SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis
Contents
1. aao Los Ministerio Instituto Nacional e de Salud de Salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACION MICROSCOPICA MODS Lima 2011 MINISTERIO DE SALUD DEL PER MINISTRO Alberto Tejada Noriega VICEMINISTRO Enrique Jacoby Mart nez INSTITUTO NACIONAL DE SALUD ALTA DIRECCI N Jefe Percy Minaya Le n Subjefe Nora Reyes Puma RGANOS DE L NEA Centro Nacional de Alimentaci n y Nutrici n Director General Wilfredo Salinas Castro Centro Nacional de Control de Calidad Director General Ruben Tabuchi Matsumoto Centro Nacional de Productos Biol gicos Director General Alberto Valle Vera Centro Nacional de Salud Intercultural Director General Oswaldo Salaverry Garc a Centro Nacional de Salud Ocupacional y Protecci n del Ambiente para la Salud Directora General Estela Ospina Salinas Centro Nacional de Salud P blica Director General Pedro Valencia V squez RGANOS DE ASESORAMIENTO Oficina General de Asesor a T cnica Director General Jos C rdenas C ceres Oficina General de Asesor a Jur dica Directora General Kirla Echegaray Alfaro Oficina General de Investigaci n y Transferencia Tecnol gica Director General Manuel Espinoza Silva RGANOS DE APOYO Oficina General de Administraci n Director General Jos Arr spide Aliaga Oficina General de Informaci n y Sistemas Director General Javier Vargas Herrera COMIT EDITOR INS2. Se refiere a la tuberculosis que presenta resistencia simult nea a isoniacida y rifampicina dos de los medicamentos m s potentes en el tratamiento antituberculoso 1 2 Siglas AC aseguramiento de la calidad BAAR bacilo alcohol cido resistente CSB cabina de seguridad biol gica CC control de calidad DMSO dimetil sulfoxido ESNP y CTB Estrategia Sanitaria Nacional de Prevenci n y Control de la Tuberculosis EEC evaluaci n externa de calidad EPP equipos de protecci n personal INH isoniacida INS Instituto Nacional de Salud MDR Multidrogorresistente Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS MODS m todo de ensayo de cultivo y susceptibilidad a medicamentos antituberculosis mediante observaci n microsc pica MTB Mycobacterium tuberculosis NaLC N acetil L ciste na NaOH hidr xido de sodio OADC suplemento de enriquecimiento cido oleico alb mina dextrosa y catalasa PSD prueba de susceptibilidad a drogas PANTA mezcla liofilizada de antibi ticos polimixina B amfotericina B cido nalidixico trimetroprim azlocilina RIF rifampicina TB tuberculosis UFC unidades formadoras de colonia QP qu micamente puro 5 FUNDAMENTO DEL M TODO El m todo se basa en la observaci n de cordones caracter sticos de Mycobacterium tuberculosis cuando crece en medio l quido los cuales son visuali
3. en caldo Middlebrook 7H9 suplementado se puede examinar y detectar las microcolonias en un promedio de siete d as Es un m todo mucho m s r pido que la detecci n del crecimiento macrosc pico de las colonias en medio s lido La incorporaci n de isoniacida y rifampicina en el proceso permite analizar r pida y directamente la detecci n de TB MDR La simplicidad de la t cnica la gran sensibilidad del medio y el crecimiento caracter stico de M tuberculosis la evaluaci n de la susceptibilidad frente a drogas en un corto tiempo y el bajo costo de los reactivos son sus mayores ventajas Investigar para proteger la salud 7 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud 2 4 OBJETIVO Disponer con de un m todo r pido para determinar el crecimiento y susceptibilidad de Mycobacterium tuberculosis a isoniacida y rifampicina en medio l quido por observaci n microsc pica CAMPO DE APLICACI N El m todo es aplicado en los laboratorios que han realizado la validaci n como un m todo r pido de tamizaje para la detecci n de resistencia a isoniacida y rifampicina en muestras de esputo de pacientes con tuberculosis pulmonar que a n no hayan iniciado tratamiento antituberculosis pacientes nunca tratados reca das o abandonos recuperados con frotis positivo o negativo n mero exacto de bacilos cido alcohol resistente O DEFINICIONES Y SIGLAS 1 1 Tuberculosis Multidrogo Resistente
4. n de decontaminaci n NaOH NALC no utilizado porque despu s de 24 horas el NALC pierde su acci n mucol tica CALDO MIDDLEBROOK 7H9 Medio liquido Middlebrook 7H9 con casitona y glicerol 900 ML suficiente para 200 muestras Componentes Caldo base Middlebrook 7H9 5 99 Glicerol 3 1mL Casitona 1 259 Agua destilada est ril 900ml Procedimiento Disolver 5 9 g del medio 7H9 en polvo en 900ml de agua destilada est ril conteniendo 3 1 mL de glicerol y 1 25 g de casitona Mezclar en constante agitaci n hasta que est completamente disuelto se recomienda usar pastillas magn ticas en el mezclador Esterilizar en la autoclave a 121 124 C por 15 min Enfriar y alicuotar 4 5 mL del medio en tubos de vidrio est riles de 16x 100 mm para las muestras y al cuotas de 10 8 mL para la preparaci n de las soluciones de antibi ticos y para los controles internos Tomar una muestra al azar de los tubos e incubarlos a 37 C por 48 horas luego dejarlos a temperatura ambiente durante las subsiguientes 48 horas para controlar la esterilidad que se traduce como ausencia de turbidez Registrar el lote la fecha de preparaci n y el volumen Investigar para proteger la salud 27 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud Disponer que se haga el control de sensibilidad del lote Registrar el d a en que se pone en uso y el d a en que se termine cada lote Almacenar el frasco y los tubos con las al cuotas de medio 7H9
5. n microsc pica MODS Que la aplicaci n de dicho m todo facilitar el examen de un gran n mero de muestras de esputo a fin de seleccionar aquellos pacientes que pudieran estar potencialmente infectados con Mycobacterium tuberculosis multirresistente MDR a los medicamentos que no hayan iniciado tratamiento antituberculosis pacientes nunca tratados reca das o abandonos recuperados con frotis positivo o negativo Susceptibilidad a Drogas de Mycobacterium tuberculosis mediante Observaci n Microsc pica MODS lo cual contribuir a incrementar los niveles de seguridad diagn stica de la Tuberculosis O Que mediante documento del Visto el Centro Nacional de Salud P blica alcanza entre otros el Manual j denominado M todo de Susceptibilidad a Drogas de Mycobacterium tuberculosis mediante Observaci n NICA De a ON 54 2 Microsc pica MODS V 01 para su aprobaci n por esta Jefatura Institucional Estando a lo propuesto por el Centro Nacional de Salud P blica con el visto bueno de la Sub Jefatura de la Oficina General de Asesor a T cnica y de la Oficina General de Asesor a Juridica y En uso de las atribuciones establecidas en el literal h del articulo 12 y el art culo 36 del Reglamento de Organizaci n y Funciones del Instituto Nacional de Salud aprobado por Decreto Supremo N 001 2003 SA y en concordancia con lo dispuesto en la Directiva N 001 INS OGAT V O2 Directiva para la Elaboraci n Revi
