diversi valori di portata in RPM Questa acquisizione stata fatta tramite il cablaggio illustrato nel paragrafo 2 2 1 1 Ci si aspetterebbe che 1 valori di tensione acquisiti comandando la pompa via SW siano uguali a quelli registrati comandandola via display poich la calibrazione del SW stata fatta proprio sulla base dei valori acquisiti dalla pompa comandandola da display Dall analisi dei dati si evidenzia invece una discrepanza tra 1 valori di tensione ottenuti comandando la pompa da display e da SW In Tabella 3 3 sono riportati 1 valori di tensione acquisiti nelle due modalit Tensione acquisita Portata i Differenza impostata RPM Controllo via display V Omen VI Display SW V V 0 0
198. siti comandando la pompa via SW e letti sul display Analizzando 1 risultati e 1 valori di intercetta utilizzati per ogni singolo valore di portata impostato si pensato di individuare due valori di intercetta q medio in Tabella 3 4 il primo che ottimizzasse la calibrazione nell intervallo di portate tra 0 e 33 RPM ed un secondo nell intervallo tra 33 e 100 RPM Questi due valori di intercetta sono stati poi implementati nel SW che quindi in grado di impiegare l uno o l altro a seconda del valore di RPM impostato dall utente Da questa analisi s1 notato inoltre che l incremento minimo rilevabile dalla pompa impostando la portata via SW pari 0 5 RPM 3 4 2 Calibrazione della portata espressa in ml min Si proceduto a calibrare il valore di portata espresso in ml min rispetto al valore di tensione erogato dal motore della pompa per consentire all utente che utilizza 11 SW di impostare la portata in ml min Per far ci tramite il menu della pompa manualmente tramite display si impostato il diametro interno del sottopompa impiegato tramite men della pompa si selezionata la modalit di indicazione della portata in ml min comandando la pompa via SW si sono impostate diverse portate in RPM utilizzando la retta di calibrazione descritta nel paragrafo 3 4 1 tramite il display della pompa si letto il valore di portata in ml min corrispondente al valore impostato via SW in RPM
199. st in base al valore della variabile di controllo viene abilitata la corrispondente finestra del case e di conseguenza vengono eseguite le specifiche operazioni in essa contenute rappresentato da un rettangolo bianco e nero dove la variabile di controllo indicata da un rettangolo azzurro variabile numerica o da un rettangolo rosa variabile stringa MC in Figura 3 2 Nel SW sviluppato nel presente progetto di tesi 11 VI principale gestisce l esecuzione delle operazioni contenute in 7 differenti cicli while come schematizzato in Figura 3 2 62 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Volume Cycle F P V Cycle 9 Post Processing Cycle _ Pressure Acquisition Voltage Pump Out Acquisition Pressure Sensor Voltage Supply Property Node Cycle Figura 3 2 Schema della architettura dei cicli che compongono il SW di controllo esso composto da 7 cicli while 1 5 e 1A 1B un case true false TF ed un case multiplo MC tra loro opportunamente interconnessi Nel dettaglio il ciclo while Main 1 in Figura 3 2 contiene ed abilita disabilita l esecuzione del ciclo while di controllo degli attuatori 1A in Figura 3 2 e del ciclo while di acquisizione dati 1B in Figura 3 2 nel ciclo while Property Node 2 in Figura 3 2 sono definiti gli attributi e le propriet dei controlli e degli indicatori dell interfaccia utente descritta nel ca
200. st 3 ta Sti Hi Lo rd a Di e 3 3 Pattern Time 3 T Infusion i T Rest T Withdraw ony i wa eR et ASAN pe z 3 f be I s za 9 DI G A L D j t i E MaA AAA AAAA AAA Aa H I irection DAQ mx f EUT s DIREC ye 3 qa gt TION t l 3 Digital Output usi TITO TITTI VOLTO Figura 3 4 Architettura della funzione controllo in volume in modalit automatica vengono evidenziati il pattern di stimolazione impostato dall utente 1 il contatore utilizzato per il controllo della durata delle fasi 2 1 valori della durata delle fasi impostati 3 le operazioni svolte per la determinazione del passaggio da una fase della stimolazione alla fase successiva riquadri azzurri Il passaggio da una fase ad un altra gestito tramite un contatore 2 in Figura 3 4 il cui valore viene confrontato riquadri azzurri di Figura 3 4 con il tempo di durata impostato dall utente per ciascuna fase del pattern 3 in Figura 3 4 Quando il valore del contatore maggiore della durata impostata per la specifica fase in cui ci si trova in quell istante 11 SW invia un segnale al SubVI Direction Pump D in Figura 3 1 che determina il passaggio alla fase successiva nel caso di passaggio tra Infusion Withdraw e viceversa invertendo la direzione di rotazione dei rulli o al 69 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo SubVI Start Stop C in Figura 3 1 che consente
