Vysis LSI ETV6(TEL)/ RUNX1(AML1) ES Dual Color
Contents
1. Micropipetas 1 ul a 10 pl Pehach metro Portaobjetos limpios de vidrio para microscopio Agua purificada Cron metro Mezclador V rtex Ba o de agua 37 C y 72 C Microscopio de fluorescencia Incubador a 37 C 20X SSC NP 40 Formamida ultra pura Tinci n de contraste DAPI Il Calentador de portaobjetos Prepare tres jarras de Coplin A ada 70 ml de etanol al 100 en una jarra 70 ml de etanol al 85 en la segunda y 70 ml de etanol al 70 en la tercera Utilicese a temperatura ambiente Des chelas transcurridos 7 d as o si muestran diluci n excesiva o evaporaci n Para asegurar buenos resultados verifique que los reactivos se preparen y se usen a las temperaturas descritas en este prospecto Mida las temperaturas de las soluciones dentro de las jarras de Coplin con un term metro calibrado Cuando realice una hibridaci n que combine las sondas CEP y LSI proceda de acuerdo con el m todo general LSI para determinar el protocolo de calidad del reactivo Preparaci n de la muestra NOTA Deje que las jarras de Coplin que contienen la soluci n desnaturalizante alcancen la temperatura ambiente Antes de su uso coloque las jarras en un ba o de agua a 73 C 1 C durante aproximadamente 30 minutos para que alcancen la temperatura adecuada 1 Aseg rese de que la temperatura de la soluci n desnaturalizante sea de 73 C 1 C 2 Sumerja los portaobjetos en la soluci n desnaturalizante durante 5 minutos2. as como tener en cuenta otros datos cl nicos y de diagn stico Resultados esperados El patr n esperado en un n cleo normal hibridado con la sonda LIS ETV6 RUNX1 ES son dos se ales naranjas y dos verdes 202G En un n cleo con una fusi n t 12 21 ETV6 RUNX1 se puede observar una fusi n de una se al verde alelo normal ETV6 una naranja grande alelo normal RUNX1 una naranja m s peque a diana RUNX1 en der 12 y una fusi n naranja verde en der 21 201G1F En muchos casos la se al verde del alelo ETV6 que no se ha traslocado puede no estar presente debido a la deleci n 200G1F Tambi n se pueden observar otros patrones en muestras anormales La interpretaci n de los resultados FISH se debe realizar utilizando controles y t cnicas de an lisis adecuadas as como tener en cuenta otros datos cl nicos y de diagn stico Resultados del diagn stico y soluci n de problemas de un ensayo de codenaturalizaci n La morfolog a del cromosoma observada en una hibridaci n en la cual se utiliza la codesnaturalizaci n puede ser diferente a una muestra que se desnaturaliza y se deshidrata antes de aplicar la sonda Problema Soluci n posible Hibridaci n Repita el ensayo con una muestra nueva cruzada realizando una de las acciones siguientes e Aumente 2 C la temperatura de la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 Vaya aumentando la temperatura hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Reduzca 2
3. C la temperatura de fusi n El aspecto de la sonda es turbio Repita el ensayo con una muestra nueva realizando una de las acciones siguientes e Aumente el tiempo de hibridaci n e Aumente la temperatura de fusi n Vaya aumentando la temperatura hasta que la morfolog a sea aceptable e Lave el portaobjetos utilizando 0 4X SSC 0 3 NP 40 a una temperatura entre 70 C y 73 C Problema Soluci n posible Se al difusa Repita la hibridaci n realizando una de las moteada acciones siguientes e Reduzca 2 C la temperatura de fusi n e Reduzca el tiempo de fusi n NOTA Vaya reduciendo la temperatura o el tiempo de fusi n hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Lave utilizando 0 4X SSC 0 3 NP 40 entre 73 C y 76 C La morfolog a de la Repita el ensayo con una muestra nueva metafase es de realizando una de las acciones siguientes poca calidad e Reduzca 2 C la temperatura de fusi n e Reduzca el tiempo de fusi n NOTA Vaya reduciendo la temperatura o el tiempo de fusi n hasta que la intensidad de la se al sea aceptable e Pretrate los portaobjetos 1 Prepare una soluci n de 2X SSC paraformaldeh do al 1 2 Sumerja el portaobjetos en 2X SSC paraformaldeh do al 1 durante 1 minuto 3 Sumerja varias veces los portaobjetos en agua purificada 4 Deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 5 Deje secar los portaobjetos al aire y cont