6. FOR 001 a Placa n Edici n N 01 A PRUEBA DE CULTIVO Y SUSCEPTIBILIDAD DIRECTA A F RMACOS POR EL M TODO DE OBSERVACI N MICROSC PICA P gina 01 de 01 MODS Responsable del proceso Lectura siz a 5 Li Lis 8 interpretacion de resultados Focha segin Anexo 5 de la Guia NODS UPCH versi n 12 1 li livo Fecha de proceso C HyRv y Nes susceptibilidad RIF C d de c Controles Positvos p oo NH usceptibiidad RIF Fecha de resultados C digolnS C digode origen cs q Cy Nia usceptiblidad RIF Fecha de resulta C digolnS C digode origen C amp Niy usceptibiidad RIF Fecha de resultados Cy Controles contaminaci n Ca Contaminaci n Negativos cruzada C eruzada LI C digo INS C digodeorigen C amp IN i Susceptiblidad RIE Fecha de resultados C digo INS C digode origen Cs O Nia usceptiblidad RIE Fecha de resultados C digo INS C digode origen cs kas Cy IN Susceptiblidad RIF o Responsable Fecha de resultados de lectura Donde Prueba de cutivo MODS Prueba de susceptibilidad a drogas MODS G Pazo A control 1 sin droga Postio Resistente Referencia t cnica Guia MODS UPCH versi n 12 1 208 i Pozo B control 2 sin droga Negativo Sense Lote de medio 749 Iiko Pozo socari e 04 poi l Indeterminado Indteminado Superisor Ri Pozo D Riampicina 10 ugm Contaminado c Contaminado Cs Control sin droga y sin muestra hor Mulgrgoresitnt NH y RIF 38 Inves
7. Posiivo Cultivo 04001608 160 INM kanina SES 21 RIE E Resistente a RIF Fecha de resultados C digoInS C digode origen C EES Postivo lc sii si 10 0002408 208 Ha sapaj essere a RIF Sensible a RIF Fecha de resultados 1071112008 i i C digoInS C digo de origen Cy ka Posiivo lc 10 00081 08 20 INHa 3 Sensible a INH Susceptiblidad RIF e Sensible a RIF heng Margoth Acurio Lourdes Garcia Margo Acurio Margot Acurio Margo Acurio Lourdes Garcia Margoth Acurio Lourdes Garcia de resultados tonem Donde Prueba de cultivo MODS Prueba de susceptibilidad a drogas MODS Cy Pozo A control 1 sin droga Positivo Resistente Referencia t cnica Guia MODS UPCH versi n 12 1 2008 Ci Pozo B control 2 sin droga Negativo Sensible Lote de medio 749 35 15 11109 Hag Pozo C Isocianida 0 4 pgm ll Indeterminado ll Indeterminado Supervisor Bigo Luis Asencios RIE Pozo D Rilampicina 1 0 pgm c Contaminado C Contaminado Cy Control sin droga y sin muestra MDR Mulidrogoresistente INH y RIF Investigar para proteger la salud 39 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud ANEXO I CRIOCONSERVACI N DE LAS CEPAS DE LOS CULTIVOS MODS Preparaci n del caldo Middlebrook 7H9 con 10 de glicerol para la criopreservaci n de las cepas Componentes Caldo base Middlebrook 7H9 0 94 g Glicerol 20 mL Agua destilada est ril 160 mL Suplemen
8. Tubos de vidrio est riles con tapa rosca de 16 x 100 mm Tubos de centr fuga de polipropileno base c nica de 15 mL o 50 mL Pipetas serol gicas de 10 mL Pipetas Pasteur Puntas de 200 UL 1000 uL con y sin filtro Jeringas de tuberculina en caso de no tener micropipetas Microplacas de polipropileno de 24 pozos Bolsas de polietileno tipo ziplock Filtros de 0 2 um para solventes acuosos Filtros de 0 2 um para solventes org nicos Tubos de microcentrifuga Probeta graduada de 1000 mL Matraz Erlenmeyer de 500 mL Matraz Erlenmeyer de 1000 mL Matraz Erlenmeyer de 2000 mL Propipetas de 50 mL Embudo de plastico de 15 cm de diametro Portatubos de 16 x 100 mm Bolsas de bioseguridad Crioviales de 2 mL Plumon indeleble Cinta indicadora para autoclave Cinta indicadora para horno Parafilm M Investigar para proteger la salud 11 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud Papel aluminio Pl sticos para pesar peque as cantidades o papel glycine Esp tulas peque as y delgadas de acero inoxidable para pesar Insumos Caldo Middlebrook 7H9 Casitona caseina pancreatica digestiva PANTA OADC ADC RIF quimicamente puro Sigma Cat R 3501 INH qu micamente puro Sigma Cat l 3377 DMSO Hidr xido de sodio en lentejas NaOH Citrato de sodio trib sico dihidratado N acetil L cisteina NaLC Fosfato de sodio dib sico anhidro Na HPO Fosfat
9. Un volumen aproximado de 1900 mL es suficiente para al menos 190 muestras Se recomienda que las soluciones stock el volumen total sean preparadas con anticipaci n El volumen total de las soluciones stock y las al cuotas que ser n almacenadas pueden ajustarse de acuerdo con las necesidades del laboratorio Procedimiento Mezclar 950 mL de la soluci n A con 950 mL de la soluci n B separar 50 mL de cada soluci n para ajustar el pH si fuera necesario Medir el pH el cual debe estar en 6 8 0 2 Para ajustar a adir la soluci n A para aumentar el pH A adir la soluci n B para bajar el pH Esterilice en la autoclave a 121 124 C por 15 min Rotular con el nombre del buffer y fecha de preparaci n Para confirmar la esterilidad de la soluci n buffer fosfato colocar una al cuota de 100 ul en un medio de agar nutritivo e incubar por 48 h a 37 C Almacenar en el refrigerador a 2 8 C por un mes Investigar para proteger la salud 25 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud Notas Cada muestra de esputo requiere 10 mL de la soluci n buffer fosfato pH 6 8 La soluci n buffer est ril puede ser almacenada en botellas est riles de 50 200 mL para ser usadas en el dia o ser almacenada en vol menes mayores Si se almacenan en vol menes mayores se puede alicuotar la cantidad necesaria de buffer el mismo d a del proceso de las muestras usando t cnicas est riles SOLUCI N DESCONTAMINANTE N
10. con las tapas bien cerradas a 2 8 C por el periodo de un mes Notas Cada muestra de esputo y los controles internos requieren tubos que contengan 4 5 mL de medio 7H9 Cada tubo con 10 8 mL de medio 7H9 es suficiente para preparar las soluciones de antibi ticos y para los controles internos de quince muestras de esputo La cantidad a prepararse mL depende de las necesidades de cada laboratorio Si se almacena en frascos de mayor volumen se puede repartir el medio de forma est ril el mismo d a de proceso de las muestras Mezcla de antibi ticos PANTA 28 Es una mezcla de antibi ticos que se comercializa en forma liofilizada y que puede ser agregada al medio Middlebrook 7H9 Luego de reconstituida en agua destilada est ril 3 mL la mezcla contiene por mL de soluci n Polimixina B 2000 unidades Anfotericina B 200 ug Acido nalidixico 800 ug Trimetoprima 200 ug Azlocilina 200 ug La soluci n debe ser utilizada dentro de las 72 h despu s de reconstituirla Si se quiere mantener la eficiencia del PANTA por m s tiempo se debe de alicuotar en crioviales cantidades de 500 uL aproximadamente para luego colocarlas en refrigeraci n a 20 C por un mes Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS ANEXO C PREPARACI N DE ANTIBI TICOS STOCK DE INH 8 mg mL Componentes Isoniacida 20 mg Agua destilada est ril 2 5mL Pro