201. t Gamp X Vin 4 Dall equazione 1 si ricava quindi che il valore di Gamp per i due sensori pari a Eq 2 10V Gamp Hw 167 mV 598 5 10V GamP PT 16 7 mV TV 678 131 APPENDICE A L equazione 3 40 consente quindi di determinare il valore di Rg da settare attraverso il potenziometro per ottenere il guadagno desiderato per 1 due sensori Rg 200 KO x Gamp 5 6 Dall Eq 3 si ricava dunque che Rg yw 337 Q e Rg pr 297 Q In figura A3 viene schematizzata la relazione tra la pressione acquisita dal sensore e il valore di tensione ad essa associata erogato tramite il circuito di amplificazione Relazione pressione acquisita dal sensore tesnione associata erogata dal sensore 12 cS Q 0 1934x A 0 04x CS 8 S a 2 3 E gt 4 Honeywell Pendotech DO 2 S Oe 5 0 50 100 150 200 250 300 z Range pressione acquisita dal sensore di pressione mmHg Figura 0 13 Relazione tra il segnale di pressione mmHg acquisito dal sensore ed il valore ad esso associato della tensione V erogata dal sensore tramite il circuito di amplificazione Il coefficiente angolare della retta del grafico in figura A3 rappresenta la risoluzione p del sensore di pressione amplificato Eq 4 10 V a mmHg 10 V pa Sci mmHg nh mmHg 0 193 7 mmHg 132 APPENDICE A Procedendo poi al calcolo della risoluzione della scheda NI DAQ ppag Eq 5 pari al rapporto
202. tare 1 parametri di stimolazione far partire la prova monitorare l andamento della stessa ed elaborare 1 dati ottenuti ai ati asian cos omo 0570 10200 1140 13000 1420 15200 16500 17500 Figura 2 9 Interfaccia utente del SW dettaglio dei cinque pannelli presenti Settings 1 Acquistion 2 Control Pump 3 Post Processing 4 Advanced Settings 5 44 il iil IV Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo Pannello 1 Settings In questo pannello l utente imposta alcuni parametri della stimolazione come il diametro del sottopompa o la soglia massima e minima nel caso di stimolazione in limitazione di pressione Questi sono 1 primi parametri da definire in quanto non andranno pi variati una volta definito il protocollo di stimolazione della campagna sperimentale Pannello 2 Acquisition Questo pannello dedicato alla calibrazione del sensore Infatti prima di iniziare un qualsiasi tipo di prova necessario calibrare il sensore di pressione ovvero convertire il segnale di tensione Volt che esso genera in un segnale di pressione Pa mmHg bar Pannello 3 Control Pump il pannello principale del SW l utente imposta la modalit di controllo manuale controllo in volume limitata in pressione il pattern di stimolazione ed 1 suoi parametri sequenza portate e durata di ciascuna fase Vi sono pol le finestre grafiche che most
203. tata di infusione pari a 5 uI min e portata di aspirazione pari a 50 ul min Le soglie di controllo della pressione impostate sono pari a 0 soglia minima e 40 mmHg soglia massima che definiscono quindi 1l range di pressione con cui si vuole stimolare 1l patch Come si pu osservare in Figura 3 12 che riporta l andamento della pressione nel tempo per tutta la durata della stimolazione il valore di pressione si mantenuto all interno del range desiderato 0 40 mmHg senza derive del segnale di pressione Cicli 1 3 Cicli 55 58 Cicli 125 128 40 J 0 L Ei u j 0 00 16 05 00 05 16 11 00 11 16 Pressure mmHg Tempo hh mm Figura 3 12 Tracciato delle curve di pressione rispetto al tempo in modalit automatica in limitazione di pressione ricavate dalla prova di collaudo del SW con il bioreattore a perfusione e patch di lattice 80 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo A valle di questo collaudo non stato quindi necessario apportare alcuna modifica all architettura del SW per questa modalit di controllo 3 3 Temporizzazione del ciclo di controllo Come anticipato nel paragrafo 3 1 1 1 11 ciclo while di controllo 1A in Figura 3 2 eseguito ad intervalli temporali pari a 20 ms Questa scelta stata fatta in base al monitoraggio del tempo effettivo di esecuzione del ciclo Si innanzitutto provveduto all ottimizzazione dell a
204. tatale degli Studi di Milano nel presente lavoro di tesi si proceduto ad integrare il sistema di controllo in un set up sperimentale volto alla decellularizzazione di un organo intero nello specifico la vescica del modello animale del coniglio 36 In applicazioni di medicina rigenerativa della vescica la matrice di vescica decellularizzata bladder acellular matrix BAM si dimostrata essere una valida alternativa come sostituto di porzioni di tessuto nativo affetto da patologia rispetto alle tecniche di medicina tradizionale L aspetto pi innovativo del protocollo proposto per la decellularizzazione dell organo intero l utilizzo di un sistema che consente di realizzare una decellularizzazione 112 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici dinamica della vescica basata su un protocollo di decellularizzazione chimico fisico che consiste nell applicazione di cicli ripetuti di infusione all interno dell organo e successiva aspirazione delle soluzioni contenenti gli agenti decellularizzanti Tale approccio non innovativo rispetto 1 metodi ad oggi presentati in letteratura la maggior parte dei protocolli di decellularizzazione della vescica basato infatti sulla incubazione statica dell organo ovvero l immersione della vescica all interno delle soluzioni decellularizzanti 38 39 La natura dinamica del processo c