4. Este conjunto de sondas se ha utilizado tambi n para demostrar la deleci n com n de la diana ETV6 de la sonda que no est involucrada en la fusi n ETV6 RUNX1 3 Descripci n de la sonda LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation Probe Set es una mezcla de una sonda SpectrumGreen ETV6 y de una sonda SpectrumOrange RUNX1 La sonda LSI ETV6 comienza entre los exones 3 y 5 y se extiende hacia el tel mero 12p del cromosoma hasta aproximadamente 350 kb La sonda LSI RUNX1 cubre el gen completo RUNX1 y de 500 kb aproximada Regi n telom rica Regi n 12p13 Regi n centrom rica 1A 2 1B 345 678 S Iie ms Regi n del punto de ruptura A Intr n 5 lt 350 kb gt LSI TEL Regi n centrom rica Regi n 21q22 Regi n telom rica 87B 7A65 43 1 sfl II LI E Regi n del punto de ruptura Intr n 2 7 he 500 kb gt LSI AML1 Reactivos 1 Vysis LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation Probe Set conjunto de sondas bicolor para la translocaci n n mero de referencia 30 191005 1 tubo de 20 yl 450 ng l sonda de DNA marcada con fluor foro y DNA bloqueante en tamp n Tris EDTA 2 Vysis LSI WCP Hybridization Buffer tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP n mero de referencia 30 804826 1 tubo de 150 pl Sulfato de dextrano formamida SSC pH 7 0 Existen fichas de datos de seguridad de todos los reactivos suministrados con estos equipos disponibles en el Servicio de Asisten
5. NOTA No introduzca simult neamente m s de cuatro portaobjetos por cada jarra de Coplin 3 Deshidrate los portaobjetos manteni ndolos 1 minuto en etanol al 70 a continuaci n 1 minuto en etanol al 85 y por ltimo 1 minuto en etanol al 100 NOTA Mantenga los portaobjetos sumergidos en la soluci n de etanol al 100 hasta que pueda secar todos los portaobjetos y aplicar la mezcla de sondas Preparaci n de la mezcla de sondas 1 Por cada rea diana a ada en un tubo de microcentr fuga los siguientes componentes a temperatura ambiente 7 ul de tamp n de hibridaci n LSI WCP 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada NOTA Si desea hibridar un m ximo de tres sondas simult neamente cada una marcada con un fluor foro diferente a ada un microlitro de cada sonda A ada agua purificada hasta conseguir que la mezcla tenga un volumen de tres microlitros 2 Centrifugue el tubo entre 1 y 3 segundos 3 Ag telo con el V rtex y centrif guelo de nuevo 4 Coloque los tubos en un ba o de agua a 73 C 1 C durante 5 minutos 5 Extraiga el tubo del ba o de agua 6 Col quelo en un calentador de portaobjetos a una temperatura entre 45 C y 50 C hasta que aplique la sonda al DNA diana NOTA Si los portaobjetos est n listos cuando haya desnaturalizado la sonda puede aplicarla inmediatamente al DNA diana Hibridaci n de la sonda a la diana NOTA Prepare una c mara h meda colocando en la pared lateral de un recipiente herm tic
6. ngase en contacto con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott O utilice un portaobjetos con muestras reci n preparados Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible No se ha a adido la Prepare una nueva mezcla Se al d bil o La mezcla de Tape el rea diana sonda de sondas Deje que la inexistente sondas se ha secado con el cubreobjetos sonda se descongele completamente Mezcle con un agitador tipo V rtex O pipetee los reactivos que quiera mezclar y centrifugue brevemente Pipetee la sonda lentamente La sonda el tamp n de hibridaci n o la mezcla de sondas no se mezclaron bien antes de su uso Mezcle con un agitador tipo V rtex o pipetee los reactivos que quiera mezclar y centrifugue brevemente Las sondas no se han diluido correctamente para la hibridaci n Utilice los vol menes indicados en el procedimiento del ensayo para mantener el cociente de la mezcla de sondas 7 ul de tamp n de hibridaci n 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada Aseg rese de que la pipeta est calibrada Deje que el tamp n de hibridaci n se descongele completamente y alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlo A continuaci n pipet elo lentamente La sonda no se ha desnaturalizado correctamente NOTA No afecta a las sondas que se suministran en tamp n de hibridaci n y est n desnaturalizadas Aseg rese de que la temperatura del