11. de protecci n personal respiradores N95 mandiles doble guante Todos los procedimientos deben ser realizados cuidadosamente con el objetivo de minimizar la producci n de aerosoles Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas diariamente antes y despu s de terminar el trabajo con alcohol al 70 o hipoclorito de sodio al 3 En caso ocurra cualquier derrame de material peligroso sobre las superficies de trabajo deben ser descontaminadas inmediatamente de acuerdo con el procedimiento interno Todos los residuos s lidos peligrosos deben ser descontaminados antes de ser descartados Losanalistas deben recibir entrenamiento en bioseguridad sobre los riesgos potenciales asociados al trabajo desarrollado 6 3 Equipos insumos y materiales Autoclave Balanza anal tica 200 g 1 9 Potenci metro medidor de pH Calentador Hot plate con barras de agitaci n magn ticas Refrigeradora 4 C Congeladora 20 C o 70 C Microscopio de luz invertida objetivos 4x y 10x 10 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS Micropipetas autom ticas 1000 uL 200 UL 20 uL Pipetas multicanal Termometros control de temperatura Vortex Cabina de bioseguridad de clase ll tipo A2 Incubadora 37 C Centrifuga para trabajar a 3000 g x 15 min puede ser refrigerada Materiales
12. n 1 1 Asegurar bien la tapa y mezclar en el agitador por 20 s mover el tubo por inversi n para asegurar que la soluci n NaOH NALC est en contacto con todo el interior del tubo y con la tapa Dejar reposar dentro de CSB por un m nimo de 15 min Puede prologarse por unos minutos m s si la muestra es demasiado mucoide Evitar el tiempo de sobreexposici n este no debe exceder los 20 min Adicionar buffer fosfato pH 6 8 para neutralizar la reacci n alcalina y terminar con el proceso de descontaminaci n mezclar bien invirtiendo el tubo por cuatro veces Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N 6 5 1 6 5 2 MICROSC PICA MODS Centrifugar a 3000 g por 15 min Decantar cuidadosamente el sobrenadante en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 3 u otro desinfectante apropiado mantener el sedimento de la muestra Resuspender el sedimento de la muestra con 2 mL del medio 7H9 OADC PANTA 5 1 mL Homogenizar bien la suspensi n evitando formar burbujas de aire De esta suspensi n de la muestra extraer 1 mL y hacer la siembra en dos tubos con medio L J a raz n de 0 2 mL por tubo y el resto en un criovial para conservarlo a 2 8 C como muestra de contingencia A adir el otro mililitro de la suspensi n de la muestra al resto del medio 7H9 OADC PANTA que est en el tubo mezclar bien Esta es la suspensi n final de la muestra lista par
13. reproducci n total o parcial siempre y cuando se cite la fuente SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS NDICE 1 Introducci n 7 2 Objetivo 8 3 Campo de aplicaci n 8 4 Definiciones y SIGLAS 8 5 Fundamento del m todo 9 6 Desarrollo del m todo de ensayo 9 6 1 Condiciones previas 9 6 2 Aspectos de bioseguridad 10 6 3 Equipos Insumos y materiales 10 6 4 Prean lisis 12 6 5 Procedimiento anal tico 14 Preparaci n final de la placa MODS 15 Preparaci n Control positivo 15 Lectura de placas 16 6 6 Interpretaci n de resultados 17 6 7 Informe de resultados 19 7 Referencia Bibliogr ficas 20 8 ANEXOS Anexo A Fujograma del m todo de an lisis MODS 21 Anexo B Preparaci n de soluciones y medio de cultivo 25 Anexo C Preparaci n de antibi ticos 29 Anexo D Escala est ndar Mc Farland N 1 32 Anexo E Aseguramiento de la calidad 34 Anexo F Lectura e interpretaci n de los resultados 36 Anexo G Formulario de reporte de los resultados 38 Anexo H Ejemplo de registro del formulario de informe de resultados 39 Anexo Crioconservacion de los cultivos MODS 40 Investigar para proteger la salud 3 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud 4 Investigar para proteger la salud SECTOR SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD N 388 2011 J OPEJINS RESOLUCI N JEFATURAL Lima 22 de diciembre de 2011 VISTO El Informe N 199 201
14. 1 DG CNSP INS de fecha 22 de diciembre del 2011 del Centro Nacional de Salud P blica que alcanza los Manuales de Procedimientos de Laboratorio y CONSIDERANDO Que mediante Decreto Supremo N 001 2003 SA del 09 de enero del 2003 se aprueba el Reglamento Zye Organizaci n y Funciones del Instituto Nacional de Salud el cual se ala entre sus objetivos funcionales fortalecer la capacidad de diagn stico en el mbito nacional para la prevenci n y control de desgos y da os asociados a las enfermedades trasmisibles y no trasmisibles as como fortalecer el sistema de control de calidad de los alimentos productos farmac uticos y afines como organismo de referencia nacional Que de acuerdo a lo establecido en el art culo 36 del mismo texto normativo el Centro Nacional de S N Salud P blica es el rgano de l nea del Instituto Nacional de Salud encargado de normar desarrollar DAA A evaluar y difundir de manera integral la investigaci n en salud p blica y las tecnolog a apropiadas para la z prevenci n y el control de las enfermedades transmisibles y no transmisibles aportando criterios t cnicos para la formulaci n de pol ticas que orienten la atenci n de salud en el rea de su competencia A Que es necesario disponer de un m todo r pido para determinar el crecimiento y susceptibilidad del Mycobacterium tuberculosis a drogas como la isoniacida y la rifampicina en medio l quido mediante la observaci
15. Anexo C Empleando una micropipeta retirar 200 uL del pozo D de la columna 2 y a adir 200 uL de la diluci n 1 de RIF al mismo pozo D de la microplaca mezclar bien 10 ug mL RIF soluci n de trabajo ver Anexo C Empleando una micropipeta multicanal cargar 100 uL de la soluci n de trabajo de los pozos A B C y D de la columna 2 y dispensar a los pozos A B C y D de la columna 1 de una nueva microplaca destinada para las muestras Repetir el mismo procedimiento hasta llenar todos los pozos de la microplaca incluyendo el control negativo de la columna 3 Separar en tubos de polipropileno de 15 o 50 mL el volumen requerido de la soluci n buffer fosfato pH 6 8 para enrasar de acuerdo a la capacidad del tubo utilizado en proceso de cada muestra de esputo ver Anexo B Separar en tubos de polipropileno de 15 o 50 mL la soluci n stock de NaOH citrato de sodio para la descontaminaci n de las muestras de esputo ver Anexo B Cada 2 mL de muestra de esputo requiere 2 mL de soluci n NaOH citrato de sodio Pesar la cantidad necesaria de NaLC que se va a a adir a la soluci n NaOH citrato de sodio ver Anexo B Dispensar 4 5 mL de caldo 7H9 a los tubos 16 x 100 mm para las muestras de esputo y a adir 0 5 mL de OADC a cada tubo Reconstituir PANTA y a adir 0 1mL a los tubos con 4 5 mL caldo 7H9 0ADC para muestras y controles negativos ver Anexo B Investigar para proteger la salud 13 INSTITUTO NACIONAL DE SA
