Guía de usuario de Microarray Affymetrix
Contents
1. 250 ng RNA total diluci n m nima de 40 ng ul Gene Array e No menos de 500 ng RNA total diluci n m nima de 100 ng pl A dt UNIDAD DE GENOMICA ANDALLISIAN CENTER FOR MOLECULAR MOLOG AND REGENERATIWE MEDECINE caDii e 2 Gu a de Usuario de Microarray N Exon Array e No menos de 500 ng RNA total diluci n m nima de 100 ng pl miRNA Array No menos de 5 ug RNA total diluci n m nima de 200 ng pl No existe ning n inconveniente en mandar m s cantidad de RNA o m s concentrada Si la cantidad de muestra que se puede obtener es problem tica o hay cualquier duda sobre ella o la concentraci n de la misma ponerse en contacto con la Unidad c Al menos 3 r plicas por condici n experimental d Todas las muestras deber n estar correctamente identificadas m nimo de 3 caracteres y acorde a la Hoja de solicitud debidamente cumplimentada que debe acompa ar a las muestras ror El an lisis de Calidad de las muestras est incluido en el servicio Al llegar las muestras a la Unidad se proceder a la cuantificaci n de stas as como a la determinaci n de su integridad por medio del Bioanalyzer 2100 Las que no pasen un m nimo de calidad exigida se le comunicar al usuario junto con una explicaci n y recomendaciones para la obtenci n de muestras adecuadas 2 An lisis de regulaci n y genomas completos Para ello los distintos tipos de Microarrays dispon2. a nivel de exones miRNA Array miRNA de mas de 70 organismos distintos principalmente humanos rata rat n y primates y snoRNA y scaRNA de humanos Tiling Arrays Whole Genome Array que cubren todo el genoma y pueden ser empleados para estudios de Mapeo transcripcional completo y de Interacciones prote na DNA a nivel gen mico ChIP on Chip En el caso de rat n existen arrays espec ficos para ChlP on Chip de regiones promotoras Promoter Arrays 1 s lo array para todo el genoma Para humanos tambi n existen Promoter Arrays y arrays basados en el proyecto ENCODE ENCODE Arrays que sirven para cualquier aplicaci n 3 Expression Array Gene Array Exon Array Tiling Arrays gt Recomendaciones para el Dise o del experimento Antes de utilizar el Servicio de Gen mica hay algunos requisitos importantes de los que depende la obtenci n de resultados fiables y reproducibles dado la gran inversi n de tiempo y dinero en estos experimentos a Cu l es el objetivo de dicho experimento es decir qu respuestas son las que buscamos Establecer los controles m s apropiados para las muestras a estudiar Definir n de r plicas por cada condici n experimental para promediar los resultados y que stos sean estad sticamente significativos Como m nimo son necesarias 3 En el caso de estudios de expresi n para disminuir la variabilidad de cada individuo es recomendable hacer mezclas pooles d
3. cabimer gt Guia de Usuario de MioroarrayAttymetrix AMD AEGENERATIWVE MEDECINE Y UNIDAD DE GEN MICA CABIMER Gu a de usuario de Microarray Affymetrix La tecnolog a de Microarrays basada en la complementariedad de bases de los cidos nucleicos puesta a punto por Affymetrix permite el an lisis funcional del genoma Dicha plataforma est permanentemente actualizada es de alta reproducibilidad y exactitud motivos por los cuales es una de las m s utilizadas en el mundo Esto permite una comparaci n directa de datos con los de otros laboratorios y se encuentra en sincron a con las necesidades de nuestra comunidad cient fica Los Microarrays de Affymetrix se obtienen mediante la s ntesis de oligonucle tidos de 25 mer utilizando la t cnica de fotolitograf a sobre una superficie de cuarzo X Human Genome 4 Probe Cell 3 Xs o U133A GeneChip6 A SS Array probe A a a probe single stranded sense fluorescently labele oligonucleotide 25 mersi he neS complementary to genetic gt A s5 information of interest Si i v a y 7 PR 1 Probe Array 2 Probe Se Each Probe Set contains 3 Probe Pair 11 Probe Fairs Pd lot hi Each Perfect Match of different probes Pi and MisMatch ii Probe Cells are associated by pairs The Human Genome U1a3 A GeneChipt array represents more than 22 000 full length genes and EST clusters Representaci n esquem tica del sistema de an lisis