7. rese de que la observado con filtros de banda estrecha o temperatura de la soluci n de paso de banda multibanda para reducir la de desnaturalizaci n sea ancha luz de fondo de 73 C 1 C antes de Se al d bil o El portaobjetos de Aseg rese de que la sumergir el portaobjetos inexistente la muestra no se temperatura de fusi n Reduzca la temperatura de fusi n a 72 C Reduzca el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n entre 1 y 3 minutos Los portaobjetos de la muestra no est n completamente secos antes de su inmersi n en la soluci n de desnaturalizaci n Caliente los portaobjetos con las muestras a una temperatura entre 45 C y 50 C antes de desnaturalizarlos o deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 Los portaobjetos estaban reci n preparados antes de la desnaturalizaci n Deje los portaobjetos como m nimo durante 24 horas a temperatura ambiente Fondo del portaobjetos demasiado intenso Los portaobjetos de vidrio est n sucios antes de la preparaci n de la muestra Sum rjalos en etanol y s quelos utilizando papel sin pelusas antes dispensarlos Residuo celular en la preparaci n de la muestra Lave 3 veces el sedimento con fijador reci n preparado y repita el procesamiento de dispensaci n de muestra sobre el portaobjetos Las extensiones de metaf
8. sta presenta un aspecto turbio o contaminado Soluci n de lavado 2X SSC 0 1 NP 40 Mezcle bien 100 ml de 20X SSC pH 5 3 con 850 ml de agua purificada A ada 1 ml de NP 40 Mezcle bien hasta que el NP 40 se haya disuelto completamente Mida el pH y aj stelo a 7 0 0 2 con NaOH A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 1 litro Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n una vez pasados seis meses o si sta presenta un aspecto turbio o contaminado Soluci n desnaturalizante formamida al 70 2X SSC Mezcle bien 49 ml de formamida 7 ml de 20X SSC pH 5 3 y 14 ml de agua purificada en una jarra de Coplin de vidrio Verifique que el pH se encuentre entre 7 0 y 8 0 utilizando tiras reactivas de medici n de pH Cuando no la utilice almac nela en un recipiente cerrado entre 2 C y 8 C Des chela despu s de transcurridos 7 d as Soluciones de etanol 70 85 100 Prepare diluciones de etanol al 100 v v con agua purificada Cuando no las utilice almac nelas a temperatura ambiente Des chelas transcurridos 6 meses Soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 para el procedimiento de lavado r pido Mezcle bien 20 ml de 20X SSC pH 5 3 con 950 ml de agua purificada A ada 3 ml de NP 40 Mezcle bien hasta que el NP 40 se haya disuelto completamente Mida el pH y aj stelo a 7 0 7 5 con NaOH A ada agua purificada hasta alcanzar un volumen total de 1 litro Almac nese a tempera
9. Vysis LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation Probe Set EE CE es Vysis LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation Probe Set 08L66 020 B8L663 84 6419 R1 EE vitro gt c Abbott m E z E m v Clave de los s mbolos utilizados N mero de referencia LOT Para uso en diagn stico in 20 C Almac nese a una temperatura inferior o igual a 20 C Representante autorizado Fabricante legal N mero de lote Fecha de caducidad Consultar instrucciones de uso Atenci n ver instrucciones de uso Finalidad de uso Esta sonda para la hibridaci n in situ por fluorescencia FISH permite detectar la t 12 21 p13 q22 que se obtiene de la fusi n ETV6 RUNX1 Resumen y explicaci n del ensayo La translocaci n cromos mica t 12 21 p13 q22 es el reordenamiento cromos mico m s com n en la leucemia linfobl stica aguda ALL infantil A pesar de que no se detecta mediante t cnicas de citogen tica cl sicas la t 12 21 que resulta en la fusi n del fragmento 5 del gen ETV6 TEL en el cromosoma 12p13 con pr cticamente todo el gen RUNX1 AML1 situado en el cromosoma 21q22 ocurre en aproximadamente el 25 de los casos de ALL infantil 2 LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation Probe Set se ha utilizado en diversos estudios para la detecci n de t 12 21 por ejemplo Harrison y otros Marineau y otros Lee y otros y Mori y otrosf