16. EDICAMENTOS 2 OBSERVACI N m todos 3 ISONIAZIDA 4 RIFAMPIN 5 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 6 PER Asencios Sol s Luis Acurio Usca Margoth Quispe Torres Neyda Vasquez Campos Lucy Instituto Nacional de Salud Per Per Ministerio de Salud ISBN 978 612 310 002 5 Hecho el Dep sito Legal en la Biblioteca Nacional del Per Ne 2012 01 107 Tiraje 500 ejemplares 1ra edici n O Ministerio de Salud 2012 Av Salaverry cuadra 8 s n Jes s Mar a Lima Per Tel fono 511 431 0410 Telefax 01 3156600 anexo 2669 P gina web www minsa gob pe O Instituto Nacional de Salud 2012 C pac Yupanqui 1400 Jes s Mar a Lima Per Tel fono 617 6200 Correo electr nico postmasterGins gob pe P gina Web www ins gob pe Norma T cnica aprobada con Resoluci n Jefatural N 388 201 1 J OPE INS Dise o y diagramaci n Segundo Eliades Moreno Pacheco Correcci n de estilo Lic Daniel C rdenas Rojas La versi n electr nica de este documento se encuentra disponible en forma gratuita en www ins gob pe Este Manual ha sido desarrollado en el marco del Proyecto Haciendo la diferencia consolidando una respuesta amplia e integral contra la Tuberculosis en el Per Octava Ronda Fondo Mundial Componente Tuberculosis bajo los t rminos de donaci n Acuerdo de Subvenci n PER 809 GO07 T suscrito entre el Ministerio de Salud y el Fondo Mundial Receptor Principal PARSALUD 11 Primera Fase Se autoriza su
17. LUD Investigar para proteger la salud 14 Separar dos tubos con 5 mL de 7H9 0ADC para los controles positivos estos no requieren PANTA Muestras de esputo La cantidad m nima de muestra requerida es 2 mL con tiempo de recolecci n no mayor a 72 h de pacientes con diagn stico de TB pulmonar con baciloscop a positiva o negativa que a n no hayan iniciado tratamiento antituberculosis pacientes nunca tratados reca das o abandonos recuperados En caso de que la muestra no se procese el mismo d a de la recolecci n conservar la muestra en refrigeraci n de 4 a 8 C Enviar la muestra al laboratorio dentro de las 72 h 3 d as de haber sido recolectada Todas las muestras de esputo deben ser recolectadas en recipientes pl sticos de boca ancha y tapa rosca suministrados por la ESNP y CTB Las muestras de esputo son recolectadas en establecimientos de salud bajo la supervisi n de trabajadores de salud capacitados quienes instruyen a los pacientes sobre la forma de obtener la muestra de esputo adecuada durante la consulta con el m dico primera muestra y la segunda muestra tomada en la ma ana siguiente despu s de la consulta Las muestras deben ser transportadas siguiendo el protocolo establecido para la red de laboratorios 6 5 Procedimiento anal tico Procedimiento de descontaminaci n Colocar 2 mL de esputo en un tubo de polipropileno de centr fuga de 15 mL o 50 mL A adir 2 mL de la soluci n NaOH NaLC a una proporci
18. TITUTO NACIONAL DE SALUD PRESIDENTE C sar Cabezas S nchez MIEMBROS Rosario Belleza Zamora Zu o Burstein Alva Daniel C rdenas Rojas Flor Fuentes Paredes Lucio Huam n Espino Charles Huamani Salda a Oswaldo Salaverry Garc a Diana Vergara N ez Liliana Vigil Romero Javier Vargas Herrera Secretar a T cnica Bertha Huarez Sosa PROGRAMA DE APOYO A LA REFORMA EN EL SECTOR SALUD PARSALUD II Coordinadora General Paulina Giusti Hundskopf Coordinador T cnico Walter Vigo Valdez Coordinadora del Proyecto Octava Ronda Fondo Mundial Rosa In s B jar C ceres Especialista en Laboratorio Jessica Alvarado Guerrero Y Ministerio Instituto Nacional LI de Salud de Salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACION MICROSCOPICA MODS ELABORADO POR Blgo LUIS ASENCIOS SOLIS Blga MARGOTH ACURIO USCA Blga NEYDA QUISPE TORRES Blga LUCY VASQUEZ CAMPOS LIMA 2011 Catalogaci n hecha por el Centro de Informaci n y Documentaci n Cient fica del INS Asencios Solis Luis Acurio Usca Margoth Quispe Torres Neyda y Vasquez Campos Lucy Susceptibilidad a drogas de Mycobacterium tuberculosis mediante observaci n micro sc pica MODS Elaborado por Luis Asencios Sol s Margoth Acurio Usca Neyda Quispe Torres y Lucy Vasquez Campos Lima Ministerio de Salud Instituto Nacional de Salud 2012 41 p il tab 14 5 x 22 5 cm 1 TUBERCULOSIS RESISTENTE A M LTIPLES M
19. a dispensarse en la placa Los tubos que contienen PANTA 7H9 OADC PANTA se emplean para las muestras y para los controles negativos Se emplea 7H9 OADC sin PANTA para los controles positivos y para la preparaci n de la soluci n de INH y RIF Preparaci n final de la placa de MODS Dispensar 900 uL de la suspensi n final de la muestra a cada uno de los cuatro pozos de la placa de 24 pozos Excepto los pozos de la columna 3 Dispensar 900 uL del medio 7H9 OADC PANTA sin muestra en los 4 pozos de la columna 3 de cada placa de MODS controles internos negativos Cerrar la placa colocar en una bolsa de polietileno tipo ziplock y cerrar la bolsa no se debe abrir de ahora en adelante Incubar a 37 C entre 5 a 21 d as Preparacion de las cepas control positivo Control de Calidad Interno Cada vez que se procesan muestras deben incluir dos cepas control positivo sensible y resistente INH y RIF Mezclar 5 uL de cada suspensi n de cepas escala MacFarland N 1 con 5 mL del medio 7H9 0ADC Investigar para proteger la salud 15 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud 16 Empleando una pipeta multicanal adicionar a los cuatro pozos 100 uL de caldo 7H9 0ADC y la soluci n de trabajo de antibi ticos igual que para las muestras Alicuotar 900 uL de cada suspensi n de cepas en los cuatro pozos de una columna en la placa separada para los controles positivos Cerrar la placa y