4. cambio de expresi n Grado de confianza etc Esto permitir al usuario establecer cortes significativos para poder seleccionar grupos de genes diferencialmente expresados Esta informaci n se ofrece en un plazo m ximo de 15 d as desde el comienzo del an lisis gt Tarifas Consultar con la Unidad gt informaci n de inter s Affymetrix http www affymetrix com 3 Expression Array GeneChip6 Human Genome U133 Arrays http www affymetrix com products_services arrays specific ngu133plus affx H1_2 Exon Arra GeneChip Human Exon 1 0 ST Array http www affymetrix com products_services arrays specific exon atffx H1_2 Gene Array GeneChip Human Gene 1 0 ST Array http www affymetrix com products_services arrays specific nugene_1_0 st affxi1_4 Tiling Array Chip on Chip GeneChip Human Tiling 2 0R Array Set 14 arrays http www affymetrix com products_services arrays specific numan_tiling_2 affx 1_2 Tiling Array Transcript Mapping GeneChip Human Tiling 1 0R Array Set 7 arrays http www affymetrix com products_services arrays specific numan_tiling affx miRNA http www affymetrix com products_services arrays specific mi_rna affx H1_2
5. de expresi n 3 GeneChipO de Affymetrix Imagen tomada de http www weizmann ac il home ligivol research_interests html Las muestras de RNA se marcan con biotina y cada muestra se hibrida en un array independiente Para su procesamiento se utiliza la Estaci n Flu dica 450 de Affymetrix La Unidad dispone del Scanner modelo 3000 7G para la captura de la imagen que tras la hibridaci n se lleva a cabo Posteriormente se analizan de forma rutinaria los GeneChips6 escogidos seg n el objetivo del experimento Los GeneChips6 espec ficos para cada genoma y tipo de an lisis est n disponibles en la web de Affymetrix http www affymetrix com products arrays index affx Seg n el objetivo del estudio destacan C3DI 2 Gu a de Usuario de Microarray ANDA 5145 CENTER FOA MOLECAAA UNIDAD DE GENOMICA AMO REGENERATWE MEDECINE YW 3 Expression Arrays 11 sondas gen que hibridan con la regi n 3 del transcrito Para el an lisis convencional de patrones de expresi n basado en secuencias predichas y bien anotadas de mensajeros Gene Array 26 sondas gen dise adas a lo largo del gen completo Para estudios de expresi n diferencial m s completos consideran tambi n transcritos sin extremos PolyA m s concretos s lo genes bien anotados y m s econ micos que los 3 Expression Arrays Exon Array 4 sondas ex n y 40 sondas gen 10 exones Para estudios de niveles de expresi n g nica y
6. e las muestras C3DI 2 Gu a de Usuario de Microarra UNIDAD DE GENOMICA ARDALLUSIAN CENTER POR MOLEGAAA AND AEGENERATIVE MEDICINE Y CONTROL CONDICI N 1 R plica 1 R plica 2 R plica 3 R plica 1 R plica 2 R plica 3 p Pool RNA1 Pool RNA2 Pool RNA3 Pool RNA1 Pool RNA2 Pool RNA 3 RNA RNA 3 A y y RNA RNA RECOMENDACIONES DISE O EXPERIMENTAL 1 Hibridaci n 1 R plica de 1 Condici n Experimental M nimo 3 R plicas c Condici n Experimental gt Requisitos de las muestras 1 An lisis de perfiles de expresi n g nica Tanto para los 3 Expression Arrays como para los Exon Arrays Gene Arrays y miRNA Arrays a Aislamiento del RNA Es imprescindible que el usuario obtenga un de un RNA de alta calidad y pureza El m todo que da mejores resultados es la extracci n con TRIzol Invitrogen cat 15596 026 seg n recomienda Affymetrix con una purificaci n adicional por columnas RNeasy de QIAGEN Qiagen RNeasy cat 74104 La purificaci n por Kits de extracci n de RNA de Qiagen son igualmente recomendables fiables y productivas b RNA resuspendido en Agua libre de RNAsas La cantidad depender del protocolo de marcaje us ndose uno u otro seg n la disponibilidad de material de partida para las muestras que vayan a ser marcadas y del tipo de array que se vaya a hibridar 3 Expression Array e No menos de