205. te e qualitativamente la differenza tra 1 valori di tensione acquisiti comandando la pompa nelle due diverse modalit Sulla base di questi dati si proceduto quindi a correggere la retta di calibrazione da implementare nel SW modificando il valore dell intercetta di un valore pari alla met del valore della differenza calcolata Si utilizzato la meta del valore della differenza poich mentre il segnale di tensione acquisito nel range 0 10 V il segnale di tensione con cui si varia la portata della pompa varia tra 0 5 V Si quindi verificato che la retta di calibrazione modificata garantisse una corrispondenza tra la portata in RPM impostata via SW e la portata in RPM letta sul display della pompa utilizzando come valori di intercetta quelli indicati in Tabella 3 4 Portata impostata Indicazione Intercetta retta via software RPM display pompa di calibrazione J RPM V l 0 0 4 0 04905 3 2 9 0 08826 5 5 0 07984 7 5 7 5 0 08657 10 10 0 08128 2 20 0 08644 __ q medio range 0 33 0 08448 50 50 0 07705 80 80 0 06252 90 90 0 06740 95 95 0 06611 100 100 0 05544 _q medio range 33 100 0 06827 _ Tabella 3 4 Confronto tra valori impostati via SW e valori letti sul display della pompa in base al valore di intercetta modificato nella retta di calibrazione 84 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo Si pu osservare come ci sia ora una buona corrispondenza tra 1 valori acqui
206. tessuto o sugli organi stimolati all interno della camera di coltura in tempo reale In questo progetto di tesi sono stati utilizzati due differenti modelli di sensori di pressione in funzione delle specifiche condizioni sperimentali delle prove effettuate Entrambi 1 sensori sono di tipo flow through e sono quindi integrabili in serie nel circuito idraulico senza dover ricavare diramazioni per la lettura del segnale di pressione in derivazione I sensori Impiegati sono 35 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo i il sensore Pendotech Press S 000 Figura 2 5 A viene impiegato quando le condizioni sperimentali richiedono di monitorare valori di pressioni relativamente elevati fino a 250 mmHg 21 11 il sensore della Honeywell 26PCA Figura 2 5 B consente di acquisire pressioni in un range minore 0 50 mmHg 22 ma ha una risoluzione maggiore rispetto al sensore della Pendotech per 1 calcoli si veda l appendice A Figura 2 5 Sensore Pendotech Press S 000 A Sensore Honeywell 26PCA B I sensori sono connessi alla scheda NI DAQ USB 6211 tramite un circuito di amplificazione dimensionato al fine di associare 11 segnale di tensione massimo inviato dal sensore di pressione dell ordine delle poche decine di mV 16 7 mV per il sensore Honeywell 26PCA e 14 75 mV per il sensore Pendotech Press S 000 al valore massimo acquisibile dalla scheda NI DAQ 10 V In tal modo si sfrutta tutto l intervallo
207. ti estratti del provini circolari del diametro di circa 8 mm ovvero della dimensione adatta per poter essere alloggiati 97 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici all interno della bioreattore a perfusione utilizzato 27 35 descritto nel paragrafo 3 2 3 e sottoposti a test di permeabilita Come detto il protocollo delle prove di permeabilit stato mutuato da un precedente lavoro di tesi 35 condotto presso il uBS Lab L obiettivo della prova quindi quello di monitorare la pressione che si genera a cavallo del patch in risposta ad una costante infusione di fluido erogato dalla pompa volumetrica Il set up realizzato mostrato in Figura 4 5 Figura 4 5 Set up sperimentale per i test di permeabilit su patch di tessuto di vescica decellularizzata Sono evidenti reservoir pompa volumetrica scheda NI DAQ sensore di pressione bioreattore a perfusione PC con il SW di controllo Il sistema composto da una pompa peristaltica IPCN 12 Ismatec utilizzate per infondere il fluido all interno della camera e stimolare in pressione 11 patch di vescica La pompa controllata via SW come descritto nel capitolo 2 un sensore di pressione di tipo flow through Pendotech Press S 000 comprensivo del suo circuito di amplificazione paragrafo 2 2 2 connessi tramite scheda NI DAQ USB 6211 al PC su cui viene eseguito