20. aOH NALC Soluci n stock de NaOH citrato de Na 4 NaOH 2 996 citrato de sodio para la descontaminaci n de las muestras de esputo 400 mL suficiente para 200 muestras Componentes Hidr xido de sodio 8 09 Citrato de sodio 5 89 Agua destilada 400 mL Procedimiento 26 Disolver 8 0 g de hidr xido de sodio en 200 mL de agua destilada Disolver 5 8 g de citrato de sodio en otros 200 mL de agua destilada Combinar las soluciones de hidr xido de sodio y citrato de sodio en vol menes iguales Mezclar y esterilizar en el autoclave a 121 124 C por 15 min Rotular con el nombre del reactivo y fecha de preparaci n Almacenar en refrigeraci n a 2 8 C por un mes Notas Cada 2 mL de muestra de esputo requiere 2mL de soluci n NaOH citrato de Na Se puede almacenar la soluci n stock en al cuotas de menor volumen usando tubos tapa rosca el volumen apropiado va a depender de la cantidad de muestras que se procesan por d a Disolver 0 1g de los cristales de NALC por cada 20 mL de la soluci n de descontaminaci n 0 5 de NALC en NaOH citrato de Na soluci n de descontaminaci n NaOH NALO Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS Preparaci n de la soluci n de descontaminaci n Mix N mero de muestras ara Na NALC g 10 20 0 1 20 40 0 2 50 100 0 5 100 200 1 0 Notas Descartar el remanente de la soluci
21. be repetirse c Controles internos negativos e Los controles internos negativos se realizan en cada placa con las muestras que se procesa cada d a los resultados se deben registrar en las hojas de trabajo junto con los resultados de las muestras c Control de esterilidad del medio Medio l quido caldo 7H9 en tubos e Verificar que el caldo sea transparente ligeramente amarillo e Seleccionar al azar cinco tubos de cada lote de medio reci n preparado e incubar a 37 C entre 48 a 72 h e Verificar que los caldos incubados se mantengan transparentes si presentan turbidez descartar todo el lote preparado 34 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS d Eliminaci n de las placas e Mantener todas las placas en sus respectivas bolsas ziplock colocarlas en bolsas de autoclave y sellar la bolsa e Esterilizaren la autoclave a 121 124 C durante 45 60 minutos e Descartar las bolsas de autoclave ya esterilizadas en los lugares designados para este prop sito Nota Una vez que las placas de MODS est n con las muestras estas permanecer n en sus bolsas ziplock selladas as contengan cultivos positivos o no Investigar para proteger la salud 35 iNSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud ANEXO F LECTURA E INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS Los resultados para la mayor a de las muestras procesada
22. cedimiento Disolver completamente 20 mg de INH en 2 5 mL de agua destilada est ril Filtrar empleando un jeringa de 0 2 um para solventes acuosos Almacenar en al cuotas de 20 ul en tubos est riles de microcentrifuga a 20 C hasta por 6 meses Notas Cada al cuota almacenada de 20 ul es suficiente para 100 muestras incluyendo sobrantes STOCK DE RIF 8 mg mL Componentes Rifampicina 20 mg Dimetil sulfoxido 1 25 mL Agua destilada est ril 1 25 mL Procedimiento Disolver completamente 20 mg de RIF en 1 25 mL de DMSO A adir 1 25 mL de de agua destilada est ril y mezclar Filtrar empleando un filtro de jeringa de 0 2 um para solventes org nicos Almacenar en al cuotas de 20 ul en tubos est riles de microcentrifuga a 20 C hasta por 6 meses Notas Cada al cuota almacenada de 20 ul es suficiente para 100 muestras incluyendo sobrantes Investigar para proteger la salud 29 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud Sol 30 Cada al cuota congelada de 8 mg mL de la soluci n stock de antibi tico es suficiente para 100 pozos de INH o RIF Los vol menes de 2 mL de medio y la soluci n de trabajo de los antibi ticos preparados en la columna 2 son suficientes para tres placas de MODS que corresponde a quince muestras de esputo tres controles negativos y dos controles positivos estos ltimos van en una placa aparte Si se van a procesar mas muestras se puede emplear la columna 3
23. cesan para MODS Los controles positivos eval an la calidad del medio y la efectividad de los antibi ticos Para disminuir el riesgo de contaminaci n cruzada estos controles positivos son procesados y colocados en una placa diferente este proceso se realiza despu s de que las muestras cl nicas hayan sido procesadas y selladas en bolsas pl sticas tipo ziplock Para evaluar la contaminaci n cruzada se debe de correr los controles internos negativos en cada placa Investigar para proteger la salud 33 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud ANEXO E ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD a Cepas de referencia para control de calidad e Cepa de MTB H37Rv pansensible procedentes de ATCC American Type Culture Collection o de los Laboratorios Supranacionales de la OPS OMS e Cepa resistente a isoniacida ATCC e Ceparesistente a rifampicina ATCC o de los Laboratorios Supranacionales de la OPS OMS b Control de calidad interno e La cepa de referencia sensible debe ser utilizada cada vez que se corre la prueba La cepa sensible no debe tener crecimiento en medios que contienen concentracion critica de los medicamentos Si se observa crecimiento la prueba no es valida y debe repetirse e Las cepas de referencia Resistente debe ser utilizada cada vez que se corre la prueba La cepa resistente crece en los medios que contiene las concentraciones criticas Si no se observa crecimiento la prueba no es valida y de
24. ci n y Desarrollo Manual para el diagn stico bacteriol gico de la tuberculosis Normas y gu a t cnica Parte Il Cultivo 2008 OPS Caviedes L 2000 Rapid efficient detection and drug susceptibility testing of MTB in sputum by microscopic observation of broth cultures J Clin Microbiol Norma T cnica N 10 Manual de Normas y Procedimientos de Bacteriolog a de la Tuberculosis pp 67 1995 Lima Per www cdc gov tb publications reportsarticles mmwr mmwr_mdrtb htm Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS 8 ANEXOS ANEXO A FLUJOGRAMA DEL METODO DE ANALISIS MODS Dispensar 4 5 mL de medio 7H9 a los tubos de trabajo A adir 0 5 mL OADC al medio 7H9 7H9 OADC Reconstituir el PANTA agregar 100HL 7H9 OADC PANTA Preparar la solu ci n de trabajo de los antibi ticos en la placa de 24 pozos 100 uL de INH y RIF a cada pozo Dispensar los vol menes reque ridos del stock de NaOH citrato de Na buffer fosfato y pesar el NALC cantidad necesaria Muestra de esputo con volumen no menor a 2mL Transvasar 2mLde muestra de esputo a tubo Falcon de 15mL o 50 mL Agregar 2 mL de la soluci n NAOH NALC Investigar para proteger la salud 21 9 Mezclar con vortex los tubos 14 Resuspender el sedimento con Do por 20 s mover 2 mL de caldo el tubo por Middlebroo