7. ibles hasta el momento son los de Promoter Arrays ENCODE Arrays o los de Tiling Arrays Seg n la aplicaci n los requisitos son los siguientes Mapeo Transcripcional a Cantidad de RNA RNA total aislado mediante columnas RNeasy de QIAGEN Qiagen RNeasy cat 74104 No menos de 6ug de RNA total para muestras de rat n y humanos concentraci n m nima de 0 24 ug ul y 7ug de RNA total para muestras de levaduras S cerevisiae S pombe Drosohila C elegans y A thaliana con una concentraci n m nima de 1ug uL b Muestras resuspendidas en Agua libre de RNAsas DNAsas c Al menos 3 r plicas por condici n experimental e Todas las muestras deber n estar correctamente identificadas m nimo de 3 caracteres y acorde a la Hoja de solicitud debidamente cumplimentada que debe acompa ar a las muestras ror ChIP on Chip a Cantidad de DNA inmunoprecipitado Entre 5 50 ng seg n el estudio con un enriquecimiento de entre 5 y 8 veces b Muestras resuspendidas en Agua libre de RNAsas DNAsas c Recomendable 2 3 r plicas por condici n experimental dd ma UNIDAD DE GENOMICA ANDALLSAN CENTER POR MOLECULAR BIOLOGY q A AA A A A A A AMD REGENERATWE MEDICINE cabinmer 2 Gu a de Usuario de Microarray N d Todas las muestras en tubos eppendorf de 1 5mL deber n estar correctamente identificadas m nimo de 3 caracteres y acorde a la Hoja de solicitud debidamente cumplimentada que debe acompa ar a las mue
8. os resultados se le enviar n al usuario v a e mail junto con un informe final En el caso de Estudios de expresi n se les enviar los ficheros CEL y CHP que contienen toda la informaci n de cada microarray y un documento Excel en el que se incluyen los datos brutos y normalizados por estad stico as como an lisis comparativo apropiado Este documento Excel incluye varias Hojas que contienen concretamente la siguiente informaci n a La primera hoja contiene los datos normalizados por RMA Robust Microarray Average que s lo da valores num ricos en log2 pero que permite la comparaci n directa entre el valor de expresi n de un gen en un experimento con el de otro experimento ya sea r plica u otra condici n experimental distinta Tambi n se muestra en esta hoja el s mbolo del gen correspondiente as como la descripci n Estos valores corresponden a las intensidades relativas de las hibridaciones de las mol culas de RNA DNA con cada sonda representada en el array Unidades de Fluorescencia nnhinn Gu a de Usuario de Mi y cabimer gt uia de dadario de Meraner ANDALUSIAN CENTER FOR MOLECULAR BIOLOGY AND REGENERATIVE MEDICINE A b En las dem s Hojas seg n comparaciones vuelven a estar los datos normalizados de cada r plica se mostrar n una serie de par metros y algoritmos que corresponden al An lisis Estad stico realizado por LIMMA Linear Models for Microarray Analysis entre los que se incluyen Nivel de
9. stras FoF Para cualquier duda puede ponerse en contacto con el Servicio de Gen mica a trav s de las siguientes direcciones de correo electr nico Eloisa Andujar M nica P rez Andr s Aguilera o en el tel fono 954 467 828 gt Env o de muestras Las muestras de RNA DNA una vez purificadas y en las concentraciones indicadas en los apartados anteriores se enviar n congeladas en nieve carb nica en tubos Eppendorf6O de 1 5 mL en Agua libre de RNAsas junto con una copia original impresa del Formulario de Solicitud cumplimentado correctamente ror Si por alg n motivo ajeno a la Unidad una vez realizada la solicitud el usuario cancelara la misma el material fungible correspondiente le ser facturado La direcci n a la cual pueden ser remitidas es Unidad de Gen mica Centro Andaluz de Biolog a Molecular y Medicina Regenerativa Cabimer Avda Am rico Vespucio s n Parque Tecnol gico Cartuja 93 41 092 SEVILLA Horario de recepci n de muestras 9 00 h a 17 00 h El env o de las muestras debe ser comunicado previamente por tel fono 954 467828 o por e mail eloisa andujar Vdcabimer es monica perezOcabimer es Por su parte la Unidad de Gen mica comunicar v a e mail la recepci n de las mismas as como cualquier problema que pueda surgir tras los controles de calidad realizados sobre stas gt Entrega de los Resultados Una vez terminado el experimento y obtenidos los datos de su an lisis CEL l
Download Pdf Manuals
Related Search