208. tive Medicine S Stem cells Electrical embryonic V A AAA MP PPP AP PADIS CRE Co culture of cells Mechanical Figura 1 1 L interazione tra componente biologica biomateriali e stimoli indotti dal bioreattore costituiscono la base dell ingegneria dei tessuti 11 Capitolo 1 Introduzione Brevemente vengono descritti 1 tre elementi principali dell ingegneria dei tessuti Le cellule impiegate possono essere di diversa provenienza Autologhe prelevate dallo stesso individuo su cui sar eseguito l impianto Questo tipo di cellule abbatte drasticamente 1 problemi di rigetto e di trasmissione di malattie Allogeniche provenienti da un donatore della stessa specie Xenogeniche ottenute da un donatore di un altra specie origine animale Inoltre si pu fare una distinzione in funzione dello stato di differenziamento delle cellule Primarie cellule differenziate che hanno quindi una funzione ben definita cellule muscolari nervose epiteliali Staminali cellule indifferenziate che hanno la capacit maturando sotto opportune condizioni fisico chimiche di differenziare in cellule specializzate di vario tipo Possono essere impiegate cellule di tessuti fluidi come il sangue o di tessuti solidi come la pelle Nel primo caso vengono usati metodi come la centrifugazione o l aferesi per separare le cellule di interesse dalle altre componenti Per quanto riguarda invece le cellule di tessuti so
209. torna dopo la rimozione di una sollecitazione esterna in questo caso la pressione Imposta Esiste per una condizione di omeostasi nella quale 11 tessuto raggiunge una condizione di equilibrio meccanico e biochimico questa condizione si raggiunge caricando il campione ciclicamente precondizionamento 30 Prima di procedere con la prova quindi necessario riportarsi in questa condizione per ottenere risultati ripetibili Il precondizionamento del vaso stato realizzato imponendo una portata di infusione pari a 0 02 ml min fino al raggiungimento di un valore di pressione interna al vaso pari a 10 mmHg seguita da una fase di aspirazione del fluido precedentemente infuso con una portata di 0 02 ml min fino al raggiungimento di un valore di pressione nulla all interno del vaso Tra un ciclo di precondizionamento ed il successivo si atteso un tempo pari a 5 min in cui il vaso stato mantenuto a pressione interna nulla fase di recovery La fase di rest funzionale a far si che 1l 93 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici valore della pressione acquisita dal sensore si assesti effettivamente al valore di 0 mmHg al fine di non falsare l acquisizione del dato nella successiva fase di infusione Al termine della fase di precondizionamento dopo ulteriori 5 min in cui il vaso stato mantenuto in condizione di pressione interna nulla so
210. tput analogico Per la porta analogica della pompa sono indicati i pin cablati con la scheda NI DAQ il pin 1 e 2 della pompa sono cortocircuitati tra di loro e connessi ad un morsetto di ground della scheda NI DAQ D GND in Figura 2 4 in modo da attivare il controllo remoto della pompa tramite porta analogica il pin 3 che permette 11 controllo sullo Start e sullo Stop della pompa gestito tramite un canale digitale che fornisce un segnale di tipo alto basso cablato con il morsetto P1 0 della scheda NI DAQ Figura 2 4 corrispondente a un canale di output digitale il pin 4 consente di invertire il verso di rotazione della pompa per passare da una fase di infusione ad una di aspirazione e viceversa Come 1l pin 3 controllato da un canale digitale e perci collegato ad un altro canale di output digitale morsetto P1 1 di Figura 2 4 della scheda NI DAQ il pin 5 consente di variare la portata impostata della pompa collegato a un canale di output analogico della scheda NI DAQ morsetto AO 0 di Figura 2 4 settato per erogare una tensione tra 0 e 5 V Questa tensione inviata alla pompa si traduce in una variazione di velocit dei rulli tra 0 11 e 11 25 RPM 19 con incrementi minimi dello 0 4 e quindi in una variazione della portata impostata 34 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo il pin 9 un pin di output della pompa tramite 11 quale si in grado di acquisire il valore di tens
211. tro interno del sottopompa 4 pattern di stimolazione 5 fase della stimolazione corrente 6 finestra grafica del volume nel tempo 7 indicatore numerico del volume in tempo reale 8 Per consentire 11 monitoraggio del valore di volume 11 SW esegue le seguenti operazioni 1 attraverso la scheda NI DAQ il SW acquisisce il valore di tensione Volt Speed Out 1 in Figura 3 5B erogata dal motore della pompa per garantire la portata richiesta dall utente Tale valore acquisito nel ciclo di acquisizione Figura 3 5B viene passato tramite una variabile locale 2 in Figura 3 5A al ciclo parallelo di controllo Figura 3 5A 70 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 2 nel ciclo parallelo di controllo il valore di tensione Volt Speed Out viene convertito in un valore di portata A seconda che l utente imposti la portata in RPM o ml min 3 in Figura 3 5A il SW attiva la finestra del case vero falso corrispondente per abilitare la procedura di calibrazione descritta nel paragrafo 3 4 Se come in Figura 3 5A attiva la modalit ml min la variabile che definisce il diametro interno del sottopompa 4 in Figura 3 5A agisce su un case multiplo per abilitare la corretta conversione da volt a ml min per il sottopompa impostato 3 il valore della portata viene quindi integrato nel tempo in funzione del pattern di stimolazione scelto 5 in Figura 3 5A e della fase di stimolazione attiva in quel momento 6 in Fi