25. colocarla en la bolsa tipo ziplock Incubar a 37 C junto con las otras placas procesadas el mismo d a 6 5 3 Lectura de las placas Un resultado positivo es definido como el crecimiento de dos o m s unidades formadoras de colonia gt 2 ufc en cada uno de los pozos sin droga Las placas son retiradas de la incubadora para su observaci n en el microscopio de luz invertida con las bolsas selladas las cuales no deben abrirse La lectura de las placas se inicia por los pocillos sin antibi ticos en el d a 5 de incubaci n En sus inicios entre los d as 5 a 9 el crecimiento de MTB se observa como peque as curvas comas o espirales La formaci n de las colonias por lo general progresa a la formaci n de cordones y luego a un crecimiento irregular m s enmara ado Para las lecturas iniciales examinar los pozos con el objetivo 10X aumento total de 100X en el microscopio de luz invertida buscando el temprano crecimiento de las microcolonias Para subsecuentes lecturas se utiliza el objetivo de 4X 40X total de aumento para examinar todo el contenido de cada pocillo No es muy com n la contaminaci n con bacterias u hongos pero usualmente aparece al d a 5 un aspecto turbio y con crecimiento abundante Si se produce la contaminaci n se deben volver a descontaminar y reprocesar las al cuotas de la muestra de contingencia o solicitar una nueva muestra al paciente Los medios de cultivo no deben tener un aspecto t
26. cos etc Colocar todo el material infeccioso para descartar en una bolsa de autoclave y sellar Esterilizar en la autoclave a 121 124 C por 45 60 minutos Investigar para protegerla salud 41 Este documento se termin de imprimir en los talleres gr ficos de AGL gr fica color SRL Pasaje Monte Eucalipto 140 Santiago de Surco Telf 511 242 7199 2012 978 612 310 002 5 02 5 6123 II ISBN 9478 Instituto Nacional de Salud Jir n C pac Yupanqui 1400 Lima 11 Per Tel fonos 0511 617 6200 Fax 0511 617 6244 Correo electr nico postmastereWins gob pe P gina web www ins gob pe y El Fondo Mundial CONAMUSA
27. e Usar para trabajo controles positivos 4 Retirar 200 uL 7H9 OADC de los pozos 2C 82D A adir 200 UL del stock 2 de INH amp RIF a los pozos respectivos diluci n 1 en 10 Investigar para proteger la salud 31 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud ANEXO D ESCALA ESTANDAR DE MCFARLAND 1 0 La preparaci n de la suspensi n de bacterias ajustada a la escala Mac Farland N 1 debe llevarse a cabo solo en cabinas de bioseguridad clase ll tipo A2 Si las cepas control no est n comercialmente disponibles se pueden emplear cepas locales caracterizadas y con un patr n de susceptibilidad conocido cepa sensible a todas las drogas y cepa mono resistente a RIF y mono resistente a INH Requisitos Cepa H Rv de MTB ATCC 27294 control sensible o cepa de referencia pan sensible Cepa mono resistente a RIF Cepa mono resistente a INH Agar Middlebrook 7H11 5 OADC en placas Petri Soluci n est ril de Tween 80 al 10 40 uL Agua destilada est ril 10 mL Procedimiento Reconstituir con la soluci n acompa ante la cepa control comercialmente preparado Colocar la soluci n de la cepa en una placa Petri conteniendo agar Middlebrook 7H11 recuperaci n y criopreservaci n de cultivos positivos de MODS Incubar a 37 C por 15 20 d as El mismo d a de la preparaci n de la suspensi n de la cepa MacFarland 1 mezclar 10 mL de agua destilada est ril y 40uL de soluci n est ril de Twee
28. erminado Investigar para proteger la salud 17 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud 6 6 1 Determinaci n de la resistencia a medicamentos antituberculosis Los pozos con antibi ticos solo deben examinarse cuando los pozos sin droga son positivos gt 2 UFC La resistencia es definida como el crecimiento gt 2 UFC en los pozos con drogas INH y RIF el mismo d a en que ambos pozos sin droga son positivos Si hubiese crecimiento en un pozo que contiene droga la muestra es resistente a esa droga a la concentraci n espec fica si no hay crecimiento significa que la muestra es sensible Si existe crecimiento en ambos pozos conteniendo INH y RIF la muestra es considerada MDR Los pozos con droga NO deben volver a examinarse despu s del d a que los pozos sin droga hayan sido identificados como positivos Despu s de una incubaci n prolongada el progreso en el crecimiento en los pozos con droga no es indicativo de resistencia El crecimiento de MTB resistente en los pozos que contienen drogas suele ser f cilmente identificable cuando los pozos sin droga son positivos En pocas ocasiones es detectado una sola UFC en los pozos que contienen droga si esto sucediera la interpretaci n es indeterminada Observaci n de los pozos C o D Interpretaci n de los que contienen drogas hallazgos en los pozos No hay crecimiento 0 UFC Sensible Crecimiento de gt 2 UFC Resistente Crec
29. imiento de solo 1 UFC Indeterminado Crecimiento de bacterias hongos Contaminado 18 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS Interpretaci n Interpretaci n total de la susceptibilidad a los medicamentos antituberculosis Combinando los hallazgos en ambos pozos C y D No hay crecimiento en ninguno de los pozos conteniendo medicamento Sensible no es MDR antituberculosis Crecimiento solo en el pozo con INH Resistente a INH no es MDR Crecimiento solo en el pozo con RIF Resistente a RIF no es MDR Crecimiento en ambos pozos con drogas MDR Crecimiento de 1 UFC en cualquier pozo Indeterminado para ese con medicamento antituberculosis medicamento antituberculosis Cualquiera de los pozos con medicamento antituberculosis contaminado Indeterminado para ese medicamento antituberculosis 6 7 Informe de resultados Determinaci n del crecimiento de micobacterias mediante cultivo Positivo Negativo Indeterminado Contaminado Determinaci n de la resistencia a medicamentos antituberculosis Resistente Sensible MDR Contaminado Indeterminado Investigar para proteger la salud 19 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud 7 REFERECIAS BIBLIOGR FICAS 20 MODS Gu a del usuario Microscopic observation drug susceptibility assay 2008 Universidad Peruana Cayetano Heredia Laboratorio de Investiga
30. k 7H9 OADC PANTA inversi n para homogenizar 15 Sembrar en medio s lido L J 0 2 mL x tubo agregar 1mL al caldo 7H9 para MODS y guardar el resto como backup 10 Dejar reposar por 15 min a dentro de la CSB 11 Agregar PBS por muestra 16 Homogenizar bien la suspensi n evitando la formaci n de burbujas de aire 12 Centrifugar por 15 min a 3000 g 17 Distribuir 900 UL de la suspensi n final de la muestra hasta que la placa este llena excepto la columna 3 13 Decantar el sobrenadante 18 Dispensar 900uL del medio 7H9 OADC PANTA sin muestra en los cuatro pozos de la columna 3 controles negativos internos 22 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N 19 20 21 22 Cerrar las placas con su respectiva tapa y colocar en una bolsa tipo ziplock Incubar a 37 C y posteriormente proceder a la lectura a partir del quinto dia Mezclar 5 uL de cada suspensi n de cepas ajustadas a la escala de 1 de MacFarland con 5 mL de medio 7H9 OADC Dispensar los controles positivos en los pozos no utilizados donde se prepar la soluci n de antibi ticos Fuente Laborat rio de Micobacterias INS MICROSC PICA MODS 23 24 26 27 Cerrar la placa y colocar en una bolsa tipo ziplock Incubar a 37 9C junto a las placas de las muestras p