10. a Si desea m s DAPI II informaci n p ngase en La tinci n de Almacene la tinci n contacto con el Centro contraste ha protegida de la luz a una de Asistencia T cnica de caducado o ha temperatura inferior o igual Abbott estado expuesta a la a 20 C durante el uso La configuraci n P ngase en contacto luz durante per odos Aseg rese de que la o los objetivos del con el fabricante del prolongados de tinci n de contraste no se microscopio no microscopio tiempo utilice transcurrida la fecha son adecuados de caducidad para visualizar los resultados FISH Bibliograf a o los filtros del 1 Romana SP Coniat ML Berger R t 12 21 A New Recurrent microscopio est n Translocation in Acute Lymphoblastic Leukemia Genes Chromosomes da ados Cancer 1994 9 186 191 Se al poco Las sondas no Aseg rese de que la 2 Romana SP Mauchauff M Le Coniat M et al The t 12 21 of Acute espec fica se han diluido mezcla de sondas se haya Lymphoblastic Leukemia Results in a tel AML1 Gene Fusion Blood correctamente A menudo es posible que haya excesiva cantidad de sonda en el ensayo preparado de acuerdo con lo descrito en el prospecto 1995 85 12 3662 3670 Condiciones de hibridaci n inadecuadas Aseg rese de que la temperatura del incubador sea de 37 C Aseg rese de que se haya a adido la cantidad correcta de tamp n de hibridaci n a la mezcla de la sonda Temperatura de lavado demasiado baja Mantenga la tem
11. a del Los portaobjetos de Aumente la temperatura El portaobjetos Aseg rese de que las cromosoma la muestra se han del ba o termost tico no se ha lavado soluciones de lavado se distorsionada secado demasiado aumenta la humedad correctamente prepararon de acuerdo con r pido durante la cuando dispense tras la hibridaci n lo descrito en el prospecto preparaci n las muestras a los Aseg rese de que el pH portaobjetos y la temperatura de las Reduzca la temperatura soluciones de lavado sean del calentador para correctos portaobjetos durante la Retire los cubreobjetos preparaci n de la muestra Repita el procedimiento de Aumente el tiempo de lavado secado a temperatura Las soluciones Aseg rese de que las ambiente a una noche de lavado se han soluciones de lavado que como m nimo y a utilizado durante contengan formamida continuaci n deje los demasiado tiempo o se almacenen a 4 C portaobjetos como m nimo se han almacenado Des chelas transcurridos 24 horas a temperatura incorrectamente 7 d as o despu s de un uso ambiente muy frecuente Deseche No caliente los portaobjetos todas las otras soluciones a altas temperaturas de lavado transcurrido La muestra Aseg rese de que 1 d a est sobre la soluci n de Aseg rese de que el pH de desnaturalizada desnaturalizaci n se las soluciones de lavado de prepar de acuerdo con lo formamida sea 7 0 8 0 descrito en el prospecto La hibridaci n se ha Cambie a filtros con ancho Aseg
12. ase est n envejecidas por calentamiento o contienen citoplasma Aumente el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n a 10 minutos ha desnaturalizado adecuadamente en la jarra de Coplin sea de 73 C 1 C antes de sumergir el portaobjetos Aumente la temperatura de fusi n a 74 C Aumente el tiempo que el portaobjetos est sumergido en la soluci n de desnaturalizaci n entre 2 y 4 minutos El portaobjetos de la muestra no se ha preparado correctamente para FISH Contacte con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott si desea m s informaci n sobre la preparaci n de las muestras para FISH Los portaobjetos de la muestra no se han dejado reposar adecuadamente despu s de dispensar la muestra D jelos durante 24 horas a temperatura ambiente antes de realizar la t cnica FISH Los portaobjetos de la muestra no est n completamente secos antes de su inmersi n en la soluci n de desnaturalizaci n Caliente los portaobjetos con las muestras a una temperatura entre 45 C y 50 C antes de desnaturalizarlos o deshidr telos aclar ndolos en series de un minuto con una soluci n de etanol al 70 85 y 100 La muestra ten a bandas GTG La utilizaci n de muestras con bandeo tripsina Giemsa para FISH puede requerir ajustes en los protocolos de hibridaci n o de bandeo Si desea m s informaci n sobre el bandeo p
13. ba o termost tico utilizado para desnaturalizar la mezcla de sondas sea 73 C 1 C Desnaturalice la mezcla de sondas durante 5 minutos La sonda desnaturalizada no se aplic inmediatamente a la muestra Aplique la sonda inmediatamente despu s de haber retirado los portaobjetos de la soluci n de etanol al 100 Aseg rese de que la soluci n de etanol se ha evaporado antes de aplicar la sonda Saque el tubo que contiene la mezcla de sondas del ba o termost tico a 73 C 1 C y col quelo inmediatamente en el calentador para portaobjetos a una temperatura entre 45 C y 50 C Mantenga el tubo en el calentador para portaobjetos mientras pipetea la sonda en el portaobjetos Procese s lamente tantos portaobjetos como pueda y aseg rese de mantener la temperatura y la duraci n descritas en el proceso del ensayo excesivamente en el portaobjetos de la muestra inmediatamente despu s de aplicar la mezcla de sondas Cuando lave la hibridaci n retire primero el cubreobjetos de un portaobjetos y sumerja el portaobjetos en la soluci n de lavado antes de retirar el cubreobjetos del siguiente portaobjetos Durante la hibridaci n se han formado burbujas debajo del cubreobjetos Deposite el cubreobjetos tocando primero la superficie de la mezcla de sondas Coloque cuidadosamente el portaobjetos con el cubreobjetos hacia abajo sobre papel secante y elimine cuidadosamente