212. trollo dei pannelli grafici che mostrano l andamento della pressione in funzione del volume l utente pu monitorare in tempo reale l output della prova e qualora necessario correggere alcuni parametri impostati precedentemente quali il valore della portata di infusione nel caso in cui si accorgesse che questi ultimi non sono adatti allo specifico organo testato Infatti 11 valore di portata di infusione impostato 1 ml min stato scelto sulla base di precedenti prove effettuate dai ricercatori del uBS Lab ma stimato sulla base di un analisi statistica effettuata su un certo numero di organi Ovviamente per a causa 111 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici dell intrinseca variabilita di comportamento tra differenti campioni biologici questo valore potrebbe non essere il pi adeguato per tutti gli organi In questo caso quindi l utilizzo del SW di controllo ed in particolare la possibilit di monitorare l output delle prove in tempo reale consente di definire un protocollo di prova specifico per ciascun campione Nel caso della cistometria pre decellularizzazione il monitoraggio della stimolazione tramite 11 SW ha inoltre permesso di valutare il range di pressioni entro cui sollecitare l organo durante il processo di decellularizzazione per mantenere la stimolazione in un range di pressioni fisiologico V lt Vo in
213. trollo sul tempo permette di uscire da situazioni di stallo se ad esempio ad un certo punto della stimolazione il tessuto non riuscisse pi a raggiungere il valore di pressione desiderato perch sono variate le sue propriet meccaniche si pensi alla stimolazione di patch di tessuto ricellularizzato in cui col procedere della stimolazione le cellule secernono proteine di matrice che vanno a modificare le propriet del costrutto stesso si potrebbe rischiare di rimanere sempre in fase di infusione provocando ad esempio l eccessivo riempimento della camera in cui alloggiato il tessuto organo e quindi il danneggiamento del costrutto stimolato In questa modalit perde significato l indicatore del volume infuso aspirato per ciclo blocco D di Figura 2 16 in quanto non possibile a priori sapere quanto volume dovr essere infuso aspirato per 53 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo raggiungere le soglie di pressione impostate e inoltre non detto che serva lo stesso volume in ogni ciclo poich la risposta dei tessuti biologici non sempre lineare e come accennato non rimane costante nel tempo Anche in questo caso l architettura che sta dietro a questa modalit di funzionamento del programma verr illustrata nel capitolo 3 2 5 3 2 Area monitoraggio stimolazione In quest area del pannello di controllo riquadro viola di Figura 2 13 sono disposti i grafici che mostrano l andamento i
214. uadro rosa di Figura 2 10 Infatti 11 SW utilizza per ogni diametro del sottopompa opportune curve di calibrazione che consentono di convertire il valore della portata impostata dall utente in un segnale di tensione che va ad agire sul motore della pompa determinando la velocit di rotazione dei rulli e quindi il volume di fluido erogato L altro set di parametri che l utente deve impostare in questo pannello quello riguardante la stimolazione limitata in pressione riquadro verde di Figura 2 10 Come sar descritto pi approfonditamente nel paragrafo 2 5 3 1 3 la modalit limitata in pressione richiede di impostare alcuni parametri il valore di soglia minimo del range di pressioni il valore di soglia massimo del range di pressioni il tempo oltre soglia ossia il tempo minimo per cui il valore della pressione deve mantenersi oltre la soglia impostata prima di attivare l effettivo cambio fase il valore di pressione massima valore di sicurezza che se raggiunto provoca l arresto immediato della pompa Il pannello Settings offre poi all utente un area riquadro azzurro di Figura 2 10 dedicata alla conversione tra 1 due parametri di controllo sulla velocit dei rulli che l utente ha a disposizione 46 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo portata in RPM e ml min E presente una tabella riassuntiva che riporta 1 sottopompa disponibili e 1 loro rispettivi range di port