31. n 80 al 10 en un tubo est ril concentraci n final de Tween 0 04 Utilizando un asa de siembra est ril extraer varias colonias de micobacterias y colocarlas en un tubo est ril con perlas de vidrio que contenga 100 uL de la soluci n salina Tween 80 Asegurar fuertemente la tapa del tubo y mezclar en el agitador por 2 3 minutos dejar reposar por cinco minutos Abrir el tubo y a adir 3 mL de la soluci n salina Tween 80 asegurar bien la 32 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS tapa del tubo y mezclar en el agitador por 20 segundos Dejar reposar por 30 minutos Transferir el sobrenadante a otro tubo est ril empleando una pipeta de transferencia Ajustar la turbidez a la escala 1 de MacFarland aprox 3x108 UFC mL con soluci n salina Tween 80 La suspensi n de bacterias a escala 1 de MacFarland se debe mantener bien sellada y refrigerada a 2 8 C para ser empleada posteriormente por un periodo no mayor a 15 d as Elresto de colonias que quedan en la placa Petri pueden ser repicados en una nueva placa Petri con agar 7H11 para mantener futuros repiques Prepararlas para congelarlas por un largo periodo Notas Las cepas bien caracterizadas de MTB una cepa sensible y cepas mono resistentes a INH y RIF son usadas como controles positivos estos se emplean cada vez que las muestras cl nicas se pro
32. o de potasio monob sico en cristales KH PO Hipoclorito de sodio al 10 Glicerol QP Agua destilada est ril 70 v v etanol 6 4 Prean lisis Retirar de la congeladora la soluci n stock de los antibi ticos 8 mg mL dejar descongelar a temperatura ambiente Preparaci n de la soluci n de trabajo de los antibi ticos en la microplaca de 24 pozos Disponer de dos tubos con 10 8 mL de caldo 7H9 a adir a estos tubos 1 2 mL del suplemento OADC volumen total 12 mL Dispensar 1 mL del caldo 7H9 0ADC a los pozos C y D de la columna 1 de la microplaca Empleando una micropipeta retirar del pozo C 5 uL de medio y a adir 5 uL de la soluci n stock de INH Mezclar bien 0 04 mg mL 40 ug mL INH diluci n 1 ver anexo C 12 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS Empleando una micropipeta retirar del pozo D correspondiente a ri fampicina 12 5 uL de medio y luego a adir 12 5 uL de la soluci n stock de RIF mezclar bien 0 1 mg mL 100 ug ML RIF diluci n 1 ver Anexo C Preparaci n de la soluci n de trabajo Dispensar 2 mL de caldo 7H9 0ADC a los 4 pozos A B C y D de la columna 2 de la microplaca Empleando una micropipeta retirar 200 uL del pozo C de la columna 2 y a adir 200 uL de la diluci n 1 de INH al mismo pozo C de la microplaca mezclar bien 4 ug mL INH soluci n de trabajo ver
33. rocesadas el mismo dia La lectura de las placas se inicia por los controles internos y examinados e interpretados correctamente antes de que los resultados se consideren validos El crecimiento de MTB se caracterizan por que las colonias lucen como peque as curvas comas o espirales Investigar para proteger la salud 23 iNSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud ANEXO A continuaci n DISTRIBUCI N FINAL DE LA PLACA MODS Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Control Control Control Control A sin sin i sin sin droga droga droga droga Control Control Control Control Control B sin sin sin sin sin droga droga Control D negativo INH isoniacida RIF rifampicina 24 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS ANEXO B PREPARACI N DE SOLUCIONES Y MEDIO DE CULTIVO BUFFER FOSFATO Buffer fosfato pH 6 8 0 067M Componentes Fosfato de sodio di b sico anhidro Na HPO 9 47 g Fosfato de potasio monob sico en cristales KH PO 9 07 g Agua destilada 2 000 mL Preparaci n Soluci n A Na HPO fosfato de sodio dib sico Disolver 9 47g de fosfato de sodio dib sico en 1000 mL de agua destilada Soluci n B KH PO fosfato de potasio monob sico Disolver 9 07 g de fosfato de potasio monob sico en 1000 mL de agua destilada Soluci n final del buffer fosfato pH 6 8
34. s por MODS son claramente positivas muchas colonias o claramente negativas no hay crecimiento La dificultad se presenta nicamente cuando el crecimiento es m nimo o si la contaminaci n est presente Pozo A Pozo B Interpretaci n db Positivo Negativo E Contaminado C Contaminado E Contaminado C Contaminado E Contaminado C Contaminado Contaminado Indeterminado dr Indeterminado Indeterminado ella Indeterminado Indeterminado aof Indeterminado Indeterminado significa 2 2 ufc en el pozo significa 1 ufc en el pozo significa no crecimiento en el pozo C significa contaminaci n en el pozo y no crecimiento visible de MTB 36 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS Susceptibilidad a isoniacida y rifampicina Pozo C Pozo D INH 0 4 ug mL RIF 1 0 pg mL Interpretaci n Sensible a isoniacida y rifampicina Resistente a isoniacida rifampicina indeterminado Sensible a Isoniacida y resistente a rifampicina Isoniacida indeterminado resistente a i rifampicina Investigar para proteger la salud 37 ANEXO G FORMULARIO DE REPORTE DE RESULTADOS FORMULARIO
35. si n Aprobaci n Difusi n Actualizaci n y Control de los Documentos Normativos del Instituto Nacional de Salud aprobada mediante Resoluci n Jefatura N 310 2010 J OPE INS SE RESUELVE Art culo 1 Aprobar el Manual Susceptibilidad a Drogas de Mycobacterium tuberculosis mediante Observaci n Microscopica MODS V 01 Art culo 2 Encargar a los Directores Generales dentro del mbito de su competencia comunicar y difundir entre el personal a su cargo la presente Resoluci n Articulo 39 Encargar a la Oficina Ejecutiva de Organizaci n la difusi n de la presente Resoluci n en el Portal de Normatividad Virtual Reg strese y comuniquese e 5 REL ci VADI E gra Mia SN 6 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS 1 INTRODUCCI N El m todo de MODS Microscopic Observation Drug Susceptibility assay se basa en un cultivo directo de muestras de esputo en medio l quido que detecta Mycobacterium tuberculosis y eval a la susceptibilidad frente a isoniacida y rifampicina directamente de dichas muestras El m todo se basa en que el crecimiento bacteriano en forma de cordones se visualiza tempranamente en medio l quido a trav s de un microscopio de luz invertida Empleando un microscopio ptico de luz invertida y una placa de 24 pozos con muestras de esputo decontaminadas y resuspendidas