14. caciones y de los tipos de muestras Los par metros aqu descritos son para su uso con el Vysis HYBrite Denaturization Hybridization System sistema de desnaturalizaci n hibridaci n En funci n de la muestra ser n necesarios procesos adicionales de optimizaci n El aspecto de una hibridaci n que utiliza la codesnaturalizaci n puede variar con respecto a una hibridaci n en la que la muestra diana se desnaturaliza y se deshidrata antes de aplicar la sonda Preparaci n de un portaobjetos para la codesnaturalizaci n 1 Por cada rea diana a ada en un tubo de microcentr fuga los siguientes componentes a temperatura ambiente 7 ul de tamp n de hibridaci n LSI WCP 1 ul de sonda 2 ul de agua purificada NOTA Si desea hibridar un m ximo de 3 sondas simult neamente cada una provista de un fluor foro diferente a ada 1 ul de cada sonda A ada agua purificada hasta conseguir que la mezcla tenga un volumen de 3 pl 2 Centrifugue el tubo entre 1 y 3 segundos 3 Ag telo con el V rtex y centrif guelo de nuevo 4 Dispense 10 ul de la mezcla de sondas sobre el portaobjetos y t pelo inmediatamente con un cubreobjetos 5 Selle el cubreobjetos con adhesivo de caucho Elecci n de los par metros del sistema de desnaturalizaci n hibridaci n Las instrucciones que se describen a continuaci n son espec ficas del sistema HYBrite Denaturation Hybridization Si desea m s informaci n sobre la utilizaci n de este instr
15. cence in situ hybridization assays for clinical practice Genet Med 2006 8 16 23 Asistencia t cnica Si requiere asistencia t cnica p ngase en contacto con el Centro de Asistencia T cnica de Abbott o consulte la p gina web de Abbott Molecular en http lwww abbottmolecular com Direcci n del representante autorizado ABBOTT Max Planck Ring 2 65205 Wiesbaden Alemania Tel fono 49 6122 580 La patente europea 0 430 402 B1 asignada a la Universidad de California y con autorizaci n exclusiva para Abbott Molecular Inc protege la utilizaci n de las sondas Vysis LSI Dual Color Rearrangement o de las sondas Dual Color Break Apart La patente europea EP 0 444 115 B1 asignada a la Universidad de Yale y con autorizaci n exclusiva para Abbott Molecular Inc protege la utilizaci n de sondas LSI de Vysis CEP LSI WCP y Vysis son marcas comerciales registradas de Abbott Molecular Inc SpectrumGreen SpectrumRed SpectrumOrange SpectrumAqua SpectrumBlue SpectrumGold y HYBrite son marcas comerciales de Abbott Molecular Inc ThermoBrite es una marca comercial de Iris Sample Processing Inc Abbott Molecular Inc EC REP ABBOTT Des Plaines IL 60018 USA Max Planck Ring 2 65205 Wiesbaden Germany 49 6122 580 2007 Abbott Laboratories www abbottmolecular com Noviembre 2007 E Abbott
16. cia T cnica de Abbott Molecular Almacenamiento 20 C El conjunto de sondas Vysis LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation se debe almacenar a una temperatura igual o inferior a 20 C protegido de la luz Advertencias y precauciones IVD Para uso exclusivo en diagn stico in vitro El tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP ha sido clasificado seg n las directivas de la Comunidad Europea CE como T xico T e Irritante Xi A continuaci n se indican las frases R que indican los riesgos espec ficos derivados de los peligros de la sustancia y frases S consejos de prudencia en relaci n con el uso de la sustancia T R41 Riesgo de lesiones oculares graves k R61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto S45 En caso de accidente o malestar ac dase inmediatamente al m dico si es posible mu stresele la etiqueta S53 Ev tese la exposici n rec bense instrucciones especiales antes del uso x Preparaci n de los reactivos NOTA Mida a temperatura ambiente el pH de las soluciones que as lo indiquen Si no se indica lo contrario utilice un pehach metro con un electrodo de vidrio Soluci n de lavado 20X SSC Mezcle bien 132 g de 20X SSC en 400 ml de agua purificada Mida el pH y aj stelo a 5 3 con HCI A ada agua purificada hasta conseguir un volumen total de 500 ml Almac nese a temperatura ambiente Deseche la soluci n una vez pasados seis meses o si