215. uate le prove infondendo per 5 min il liquido cos da per poter apprezzare una variazione del peso maggiore della risoluzione della bilancia 0 01g controllando la portata in RPM Per il sottopompa con diametro di 1 02 mm la durata dell infusione stata di 3 minuti imponendo una portata in ml min Per ogni prova si impostato un valore di portata costante in RPM o ml min e si misurato al termine della prova la variazione di peso I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 3 5 86 Capitolo 3 Architettura e collaudo del software di controllo 0 25 mm 1 02 mm Peso misurato g l Portata Controllo Controllo Differenza Portata Controllo Controllo Differenza impostata via Display impostata via i Display RPM display 2 SW SW slug Tei SW 0 0141 0 05 0 01 0 04 3 0 0423 0 11 0 11 0 5 0 02 0 03 0 01 0 0705 0 23 0 23 0 7 5 0 05 0 05 0 0 10575 0 32 0 32 0 10 0 06 0 06 0 0 141 0 46 0 45 0 01 20 0 14 0 14 0 0 282 0 9 0 91 0 01 50 0 36 0 35 0 01 0 705 2 29 2 28 0 01 80 0 58 0 56 0 02 1 128 3 67 3 66 0 01 90 0 65 0 63 0 02 1 269 4 14 4 12 0 02 95 0 67 0 66 0 01 1 3395 4 35 4 36 0 01 100 0 71 0 7 0 01 1 41 4 59 4 58 0 01 Tabella 3 5 Risultati della misura del peso del volume erogato dalla pompa nelle due diverse modalit di controllo display e SW Dall analisi dei dati si pu affermare che la differenza calcolata nelle due diverse modalit pu essere ritenuta trascurabile ai fini dell
216. ui parametri di stimolazione meccanica della coltura Figura 1 6 Bioreattore a compressione volto alla rigenerazione di tessuto cartilagineo 1 4 4 Strain bioreactor Questi bioreattori sono caratterizzati dalla capacit di applicare uno sforzo e quindi una deformazione al tessuto ingegnerizzato Sono principalmente utilizzati per tessuti come muscoli tendini legamenti ossa o cartilagine poich la deformazione provocata dallo sforzo applicato sullo scaffold consente di replicare la sollecitazione che il tessuto ha in vivo 2 In uno studio condotto da Altman et al 14 si mette in evidenza come un bioreattore che riesca a garantire uno sforzo meccanico su una matrice seminata con cellule stromali umane del midollo osseo human bone marrow stromal cell hBMSC possa favorire le rigenerazione del legamento crociato anteriore Il sistema composto da una camera di coltura dove posta la matrice una camera adibita allo scambio dei gas per controllare l ossigenazione del medium e il valore di pH una pompa peristaltica multicanale per il ricircolo del medium un sistema per il controllo della temperatura e un sottosistema per il controllo della stimolazione meccanica Figura 1 7 21 Capitolo 1 Introduzione A Il Tension jan a 4 E___ EA __ Torsion C O a i rr Perfusion Flow Sheath Flow Environmental Chamber Reactor Fi ee S p _ Fi Hoat Blocks Matrix peal Pe
217. ura 2 13 l utente imposta tutti 1 parametri della stimolazione Prima di tutto l utente sceglie la modalit di controllo tra le tre che il software mette a disposizione 1 stimolazione in controllo di volume in modalit manuale 11 controllo in volume in modalit automatica e 111 stimolazione in limitazione di pressione in modalit automatica Descrivendo le modalit qui di seguito andiamo ad evidenziare anche 1 controlli presenti nell area di stimolazione 2 5 3 1 1 Controllo in volume modalit manuale In questa modalit Operation Mode Manual in Figura 2 14 A l utente controlla manualmente tutti e tre 1 parametri di controllo delle pompa Start Stop verso di rotazione portata impostata in ml min o RPM Pressure Limitation timuation Fatte Withdraw Volume per Cycle ori i 06 ml 00 05 00 i 0 376 if 0 376 TF Rest Pattern Time 0 3 0 3 100 02 00 00 10 00 gaze Sa be 0 2 Session Time Cycles 1 0 1 Infusion Withdraw Rest Q Q E Figura 2 14 Area di stimolazione modalit manuale suddivisa in 5 blocchi A E In questa modalit non sono presenti cicli preimpostati o controlli sulla pressione Pressure Limitation Off Infatti quando l utente seleziona la modalit manuale 1 controlli per la selezione del pattern di stimolazione e le durate delle relative fasi si disattivano automaticamente Figura 2 14 B la modalit pi semplice delle tre implementate ed pensata pe
218. ura della compliance della vena safena Sono messi in evidenza la pompa volumetrica la scheda NI DAQ l alimentatore da banco che fornisce la tensione di alimentazione al sensore di pressione il sensore di pressione la camera di coltura ed il PC su cui viene eseguito il SW di controllo Il set up composto da una pompa peristaltica IPCN 12 Ismatec in grado di infondere il vaso con una portata costante La pompa controllata via SW come descritto nel capitolo 2 un sensore di pressione di tipo flow through Pendotech Press S 000 e il suo circuito di amplificazione paragrafo 2 2 2 connessi tramite scheda NI DAQ USB 6211 al PC su cui viene eseguito il SW di controllo Il sensore permette 11 monitoraggio in tempo reale del valore di pressione all interno del vaso in risposta all incremento del suo volume interno durante l infusione del fluido processato dalla pompa un alimentatore da banco che consente di alimentare il sensore di pressione al momento della prova non era ancora stato realizzato il sistema miniaturizzato di alimentazione del sensore Pendotech descritto nel paragrafo 2 2 2 1 il SW di controllo sviluppato nel presente lavoro di tesi una camera di coltura che permette di alloggiare e stimolare 11 campione di vena safena 5 La pompa preleva il fluido PBS da un reservoir reservoir di mandata posto a monte della pompa e infonde il fluido all interno della vena alloggiata nel camera di coltur