36. tigar para proteger la salud ANEXO H EJEMPLO DEL REGISTRO DEL FORMULARIO DE REPORTE DE RESULTADOS FORMULARIO FOR 001 y Placa n Edici n N 01 PRUEBA DE CULTIVO Y SUSCEPTIBILIDAD DIRECTA A F RMACOS POR EL M TODO DE OBSERVACI N MICROSC PICA P gina 01 de 01 MODS Responsable del proceso Lectura e A su a p e Te 8 linterpretacion de resultados Fecha 404112008 124412008 441112008 171112008 19112008 21712008 2412008 26 14 2008 seg n Anexo 5de la Gu a MODS UPCH versi n 12 1 Biga Margot Acurio c 1 Posiivo Cultivo Fecha de proceso lc HyRv 5 1 05 14 2008 Ln Suscepitiidad Seda INA IF Sensible a RIF C digo de G kas Positivo di z Controles Positivos ypg VI 001 08 LE Sacate POR RE Fecha de resultados 10 11 2008 i ni C digoINS C digo de origen C I Posiivo P P 4 vi 10 00001 08 TA kana POR RIF Fecha de resultados C digoINS C digo de origen Cy Ls Negativo lc a i 5 00001508 166 INM kanina Pego Rio i ii li li ki li i Fecha de resultados 26 11 2008 lcs E i z Negativo Controles contaminaci n C ii Ni i ki Ei ES E Ni Contaminaci n Negativos cruzada Ca S 5 3 z E F pma le 5 A E i _ ZHEZEIEEE E E CadigoINs C digo de origen C
37. to ADC 20 m Procedimiento 1 Disolver 0 94 g del caldo base Middlebrook 7H9 en 160 mL de agua destilada est ril y a adir 20 mL de glicerol 2 Agitar constantemente se puede emplear un agitador magn tico hasta que se disuelva por completo 3 Esterilizaren la autoclave a 121 124 C por 15 minutos 4 Dejar que baje la temperatura y a ada 20 mL del suplemento enriquecedor ADC 5 Mezcle bien y verifique la esterilidad del medio incub ndolo a 37 C por 24 48 horas 6 Dispense 0 9 mL en crioviales en condiciones est riles asegure bien la tapa y almacene a 2 8 C e Nota para este proceso se emplea ADC y no OADC Crioconservaci n de las cepas 1 Coloque en el interior de la cabina de bioseguridad biol gica las placas Petri con agar 7H11 que contiene los subcultivos cepas obtenidas a partir de MODS 2 Abra la placa Petri con cuidado y coseche las colonias con un asa de siembra est ril A adir un asa completa de cepa a cada criovial conteniendo caldo 7H9 con 10 de glicerol 40 Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS Sellar bien el vial y agitar por 10 15 segundos para homogenizar las cepas Almacenar a 70 C se puede almacenar a 20 C si 70 C no esta disponible Las colonias restantes pueden utilizarse para realizar ensayos adicionales pruebas moleculares pruebas indirectas de sensibilidad a los antibi ti
38. urbio con el crecimiento de MTB Los desechos acompa antes en la muestra pueden dificultar la detecci n temprana de micobacterias pero con el tiempo las Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS colonias m s maduras pueden ser detectadas sobre todo en la periferia de los pozos Elcrecimientoen un solo pozo con ausencia de contaminaci n o menos de 2 UFC en cada pozo debe considerarse como un resultado indeterminado y se debe solicitar inmediatamente la repetici n del proceso de la muestra y la b squeda de evidencias de contaminaci n cruzada El intervalo entre las lecturas puede ser flexible para adaptarse al trabajo y calendario del laboratorio Lecturas m s frecuentes conducen a obtener resultados m s r pidos 6 6 Interpretaci n de resultados Observaci n de un Interpretaci n delos pozo sin drogas hallazgos en los pozos 2 2 UFC Positivo No crecimiento 0 UFC Negativo Crecimiento de 1 UFC Indeterminado Sobre crecimiento de bacterias hongos Contaminado Interpretaci n Combinando los hallazgos en Interpretacion general ambos pozos A y B de los cultivos Ambos pozos positivos Positivo Ambos pozos negativos Negativo Uno o dos pozos indeterminados Indeterminado Un pozo positivo y otro pozo negativo Indeterminado Un pozo positivo y otro pozo indeterminado Uno o dos pozos contaminados Contaminado Indet
39. y la columna 4 si fuera necesario de la misma manera que la columna 2 colocar 2 mL de 7H9 OADC en la columna 3 y seguir el procedimiento antes mencionado Cuando se realicen los c lculos para la preparaci n de la soluci n de trabajo hay que recordar en incluir los controles negativos en cada placa y los controles positivos as como tener en cuenta las posibles perdidas No congele o reuse de nuevo la soluci n stock y la soluci n de trabajo de antibi ticos porque la actividad de los antibi ticos se puede perder Descarte al final todo el resto de la soluci n stock de antibi ticos que no se emple Diluci n de la soluci n de trabajo de los antibi ticos luci nsiockde Diluci n del stock en Diluci n del stock2en Concentraci n final en los antibi ticos 7H9 OADC para generar 7H9 OADC para generarla pozos cuando se a ade la el stock 2 soluci n de trabajo muestra ug mL lsoniacida 5 uL stock 995 uL 1 10 sime 7H9 OADC 4ug mL INH 0 4 g 40 ug ml Rifampicina 12 5 uL stock 987 5 uL 1 10 8 ma ml 7H9 0ADC 10 Hg mL RIF 1 0 9 100 pg ml Investigar para proteger la salud SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTE OBSERVACI N MICROSC PICA MODS A adir 1mL 7H9 OADC pozos C y D columna1 2 mL a todo los pozos columna A Sin droga B Sin droga 2 Retirar 5 uL 7H9 OADC C Isoniacida A adir 5 uL INH stock 3 Retirar 12 5 uL 7H9 D Rifampicina OADC a adir 12 5 uL RIF stock Soluci n d
40. zados tempranamente mediante el uso de un microscopio luz invertida El m todo ha sido dise ado para la detecci n del crecimiento de MTB y la susceptibilidad a INH y RIF La simplicidad de la t cnica la gran sensibilidad la especificidad y el bajo costo son las mayores ventajas para su uso en pa ses en v as de desarrollo 6 DESARROLLO DEL M TODO DE ENSAYO 6 1 Condiciones previas Se debe realizar el mantenimiento y la calibraci n de los equipos que se van utilizar tales como las micropipetas la balanza anal tica los equipos controlados por temperatura autoclave centr fuga incubadora el potenci metro y las cabinas de seguridad biol gica clase Il tipo A2 de acuerdo con el programa de mantenimiento preventivo establecido para Investigar para proteger la salud 9 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Investigar para proteger la salud estos instrumentos y equipos La balanza anal tica debe ser calibrada antes de su uso y verificada usando pesas patrones certificadas 6 2 Aspectos de bioseguridad Las pr cticas microbiol gicas est ndar y las pr cticas especiales deben ser siempre rigurosamente cumplidas Todos los procedimientos que incluyen la manipulaci n de materiales infecciosos deben ser desarrollados dentro de la CSB Las ventanas y las puertas del laboratorio han de permanecer siempre cerradas La cabina debe de instalarse sobre una superficie s lida nunca m vil Los analistas deben usar equipos
Download Pdf Manuals
Related Search