17. in Utilicese a temperatura ambiente Puede utilizar esta soluci n durante un d a transcurrido este tiempo des chela NOTA Para mantener la temperatura adecuada en la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 lave cuatro portaobjetos simult neamente Si tiene menos de cuatro a ada portaobjetos vac os que est n a temperatura ambiente hasta tener un total de 4 Cronometre despu s de haber sumergido el cuarto portaobjetos 1 Retire el cubreobjetos de uno de los portaobjetos y sumerja ste ltimo inmediatamente en 0 4X SSC 0 3 NP 40 Agite los portaobjetos de 1 a 3 segundos Repita el mismo procedimiento con los dem s portaobjetos 2 S quelos transcurridos 2 minutos NOTA Aseg rese de que la temperatura de las soluciones de lavado sea 73 C 1 C antes del lavado de otra serie de 4 portaobjetos 3 Sumerja los portaobjetos en 2X SSC 0 1 NP 40 Agite los portaobjetos de 1 a 3 segundos Saque los portaobjetos transcurridos de 5 segundos a 1 minuto Visualizaci n de la hibridaci n 1 Deje que los portaobjetos se sequen al aire en la oscuridad 2 Aplique 10 yl de la tinci n de contraste DAPI ll sobre el rea de hibridaci n del portaobjetos y cubra con un cubreobjetos Visualice los portaobjetos utilizando un conjunto de filtros adecuados en un microscopio para fluorescencia que funcione correctamente Los conjuntos de filtros pticos que se describen a continuaci n le permitir n visualizar los fluor foros uti
18. in e con la preparaci n del portaobjetos para la codesnaturalizaci n e Si persiste la morfolog a de poca calidad modifique la utilizaci n del instrumento HYBrite 1 Prepare 280 yl de formamida al 70 soluci n de desnaturalizaci n 2X SSC 196 ul de formamida 28 ul de 2X SSC 56 ul de agua purificada 2 Ejecute un programa a una temperatura de mantenimiento HYBrite Hold Temp de 73 C 3 A ada 10 ul de formamida al 70 soluci n de desnaturalizaci n 2X SSC en cada rea diana y t pela con el cubreobjetos 4 Cuando el HYBrite alcance 73 C coloque los portaobjetos sobre la superficie de calentamiento Cierre la cubierta 5 Retire los portaobjetos transcurridos 3 minutos 6 Retire los cubreobjetos 7 Contin e con el paso de deshidrataci n descrito en el apartado Preparaci n de la muestra para el procedimiento del ensayo no sometido a codesnaturalizaci n Consejos diagn stico y soluci n de problemas Cuando vaya a visualizar los resultados de un ensayo FISH aseg rese de que el microscopio est adecuadamente alineado y funcionando correctamente En la siguiente tabla se enumeran aquellos resultados que se desv an de lo que se considera un resultado ptimo al utilizar las sondas LSI Asimismo se incluyen las posibles causas y las sugerencias para mejorar el rendimiento del ensayo Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n posible Morfolog
19. las burbujas aplicando una ligera presi n Condiciones de hibridaci n inadecuadas Aseg rese de que se cumplan el tiempo y la duraci n establecidos para la hibridaci n Aseg rese de que la temperatura del incubador sea de 37 C Selle bien y completamente el cubreobjetos con adhesivo de caucho Aumente el tiempo de hibridaci n Las condiciones o las soluciones de lavado no son correctas Aseg rese de que las soluciones de lavado se hayan preparado de acuerdo con lo descrito en el prospecto Aseg rese de que la temperatura de las soluciones de lavado correspondan a las descritas en el procedimiento de lavado Aseg rese de que los term metros y los pehach metros se hayan calibrado correctamente Retire los cubreobjetos antes de sumergir los portaobjetos en la soluci n de lavado Las sondas o los portaobjetos de las muestras se han almacenado incorrectamente Almacene la sonda sin diluir a una temperatura igual o inferior a 20 C y protegida de la luz Almacene los portaobjetos sin hibridar con desecante a una temperatura inferior o igual a 20 C para un per odo prolongado de tiempo o a temperatura ambiente para per odos cortos Almacene los portaobjetos hibridados protegidos de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C hasta un m ximo de 3 semanas Problema Causa probable Soluci n posible Problema Causa probable Soluci n p