219. uretra incannulata tramite un apposito catetere la vescica viene fissata tramite una fascetta in plastica al catetere all altezza dell uretra Figura 4 12 e gli ureteri vengono suturati filo da sutura chirurgico per evitare che vi sia la fuoriuscita del liquido infuso all esterno dell organo durante la prova Questa operazione garantisce quindi la tenuta idraulica dell organo in risposta all infusione del fluido al suo interno Durante l infusione la vescica viene immersa all interno di un beaker contenente acqua bi distillata Figura 4 12 Vescica nativa di coniglio incannulata attraverso l uretra e fissata tramite una fascetta al catetere Il set up realizzato per le prove di cistometria prevede l impiego di una pompa peristaltica IPC N12 Ismatec utilizzata per il riempimento del lume interno della vescica un sensore di pressione 26PCA Honeywell ed il suo circuito di amplificazione per monitorare il valore di pressione intravescicale in tempo reale durante l infusione un PC con il SW di controllo sviluppato controllo dell attuatore idraulico e monitoraggio del sensore una scheda NI DAQ USB 6211 ed 1 relativi cablaggi per interfacciare l hardware del set up al PC illustrati nel capitolo 2 107 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Durante le prove sperimentali stato allestito un
220. ute per tutta la durata del processo di decellularizzazione 17 ore I parametri scelti per la decellularizzazione ed in particolare 11 volume infuso ad ogni ciclo 20 ml sono stati settati sulla base di prove di cistometria effettuate su diversi campioni di vesciche native In particolare si stimato su base statistica che 20 ml fosse il volume limite di capacit overstretching dell organo cos da mantenere la vescica nella zona della curva P V di comportamento fisiologico Figura 4 11 Il protocollo quindi basato sul controllo del volume infuso e indipendentemente dallo specifico organo processato prevede di infondere sempre lo stesso volume di fluido assumendo cio che questo sia sempre inferiore alla capacit massima dell organo La variabilit intrinseca nei differenti campioni biologici in particolare la differente taglia dell animale e la conseguente differente dimensione dell organo per non garantisce che questa condizione sia sempre rispettata In particolare tale variabilit pu portare a generare nell organo di dimensioni ridotte una sollecitazione meccanica che pu danneggiare il tessuto dal punto di vista strutturale compromettendone le sue propriet meccaniche Nell ambito del presente lavoro di tesi si pertanto deciso di impostare un protocollo di decellularizzazione dinamica in controllo di volume ma limitato in pressione cio che garantisse la sollecitazione dell organo entro un range di pressi
221. utente tramite il comando manual rec Nella modalit automatica l utente in grado di registrare pacchetti di dati della durata desiderata T Auto Rec e di definire l intervallo di tempo che intercorre tra una registrazione e la successiva 7 to Wait Il sistema salva automaticamente blocchi di dati registrati in un file di testo txt che il programma genera nella cartella dove presente il VI Figura 2 19 55 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo File Modifica Formato Visualizza Tube 6 int mm 2 79 a Operation Mode Pressure Limitation Stimulation Pattern Infusion withdraw Rest Max T Infusion Max T withdraw T Rest s 600 300 15 control Speed ml min Infusion give withdraw speed ml min 1 00 2 00 Pressure Threshold Min mmHg Pressure threshold Max mmHg Time Over Threshold s Pressure Max mmHg 0 4 1 10 NI DAQ USB 6211 ACQ Frequency Hz 50 Time Auto Rec 00 00 30 Time to Wait Rec 00 00 01 Active channel PL 0 Pressure sensor Supply v 10 28 03 2013 15 58 20 Session Time 00 00 30 REC Time 00 00 30 Infusion g a E ch 4 ch ch 0 017783 0 007010 0 122241 0 355091 0 699761 0 779680 0 878674 1 038182 0 002751 0 006023 0 008119 0 129148 0 297207 0 454743 0 548474 0 693512 0 039005 0 003514 0 017534 0 043638 0 095273 0 226168 0 296550 0 425143 0 085772 0 007339 0 028387 0 013710 0 005488 0 099219 0 136712 0 240639 0 0607