20. lizados en la hibridaci n Si utiliza este filtro Se produce la excitaci n y emisi n de Vysis simult nea de DAPI Orange Fluor foros DAPI y SpectrumOrange DAPI Green Fluor foros DAPI y SpectrumGreen Aqua Green Orange Fluor foros SpectrumAqua SpectrumGreen y SpectrumOrange DAPI Orange Green Fluor foros DAPI SpectrumOrange y SpectrumGreen Fluor foros DAPI SpectrumAqua SpectrumGreen y SpectrumOrange DAPI Aqua Green Orange Almacenamiento Los portaobjetos que se hayan almacenado a 20 C y protegidos de la luz se pueden analizar al menos durante tres semanas despu s de la hibridaci n Utilizaci n del proceso de codesnaturalizaci n La codesnaturalizaci n es un proceso que simplifica la t cnica de hibridaci n in situ con fluorescencia FISH al combinar en un s lo paso la desnaturalizaci n de la mezcla de sondas y de la muestra Generalmente la codesnaturalizaci n consiste en colocar los portaobjetos de las muestras con las sondas y los cubreobjetos sobre una placa caliente o en el estante de una estufa o de un incubador que est a la temperatura de desnaturalizaci n Transcurridos entre 2 y 10 minutos los portaobjetos se retiran de la superficie caliente y se colocan en un incubador a la temperatura de hibridaci n Las condiciones documentadas para la codesnaturalizaci n especifican un amplio intervalo de temperaturas y duraci n que hacen necesaria la optimizaci n de las condiciones de las apli
21. o una toallita de papel humedecida con agua Col quela en un incubador a 37 C 1 Saque los portaobjetos de la soluci n de etanol al 100 2 Seque el portaobjetos colocando el borde inferior en contacto con papel secante y seque la parte inferior con una toallita de papel 3 Coloque los portaobjetos en un calentador para portaobjetos a una temperatura entre 45 C y 50 C para evaporar el etanol restante 4 Deposite 10 ul de la mezcla de sondas sobre un rea diana y t pela inmediatamente con el cubreobjetos Repita este proceso para las reas adicionales 5 Selle el cubreobjetos con adhesivo de caucho 6 Coloque el portaobjetos en una c mara h meda precalentada e inc belo a 37 C entre 6 y 16 horas Para conseguir que la intensidad de la se al del ensayo sea suficiente la duraci n de la hibridaci n para la mayor a de las sondas LSI debe ser al menos de entre 12 y 16 horas Lavado del portaobjetos Procedimiento de lavado r pido NOTA Cuando se trate de cortes de muestras incluidos en parafina sustituya la soluci n de lavado 0 4X SSC 0 3 NP 40 por la 2X SSC 0 3 NP 40 Preparaci n de las soluciones de lavado e Dispense 70 ml de 0 4X SSC 0 3 NP 40 en una jarra de Coplin y col quela en un ba o de agua a 73 C 1 C durante como m nimo 30 minutos antes de su uso Puede utilizar esta soluci n durante un d a transcurrido este tiempo des chela e Dispense 70 ml de 2X SSC 0 1 NP 40 en una jarra de Copl
22. osible Se ha utilizado una Retire los cubreobjetos Tinci n de La tinci n aparece Retire los cubreobjetos tinci n de contraste Sumerja los portaobjetos contraste brillante d bil los portaobjetos Sumerja los portaobjetos equivocada durante 5 minutos en o d bil con las muestras no durante 5 minutos en La tinci n de 2X SSC 0 1 NP 40 a se han deshidratado 2X SSC 0 1 NP 40 a contraste es temperatura ambiente y antes de aplicarles temperatura ambiente y excesivamente deshidr telos aclar ndolos la tinci n o hay deshidr telos aclar ndolos brillante en series de un minuto con gotas de aceite en la en series de un minuto con una soluci n de etanol al tinci n una soluci n de etanol al 70 85 y 100 D jelos 70 85 y 100 D jelos secar al aire y vuelva secar al aire y vuelva a aplicar la tinci n de a aplicar la tinci n de contraste contraste La hibridaci n se ha Los conjuntos de filtros Concentraci n Si la tinci n es observado con un multibanda proporcionan incorrecta de tinci n excesivamente brillante conjunto de filtros menos luz que los filtros de contraste dil yala con Antifade inapropiado de paso de banda simple NOTA La Solution n mero de y por tanto las se ales concentraci n de la referencia 06J29 010 luminosas pueden parecer tinci n de contraste antes de aplicarla m s d biles DAPI es 8 veces Utilice el filtro correcto superior a la de la para visualizar el fluor foro tinci n de contraste de la sond
23. peratura de lavado de las soluciones de lavado colocando un m ximo de cuatro portaobjetos en una jarra de Coplin cada vez y comprobando que la temperatura sea correcta antes de lavar otra serie de portaobjetos Las condiciones restrictivas astringencia de la soluci n de lavado son demasiado d biles Aseg rese de que las soluciones de lavado se prepararon de acuerdo con lo descrito en el prospecto NOTA Cuanto menor sea la concentraci n de sales SSC y mayor la concentraci n de formamida y NP 40 mayor ser la condici n restrictiva astringencia del lavado 3 Harrison CJ Moorman AV Barber KE et al Interphase Molecular Cytogenetic Screening for Chromosomal Abnormalities of Prognostic Significance in Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia A UK Cancer Cytogenetics Group Study Br J Haematol 2005 129 520 530 Martineau M Jalali GR Barber KE et al ETV6 RUNX Fursion at Diagnosis and Relapse Some Prognostic Indications Genes Chromosomes Cancer 2005 43 54 71 Lee DS Kim YR Cho HK et al The presence of TEL AML1 rearrangement and cryptic deletion of the TEL gene in adult acute lymphoblastic leukemia ALL Cancer Genet Cytogenet 2005 162 176 78 Mori H Colman SM Xiao Z et al Chromosome Translocations and Covert Leukemic Clones are Generated During Normal Fetal Development PNAS 2002 99 12 8242 47 Wiktor AE Van Dyke DL Stupca PJ et al Preclinical validation of fluores
24. tura ambiente Deseche la soluci n una vez pasados seis meses o si sta presenta un aspecto turbio o contaminado Almacenamiento de la sonda LSI DNA La sonda LSI DNA se debe almacenar protegida de la luz a una temperatura inferior o igual a 20 C Descomposici n Los fluor foros son fotosensibles Para limitar esta descomposici n maneje las soluciones y los portaobjetos que contengan fluor foros en condiciones de luz reducida Lleve a cabo todos los pasos que no requieran luz periodos de incubaci n lavados etc en la oscuridad Observaciones durante el procedimiento Antes de su uso descongele los reactivos a temperatura ambiente y a continuaci n centrifugue cada tubo entre 2 y 3 segundos con una microcentr fuga Recogida y preparaci n de las muestras para el an lisis Las c lulas de la m dula sea se deben cultivar recoger fijar y colocar en los portaobjetos para microscopio seg n los procedimientos habituales de citogen tica Procedimiento Materiales necesarios e Vysis LSI ETV6 TEL RUNX1 AML1 ES Dual Color Translocation Probe Set e Tamp n de hibridaci n Vysis LSI WCP Materiales necesarios pero no suministrados HCI 12N para el ajuste del pH de las soluciones de lavado NaOH 1N para el ajuste del pH de las soluciones de lavado Jarras de Coplin de vidrio Term metro calibrado Pinzas Probeta graduada de 1 000 ml Agitador magn tico Etanol Microcentr fuga Puntas de pipeta 1 ul a 10 yl
25. umento consulte la Gu a del usuario del sistema HYBrite Tambi n es posible la utilizaci n del sistema ThermoBrite Denaturation Hybridization System ya que sus caracter sticas t rmicas son comparables a las del sistema HYBrite Cuando utilice el sistema ThermoBrite el control m s ajustado 1 C har necesario el ajuste de las condiciones de desnaturalizaci n e hibridaci n Si desea informaci n m s detallada consulte el apartado Consejos diagn stico y soluci n de problemas de este prospecto 1 Para las muestras de linfocitos de cultivo y de m dula sea ajuste la temperatura de fusi n Melt Temp a 73 C y el tiempo de fusi n Melt Time a un 1 minuto Para las muestras incluidas en parafina ajuste la temperatura de fusi n a 73 C y el tiempo de fusi n a 5 minutos 2 Fije la temperatura de hibridaci n Hyb Temp a 37 C y el tiempo de hibridaci n Hyb Time entre 4 horas y toda la noche 3 Una vez finalizada la hibridaci n lave los portaobjetos mediante el procedimiento de lavado r pido 4 Deje que los portaobjetos se sequen al aire en la oscuridad 5 Aplique 10 yl de tinci n de contraste al rea diana y t pela con un cubreobjetos Procedimientos de control de calidad Los controles positivos y negativos se deben analizar con muestras de paciente Limitaciones del procedimiento La interpretaci n de los resultados FISH se debe realizar utilizando controles y t cnicas de an lisis adecuadas
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