222. uti umani non autologhi che di tessuti animali provocherebbe nel paziente in cui viene impiantato l organo o il tessuto il fenomeno del rigetto obbligando il paziente ad un trattamento farmacologico a vita Inoltre aumentano le possibilit di trasmettere malattie da donatore a ricevente 1 Sono stati valutati vari protocolli di decellularizzazione ma in generale tutti si basano su tre fasi 9 10 1 la prima prevede un azione litica sulle cellule che comporta quindi la rottura delle membrane cellulari 11 la seconda fase volta alla rimozione delle componenti cellulari e nucleiche in modo da eliminare quei residui che potrebbero indurre risposte infiammatorie o immunitarie Con questo procedimento si aumenta inevitabilmente 11 grado di permeabilit della matrice poich le cellule distaccate lasciano dei vuoti tra le strutture della ECM ii l ultima fase di lavaggio permette di ripulire la matrice ottenuta sia dai residui nucleici non rimossi nella fase precedente sia dagli eventuali residui chimici o enzimatici degli agenti decellularizzanti utilizzati Possono essere utilizzate tre tipologie di agenti decellularizzanti agenti chimici detergenti ionici e non e solventi biologici enzimi e agenti chelanti e fisici temperatura pressione e elettroporazione 9 Il protocollo di decellularizzazione va poi adattato al tessuto o organo che si vuole decellularizzare variando ad esempio il tempo di esposizione del tessuto organo a
223. viene impartita tramite il flusso del medium all interno del vaso stesso Un esempio di bioreattori pulsatili per costrutti vascolari presentato da S Diamantouros nel suo progetto per la tesi di dottorato 15 Questo lavoro particolarmente significativo poich presenta un sistema di controllo completo e relativamente simile a quello sviluppato in questo lavoro di tesi Il sistema composto da due circuiti idraulici il primo preposto alla sollecitazione della parete interna del vaso mentre il secondo agisce su quella esterna Il fluido pompato da un reservoir A mosso da una pompa centrifuga B che fornisce un flusso costante mentre la componente pulsatile data dall attuazione di un motore lineare che agisce su una camera F posta a valle del costrutto vascolare E Figura 1 9 Il sistema sviluppato prevede anche un software di controllo e monitoraggio sviluppato in ambiente di programmazione LabVIEW 8 6 Questo programma permette di controllare tramite PC l attuatore che genera il segnale pulsatile potendone variare ampiezza e frequenza Il 23 Capitolo 1 Introduzione software raccoglie anche gli input trasmessi dai sensori di pressione D uno a valle e uno a monte della camera di coltura dal flussimetro G e dal sensore di gas e pH I potendo cos monitorare queste variabili durante la campagna sperimentale 15 Figura 1 9 Schema del bioreattore a perfusione pulsatile per graft vascolari 1 4 7 Bio
224. zione e azzurra per la fase di rest 58 Capitolo 2 Sviluppo della componente HW e SW del sistema di controllo 2 5 5 Il pannello Advanced Settings Questo pannello Figura 2 21 posto per ultimo in quanto non contiene impostazioni relative alla stimolazione ed dedicato esclusivamente ad utenti esperti 9 Acquisition Settings Settings Acquistion Control Pump Post Processin Advanced Settings Pump Control Settings Expert Only Al Pressure i Dev1 ai0 Pressure Acquistion Mode GRE OO DIGITAL Start Stop Devi port0 lined AO Pressure Transducer Supply DIGITAL Direction IE Devi port0 linel v Scan Rate ali 200 Hz 5000 Scans to Read at aj the Time 25 oy 5 DAQ Card Channel A NI DAQ USB 6211 AO Speed Presure Limitation A ik Devi acd I Devi aol DIGITAL Elecrtovalve Devi port0 line2 Mi K p x Transducer Supply V 5 10 Figura 2 21 Pannello Advanced Settings riquadro verde parametri di acquisizione del segnale di pressione riquadri viola canali I O della scheda NI DAQ riquadri gialli canali di input dedicati alla limitazione in pressione e alla acquisizione del segnale di tensione proporzionale alla portata impostata alla pompa riquadro azzurro tensione di alimentazione del sensore di pressione In questo pannello infatti possibile impostare alcuni parametri che normalmente non occorre cambiare e anzi se impostati non correttamente
225. zzazione dell organo intero come sar descritto nel paragrafo 4 5 2 Il test cistometrico consente quindi di costruire la curva P V di cui in Figura 4 11 mostrato l andamento tipico per la vescica nativa 105 Capitolo 4 Applicazione del sistema di controllo monitoraggio e controllo dei parametri della stimolazione di organi e tessuti biologici Curva cistometrica della vescica nativa Regione Regione 2 Regione 3 Pressione _ os Volume Figura 4 11 Curva P V di una vescica nativa sono evidenziate le tre regioni caratteristiche della curva in funzione di due specifici valori di volume intravescicale V e V2 Analizzando la curva in Figura 4 11 possibile distinguere tre diverse regioni 1 regione l si osserva un repentino incremento della pressione intravescicale a seguito dell infusione di limitati volumi di fluido V lt Vi ll regione 2 si osserva un moderato incremento della pressione a fronte di un consistente aumento del volume infuso all interno dell organo V lt V lt V2 lil regione 3 continuando ad infondere volume oltre il valore V2 si osserva un brusco e significativo incremento del valore di pressione per limitati incrementi del volume infuso Il range fisiologico di sollecitazione della vescica si limita alle prime due regioni In particolare si pu definire V2 come il valore corrispondente alla capacit della vescica oltre il quale si giunge nella

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